JPH05227967A - カイコからの有用タンパク質の製造方法 - Google Patents
カイコからの有用タンパク質の製造方法Info
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- JPH05227967A JPH05227967A JP4061521A JP6152192A JPH05227967A JP H05227967 A JPH05227967 A JP H05227967A JP 4061521 A JP4061521 A JP 4061521A JP 6152192 A JP6152192 A JP 6152192A JP H05227967 A JPH05227967 A JP H05227967A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
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- C12N2710/14011—Baculoviridae
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 冷蔵処理したカイコに、目的タンパク質をコ
ードする遺伝子を組込んだウイルスを経口的に感染さ
せ、次いでカイコを飼育し、カイコ中から目的タンパク
質を採取することを特徴とするカイコからの有用タンパ
ク質の製造方法。 【効果】 本発明方法によれば、多数のカイコに対し経
口投与という簡易な手段によって組換えウイルスを感染
せしめることができ、当該カイコから有用タンパク質を
得ることができるので、従来行なわれていた注射による
感染法に比べ、工業的に極めて有利である。
ードする遺伝子を組込んだウイルスを経口的に感染さ
せ、次いでカイコを飼育し、カイコ中から目的タンパク
質を採取することを特徴とするカイコからの有用タンパ
ク質の製造方法。 【効果】 本発明方法によれば、多数のカイコに対し経
口投与という簡易な手段によって組換えウイルスを感染
せしめることができ、当該カイコから有用タンパク質を
得ることができるので、従来行なわれていた注射による
感染法に比べ、工業的に極めて有利である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、カイコを用いる有用タ
ンパク質の製造方法に関し、更に詳細には、目的タンパ
ク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルス（以下、
「組換えウイルス」という）を経口的に効率的に感染さ
せることを特徴とする有用タンパク質の製造方法に関す
る。
ンパク質の製造方法に関し、更に詳細には、目的タンパ
ク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルス（以下、
「組換えウイルス」という）を経口的に効率的に感染さ
せることを特徴とする有用タンパク質の製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子組換え技術を利用して、カ
イコで有用タンパク質を生産する技術が盛んに研究され
ている。 例えば、カイコ核多角体ウイルスをベクター
として利用する方法が報告されている（特開昭６１−９
２８８号、同６２−２０８２７６号等）。
イコで有用タンパク質を生産する技術が盛んに研究され
ている。 例えば、カイコ核多角体ウイルスをベクター
として利用する方法が報告されている（特開昭６１−９
２８８号、同６２−２０８２７６号等）。
【０００３】これらの方法は、カイコ核多角体ウイルス
の有する多角体遺伝子を他の有用物質をコードする遺伝
子に置き換えて組換えウイルスを調製し、これを５齢カ
イコに接種して感染させ、４〜８日後に組換え体ウイル
スが増殖の過程でカイコ細胞中で産生し、体液中に分泌
した有用物質を採取、分離、精製するというものであ
る。
の有する多角体遺伝子を他の有用物質をコードする遺伝
子に置き換えて組換えウイルスを調製し、これを５齢カ
イコに接種して感染させ、４〜８日後に組換え体ウイル
スが増殖の過程でカイコ細胞中で産生し、体液中に分泌
した有用物質を採取、分離、精製するというものであ
る。
【０００４】このようなカイコを利用した遺伝子組換え
の技術は、宿主となるカイコが従来用いられている大腸
菌や酵母と比べて遺伝的に人間に近いものであるため、
産生有用物質の活性や抗原性の点等から好ましいとされ
ている。
の技術は、宿主となるカイコが従来用いられている大腸
菌や酵母と比べて遺伝的に人間に近いものであるため、
産生有用物質の活性や抗原性の点等から好ましいとされ
ている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
カイコを利用する遺伝子組換え方法には大きな問題があ
った。すなわち、組換えウイルスをカイコに感染、接種
させる方法としては、ウイルス液をカイコ１頭づつに注
射して感染させる経皮感染方法と、飼料とともにウイル
ス液を給餌し、消化管から感染させる経口感染方法の二
方法が検討されている。
