CN109880838B

CN109880838B - 一种分泌表达猪o型口蹄疫病毒多表位基因的重组病毒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109880838B
Application number: CN201910185963.6A
Authority: CN
Inventors: 陈金顶; 聂恺阳; 黄允真; 章洋溢; 杨超; 赵明秋
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2039-03-12
Also published as: CN109880838A

Abstract

本发明公开了一种分泌表达猪O型口蹄疫病毒多表位基因的重组病毒及其制备方法和应用。本发明通过将猪O型口蹄疫病毒T、B细胞表位串联的方法，根据密码子的偏爱性，人工设计合成了融合蜂毒信号肽的猪O型口蹄疫多表位重组抗原的基因序列，并构建了含有上述重组基因的重组杆状病毒，提高了基因在杆状病毒中分泌表达水平和免疫原性。利用本发明的重组杆状病毒Ac‑RBT所表达RBT蛋白制备亚单位疫苗，免疫猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，诱导猪体产生较高水平特异性抗体，能有效预防口蹄疫病毒的感染，对控制和净化我国猪O型口蹄疫具有重要意义。

Description

一种分泌表达猪O型口蹄疫病毒多表位基因的重组病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，更具体地，涉及一种分泌表达猪O型口蹄疫病毒多表位基因的重组病毒及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(food and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(food and mouthdisease virus,FMDV)引起的一种烈性传染性疾病，能够导致牛、羊、猪等偶蹄动物发病死亡。FMD的临床症状主要表现为感染动物的蹄部、口腔黏膜、乳房皮肤等多处发生水泡，进而引发溃烂现象。临床症状最明显的是高产奶牛和集中饲养的猪。FMD平均致死率虽很低，感染动物发病率却为100％，且传播速度极快，引发畜产量减少，将对畜牧业造成极大的经济损失。由于FMD危害极大，影响范围极广，因此，世界动物卫生组织(Office Internationaldes Epizoofies,OIE)将其列为“A类烈性传染病”第一位。目前，我国主要以接种灭活疫苗预防FMD感染。但传统的灭活疫苗存在病毒灭活不彻底而引发疫苗毒株流行的危险。正是由于传统灭活疫苗的不安全性加速了口蹄疫新型疫苗的研发。表位疫苗不含对动物构成潜在威胁的病毒基因组，其安全性较高。

VP1蛋白是FMDV中能够刺激机体产生中和抗体的主要保护性抗原蛋白，是目前研发口蹄疫新型疫苗的首选靶基因。但VP1蛋白存在着免疫原性不高，且VP1蛋白疫苗特异性不强等问题。

近年来，杆状病毒表达载体因其具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效率高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点，已经在表达载体上占了主导的地位。多抗原表位串联是一种提高抗原蛋白免疫原性的方法，但是目前还未见有针对猪O型口蹄疫病毒的多抗原表位串联来制备疫苗的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服猪O型口蹄疫病毒疫苗存在的缺陷和不足，提供一种分泌表达猪O型口蹄疫病毒多抗原表位基因的重组病Ac-RBT，并利用所述重组病毒Ac-RBT所表达重组蛋白RBT制备亚单位疫苗，免疫BALB/c雌鼠和猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，能有效预防口蹄疫病毒的感染，对控制和净化我国猪O型口蹄疫具有重要意义。

本发明的第一个目的是提供一种密码子优化的猪O型口蹄疫多抗原表位重组基因。

本发明的第二个目的是提供一种密码子优化的猪O型口蹄疫多抗原表位重组蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述重组基因的杆状病毒转移载体。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述载体的重组杆状病毒。

