CN101285072A - 一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法 - Google Patents
一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101285072A CN101285072A CNA2008100385808A CN200810038580A CN101285072A CN 101285072 A CN101285072 A CN 101285072A CN A2008100385808 A CNA2008100385808 A CN A2008100385808A CN 200810038580 A CN200810038580 A CN 200810038580A CN 101285072 A CN101285072 A CN 101285072A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- expression
- baculovirus
- virus
- cell
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程技术领域,具体为一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法。本发明将真核细胞染色质调控元件的DNA序列加入到杆状病毒基因组中目的基因表达框附近,得到改造的病毒。用改造后的病毒感染适当的细胞,在感染后48小时到96小时间,与未改造的病毒载体相比,目的蛋白的表达量明显增加。依不同目的蛋白,不同感染复数,不同蛋白收获时间及不同培养基使用量,目的蛋白表达量增加3~10倍。本发明适用于生产具有天然活性的蛋白质。
Description
技术领域
本发明属基因工程技术领域,具体涉及一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法。
技术背景
杆状病毒是自然界存在的一类天然宿主为鳞翅目和鞘翅目昆虫的病毒,被用作防治农林害虫的生物农药和在昆虫细胞中生产蛋白质的基因工程表达载体。其标准株为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,简称AcMNPV)。
杆状病毒-昆虫细胞表达系统最早由Smith & Summer于1983年建立1,经过20多年的发展现在已经成为了一种最常用的真核细胞表达系统。其基本原理是将目的基因置于杆状病毒超量表达启动子的调控下,使目的基因在感染末期超量表达。杆状病毒感染昆虫细胞时,在感染的极晚期有两个蛋白质可以超量表达:多角体蛋白和p10蛋白。它们对病毒在体外培养细胞中复制都是非必须的,所以可以利用这两个基因的启动子启动目的基因的表达,可以在感染末期高水平地生产所需的蛋白。其主要的优点有2,3:病毒遗传背景清楚;基因容量大,能承载较大目的基因;生物安全性好,天然情况下不能感染人类;表达目的蛋白效率高;可对表达的蛋白进行糖基化修饰;容易扩大规模,达到生产要求。迄今,已经通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功表达了各种目的基因数以千计,例如鸡胃酶解肌球蛋白4、视紫质激酶5、人类beta-干扰素1等。综合其特点,杆状病毒是一种优良的蛋白表达载体,尤其适合于生物工程的酶类,药物类等活性蛋白的大规模生产。但是,杆状病毒载体表达目的基因时,其表达水平与天然的多角体蛋白的表达水平仍有非常大的差距,表明目的蛋白表达水平仍然有较大的提高空间。
染色质调控元件是一类通过调节DNA组蛋白的甲基化、乙酰化,及调节染色质区室化来改变DNA的高级结构,影响DNA的转录活性的序列。其代表包括绝缘子,如鸡的β球蛋白基因HS4绝缘子,果蝇的scs和scs’,gyp绝缘子等。它能阻止异染色质的扩散,以维持被保护基因的持续表达6,7。目前绝缘子序列被广泛应用于血液病和神经系统疾病的基因治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法。
本发明提出的提高杆状病毒表达载体表达目的基因的方法,是在杆状病毒基因组中的适当位置插入真核细胞染色质调控元件的DNA序列。
本发明中,所述适当位置包括邻近目的基因表达框的上游一侧或下游一侧,或上、下游两侧,或其他合适的任何位置。
本发明中,所述的杆状病毒,包括但不限于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)。
本发明中,目的基因表达通过病毒感染细胞进行;其使用的细胞株包括但不限于草地夜蛾细胞系SF9;其表达的目的基因没有限制。
本发明中,所述的染色质调控元件包括但不限于和和绝缘子(insulator)(如鸡的β球蛋白基因HS4绝缘子,果蝇的scs和scs’,gyp绝缘子等),抗抑制子(anti-repressor),
本发明中,所述杆状病毒的构建方法但不限于Bac-To-Bac法等。
本发明插入染色质调控元件的DNA序列,这种序列能够在表观遗传学层面提高目的基因转录的水平,和目的蛋白质合成的水平。本发明将真核细胞染色质调控元件的DNA序列加入到杆状病毒基因组中目的基因表达框附近,得到改造的病毒。用改造后的病毒感染适当的细胞,在感染后48小时到96小时间,与未改造的病毒载体相比,目的蛋白的表达量明显增加。依不同目的蛋白,不同感染复数,不同蛋白收获时间及不同培养基使用量,目的蛋白表达量增加3~10倍。本发明适用于生产具有天然活性的蛋白质
附图说明
图1经改造的杆状病毒基因结构示意图。Ac-EGFP为作为对照的标准的重组杆状病毒,Ac-EGFP-I为插入绝缘子的重组杆状病毒。
图2带有绝缘子的重组杆状病毒Ac-EGFP-I和对照重组杆状病毒Ac-EGFP感染细胞后表达的eGFP蛋白被激发的荧光强度比较。
具体实施方式
1.供体质粒构建:利用基因工程技术将外源目的基因序列插入构建重组杆状病毒专用的转移载体(例如pFastbac-1)上的多克隆位点,使之位于多角体蛋白基因启动子,或p10启动子,或其他合适的启动子的下游。同时,在目的基因表达框上游、下游的特定位置插入染色质调控元件的DNA片段,得到供体质粒。
2.目标病毒获得:将供体质粒上的目的基因表达框和染色质调控元件片段插入到病毒骨架的特定位置,得到重组病毒DNA。具体方法可以采用Bac-to-Bac系统(Invitrogen公司),或通过同源重组、Red重组等各种方法进行。提取重组病毒DNA(方法参照Bac-to-Bac系统),用脂质体转染方法将病毒DNA转入SF9细胞,或其他合适细胞。细胞培养4~6天后,收集细胞培养液,即得到目标病毒。该病毒作为原代病毒液4℃保存备用。也可利用直接在昆虫细胞中进行同源重组的方式,将供体质粒及线性化的病毒骨架DNA共转染细胞,得到目标病毒。
3.病毒扩增及效价测定:用SF9或其他合适的细胞扩增得到第一代病毒,并进一步大量扩增,得到病毒储备液。病毒液用终点稀释法,空斑法,或其他合适的方法测定病毒效价。
