CN109929014A - 一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白及其应用，该蛋白表达升高可增强鸡马立克氏病病毒(尤其是疫苗株)在鸡胚成纤维细胞上的复制，从而提高疫苗的免疫效力，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；或在SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性由a)衍生的蛋白。本发明还构建该蛋白基因缺失的重组马立克氏病病毒研究结果发现，缺失了该蛋白的MDV病毒增强了MDV诱导IFN‑I的产生，从而为设计抗马立克氏病病毒强毒感染的药物提供物质基础。该蛋白过表达ICP0蛋白的鸡胚成纤维细胞能够增强MDV的复制。

Description

一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白及其应用。

背景技术

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)自1961年正式命名以来，在世界养禽业中广泛存在，死亡率一般为10％-60％，造成巨大的经济损失。近年来，随着MDV研究技术及理论的不断发展，研究者利用MDV CVI988/Rispens株及MDV 814中国分离株等制备了具有保护力的疫苗，这些疫苗在国内外的养鸡场的广泛使用，初步控制了马立克氏病在养殖场大规模发生。然而，现行的疫苗虽然能够控制马立克氏病的发生，但不能彻底清除潜伏感染的MDV病毒粒子，这些潜伏感染的MDV可能会再次被激活，发生马立克氏病，一旦发生，将会造成严重的经济损失。然而目前，虽然MDV病毒疫苗的研究已经成功，较好的防控了国内外MDV病毒的发生，然而，MDV疫苗病毒在培养过程中的病毒滴度仍然明显低于其他禽病病毒，而目前在国内外的研究主要集中在对MDV重组疫苗及致瘤特性的研究，而对MDV复制相关基因及蛋白的研究鲜见，这将严重阻碍MDV疫苗优化改进的研究进程，使得MDV在防控上造成困难，也将使得目前现行的疫苗存在使用风险。

MDV是α疱疹病毒亚科重要的成员之一，是一种严格细胞结合型病毒，其能够激发宿主产生抗肿瘤免疫反应，而IFN-I在MDV诱导的肿瘤免疫中发挥重要的作用。研究发现，IFN-I抑制强毒MDV RB1B株复制及其诱导的肿瘤的发生，同时IFN-I表达水平在感染的不同状态具有较大差异，这表明MDV的复制与其诱导的宿主细胞IFN-I的抗感染免疫极为相关。IFN-I几乎表达于所有的细胞，产生抗病毒感染效应是通过宿主细胞通过模式识别受体识别病原相关分子模式后，调节干扰素调节因子(Interferon regulatory factor，IRF)、核转录激活蛋白1(Nuclear transcription factor activator protein-1，AP-1)及核因子NF-κB等激活IFN-I基因的表达，发挥IFN-I的抗病毒免疫作用。然而，研究者在对α疱疹病毒的研究中发现，病毒蛋白可以调节IFN-I信号通路，抑制IFN-I的表达，增强病毒的复制。Afroz S等发现，牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1，BoHV-1)病毒通过其衣壳蛋白vp8与宿主细胞STAT1相互作用，抑制IFN-I转录及表达，增强BoHV-1病毒的复制。研究者发现单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)泛素蛋白酶UL36泛素化降解宿主细胞TRAF3分子，抑制了IFN-β启动子活性，阻断了IFN-I的抗病毒活性。这表明，宿主细胞通过IFN-I进行抗α疱疹病毒免疫反应，而α疱疹病毒则通过其相关蛋白干扰IFN-I表达的信号通路，抵抗宿主IFN-I的抗病毒免疫反应。而对MDV的研究中发现，MDV感染雏鸡细胞后，宿主通过模式识别受体介导IFN-I产生来抗病毒感染，而MDV则通过其Meq、早期基因等调节宿主细胞IFN-I等相关细胞因子的表达，实现其在宿主体内的复制以及致瘤作用。

