CN104761624A

CN104761624A - 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法及其制品

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Publication number: CN104761624A
Application number: CN201510199796.2A
Authority: CN
Inventors: 胡小元; 李轶女; 张志芳; 李田田; 杨鑫; 易咏竹; 吕言娜; 王智权
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2035-04-23
Also published as: CN104761624B

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法及其制品。本发明将鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因和VP2基因进行优化。本发明进一步将优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或VP2基因在家蚕生物反应器中进行表达。本发明还公开了一种鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的制备方法，包括：将优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或VP2基因克隆到哺乳动物启动子控制的杆状病毒转移载体中，与杆状病毒重组感染昆虫宿主，在昆虫宿主中呈递外源基因，制备得到核酸疫苗。用所表达的抗原制备疫苗免疫动物或将核酸疫苗经过注射或者口服免疫动物，均能为动物提供有效的免疫保护。

Description

鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法及其制品

技术领域

本发明涉及鸡传染性法氏囊病病毒抗原，尤其涉及利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内表达传染性法氏囊病病毒抗原的方法及其制品，本发明还涉及利用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中制备鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的方法，属于鸡传染性法氏囊病病毒抗原及核酸疫苗的制备领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种急性接触传染性疾病。

目前，预防IBD的主要疫苗为弱毒苗和灭活苗。但是，随着IBDV变异株和超强毒株的出现，经常导致免疫失败，因此开发新的疫苗成为必然。在过去的几十年，许多研究人员已经利用大肠杆菌、禽痘病毒、重组火鸡疱疹病毒(HVT)、毕赤酵母、植物等多种表达系统研制基因工程疫苗。但是当前应用这些表达系统存在一些缺陷，其中大肠杆菌表达的VP2蛋白多以包涵体形式存在，不可溶，必须经过变性复性，但IBDV核衣壳蛋白的抗原表位具有构像依赖性，变性的结构蛋白对鸡没有保护性，变性再复性的VP2也失去了诱导鸡产生中和抗体的能力。重组活载体疫苗不但存在实验室和生产过程中的安全问题，与普通活疫苗一样发生基因突变、重组的几率也相对较高。利用转基因植物生产IBDV疫苗，其表达量不高，实验操作过程繁琐。因此，选择一种合适的表达系统研制高效、安全、经济的新型IBD疫苗成为研究人员共同努力的方向。

杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群，发现最早、研究最多、实用性最强的昆虫病毒。昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)自1983年问世以来(Smith et al.,1983)，由于其具有高效表达、安全、易操作等特点，已经成为研究和生产各种原核、真核蛋白的有力工具。

因此，利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达传染性法氏囊病病毒抗原以及制备传染性法氏囊病核酸疫苗，将为鸡传染性法氏囊病新的基因工程疫苗的生产奠定良好的基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内高效的表达鸡传染性法氏囊病病毒抗原以及制备鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了优化后的鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal diseasevirus)VP2/4/3多聚蛋白基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示；

优化后的鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus)VP2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

本发明分析了近些年流行的24条IBDV(Infectious bursal disease virus)毒株的多聚蛋白序列，利用OptimumGene^TM技术对VP2/4/3蛋白基因序列进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变，共获得4条优化后的序列，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

本发明优化获得的SEQ ID NO.3所示序列，使密码子适应指数(Condon AdaptionIndex,CAI)由原来的0.84变成0.87；基因序列的GC含量降低，由原来的53.72％变成50.51％，使多聚蛋白基因在家蚕中的转录效率与翻译效率有了较大的提高。为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列AAC，将终止密码子改为TAA，提高了翻译终止效率。此外，去除了基因序列内部的BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ等限制性酶切位点，在基因上游加上了EcoR Ⅰ和BamHⅠ，在基因下游加上了Pst Ⅰ限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体中。

本发明将优化后的VP2/4/3-O基因序列(SEQ ID NO.3所示)在家蚕生物反应器中进行可溶性表达，ELISA检测表明，优化后的VP2/4/3-O基因在家蚕中表达量高比IBDV-VP2/4/3基因原始序列在家蚕中表达量高出2-3倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。对优化后的SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7所示序列进行相同的基因操作，均获得了在蚕体内或蛹内扩增，但表达效率均低于SEQ ID NO.3所示序列。

本发明以优化的VP2/4/3-O基因序列为模板，扩增VP2-O基因(SEQ ID NO.4所示)并在家蚕生物反应器中进行表达，ELISA检测结果表明，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应，表明VP2-O基因在家蚕中的表达量比原始序列在家蚕中的表达量要高。

本发明还公开了含有所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达载体以及含有所述表达载体的宿主或宿主细胞。

本发明进一步公开了一种鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别将鸡传染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因、原始VP2基因、优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；

(2)将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；

(3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的抗原，纯化，即得。

本发明还公开了一种鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别将鸡传染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因、原始VP2基因、优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因克隆到哺乳动物启动子控制的杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；

(3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，在昆虫宿主或细胞中呈递外源基因，制备得到核酸疫苗。

本发明所述哺乳动物启动子选自CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人leukosialin基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶l基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子或鼠乳房瘤病毒启动子；优选为CAG启动子。

本发明所述鸡传染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述原始VP2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述杆状病毒转移载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF 8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP 25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC 3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030或pUAC-5；优选pVL1393；

所述杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、SpltNPV或家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid；优选为家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid；

所述昆虫宿主选自家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthiapryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantriadispar)；优选为家蚕(Bombyx mori)；

所述感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选为，将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种鸡传染性法氏囊病毒抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹最优为1-2天的早期嫩蛹。

本发明所构建的重组转移载体包括：含有鸡传染性法氏囊病毒VP2/4/3多聚蛋白基因原始序列的载体pVL1393-IBDV-VP2/4/3；含有鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白基因原始序列的载体pVL1393-IBDV-VP2；含有鸡传染性法氏囊病毒VP2/4/3多聚蛋白基因密码子优化后序列的载体pVL1393-IBDV-VP2/4/3-O；含有优化后VP2/4/3基因序列的载体pVLCAG1393-IBDV-VP2/4/3-O；含有优化后VP2基因序列的载体pVLCAG1393-IBDV-VP2-O。

本发明所获得的重组杆状病毒包括：重组家蚕核型多角体病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)、rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3-O)、rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2)、rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2-O)、rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2/4/3-O)、rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2-O)。

