CN110358741A

CN110358741A - 一种表达猪塞内卡病毒vp2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110358741A
Application number: CN201910603934.7A
Authority: CN
Inventors: 徐高原; 张华伟; 孙芳; 周明光; 郝根喜; 曾小燕; 朱娴静
Original assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Current assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2019-07-05
Publication date: 2019-10-22
Anticipated expiration: 2039-07-05
Also published as: CN110358741B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达猪塞内卡病毒VP2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用。本发明提供一种重组杆状病毒，其包含一个或多个拷贝的猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因。本发明还提供猪塞内卡病毒亚单位疫苗，其包含采用所述重组杆状病毒表达的猪塞内卡病毒VP2蛋白。本发明通过人工密码子优化，实现了猪塞内卡病毒的VP2蛋白的高水平、高纯度表达，最大程度地保留了VP2蛋白的免疫原性。本发明提供的猪塞内卡病毒亚单位疫苗具有优异的免疫原性和高度的安全性，对猪塞内卡病毒的感染发挥理想的免疫保护效果。

Description

一种表达猪塞内卡病毒VP2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达A型猪塞内卡病毒 VP2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用以及包含猪A型猪塞内卡病毒VP2蛋白的亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Senecavirus病毒属，为无囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈典型的二十面体对称。SVA病毒颗粒由四种结构蛋白组成，分别是VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1、VP2和VP3蛋白暴露在病毒颗粒表面，VP4蛋白包埋在病毒粒子内侧。SVA可引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡，被感染的仔猪(4日龄以内)死亡率达30％～70％。该病毒的感染和扩散对生猪养殖业具有非常不利的影响，因此，开发安全有效的SVA疫苗对于SVA 的防控至关重要。

申请号为201810003888.2的中国专利公开了利用塞内卡全病毒制备灭活疫苗的方法，然而，灭活疫苗在生产和应用过程中安全性较差，可能会出现灭活不充分而在动物体内返强的潜在危险。相比于灭活疫苗，亚单位疫苗具有更高的安全性，且具有良好的免疫原性。因此开发高效的SVA亚单位疫苗具有重要意义。

亚单位疫苗中作为抗原的病毒蛋白的自身免疫原性及其在表达制备过程中天然结构和免疫原性的保持是决定亚单位疫苗免疫效果的关键。VP2蛋白是诱导动物机体产生中和抗体的保护性抗原的主要成分。昆虫-杆状病毒表达系统是近年来常用的真核表达系统，具有以下优势：①昆虫杆状病毒表达系统为外源目的蛋白的正确折叠、二硫键和寡聚物的形成提供良好的环境，使表达的目的蛋白具有完整的生物学功能；②可对目的蛋白进行翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、信号肽切除等，最大程度地还原了目的蛋白的天然状态；③表达水平高，最高能使目的蛋白的表达量占细胞总蛋白的30％；④安全性高、人畜无害；⑤能够容纳大分子量的插入片段或同时表达多个外源基因。

亚单位疫苗的规模化制备需要大量地制备抗原蛋白，因此，实现高水平、高纯度的蛋白表达是降低亚单位疫苗生产成本的首要关键问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种表达A型猪塞内卡病毒VP2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用以及包含A型猪塞内卡病毒VP2蛋白的亚单位疫苗及其制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种重组杆状病毒，其包含一个或多个拷贝的猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因。

本发明中，所述VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

猪塞内卡病毒VP2蛋白的原始编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在保证序列和结构正确以及较高的免疫原性的同时，为实现猪塞内卡病毒VP2蛋白的高水平表达，本发明优选的VP2蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为根据昆虫-杆状病毒表达系统的特点，通过特定的人工密码子优化和筛选获得。

为更好地保证VP2蛋白的高水平表达以及分泌性，同时便于纯化，在所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因的5’端连接GP64信号肽序列，3’端连接His标签肽序列。

作为优选，在所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因的5’端连接GP64信号肽序列，3’端连接His标签肽序列得到如SEQ ID NO.8所述的序列。所述重组杆状病毒含有如SEQ IDNO.8所示的序列。

进一步优选地，所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因在P10启动子的控制下转录。

本发明还提供一种重组杆状病毒的制备方法，包括如下步骤：

(1)将猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因进行密码子优化，获得序列如SEQ IDNO.5所示的VP2蛋白的编码基因；