研究发现，α疱疹病毒的早期转录因子在病毒感染过程中通过调节宿主IFN-I信号通路来增强病毒的复制方式，是其抵抗宿主免疫反应实现其复制及感染的新途径。致瘤型的α疱疹病毒通过早期转录因子抑制抗原递呈细胞抵抗宿主的抗感染免疫反应，而宿主细胞则通过IFN-I抑制病毒早期基因的表达阻止病毒的感染，这种作用机制在HSV研究中被证实，HSV的早期转录因子促进宿主细胞PML蛋白的降解抑制IFN-I的产生，而早期转录因子的突变减弱了病毒的致瘤能力，增强了宿主IFN-I的抗感染能力。这表明早期转录因子是α疱疹病毒调节宿主IFN-I抗感染的重要蛋白。最近的研究发现，HSV的ICP0蛋白通过抑制人上皮成纤维细胞DNA受体干扰素诱导蛋白16(IFI16)活性阻断干扰素调节因子3(IFR3)的活化，抑制了的IFN-I的表达与分泌，增强病毒在宿主细胞内的复制；除人类的HSV外，动物的BoHV-1的ICP0降解宿主细胞的IRF3抑制了IFNβ抗感染免疫反应，水痘带状疱疹病毒(Varicella-zoste virus，VZV)ICP0(ORF61)阻断NFκB信号通路的活化，抑制IFN-I的抗感染作用。以上研究结果表明，ICP0蛋白在IFN-I诱导的抗α疱疹病毒免疫过程中发挥重要的调节作用，且在不同α疱疹病毒感染过程中的作用机制具有较大差异。研究者在对MDV基因组序列分析发现，MDV基因组的TRL和IRL区的一个ORF(LORF1)存在一个与其它α疱疹病毒ICP0类似的基因。因此，挖掘此MDV调节宿主细胞IFN-I产生的相关蛋白，将为解析MDV诱导IFN-1抗感染免疫以及在疫苗生产中提高MDV复制提供基础，也将为制备抗MDV肿瘤免疫相关的生物制剂作用提供参考。

本发明就MDV早期转录蛋白ICP0能否够调节IFN-I，着眼于鸡MDV防控过程中存在的难题，利用细菌人工染色体(BAC)技术和病毒拯救技术，构建ICP0基因缺失的MDV重组病毒，然后检测重组病毒诱导宿主IFN-I的水平。并在传代细胞系DF-1细胞上对ICP0蛋白抑制IFN-I的水平进行检测，研究结果将为马立克氏病的重组活载体疫苗以及为提高MDV病毒疫苗的滴度奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白，该蛋白可以抑制宿主细胞的先天性免疫反应，而且对MDV病毒的复制具有重要作用。

本发明研究发现了MDV中的一种抑制宿主细胞IFN-I产生的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该蛋白氨基酸序列大小为238个AA，包含9个可能的结构域(可参加见图4A)，该抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白主要是通过位于138-168为氨基酸的LRR区域抑制宿主细胞IFN-I的产生，过表达的抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白的鸡胚成纤维细胞能够增强MDV的复制。

基于以上，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白，其为：a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；或

b)在a)中所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性由a)衍生的蛋白。

本领域技术人员应当理解，在不影响蛋白活性的前提下，本领域技术人员可以将所述氨基酸序列进行修改或修饰，例如将Ser替换为Thr，或者对蛋白质进行修饰以提高其稳定性。通过采用实施例中的方式制备重组病毒可以来验证所述衍生蛋白的活性。

进一步，本发明提供一种编码上述抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白的基因。具体地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因大小为717bp(包含终止密码子)。

本发明还提供一种MDV病毒，该病毒不表达所述的蛋白，或所述的蛋白表达被抑制，或所述的蛋白失活。例如，所述病毒中表达所述蛋白的基因缺失、突变或被取代。

这种缺失所述蛋白的MDV病毒，进一步可以用于各种病毒载体或疫苗。具体地说，例如该蛋白可以用于构建以该病毒的疫苗株(CVI988)作为活载体的重组疫苗，即可以在该蛋白基因所处的位置插入外源病原体抗原蛋白，以构建多价疫苗。

本发明还提供所述蛋白在抑制细胞产生IFN-I中的应用；或，在增强病毒在宿主细胞中复制中的应用；或，在提高疫苗病毒产量中的应用。

本发明还提供一种表达载体、重组病毒或转化细胞，所述表达载体上含有上述基因；所述病毒重组有上述的基因，或过表达上述的基因；所述细胞转化有所述的表达载体或所述的重组病毒。