本发明方法所制备的鸡传染性法氏囊病病毒抗原能够用于制备预防或治疗鸡传染性法氏囊病的药物或试剂，为动物提供有效免疫保护。

本发明将鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白原始序列(SEQ ID NO.1所示)、VP2蛋白原始序列(SEQ ID NO.2所示)分别在家蚕生物反应器中表达，ELISA检测结果表明IBDV-VP2/4/3基因、IBDV-VP2基因在家蚕中表达量高，在1600倍稀释度下抗原与抗体的仍然呈现阳性反应。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到48kDa大小的特异性条带。动物实验结果表明，IBDV-VP2/4/3或IBDV-VP2样品组的中和抗体效价为1：810以上，保护率为80％。

本发明将鸡传染性法氏囊病毒优化后的IBDV-VP2/4/3-O序列(SEQ ID NO.3所示)或优化后的IBDV-VP2-O序列(SEQ ID NO.4所示)在家蚕生物反应器中表达，动物实验结果表明，IBDV-VP2/4/3-O样品组的中和抗体效价达到1：2430以上，保护率为90％以上。

本发明所制备的鸡传染性法氏囊病核酸疫苗经注射或者口服免疫动物能够达到免疫保护的效果，能够应用于制备预防或治疗鸡传染性法氏囊病的药物或试剂。

本发明将鸡传染性法氏囊病病毒多聚蛋白优化后的序列IBDV-VP2/4/3-O(SEQID NO.3所示)或优化后的IBDV-VP2-O序列(SEQ ID NO.4所示)在家蚕生物反应器中进行扩增，制备核酸疫苗。动物实验结果表明，IBDV-VP2/4/3-O或IBDV-VP2/4/3-O核酸样品组的中和抗体效价不少于1：7290，保护率为100％；对照组发病率达到80％以上。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明成功实现了利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和VP2/4/3多聚蛋白。通过密码子优化使VP2/4/3多聚蛋白和VP2蛋白的表达量明显提高；尤其VP2/4/3多聚蛋白的表达产量比优化前提高4倍，中和抗体效价提高3倍以上。本发明还将优化后的VP2/4/3多聚蛋白基因或VP2蛋白基因在家蚕生物反应器中进行呈递，制备得到核酸疫苗，所制备的核酸疫苗可使免疫动物的中和抗体提高到1：7290，攻毒保护率达到90％以上。本发明采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达鸡传染性法氏囊病病毒抗原制备基因工程蛋白疫苗或制备核酸疫苗，具有经济、安全、高效、安全性好，免疫效果好等优点。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。

术语“转染”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

附图说明

图1为转移载体pVL1393示意图；

图2为真核表达优化后IBDV多聚蛋白和IBDV VP2蛋白基因产物的Western-blot分析；其中，M：蛋白分子质量标准；1：表达IBDV-VP2/4/3-O蚕血淋巴样品；2：表达IBDV-VP2-O蚕血淋巴样品；3：蚕血淋巴阴性对照；

图3为IBDV类病毒粒子电镜图；其中，A：IBDV VLPs电镜图；B、C、D：金标二抗标记的IBDV VLPs电镜图；标尺：200nm；

图4为转移载体pVLCAG-1393示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、实验材料

(1)菌株、病毒株与载体：原核表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌TOP10菌株、原核表达菌株BL21(DE3)、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid(专利申请号为：201110142492.4，申请公布号CN 102286534A)、家蚕品种JY1均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；转移载体pVL1393购自于Invitrogen公司；克隆载体pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司；

(2)IBDV VP2/4/3多聚蛋白和VP2蛋白基因序列：鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因的原始序列是从发病动物病灶组织中提取并克隆到pMD18-T载体上得到；原始的VP2基因序列是以原始VP2/4/3基因序列为模板扩增得到的；

(3)酶与试剂：限制性内切酶、T4DNA连接酶及所对应的缓冲液均购自Promega公司；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech公司产品；2K PlusⅡDNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自MBL公司；DEPC、M-MLV-Rtase(逆转录酶)购自Promega公司；

(4)生化试剂：Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素(Kanamycin)购自Sigma公司；bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal购自Promega公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0.2um、0.45um滤器购自Gelman Sciences公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；Ni-NTA Agarose、Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；牛血清白蛋白购自罗氏公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。引物合成与基因测序均由北京擎科新业生物技术有限公司完成；

(5)培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自AppliChem公司；

(6)鸡传染性法氏囊病病毒基因工程蛋白疫苗和核酸疫苗的动物实验在隔离实验室进行。

实施例1鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白原始序列在家蚕生物反应器中的表达及检测

1有关溶液和培养基的配置

有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Joseph et al.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998)。

2鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因原始序列获得

2.1总RNA的提取

取一定量鸡病灶组织于1mL Trizol试剂中，充分研磨，室温静置10min；加入200μL氯仿，涡旋震荡15s，室温静置5min；4℃，12000rpm离心15min；取上层水相于新的EP管中，加入500μL异丙醇，冰浴10min；4℃，12000rpm离心10min；沉淀用70％乙醇洗一次，4℃，12000rpm离心5min；室温晾干沉淀，加入适量DEPC处理的双蒸水或去离子甲酰胺中，-20℃保存备用。

2.2扩增目的基因的引物

设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出VP2/4/3原始序列。所设计反转录特异引物为：IBDV-RT：5'-TCAAGAGACAGCCCTGATCC-3'。

扩增VP2/4/3多聚蛋白基因的原始序列的引物为：IBDV-VP2/4/3-F和IBDV-VP2/4/3-R。

表1引物序列

2.3RT-PCR反应

2.3.1cDNA第一链合成

取2μL RNA(≤1μg)，加2μL IBDV-RT，加13.75μL DEPC处理水，充分混匀后于70℃反应5min，迅速冰浴5min；加入5μL 5×M-MLV buffer，1.25μL 10mMdNTPs，1μL M-MLV-RT(200U)，使终体积为25μL，混匀后室温放置10min；42℃反应1h；70℃灭活2min RTase，-20℃保存备用。

2.3.2IBDV VP2/4/3的PCR扩增

PCR反应体系为：

PCR参数设置：

2.4玻璃奶纯化回收DNA片段

配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下含有单一的目的核酸条带的凝胶，放入1.5mL的离心管中，称重，加三倍体积的6M NaI，放于37℃恒温培养箱中融化；向已经完全融化的溶液中加8μL Glassmilk，混匀，冰浴5min，中间摇匀两次；8000rpm离心10s，弃掉上清；加800μL New Wash洗涤，轻轻弹起后离心，重复2次；弃去上清，将离心管放37℃恒温培养箱干燥2～3min；干燥后加20μL 0.1×TE溶解，混合充分溶解DNA，12000rpm离心5min，取上清立即用于连接，其余放-20℃保存。

