CN112961232A - 一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抑制伪狂犬病毒侵染的BanLec重组蛋白，通过体外原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的BanLec重组蛋白。以IPEC‑J2为细胞模型，检测了该重组蛋白对伪狂犬病毒感染细胞是否有抑制活性。通过CPE观测和病毒滴度测定发现该蛋白可以抑制伪狂犬病毒感染引起的细胞病变和死亡，并能显著抑制病毒侵染宿主细胞，蛋白用量在100μg/mL的条件下，对伪狂犬病毒的抑制率可达99.10％，该重组蛋白在伪狂犬病毒防治生物制剂中有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)是疱疹病毒科的一种双链DNA囊膜病毒，能感染猪、牛、羊等多种家畜和野生动物，引发以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症状的伪狂犬病。PRV具有典型的疱疹病毒粒子结构，直径一般200nm左右，在电子显微镜下观察呈圆形或者椭圆形。成熟的病毒粒子由外到内主要包括囊膜、蛋白质皮层、核衣壳和双链线状基因组DNA，其中囊膜含有11个功能多样的糖蛋白包括gB、gC、gD等。
猪是PRV的自然宿主和贮存宿主，受PRV感染后，成年猪出现呼吸道症状并可建立终身性潜伏感染，仔猪出现脑脊髓炎，病死率可达100％，怀孕母猪流产、死胎。2011年PRV强变异毒株在我国出现，不仅给生猪养殖行业造成巨大经济损失，还出现多起感染人的病例，PRV已成为公共卫生和健康养殖领域共同面临的一个重要威胁，抗PRV蛋白抑制剂的开发对于PRV的有效防控具有重要意义。
香蕉凝集素(BanLec)，是一种从成熟的香蕉果实里分离出来的二聚体的蛋白，分子量约30kDa。它采用的是β-三棱镜(β-prism)折叠模式，包含三个希腊钥匙转角基序，希腊钥匙基序1和2都含有一个可以结合高甘露糖的GXXXD基序。BanLec被报道能够结合在某些富含甘露糖的病毒上(比如HIV、HCV、Influenza virus)从而阻断病毒侵染细胞的进程。但目前尚未报道它是否抑制伪狂犬病毒的侵染和增殖。然而，BanLec同时也具有分裂素的活性，能够激活细胞的增殖，从而产生一定的副作用。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种BanLec重组蛋白，该蛋白保留了抗病毒的活性，能够抑制伪狂犬病毒感染，但去除了刺激细胞增殖的副作用。
本发明提出一种BanLec重组蛋白，所述重组蛋白包括BanLec蛋白的氨基酸序列，并且包括在第84位氨基酸处的突变，第84位氨基酸由组氨酸突变为苏氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白的C末端添了亮氨酸和谷氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白的C末端还添加了蛋白标签。
在本发明的一些优选实施方式中，所述蛋白标签为HIS6标签。
在本发明的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白具有：
(I)：如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：MNGAIKVGAWGGNGGSAFDMGPAYRIISVKIFSGDVVDGVDVTFTYYGKTETRHYGGSGGTPHEIVLQEGEYLVGMAGEVANYTGAVVLGKLGFSTNKKAYGPFGNTGGTPFSLPIAAGKISGFFGRGGKFLDAIGVYLEPLEHHHHHH；
(II)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(III)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(IV)：与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(III)序列至少有80％同源性的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。
本发明还提出一种核酸分子，所述核酸分子编码上述氨基酸。
本发明还提出一种表达载体，所述表达载体包含上述核酸分子。
本发明还提出一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体。
本发明还提出一种菌株，所述菌株包含上述表达载体。
本发明还提出上述BanLec重组蛋白或核酸分子或表达载体或宿主细胞或菌株在制备抑制疱疹病毒感染药物中的应用。
本发明还提出上述BanLec重组蛋白或核酸分子或表达载体或宿主细胞或菌株在制备治疗伪狂犬病毒药物中的应用。
本发明还提出一种药物，所述药物含有上述BanLec重组蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包含药学可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的形式为注射剂、胶囊或贴剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为疫苗。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种重组BanLec重组蛋白，该蛋白保留了抗病毒的活性，但去除了刺激细胞增殖的副作用，并在C端带有组氨酸标签，为该蛋白的检测和纯化提供了便利条件。通过体外原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的BanLec重组蛋白。