例如，所述蛋白的在增强病毒在鸡胚成纤维细胞上复制的应用，可以将该病毒蛋白在细胞内表达后，增强病毒在细胞上的复制，提高病毒增殖滴度，从而提高疫苗株(CVI988)的免疫效力，因为(中华人民共和国农业部公告第2076号；2014.03.10)关于鸡马立克氏病疫苗质量标准中规定，疫苗的病毒滴度越高，其免疫效力越高。而针对MDV强毒，则可以为设计抗病毒药物提供靶标。

本发明还提供一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白基因缺失的MDV病毒的制备方法，其包括如下步骤：

S1、制备携带MDV BAC系统的EL250感受态细胞；

S2、采用引物从PSK-Galk载体上扩增携带MDV病毒ICP0基因同源臂的Galk基因片段；

S3、将获取的Galk基因片段转化到含有MDV BAC系统的EL250感受态大肠杆菌中；

S4、将转化后的感受态细胞在SOC培养基中复苏4-6h后，涂布到Galk阳性筛选板上，培养后，挑取单克隆采用galk的特异性引物进行PCR鉴定；

S5、将步骤S4中鉴定Galk阳性的单克隆再次划线于Galk平板上进行纯化和进一步鉴定，同时将纯化后克隆菌提取质粒后采用ICP0特异性引物进行PCR鉴定；

S6、将Galk阳性及ICP0检测阴性的MDV质粒BAC均采用QIAgen公司的Maxiprep质粒提取试剂盒提取的重组MDV BAC的DNA；

S7、将重组MDV BAC DNA转染鸡胚成纤维细胞，培养、传代，观察到典型的MDV细胞病变效应的鸡胚成纤维细胞即为MDV ICP0缺失病毒。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

进一步地，所述扩增的条件为94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃2min，72℃2min，35个循环。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述galk的特异性引物的序列如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S5中，所述ICP0特异性引物的序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白及其应用，不仅可以抑制宿主细胞的先天性免疫反应，而且对MDV病毒的复制具有重要作用，本发明将在疫苗制备过程中，可以广泛应用于降低病毒培养导致的细胞免疫水平，从而提高疫苗病毒产量，有利于疫苗生产工艺的改进，或者。如果利用其制备特异性的抗病毒药物，将该蛋白抑制或者缺失，则可增强MDV诱导IFN-I的产生。该抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白主要是通过位于138-168为氨基酸的LRR区域抑制宿主细胞IFN-I的产生，过表达的抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白的鸡胚成纤维细胞能够增强MDV的复制。此外，本发明构建抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白(ICP0)基因缺失的MDV，将成为将来研发新型MD疫苗提供物质基础。

附图说明

图1为重组基因缺失ICP0的MDV病毒构建，A为ICP0 PCR鉴定结果，各条带为M：DNA分子Marker，1：CVI988^ΔICP0BAC DNA，2：RB1B^ΔICP0BAC DNA，3：CVI988 BAC DNA，4：RB1B BACDNA)；B为Galk PCR鉴定结果，各条带为M：DNA分子Marker，1：CVI988^ΔICP0BAC DNA，2：RB1B^ΔICP0BAC DNA，3：CVI988 BAC DNA，4：RB1B BAC DNA；C为重组CVI988^ΔICP0病毒；D为重组RB1B^ΔICP0病毒。

图2为MDV ICP0对病毒诱导CEF细胞IFN-β产生的影响，其中，A.CVI988^ICP0对IFN-β的影响；B.RB1B^ICP0对IFN-β的影响。

图3为过表达ICP0对刺激剂诱导DF-1细胞IFN-β产生的影响，A为Poly(I：C)；B为Poly(dA：dT)；C为cGAMPs。

图4为ICP0抑制IFN-I功能域的分析结果，A为ICP0蛋白结构图；B为ICP0不同截断体对IFN-I表达的影响。

图5为ICP0对MDV病毒复制的影响；其中，A为ICP0蛋白对IB1B复制的影响，B为ICP0对CVI988复制的影响，C为ICP0过表达对RB1B复制的影响；D为ICP0过表达对CVI988复制的影响。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