2.5感受态细胞的小量制备

制备大肠杆菌Top10感受态细胞，－80℃保存。

2.6IBDV VP2/4/3与pMD-18T载体的连接与转化

2.6.1连接

将回收纯化的PCR产物与T载体pMD-18T连接。取3μL Solution I、2.5μL回收纯化的PCR扩增产物和0.5μL pMD18-T，加到PCR管中，轻轻弹起混匀，5000rpm离心10s，在16℃连接30min。

2.6.2转化

取－80℃保存的感受态细胞，快速融化一半，加入上述连接产物3μL，冰上放置半小时；42℃恒温水浴锅中放置90s，迅速置于冰上3～5min；向管中加入适量的1mLLB培养基，37℃恒温培养箱中静置培养60min；离心，弃去大部分上清，留200μL涂布于LB平板(100μg/mL Amp)上，37℃恒温培养箱正置培养30min，后倒置培养过夜。

2.7核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

挑取LB平板上的单菌落，接种于LB液体培养基(100μg/mL Amp)中，置于37℃恒温震荡培养器中，设置转速为220rpm，过夜培养；取500μL菌液于离心管内，收集菌体；加入30μL Loading Buffer和20μL酚/氯仿(1:1)，用涡旋震荡器充分混匀，使菌体重悬；12000rpm离心3min，取8μL上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时以同样方法处理的空载体作为对照。凝胶成像系统的紫外灯下观察条带，选取质粒带明显退后的菌液提取质粒。

2.8SDS碱裂解法提取质粒DNA

收集3mL菌液于离心管中，SDS碱裂解法提取质粒DNA，-20℃保存备用。

2.9阳性克隆的酶切与测序鉴定

酶切体系如下：

37℃反应2h后，取7μL用1％的琼脂糖进行电泳检测。酶切检测正确的质粒DNA，送北京擎科新业生物技术有限公司测序，结果如SEQ ID NO.1所示，得到的重组质粒命名为pT-IBDV-VP2/4/3。

3传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因原始序列在家蚕生物反应器中的可溶性表达

3.1重组杆状病毒转移载体pVL1393-IBDV-VP2/4/3的构建

3.1.1IBDV-VP2/4/3目的片段的获得

测序正确的重组质粒pT-IBDV-VP2/4/3用限制性内切酶Bgl Ⅱ和Xba Ⅰ进行双酶切获得目的片段IBDV-VP2/4/3基因。酶切体系如下：

37℃酶切反应2h后用琼脂糖凝胶电泳分离后，用玻璃奶法回收目的片段。

3.1.2酶切处理pVL1393

用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ对转移载体pVL1393进行分部酶切，pVL1393的示意图如图1，首先用限制性内切酶BamH Ⅰ，进行酶切2h，取产物琼脂糖电泳检测，呈现单一条带且大小正确后，沉淀DNA，加入另一个限制性内切酶Xba Ⅰ酶切3h，65℃灭活15min，保存于－20℃备用。

3.1.3IBDV-VP2/4/3目的片段与酶切处理pVL1393的连接

酶切回收的IBDV-VP2/4/3目的片段与经BamH Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切处理后的转移载体pVL1393的连接。用T4DNA连接酶，16℃，连接过夜。连接体系如下：

3.1.4重组质粒的转化与鉴定

参照2.6.2中的转化方法将连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，核酸快速抽提法粗筛阳性克隆，提取质粒，基因测序，鉴定正确的重组质粒命名为pVL1393-IBDV-VP2/4/3。

3.2家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用ORF1629缺损的家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid(专利申请号为：201110142492.4)感染对数生长期的细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。

3.3重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)的构建和获得

接种大约1×10⁶细胞于15cm²培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBcmid DNA，2μg重组转移质粒pVL1393-IBDV-VP2/4/3和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)。

3.4重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)。

3.5重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA，引物为IBDV-VP2/4/3-F和IBDV-VP2/4/3-R。

取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、58℃1min、72℃3min，30个循环，最后72℃延伸10min。取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。

3.6IBDV-VP2/4/3在家蚕体和蚕蛹中的表达

所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵pfu rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)，4～5d后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。

3.7IBDV-VP2/4/3类病毒颗粒的收集与纯化

将含表达有IBDV-VP2/4/3的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1：9)在匀浆器中研磨后，用0.45um滤器过滤。在30％蔗糖溶液中，1.5×10⁵g超高速离心2h。用含0.1MNaCl的Tris-HCl(pH 7.0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交换层析填料SP(GE公司)，0.5M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)洗脱。再通过分子筛层析S200(GE公司)。纯度可达95％，得率可达40％以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白在高浓度下是可以自组装成类病毒颗粒，而且还建立了相应的家蚕表达基因工程鸡传染性法氏囊病病毒类病毒颗粒抗原的纯化方法。

4表达产物的检测

4.1ELISA及Western blotting检测

将重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3)注射家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测IBDV-VP2/4/3抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，以实施例3原核表达的His-VP2A蛋白免疫小鼠后的血清为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。任取所收蚕血中的样品，用包被液做梯度稀释，进行2倍倍比稀释(1：100～1：6400)，每个梯度处做复孔检测，计算时取平均值，各取100μL包被到酶标板上。结果如表2，表明IBDV-VP2/4/3基因在家蚕中表达量高，在1600倍稀释度下抗原与抗体的仍然呈现阳性反应。

表2ELISA检测家蚕生物反应器表达的IBDV-VP2/4/3蛋白

4.2Western blotting检测

将重组病毒感染的家蚕血淋巴用PBS(pH 7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用PBST配制3％BSA封闭，原核表达的His-VP2A蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(1:1000稀释)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000稀释)，最后用DAB(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止，检测结果。

Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到48kDa大小的特异性条带。

4.3动物免疫实验

将表达IBDV-VP2/4/3多聚蛋白的蚕蛹分制成100羽份/g蚕蛹剂量的疫苗。

制备方法为：称取10g表达IBDV多聚蛋白的蚕蛹，加入90ml PBS缓冲液，搅拌器搅拌5～10min使其充分混匀，制备成母液放入灭菌瓶中。206佐剂事先灭菌后放到30℃保温箱中保温。母液先放在冰上，与佐剂混合时，先在15ml离心管中加佐剂3ml，慢慢滴加母液3ml，用匀浆器匀浆3min。加入盐酸环丙沙星，使用量为30～50mg/1kg鸡体重。疫苗呈乳白色，检测疫苗质量时可取出少量，3000rpm离心15min，疫苗不分层即为合格。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。

取21日龄的SPF鸡30只，10只各颈背部皮下注射疫苗1羽份(0.2ml)。10只接种健康蚕蛹疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组。接种30日后，采用翅下静脉采血，采2ml左右，放试管中倾斜放置，37℃静置2h后，转至室温过夜。将血清转移至离心管中，2000rpmin，10min，收集血清，检测鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体，阴性蚕蛹免疫组和正常对照组的中和抗体效价为1：30左右，而IBDV-VP2/4/3样品组的中和抗体效价为1：810以上。

在取血的同时进行攻毒实验，IBDV-VP2/4/3样品组无鸡传染性法氏囊病典型症状，而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组均出现IBD典型症状，精神沉郁，采食量和饮水量减少，有些自啄肛门，排白色水样稀粪，重者脱水，卧地不起，极度虚弱。三天后剖检IBDV-VP2/4/3样品组的法氏囊正常，保护为80％，而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组法氏囊肿大，表面有出血点或出血带，有胶冻状物质，发病率达到80％以上。

实施例2鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白原始序列在家蚕生物反应器中的表达及检测

1有关溶液和培养基的配置

有关溶液和培养基的配置方法同实施例1。

2鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白原始序列的扩增与连接T载体

以实施例1所得到的pT-IBDV-VP2/4/3质粒为模板，设计特异性引物对IBDV-VP2蛋白的基因序列进行扩增，上游引物同IBDV-VP2/4/3-F，下游引物为IBDV-VP2-R：5'-GATCTAGATTACCTCCGTAGGGCCCGGATTATG-3'，引入Xba Ⅰ限制性酶切位点。按照如下PCR扩增体系和参数对VP2目的序列进行扩增。

PCR反应体系为：

PCR参数设置：

配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳分析，用实施例1中的方法，用玻璃奶纯化回收IBDV-VP2目的片段，然后连接克隆载体pMD-18T，用核酸快速抽提法粗筛阳性克隆，经过测序，结果如SEQ ID NO.2所示，得到的重组质粒命名为pT-IBDV-VP2。

3鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白原始基因序列在家蚕生物反应器中的可溶性表达

3.1重组杆状病毒转移载体pVL1393-IBDV-VP2的构建

3.1.1IBDV-VP2目的片段的获得

测序正确的重组质粒pT-IBDV-VP2用限制性内切酶Bgl Ⅱ和Xba Ⅰ进行双酶获得目的片段IBDV-VP2基因。酶切体系如下：

37℃酶切反应2h，后用琼脂糖凝胶电泳分离后，用玻璃奶法回收目的片段。

3.1.2酶切处理pVL1393

用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ对转移载体pVL1393进行分部酶切，首先用限制性内切酶BamH Ⅰ，进行酶切2h，取产物琼脂糖电泳检测，呈现单一条带且大小正确后，沉淀DNA，加入另一个限制性内切酶Xba Ⅰ酶切3h，65℃灭活15min，保存于－20℃备用。

3.1.3IBDV-VP2目的片段与酶切处理pVL1393的连接

酶切回收的IBDV-VP2目的片段与经BamH Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切处理后的转移载体pVL1393的连接。用T₄DNA连接酶，16℃，连接过夜。连接体系如下：

3.1.4重组质粒的转化与鉴定

参照实施例1中的转化方法将连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，核酸快速抽提法粗筛阳性克隆，提取质粒，基因测序，鉴定正确的重组质粒命名为pVL1393-IBDV-VP2。

3.2家蚕核型多角体病毒亲本株BmBcmid的繁殖及病毒DNA的制备

具体方法同实施例1。

3.3重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2)的构建和获得

具体方法同实施例1。

经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2)。

3.4重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2)。

3.5重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。引物为IBDV-VP2/4/3-F和IBDV-VP2-R。

3.6IBDV-VP2在家蚕体和蚕蛹中的高效表达

具体方法同实施例1，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2)，4～5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。

4表达产物的检测

4.1ELISA及Western blotting检测

将重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2)注射家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测IBDV-VP2抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血淋巴作为阴性对照，用实施例3中原核表达的IBDV-VP2A蛋白免疫小鼠后制备的多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。任取所收蚕血中的样品，用包被液做梯度稀释，进行2倍倍比稀释(1：50～1：6400)，每个梯度处做复孔检测，计算时取平均值，各取100μL包被到酶标板上。结果如表3，在1600倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应，表明IBDV-VP2基因在家蚕中得到成功表达。

表3ELISA检测家蚕生物反应器表达的IBDV-VP2蛋白

4.2Western blotting检测

方法同实施例1，结果表明在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的上清液中可检测到48kDa大小的特异性条带。

4.3动物免疫实验

按照实施例1的方法制备疫苗将表达IBDV-VP2蛋白的蚕蛹按100羽份/g蚕蛹的剂量制备疫苗。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。

取21日龄的SPF鸡30只，10只各颈背部皮下注射疫苗1羽份(0.2ml)。10只接种健康蚕蛹疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组。接种30日后，采用翅下静脉采血，收集血清，检测鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体，阴性蚕蛹免疫组和正常对照组的中和抗体效价为1：30左右，而IBDV-VP2样品组的中和抗体效价为1：810以上。

在取血的同时进行攻毒实验，IBDV-VP2样品组无鸡传染性法氏囊病典型症状，而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组均出现IBD典型症状，精神沉郁，采食量和饮水量减少，有些自啄肛门，排白色水样稀粪，重者脱水，卧地不起，极度虚弱。三天后剖检IBDV-VP2样品组的法氏囊正常，保护为80％，而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组法氏囊肿大，表面有出血点或出血带，有胶冻状物质，发病率达到80％以上。