本发明的第五个目的是提供所述重组杆状病毒在制备猪O型口蹄疫病毒亚单位疫苗中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种密码子优化的猪O型口蹄疫多抗原表位重组基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明以国内流行毒株O/BY/CHA/2010毒株(NCBI登录号：JN998085.1)的优势B细胞抗原表位(第129～160位、第200～213位氨基酸)，优势T细胞表位(第16～44位氨基酸)为基础，在相邻表位之间引入间隔子序列GG保证各个表位结构能够正确展示。以B(129～160)-B(200～213)-B(129～160)-T(16～44)为一个基本单元，根据杆状病毒密码子偏好性人工合成1122bp的如SEQ ID NO.1所示的3个基本单元串联的多表位重组基因序列RBT。

一种密码子优化的猪O型口蹄疫多抗原表位重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

上述重组基因或重组蛋白在制备猪O型口蹄疫病毒亚单位疫苗中的应用也在本发明保护范围内。

一种含上述重组基因的载体。

优选地，所述载体为杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2RBT。

本发明还请求保护所述杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2RBT的制备方法，包括如下步骤：

S1.重组质粒pUC-19-RBT的构建

在SEQ ID NO.1所示猪O型口蹄疫多抗原表位重组基因蛋白的N端引入蜂毒信号肽基因序列然后克隆入pUC-19中，获得重组质粒pUC-19-RBT；

S2.杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2RBT的构建

以pUC-19-RBT为模板，5’-CGGGATCCATGAAGTTCCTGGTTAACGTT-3’(SEQ ID NO.3)；5’-CGGAATTCTTAGGGTGTCACTTTAACGAA-3’(SEQ ID NO.4)为引物扩增多表位重组基因，胶回收纯化的RBT基因和杆状病毒转移载体pFastBac Dual分别被BamHΙ和EcoRΙ双酶切，胶回收纯化后连接构建质粒pFastBac Dual-RBT；以pUC-19-RBT为模板，5’-CCCTCGAGATGAAGTTCCTGGTTAACGTT-3’(SEQ ID NO.5)；5’-CGAACTGCTTAGGGTGTCACTTTAACGAA-3’(SEQ ID NO.6)为引物扩增多表位重组基因，胶回收纯化的RBT基因和重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-RBT分别被XhoΙ和NheΙ双酶切，胶回收纯化后连接构建重组转移载体pFastBac Dual-2RBT。

一种含有上述杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2RBT的宿主菌；具体地，所述宿主菌为大肠杆菌；更具体地，所述大肠杆菌为DH10Bac。

一种含上述杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2RBT的重组杆状病毒Ac-RBT。

本发明还请求保护所述重组杆状病毒Ac-RBT的制备方法，具体包括如下步骤：

S1.重组杆粒Ac-RBT的获得与鉴定

取pFastBac Dual-2RBT与大肠杆菌感受态细胞混合，热激转化，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，经M13引物PCR鉴定获得重组杆粒Ac-RBT；

S2.重组病毒Ac-RBT的获得

利用阳离子脂质体cellfectin II介导转染，将重组杆粒Ac-RBT转染入sf9单层细胞，经培养、观察后，收集培养上清即为P1代重组病毒Ac-RBT。

本发明还请求保护所述重组杆状病毒在制备猪O型口蹄疫病毒亚单位疫苗中的应用；将重组杆状病毒Ac-RBT接种悬浮培养的昆虫细胞，感染后收集培养物，离心去除培养上清，细胞破碎后，离心去除细胞碎片，将超声上清中目的蛋白与免疫佐剂乳化即制备成亚单位疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明根据密码子的偏爱性，人工设计合成了融合蜂毒信号肽的猪O型口蹄疫多抗原表位重组基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，提高了基因在杆状病毒中表达水平和免疫原性，同时提高蛋白分泌水平。

(2)本发明将人工合成的多表位重组基因FMDV RBT分别置于杆状病毒pH和p10启动子下表达，提高了外源基因的表达量。

(3)本发明的重组杆状病毒Ac-RBT所表达重组蛋白RBT制备亚单位疫苗，免疫BALB/c雌鼠和猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，能有效预防口蹄疫病毒的感染，对控制和净化我国猪O型口蹄疫具有重要意义。