下面实施例中所用的材料试剂来源如下：

鸡MDV病毒CVI988及RB1B毒株的细菌人工染色体(Bacteria ArtificialChromosome，BAC)系统及其拯救毒株按常规方法制备，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术研究室(以下简称为本实验室)保存并提供，半乳糖激酶galk基因(Gene ID：945358)由从本实验室保存的PSK-Galk载体(将galk基因在华大基因公司全基因合成后置于通用的PSK载体上保存)上扩增获得。鸡胚成纤维细胞：按常规方法取9～11日龄SPF鸡胚(购自北京市实验动物中心)，制备鸡胚成纤维细胞单层，用于增殖重组马立克氏病病毒。

大肠杆菌EL250株：将鸡MDV病毒CVI988及RB1B BAC电转化入大肠杆菌EL250感受态细胞。

马立克氏病病毒MDV CVI988/Risepens株、pUS2载体及其转移载体由本实验室保存和发明(具体制备方法可参照申请号为ZL200510086230.5的专利文献)

采用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，运用PCR程序：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃60s，72℃2min，35个循环，扩增表达鸡MDV ICP0的基因(其核苷酸序列如SEQID NO.2所示(含有终止密码子)，对应的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的真核表达质粒为p EGF-N1-ICP0由本实验室采用通用的p EGF-N1(Invitrogen)真核表达载体可按照常规载体构建方法构建并保存。DL2000及DL15000 DNA Marker：购自大连TaKaRa生物工程公司；质粒提取试剂盒：购自QIAGEN公司；DMEM、MEM及转染用营养液opti-MEM：均为Invitrogen产品；凝胶回收纯化试剂盒：购自鼎国公司和天为时代公司；脂质体：LipofectamineTM 3000，购自Invitrogen公司。

所用的溶液及配制方法如下：

50×TAE(Tris-乙酸)：24.2g Tris碱，5.71g冰乙酸，10mL 500mmol/L EDTA(pH8.0)，加去离子水，定容至100mL，工作液为1×TAE。

0.8％琼脂糖凝胶：称取0.8g琼脂糖溶于100mL1×TAE电泳缓冲液，融化后加入5μL10mg/mL EB贮存液，使凝胶中GoldView终浓度达到0.5μg/mL

5×M9储存液(1L)

30g Na₂HPO₄，15g KH₂PO₄，5g NH₄Cl，2.5g NaCl

溶解于1L去离子水中，使用前高压灭菌.

5X M63储存液(1L)

10g(NH₄)₂SO₄，68g KH₂PO₄，2.5mg FeSO₄·7H₂O，以KOH调节pH＝7，溶解于1L去离子水中，使用前高压灭菌。

其它储存液

0.2mg/mL d-biotin生物素(过滤除菌)；20％半乳糖激酶galactose(高压灭菌)；20％甘油glycerol(高压灭菌)；10mg/ml L-leucine亮氨酸，10mg/mL L-isoleucine异亮氨酸，10mg/mL L-valine缬氨酸，1M MgSO₄·7H₂O。

500×MM1，0.5mM each of ZnSO₄，CuSO₄，Na₂MoO₄，CoC₁₂，MnSO₄，CrCl₃，NiC₁₂

25mg/mL以乙醇溶解的氯霉素(1∶1000)简称为C25。

LB+C25平板：常规LB琼脂培养基在冷却至50℃，按25μg/mL终浓度加入氯霉素后倒板。

GalK阳性选择平板

在1L的试剂瓶中加入7.5g的琼脂400mL的去离子水后高压灭菌，稍微冷却后100mL高压过的5xM63培养基和0.5mL 1M MgSO₄·7H₂O。再瓶子放到50℃的水浴锅中平衡温度，加5mL的20％半乳糖激酶(终浓度0.2％)，2.5mL的0.2mg/mL生物素，2mL的如下每种氨基酸10mg/mL L-leucine，10mg/mL L-isoleucine，10mg/mL L-valine，1mL的500x MM1和500μL的25mg/mL氯霉素后倒板。

