CN107485712A

CN107485712A - 一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107485712A
Application number: CN201710675923.0A
Authority: CN
Inventors: 丁国伟; 宋庆庆; 李玉安; 叶正琴; 许兆君; 杨豫蒙
Original assignee: YANGZHOU UNI BIO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: YANGZHOU UNI BIO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2017-12-19

Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。本发明通过：(1)分别克隆、扩增gB蛋白片段基因、gC蛋白片段基因；(2)人工合成大肠杆菌肠毒素基因STLT；(3)构建表达融合蛋白gB‑STLT‑gC的质粒；(4)表达得到gB‑STLT‑gC重组蛋白、纯化，加入佐剂，乳化，制备得到猪伪狂犬病毒亚单位疫苗。本发明制备方法简单，能大量制备猪伪狂犬的抗原蛋白，耗时短，表达量高，大大降低生产成本，有利于大规模生产，所得亚单位疫苗，免疫效果良好，免疫剂量小，能有效预防猪伪狂犬相关疾病和由猪伪狂犬造成的感染的相关疾病。

Description

一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm。病毒粒子的最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。囊膜表面有长约8～10nm呈放射状排列的纤突。

伪狂犬病毒是疱疹病毒科中抵抗力较强的一种。在37℃下的半衰期为7h，8℃可存活46天，而在25℃干草、树枝、食物上可存活10～30天，但短期保存病毒时，4℃较-15℃和-20℃冻结保存更好。病毒在pH4～9之间保持稳定。5％石炭酸经2min灭活，但0.5％石炭酸处理32天后仍具有感染性。0.5％～1％氢氧化钠迅速使其灭活。对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。

伪狂犬病毒在全世界广泛分布。伪狂犬病自然发生于猪、牛、绵羊、犬和猫，另外，多种野生动物、肉食动物也易感。水貂、雪貂因饲喂含伪狂犬病毒的猪下脚料也可引起伪狂犬病的暴发。实验动物中家兔最为敏感，小鼠、大鼠、豚鼠等也能感染。关于人感染伪狂犬病毒的报道很少，并且都不是以病毒分离为报道依据。如土耳其及我国台湾曾报道有血清学反应阳性者。欧洲也曾报告数例因皮肤伤口接触病料组织而感染，主要表现为局部有发痒，未曾报告有死亡。最新的报道见于1992年，在波兰因直接接触伪狂犬病毒而感染的工人，首先是手部先出现短暂的瘙痒，后扩展至背部和肩部。

猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源。不少学者认为，其他动物感染本病与接触猪、鼠有关。在猪场，伪狂犬病毒主要通过已感染猪排毒而传给健康猪，另外，被伪狂犬病毒污染的工作人员和器具在传播中起着重要的作用。而空气传播则是伪狂犬病毒扩散的最主要途径，但到底能传播多远还不清楚。人们还发现在邻近有伪狂犬病发生的猪场周围放牧的牛群也能发病，在这种情况下，空气传播是惟一可能的途径。在猪群中，病毒主要通过鼻分泌物传播，另外，乳汁和精液也是可能的传播方式。

除猪以外的其他动物感染伪狂犬病毒后，其结果都是死亡。猪发生伪狂犬病后，其临诊症状因日龄而异，成年猪一般呈隐性感染，怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊胎和种猪不育等综合症候群。15日龄以内的仔猪发病死亡率可达100％，断奶仔猪发病率可达40％，死亡率20％左右；对成年肥猪可引起生长停滞、增重缓慢等。

疫苗接种是预防、控制甚至消灭伪狂犬病的主要措施之一。亚单位疫苗不含有核酸物质，安全性较好，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭，然而，目前研究的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗生产成本高，免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗，应用受到限制。可以说，缺少安全、有效的疫苗是目前预防和控制猪繁殖与呼吸综合征发生与流行的主要障碍，迫切需要安全、有效、廉价的新型疫苗。

