JPH0797995B2 - ペプチド類の製造法 - Google Patents

ペプチド類の製造法

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JPH0797995B2 JP61271110A JP27111086A JPH0797995B2 JP H0797995 B2 JPH0797995 B2 JP H0797995B2 JP 61271110 A JP61271110 A JP 61271110A JP 27111086 A JP27111086 A JP 27111086A JP H0797995 B2 JPH0797995 B2 JP H0797995B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （目的） 従来の技術および発明が解決しようとする問
題点 カイコ核多角体病ウイルス（BmNPV）を利用するペプチ
ド類の生産方法は既に報告されている（文献１〜３。な
お引用文献はまとめて最後に示す）。
その方法の中心は組換DNA技術により多角体蛋白の構造
遺伝子部分を所望の蛋白の構造遺伝子と置換した型の組
換BmNPVを作成し、これをカイコ培養細胞またはカイコ
生体中で増殖させて目的蛋白を蓄積させるものであっ
た。
しかしながら、この方法では目的蛋白の生産量が未だ充
分とは言えない。そこで本発明者は更に優れた方法を開
発すべく研究を重ね本発明を完成した。
なお、融合蛋白の製造は既に大腸菌を利用して行われて
いるが、収量が著しく良くなるとは言えない（文献４〜
10）。
（構 成） 本発明は、カイコ核多角体病ウイルスDNAの多角体蛋白
構造遺伝子部分に、（）その遺伝子の全部又は一部
と、（）所望の蛋白の構造遺伝子を、（）結合手塩
基配列を介して又は介さずに連結した型の塩基配列を有
する、組換カイコ核多角体病ウイルスに関するものであ
り、またこの組換ウイルスをカイコ培養細胞またはカイ
コ生体中で増殖させて融合蛋白を生産させる方法に関す
るものであり、さらに、この融合蛋白の連結部を切断・
分解して所望の蛋白を製造する方法に関するものであ
る。
BmNPVは養蚕業者に広く知られているが、本発明者が単
離した代表的な株としてT3株があり、この株のウイルス
DNA（BmNPV DNA）は米国のATCCにATCC No.40188として
寄託されている。
このウイルスDNAから多角体蛋白の構造遺伝子を含む部
分を取出すには、文献１〜３の記載の如くEcoR I処理等
が適当であり、このEcoR I−EcoR I断片（約10.5kb）を
pBR322のEcoR I切断点に導入したプラスミドpBmE36を有
する大腸菌（E.coli K12 JM83 DGB−0036）はFERM BP−
813として微生物工業技術研究所に寄託されている。
更に、文献１に記載があるように、pBmE36をHind III処
理して多角体蛋白構造遺伝子を含有する約3.9kbの断片
をとってこれを市販のプラスミドpUC9（pharmacia P−L
Biochemical社）に組込み、EcoR Iで切断後、Bal31で
処理し（処理時間を調節すれば種々の長さの断片が製造
できる）さらにHind IIIで切断する等の操作で多角体蛋
白遺伝子の全部または一部を有する断片を製造すること
ができる。
多角体蛋白遺伝子の全部または一部に、所望の蛋白の構
造遺伝子を結合するには、適当な結合手（DNA）を用い
ることができ、生産された融合蛋白のうちこの結合手塩
基配列に対応して翻訳されたペプチドまたはアミノ酸
（連結部）を適当な手段で切断すれば所望の蛋白が生産
され、これを常法により単離することができる。融合蛋
白それ自体で有用な場合は当然切断操作は不用であり結
合手もなくてもよい。
結合手に対応したペプチドまたはアミノ酸（連結部）
と、その切断・分解法としては、Ile−Glu−Gly−Argの
配列を切断する血液凝固因子Xa（Ｆ−Xaと略示する）、
Pro−Ama−Gly−Pro（Amaは任意のアミノ酸）のアミノ