(2)在序列如SEQ ID NO.5所示的VP2蛋白的编码基因的5’端和3’端分别连接GP64信号肽和His标签肽，得到如SEQ ID NO.8所示的序列，将如SEQ ID NO.8所示的序列与转移载体连接，构建携带一个或多个拷贝的VP2蛋白编码基因的重组转移载体；

(3)将所述重组转移载体转入大肠杆菌DH10Bac，构建携带一个或多个拷贝的连接有GP64信号肽的VP2蛋白编码基因的重组杆粒；

(4)将所述重组杆粒导入昆虫细胞，获得重组杆状病毒。

本发明还提供所述重组杆状病毒在制备猪塞内卡病毒的抗原、抗体或亚单位疫苗中的应用。

本发明还提供一种猪塞内卡病毒亚单位疫苗，其包含猪塞内卡病毒VP2蛋白。

所述猪塞内卡病毒亚单位疫苗中，所述VP2蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

作为优选，所述猪塞内卡病毒VP2蛋白为采用本发明所述的重组杆状病毒表达得到。

本发明还提供一种猪塞内卡病毒亚单位疫苗的制备方法，包括：利用重组杆状病毒表达猪塞内卡病毒VP2蛋白；所述重组杆状病毒包含一个或多个拷贝的猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因；所述VP2蛋白的编码基因为经密码子优化得到，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

作为优选，所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因的5’端连接有GP64信号肽序列，3’端连接有His标签肽序列；所述重组杆状病毒含有如SEQ ID NO.8所示的序列。

具体地，所述猪塞内卡病毒亚单位疫苗的制备方法包括如下步骤：

(1)构建携带所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因的重组杆状病毒；

(2)将所述重组杆状病毒导入昆虫细胞，培养导入所述重组杆状病毒的昆虫细胞，表达猪塞内卡病毒VP2蛋白；

(3)分离和纯化VP2蛋白；

(4)将经纯化的VP2蛋白与佐剂混合，制备亚单位疫苗。

作为优选，上述步骤(3)中，所述纯化包括镍柱亲和层析纯化。

作为优选，上述步骤(1)中，构建携带所述猪塞内卡病毒VP2 蛋白的编码基因的重组杆状病毒包括如下步骤：

①将VP2蛋白的编码基因进行密码子优化，获得序列如SEQ ID NO.5所示的VP2蛋白的编码基因；

②在序列如SEQ ID NO.5所示的VP2蛋白的编码基因的5’端和3’端分别连接GP64信号肽和His标签肽，得到如SEQ ID NO.8所示的序列，将如SEQ ID NO.8所示的序列与转移载体连接，构建携带一个或多个拷贝的VP2蛋白编码基因的重组转移载体；；

③将所述重组转移载体转入大肠杆菌DH10Bac，构建携带一个或多个拷贝的VP2蛋白编码基因的重组杆粒；

④将所述重组杆粒导入昆虫细胞，获得所述重组杆状病毒。

作为优选，所述佐剂包括MONTANIDE^TM ISA201VG、 MONTANIDE^TM GEL01、MONTANIDE^TM IMS 1313VG中的任意一种或多种。

作为本发明的优选方案，所述佐剂的用量为与所述结构蛋白VP2 按1:1～1:4的质量比添加。

本发明的有益效果在于：本发明以猪塞内卡病毒的VP2蛋白作为猪塞内卡病毒亚单位疫苗的抗原蛋白，利用昆虫-杆状病毒表达系统表达猪塞内卡病毒的VP2蛋白，通过人工密码子优化，实现了猪塞内卡病毒的VP2蛋白的高水平、高纯度表达，得到的VP2蛋白的结构状态与天然结构状态完全一致，最大程度地保留了VP2蛋白的免疫原性。进一步采用特殊信号肽GP64与8×His肽标签，使得VP2蛋白能够高效表达并分泌到细胞外，细胞培养上清中杂蛋白较少，极大地简化了蛋白的提取纯化过程。在此基础上，本发明提供猪塞内卡病毒亚单位疫苗，该疫苗具有优异的免疫原性和高度的安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激免疫猪产生高水平的保护性中和抗体，对猪塞内卡病毒的感染起到理想的免疫保护效果；还具有制备方法简单高效、安全无害、成本低廉等优势，具有较好的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组转移载体pFastdual-VP2-3采用 BamHI和EcoRI双酶切的鉴定结果；其中，泳道1为DNA marker DL15000，泳道2为pFastdual-VP2-3采用BamHI和EcoRI双酶切。