4.蛋白生产:根据病毒效价,按细胞数∶病毒=1∶0.01~5的比例将病毒加入培养细胞,27℃静置培养48~96小时,或者摇瓶110转/分钟培养48~96小时。收取蛋白。
应用实例
1.构建供体质粒:利用限制性内切酶SallI酶切egfp和pFastBac-1(Invitrogen公司),利用T4连接酶连接,得到重组质粒pFB-EGFP(图1),经DNA测序鉴定序列的egfp基因插入的方向正确性。然后,用类似方法在egfp基因和SV40polyA信号的下游正向插入鸡β-球蛋白HS4绝缘子,获得供体质粒pFB-EGFP-I(图1)。不含绝缘子的对照病毒的供体质粒pFB-EGFP可作为对照。
2.获得病毒DNA:将供体质粒pFB-EGFP-I和pFB-EGFP分别转化到大肠杆菌DH10Bac(Invitrogen公司),使目的基因表达框转座到AcMNPV杆状病毒DNA骨架,得到重组病毒DNA。
3.获得重组病毒:从大肠杆菌中提取并纯化重组病毒DNA,分别转染Sf9细胞,5天后收获重组病毒。带有绝缘子的重组病毒命名为Ac-EGFP-I,对照病毒命名为Ac-EGFP。分别取2微升初代病毒扩增病毒,并测定病毒效价。
4.表达蛋白:按细胞数∶病毒数1∶1的比例将病毒加入培养的SF9细胞中,27℃静置培养72小时,测定带有绝缘子的杆状病毒Ac-EGFP-I和对照病毒Ac-EGFP感染细胞后表达的eGFP蛋白被激发的荧光强度,结果如图2所示。
参考文献:
1.Smith MD.Production of human beta interferon in insect cell infectedwith baculovirus express vectors.Mol Cell Biol 1983,3:2156-2165。
2.Miller LK.Baculovirus as gene expression vectors.Ann Rev microbial1981,42:177-199。
3.Maeda S.Expression of foreign genes in insects using baculovirus vector.Ann Rev Entomol 1989,34:351-372。
4.Onishi H,Maeda K,Maeda Y,Inoue A,Fujiwara K.Functional ChickenGizzard Heavy Meromyosin Expression in and Purification from Baculovirus-InfectedInsect Cells.Proc Natl Acad Sci USA 1995,92:704-708。
5.Cha K,Bruel C,Inglese J,Khorana HG.Rhodopsin kinase Expression inbaculovirus-infected insect cells,and characterization of post-translationalmodifications.Proc Natl Acad Sci USA 1997,94:10577-10582。
6.章波,刘昕.染色质隔离子研究进展.遗传,2004,26:551-555。
7.Emily J K,Pamela K G.Genomic insulators:connecting properties tomechanism.Curr Opin Cell Biol,2003,15:259-265。
Claims (4)
1. 一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法,其特征在于在杆状病毒基因组中的适当位置插入真核细胞染色质调控元件的DNA序列。
2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。
3. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的目的基因表达通过病毒感染细胞进行;其使用的细胞株为草地夜蛾细胞系SF9。
4. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的染色质调控元件为绝缘子或抗抑制子;染色质调控元件在杆状病毒基因组中插入的位置为邻近目的基因表达框的上游一侧或下游一侧,或上下游两侧。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2008100385808A CN101285072A (zh) | 2008-06-05 | 2008-06-05 | 一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2008100385808A CN101285072A (zh) | 2008-06-05 | 2008-06-05 | 一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101285072A true CN101285072A (zh) | 2008-10-15 |
Family
ID=40057484
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2008100385808A Pending CN101285072A (zh) | 2008-06-05 | 2008-06-05 | 一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101285072A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013096056A1 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Danisco Us Inc. | Improving fungal gene expression using insulator dna sequences |
CN104293737A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-01-21 | 太原博奥特生物技术有限公司 | 一种包含表达功能性重组人凝血因子ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法 |
CN106636207A (zh) * | 2016-09-22 | 2017-05-10 | 西北农林科技大学 | 一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体 |
CN110387385A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-10-29 | 西北农林科技大学 | 一种新型杆状病毒表达载体 |