本发明还以IPEC-J2为细胞模型，检测了该重组蛋白对伪狂犬病毒感染细胞是否有抑制活性，通过CPE观测和病毒滴度测定发现该蛋白可以抑制伪狂犬病毒感染引起的细胞病变和死亡，并能显著抑制病毒侵染宿主细胞，蛋白用量在100μg/mL的条件下，对伪狂犬病毒的抑制率可达99.10％，所述蛋白可用于阻断伪狂犬病毒对宿主细胞的侵染，可明显缓解伪狂犬病毒感染引发的细胞病变，可能通过结合伪狂犬病毒gH等蛋白表面的甘露糖分子来阻断病毒感染细胞，该重组蛋白在伪狂犬病毒防治生物制剂中有潜在的应用前景，并可拓展至抑制疱疹病毒对细胞的侵染。
附图说明
图1为本发明实施例1中的BanLecH84T表达分析。
图2为本发明实施例1中的BanLecH84T亲和层析纯化结果图。
图3为本发明实施例2中的BanLecH84T和PRV处理对细胞的影响。
图4为BanLecH84T抑制伪狂犬病毒的复制；其中A图为BanLecH84T对PRV的滴度检测，B图为BanLecH84T对PRV的抑制率。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
1.重组质粒BanLecH84T-pET 24b的构建及转化
通过酶切位点Nde I和Xho I将BanLecH84T编码区连入含C端HIS标签的载体pET24b获得重组表达质粒。将1μl重组质粒BanLecH84T-pET 24b加到装有100μl RosettaBlue pLys S E.coli cells感受态的1.5ml EP管中，冰浴30min，42℃90s，再次放置在冰上3min，向管中加入0.5ml 2YT液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。取出EP管，2500rpm离心5min，去除上清，轻轻吹打悬菌。将取上述菌液涂布于含卡那霉素的筛选平板上,然后正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。
2.BanLecH84T蛋白的表达
设置不同诱导条件对进行BanLecH84T蛋白试表达，蛋白序列如SEQ ID NO.1所示：MNGAIKVGAWGGNGGSAFDMGPAYRIISVKIFSGDVVDGVDVTFTYYGKTETRHYGGSGGTPHEIVLQEGEYLVGMAGEVANYTGAVVLGKLGFSTNKKAYGPFGNTGGTPFSLPIAAGKISGFFGRGGKFLDAIGVYLEPLEHHHHHH。挑取转化子单菌落接种于适量含卡那霉素的2YT液体培养基中。待OD600达到0.8时加入终浓度为0mM、1mM、0.1mM的IPTG，分别于37℃诱导5h，16℃诱导16h。收集细菌后，以适量PBS重悬菌体，超声裂解，分别取上清和沉淀加入SDS上样缓冲液制备电泳样品，并以15％分离胶浓度的SDS-PAGE电泳分析，结果见图1。从图1中的电泳结果表明，在BanLecH84T 1mM IPTG，37℃诱导5h，可以得到较多的可溶蛋白，BanLecH84T以可溶蛋白形式在大肠杆菌中表达，最适诱导表达条件为1mM IPTG，37℃诱导表达5h，于是接下来采用这个条件来大量表达目的蛋白。
取400μl菌液加到50ml含卡那霉素和2YT培养基的三角瓶中，200rpm 37℃培养5h。接种20ml于2L含有Amp抗性(100μg/ml)的LB大瓶中，200rpm 37℃培养至OD600＝0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃振荡培养5h后收菌提取蛋白。
收菌(以下步骤均在低温下进行)：6000rpm，15min离心，去除上清，将沉淀(大肠杆菌)用50ml左右的分子筛缓冲液(20mM Tris,50mM NaCl，pH8.0)悬浮，收集于小瓶中，冰上超声裂解(超声6S，间隔12S，120次，300W)。15000rpm，20min离心，去除沉淀，将上清用0.22μm的滤器过滤除菌，倒入干净的小瓶中放冰上备用。
3.BanLecH84T的纯化
处理后的上清液在4℃通过蠕动泵以1～2ml/min的速度流入5ml His Trap预装柱中，从而使得带His标签的nectin4 V结构域蛋白和His-Beads结合。利用快速蛋白液相色谱(AKTA)来进行蛋白质分离纯化。A泵中流过的是分子筛凝胶层析缓冲液，即20mM Tris，50mMNaCl，pH8.0；B泵中流过的是20mM Tris，50mM NaCl，400mM咪唑，pH8.0。通过B泵中液体与A泵中液体的百分比来调节流过His Trap预装柱的液体中相应咪唑的浓度，从而形成一个咪唑洗脱梯度，依次为20mM、40mM、100mM、200mM、400mM。不同梯度下洗脱的蛋白经过5％的SDS-PAGE检测，从而鉴定出目的蛋白是在哪个咪唑梯度下洗脱下来。以3kD截留的超滤管将目的蛋白洗脱液浓缩，然后利用HiTrap Desalting 5ml柱去除咪唑，收集含目的蛋白的洗脱峰，以SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白质，结果见图2。从图2可以看出100mM的咪唑能洗脱部分目的蛋白，400mM咪唑洗脱下来的蛋白纯度很高，没有杂蛋白。
实施例2
1.BanLecH84T和PRV对细胞形态的影响
将IPEC-J2接种至12孔细胞培养板中(37℃、5％CO2)中，培养至单层，每孔2х105个，设置对照组和3个不同处理组，对照组不加BanLecH84T和PRV，3个处理组分别加入PRV、BanLecH84T(100μg/ml)、PRV+BanLecH84T(100μg/ml)，每组3个重复，针对不同浓度的BanLecH84T(1,10，100μg/ml)设置多块12孔板。细胞接种PRV(100μL/well，MOI＝0.1)后孵育2h后移除上清液，换成细胞培养基，在处理12h、24h、36h、48h后等不同时间点在显微镜下观察各孔中细胞病变程度，拍照记录细胞形态，48h后的细胞形态结果见图3，可以看出，PRV感染细胞引起一系列病变包括细胞变圆、脱落漂浮等，加入BanLecH84T可以抑制PRV引起的细胞病变，用BanLecH84T直接处理细胞不会引起细胞病变。
2.BanLecH84T抑制伪狂犬病毒的复制实验