图2为本发明实施例2中重组杆状病毒Ac-VP2-1、Ac-VP2-2、 Ac-VP2-3表达蛋白的SDS-PAGE检测结果，其中，MK为蛋白marker，泳道1为Ac-VP2-1，泳道2为Ac-VP2-2，泳道3为Ac-VP2-3，泳道4为 High Five细胞空白对照。

图3为本发明实施例2中经镍柱亲和层析纯化的VP2蛋白的 SDS-PAGE和Westernblotting检测结果；其中，A为SDS-PAGE检测结果，M为蛋白marker，VP2为VP2蛋白纯化样品，浓度为1.8mg/mL； B为Western blotting检测结果,M为蛋白marker，VP2为VP2蛋白纯化样品。

图4为本发明实施例4中VP2亚单位疫苗免疫小鼠的特异性抗体检测结果。

图5为本发明实施例5中VP2亚单位疫苗免疫猪的特异性抗体和保护性中和抗体的检测结果，其中A为特异性抗体；B为保护性中和抗体。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1携带猪塞内卡病毒VP2蛋白编码基因的重组杆状病毒的构建

(一)构建重组转移载体pFastdual-VP2

1、VP2蛋白编码基因的密码子优化

在数据库中获取猪塞内卡病毒VP2蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO.1所示)和编码基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)。为更好地实现VP2蛋白的高水平、高纯度表达，本发明首先根据杆状病毒的密码子偏好性进行猪塞内卡病毒VP2蛋白的密码子优化。在密码子优化过程中，本发明发现，采用常规的密码子优化软件或简单遵循昆虫-杆状病毒表达系统密码子的偏好性进行VP2的密码子优化，得到的编码基因序列的表达水平和纯度并不能满足疫苗生产高纯度大量制备的要求，且不同程度的人工密码子优化得到的编码序列的表达水平差异较大，而密码子优化位置和优化程度与表达水平之间并无明显的规律。本发明针对猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码序列设计了多条密码子优化序列，本实施例以设计的不同密码子优化序列中的3条序列为例(序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示)进行密码子优化序列筛选过程的示例性说明。

进一步地，分别在如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5 所示的序列的5’端引入GP64信号肽序列，以促进表达的VP2蛋白有效分泌到细胞外；在3’端引入8×His标签肽序列，为目的蛋白VP2的亲和纯化奠定基础，得到的序列分别如SEQ ID NO.6(VP2-1)、SEQID NO.7(VP2-2)、SEQ ID NO.8(VP2-3)所示，由生工生物工程股份有限公司进行基因合成。合成的如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的序列连接于质粒载体pUC-SP上，即以pUC-SP-VP2-1、 pUC-SP-VP2-2、pUC-SP-VP2-3的形式取得。

2、构建重组转移载体pFastdual-VP2

采用本领域常规的重组质粒构建流程和方法构建携带如SEQ ID NO.4所示的序列的重组转移载体pFastdual-VP2，具体方法如下：

(1)酶切：采用BamHI和EcoRI(购自TAKARA)双酶切 pUC-SP-VP2-1、pUC-SP-VP2-2、pUC-SP-VP2-3质粒，分别获得分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的VP2-1、VP2-2、 VP2-3基因合成片段；同时用相同的内切酶对转移载体pFastdual进行双酶切。双酶切反应体系和条件如表1所示。

表1 pUC-SP-VP2和pFastdual质粒双酶切反应体系和条件

酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

(2)目的片段和载体连接：VP2基因合成片段与载体pFastdual 的连接反应体系和条件如表2所示。

表2 VP2基因合成片段与载体pFastdual的连接反应体系和条件

(3)转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH10B中，涂平板。

(4)提取重组质粒pFastdual-VP2：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，经BamHI、EcoRI进行酶切鉴定正确后，得到含VP2基因的重组转移载体pFastdual-VP2-1、pFastdual-VP2-2 和pFastdual-VP2-3，其中pFastdual-VP2-3的酶切鉴定结果如图1所示。

(二)构建重组杆状病毒Ac-VP2

1、获得重组穿梭载体：

取4μl重组转移质粒pFastdual-VP2-1、pFastdual-VP2-2和 pFastdual-VP2-3分别转入100μl大肠杆菌感受态DH10Bac(购自 GiBCO BRL)中，冰浴30min后，42℃热激1min，再冰浴3min，加入 900μl无抗性的LB，37℃复苏4h，涂布于三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)LB平板中，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选纯化阳性菌落。