カイコを利用する遺伝子組換え方法には大きな問題があ
った。すなわち、組換えウイルスをカイコに感染、接種
させる方法としては、ウイルス液をカイコ１頭づつに注
射して感染させる経皮感染方法と、飼料とともにウイル
ス液を給餌し、消化管から感染させる経口感染方法の二
方法が検討されている。
【０００６】この方法のうち、経口感染方法は、例えば
人工飼料にウイルス液を塗布し、一度に添食すれば感染
が終了するので、有用物質の大量生産においては極めて
効率的である。 しかし、例えばカイコ核多角体ウイル
スを用いる場合、組換えウイルスは本来ウイルス自身を
包埋し、外界の乾燥や紫外線、感染時のカイコ消化液か
ら身を守るべき多角体タンパク質に代えて目的タンパク
質を産生するのであるから、この経口感染方法によって
カイコ消化管内に取り込まれた組換えウイルスがカイコ
消化液で容易に不活性化され、カイコに全く感染しなか
った。
人工飼料にウイルス液を塗布し、一度に添食すれば感染
が終了するので、有用物質の大量生産においては極めて
効率的である。 しかし、例えばカイコ核多角体ウイル
スを用いる場合、組換えウイルスは本来ウイルス自身を
包埋し、外界の乾燥や紫外線、感染時のカイコ消化液か
ら身を守るべき多角体タンパク質に代えて目的タンパク
質を産生するのであるから、この経口感染方法によって
カイコ消化管内に取り込まれた組換えウイルスがカイコ
消化液で容易に不活性化され、カイコに全く感染しなか
った。
【０００７】このような理由から、組換えウイルスの感
染は、経皮感染により行なうことが一般的であるが、経
皮感染は、カイコが脱皮した直後に、カイコ１匹づつに
注射をしなければならず、しかもカイコ体内の各種臓器
に傷を付けないように行なう必要があるため熟練と手間
が必要であり、到底工業的な有用物質生産において採用
しうるものではなかった。
染は、経皮感染により行なうことが一般的であるが、経
皮感染は、カイコが脱皮した直後に、カイコ１匹づつに
注射をしなければならず、しかもカイコ体内の各種臓器
に傷を付けないように行なう必要があるため熟練と手間
が必要であり、到底工業的な有用物質生産において採用
しうるものではなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、カイコを利用
した遺伝子組換え技術を工業的生産で行なうためには、
効率が良く、簡単に組換えウイルスをカイコに感染せし
める方法の確立が望まれていた。
した遺伝子組換え技術を工業的生産で行なうためには、
効率が良く、簡単に組換えウイルスをカイコに感染せし
める方法の確立が望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、組換えウ
イルスをカイコに経口投与することにより十分に感染さ
せるための手段について鋭意研究を行なった結果、冷蔵
処理した後のカイコ消化管の働きは低下しており、この
時期に組換えウイルスを経口投与すれば注射による処理
と同様に感染せしめることができることを見出し、本発
明を完成した。
イルスをカイコに経口投与することにより十分に感染さ
せるための手段について鋭意研究を行なった結果、冷蔵
処理した後のカイコ消化管の働きは低下しており、この
時期に組換えウイルスを経口投与すれば注射による処理
と同様に感染せしめることができることを見出し、本発
明を完成した。
【００１０】すなわち本発明は、カイコを用いる有用タ
ンパク質の製造方法に関し、更に詳細には、目的タンパ
ク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスを経口的
に効率的に感染させることを特徴とする有用タンパク質
の製造方法を提供するものである。
ンパク質の製造方法に関し、更に詳細には、目的タンパ
ク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスを経口的
に効率的に感染させることを特徴とする有用タンパク質
の製造方法を提供するものである。
【００１１】本発明を実施するには、まず、カイコを冷
蔵処理することが必要である。本発明において用いられ
るカイコについては特に制限はなく、一般に普及してい
る品種を用いることができ、例えば秋光×竜白、錦秋×
鐘和、芙蓉×東海などの交雑品種が好適に用いられる。
これらのカイコは、無菌飼育が可能な人工飼育で飼育
するのが好ましいため、母蛾検査による微粒子病等が検
出されないものを用いることが望ましい。
蔵処理することが必要である。本発明において用いられ
るカイコについては特に制限はなく、一般に普及してい
る品種を用いることができ、例えば秋光×竜白、錦秋×
鐘和、芙蓉×東海などの交雑品種が好適に用いられる。
これらのカイコは、無菌飼育が可能な人工飼育で飼育
するのが好ましいため、母蛾検査による微粒子病等が検
出されないものを用いることが望ましい。
【００１２】カイコの無菌飼育の場合、好ましくは消毒
用アルコールあるいはホルマリン液、次亜塩素酸液等に
より消毒した蚕種を用い、無菌的条件で催青し孵化させ
る。さらに無菌の飼料を用いた無菌の環境で飼育したカ
イコの４齢の就眠時に経過を揃え、一斉に脱皮した５齢
起蚕を使用する。 また目的のタンパク質によっては、