发明内容

为解决现有技术不足，本发明创造性地将猪伪狂犬病毒变异株的gB、gC糖蛋白片段基因串联大肠杆菌耐热肠毒素(ST)及不耐热肠毒素(LT)融合基因片段STLT进行表达，生产了一种能够有效预防猪伪狂犬病毒感染的新型亚单位疫苗，疫苗免疫效果好。本发明提供的制备猪伪狂犬病毒亚单位疫苗的方法，成本低、生产效率高。

本发明提供的一种猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗，包括免疫量的gB-STLT-gC重组蛋白。所述gB-STLT-gC重组蛋白是猪伪狂犬病毒gB蛋白片段、大肠杆菌耐热肠毒素(ST)及不耐热肠毒素(LT)、猪伪狂犬病毒gC蛋白片段的融合。

作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病毒gB蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病毒gC蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

作为本发明的一种实施方式，所述大肠杆菌耐热肠毒素(ST)及不耐热肠毒素(LT)的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。

作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗还包括佐剂，例如SEPPIC公司的MONTANIDE ISA 206 VG佐剂。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗中gB-STLT-gC重组蛋白的抗原含量为50～100μg/mL。进一步地，所述疫苗组合物中gB-STLT-gC重组蛋白抗原含量为75μg/mL。

本发明提供的一种猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗的制备方法，包括步骤：

(1)分别克隆、扩增编码猪伪狂犬病毒gB蛋白片段、gC蛋白片段的基因、以及编码大肠杆菌耐热肠毒素(ST)及不耐热肠毒素(LT)的基因；

(2)构建gB-STLT-gC融合蛋白基因片段；

(3)构建表达gB-STLT-gC融合蛋白的质粒；

(4)通过表达gB-STLT-gC融合蛋白的质粒表达gB-STLT-gC重组蛋白、纯化，加入佐剂，乳化。

作为本发明的一种实施方式，所述gB蛋白片段是氨基酸SEQ ID NO.1所述的猪伪狂犬病毒TJ株gB蛋白的第529位至744位。

作为本发明的一种实施方式，所述编码gB蛋白片段的基因如SEQ ID NO.6所示。

作为本发明的一种实施方式，所述gC蛋白片段是氨基酸SEQ ID NO.3所述的猪伪狂犬病毒TJ株gC蛋白的第52位至257位。

作为本发明的一种实施方式，所述编码gC蛋白片段的基因如SEQ ID NO.7所示。

作为本发明的一种实施方式，所述大肠杆菌肠毒素基因片段STLT的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

作为本发明的一种实施方式，本发明的亚单位疫苗的制备方法包括：

(1)将gB蛋白片段基因与gC蛋白片段基因通过大肠杆菌肠毒素基因片段STLT序列连接，构建gB-STLT-gC基因。

(2)将gB-STLT-gC克隆到pFastBacHTA转移载体，构建重组质粒pFastBac-gB-STLT-gC。

(3)将步骤(2)中的重组质粒pFastBac-gB-STLT-gC转化DH10Bac感受态细胞，通过转座，获得重组Bacmid-gB-STLT-gC。

(4)将步骤(3)中获得的重组Bacmid-gB-STLT-gC转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBac-gB-STLT-gC。

(5)培养所述步骤(4)得到的重组杆状病毒rBac-gB-STLT-gC，收获上清，得到表达的gB-STLT-gC重组蛋白，纯化，加入佐剂，乳化。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(5)中所述昆虫细胞为sf9细胞。

本发明的突出优点在于：

(1)本发明所述制备方法简单，能大量制备猪伪狂犬病毒抗原蛋白gB-STLT-gC，且抗原纯化方式简单，大大降低生产成本，有利于大规模生产。

(2)本发明制备方法制备抗原蛋白，免疫效果良好，免疫剂量小，进一步降低了生产成本。

(3)本发明的方法提供了一种完善预防和或治疗猪伪狂犬病病毒感染的途径，避免了传统活疫苗毒力返强及散毒风险的发生，对于净化猪伪狂犬病毒有着积极的现实意义。

附图说明

图1是SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物，M：蛋白Marker；1：感染空杆状病毒的昆虫细胞；2：rBac-gB-STLT-gC重组病毒表达产物；3：rBac-gB-gC重组病毒表达产物。