提取重组杆粒rBac-2VP2，提取方法如下：无菌挑取阳性白色菌落于三抗LB液体培养基中，培养12-16h，收集菌体用0.3mL溶液I (50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/LTris-Cl(pH8.0)) 重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III(3mol/L CH₃COOK，pH5.0)混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温14000r/min离心15min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μL无菌水中，立即使用或-20℃保存。

2、获得重组杆状病毒：

利用脂质体转染法，将提取的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，于27℃培养，48-72h后细胞病变，收集细胞培养上清即可获得重组杆状病毒Ac-VP2-1、Ac-VP2-2、Ac-VP2-3，立即使用或将收获的重组杆状病毒置于-80℃避光保存。转染方法按照脂质体说明书 (lipo2000购自invitrogen)进行。

实施例2目的蛋白VP2的表达与纯化

1、目的蛋白VP2的表达：

将实施例1收获的重组杆状病毒Ac-VP2-1、Ac-VP2-2、Ac-VP2-3 接种于悬浮培养的昆虫细胞High FiveTM(购自Invitrogen)中，接毒剂量为0.01MOI，细胞密度为0.8*10⁶/ml，细胞体积为400ml。72-96h 后收获细胞培养上清，进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示，结果显示，Ac-VP2-3的VP2表达水平明显高于Ac-VP2-1和Ac-VP2-2。进一步结合Westernblotting验证目的蛋白确实为VP2蛋白。以上结果表明本发明经特异的人工密码子优化、添加信号肽和标签肽序列得到的如SEQ ID NO.8所示的序列能够显著提高VP2蛋白的表达水平，实现高水平分泌表达。后续蛋白纯化和亚单位疫苗的制备均采用 Ac-VP2-3进行VP2的表达。

2、目的蛋白VP2的纯化：

将Ac-VP2-3的表达产物采用常规镍柱亲和层析进行纯化，具体操作步骤如下：取接毒后72-96h的High FiveTM细胞培养上清， 10000rpm离心去除细胞和细胞碎片，用0.45μm的滤膜过滤除去细小杂质；过滤后的上清与镍柱进行结合过柱；洗杂缓冲液(50mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl)过柱洗杂；洗脱缓冲液(300mM咪唑， 20mM Tris，200mM NaCl)过柱洗脱；洗脱液用透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)4℃透析过夜，得到目的蛋白。进行SDS-PAGE 和Western blotting检测纯化后的蛋白。检测结果如图3所示，结果显示，经常规镍柱亲和层析后，能够得到纯度较高的VP2蛋白，经纯化后VP2蛋白的浓度可达1.8mg/ml。

实施例3猪塞内卡病毒VP2亚单位疫苗的制备

将实施例2纯化得到的VP2蛋白测定浓度后过滤，与无菌 MONTANIDETM ISA201VG佐剂(购自SEPPIC公司)按照3:1的质量比乳化制备猪塞内卡病毒亚单位疫苗，使每毫升疫苗中的VP2抗原含量为40μg，置于4℃保存待用。

实施例4猪塞内卡病毒VP2亚单位疫苗在小鼠体内的安全性和免疫效果评价

1、小鼠体内安全性评价

购买16-18g雌性Balb/C小鼠10只，分为A、B两组，每组5只。A 组每只小鼠皮下注射0.3ml实施例3制备的VP2亚单位疫苗；B组每只小鼠注射0.3ml透析缓冲液(20mM Tris，200mM NaCl)；连续观察14 天，两组小鼠状态相同且均无异常反应，此结果表明实施例3制备的亚单位疫苗对小鼠是安全的。

2、小鼠体内的免疫效果评价

购买6-8周龄的雌性Balb/C小鼠10只，随机分成A、B两组，每组5 只。A组每只小鼠背部皮下注射0.2ml实施例3制备的VP2亚单位疫苗， 2周后加强免疫一次，B组不免疫。加强免疫2周后，断尾采血取血清，血清稀释1000倍后，用VP2蛋白的包被板做ELISA检测特异性抗体，结果如图4所示，结果表明，实施例3制备的VP2亚单位疫苗具有良好的免疫原性，可刺激小鼠产生高水平的特异性抗体。