無菌的な飼育で無くてもよく、通常の桑葉を与えたカイ
コを使用することもできる。
用アルコールあるいはホルマリン液、次亜塩素酸液等に
より消毒した蚕種を用い、無菌的条件で催青し孵化させ
る。さらに無菌の飼料を用いた無菌の環境で飼育したカ
イコの４齢の就眠時に経過を揃え、一斉に脱皮した５齢
起蚕を使用する。 また目的のタンパク質によっては、
無菌的な飼育で無くてもよく、通常の桑葉を与えたカイ
コを使用することもできる。
【００１３】カイコの冷蔵処理は、０〜１０℃でおこな
うことが適当であり、好ましくは２〜８℃である。 ま
た、処理時間としては、６〜３６時間の範囲が適当であ
る。この冷蔵処理温度と冷蔵処理時間の間には相関があ
り、例えば２.５℃の低温の場合は１２時間の処理で最
も感染率が高く、５℃の場合では２４時間の処理が最適
である。
うことが適当であり、好ましくは２〜８℃である。 ま
た、処理時間としては、６〜３６時間の範囲が適当であ
る。この冷蔵処理温度と冷蔵処理時間の間には相関があ
り、例えば２.５℃の低温の場合は１２時間の処理で最
も感染率が高く、５℃の場合では２４時間の処理が最適
である。
【００１４】次いで、上記のように冷蔵処理したカイコ
に組換えウイルスを経口投与する。組換えウイルスの経
口投与方法としては、カイコの飼料と共に投与すること
が好ましく、具体的には、冷蔵処理を施したカイコを常
温（約２５℃）に戻し、冷蔵処理による一時的休眠から
さましてから（約６時間後）組換えウイルスを塗布もし
くは浸漬した人工飼料を与えて感染させる
に組換えウイルスを経口投与する。組換えウイルスの経
口投与方法としては、カイコの飼料と共に投与すること
が好ましく、具体的には、冷蔵処理を施したカイコを常
温（約２５℃）に戻し、冷蔵処理による一時的休眠から
さましてから（約６時間後）組換えウイルスを塗布もし
くは浸漬した人工飼料を与えて感染させる
【００１５】添食方法としては、カイコ１頭当り１ｇの
人工飼料（例えば、形状：厚さ５ｍｍ、幅１０ｍｍ、長
さ２０ｍｍ）の表面に組換えウイルス液を適量均一に塗
布もしくは浸漬し、これをカイコに食下させる。
人工飼料（例えば、形状：厚さ５ｍｍ、幅１０ｍｍ、長
さ２０ｍｍ）の表面に組換えウイルス液を適量均一に塗
布もしくは浸漬し、これをカイコに食下させる。
【００１６】用いる人工飼料は市販のものでよい。 人
工飼料は、一般にはヨウカン状で、水分を６５〜７０％
含むものが適当であるが、ウイルス液を均一に吸収する
ようなペレット状の多孔質の乾体飼料を使用すれば簡便
で、しかもウイルス量を正確に投与することができるの
で好ましい。 投与は５齢初期のカイコ幼虫に１回投与
するだけでよく、その後は通常の飼育条件で４〜６日間
飼育を継続すればよい。
工飼料は、一般にはヨウカン状で、水分を６５〜７０％
含むものが適当であるが、ウイルス液を均一に吸収する
ようなペレット状の多孔質の乾体飼料を使用すれば簡便
で、しかもウイルス量を正確に投与することができるの
で好ましい。 投与は５齢初期のカイコ幼虫に１回投与
するだけでよく、その後は通常の飼育条件で４〜６日間
飼育を継続すればよい。
【００１７】カイコに投与するウイルス量は、使用する
組換えウイルスの種類、産生させるべき有用タンパク質
の種類により変化するが、例えば、カイコ核多角体ウイ
ルスを用いる場合の標準としては、５齢初期のカイコ１
頭が２４時間以内に１００％食下できる量の人工飼料
（カイコ１頭当たり、１ｇ程度）中に１×１０4〜１×
１０7ＰＦＵ／μｌ程度に調製したウイルス液１００μ
ｌを塗布または浸漬すれば良い。
組換えウイルスの種類、産生させるべき有用タンパク質
の種類により変化するが、例えば、カイコ核多角体ウイ
ルスを用いる場合の標準としては、５齢初期のカイコ１
頭が２４時間以内に１００％食下できる量の人工飼料
（カイコ１頭当たり、１ｇ程度）中に１×１０4〜１×
１０7ＰＦＵ／μｌ程度に調製したウイルス液１００μ
ｌを塗布または浸漬すれば良い。
【００１８】本発明において、用いられる組換えウイル
スの例としては、カイコ核多角体ウイルスＤＮＡ（Ｂｍ
ＮＰＶ ＤＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、目的
とする有用タンパク質を組み込んだものが挙げられる。
ここで用いられるカイコ核多角体ウイルスは、野生型
のウイルス株の中から、増殖が活発で、しかも多角体形
成の良好な株を分離し、数回のプラーク形成によりクロ
ーン化されたものであり、その代表的なものとしては、
Ｔ３株（ＡＴＣＣ）やＰ４Ｅ株（蚕糸・昆虫農業技術研
究所）が知られている。
スの例としては、カイコ核多角体ウイルスＤＮＡ（Ｂｍ
ＮＰＶ ＤＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、目的
とする有用タンパク質を組み込んだものが挙げられる。
ここで用いられるカイコ核多角体ウイルスは、野生型
のウイルス株の中から、増殖が活発で、しかも多角体形
成の良好な株を分離し、数回のプラーク形成によりクロ
ーン化されたものであり、その代表的なものとしては、
Ｔ３株（ＡＴＣＣ）やＰ４Ｅ株（蚕糸・昆虫農業技術研