附图说明

图1为口蹄疫多表位重组基因RBT的PCR扩增图；M：10000bp DNA Marker1～2：RBT。

图2为转移载体pFastBac Dual-2RBT的双酶切鉴定图；M：10000bp DNA Marker；1：pFastBac Dual-2RBT/XhoΙ和NheΙ双酶切；2：pFastBac Dual-2RBT/BamHΙ和EcoRΙ双酶切。

图3为重组杆粒rBac-RBT的PCR鉴定图；M：5000bp DNA Marker；1～2：rBac-RBT。

图4为重组杆状病毒Ac-RBT的Western-blot分析图；M：蛋白Marker；1～2：重组杆状病毒Ac-RBT感染的细胞样品；3-4：正常Sf9细胞样品。

图5为一种重组杆状病毒Ac-RBT的间接免疫荧光分析图；A：白光下Sf9细胞；B：荧光下Sf9细胞；C：白光下重组杆状病毒Ac-RBT感染的细胞；D：荧光下重组杆状病毒Ac-RBT感染的细胞。

图6为猪免疫后不同时间的猪血清VP1ELISA抗体检测结果图；重组杆状病毒Ac-RBT亚单位疫苗组、商品化灭活疫苗对照组和阴性对照组免疫后第14、21、28、35、42天的猪血清VP1ELISA抗体水平。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1表达多表位重组FMDV RBT蛋白的重组杆状病毒Ac-RBT的构建

(一)、重组杆状病毒Ac-RBT的获得

1、猪O型口蹄疫病毒VP1基因的生物信息学分析

本研究用DNAStar生物软件对国内流行毒株O/BY/CHA/2010毒株(NCBI登录号：JN998085.1)进行序列分析，确定优势B细胞抗原表位为第129～160位、第200～213位氨基酸，优势T细胞表位为第16～44位氨基酸。

2、多表位重组FMDV RBT基因的设计及合成

本发明在相邻表位之间引入间隔子序列GG保证各个表位结构能够正确展示。以B(129～160)-B(200～213)-B(129～160)-T(16～44)为一个基本单元，根据杆状病毒密码子偏好性人工合成1122bp的3个基本单元串联的多表位重组基因序列RBT(SEQ ID NO.1)并于RBT序列的N端引入蜂毒信号肽基因序列，该序列克隆入pUC-19中，获得重组质粒pUC-19-RBT。

3、杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2RBT

以pUC-19-RBT为模板，5’-CGGGATCCATGAAGTTCCTGGTTAACGTT-3’(SEQ ID NO.3)；5’-CGGAATTCTTAGGGTGTCACTTTAACGAA-3’(SEQ ID NO.4)为引物扩增多表位重组基因，胶回收纯化的RBT基因和杆状病毒转移载体pFastBac Dual分别被BamHΙ和EcoRΙ双酶切，胶回收纯化后连接构建质粒pFastBac Dual-RBT。以pUC-19-RBT为模板，5’-CCCTCGAGATGAAGTTCCTGGTTAACGTT-3’(SEQ ID NO.5)；5’-CGAACTGCTTAGGGTGTCACTTTAACGAA-3’(SEQ ID NO.6)为引物扩增多表位重组基因(图1)，胶回收纯化的RBT基因和重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-RBT分别被XhoΙ和NheΙ双酶切，胶回收纯化后连接构建重组转移载体pFastBac Dual-2RBT。使用限制性核酸内切酶BamH I\EcoRΙ和XhoΙ\NheΙ进行双酶切鉴定。

将酶切产物经1％(重量/体积，w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果显示经BamH I\EcoRΙ酶切获得1200bp和5200bp左右大小的条带，经XhoΙ\NheΙ酶切获得1200bp和5200bp左右大小的条带，大小与预期相符，表明重组转移载体pFastBac Dual-2RBT构建成功(图2)。其包含有SEQ ID NO.1所示的融合基因序列，该序列编码的蛋白质为SEQ ID NO.1所示。