细胞培养用溶液：15％NaHCO₃：15g NaHCO₃溶于100mL双蒸水中，经115℃灭菌20min，置4℃备用

MEM原液：按1000mL双蒸水溶解1包MEM粉，15％NaHCO₃调节pH为7.4，过滤除菌，4℃保存。

犊牛血清：Hyclone公司产品，-20℃保存备用。

2×10⁴U/mL青链霉素液(双抗)：青霉素、链霉素各2×10⁶U溶于100mL双蒸水中，过滤除菌，分装后，-20℃保存备用。

7.5％NaHCO₃：7.5g NaHCO₃溶于100mL双蒸水中，经115℃灭菌20min，置4℃备用。

MEM营养液：于100mL 1×MEM溶液中无菌加入5mL犊牛血清，1mL浓度为2×10⁴U/mL双抗液，用7.5％NaHCO₃溶液调节pH至7.2左右。

MEM维持液：于100mL 1×MEM溶液中无菌加入2mL犊牛血清，1mL浓度为2×10⁴U/mL双抗液，用7.5％NaHCO₃溶液调节pH至7.2左右。

10×EDTA-胰酶溶液(2.5％)：Na₂EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.89g，KH₂PO₄0.2g，1％酚红溶液1.5mL，胰酶2.5g，溶于100mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.2～7.5，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。使用时1∶10稀释。

0.01mol/L pH7.4PBS：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，NaH₂PO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，溶于900mL双蒸水中，HCl调pH值至7.4，定容至1000mL，分装后121℃高压灭菌20min，存于室温。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂为常规试剂。

实施例1 ICP0基因缺失的MDV病毒的构建

制备携带MDV BAC系统的EL250感受态细胞，将含MDV BAC质粒的大肠杆菌EL250(将鸡MDV病毒CVI988及RB1B BAC电转化入大肠杆菌EL250感受态细胞)划线于氯霉素平板上置32℃培养2-3天，待发现出现单菌落后按照以下方法制备感受态细胞：

(1)挑取单个菌落接种于3mL的新鲜的LB+C25液体培养基中，于32℃摇床中230rpm培养过夜。

(2)次日，以1∶50的比例转接到装有70mL新鲜的LB+C25液体培养基中，置于32℃摇床中230rpm培养，大约3-4h时OD600为0.5-0.6，立即将锥形瓶置于42℃水浴锅中热激15min，边热激边晃动锥形瓶。

(3)热激后，将锥形瓶立即置冰上冷却，边冷却边晃动锥形瓶，使其快速冷却至0℃。

(4)将冷却后的培养物收集于50mL预冷的离心管中，4℃4500rpm水平离心5min。

(5)准备冰水混合物，之后用到的ddH₂O都是在冰水混合物中存放，保持低温状态。弃上清，加入1mL的ddH₂O在冰上用力旋转离心管，将沉淀悬起，之后再加入40mL的ddH₂O，混匀，4℃4500rpm水平离心5min。

(6)重复步骤(5)两次。

(7)弃掉上清之后，采用离心管壁上的水将菌体悬起，即为感受态细胞。

采用引物从PSK-Galk载体上扩增携带MDV病毒ICP0基因同源臂Galk基因片段。引物序列为：ICP0-FP(SEQ ID NO.3)：5′-AGACCACAAGATGGCACTGACCCCGTGCACGGGGATCGGCGGGACGGGTGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3′，ICP0-RP(SEQ ID NO.4)：5′-CTAATCGGAGGTATTGATGGTACTGTCGCCGCGCTCCCTCCGCCCGCTGTTCAGCACTGTCCTGCTCCT-3′，PCR程序：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃2min，72℃2min，35个循环，扩增产物大小应为1456bp。将获取的Galk基因片段电转化含有MDV BAC系统的EL250感受态大肠杆菌中，电转化条件为：1850V，25μF，100Ω，1mm。将电转化后的感受态细胞在SOC培养基中复苏4-6h后，涂布到Galk阳性筛选板(Galk板)上，置于32℃培养箱中培养3-5d，挑取单克隆采用galk的特异性引物进行PCR鉴定(PCR程序：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃60s，72℃2min，35个循环；Galk引物F(SEQ IDNO.5)：5′-CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3′，Galk引物R(SEQ ID NO.6)：5′-TCAGCACTGTCCTGCTCCT，其扩增产物大小应为1356bp)，将Galk鉴定阳性的单克隆再次划线于Galk平板上进行纯化和进一步鉴定，同时将纯化后克隆菌提取质粒后采用ICP0特异性引物进行PCR鉴定(PCR程序：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃60s，72℃2min，35个循环，其扩增产物大小应为717bp)，ICP0鉴定引物为(F(SEQ ID NO.7)：5′-ATGAACCTGACCCTGCACATCG-3′，R(SEQ ID NO.8)：5′-AGCGTAGTCGGGCACGTCGTATG-3′)，将Galk阳性及ICP0检测阴性的MDV质粒BAC均采用QIAgen公司的Maxiprep质粒提取试剂盒提取的重组MDV BAC的DNA。采用LipofectamineTM 3000脂质体转染试剂(美国Invitrogen公司)按照操作说明书将重组MDVBAC DNA转染6孔板鸡胚成纤维细胞(CEF)(1ug/每孔)，将转染后的细胞置于37℃CO₂培养箱培养3-5d，将受转染的CEF细胞以0.25％的胰酶消化后按1∶100稀释度接种到新制备的CEF细胞上，并继续培养3-5d，经2-3次盲传后，可以观察到典型的MDV细胞病变效应。收集有MDV病变的CEF细胞即为MDV ICP0缺失病毒。