究所）が知られている。
【００１９】また、組換えウイルスの調製も常法にした
がって行なうことができる。 例えばカイコ核多角体ウ
イルスの多角体タンパク質発現プロモーター（プラスミ
ド）を調製し、このプラスミドの下流に目的とする有用
タンパク質をコードする遺伝子を組み込み、発現ベクタ
ーを調製する。 次いで、この発現ベクターと予めクロ
ーン化してあるカイコ核多角体ウイルスとをカイコ樹立
細胞をコ・トランスフェクトさせ、形質転換された組換
えウイルスを同じくカイコ樹立細胞中で培養増殖し、そ
の細胞を破壊して組換えウイルスを取得すれば良い。
がって行なうことができる。 例えばカイコ核多角体ウ
イルスの多角体タンパク質発現プロモーター（プラスミ
ド）を調製し、このプラスミドの下流に目的とする有用
タンパク質をコードする遺伝子を組み込み、発現ベクタ
ーを調製する。 次いで、この発現ベクターと予めクロ
ーン化してあるカイコ核多角体ウイルスとをカイコ樹立
細胞をコ・トランスフェクトさせ、形質転換された組換
えウイルスを同じくカイコ樹立細胞中で培養増殖し、そ
の細胞を破壊して組換えウイルスを取得すれば良い。
【００２０】本発明において、組換えウイルスに遺伝子
が組み込まれる有用タンパク質の例としては、ウロキナ
ーゼ、アンジオテンシン変換酵素、α−アミド化酵素、
チトクロームＰ４５０などの酵素類；インシュリン、ソ
マトメジン、ヒト成長ホルモン、各種動物成長ホルモン
等のホルモン類；インターフェロン（α、β、γ）、イ
ンターロイキン（１−７）、ＣＳＦ、ＥＰＯ等のサイト
カイン類；エイズウイルスのｇｐ１６０（ｇｐ１２０、
ｇｐ４０）、インフルエンザのＨＡタンパク質、Ｂ型肝
炎ウイルスのＨＢｓ、Ｃ型肝炎ウイルスのＨＣｓ、狂犬
病ウイルスのｇｐ５０等の各種ウイルスのタンパク質
類；Ｔ細胞のＣＤ4、Ｃ−ｆｍｓ、ｅｒｂＢ等の各種細
胞のレセプタータンパク質類；ｍｙｆ、ｆｏｓ等の核内
タンパク質類；各種生理活性物質等のペプチド類；タン
パク類、糖タンパク類を挙げることができる。
が組み込まれる有用タンパク質の例としては、ウロキナ
ーゼ、アンジオテンシン変換酵素、α−アミド化酵素、
チトクロームＰ４５０などの酵素類；インシュリン、ソ
マトメジン、ヒト成長ホルモン、各種動物成長ホルモン
等のホルモン類；インターフェロン（α、β、γ）、イ
ンターロイキン（１−７）、ＣＳＦ、ＥＰＯ等のサイト
カイン類；エイズウイルスのｇｐ１６０（ｇｐ１２０、
ｇｐ４０）、インフルエンザのＨＡタンパク質、Ｂ型肝
炎ウイルスのＨＢｓ、Ｃ型肝炎ウイルスのＨＣｓ、狂犬
病ウイルスのｇｐ５０等の各種ウイルスのタンパク質
類；Ｔ細胞のＣＤ4、Ｃ−ｆｍｓ、ｅｒｂＢ等の各種細
胞のレセプタータンパク質類；ｍｙｆ、ｆｏｓ等の核内
タンパク質類；各種生理活性物質等のペプチド類；タン
パク類、糖タンパク類を挙げることができる。
【００２１】また、カイコ樹立細胞の例としては、Ｂｍ
細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９８１０）ＢＭ−Ｎ細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ−８８５１）、Ｂｍ ３６細胞等が知られ
ており、このうちＢＭ−Ｎ細胞を用いるときはコ・トラ
ンスフェクト後に細胞を凍結、融解処理で破壊して組換
えウイルスを取得するのが適しており、Ｂｍ ３６を用
いるときは培養液の上清を用いて組換えウイルスを取得
することができる。
細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９８１０）ＢＭ−Ｎ細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ−８８５１）、Ｂｍ ３６細胞等が知られ
ており、このうちＢＭ−Ｎ細胞を用いるときはコ・トラ
ンスフェクト後に細胞を凍結、融解処理で破壊して組換
えウイルスを取得するのが適しており、Ｂｍ ３６を用
いるときは培養液の上清を用いて組換えウイルスを取得
することができる。
【００２２】上記の様にして組換えウイルスを経口投与
した後は、カイコ体内で組換えウイルスが増殖するまで
飼育する。飼育温度は２２〜２８℃の範囲が適当であ
り、一定温度で飼育した場合は常に一定の飼育日数で安
定した目的のタンパク質を得ることができる。 例え
ば、組換えウイルスとしてカイコ角多角体ウイルスを使
用し、２５℃の一定の温度で飼育した場合、感染したカ
イコ幼虫は投与後５日目には核多角体病（膿病）特有の
病徴を呈する。
した後は、カイコ体内で組換えウイルスが増殖するまで
飼育する。飼育温度は２２〜２８℃の範囲が適当であ
り、一定温度で飼育した場合は常に一定の飼育日数で安
定した目的のタンパク質を得ることができる。 例え
ば、組換えウイルスとしてカイコ角多角体ウイルスを使
用し、２５℃の一定の温度で飼育した場合、感染したカ
イコ幼虫は投与後５日目には核多角体病（膿病）特有の
病徴を呈する。
【００２３】飼育容器は無菌環境が維持できるものがよ
く、例えば除菌フィルターの付いた通気性のある蓋によ
り密閉された容器を使用するとよい。飼育頭数は例え