3、重组杆状病毒Ac-RBT的构建

(1)重组杆粒rBac-RBT的获得与鉴定

取3.0uL pFastBac Dual-RBT与100uL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900u L S.O.C液体培养基，37℃振摇培养4h，按10^-1，10^-2，10^-3稀释后，各取100u L涂布于含有三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)LB平板，使用浓度按Bac-to-Bac Baculoviruse Expression System操作说明书，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-RBT，通过PCR引物扩增鉴定：M13上游引物(M13F)和M13下游引物(M13R)。

M13F:5’-CCCAGTCACGACGACGTTGTAAAACG-3’；

M13R:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’；

PCR体系如下：

PCR反应条件为：变性温度为95℃，预变性3分钟；然后94℃作用30秒，50℃退火30秒，72℃延伸4分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟。将扩增的PCR产物经1.0％(重量/体积，w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果显示能够扩增出大小约为5000bp的特异性目的条带，大小与预期相符，表明FMDV RBT基因片段在大肠杆菌感受态中中已成功重组入杆状病毒基因组中(图3)。

(2)重组病毒Ac-RBT的获得

利用阳离子脂质体Cellfectin II介导转染，按说明书步骤将重组杆粒rBac-RBT转染Sf9单层细胞(购自武汉大学中国典型物保藏中心)，与27℃培养箱中培养96h，于倒置显微镜下观察细胞病变情况，收集培养上清即为P1代重组病毒Ac-RBT，于-80℃保存。

此重组病毒Ac-RBT具有与亲本毒株苜蓿银纹核型多角体病毒(AcMNPV)相同的形态学特性和培养特性。

(二)、重组杆状病毒Ac-RBT外源基因表达的检测

1、Western-Blotting分析检测外源基因的表达

将重组杆状病毒Ac-RBT按0.1M.O.I感染单层Sf9细胞，27℃培养72h细胞。待细胞出现明显病变并出现大量细胞脱落时收集培养液于离心管中，2000rpm离心5min后弃上清，细胞再用100μL PBS重悬，重悬后进行超声裂解破碎细胞，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5分钟。样品经SDS-PAGE电泳后转移至纤维素膜，以His标签单克隆抗体(碧云天公司)为一抗，HRP标记羊抗小鼠IgG(碧云天公司)为二抗进行Western-Blotting检测。结果显示重组病毒感染的细胞样品中有一个特异性条带，大小约45KDa，符合预期大小。Sf9细胞对照组无此特异性条带，表明目的蛋白成功表达，结果如图3所示。

2、间接免疫荧光分析检测外源基因的表达

将重组杆状病毒Ac-RBT按1M.O.I感染单层Sf9细胞，27℃培养72h细胞，72h后进行间接免疫荧光检测多表位重组RBT基因的表达。以His单克隆抗体(购自碧云天公司)为一抗，FITC标记羊抗鼠IgG(购自碧云天公司)为二抗。于荧光显微镜下观察，结果显示Ac-RBT感染的Sf9细胞有很强的绿色荧光，而阴性对照细胞则没有荧光，表明目的蛋白成功在细胞内表达，结果如图4所示。

实施例2重组杆状病毒Ac-RBT制备的亚单位疫苗的免疫效力实验

1、重组杆状病毒Ac-RBT猪O型口蹄疫病毒亚单位疫苗的制备

以实施例1中制备的重组杆状病毒Ac-RBT按照1M.O.I.感染培养浓度为2×10⁶cells/mL的Sf9悬浮细胞。感染72h后收集培养物，离心去除培养上清，加等量PBS缓冲液重悬细胞，超声细胞破碎仪处理悬液，离心去除细胞碎片。测定超声上清中目的蛋白浓度后，调整蛋白浓度至100μg/mL，后与ISA201VG佐剂(SEPPIC公司产品)乳化制备成亚单位疫苗，此时每毫升疫苗中含RBT蛋白50μg，4℃保存，疫苗用于以下实施例。