图2是Western Blot鉴定重组杆状病毒表达产物，M：蛋白Marker；1：感染空杆状病毒的昆虫细胞；2：rBac-gB-STLT-gC重组病毒表达产物；3：rBac-gB-gC重组病毒表达产物。

图3是不同组别攻毒后体温变化。

具体实施方式

实施例1融合蛋白gB-STLT-gC及gB-gC的表达

1、猪伪狂犬病毒gB蛋白片段的扩增及gB-STLT的扩增

取200μL病毒液(扬州优邦生物药品有限公司保存)，参照TaKaRa公司DNAisoReagent试剂说明书提取PRV总DNA。利用引物gBF和gBR扩增gB基因编码529～744氨基酸的片段，利用南京金斯瑞合成的STLT基因，并利用overlap PCR将二者扩增在一起(引物为gBF和STLTR)。引物见表1，PCR反应体系见表2，PCR反应条件见表3。

利用引物gBF和gBR'扩增gB'基因编码529～744氨基酸的片段，引物见表1，PCR反应体系见表2，PCR反应条件见表3。

表1 PCR引物表

人工序列，用于PCR

表2 PCR体系

表3 PCR反应条件

2、猪伪狂犬病毒gC蛋白片段基因的扩增

以步骤1中提取的DNA为模板，参照步骤1中的PCR反应体系及条件，利用引物gCF和gCR扩增gC基因编码52～257氨基酸的片段。引物见表4。

以步骤1中提取的DNA为模板，参照步骤1中的PCR反应体系及条件，利用引物gCF'和gCR扩增gC'基因编码52～257氨基酸的片段。引物见表4。

表4 gC基因扩增引物

3、gB-STLT-gC及gB-gC基因的构建

以步骤1、2扩增得到的gB-STLT和gC为模板，参照步骤1中的PCR反应体系及条件，利用引物gBF和gCR扩增gB-STLT-gC基因。

以步骤1、2扩增得到的gB'和gC'为模板，参照步骤1中的PCR反应体系及条件，利用引物gBF和gCR扩增gB-gC基因，并且在gB和gC间用GlyGlySerGlyGly进行连接。

4、gB-STLT-gC及gB-gC重组蛋白表达转移载体的构建

将步骤3扩增的PCR产物利用BamH I和Hind III进行双酶切，与同样双酶切的pFastBacHTA载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，获得的阳性质粒命名为pFastBac-gB-STLT-gC、pFastBac-gB-gC。

5、重组Bacmid的构建

将重组转移质粒pFastBac-gB-STLT-gC、pFastBac-gB-gC转化DH10Bac感受态细胞，轻轻混匀，冰上孵育30min，42℃热激转化90s，冰上孵育5min加入LB培养基37℃220rpm培养4h，取100μL培养物涂布于含有抗性的筛选平板上，37℃培养72h，挑选白斑进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的单菌落培养后抽提杆粒，并命名为rBacmid-gB-STLT-gC、rBacmid-gB-gC。

6、重组杆状病毒的获得及传代

将重组的rBacmid-gB-STLT-gC、rBacmid-gB-gC转染昆虫细胞sf9.参照Cellfectin^TM II Reagent(Invitrogen^TM)说明书进行转染，培养至可见细胞明显病变后，收获培养上清，该上清即为重组杆状病毒F1代rBac-gB-STLT-gC、rBac-gB-gC。

将上述收获的F1代重组杆状病毒以1％的接毒量接入处于生长对数期的sf9细胞(2.0×10⁶cfu/mL)，27℃ 110rpm培养至细胞病变80％以上收获培养物上清，该上清即为F2代重组杆状病毒。重复上述操作，收获F3\F4代重组杆状病毒。