ば、幅２００ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、高さ５０〜１００
ｍｍの大きさの容器には２０〜４０頭の５齢幼虫を飼育
するのが適当である。給餌は毎日与えなくてもよく、２
〜３日分を一括して与えてもよい。 組換えウイルスを
投与してから目的タンパク質を回収するまでの総給餌量
は水分含有率により異なるが、約８〜１２ｇ／頭程度で
ある。（乾物換算では約２.５〜４.０ｇ／頭相当であ
る。）
く、例えば除菌フィルターの付いた通気性のある蓋によ
り密閉された容器を使用するとよい。飼育頭数は例え
ば、幅２００ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、高さ５０〜１００
ｍｍの大きさの容器には２０〜４０頭の５齢幼虫を飼育
するのが適当である。給餌は毎日与えなくてもよく、２
〜３日分を一括して与えてもよい。 組換えウイルスを
投与してから目的タンパク質を回収するまでの総給餌量
は水分含有率により異なるが、約８〜１２ｇ／頭程度で
ある。（乾物換算では約２.５〜４.０ｇ／頭相当であ
る。）
【００２４】カイコ体中で産生された目的タンパク質の
回収・分離は、カイコ体中に目的タンパクが最も多く蓄
積される感染後４〜６日目にカイコ体液を採取し、遠心
分離、カラムクロマトグラフィー等の各種分離手段によ
り有用タンパク質を取得、精製すれば良い。 また、別
の手段としては、カイコを摺りつぶし、ＳＤＳ水溶液、
尿素水溶液、アルカリ性水溶液等で抽出した後、常法処
理によって有用タンパク質を分離、採取する方法が挙げ
られる。 更に別の手段としては、摺りつぶしたカイコ
をリン酸バッファー等に懸濁させ、超音波処理したのち
血球等の、そのタンパク質と特異的に結合する物質を加
えて有用タンパク質を取得する方法を挙げることができ
る。
回収・分離は、カイコ体中に目的タンパクが最も多く蓄
積される感染後４〜６日目にカイコ体液を採取し、遠心
分離、カラムクロマトグラフィー等の各種分離手段によ
り有用タンパク質を取得、精製すれば良い。 また、別
の手段としては、カイコを摺りつぶし、ＳＤＳ水溶液、
尿素水溶液、アルカリ性水溶液等で抽出した後、常法処
理によって有用タンパク質を分離、採取する方法が挙げ
られる。 更に別の手段としては、摺りつぶしたカイコ
をリン酸バッファー等に懸濁させ、超音波処理したのち
血球等の、そのタンパク質と特異的に結合する物質を加
えて有用タンパク質を取得する方法を挙げることができ
る。
【００２５】
【発明の効果】本発明方法によれば、多数のカイコに対
し経口投与という簡易な手段によって組換えウイルスを
感染せしめることができ、当該有用タンパク質を得るこ
とができるので、従来行なわれていた注射による感染法
に比べ、工業的に極めて有利である。
し経口投与という簡易な手段によって組換えウイルスを
感染せしめることができ、当該有用タンパク質を得るこ
とができるので、従来行なわれていた注射による感染法
に比べ、工業的に極めて有利である。
【００２６】
【実施例】次に参考例および実施例を挙げ、本発明を更
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等になんら
制約されるものではない。
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等になんら
制約されるものではない。
【００２７】参 考 例 組換えウイルスの調製：カイコ核多角体ウイルス（Ｂｍ
ＮＰＶ）の代表的な株としてはＴ３株があり、この株
のウイルスＤＮＡ（Ｂｍ ＮＰＶ ＤＮＡ）は米国のアメ
リカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）
にＡＴＣＣ ４０１８８として寄託されている。 更に、
このウイルスＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約
１０.５ｋｂ）をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ切断点に導
入したプラスミドｐＢｍＥ ３６を有する大腸菌（Ｅ.
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ８３ ＤＧＢ−００３６）は、微
生物工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−８１３として寄
託されている。
ＮＰＶ）の代表的な株としてはＴ３株があり、この株
のウイルスＤＮＡ（Ｂｍ ＮＰＶ ＤＮＡ）は米国のアメ
リカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）
にＡＴＣＣ ４０１８８として寄託されている。 更に、
このウイルスＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約
１０.５ｋｂ）をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ切断点に導
入したプラスミドｐＢｍＥ ３６を有する大腸菌（Ｅ.