实施例3鸡传染性法氏囊病毒多聚蛋白优化后的序列VP2/4/3-O在家蚕生物反应器中的表达及检测。

1有关溶液和培养基的配置

有关溶液和培养基的配置方法同实施例1。

2IBDV-VP2/4/3序列的筛选、优化与合成

选取了近些年流行的24条IBDV毒株的多聚蛋白序列，包括8株超强毒株(GenBank登陆号为JF907702.1,X92760,AY444873.3,AF322444.1,ABI52866.1,JQ403646.1,JF907703.1,AF092943.1)、8株变异毒株(GenBank登陆号为D00867.1,EF418033.1,AY368653.1,JQ411012.1、AF321055.1,AF051837.1,EU595671.1,EU595672.1)、5株经典毒株(GenBank登陆号为D00869,X16107,X84034,D00499,AY319768.2)与3株疫苗毒株(GenBank登陆号为DQ906921.1,DQ403248.1,AF499929.1)。由于IBDV在自然环境中容易变异，加上一些毒力较强的活疫苗的使用，其流行趋势经历了一个由弱毒株向强毒株发展的过程。对24条多聚蛋白序列进行比对分析，发现在多聚蛋白的222位氨基酸残基有从脯氨酸到丙氨酸的变化趋势，在此位点本发明选择了丙氨酸。另外对IBDV多聚蛋白的全部蛋白序列进行分析，在242位、253位、256位、279位、284位、299位、330位等位点用同样的方法进行筛选，得到了强毒流行株病毒的多聚蛋白同感序列。

利用OptimumGene^TM技术对同感序列进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高多聚蛋白基因在家蚕中的转效率录与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。优化后的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

多聚蛋白基因序列根据家蚕(Bombyx mori)物种的密码子偏好性进行优化，优化后的SEQ ID NO.3所示序列的密码子适应指数(Condon Adaption Index,CAI)由原来的0.84变成0.87；基因序列的GC含量降低，由原来的53.72％变成50.51％，有利于提高mRNA的翻译效率。为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因序列前面加了Kozak序列AAC，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA；此外，还去除了基因序列内部的BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ等限制性酶切位点，在基因上游加上了EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ，在基因下游加上了Pst Ⅰ限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pVL1393中，合成的序列(SEQ ID NO.3所示)克隆到了pUC57-Simple载体中，命名为pUCS-IBDV-VP2/4/3-O。

3鸡传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因优化后序列VP2/4/3-O在家蚕生物反应器中的可溶性表达

3.1重组杆状病毒转移载体pVL1393-IBDV-VP2/4/3-O的构建

3.1.1目的产物的获得

先用pUC57-simple载体上的限制性内切酶Sca Ⅰ进行酶切，体系如下：

酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳检测是单一条带后，用2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，再用限制性内切酶BamH Ⅰ和Pst Ⅰ进行双酶切，37℃酶切3h，体系如下：

3.1.2酶切产物的回收

用1％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，用实施例1所述玻璃奶法回收大小约为3000bp的目的片段，溶于0.1×TE(pH 8.0)中。

3.1.3酶切载体的获得

用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ两个限制性核酸内切酶对转移载体pVL1393进行分部酶切，-20℃保存备用。

3.1.4VP2/4/3-O目的片段与载体连接

酶切回收的目的片段IBDV-VP2/4/3-O(SEQ ID NO.3所示)与BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切后的转移载体pVL1393的连接。用T₄DNA连接酶，于16℃连接过夜。连接体系如下：

3.1.5重组质粒的转化与鉴定

参照实施例1中的转化方法将连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，按照核酸快速抽提法粗筛阳性克隆，提取质粒，基因测序，鉴定正确的重组质粒命名为pVL1393-IBDV-VP2/4/3-O。

3.2家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

同实施例1。

3.3重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3-O)的构建和获得

同实施例1。

3.4重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3-O)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3-O)感染正常生长的Bm-N细胞，培养3d后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3-O)。

3.5重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法同实施例1。

寡核苷酸引物为：按优化的VP2/4/3-O基因序列内部设计两条引物鉴定序列：

VP2/4/3-O-F：5'-ATGACCAATCTTCAGGACCAGAC-3'；

VP2/4/3-O-R：5'-TCGCCTCCAATACTCAGCGAGGT-3'。

取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、58℃1min、72℃1min，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，有相应的目的条带，结果证明获得了重组病毒。

3.6.IBDV-VP2/4/3-O在家蚕蛹和蚕体中高效表达

方法同实施例1，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵pfurBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3-O)，4～5d后收集发病蚕蛹和取蚕血淋巴，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。

3.7IBDV-VP2/4/3-O类病毒颗粒的收集与纯化

方法同实施例1，纯度可达95％，得率可达40％以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白是可溶的，而且还建立了相应的家蚕表达基因工程鸡传染性法氏囊病疫苗的纯化方法。

4鸡传染性法氏囊病毒衣壳蛋白检测抗体的制备

4.1IBDV-VP2蛋白部分序列IBDV-VP2A的扩增

以优化合成后的pUCS-IBDV-VP2/4/3-O为模板，设计特异性引物扩增VP2蛋白的在N-端主要抗原决定区33～202aa氨基酸残基区段，在引物的上下游分别加入BamH Ⅰ和HindⅢ限制性酶切位点，特异性引物为：

(1)PCR反应体系：

(2)PCR参数设置：

4.2构建重组载体pET28a-IBDV-VP2A

玻璃奶法纯化回收PCR扩增产物，与克隆载体pMD18-T连接，参照实施例1中的转化方法将连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，按照核酸快速抽提法粗筛阳性克隆，碱裂解法提取重组质粒，用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的重组质粒进行DNA测序验证，阳性克隆命名为pMD18T-IBDV-VP2A。

4.3构建重组表达载体pET28a-IBDV-VP2A

鉴定正确的阳性重组pMD18T-IBDV-VP2A用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切，用玻璃奶法回收酶切产物，将其克隆到表达载体pET-28a的BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点处，上游为His标签，获得重组表达载体pET28a-IBDV-VP2A。

4.4重组质粒pET28a-IBDV-VP2A在大肠杆菌中诱导表达

将鉴定正确的重组表达质粒pET28a-IBDV-VP2A转化BL21感受态细胞，在37℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况，约21kDa处出现了特异条带，这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达，在添加IPTG后1～4h，表达量逐渐增加，而诱导5h和诱导4h的多积累的重组蛋白几乎一样多。用超声波将菌体细胞破碎，发现上清无目的蛋白，沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-VP2A以不可溶的包涵体形式存在。