7、蛋白表达

将步骤5中获得的F4代的重组杆状病毒按照MOI＝5～10的接毒量接入HF细胞，接种后约7d左右收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白得到表达(一抗为猪伪狂犬阳性血清；二抗为HRP标记的鼠抗猪酶标二抗)。目的蛋白经过镍柱纯化，参照上海生工BCA试剂盒进行蛋白定量，结果显示纯化后的目的蛋白浓度为2.33mg/mL。

实施例2猪伪狂犬病毒亚单位疫苗的制备

取实施例1中获得的纯化的gB-STLT-gC、gB-gC重组蛋白，加入佐剂进行乳化，混匀，4℃保存。疫苗具体配比见表5、6。

表5 猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗gB-STLT-gC成分配比

表6 猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗gB-gC成分配比

实施例3猪伪狂犬病毒亚单位疫苗免疫原性试验

选取gE抗体阴性、gB抗体阳性的28日龄断奶仔猪40头，随机分成8组，每组5头，隔离饲养。1～6组分别免疫实施例2中制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3，疫苗4、疫苗5、疫苗6，第7和第8组注射相同剂量的无菌PBS。免疫后28日，采用猪伪狂犬变异株(扬州优邦生物药品有限公司于2015分离于江西某猪场送检病料，命名为JX-15)对第1～7组进行滴鼻攻毒，攻毒剂量为1×10^8.0TICD₅₀/mL。攻毒后每天观察仔猪临床表现，测量并记录直肠温度。

结果在该攻毒剂量下，第1组5只猪攻毒后第2天发烧，轻微呼吸道症状，攻毒10天后开始恢复。第2组和第3组无明显临床症状，仅出现轻微发热，咳嗽等症状，未观察到神经症状，攻毒后1周，体温基本恢复正常，攻毒后10天所有临床症状消失。第1～3组均获得免疫保护，仅第1组疫苗免疫组出现短暂临床症状，最终存活。第4、5、6组攻毒后第2天高烧，呼吸道症状严重，攻毒后第4～5天，有仔猪出现呆立、反应迟钝等症状，呼吸困难，呈犬坐状态，并伴有仔猪死亡，攻毒后第7天，存活仔猪体温基本恢复，攻毒后第10天所有症状全部消失。第7组在攻毒后出现典型的猪伪狂犬病毒感染临床症状(高热、精神沉郁、食欲废绝)，攻毒后2天发生共济失调，攻毒7天后仔猪陆续死亡；第8组仔猪无猪伪狂犬病毒感染的临床症状，全部存活。

根据攻毒试验结果发现，在gB、gC蛋白片段之间融合大肠杆菌耐热肠毒素(ST)及不耐热肠毒素(LT)融合片段STLT较之单纯的gB、gC蛋白融合表达，前者作为疫苗抗原可有效预防猪伪狂犬病毒对仔猪的感染，并起到100％的攻毒保护效果。

表6 8组猪仔的免疫实验结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州优邦生物药品有限公司

<120> 一种猪伪狂犬病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 914

<212> PRT

<213> PRV TJ株

<400> 1

Met Pro Ala Gly Gly Gly Leu Trp Arg Gly Pro Arg Gly His Arg Pro

1 5 10 15

Gly His His Gly Gly Ala Gly Leu Gly Arg Leu Trp Pro Ala Pro His

20 25 30

His Ala Ala Ala Ala Arg Gly Ala Val Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