将IPEC-J2接种至12孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养，24h后在病毒对照组中只加PRV-LC病毒，在处理组中加入1ml PRV与BanLecH84T混合液，4℃培养1h，分别弃去病毒液、混合液，PBS清洗三遍，加入含2％FBS DMEM F12培养基继续培养。细胞对照组为无血清培养基培养1h，后换成2％DMEM F12培养基。每个组分别设3个生物学重复，每个孔体系皆为1ml。分别12h、24h、48h收集细胞样品，提取核酸，以荧光定量PCR测定PRV的gD基因表达量，对比实验组和对照组gD基因拷贝数，测定病毒对照组和BanLecH84T处理组的PRV滴度，结果见图4中A图；计算BanLecH84T对PRV抑制率，结果见图4中B图，可以看出BanLecH84T可显著降低PRV感染细胞IPEC-J2 24h和48h的滴度，在培养24h后BanLecH84T对PRV的抑制率为97.70％，在培养48h后BanLecH84T对PRV的抑制率为99.10％，BanLecH84T对PRV有很好的抑制作用。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院农业生物基因研究中心
<120> 一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 149
<212> PRT
<213> BanLec
<400> 1
Met Asn Gly Ala Ile Lys Val Gly Ala Trp Gly Gly Asn Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ala Phe Asp Met Gly Pro Ala Tyr Arg Ile Ile Ser Val Lys Ile Phe
20 25 30
Ser Gly Asp Val Val Asp Gly Val Asp Val Thr Phe Thr Tyr Tyr Gly
35 40 45
Lys Thr Glu Thr Arg His Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Thr Pro His Glu
50 55 60
Ile Val Leu Gln Glu Gly Glu Tyr Leu Val Gly Met Ala Gly Glu Val
65 70 75 80
Ala Asn Tyr Thr Gly Ala Val Val Leu Gly Lys Leu Gly Phe Ser Thr
85 90 95
Asn Lys Lys Ala Tyr Gly Pro Phe Gly Asn Thr Gly Gly Thr Pro Phe
100 105 110
Ser Leu Pro Ile Ala Ala Gly Lys Ile Ser Gly Phe Phe Gly Arg Gly
115 120 125
Gly Lys Phe Leu Asp Ala Ile Gly Val Tyr Leu Glu Pro Leu Glu His
130 135 140
His His His His His
145
Claims (10)
1.一种BanLec重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括BanLec蛋白的氨基酸序列，并且包括在第84位氨基酸处的突变，第84位氨基酸由组氨酸突变为苏氨酸。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述BanLec重组蛋白的C末端添了亮氨酸、谷氨酸。
3.根据权利要求1或2任一项所述的BanLec重组蛋白，其特征在于，所述BanLec重组蛋白具有：
(I)：如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(II)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(III)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(IV)：与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(III)序列至少有80％同源性的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～3任一项所述BanLec重组蛋白。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4所述核酸分子。
6.一种菌株，其特征在于，所述菌株包含权利要求5所述表达载体。
7.权利要求1～3任一项所述重组蛋白或权利要求4所述核酸分子或权利要求5所述表达载体或权利要求6所述菌株在制备抑制疱疹病毒感染药物中的应用。
8.权利要求1～3任一项所述重组蛋白或权利要求4所述核酸分子或权利要求5所述表达载体或权利要求6所述菌株在制备治疗伪狂犬病药物中的应用。
9.一种药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1～3任一项所述重组蛋白。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物为疫苗，优选地，所述药物还包含药学可接受的载体和/或辅料。
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2021
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| PDB: 4PIT_A: "Chain A, Ripening-associated protein", 《GENBANK》 * |
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