4.5重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理

将保存于-80℃表达量高的菌种划线，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于4mL LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃培养过夜；1％的菌液转接于200mL含的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃震荡培养，使OD值达0.6左右，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，37℃继续培养4h；4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌ddH2O洗2次，离心收集菌体。用裂解缓冲液重悬菌体，用量为100μL裂解液/mL菌液，冰浴30min，冰上超声波破碎裂解菌体；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀即为重组蛋白包涵体；沉淀用适量包涵体洗涤液Ⅰ和包涵体洗涤液Ⅱ重悬并洗涤，弃上清；用适量脲NTA-0Buffer重悬沉淀，4℃，过夜溶解。

4.6镍柱亲和层析纯化重组蛋白及质谱鉴定

取上述溶解过夜的包涵体溶液，4℃，12000rpm离心15min，取上清，用0.45μm膜过滤；用Ni-NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，在脲NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度收集洗脱液，收集穿透液、洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析确定蛋白质的结合情况、目标蛋白在洗脱液中的分布情况。蛋白电泳显示在50mM咪唑浓度洗脱下来的蛋白最多，在100mM浓度也有蛋白洗脱下来，而250mM浓度下洗脱下来的很少。

纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，切取大小正确，条带单一的蛋白带，并将其切成小块，送至北京蛋白质组研究中心生物质谱实验室进行MALDI-TOF/TOF质谱分析，结果用Mascot检索软件进行检索分析。与预期重组蛋白有2段肽段相匹配，分别为GSLEKHTLR和LGDPIPAIGLDPK，覆盖整个重组蛋白的10％，得分44，期望值小于0.001，当蛋白得分大于19时，此结果显著(P<0.05)，可推断出表达出的重组蛋白为预期的His-VP2A。

4.7融合蛋白His-VP2A浓缩后浓度测定和制备多克隆抗体

将含有较多目的蛋白的洗脱液加入到3kDa的超滤管中，8000rpm离心，浓缩至1mL左右，通过Bradford法测定蛋白质浓度。收集1.5mg蛋白，经SDS-PAGE电泳后切下含有目的蛋白的凝胶，尽量切碎，37℃烘干后研磨成粉末，送至中国科学院遗传与发育研究所动物实验中心制备小鼠多克隆抗体，四免后的收集全部血清，测定血清的抗体效价，并将其余血清放于－80℃保存备用。

4.8多克隆抗体效价检测

用酶联免疫法测定抗体效价。将纯化得到的原核蛋白稀释至10μg/mL包被酶联免疫板，3％BSA封闭后，一抗用PBS稀释成不同的倍数100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200，加酶标二抗测定抗体效价，同时用免疫前的小鼠血清作为阴性对照。以血清的稀释倍数为X轴，OD₄₉₂为Y轴，做多克隆抗体效价图。减去空白对照孔的吸光度值后，样品OD值大于阴性对照的2.1倍时，即为阳性，结果表明多克隆抗体的效价可达到1:6400，表明纯化的重组蛋白可以刺激小鼠产生较高的抗体滴度，重组蛋白的免疫原性良好。

5表达产物的检测

5.1ELISA检测

重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2/4/3-O)注射家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法同实施例1。结果如表4，表明IBDV-VP2/4/3-O基因在家蚕中表达量高比IBDV-VP2/4/3基因原始序列在家蚕中表达量高出2-3倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。

表4ELISA检测家蚕生物反应器中表达的VP2/4/3-O基因

5.2Western blotting检测

Western blotting的方法同实施例1，结果表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到48kDa大小的特异性条带，如图2。

5.3电镜及胶体金二抗标记的电镜观察

如图3所示，纯化后的样品悬浮液稀释后，经过负染色，在电镜中可见IBDV类病毒颗粒，如图3A，大小约60～70nm，与IBDV病毒粒子的大小一致。样品悬浮液用胶体金二抗标记染色后在电镜下观察，如图3B、C、D，可观察到与金粒结合的IBDV类病毒粒子，说明IBDV多聚蛋白在家蚕幼虫中的表达产物能够组装成类病毒粒子。

5.4动物免疫实验

按照实施例1的方法制备疫苗将表达IBDV VP2/4/3-O蛋白的蚕蛹按100羽份/g蚕蛹的剂量制备疫苗。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。

取21日龄的SPF鸡30只，10只各颈背部皮下注射疫苗1羽份(0.2ml)。10只接种健康蚕蛹疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组。接种30日后，采用翅下静脉采血，收集血清，检测鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体，阴性蚕蛹免疫组和正常对照组的中和抗体效价为1：30左右，而IBDV-VP2/4/3-O样品组的中和抗体效价达到1：2430以上。

在取血的同时进行攻毒实验，IBDV-VP2/4/3-O样品组无鸡传染性法氏囊病典型症状，而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组均出现IBD典型症状，精神沉郁，采食量和饮水量减少，有些自啄肛门，排白色水样稀粪，重者脱水，卧地不起，极度虚弱。三天后剖检IBDV VP2/4/3-O样品组的法氏囊正常，发病率为零。保护率为90％以上。而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组法氏囊肿大，表面有出血点或出血带，有胶冻状物质，发病率达到80％以上。

实施例4鸡传染性法氏囊病毒多聚蛋白优化后的序列IBDV-VP2-O在家蚕生物反应器中的表达及检测

1有关溶液和培养基的配置

具体方法同实施例1。

2鸡传染性法氏囊病毒多聚蛋白基因优化后序列VP2-O在家蚕生物反应器中的可溶性表达

2.1鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白优化序列的PCR扩增

以实施例3优化得到的pUCS-IBDV-VP2/4/3-O质粒为模板，设计特异性引物对IBDV-VP2-O蛋白的基因序列(优化后的VP2-O序列如SEQ ID NO.4所示)进行扩增，引入BamH Ⅰ和Pst Ⅰ限制性酶切位点，方框内部分为pVL1393同源序列。

PCR反应体系：

PCR参数设置：

2.2IBDV-VP2-O与转移载体pVL1393重组形成pVL1393-IBDV-VP2-O

对PCR扩增的产物进行电泳分析，用玻璃奶法回收IBDV-VP2-O目的片段，测DNA浓度，将浓度调整至100～200ng/μL，－20℃保存待用。用限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和Pst Ⅰ分部酶切pVL1393载体制备线性化载体，测浓度在100～200ng/μL。