对ICP0基因缺失的MDV MDV ICP0缺失病毒(记为CVI988^ΔICP0及RB1B^ΔICP0)进行检测后发现，CVI988^ΔICP0及RB1B^ΔICP0病毒不能够扩增出ICP0基因，而正常MDV病毒(CVI988及RB1B)能够扩增出ICP0基因，电泳图如图1中A所示，同时CVI988^ΔICP0及RB1B^ΔICP0病毒能够扩增出标记基因Galk，而CVI988及RB1B不能够扩增出Galk基因片段，如图1中B所示，表明CVI988^ΔICP0及RB1B^ΔICP0病毒基因组DNA构建成功。将该重组病毒转染CEF细胞后，产生典型的MDV空斑，表明重组ICP0基因缺失MDV病毒拯救成功，重组病毒在形态上与原始母源病毒具有相似的致细胞堆积的特点，如图1中C和D所示。其中，在图1中，A为ICP0 PCR鉴定结果，各条带为M：DNA分子Marker，1：CVI988^ΔICP0BAC DNA，2：RB1B^ΔICP0BAC DNA，3：CVI988 BAC DNA，4：RB1B BAC DNA)；B为Galk PCR鉴定结果，各条带为M：DNA分子Marker，1：CVI988^ΔICP0BACDNA，2：RB1B^ΔICP0BAC DNA，3：CVI988 BAC DNA，4：RB1B BAC DNA；C为重组CVI988^ΔICP0病毒；D为重组RB1B^ΔICP0病毒。

实施例2MDV病毒ICP0蛋白对其诱导宿主产生IFN-I的影响

以正常MDV(CVI988及RB1B)为对照，采用相同滴度(0.01PFU/cell)的MDV及其MDVICP0缺失毒感染CEF细胞，在感染后的不同时间段即24、48、72及96h收集细胞，采用RNA提取试剂盒提取细胞RNA并反转录成cDNA，采用荧光定量PCR检测I型干扰素(IFN-β)的转录情况，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒均为全式金生物科技有限公司产品。引物为(F(SEQ ID NO.9)：5′-CCTCAACCAGATCCAGCATTAC-3′，P(SEQ ID NO.10)：5′-CCCAGGTACAAGCACTGTAGTT-3′)，PCR条件为：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃30s，95℃15s，40cycles。

研究结果发现，CVI988^ΔICP0诱导宿主细胞产生IFN-I的转录水平明显高于其正常毒株CVI988，如图2中A所示，同时，RB1B^ΔICP0诱导宿主细胞产生IFN-I的转录水平也明显高于其正常毒株RB1B如图2中B所示，这表明，缺失了ICP0基因的MDV病毒提高了其诱导宿主产生IFN-I的水平，说明ICP0蛋白是MDV抑制鸡成纤维细胞IFN-I产生的蛋白因子。