酸配列をAmaとGlyの間で切断するコラゲナーゼ、Argま
たはPheの後を切断するトリプシン、TryまたはPheの後
を切断するキモトリプシン、Pro−Argの後を切断するス
ロンビン、トリプトファンを分解するＮ−ブロムコハク
酸イミドまたはメチオニンを分解する臭化シアン等がよ
く知られている（文献４〜13）。連結部とその切断・分
解法は必ずしもこれらに限定はされず、種々のペプチド
またはアミノ酸と化学的あるいは酵素的方法を組合わせ
て利用すればよい。
所望の蛋白中には上記の連結部の切断・分解法で分解さ
れるべきペプチドあるいはアミノ酸が含まれていないの
が望ましい。しかし、適当に緩和な条件を設定して限定
的に分解し、目的を達することも可能である。
所望の蛋白とは種々の生理活性物質、診断用試薬物質、
工業的に有用な酵素類等、食品添加物および飼料添加物
等を意味し、例えばインターフェロン（IFN）類、腫瘍
壊死因子（TNF）、インターロイキン等のリンホカイン
類、インシュリン、成長ホルモン等のホルモン類、肝炎
ワクチン、インフルエンザワクチン等種々のワクチンに
用いる抗原類等、さらに組織プラスミノーゲン活性因子
（TPA）やソマトメジン等、あるいはアシラーゼ、リパ
ーゼ、アミラーゼ、ステロイド変換酵素等を挙げること
ができる。また物質によってはこれらに糖鎖が付加して
いる場合もあるが、真核細胞によりペプチド類をペプチ
ド類を生産させる本発明の方法では、真核生物遺伝子を
使用した場合にその生体内におけると同様な修飾を受け
るので、細菌類を用いる方法よりも有用性が高いと言え
る。
これらの蛋白をコードする遺伝子は、天然の原材料から
取り出された染色体DNAもしくはmRNAを経て作られたcDN
A、または化学合成したDNAあるいはそれらの手段を組合
せて製造したものの何れでもよい。
また、目的の物質は、その生理活性等必要な機能が得ら
れるかぎり、アミノ酸配列に多少の違い（置換、脱落、
付加）が生じても、あるいは意図的にそのような修飾を
してもよい。例えば、前記の連結部との関係で、臭化シ
アンでのメチオニンの分解を予定するときは、所望の蛋
白中のメチオニンを他のアミノ酸に替えるか除去するこ
とが考えられ、そのような塩基配列に基いて生産された
ペプチド類の活性が目的に合うか否かを検討すればよ
い。
さらに、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸を用いた
システインの化学的分解等で起こるような、アミノ酸の
一部分が所望な蛋白に残存することもあり得るが、この
場合も同様に活性を検討して目的に合うか否かを決定す
ればよい。
カイコ核多角体病ウイルスDNA（BmNPV DNA）の多角体蛋
白遺伝子の全部または一部と、所望の蛋白の構造遺伝子
を連結した型の（結合手塩基配列を介しまたは介さな
い）塩基配列、すなわち融合蛋白の遺伝子、が組込まれ
たプラスミド（組換用プラスミド）の製造は、市販のプ
ラスミド及び制限酸素等を利用して通常のDNA操作で可
能であり、また後述の実施例を参考にすれば容易に行な
うことができる。
これを用いて組換ウイルスを製造するには、例えばカイ
コ培養細胞を組換用プラスミドとBmNPVとで混合感染
し、必要に応じてプラーク法（文献14）や希釈法（文献
15）等により組換ウイルスを単離する。カイコ培養細胞
としては、そのその樹立細胞株としてBm細胞（文献１、
文献14および文献16のBM−Ｎ細胞:ATCC No.CRL8910）や
ATCC No.CRL−8851）として寄託されているBM−Ｎ細胞
等が知られている。目的物質をカイコを用いて生産する
には、培養細胞中で増殖したウイルス（組換ウイルスと
非組換ウイルスの混合物または組換ウイルスを単離した
もの）をカイコに経皮的にまたは体腔内に注射して感染
させる、あるいは人工飼料あるいはクワ葉にウイルスを
混ぜて与えれ感染させ、人工飼料あるいはクワ葉で適当
日数飼育し、目的の融合蛋白を蓄積させ、体液を採取し