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ８３ ＤＧＢ−００３６）は、微
生物工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−８１３として寄
託されている。
【００２８】本発明のために用いた組換え用プラスミド
は、文献（Ｎａｔｕｒｅ ３１５,５９２（１９８５））
の記載に基づいて製造する。すなわち、ｐＢｍＥ ３６
をＨｉｎｄIIIで処理して多角体蛋白構造遺伝子を含有
する約３.９ｋｂの断片を取り出し、これを市販のプラ
スミドｐＵＣ ９（ファルマシア ＰＬ バイオケミカル
社）に組込み、ＥｃｏＲＩで切断後、Ｂａｌ３１で処理
し、さらにＨｉｎｄIIIで切断する等の操作で多角体蛋
白質遺伝子の全部または一部を有する断片を製造し、ｐ
ＵＣ ９に組込む。 これと別に、フランキング領域を含
むプラスミドを作成し、両者を組合わせてプラスミド
（例えばｐ９８Ｂシリーズのプラスミド）を作ることが
できる。これをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断してｐ
ＵＣ由来の骨格を含む５.３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離
し、これと文献（Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ５
１ １５７３〜１５８０（１９８７））記載のプラスミ
ドｐＢＭ ０３０をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断し
た３.７ｋｂｐのＤＮＡ断片を結合させ、プラスミド
（例えばｐＢＭ ０５０）を作製することができる。
は、文献（Ｎａｔｕｒｅ ３１５,５９２（１９８５））
の記載に基づいて製造する。すなわち、ｐＢｍＥ ３６
をＨｉｎｄIIIで処理して多角体蛋白構造遺伝子を含有
する約３.９ｋｂの断片を取り出し、これを市販のプラ
スミドｐＵＣ ９（ファルマシア ＰＬ バイオケミカル
社）に組込み、ＥｃｏＲＩで切断後、Ｂａｌ３１で処理
し、さらにＨｉｎｄIIIで切断する等の操作で多角体蛋
白質遺伝子の全部または一部を有する断片を製造し、ｐ
ＵＣ ９に組込む。 これと別に、フランキング領域を含
むプラスミドを作成し、両者を組合わせてプラスミド
（例えばｐ９８Ｂシリーズのプラスミド）を作ることが
できる。これをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断してｐ
ＵＣ由来の骨格を含む５.３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離
し、これと文献（Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ５
１ １５７３〜１５８０（１９８７））記載のプラスミ
ドｐＢＭ ０３０をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断し
た３.７ｋｂｐのＤＮＡ断片を結合させ、プラスミド
（例えばｐＢＭ ０５０）を作製することができる。
【００２９】ここで得られるプラスミドに、インフルエ
ンザウイルスのＨＡ遺伝子を有するプラスミド［例え
ば、ＰＥＨ−ＨＡＩ （Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＨ−ＨＡＩとし
て工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−２５８５として寄託されている）］からＨＡ遺
伝子を切り出して組込み、該フラグメントが正しい方向
に挿入されたプラスミドを選択し、組換え用プラスミド
（発現ベクター）とする。
ンザウイルスのＨＡ遺伝子を有するプラスミド［例え
ば、ＰＥＨ−ＨＡＩ （Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＨ−ＨＡＩとし
て工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−２５８５として寄託されている）］からＨＡ遺
伝子を切り出して組込み、該フラグメントが正しい方向
に挿入されたプラスミドを選択し、組換え用プラスミド
（発現ベクター）とする。
【００３０】得られた組換え用プラスミドを用いて組換
えウイルスを製造するには、カイコ樹立細胞ＢＭ−Ｎを
組換え用プラスミドとカイコ核多角体とでコ・トランス
フェクトし、つづいてプラーク法（Ｊ. Ｓｅｒｉｃ. Ｓ
ｏｃ. Ｊｐｎ. ５３ ５４７（１９８４））や希釈法
（Ｊ. Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ. Ｐａｔｈｏｌ ２９ ３０４
（１９７７））等により組換えウイルスを単離し、この
操作を繰り返して組換えウイルスを純化する。
えウイルスを製造するには、カイコ樹立細胞ＢＭ−Ｎを
組換え用プラスミドとカイコ核多角体とでコ・トランス
フェクトし、つづいてプラーク法（Ｊ. Ｓｅｒｉｃ. Ｓ
ｏｃ. Ｊｐｎ. ５３ ５４７（１９８４））や希釈法
（Ｊ. Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ. Ｐａｔｈｏｌ ２９ ３０４
（１９７７））等により組換えウイルスを単離し、この
操作を繰り返して組換えウイルスを純化する。
【００３１】このように純化した組換えウイルスはＢＭ
−Ｎ細胞に感染・増殖させた後、−８０℃に保存する。
この組換えウイルスの細胞感染率（ＴＣＩＤ50）を測
定し、これを組換えウイルスの基液とする。ＢＭ−Ｎ細
胞により増殖されたウイルス液の力価は、細胞感染率
（ＴＣＩＤ50 ）が３.４であり、ウイルスの含量として
は約２×１０7ＰＦＵ／μｌであった。本発明の経口投
与の場合には、これの１０倍希釈液を１個体当り１ｇの
人工飼料に１００μｌ塗布して与えた。
−Ｎ細胞に感染・増殖させた後、−８０℃に保存する。
この組換えウイルスの細胞感染率（ＴＣＩＤ50）を測
定し、これを組換えウイルスの基液とする。ＢＭ−Ｎ細
胞により増殖されたウイルス液の力価は、細胞感染率
（ＴＣＩＤ50 ）が３.４であり、ウイルスの含量として
は約２×１０7ＰＦＵ／μｌであった。本発明の経口投
与の場合には、これの１０倍希釈液を１個体当り１ｇの
人工飼料に１００μｌ塗布して与えた。
【００３２】実 施 例 １ 組換えウイルスの感染試験：組換えウイルスとして上記
方法により調製したＨＡタンパク質遺伝子を保有し、こ
れを発現できるウイルスを用い、被験カイコとしては人
工飼料で飼育した秋光×竜白を用いて組換えウイルスの
感染試験を行った。 すなわち、５齢起蚕時に経過を揃
えた被験カイコ幼虫を１区当り４０頭づつ供試し、それ
ぞれ表１の冷蔵条件で処理した。 即ち、冷蔵温度は２.