实施例5猪塞内卡病毒VP2亚单位疫苗在猪体内的安全性和免疫效果评价

1、猪体内安全性评价

购买约2月龄SVA阴性猪6头，随机分成A、B两组，每组3头。A 组每头猪免疫1头份(含80μg VP2蛋白)实施例3制备的VP2亚单位疫苗，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明实施例3制备的VP2亚单位疫苗对本体动物猪是安全的。

2、猪体内的免疫效果评价

为了进一步评价实施例3制备的VP2亚单位疫苗对本体动物猪的免疫效力，选购约2月龄SVA阴性猪8头，随机分成A、B两组，每组4 头。A组每头猪免疫1头份(含80μg VP2蛋白)，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。首免后7天、14天、28天和42天进行前腔静脉采血，分别用ELISA进行抗原特异性抗体检测和中和抗体检测。检测结果如图5所示。结果表明，实施例3制备的 VP2亚单位疫苗具有良好的免疫原性，能够激发机体产生高水平的保护性中和抗体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种表达猪塞内卡病毒VP2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用

<130> KHP191112046.5

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn Ser Ala Asp Arg Val Ile Thr Gln

1 5 10 15

Thr Ala Gly Asn Thr Ala Ile Asn Thr Gln Ser Ser Leu Gly Val Leu

20 25 30

Cys Ala Tyr Val Glu Asp Pro Thr Lys Ser Asp Pro Pro Ser Ser Ser

35 40 45

Thr Asp Gln Pro Thr Thr Thr Phe Thr Ala Ile Asp Arg Trp Tyr Thr

50 55 60

Gly Arg Leu Asn Ser Trp Thr Lys Ala Val Lys Thr Phe Ser Phe Gln

65 70 75 80

Ala Val Pro Leu Pro Gly Ala Phe Leu Ser Arg Gln Gly Gly Leu Asn

85 90 95

Gly Gly Ala Phe Thr Ala Thr Leu His Arg His Phe Leu Met Lys Cys

100 105 110

Gly Trp Gln Val Gln Val Gln Cys Asn Leu Thr Gln Phe His Gln Gly

115 120 125

Ala Leu Leu Val Ala Met Val Pro Glu Thr Thr Leu Asp Val Lys Pro

130 135 140

Asp Gly Lys Ala Lys Ser Leu Gln Glu Leu Asn Glu Glu Gln Trp Val

145 150 155 160

Glu Met Ser Asp Asp Tyr Arg Thr Gly Lys Asn Met Pro Phe Gln Ser

165 170 175

Leu Gly Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro Asn Trp Thr Trp Gly Pro Asn Phe

180 185 190

Ile Asn Pro Tyr Gln Val Thr Val Phe Pro His Gln Ile Leu Asn Ala

195 200 205

Arg Thr Ser Thr Ser Val Asp Ile Ser Val Pro Tyr Ile Gly Glu Thr

210 215 220

Pro Thr Gln Ser Ser Glu Thr Gln Asn Ser Trp Thr Leu Leu Val Met

225 230 235 240

Val Leu Val Pro Leu Asp Tyr Lys Glu Gly Ala Thr Thr Asp Pro Glu

245 250 255

Ile Thr Phe Ser Val Arg Pro Thr Ser Pro Tyr Phe Asn Gly Leu Arg

260 265 270

Asn Arg Phe Thr Thr Gly Thr Asp Glu Glu Gln

275 280

<210> 2

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacaataccg aagaaatgga aaactctgct gatcgagtca taacacaaac ggcgggcaac 60

actgccataa acacgcaatc atcactgggt gtgttgtgtg cctacgttga agacccgacc 120

aaatctgacc ctccgtccag cagcacagat caacccacca ccacttttac tgccatcgac 180

aggtggtaca ctggacgcct caattcttgg acaaaagctg taaaaacctt ctcttttcag 240

gccgtcccgc tccctggagc cttcctgtct agacagggag gcctcaatgg aggggccttc 300

acggctaccc tacatagaca tttcttaatg aagtgcgggt ggcaggtgca ggtccaatgc 360

aatttgacac aattccacca aggtgctctt cttgttgcca tggtccccga aaccaccctt 420

gatgtcaagc ccgacggcaa ggcaaagagc ctacaggagc tgaatgaaga gcagtgggta 480

gaaatgtctg acgattaccg gaccgggaaa aacatgcctt ttcagtctct tggcacatac 540

tatcggcccc ctaactggac ttggggccct aatttcatca acccctatca agtaacagtt 600

ttcccacacc aaattctgaa cgcgagaacc tctacctcgg tagacataag tgtcccatac 660

atcggggaga ctcctacaca atcctcagag acacagaact cctggaccct cctcgttatg 720

gtgcttgtcc ccctggacta caaggaggga gccacaactg acccagaaat tacattttcc 780

gtaaggccta caagtcctta cttcaatggg cttcgtaacc gctacaagac cgggacggac 840

gaggaacag 849

<210> 3

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacaataccg aagaaatgga aaattccgcc gaccgagtga tcacccagac cgccggtaat 60