-
2008
- 2008-06-05 CN CNA2008100385808A patent/CN101285072A/zh active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013096056A1 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Danisco Us Inc. | Improving fungal gene expression using insulator dna sequences |
CN104293737A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-01-21 | 太原博奥特生物技术有限公司 | 一种包含表达功能性重组人凝血因子ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法 |
CN104293737B (zh) * | 2014-09-16 | 2017-06-13 | 太原博奥特生物技术有限公司 | 一种包含表达功能性重组人凝血因子ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法 |
CN106636207A (zh) * | 2016-09-22 | 2017-05-10 | 西北农林科技大学 | 一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体 |
CN110387385A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-10-29 | 西北农林科技大学 | 一种新型杆状病毒表达载体 |
CN110387385B (zh) * | 2019-07-18 | 2022-07-15 | 西北农林科技大学 | 一种杆状病毒表达载体 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104788554B (zh) | 猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用 | |
CN100410383C (zh) | 一种昆虫杆状病毒生物反应器的制备方法 | |
Bowers et al. | Expression of vhs and VP16 during HSV-1 helper virus-free amplicon packaging enhances titers | |
Xiang et al. | The Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) ODV-E56 envelope protein is also a per os infectivity factor | |
CN106987603B (zh) | 一种重组腺相关病毒的制备方法 | |
Palmberger et al. | MultiBac turns sweet | |
CN104059927B (zh) | 鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品 | |
CN101285072A (zh) | 一种提高杆状病毒表达载体表达目的基因水平的方法 | |
D'Adamo et al. | Prospects for viruses infecting eukaryotic microalgae in biotechnology | |
CN104130977A (zh) | 一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用 | |
Liu et al. | Gene delivery and gene expression in vertebrate using baculovirus Bombyx mori nucleopolyhedrovirus vector | |
CN102286534B (zh) | 表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用 | |
CN102994550B (zh) | 在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法 | |
CN110218726A (zh) | 一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA及其用途 | |
CN103923940A (zh) | 一种定点整合外源基因的方法 | |
Kim et al. | Generation of recombinant viral hemorrhagic septicemia virus (rVHSV) expressing two foreign proteins and effect of lengthened viral genome on viral growth and in vivo virulence | |
Amer | Baculovirus expression vector system: An efficient tool for the production of heterologous recombinant proteins | |
CN101519664B (zh) | 一种重组腺病毒载体制备转基因动物的方法 | |
CN107384919B (zh) | 一种抑制核型多角体病毒的方法 | |
CN104761624A (zh) | 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法及其制品 | |
CN112359064B (zh) | 甲基-β-环糊精在提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率中的应用 | |
JP2007159406A (ja) | 多様なバキュロウイルス種によるタンパク質生産が可能なカイコ系統 | |
JP6964843B2 (ja) | バイナリー遺伝子発現システム | |
Ramachandran et al. | The bountiful and baffling baculovirus: The story of polyhedrin transcription | |
CN114292878B (zh) | 一种Ac68-72敲除的杆状病毒表达载体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081015 |