て遠心分離等で沈澱を集める、あるいはカイコを摺りぶ
つしてドデシル硫酸ナトリウム（SDS）水溶液、尿素水
溶液、もしくはアルカリ性水溶液で抽出して常法処理に
よって得ることができる。融合蛋白を切断する場合は、
先述の如くに切断・分解操作を行えばよい。
次に、所望の蛋白としてインシュリン様成長因子（IGF
−Ｉ、IGF−II）とインターフェロン（α−IFN）の実施
例を挙げて説明するが、これらは例示にすぎず、限定的
意味はない。プラスミド構築の概略は第１図乃至第６図
に示す。DNA配列は特に示す以外は慣例により左側を
５′（上流）として、右側を３′（下流）として示す。
多角体蛋白遺伝子や所望蛋白の遺伝子および融合蛋白遺
伝子等のDNA断片の合成、切断、スクリーニング、単離
等は文献１〜３および一般的遺伝子操作技術（例えば文
献21及び22参照）を応用して行うことができる。
実施例１ A.多角体遺伝子を除去したプラスミドの構築 プラスミドpBmE36（文献１〜３）をEcoR Iで切断後dNTP
s（４種のデオキシヌクレオシド・トリ・ホスフェー
ト）存在下でDNAポリメラーゼＩ（クレノーフラグメン
ト）で平滑末端にした。これをHind IIIで部分分解後ア
ガロースゲル電気泳動によって多角体遺伝子を含むフラ
グメントを分離した。これを、pUC9をEcoR Iで切断後ク
レノーフラグメントによって平滑末端とし、更にHind I
IIで切断したもとのT4リガーゼにより結合させた。これ
で大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転換させて、プラスミドを
取りp98mE36とした。
開始コドンATG及び終止コドンTAAのところにそれぞれEc
oR V及びAat Iで認識される部位をインビトロミュータ
ゲネシス（in vitro mutagenesis、文献17）で導入し
た、すなわち、p9BmE36をエチジウムブロマイド存在下
でNNase I処理して、ニックドプラスミドを作り、これ
に予め化学合成した次の二種のDNAフラグメントをアニ
ールした。
次いでこれをポリメラーズＩおよびT4リガーゼで処理
し、生じたヘテロデュプレックスプラスミドで大腸菌Ｋ
−12 JM83を形質転換し、求めるミュータントを得るた
め再度形質転換をおこなってプラスミドp98mM36を得
た。
p98BmM36から多角体遺伝子を除き、ポリリンカーを挿入
するために次のDNAフラグメント（38mer二種）を化学合
成した。
CTAAGAGCTCCCGGGAATTCCATGGATATCTAGATAGG及びCCTATCTA
GATATCCATGGAATTCCCGGGAGCTCTTAG これら二本のフラグメント上は互いに相補的であり、ア
ニールした後には、Sac I、Sma I、EcoR I、Nco I、Eco
R VおよびXba Iによって認識される部位を生ずる。
上記二本のフラグメントをT4カイネースで５′末端をリ
ン酸化した後アニールさせた。これを、p9BmM36をEcoR
V及びAat Iで切断後多角体遺伝子部分を除いたフラグメ
ントとT4リガーゼにより結合させた。この操作により新
たにリンカーの５′側にBgl II、３′側にAat Iで認識
される部位が生じる。このプラスミドで大腸菌Ｋ−12
JM83を形質転換しプラスミドを取りpBM030とした。
pBM030のポリリンカー部のDNA配列と切断点をp9BmE36の
多角体遺伝子部分と対応させて示す。
B.部分的欠損多角体遺伝子を持つプラスミドの作製 プラスミドp9H18（文献１〜３）をEcoR Iで切断後Bal31
処理して切断点から両側を削り取らせた。Bal31の処理
時間を変えて、種々の長さの断片を製した。これをHind
IIIで処理し、0.7％アガロースゲル電気泳動で分離、
抽出し、種々の長さのウイルス由来のDNA断片を得た。
pUC9をSma I及びHind IIIで処理し、先に得たDNA断片
（平滑末端及びHind III末端を有する）とライゲートし
てプラスミドを製し、大腸菌Ｋ−12 JM83形質転換させ