实施例3 ICP0蛋白对鸡胚细胞DF-1细胞IFN-I产生的影响

为进一步研究ICP0蛋白抑制宿主IFN-I的转录水平，将DF-1细胞(鸡胚纤维细胞)生长于24孔细胞板中，将表达ICP0蛋白的p EGF-N1-ICP0真核表达载体按照每孔0.25μg、0.50μg及1.00μg，以空载体PEGF-N1为对照按照LipofectamineTM 3000脂质体转染试剂(货号：L3000001，美国Invitrogen公司)操作说明书转染DF-1细胞，待细胞生长24h后，采用免疫刺激剂POLY(I：C)、POLY(dA：dT)及cGAMPs处理细胞后收取细胞。具体地：将表达ICP0蛋白的真核表达载体PEGF-N1-ICP0质粒以不同转染剂量分别转染生长在24孔板里的鸡胚纤维细胞(DF-1)，以载体PEGF-N1(2.5μg/孔)为对照(Vector)，在转染后24h，分别采用病毒RNA的模拟物Poly(I：C)(5μg/孔)处理6-10h，或采用病毒DNA的模拟物Poly(dA：dT)(1μg/ml)处理18-24h，或采用DNA病毒cGAS激活模拟物cGAMPs(5μg/ml)处理18-24h。将细胞采用RNA提取试剂盒提取细胞RNA并反转录成cDNA，采用荧光定量PCR检测I型干扰素(IFN-β)的转录情况，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒均为全式金生物科技有限公司产品。引物为(F(SEQ ID NO.9)：5′-CCTCAACCAGATCCAGCATTAC-3′，P(SEQ ID NO.10)：5′-CCCAGGTACAAGCACTGTAGTT-3′)，PCR条件为：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃30s，95℃15s，40cycles。

检测结果表明，ICP0蛋白均能够显著的抑制Poly(I：C)、Poly(dA：dT)及cGAMPs激活的DF-1细胞IFN-I的产生，分别如图3(A)，图3(B)，图3(C所示，(p＜0.01)，表明，ICP0蛋白在过表达情况下可以明显抑制鸡胚细胞DF-1IFN-I的产生。

实施例4 ICP0蛋白调控鸡胚细胞DF-1细胞IFN-I表达核心结构域的分析

本发明研究发现ICP0蛋白具有9个结构域，如图4(A)所示(线段两段的数字表示该区段氨基酸的起止位置)，根据分析的结果，将分别去除9个结构域的ICP0突变体基因采用全基因合成，并将基因置于PEGF-N1表达载体上保存(生工生物工程(上海)有限公司)。采用无内毒素质粒大提试剂盒提取9个ICP0突变体的表达载体(天根生化科技有限公司)，将突变体表达载体采用脂质体转染方法转染至DF-1细胞24h后，采用免疫刺激剂POLY(I：C)处理细胞后，按照以上方法采用荧光定量PCR检测IFN-β的转录水平。即按照图4(A)所示进行阶段后构建载体，将构建好的载体转染DF-1细胞，采用免疫刺激剂处理后，检测IFN-I的转录水平，研究结构表明，ICP0蛋白的多个结构域对宿主细胞IFN-I具有明显影响，ICP0不同截断体对IFN-I表达的影响结果如图4(B)，但是缺失了LRRNT(138-168位的氨基酸)区域的ICP0蛋白完全失去了抑制宿主IFN-I产生的能力(统计学分析结果显示：缺失了LRRNT的ICP0与阳性对照载体诱导的IFN-β无显著性差异(ns，p＞0.05))，这表明，ICP0蛋白的LRRNT结构域是其关键抑制宿主细胞IFN-I产生的功能结构域。

实施例5 ICP0蛋白对MDV复制的影响

为研究ICP0蛋白对MDV病毒复制的影响，将缺失了ICP0蛋白基因的MDV病毒(CVI988^ΔICP0及RB1B^ΔICP0)与正常的MDV病毒(作为对照，采用CVI988及RB1B)分别以相同剂量接种CEF细胞(6孔板，每孔200PFU)，接种后，至37℃细胞培养箱内培养，分别在培养的24h，48h，72h，96h及120h收取细胞，采用细胞总DNA，以已知的病毒DNA为标准，利用MDVmeq基因设计引物，引物序列为：F(SEQ ID NO.11)：5′-CCCAACAGCCCCTCCAAACAC-3′，R(SEQ IDNO.12)：5′-CTTCATGGAGTTTGTCTACA-3′，采用荧光定量PCR方法，检测细胞内MDV病毒的绝对含量。PCR程序为：50℃2min，95℃10min，95℃ 15s，60℃1min，95℃ 15s，60℃30s，95℃15s，40cycles。