accgccatca atacccagtc ctccctgggc gtgctgtgcg cttacgtgga ggaccctact 120

aagtctgacc ctccttcttc ctccactgac cagcctacca ccaccttcac cgccatcgac 180

agatggtaca ccggtcgtct gaattcttgg accaaggctg tgaagacctt ctccttccag 240

gctgtgcctc tgcctggtgc tttcctgtct cgtcagggcg gtctgaatgg cggtgccttc 300

accgctaccc tgcaccgtca cttcctgatg aagtgtggtt ggcaggtgca ggtgcagtgt 360

aatctgaccc agttccacca gggtgccctg ctggtggcta tggtgcctga gaccaccctg 420

gacgtgaagc ctgacggcaa ggccaagtct ctgcaggaac tgaatgagga gcagtgggtg 480

gagatgtccg acgactaccg taccggcaag aatatgcctt tccagtctct gggtacatac 540

taccgtcctc ctaattggac ctggggtcct aatttcatca atccttacca ggtgaccgtg 600

ttcccccacc agatcctgaa tgctcgaacc tccacctccg tggacatctc cgtgccttac 660

atcggtgaga cacctaccca gtcctccgaa acccagaatt cttggaccct gctcgtgatg 720

gtgctggtgc ctctggacta caaggaaggt gctaccaccg accctgaaat caccttctcc 780

gttcgtccta ccagccctta cttcaatgga ctgcgtaatc gtttcaccac cggcaccgac 840

gaagaacag 849

<210> 4

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacaataccg aagaaatgga aaattccgcc gaccgcgtga tcacccagac cgccggtaat 60

accgccatca atacccagtc ctccctgggc gtgctgtgcg cttacgtgga ggaccctact 120

aagtccgacc ctccttcctc ctccactgac cagcctacca ccaccttcac cgccatcgac 180

agatggtaca ccggtcgtct gaattcctgg accaaggctg tgaagacctt ctccttccag 240

gctgtgcctc tgcctggtgc tttcctgtcc cgtcagggcg gtctgaatgg cggtgccttc 300

accgctaccc tgcaccgtca cttcctgatg aagtgtggtt ggcaggtgca ggtgcagtgt 360

aatctgaccc agttccacca gggtgccctg ctggtggcta tggtgcctga gaccaccctg 420

gacgtgaagc ctgacggcaa ggccaagtcc ctgcaggaac tgaatgagga gcagtgggtg 480

gagatgtccg acgactaccg taccggcaag aatatgcctt tccagtccct gggtacatac 540

taccgtcctc ctaattggac ctggggtcct aatttcatca atccttacca ggtgaccgtg 600

ttcccccacc agatcctgaa tgctcgcacc tccacctccg tggacatctc cgtgccttac 660

atcggtgaga cacctaccca gtcctccgaa acccagaatt cctggaccct gctcgtgatg 720

gtgctggtgc ctctggacta caaggaaggt gctaccaccg accctgaaat caccttctcc 780

gttcgtccta ccagccctta cttcaatgga ctgcgtaatc gtttcaccac cggcaccgac 840

gaagaacag 849

<210> 5

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacaacaccg aagaaatgga aaactccgcc gaccgcgtga tcacccagac cgccggtaac 60