35 40 45

Ala Leu Ala Ala Thr Pro Thr Cys Gly Ala Ala Ala Val Thr Arg Ala

50 55 60

Ala Ser Ala Ser Pro Ala Pro Gly Thr Gly Ala Thr Pro Asp Gly Phe

65 70 75 80

Ser Ala Glu Glu Ser Leu Glu Glu Ile Asp Gly Ala Val Ser Pro Gly

85 90 95

Pro Ser Asp Ala Pro Asp Gly Glu Tyr Gly Asp Leu Asp Ala Arg Thr

100 105 110

Ala Val Arg Ala Ala Ala Thr Glu Arg Asp Arg Phe Tyr Val Cys Pro

115 120 125

Pro Pro Ser Gly Ser Thr Val Val Arg Leu Glu Pro Glu Gln Ala Cys

130 135 140

Pro Glu Tyr Ser Gln Gly Arg Asn Phe Thr Glu Gly Ile Ala Val Leu

145 150 155 160

Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro His Lys Phe Lys Ala His Ile Tyr Tyr

165 170 175

Lys Asn Val Ile Val Thr Thr Val Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Ala Ala

180 185 190

Ile Thr Asn Arg Phe Thr Asp Arg Val Pro Val Pro Val Gln Glu Ile

195 200 205

Thr Asp Val Ile Asp Arg Arg Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr

210 215 220

Val Arg Asn Asn His Lys Val Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asn Pro

225 230 235 240

Val Glu Val Asp Leu Arg Pro Ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly Thr Arg

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp

290 295 300

Ile Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Leu Arg Glu Gly Ala His Gly

305 310 315 320

Glu His Ile Gly Tyr Ala Pro Gly Arg Phe Gln Gln Val Glu His Tyr

325 330 335

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340 345 350

Arg Asn Phe Leu Arg Thr Pro His Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Ala

355 360 365

Pro Lys Thr Arg Arg Val Cys Ser Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ala Glu

370 375 380

Glu Met Ile Arg Asp Glu Thr Arg Asp Gly Ser Phe Arg Phe Thr Ser

385 390 395 400

Arg Ala Leu Gly Ala Ser Phe Val Ser Asp Val Thr Gln Leu Asp Leu

405 410 415

Gln Arg Val His Leu Gly Asp Cys Val Leu Arg Glu Ala Ser Glu Ala

420 425 430

Ile Asp Ala Ile Tyr Arg Arg Arg Tyr Asn Asn Thr His Val Leu Ala

435 440 445

Gly Asp Lys Pro Glu Val Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Val Val Ala

450 455 460

Phe Arg Pro Leu Ile Ser Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Ala Arg Glu

465 470 475 480

Leu Glu Arg Leu Gly Leu Ala Gly Val Val Gly Pro Ala Ser Pro Ala

485 490 495

Ala Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Glu

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515 520 525

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530 535 540

Val Asn Asp Met Leu Ser Arg Ile Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gln

545 550 555 560

Asn Lys Asp Arg Thr Leu Trp Gly Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser

565 570 575

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580 585 590

Gly Asp Val Met Ala Ile Ser Arg Cys Val Glu Val Arg Gly Gly Val

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610 615 620

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

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Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Asp

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Val Val Leu Leu Arg Gly Ile Ala Asn Phe Phe Gln Gly Leu Gly Asp

755 760 765

Val Gly Ala Ala Val Gly Lys Val Val Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val

770 775 780

Ile Ser Ala Val Gly Gly Met Val Ser Phe Leu Ser Asn Pro Phe Gly

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Ala Leu Ala Ile Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Phe

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Leu Ala Tyr Arg His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Asn Pro Met Lys Ala

820 825 830

Leu Tyr Pro Val Thr Thr Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Val Glu Glu

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850 855 860

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Lys Lys Asn Ser Gly Pro Ala Leu Leu Ala Ser Arg Val Gly Ala Met

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Ala Thr Arg Arg Arg His Tyr Gln Arg Leu Glu Asn Glu Asp Pro Asp

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Ala Pro

<210> 2

<211> 216

<212> PRT

<213> PRV TJ株

<400> 2

Ala Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Ala His

1 5 10 15

Val Asn Asp Met Leu Ser Arg Ile Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gln

20 25 30

Asn Lys Asp Arg Thr Leu Trp Gly Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser

35 40 45

Ala Val Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gln Arg Val Ser Ala Arg Met Leu

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Gly Gln Leu Gly Asp Asp Asn Glu Leu Leu Ile Ser Arg Asp Leu Ile

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Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Ser Tyr Val Arg Met Val Glu Val Pro

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Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Asp

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Ala Leu Lys Phe Tyr Asp Ile Asp

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<210> 3

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<212> PRT

<213> PRV TJ株

<400> 3

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<400> 4

Ser Thr Pro Glu Pro Val Ser Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ser Thr

1 5 10 15

Pro Ala Ala Val Ser Thr Pro Arg Val Pro Pro Pro Ser Val Ser Arg

20 25 30

Arg Lys Pro Gln Arg Asn Gly Asn Arg Thr Arg Val His Gly Asp Lys

35 40 45

Ala Thr Ser His Gly Arg Lys Arg Ile Val Cys Arg Glu Arg Leu Phe

50 55 60

Ser Ala Arg Val Gly Asp Ala Val Ser Phe Gly Cys Ala Val Val Pro

65 70 75 80

Arg Ala Gly Glu Thr Phe Glu Val Arg Phe Cys Arg Arg Gly Arg Phe

85 90 95

Arg Ser Pro Asp Ala Asp Pro Glu Tyr Phe Asp Glu Pro Pro Arg Pro

100 105 110

Glu Leu Pro Arg Glu Arg Leu Leu Phe Ser Ser Ala Asn Ala Ser Leu

115 120 125

Ala His Ala Asp Ala Leu Ala Ser Ala Val Val Val Glu Gly Glu Arg

130 135 140

Ala Thr Val Ala Asn Val Ser Gly Glu Val Ser Val Arg Val Ala Ala

145 150 155 160

Ala Asp Ala Glu Thr Glu Gly Val Tyr Thr Trp Arg Val Leu Ser Ala

165 170 175

Asn Gly Thr Glu Val Arg Ser Ala Asn Val Ser Leu Val Leu Tyr His

180 185 190

Gln Pro Glu Phe Gly Leu Ser Ala Pro Pro Val Leu Phe Gly

195 200 205

<210> 5

<211> 108

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 5

Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Ser Ala Gly

1 5 10 15

Ser Tyr Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

20 25 30

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

35 40 45

Ser Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

50 55 60

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

65 70 75 80

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

85 90 95

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn

100 105

<210> 6

<211> 648

<212> DNA

<213> PRV TJ株

<400> 6

gccgagtttg cgcgcctgca gttcacctac gaccacatcc aggcgcacgt gaacgacatg 60

ctgagccgca tcgcggccgc ctggtgcgag ctgcagaaca aggaccgcac cctgtggggc 120

gagatgtcgc gcctgaaccc cagcgccgtg gccacggccg cgctgggcca gcgcgtctcg 180

gcgcgcatgc tcggcgacgt gatggccatc tcgcggtgcg tggaggtgcg cggcggcgtg 240

tacgtgcaga actccatgcg cgtgcccggc gagcgcggca cgtgctacag ccgcccgctg 300

gtgaccttcg agcacaacgg cacgggcgtg atcgagggcc agctcggcga cgacaacgag 360

ctcctcatct cgcgcgacct catcgagccc tgcaccggca accaccggcg ctactttaag 420

ctgggcggcg ggtacgtgta ctacgaggac tacagctacg tgcgcatggt ggaggtgccc 480

gagacgatca gcacgcgggt gaccctgaac ctgacgctgc tcgaggaccg cgagttcctg 540