用CloneEZ重组克隆试剂盒进行重组，体系如下：

22℃保持30min，之后冰浴5min，立即取5～10μL重组产物转化感受态细胞，然后用核酸快速提取法提取法筛选阳性克隆，提取质粒DNA，酶切鉴定正确后，送测序，阳性质粒命名为pVL1393-IBDV-VP2-O。

2.3家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

同实施例1。

2.4重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2-O)的构建和获得

同实施例1。

2.5重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2-O)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2-O)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2-O)。

2.6重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法同实施例1。引物为VP2-O-F和VP2-O-R。

2.7IBDV-VP2-O在家蚕体和蚕蛹中的高效表达

方法同实施例1，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2-O)，4～5d后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。

3表达产物的检测

3.1ELISA检测

将重组病毒rBmBacmid(P_PH-IBDV-VP2-O)注射家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测IBDV-VP2-O抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血淋巴作为阴性对照，原核表达的IBDV-VP2A蛋白免疫小鼠后制备的多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。任取所收蚕血中的样品，用包被液做梯度稀释，进行2倍倍比稀释(1：50～1：6400)，每个梯度处做复孔检测，计算时取平均值，各取100μL包被到酶标板上。结果如表5，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应，表明IBDV-VP2-O基因在家蚕中的表达量比IBDV原始序列在家蚕中的表达量要高。

表5ELISA检测家蚕生物反应器表达的IBDV-VP2-O蛋白

3.2Western blotting检测

方法同实施例1，结果表明在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的上清液中可检测到48kDa大小的特异性条带，如图2。

3.3动物免疫试验

按照实施例1的方法制备疫苗将表达IBDV-VP2-O蛋白的蚕蛹按100羽份/g蚕蛹的剂量制备疫苗。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。

取21日龄的SPF鸡30只，10只各颈背部皮下注射疫苗1羽份(0.2ml)。10只接种健康蚕蛹疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组。接种30日后，采用翅下静脉采血，收集血清，检测鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体，阴性蚕蛹免疫组和正常对照组的中和抗体效价为1：30左右，而IBDV-VP2-O样品组的中和抗体效价达到1：2430以上。

在取血的同时进行攻毒实验，IBDV-VP2-O样品组无鸡传染性法氏囊病典型症状，而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组均出现IBD典型症状，精神沉郁，采食量和饮水量减少，有些自啄肛门，排白色水样稀粪，重者脱水，卧地不起，极度虚弱。三天后剖检IBDV-VP2-O样品组的法氏囊正常，发病率为零。保护率为90％以上。而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组法氏囊肿大，表面有出血点或出血带，有胶冻状物质，发病率达到80％以上。

实施例5鸡传染性法氏囊病病毒多聚蛋白优化后的序列IBDV-VP2/4/3-O在家蚕生物反应器中的扩增，制备核酸疫苗

1有关溶液和培养基的配置

方法同实施例1。

2重组转移载体pVLCAG-IBDV-VP2/4/3-O的构建

2.1IBDV-VP2/4/3-O目的片段的获得

实施例3优化合成得到的pUCS-IBDV-VP2/4/3-O用EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ进行双酶切得到目的片段IBDV-VP2/4/3-O(SEQ ID NO.3所示)，体系如下：

用1％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，用玻璃奶法回收大小约为3000bp的目的片段，溶于0.1×TE(pH 8.0)中。

2.2重组转移载体pVLCAG-IBDV-VP2/4/3-O的构建

酶切(EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ)得到目的片段IBDV-VP2/4/3-O与酶切处理的转移载体pVLCAG-1393(EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ)，转移载体pVLCAG-1393的示意图见图4，用T4DNA连接酶，于16℃连接过夜连接。连接体系如下：

将连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，按照核酸快速抽提法粗筛阳性克隆，提取质粒，基因测序，鉴定正确的重组质粒命名为pVLCAG-IBDV-VP2/4/3-O。

3鸡传染性法氏囊病毒多聚蛋白优化后的序列IBDV-VP2/4/3-O在家蚕生物反应器中的扩增

3.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

同实施例1。

3.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2/4/3-O)的构建和获得

同实施例1。

3.3重组病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2/4/3-O)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2/4/3-O)感染正常生长的BmN细胞，培养3d后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2/4/3-O)。

3.4重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法同实施例1。用VP2/4/3-O-F和VP2/4/3-O-R两条引物鉴定基因是否重组到杆状病毒基因组中。

3.5IBDV-VP2/4/3-O在家蚕蛹和蚕体中高效扩增

方法同实施例1，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2/4/3-O)，4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冷冻保存。

3.6荧光定量PCR

(1)样品的处理

取50μL前述的血淋巴样品，加入等体积的1.0M NaOH轻轻混匀，室温作用5min，然后每管加10μL的10M NH4Ac，室温作用5min，轻轻摇匀以中和碱液，作用完毕后，用饱和酚，氯仿：异戊醇(24:1)去除蛋白，用2.5倍体积的乙醇沉淀总核酸，沉淀经75％酒精洗后真空抽去残余的酒精，沉淀溶于20μL TE(pH 8.0)，作为荧光定量PCR的模板。

(2)引物设计

荧光定量IBDV-VP2/4/3-O所用引物：

(3)RT-PCR反应

反应体系：

反应程序：扩增曲线分析

反应程序：溶解曲线分析

从55℃升至95℃，每0.5℃读取10s。

由Chromo 4Detector,MJ Research荧光定量PCR仪检测。

(4)标准曲线的制作

将PCR产物电泳回收并定量，根据如下公式计算每微升目的基因的拷贝数：

每微升拷贝数＝(OD₂₆₀×50×0.001×阿佛加德罗常数)/(扩增片段长度(bp)×649×1000)

(注：1OD₂₆₀相当于50μg/mL dsDNA；每bp碱基分子量按649Da计算，阿佛加德罗常数为6.02×10²³。)

根据所得拷贝数，将回收产物依次稀释为每微升10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³个拷贝，分别取1μL作为模板进行荧光定量PCR，以拷贝数指数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线。

(5)结果：根据标准曲线，计算得到1μL蚕血淋巴中分别含有约10⁷个重组病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2-O)的拷贝数。

4动物试验

将含有扩增IBDV-VP2/4/3-O基因的蚕蛹按100羽份/g蚕蛹的剂量制备疫苗。

称取10g蚕蛹，加入90ml PBS缓冲液，搅拌器搅拌5～10min使其充分混匀，制备成母液放入灭菌瓶中。取5mL母液，加20mL PBS缓冲液充分混匀。加入盐酸环丙沙星(使用量为30～50mg/1kg鸡体重)。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。