accgccatca acacccagtc ctccctgggc gtgctgtgcg cttacgtgga ggaccctact 120

aagagcgacc ctcctagctc ctccactgac cagcctacca ccaccttcac cgccatcgac 180

cgctggtaca ccggtcgtct gaacagctgg accaaggctg tgaagacctt ctccttccag 240

gctgtgcctc tgcctggtgc tttcctgagc cgtcagggcg gtctgaacgg cggtgccttc 300

accgctaccc tgcaccgtca cttcctgatg aagtgtggtt ggcaggtgca ggtgcagtgt 360

aacctgaccc agttccacca gggtgccctg ctggtggcta tggtgcctga gaccaccctg 420

gacgtgaagc ctgacggcaa ggccaagagc ctgcaggaac tgaacgagga gcagtgggtg 480

gagatgtccg acgactaccg taccggcaag aacatgcctt tccagagcct gggtacatac 540

taccgtcctc ctaactggac ctggggtcct aacttcatca acccttacca ggtgaccgtg 600

ttcccccacc agatcctgaa cgctcgcacc tccacctccg tggacatctc cgtgccttac 660

atcggtgaga cacctaccca gtcctccgaa acccagaaca gctggaccct gctcgtgatg 720

gtgctggtgc ctctggacta caaggaaggt gctaccaccg accctgaaat caccttctcc 780

gttcgtccta ccagccctta cttcaacgga ctgcgtaacc gtttcaccac cggcaccgac 840

gaagaacag 849

<210> 6

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatccgcca ccatggtaag cgctattgtt ttatatgtgc ttttggcggc ggcggcgcat 60

tctgcctttg cggcggatct acacaatacc gaagaaatgg aaaattccgc cgaccgagtg 120

atcacccaga ccgccggtaa taccgccatc aatacccagt cctccctggg cgtgctgtgc 180

gcttacgtgg aggaccctac taagtctgac cctccttctt cctccactga ccagcctacc 240

accaccttca ccgccatcga cagatggtac accggtcgtc tgaattcttg gaccaaggct 300

gtgaagacct tctccttcca ggctgtgcct ctgcctggtg ctttcctgtc tcgtcagggc 360

ggtctgaatg gcggtgcctt caccgctacc ctgcaccgtc acttcctgat gaagtgtggt 420

tggcaggtgc aggtgcagtg taatctgacc cagttccacc agggtgccct gctggtggct 480

atggtgcctg agaccaccct ggacgtgaag cctgacggca aggccaagtc tctgcaggaa 540

ctgaatgagg agcagtgggt ggagatgtcc gacgactacc gtaccggcaa gaatatgcct 600

ttccagtctc tgggtacata ctaccgtcct cctaattgga cctggggtcc taatttcatc 660

aatccttacc aggtgaccgt gttcccccac cagatcctga atgctcgaac ctccacctcc 720

gtggacatct ccgtgcctta catcggtgag acacctaccc agtcctccga aacccagaat 780

tcttggaccc tgctcgtgat ggtgctggtg cctctggact acaaggaagg tgctaccacc 840

gaccctgaaa tcaccttctc cgttcgtcct accagccctt acttcaatgg actgcgtaat 900

cgtttcacca ccggcaccga cgaagaacag ggtggcggta gcggtggtgg tagccatcac 960

catcaccatc accatcacta agaattc 987

<210> 7

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggatccgcca ccatggtaag cgctattgtt ttatatgtgc ttttggcggc ggcggcgcat 60

tctgcctttg cggcggatct acacaatacc gaagaaatgg aaaattccgc cgaccgcgtg 120

atcacccaga ccgccggtaa taccgccatc aatacccagt cctccctggg cgtgctgtgc 180

gcttacgtgg aggaccctac taagtccgac cctccttcct cctccactga ccagcctacc 240

accaccttca ccgccatcga cagatggtac accggtcgtc tgaattcctg gaccaaggct 300

gtgaagacct tctccttcca ggctgtgcct ctgcctggtg ctttcctgtc ccgtcagggc 360

ggtctgaatg gcggtgcctt caccgctacc ctgcaccgtc acttcctgat gaagtgtggt 420

tggcaggtgc aggtgcagtg taatctgacc cagttccacc agggtgccct gctggtggct 480

atggtgcctg agaccaccct ggacgtgaag cctgacggca aggccaagtc cctgcaggaa 540

ctgaatgagg agcagtgggt ggagatgtcc gacgactacc gtaccggcaa gaatatgcct 600

ttccagtccc tgggtacata ctaccgtcct cctaattgga cctggggtcc taatttcatc 660

aatccttacc aggtgaccgt gttcccccac cagatcctga atgctcgcac ctccacctcc 720

gtggacatct ccgtgcctta catcggtgag acacctaccc agtcctccga aacccagaat 780

tcctggaccc tgctcgtgat ggtgctggtg cctctggact acaaggaagg tgctaccacc 840

gaccctgaaa tcaccttctc cgttcgtcct accagccctt acttcaatgg actgcgtaat 900

cgtttcacca ccggcaccga cgaagaacag ggtggcggta gcggtggtgg tagccatcac 960

catcaccatc accatcacta agaattc 987

<210> 8

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatccgcca ccatggtaag cgctattgtt ttatatgtgc ttttggcggc ggcggcgcat 60