cccctcgagg tgtacacgcg cgaggagctc gccgacacgg gcctcctgga ctacagcgag 600

atccagcgcc gcaaccagct gcacgcgctc aagttctacg acattgac 648

<210> 7

<211> 621

<212> DNA

<213> PRV TJ株

<400> 7

tcgacgcccg agcccgtctc ggggacgacg ggggccgcgg cctccacgcc cgccgccgtc 60

tcgacgcccc gggtcccgcc gccctcggtc tcgcgccgga agccccagcg gaacggcaac 120

aggacgcgcg tccacggcga caaggccacc tcgcacgggc gcaagcgcat cgtgtgccgc 180

gagcggctgt tctcggcgag ggtgggggac gcggtcagct tcgggtgcgc cgtcgtcccg 240

cgcgccgggg agaccttcga ggtccgcttc tgccgccgcg ggcgcttccg ctcgcccgac 300

gccgaccccg agtactttga cgagcccccg cgcccggagc tcccgcggga gcggctcctc 360

ttcagctccg ccaacgcctc cctcgcccac gcggacgcgc tcgcctccgc cgtcgtcgtc 420

gagggcgagc gcgcgaccgt cgccaacgtc tcgggcgagg tgtccgtgcg cgtggccgcg 480

gcggacgccg agaccgaggg cgtctacacg tggcgcgtgc tgtccgccaa cggcaccgag 540

gtccgcagcg ccaacgtctc gctcgtcctg taccaccagc ccgagttcgg cctgagcgcg 600

ccgcccgtcc tcttcggctg a 621

<210> 8

<211> 324

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 8

aacacatttt actgctgtga actttgttgt aatcctgcca gtgctggaag ttataacaca 60

caaatatata cgataaatga caagatacta tcatatacgg aatcgatggc aggcaaaaga 120

gaaatggtta tcattacatt taagagcggc gaaacatttc aggtcgaagt cccgggcagt 180

caacatatag actcccagaa aaaagccatt gaaaggatga aggacacatt aagaatcaca 240

tatctgaccg agaccaaaat tgataaatta tgtgtatgga ataataaaac ccccaattca 300

attgcggcaa tcagtatgaa aaac 324

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 9

cgcggatcca tggccgagtt tgcgcgcc 28

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 10

cagcagtaaa atgtgttgtc aatgtcgtag aacttgagcg tgctgg 46

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 11

gcctccgctt ccgccgtcaa tgtcg 25

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 12

tcgggcgtcg agtttttcat actgattgcc gcaattg 37

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 13

atgaaaaact cgacgcccga gcccgtctcg ggg 33

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 14

ggcggaagcg gaggctcgac gcccg 25

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 15

ccaagctttc agccgaagag gacgggcggc gcg 33

Claims

1.一种猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗，其特征在于，包括免疫量的gB-STLT-gC重组蛋白；所述gB-STLT-gC重组蛋白是猪伪狂犬病毒gB蛋白片段、大肠杆菌耐热肠毒素及不耐热肠毒素、猪伪狂犬病毒gC蛋白片段的融合。

2.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒gB蛋白片段的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒gC蛋白片段的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。

4.根据权利要求1～3任一所述的一种猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗还包括佐剂。

5.根据权利要求1～3任一所述的一种猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中gB-STLT-gC重组蛋白的抗原含量为50～100μg/mL。

6.一种猪伪狂犬病毒病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)分别克隆、扩增编码猪伪狂犬病毒gB蛋白片段、gC蛋白片段的基因、以及编码大肠杆菌耐热肠毒素及不耐热肠毒素的基因；

(2)构建gB-STLT-gC融合蛋白基因片段；

(3)构建表达gB-STLT-gC融合蛋白的质粒；

7.一种基因，其特征在于，编码gB-STLT-gC重组蛋白；所述gB-STLT-gC重组蛋白是猪伪狂犬病毒gB蛋白片段、大肠杆菌耐热肠毒素及不耐热肠毒素、猪伪狂犬病毒gC蛋白片段的融合。

8.一种载体，其特征在于，携带权利要求7所述的基因。

9.一种细胞，其特征在于，携带权利要求7所述的基因或其编码的蛋白。

10.权利要求1～5任一所述疫苗在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病毒相关疾病或由猪伪狂犬病毒感染的药物中的应用。