た。これを増殖させた後プラスミドを取り、挿入したウ
イルス由来のDNA断片の３′側からの塩基配列をプライ
マー（M13用15 basq sequencing primer）を用いて、ダ
イデオキシ法（dideoxy法：文献18）により決定し、ウ
イルスの多角体遺伝子部分を同定した。即ち、セレブリ
アニらの文献（文献19）記載の多角体蛋白のアミノ酸配
列に対応する塩基配列をウイルス由来のDNA断片の塩基
配列中に見出し、翻訳開始コドンATG及び終止コドンTAA
も決定した。
Bal31の処理時間に対応して得られた種々のプラスミド
（p9Bシリーズプラスミド）の内、多角体遺伝子の翻訳
開始コドンATGの下流212bp、338bp、662bp及び727bp以
下が欠損しているものを夫々p9B240、p9B120、p9B115及
びp9B086とした。なお多角体遺伝子は終止コドンTAAま
で含めて738bpある。
C.α−インターフェロンと多角体蛋白との融合蛋白の遺
伝子の作製 pIFN2B310（文献１〜３）をSma Iで切断しα−IFN−Ｊ
フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。こ
れと、Sma Iで切断したpBM030をT4リガーゼで結合し、
生じたプラスミドで大腸菌Ｋ−12JM83を形質転換した。
得られた組換体プラスミドが正しい方向に挿入されたα
−IFN−Ｊ遺伝子を持っていることを確認してpBT310と
した。
pBT310をBgl IIで切断後、dNTPs存在下クレノーフラグ
メントを用いて平滑末端としたのちSca Iで切断した。
アガロースゲル電気泳動を行なってα−IFN−Ｊ遺伝子
を含むフラグメントを分離した。
p9B086をEcoR I及びSca Iで切断し、アガロースゲル電
気泳動によって多角体遺伝子を含むフラグメントを分離
し、これをS1ヌクレアーゼで平滑末端としたものと、先
に得たα−IFN−Ｊ遺伝子を含む断片とをT4リガーゼで
結合した。生じたプラスミド大腸菌Ｋ−12 JM83を形質
転換して、得たプラスミドの結合部のDNA配列が正しい
ことをダイデオキシ法で確認してpIFNF086を得た。
結合部のDNA配列 D.IGF−Ｉと多角体蛋白との融合蛋白の遺伝子の作製 大腸菌K12 MC1061 IGF001（FERM BP−932）よりプラス
ミドpIGF001を採取し、Sal Iで切断後dNTPs存在下クレ
ノーフラグメントで平滑末端とした後Ava IIで切断した
ものをポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ないIGF−
Ｉ遺伝子を含むフラグメントを分離した。
別にpBM030をEcrR V及びSac Iで切断した。
融合蛋白を血液凝固因子Xa（Ｆ−Xa）が確認して切断で
きるように、多角体蛋白とIGF−Ｉとの融合蛋白を作る
際、両者の間にIle−Glu−Gly−Argのアミノ酸配列を導
入することとした。そのために次の二本のDNAフラグメ
ントを化学合成した。
ATTGAAGGCAGAG（13mer）及び GACCTCTGCCTTCAATAGCT（20mer） これら二本のフラグメントは互いに相補的であり、アニ
ールした後に上流側にSac I切断点と結合できる末端
を、下流側にAva II切断点と結合できる粘着末端を生じ
る。
これらの二本のフラグメントをT4カイネースで５′末端
をリン酸化した後アニールさせ、上記のIGF−Ｉのフラ
グメントおよび切断されたpBM030とをT4ガーゼを用いて
結合させた。これで大腸菌Ｋ−12JM83を形質転換させ組
換プラスミドを得た。このプラスミドpIGF−I030は、Ｆ
−Xa認識部位とIGF−Ｉ遺伝子を正しく結合しているこ
とをダイデオキシ法でDNA配列を決定して確認した。pIG
F−I030をBal IIで切断後dNTPs存在下クロノーフラグメ
ントで平滑末端とした後、Sca Iで切断したアガロース
ゲル電気泳動でIGF−Ｉ遺伝子を含むフラグメントを分