2、重组杆状病毒Ac-RBT口蹄疫亚单位疫苗技术指标的检验

(1)物理性状

本品外观为乳白色均匀乳液

本品剂型为水包油包水，取1mL滴于冷水表面，液滴均匀铺于水面不分散。

取本品10mL加入离心管中,用离心机按每分钟3000r离心15min，无水相油相析出。

用1mL吸管(规格要求:吸管吸入内径1.2mm,吸出内径2.7mm)，吸取25℃左右的本品1mL，样品垂直自然状态流出，0.5mL流出需要8秒钟。

(2)无菌检验

按照《中国兽药典》附录进行，结果显示本品为无菌制剂。

(3)安全性检验

取本品0.2mL，皮下注射于1月龄BALB/c小鼠，共5只，观察14天，结果显示注射本品后小鼠无不良反应。

3、重组杆状病毒Ac-RBT口蹄疫亚单位疫苗对及猪的免疫效力实验

为了评价上述制备的亚单位疫苗对猪的免疫效力，选取约2月龄左右的口蹄疫抗体阴性猪15只，随机分成3组，每组5只。实验组按照每头猪100μg的RBT蛋白的剂量进行颈部肌肉注射，并于4周后加强免疫一次；商品化口蹄疫灭活疫苗为阳性对照组，按照2ml/头的剂量进行颈部肌肉注射，并于4周后加强免疫一次；以PBS为水相制备的油乳剂为阴性对照组，按照1ml/头的剂量进行颈部肌肉注射，并于4周后加强免疫一次。首免后第14、21、28、35、42天分别进行前腔静脉采血，分离血清，评价其特异性抗体水平。

利用芬德生物技术公司的猪口蹄疫病毒O型抗体检测试剂盒检测免疫后不同时间点猪血清中的特异性抗体水平，结果如图6所示，重组杆状病毒Ac-RBT口蹄疫亚单位疫苗组与商品化口蹄疫灭活疫苗组均能诱导猪体产生较高水平的针对猪O型口蹄疫病毒的特异性抗体，两者均与阴性对照组之间存在显著性差异(p<0.05)，两者之间在首免后第42天存在显著性差异(p<0.05)。二免后重组杆状病毒Ac-RBT口蹄疫亚单位疫苗组猪血清中特异性抗体水平显著性提高。阴性对照组血清无特异性抗体。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种分泌表达猪O型口蹄疫病毒多表位基因的重组病毒及其制备方法和应用

<141> 2019-03-11

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1122

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(food and mouth disease virus)