tctgcctttg cggcggatct acacaacacc gaagaaatgg aaaactccgc cgaccgcgtg 120

atcacccaga ccgccggtaa caccgccatc aacacccagt cctccctggg cgtgctgtgc 180

gcttacgtgg aggaccctac taagagcgac cctcctagct cctccactga ccagcctacc 240

accaccttca ccgccatcga ccgctggtac accggtcgtc tgaacagctg gaccaaggct 300

gtgaagacct tctccttcca ggctgtgcct ctgcctggtg ctttcctgag ccgtcagggc 360

ggtctgaacg gcggtgcctt caccgctacc ctgcaccgtc acttcctgat gaagtgtggt 420

tggcaggtgc aggtgcagtg taacctgacc cagttccacc agggtgccct gctggtggct 480

atggtgcctg agaccaccct ggacgtgaag cctgacggca aggccaagag cctgcaggaa 540

ctgaacgagg agcagtgggt ggagatgtcc gacgactacc gtaccggcaa gaacatgcct 600

ttccagagcc tgggtacata ctaccgtcct cctaactgga cctggggtcc taacttcatc 660

aacccttacc aggtgaccgt gttcccccac cagatcctga acgctcgcac ctccacctcc 720

gtggacatct ccgtgcctta catcggtgag acacctaccc agtcctccga aacccagaac 780

agctggaccc tgctcgtgat ggtgctggtg cctctggact acaaggaagg tgctaccacc 840

gaccctgaaa tcaccttctc cgttcgtcct accagccctt acttcaacgg actgcgtaac 900

cgtttcacca ccggcaccga cgaagaacag ggtggcggta gcggtggtgg tagccatcac 960

catcaccatc accatcacta agaattc 987

Claims

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，其包含一个或多个拷贝的猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因。

2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述VP2蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；

优选地，所述VP2蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因的5’端连接有GP64信号肽序列，3’端连接有His标签肽序列；

优选地，所述重组杆状病毒含有如SEQ ID NO.8所示的序列；

更优选地，所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因在P10启动子的控制下转录。

4.一种重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因进行密码子优化，获得序列如SEQ ID NO.5所示的VP2蛋白的编码基因；

(3)将所述重组转移载体转入大肠杆菌DH10Bac，构建携带一个或多个拷贝的VP2蛋白编码基因的重组杆粒；

(4)将所述重组杆粒导入昆虫细胞，获得重组杆状病毒。

5.权利要求1～3任一项所述的重组杆状病毒在制备猪塞内卡病毒的抗原、抗体或亚单位疫苗中的应用。

6.一种猪塞内卡病毒亚单位疫苗，其特征在于，其包含猪塞内卡病毒VP2蛋白。

7.根据权利要求6所述的猪塞内卡病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述猪塞内卡病毒VP2蛋白为采用权利要求1～3任一项所述的重组杆状病毒或采用权利要求4所述的制备方法制备得到的重组杆状病毒表达得到。

8.一种猪塞内卡病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，利用重组杆状病毒表达猪塞内卡病毒VP2蛋白；所述重组杆状病毒包含一个或多个拷贝的猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因；所述VP2蛋白的编码基因为经密码子优化得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

优选地，所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因的5’端连接有GP64信号肽序列，3’端连接有His标签肽序列；所述重组杆状病毒含有如SEQ ID NO.8所示的序列。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)分离和纯化VP2蛋白；

(4)将经纯化的VP2蛋白与佐剂混合，制备亚单位疫苗；

优选地，所述构建携带所述猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因的重组杆状病毒包括如下步骤：

(1)将VP2蛋白的编码基因进行密码子优化，获得序列如SEQ ID NO.5所示的VP2蛋白的编码基因；

(4)将所述重组杆粒导入昆虫细胞，获得所述重组杆状病毒。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述佐剂包括MONTANIDE^TMISA201VG、MONTANIDE^TMGEL01、MONTANIDE^TMIMS 1313VG中的任意一种或多种；

优选地，所述佐剂为MONTANIDE^TMISA201VG，所述MONTANIDE^TMISA201VG的用量为与所述VP2蛋白按1:1～1:4的质量比添加。