结果如图5所示，其中，A为ICP0蛋白对IB1B复制的影响结果；B为ICP0对CVI988复制的影响结果；C为ICP0过表达对RB1B复制的影响结果；D为ICP0过表达对CVI988复制的影响结果。结果表明，CVI988^ΔICP0重组病毒复制水平在24-120h内明显低于CVI988病毒，同时RB1B^ΔICP0重组病毒复制水平也低于其母本病毒RB1B，这表明ICP0可以影响病毒在细胞内的复制水平；与此同时，将表达ICP0蛋白的真核表达载体PEGF-N1-ICP0质粒转染细胞后，以空载体及不转染的细胞为对照，发现表达ICP0蛋白的鸡胚细胞可以增强MDV病毒(CVI988或者RB1B病毒)的复制水平，这表明ICP0蛋白可以增强MDV病毒的复制。

本发明基于MDV的细菌人工染色体(Bacteria Artificial Chromosome，BAC)构建了缺失ICP0基因的MDV重组病毒，在此基础上，采用表达ICP0的真核表达载体，对ICP0蛋白调节MDV诱导的宿主IFN-I的产生特性进行了研究，并对ICP0蛋白调控宿主IFN-I的关键结构域进行了探索，并对ICP0蛋白对MDV复制的影响进行了研究，由此发现了一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白ICP0，此类先天性免疫反应抑制蛋白在国内外属于首次发现。MDV的ICP0蛋白不仅可以抑制宿主细胞的先天性免疫反应，而且对MDV病毒的复制具有重要作用，本发明将在疫苗制备过程中，可以广泛应用于降低病毒培养导致的细胞免疫水平，从而提高病毒产量，有利于疫苗生产工艺的改进，或者利用其制备特异性的抗病毒药物。除此之外，本发明首次发现了禽疱疹病毒的对宿主先天性免疫调控具有作用的转录因子，，为未来优化疫苗及制备抗病毒药物提供了物质基础。

Claims (10)

1.一种抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白，其为：a)氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的蛋白；或

b)在a)中所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性由a)衍生的蛋白。

2.编码权利要求1所述的抑制鸡先天性免疫反应鸡马立克氏病病毒蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种MDV病毒，该病毒不表达权利要求1所述的蛋白，或权利要求1所述的蛋白表达被抑制，或权利要求1所述的蛋白失活。

5.根据权利要求4所述的病毒，其特征在于，所述病毒中表达权利要求1所述蛋白的基因缺失、突变或被取代。

6.权利要求4或5所述的病毒制备的病毒载体或疫苗。

7.权利要求1所述的蛋白在抑制细胞产生IFN-I中的应用；或，在增强病毒在宿主细胞中复制中的应用；或，在提高疫苗病毒产量中的应用。

8.一种表达载体、重组病毒或细胞，所述表达载体上含有权利要求2或3所述的基因；所述病毒重组有权利要求2或3所述的基因，或过表达权利要求2或3所述的基因；所述细胞转化有所述的表达载体或所述的重组病毒。

9.权利要求4所述MDV病毒的制备方法，其包括如下步骤：

S1、制备携带MDV BAC系统的EL250感受态细胞；

S2、采用引物从PSK-Galk载体上扩增携带MDV病毒ICP0基因同源臂的Galk基因片段；

S3、将步骤S2获取的Galk基因片段转化到含有MDV BAC系统的EL250感受态大肠杆菌中；

S4、将转化后的感受态细胞在SOC培养基中复苏4-6h后，涂布到Galk阳性筛选板上，培养后，挑取单克隆采用galk的特异性引物进行PCR鉴定；

S5、将步骤S4中鉴定Galk阳性的单克隆再次划线于Galk平板上进行纯化和进一步鉴定，同时将纯化后克隆菌提取质粒后采用ICP0特异性引物进行PCR鉴定；

S6、对步骤S5中鉴定为Galk阳性及ICP0检测阴性的MDV质粒BAC提取的重组MDV BAC的DNA；

S7、将重组MDV BAC DNA转染鸡胚成纤维细胞，培养、传代，观察到典型的MDV细胞病变效应的鸡胚成纤维细胞即为MDV ICP0缺失病毒。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述引物的序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示；其中步骤S4，所述galk的特异性引物的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；其中步骤S5，所述ICP0特异性引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。