離した。
別にp9B086をEcoR I及びSca Iで切断後S1ヌクレアーゼ
で平滑末端とし、アガロースゲル電気泳動で多角体遺伝
子を含むフラグメントを分離し、これと先のIGF−Ｉ遺
伝子を含むフラグメントとをT4リガーゼで結合した。生
じたプラスミドで大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転換させ、
正しく結合した融合蛋白遺伝子を持っているプラスミド
pIGF−IF086を得た。結合部分のDNA配列を示す。
E.IGF−IIと種々の長さの多角体蛋白との融合蛋白の遺
伝子を作製 大腸菌K12 MC1061 IGF002（FERM BP−933）よりプラス
ミドpIGF002を採取し、Sal Iで部分分解後dNTPs存在下
クレノーフラグメントで平滑末端となし、次いでHae II
Iで切断したものをポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない、IGF−II遺伝子を含んだフラグメントを分離し
た。これを、pBM030をSma Iで切断したものとT4リガー
ゼを用いて結合させ、大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転換し
た。得られた形質転換体がIGF−II遺伝子が正しい方向
に挿入されているプラスミドpIGF−II030を持っている
ことを認識した。
pIGF−II030をEcoR Iで部分分解後Sca Iで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動でIGF−II遺伝子を含んフラグメン
トを分離した。これと、p9B240、p9B120あるいはp9B115
をEcoR I及びSca Iで切断した後アガロースゲス電気泳
動で分離した多角体遺伝子の一部を含むフラグメントと
を、T4リガーゼで結合させた。
生じたプラスミドで大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転換し、
得られた形質転換体がもつプラスミドは、正しく結合し
た融合蛋白の遺伝子を持っていることをダイデオキシ法
でDNA配列を調べて確認した。
これらのプラスミドをおのおのpIGF−II F240、pIGF−I
I F120あるいはpIGF−II F115とした。
各プラスミドの結合部分のDAN配列を示す。
実施例2:Bm細胞へのトランスフェクション BmNPV T3株のウイルスDNA（ATCC NO.40188）とpIFN F08
6をモル比で1:100になる様にし、下記組成液ＩとIIを混
合した。
I.蒸溜水 2.1ml キャリアDNA（鮭正精巣、1mg/ml） 50 μｌ BmNPV DNA（1mg/ml） 10 μｌ pINF F086 DNA 50 μｇ 2M塩化カルシウム液 300 μｇ II.0.28M塩化ナトリウム含有の50mM HEPES緩衝液（pH7.
1） 2.5ml リン酸緩衝液（35mM Na2HPO4−35mM NaH2PO4）50 μｌ 生じた懸濁液の1mlをBm細胞培養用培地（10％牛胎児血
清を含むTC−10培地：文献20）4mlに加え、これを、5ml
の培地が残っている、Bm細胞（ATCC No.CRL 8910:2x106
個）が培養されている。培養器中に加えることにより、
上記DNAをBm細胞内に導入した。20時間後に新鮮な培地
と交換し、更に５日間培養後培地を回収した。これを遠
心して上清をとり、プラークアッセイ法（文献14）によ
ってクローン化した組換ウイルスを採取し、これをvIFN
F086とした。
同様にして、pIGF−I F086、pIGF−II F240、pIGF−II
F120およびpIGF−II F115より組換ウイルスvIGF−I F08
6、vIGF−II F240、vIGF−II F120およびvIGF−II F115
を得た。
実施例3:Bm細胞での融合蛋白の発現 Bm細胞（ATCC No.CRL 8910:2×106個）にvIFNF086懸濁