<400> 1

atgaagttcc tggttaacgt tgccctggtt ttcatggtgg tttacatctc ttacatttac 60

gctcaccatc accaccacca cgtttacaac ggaaactgca aatacgccgg tggtagcttg 120

cctaacgtgc gtggtgacct gcaggtgctc gcccagaagg ctgcccgccc actgccaggc 180

ggccgccaca agcaaaagat cgtggccccc gtcaagcagt ccctgggtgg tgtgtacaac 240

ggtaactgta agtacgccgg tggcagcctg cccaacgtgc gcggcgacct gcaagtgctg 300

gctcagaagg ccgctcgccc tctcccaggc ggtgaggaaa actacggagg agagacacag 360

gttcagcgtc gccaccacac agacgtgtcc ttcatcctcg accgcttcgt gaaggtgacc 420

ccaggtggtg tgtacaacgg caactgtaag tacgctggcg gctccctccc taacgttcgc 480

ggtgacctgc aggtcctggc tcagaaggcc gctcgccccc tgccaggtgg acgccacaag 540

cagaagatcg tggctcctgt caagcagtcc ctcggaggtg tctataacgg caactgcaag 600

tacgccggtg gttccctccc taacgtccgt ggcgacctgc aagtgctggc ccagaaggcc 660

gcccgtcccc tgcccggagg agaagaaaac tacggtggcg aaactcaagt gcagcgtcgt 720

caccacactg acgtgagctt cattctggac cgcttcgtca aggtgacacc aggcggagtc 780

tacaacggca actgcaagta cgctggcggc agcttgccca acgttcgcgg cgacctgcag 840

gtgctcgccc aaaaggctgc ccgccctctg ccaggcggcc gccacaagca gaagatcgtc 900

gccccagtga agcaatcact cggtggcgtg tacaacggca attgtaagta cgctggagga 960

tctctgccaa acgtgcgcgg tgacctccag gtcctggctc aaaaggctgc caggcctttg 1020

ccaggtggag aagaaaacta cggtggtgaa actcaagttc aacgcagaca ccacactgat 1080

gtttctttca tcctggatag attcgttaaa gtgacaccct aa 1122

<210> 2

<211> 373

<212> PRT

<213> 口蹄疫病毒(food and mouth disease virus)

<400> 2

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala His His His His His His Val Tyr Asn Gly Asn

20 25 30

Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln

35 40 45

Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly Gly Arg His Lys

50 55 60

Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Ser Leu Gly Gly Val Tyr Asn

65 70 75 80

Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp

85 90 95

Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly Gly Glu

100 105 110

Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp

115 120 125

Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Gly Gly Val

130 135 140

Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg

145 150 155 160

Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly

165 170 175

Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Ser Leu Gly

180 185 190

Gly Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn

195 200 205

Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu

210 215 220

Pro Gly Gly Glu Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg

225 230 235 240

His His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr

245 250 255

Pro Gly Gly Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu

260 265 270

Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg

275 280 285

Pro Leu Pro Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys

290 295 300

Gln Ser Leu Gly Gly Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly

305 310 315 320

Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala

325 330 335

Ala Arg Pro Leu Pro Gly Gly Glu Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln

340 345 350

Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe

355 360 365

Val Lys Val Thr Pro

370

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(food and mouth disease virus)

<400> 3

cgggatccat gaagttcctg gttaacgtt 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(food and mouth disease virus)

<400> 4

cggaattctt agggtgtcac tttaacgaa 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(food and mouth disease virus)

<400> 5

ccctcgagat gaagttcctg gttaacgtt 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(food and mouth disease virus)

<400> 6

cgaactgctt agggtgtcac tttaacgaa 29

Claims

1.一种密码子优化的猪O型口蹄疫多抗原表位重组基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种密码子优化的猪O型口蹄疫多抗原表位重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述重组基因或权利要求2所述重组蛋白在制备猪O型口蹄疫病毒亚单位疫苗中的应用。

4.一种含权利要求1所述重组基因的载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为杆状病毒转移载体pFastBacDual-2RBT。

6.权利要求5所述杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2RBT的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.重组质粒pUC-19-RBT的构建

在SEQ ID NO.1所示猪O型口蹄疫多抗原表位重组基因的N端引入蜂毒信号肽基因序列然后克隆入pUC-19中，获得重组质粒pUC-19-RBT；

S2.杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2RBT的构建

以pUC-19-RBT为模板，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物扩增多表位重组基因，胶回收纯化的RBT基因和杆状病毒转移载体pFastBac Dual分别被BamH Ι和EcoR Ι双酶切，胶回收纯化后连接构建质粒pFastBac Dual-RBT；以pUC-19-RBT为模板，SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6为引物扩增多表位重组基因，胶回收纯化的RBT基因和重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-RBT分别被Xho Ι和Nhe Ι双酶切，胶回收纯化后连接构建重组转移载体pFastBac Dual-2RBT。

7.一种含权利要求5所述载体的重组杆状病毒Ac-RBT。

8.权利要求7所述重组杆状病毒在制备猪O型口蹄疫病毒亚单位疫苗中的应用。