取21日龄的SPF鸡30只，10只灌喂疫苗1羽份(0.5mL)。10只灌喂健康蚕蛹疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组。接种30日后，采用翅下静脉采血，取血清，检测鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体，阴性蚕蛹免疫组和正常对照组的中和抗体效价为1：30左右，而IBDV-VP2/4/3-O核酸样品组的中和抗体效价不少于1：7290。

在取血的同时进行攻毒实验，IBDV-VP2/4/3-O样品组无鸡传染性法氏囊病典型症状，而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组均出现IBD典型症状，精神沉郁，采食量和饮水量减少，有些自啄肛门，排白色水样稀粪，重者脱水，卧地不起，极度虚弱。三天后剖检IBDV VP2/4/3-O样品组的法氏囊正常，发病率为零。保护率为100％。而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组法氏囊肿大，表面有出血点或出血带，有胶冻状物质，发病率达到80％以上。

实施例6鸡传染性法氏囊病毒多聚蛋白优化后的序列IBDV-VP2-O在家蚕生物反应器中的扩增，制备核酸疫苗

1有关溶液和培养基的配置

方法同实施例1。

2重组转移载体pVLCAG-IBDV-VP2-O的构建

2.1IBDV-VP2-O目的片段的获得

以实施例3优化得到的pUCS-IBDV-VP2/4/3-O质粒为模板，设计特异性引物对IBDV-VP2-O蛋白的基因序列进行扩增，引入EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ限制性酶切位点，方框内部分为pVLCAG同源序列：

PCR反应体系：

PCR参数设置：

2.2重组转移载体pVLCAG-IBDV-VP2-O的构建

对PCR扩增的产物进行电泳分析，用玻璃奶法回收IBDV-VP2-O目的片段(SEQID NO.4所示)，测DNA浓度，将浓度调整至100～200ng/μL，－20℃保存待用。用限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和Pst Ⅰ分部酶切pVLCAG制备线性化载体，测浓度在100～200ng/μL。用CloneEZ重组克隆试剂盒进行重组，体系如下：

22℃保持30min，之后冰浴5min，立即取5～10μL重组产物转化感受态细胞，然后用核酸快速提取法提取法筛选阳性克隆，提取质粒DNA，酶切鉴定正确后，送测序，阳性质粒命名为pVLCAG-IBDV-VP2-O。

3鸡传染性法氏囊病毒多聚蛋白优化后的序列IBDV-VP2-O在家蚕生物反应器中的扩增

3.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

同实施例1。

3.2.重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2-O)的构建和获得

同实施例1。

3.3重组病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2-O)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2-O)感染正常生长的BmN细胞，培养3d后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2-O)。

3.4重组病毒的鉴定

用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA提取方法同实施例1。用IBDV-VP2-O-F和IBDV-VP2-O-R两条引物鉴定基因是否重组到杆状病毒基因组中。

3.5IBDV-VP2-O在家蚕蛹和蚕体中高效扩增

具体方法同实施例1，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵rBmBacmid(CAG-IBDV-VP2-O)，4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冷冻保存。

3.6荧光定量PCR

(1)样品的处理

方法同实施例5。

(2)引物设计

荧光定量IBDV-VP2-O所用引物：

(3)RT-PCR反应

反应体系：

反应程序：扩增曲线分析

反应程序：溶解曲线分析

从55℃升至95℃，每0.5℃读取10s。

由Chromo 4Detector,MJ Research荧光定量PCR仪检测。

(4)标准曲线的制作

同实施例5。

5动物实验

将扩增IBDV-VP2-O基因的蚕蛹按100羽份/g蚕蛹的剂量制备疫苗，方法同实施例5。

取21日龄的SPF鸡30只，10只灌喂疫苗1羽份(0.5mL)。10只灌喂健康蚕蛹疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组。接种30日后，采用翅下静脉采血，取血清，检测鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体，阴性蚕蛹免疫组和正常对照组的中和抗体效价为1：30左右，而IBDV-VP2-O核酸样品组的中和抗体效价为1：7290以上。

在取血的同时进行攻毒实验，IBDV-VP2-O样品组无鸡传染性法氏囊病典型症状，而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组均出现IBD典型症状，精神沉郁，采食量和饮水量减少，有些自啄肛门，排白色水样稀粪，重者脱水，卧地不起，极度虚弱。三天后剖检IBDV VP2-O样品组的法氏囊正常，发病率为零。保护率为100％。而阴性蚕蛹免疫组和正常对照组法氏囊肿大，表面有出血点或出血带，有胶冻状物质，发病率达到80％以上。

实施例7鸡传染性法氏囊病毒多聚蛋白优化后的序列VP2/4/3-O在家蚕生物反应器中的表达及检测

分别将实施例3优化获得的SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示优化后的IBDV-VP2/4/3-O基因序列在家蚕生物反应器中表达，具体方法同实施例3。

ELISA检测结果(表6)表明，优化后的IBDV-VP2/4/3-O基因在家蚕中的表达量高与原始序列在家蚕中表达量相比没有明显提高。

表6ELISA检测家蚕生物反应器中表达的VP2/4/3-O基因

Claims

1.优化后的鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus)VP2/4/3多聚蛋白基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

2.优化后的鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus)VP2基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

3.含有权利要求1所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或权利要求2所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主或宿主细胞。

5.一种鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别将鸡传染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因、原始VP2基因、权利要求1所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或权利要求2所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；

6.一种鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别将鸡传染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因、原始VP2基因、权利要求1所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或权利要求2所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因克隆到哺乳动物启动子控制的杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；

(3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或细胞，在昆虫宿主或细胞中呈递外源基因，制备得到核酸疫苗。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述哺乳动物启动子选自CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人leukosialin基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶l基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子或鼠乳房瘤病毒启动子；优选为CAG启动子。

8.按照权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述鸡传染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述原始VP2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。

9.权利要求5所述制备方法制备得到的鸡传染性法氏囊病病毒抗原或权利要求6所述方法制备得到的鸡传染性法氏囊病核酸疫苗。

10.权利要求9所述鸡传染性法氏囊病病毒抗原或鸡传染性法氏囊病核酸疫苗在制备预防或治疗鸡传染性法氏囊病的药物或试剂中的用途。