液（５×107pfu）を加えて感染させ、30分後に上清を除
去し、新鮮な培地4.5mlを加えて25℃で４日間培養後、
培養物を集めて遠心し（1,000rpm,10分）沈殿を採取し
た。これに新鮮な培地500μｌを加え、凍結−融解を５
回繰り返した後遠心（15,000rpm,10分）して沈殿を採取
した。これに４％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−10
％メルカプトエタノール200μｌを加えて溶かし、その
うち５μｌをSDS−14％アクリルアミドゲル電気泳動の
サンプルとした。
電気泳動後、ゲルに融合蛋白に相当するバンドが認めら
れたので、その濃さをデンシトメーターで測定し、マー
カー（各バンド１μｇの蛋白を含む）の濃さとの比較に
よって生産量を測定したところ、最初の細胞培養液1ml
あたり0.3mgであった（この融合蛋白のうち、IFN部分は
分子量の計算から約40％を占めているので、IFNを分離
すれば0.12mg/ml生産されていることになる）。これは
従来のカイコ細胞でIFNを発現させた報告（文献１）に
示された値５×106U/ml（これは0.005mg/mlになる）と
比較すると20倍以上に相当する。
同様にして、vIGF−I F086、vIGF−II F240、vIGF−II
F120及びvIGF−II F115を感染させたBm細胞が生産する
融合蛋白の量を測定したところ各々の細胞培養液1ml当
り0.5mg、0.1mg、0.4mg及び0.5mgであった（分子量から
計算するとこれらの融合蛋白中に含まれるIGF−Ｉある
いはIGF−IIの量は0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml及び
0.1mg/mlである）。
実施例4:Bm細胞での融合蛋白の発現および臭化シアン
（BrCN）による切断 Bm細胞（２×106個）にvIVF−II F120懸濁液（５×107p
fu）を加えて感染させ、30分後ウイルスを除き、新鮮な
培地4.5mlを加えて25℃で４日間培養後培養物を集めて
遠心（1,000rpm、10分）し沈殿を採取した。これに新鮮
な培地500μｌを加え、凍結−融解を５回繰り返した後
遠心（15,000rpm、10分）し沈殿を採取した。この沈殿
を蒸留水で洗浄後、0.5％SDSで溶解させ、高速液体クロ
マトグラフィー（TSKゲル フェニル5PWRP（東洋曹達
（株））溶媒系:0.1％トリフルオロ酢酸−アセトニトリ
ル20％〜75％の直線濃度勾配）によって融合蛋白を含む
2mlのフラクションを取つた。これに１％SDSを50μｌ加
え濃縮乾固させた後50μｌの蒸留水に溶かし、このうち
５μｌをとり、蟻酸35μｌおよび70％蟻酸45μｌを加え
る。これに臭化シアンの70％蟻酸溶液（200μ mcl/ml）
５μｌを加え、室温で24時間反応後濃縮乾固させ、7.5
μｌの蒸留水に溶かし、電気泳動を行ったところIGF−I
Iに相当するバンドを検出できた。
すなわち、SDS−16％ポリアクリルアミドゲルを用いた
電気泳動では、vIGF−II F120を感染させたBm細胞よりS
DS水溶液で抽出し、高速液体クロマトグラフィーで部分
精製したフラクションには、多角体蛋白（部分）とIGF
−IIとの融合蛋白に相当するバンドが約23Kに、これを
臭化シアンで分解したものには、IGF−IIに相当する約7
Kのバンドおよび多角体蛋白の分解物と推定される10〜1
4Kの数本のバンドが認められた。
IGF−IIのＮ末端の決定 上記の方法と同様にして、vIGF−II F120に感染させたB
m細胞50ml培養より約20mgの融合蛋白を取り臭化シアン
で切断した後、反応液を濃縮した。
この濃縮液を200mMピリジン−酢酸バッヘァー（pH3.0）
に溶かし、カラムクロマトグラフィ（SP−トヨパール
（東洋曹達（株））溶媒系:200mMピリジン−酢酸バッフ
ァー（pH3.0）〜2.0Mピリジン−酢酸バッファー（pH5.