５℃、５℃、１０℃、１５℃、冷蔵時間は６時間、１２
時間、２４時間、３６時間とし、これらをそれぞれ組合
せて処理した。 冷蔵処理後、２５℃に戻してからウイ
ルス濃度約２×１０6ＰＦＵ／μｌの組換えウイルス液
を人工試料１ｇ当り１００μｌづつ塗布して添食させ感
染させた。 その後引き続き通常の人工試料を与え、２
５℃の温度条件で飼育を行ない、感染率を調べた。
方法により調製したＨＡタンパク質遺伝子を保有し、こ
れを発現できるウイルスを用い、被験カイコとしては人
工飼料で飼育した秋光×竜白を用いて組換えウイルスの
感染試験を行った。 すなわち、５齢起蚕時に経過を揃
えた被験カイコ幼虫を１区当り４０頭づつ供試し、それ
ぞれ表１の冷蔵条件で処理した。 即ち、冷蔵温度は２.
５℃、５℃、１０℃、１５℃、冷蔵時間は６時間、１２
時間、２４時間、３６時間とし、これらをそれぞれ組合
せて処理した。 冷蔵処理後、２５℃に戻してからウイ
ルス濃度約２×１０6ＰＦＵ／μｌの組換えウイルス液
を人工試料１ｇ当り１００μｌづつ塗布して添食させ感
染させた。 その後引き続き通常の人工試料を与え、２
５℃の温度条件で飼育を行ない、感染率を調べた。
【００３３】また、ウイルス感染から約５日目のカイコ
はＢｍ ＮＰＶによるカイコ特有の病徴、すなわち外観
的には関節部分がくびれるように膨れ、全体に透明色に
なり、あたりを這迴するという病徴を呈し、そのまま放
置するとまもなく死亡するので、死亡前のカイコの体液
を採取して、次の操作によりＨＡ価を測定した。
はＢｍ ＮＰＶによるカイコ特有の病徴、すなわち外観
的には関節部分がくびれるように膨れ、全体に透明色に
なり、あたりを這迴するという病徴を呈し、そのまま放
置するとまもなく死亡するので、死亡前のカイコの体液
を採取して、次の操作によりＨＡ価を測定した。
【００３４】（ Ｈ Ａ 価 測 定 法 ）カイコ１頭当り
１５ｍｌのＰＢＳ（リン酸バッファー）を加え、ホモジ
ナイザーにて磨砕し、さらに超音波磨砕機で時間を限定
し（約１分）磨砕する。次にカイコ磨砕液を３,０００
ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た上清を試料原液とし
た。
１５ｍｌのＰＢＳ（リン酸バッファー）を加え、ホモジ
ナイザーにて磨砕し、さらに超音波磨砕機で時間を限定
し（約１分）磨砕する。次にカイコ磨砕液を３,０００
ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た上清を試料原液とし
た。
【００３５】Ｕ底９６穴プレートで、ＰＢＳを用いて試
料原液の２倍段階希釈を実施し（各ウエルに５０μｌを
入れる）、これに０.５％ニワトリ赤血球浮遊液を５０
μｌ加えて良く振盪する。 室温で１時間反応させた後
に赤血球の凝集を観察する。凝集の観察された最大希釈
倍数をその試料原液のＨＡ価とする。 供試したカイコ
は１区４０頭であり、４回に分け測定しＨＡ価はそれの
平均値を示した。
料原液の２倍段階希釈を実施し（各ウエルに５０μｌを
入れる）、これに０.５％ニワトリ赤血球浮遊液を５０
μｌ加えて良く振盪する。 室温で１時間反応させた後
に赤血球の凝集を観察する。凝集の観察された最大希釈
倍数をその試料原液のＨＡ価とする。 供試したカイコ
は１区４０頭であり、４回に分け測定しＨＡ価はそれの
平均値を示した。
【００３６】 * コントロール： ウイルス濃度２×１０4 PFU／μｌの
組換えウイルス液を１個体当たり５０μｌ、注射により
体腔内に投与した。
組換えウイルス液を１個体当たり５０μｌ、注射により
体腔内に投与した。
【００３７】この結果から、冷蔵処理を行なうことによ
り、経口投与でも組換ウイルスの感染が可能となり、注
射による感染と同じ程度の結果を得ることが判明した。
また、次のようなこともわかった。 （１）２.５℃の低温での長時間処理（３６時間）は餌
の食下量が少なくなるなどの生理障害が見られた。 （２）１０℃では処理時間が長くなるに従い感染効果が
見られる。 （３）１５℃では殆どの感染の効果が見られない。 以 上
り、経口投与でも組換ウイルスの感染が可能となり、注
射による感染と同じ程度の結果を得ることが判明した。
また、次のようなこともわかった。 （１）２.５℃の低温での長時間処理（３６時間）は餌
の食下量が少なくなるなどの生理障害が見られた。 （２）１０℃では処理時間が長くなるに従い感染効果が
見られる。 （３）１５℃では殆どの感染の効果が見られない。 以 上
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/86 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (3)
- 【請求項１】 冷蔵処理したカイコに、目的タンパク質
をコードする遺伝子を組込んだウイルスを経口的に感染
させ、次いでカイコを飼育し、カイコ中から目的タンパ
ク質を採取することを特徴とするカイコからの有用タン
パク質の製造方法。 - 【請求項２】 カイコの冷蔵処理を０〜１０℃で行なう
請求項第１項記載の有用タンパク質の製造方法。 - 【請求項３】 カイコの冷蔵処理を３〜３６時間行なう
請求項第１項記載の有用タンパク質の製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4061521A JPH05227967A (ja) | 1992-02-17 | 1992-02-17 | カイコからの有用タンパク質の製造方法 |
| CA002067837A CA2067837A1 (en) | 1992-02-17 | 1992-05-01 | Process for producing economic protein by using silkworms |
| EP19920107823 EP0556434A3 (en) | 1992-02-17 | 1992-05-08 | Process for economically producing a protein by using silkworms |
| US07/882,542 US5288616A (en) | 1992-02-17 | 1992-05-13 | Process for producing proteins using silkworms infected with recombinant virus |
| GR930300105T GR930300105T1 (en) | 1992-02-17 | 1993-10-29 | Process for economically producing a protein by using silkworms. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4061521A JPH05227967A (ja) | 1992-02-17 | 1992-02-17 | カイコからの有用タンパク質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227967A true JPH05227967A (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=13173485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4061521A Pending JPH05227967A (ja) | 1992-02-17 | 1992-02-17 | カイコからの有用タンパク質の製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5288616A (ja) |
| EP (1) | EP0556434A3 (ja) |
| JP (1) | JPH05227967A (ja) |
| CA (1) | CA2067837A1 (ja) |
| GR (1) | GR930300105T1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002068916A (ja) * | 2000-08-30 | 2002-03-08 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 昆虫の休眠卵誘導剤およびその休眠卵産出方法 |
| WO2015053419A1 (ko) * | 2013-10-08 | 2015-04-16 | 그린테코 주식회사 | 누에 조성물 및 애벌레에 주사액을 주입하는 장치 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995017515A1 (en) * | 1993-12-23 | 1995-06-29 | University Technologies International Inc. | Methods of expressing proteins in insect cells and methods of killing insects |
| JP3660981B2 (ja) * | 2001-10-04 | 2005-06-15 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | カイコへのウイルスの感染率を高める飼料および該飼料を用いたウイルス接種方法 |
| US20110314562A1 (en) * | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Executive Yuan | Insect Infection Method for Production of Proteins |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS619288A (ja) * | 1984-06-21 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
| IL80529A0 (en) * | 1985-11-14 | 1987-02-27 | Daiichi Seiyaku Co | Method of producing peptides |
| US5041379A (en) * | 1987-03-16 | 1991-08-20 | American Biogenetic Science, Inc. | Heliothis expression systems |
| US5017478A (en) * | 1987-07-16 | 1991-05-21 | Berlex Laboratories, Inc. | Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of using |
| US5155037A (en) * | 1989-08-04 | 1992-10-13 | The Texas A&M University System | Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems |
-
1992
- 1992-02-17 JP JP4061521A patent/JPH05227967A/ja active Pending
- 1992-05-01 CA CA002067837A patent/CA2067837A1/en not_active Abandoned
- 1992-05-08 EP EP19920107823 patent/EP0556434A3/en not_active Ceased
- 1992-05-13 US US07/882,542 patent/US5288616A/en not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-10-29 GR GR930300105T patent/GR930300105T1/el unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002068916A (ja) * | 2000-08-30 | 2002-03-08 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 昆虫の休眠卵誘導剤およびその休眠卵産出方法 |
| WO2015053419A1 (ko) * | 2013-10-08 | 2015-04-16 | 그린테코 주식회사 | 누에 조성물 및 애벌레에 주사액을 주입하는 장치 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0556434A2 (en) | 1993-08-25 |
| CA2067837A1 (en) | 1993-08-18 |
| EP0556434A3 (en) | 1993-12-29 |
| GR930300105T1 (en) | 1993-10-29 |
| US5288616A (en) | 1994-02-22 |
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