0）の直線濃度勾配）によってIGF−IIを含むフラクショ
ンを取った。このフラクションを凍結乾燥した後、蒸留
水に溶解し、高速液体クロマトグラフィ（0DS−120T
（東洋曹達（株））溶媒系:0.1％トリフルオロ酢酸−ア
セトニトリル10％〜65％の直線濃度勾配）によって精製
してIGF−IIを得た。ペプチドシーケンサー（470Aプラ
テインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ
社））によってこのIGF−IIのＮ末端側のアミノ酸配列
を調べた。確認された配列は以下に示す通りである。
Ala−Tyr−Arg−Pro−Ser−Glu−Thr−Leu−Cys−Gly−
Gly−Glu−Leu−Val−Asp−Thr−Leu−Gln−Phe−Val−
Cys−Gly−Asp−Arg−Gly−Phe−Tyr−Phe−Ser−Arg−
Pro−Ala−Ser 実施例5:Bm細胞による融合蛋白の生産とコラゲナーゼに
よる切断 大腸菌K12 MC1061 IGF001（FERM BP−932）よりプラス
ミドpIGF001を採取した。これをSal Iで切断し、dNTPs
存在下クレノーフラグメントで平滑末端とした後Ava II
で切断したものをポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
ない、IGF−Ｉ遺伝子を含むフラグメントを分離した。
別にpIGF−II F120をEcor V及びEcoR Iで切断しIGF−II
遺伝子を取除いた。
Pro−Ama−Gly−Pro（Amaは任意のアミノ酸）のアミノ
酸配列をAmaとGlyの間で切断するコラゲナーゼが認識し
て切断できるように、多角体蛋白とIGF−IIとの融合蛋
白を作る際、両者の間にGly−Pro−Ala−Gly−Pro−Ala
のアミノ酸配列を導入することとした。そのために次の
二本のDNAフラグメントを化学合成した。
これら二本のフラグメントは互いに相補的であり、アニ
ールした後に上流側にEcoR I切断点と結合できる末端
が、下流側にAva II切断点と結合できる粘着末端が生じ
る。
これら二本のフラグメントを、T4カイネースで５′末端
をリン酸化した後アニールさせ、これと上記のIGF−Ｉ
のフラグメント及び切断されたpIGF−II F120とをT4リ
ガーゼを用いて結合させた。これで大腸菌Ｋ−12 JM83
を形質転換させ、組換プラスミドを得た。このプラスミ
ドpIGF−I F120は、コラゲナーゼ認識部位とIGF−Ｉ遺
伝子が正しく結合していることをダイデオキシ法でDNA
配列を決定して認識した。
結合部分のDNA配列及び対応アミノ酸を示す。
実施例２に述べた方法と同様にしてpIGF−I F120を用い
て組換えウイルスvIGF−I F120を得た。
実施例４に述べた方法と同様に、vIGF−I F120に感染し
たBm細胞を50μｌ培養より集め、凍結−融解処理を行な
い遠心し（15,000rpm、10分）、沈殿を採取した。これ
を6M塩酸グアニジンで抽出し、遠心して（15,000rpm、
５分）残渣を除いた後、透析を行ない、生じた沈殿を遠
心（15,000rpm、10分）で集めた。これを800μｌの10M
尿素に溶かし、200mM塩化カルシウム100μｌ、250mMト
リス−塩酸（pH7.4）200μｌを加えた。これにコラゲナ
ーゼ水溶液（1,500U/ml:シグマケミカル社製）900μｌ
を加え、30℃で２時間反応後、遠心（15,000rpm、５
分）し、上清を採った。これをイオン交換クロマトグラ
フィ（DEAM−トヨパール（東洋曹達（株））溶媒系:25m
Mトリス−塩酸（pH7.4）にかけ、Ｎ末端に余分のアミノ
酸配列をもつIGF−Ｉ（IGF−IPと略示する）を含むフラ
クションを取った。これを濃縮後高速液体クロマトグラ
フィ（RPSC（ベックマン社）溶媒系:0.1％トリフルオロ
酢酸−アセトニトリル10％〜65％直線濃度勾配）によっ
てIGF−IPを精製した。このIGF−IPのＮ末側のアミノ酸
配列を470Aプロテインシーケンサー（アプライドバイオ
システム社）を用いて調べたところ、融合蛋白は、コラ
ゲナーゼによって正しい位置で切断されていることが判
った。
確認されたIGF−IPのＮ末側のアミノ酸配列は次の通り
である。
Gly−Pro−Ala−Gly−Glu−Phe−Ile−Glu−Gly−Arg−
Gly−Pro−Glu−Thr−Leu−Cys−Gly−Ala−Glu−Leu 実施例6:カイコ個体での多角体−IGF−Ｉ融合蛋白の発
現 ５令１日目のカイコに、vIGF−I F086懸濁液0.5ml/匹
（107pfu）を経皮的に注射し、25℃で３日間、クワ葉を
与えて飼育後、腹脚に採取針をさして体液を氷冷したエ
ッペンドルフ・チューブに採取し、遠心（15,000rpm,10
分）し沈殿を採った。これに４％SDS−10％メルカプト
エタノール200μｌを加えて溶かし、そのうちの２μｌ
をSDS−14％アクリルアミドゲル電気泳動のサンプルと
した。電気泳動後ゲルに融合蛋白に相当するバンドが認
められたので、その濃さをデンシトメーターで測定し、
マーカー（各バンド１μｇの蛋白を含む）の濃さとの比
較によって生産量を測定したところ、体液1mlあたり5mg
であった（この融合蛋白からIGF−Ｉを分離するとすれ
ば、分子量の計算から1mg/mlとれることになる）。
SDS−14％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で
は、BmNPV−T3株感染カイコ体液が約30Kに多角体蛋白に
相当する明瞭なバンドを示すのに対し、vIGF−I F086感
染カイコ体液には多角体蛋白に相当するバンドがなく多
角体蛋白とIGF−Ｉとの融合蛋白の特徴あるバンドが約3
6Kに認められた。
実施例で用いたIGF−Ｉ及びIGF−IIの合成遺伝子のDNA
配列とアミノ酸配列を次に示す。
文献1:Nature315 592（1985） 文献2:特開昭61−9288号公報 文献3:特開昭61−9297号公報 文献4:Science198 1056（1977） 文献5:特開昭54−145289号公報 文献6:特開昭55−19092号公報 文献7:特開昭55−45395号公報 文献8:特開昭55−104886号公報 文献9:特開昭56−145221号公報 文献10:特開昭56−166200号公報 文献11:Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81,4692（1984） 文献12:Nature309 810（1984） 文献13:Nature285 456（1980） 文献14:J.Seric.Sci.Jpn.,53 547（1984） 文献15:J.Invertebr.Pathol.,29 304（1977） 文献16:Appl.Environ.Microbiol.,44 227（1982） 文献17:Nucle.Acids Res.,９ 3647（1981） 文献18:Science214 1205（1981） 文献19:J.Invertebr.Pathol.,30 442（1977） 文献20:J.Invertebr.Pathol.,25 363（1975） 文献21:Am.J.Hum.Genet.,31 531（1979） 文献22:T.Maniatis et al.Molecular Cloning;Cold Spr
ing Harbor Laboratory（1982）
【図面の簡単な説明】
第１図乃至第６図は組換ウイルス製造用プラスミド作成
例の概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 佐藤 嘉生 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬中央研究所内 (72)発明者 佐伯 欣之 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬中央研究所内 審査官 加藤 浩 (56)参考文献 特開 昭60−37988（ＪＰ，Ａ) 特公 平５−73393（ＪＰ，Ｂ２) Ｎａｔｕｒｅ 315（1985）Ｐ．592− 594 Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ.

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】カイコ核多角体病ウイルスDNA（BmNPV DN
    A）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、（）その遺伝子
    の全部又は一部と、（）所望の蛋白の構造遺伝子を
    （）結合手塩基配列を介して又は介さずに連結した型
    の塩基配列を有する組換ウイルスを作製し、このウイル
    スを増殖させて、多角体蛋白（全部又は一部）と、連結
    アミノ酸若しくは連結ペプチドを介した又は介さない、
    所望の蛋白との融合蛋白を生産させることを特徴とする
    ペプチド類の製造法。
  2. 【請求項２】カイコ核多角体病ウイルスDNA（BmNPV DN
    A）の多角体蛋白構造遺伝子部分に（）その遺伝子の
    全部又は一部と、（）所望の蛋白の構造遺伝子を
    （）結合手塩基配列を介して又は介さずに連結した型
    の塩基配列を有する組換ウイルスを作製し、このウイル
    スを増殖させて多角体蛋白（全部又は一部）と、連結ア
    ミノ酸又は連結ペプチドを介した又は介さない、所望の
    蛋白との融合蛋白を生産させ、次いでその融合蛋白の連
    結部を切断することを特徴とするペプチド類の製造法。
  3. 【請求項３】カイコ核多角体病ウイルスDNA（BmNPV DN
    A）の多角体蛋白構造遺伝子部分に（）その遺伝子の
    全部又は一部と、（）所望の蛋白の構造遺伝子を
    （）結合手塩基配列を介して又は介さずに連結した型
    の塩基配列を有する組換ウイルスを作製し、このウイル
    スをカイコ生体中で増殖させて、多角体蛋白（全部又は
    一部）と、連結アミノ酸若しくは連結ペプチドを介した
    又は介さない、所望の蛋白との融合蛋白を生産させるこ
    とを特徴とするペプチド類の製造法。
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