CN1763205A - 重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用”。一种转移载体pUS2－LacZ，其特征在于重组质粒pUS2上的US2基因片段由CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因替换。该转移载体可通过与MDV疫苗病毒同源重组，获得LacZ标记基因的重组病毒MDV；同时转移载体上具有多克隆位点，可插入外源病毒基因，由此获得了重组质粒，再通过同源重组并纯化筛选得到重组病毒。该重组病毒制成疫苗，具有抗多种病毒的效果。

Description

重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种病毒转移载体及其应用。

技术背景

重组活载体疫苗是指利用基因工程技术，将保护性抗原基因(目的基因)转移到相应的载体中，通过和病毒基因重组后表达出保护性抗原蛋白质的活疫苗，这种疫苗可通过1次免疫预防多种疾病，明显降低疫苗的成本，简化免疫程序，增加免疫覆盖率，同时这种疫苗中的保护性抗原成分单一，有利于建立免疫监测方法，因此利用活的疫苗病毒作为载体研究重组活载体疫苗是未来疫苗的一个重要方向。

随着分子生物学的发展，一些基因组庞大的病毒的分子位点和结构被逐步搞清楚，从而奠定了这些病毒在重组活载体疫苗研究中的地位。禽病疫苗的研究中，用于构建重组疫苗的病毒载体主要有：鸡痘病毒(FPV)、禽腺病毒以及疱疹病毒，包括鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡马立克氏病病毒(MDV)。目前应用较为广泛的病毒活载体是痘病毒载体，痘病毒作为载体有很多优点，如插入外源基因组大、不会整合入宿主染色体、免疫方法简单、疫苗生产成本低等优点，因此重组鸡痘疫苗已广泛应用到生产实践中。但痘病毒作为载体一个最重要的缺点是能引起载体效应，因而痘病毒载体疫苗不能用于接种过痘苗的禽，而且由于机体产生的抗痘病毒抗体也会消灭载体病毒，因而痘病毒载体疫苗也无法克服母源抗体的干扰。

鸡马立克氏病病毒(MDV)是鸡的一种传染性肿瘤病(淋巴组织增生和肿瘤形成为特征的疾病)的病原，它在世界范围内流行，是严重危害着养禽业健康发展。近30年来，为了控制该病的发生，人们不断地研制和使用MDV的致弱毒株作为疫苗。MD疫苗病毒有3个血清型，即弱毒MDV1、自然无毒MDV2和自然无毒株火鸡疱疹病毒(HVT)即MDV3。在MDV疫苗病毒的3个血清型中，减毒的I型MDV毒株(MDV1)如CVI988比HVT更具优越性，这是因为MDV1疫苗与超强毒的(vv)MDV1(包括野毒株)的抗原性更为接近，减毒MDV1对预防MD最为有效。由于马立克氏病病毒的DNA较大，容许插入多个外源基因而不影响自身的复制和生物学特性，所以其弱毒株也可和鸡痘病毒(FPV)一样作为病毒载体来表达外源基因。在三个血清型的MDV疫苗毒株中，MDV1被研究者作为另一个重要的病毒载体而得到广泛研究。

选用MDV弱毒株作为重组病毒载体还具有如下优点：(1)MDV为细胞结合性疱疹病毒，可持续感染，经疫苗免疫的鸡可终生带毒，产生持久的免疫力。(2)MDV疫苗接种后，病毒在细胞间传播，因而不受母源抗体的干扰。(3)MDV存在于细胞内，不容易引起载体效应，可以使用不同型的MDV协同免疫或多次接种，而不象痘病毒载体疫苗那样不能用于接种过痘苗的禽。(4)该病毒的自然宿主只有禽类，对其它家畜和人类是安全的(5)MDV的基因组比较大，可插入多个外源基因，在MDV的基因组中，US是位于S节段中部的一个ORF，为病毒生长的非必需基因，US区有12个开放的阅读框(ORF)，其中US1、US2、US10、US3、US6均为病毒非必需区。因此MDV1基因组的US区可提供一个适于外源基因插入的合适位点。

MDV CVI988/Rispens株是上世纪70年代初开始使用的一株分离自健康鸡的I型MDV原始弱毒株，美国于1992年批准使用CVI988来预防超强野毒株(vvMDV)和特超强野毒株(+vvMDV)，由于它被发现比二价苗对vvMDv有更强的保护力，因而是目前公认的最有效防制MD的疫苗毒株。该毒种实验室和田间试验均表明，其对MD的免疫保护率可达95％以上，因此该疫苗株可作为一种安全有效的病毒载体。

发明内容

本发明提供一种重组鸡马立克氏病病毒的转移载体，及其构建方法，该转移载体可通过与MDV疫苗病毒同源重组，获得重组病毒MDV，为MDV CV1988株病毒作为载体构建抗MD和其它病原的新型重组疫苗打下基础。

一种转移载体pUS2-LacZ，其特征在于重组质粒pUS2上的US2基因片段由CMV启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40 polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因替换。

上述转移载体的制备方法，用BglII和AvrII酶切pcDNA4.0/His/LacZ质粒，回收CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因；用BglII和AvrII酶切pUS2质粒，回收酶切位点2端的pUS2片段(命名为pUSE)；将CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因插入pUSE片段中的BglII和AvrII之间，即得上述转移载体。

重组马立克氏病病毒制备方法，包括如下步骤：

(1)MDV CVI988/Rispens疫苗病毒感染鸡胚成纤维细胞，

(2)权利要求1所述的转移载体pUS2-LacZ质粒转染，

(3)加底物X-gal显色，

(4)通过蓝斑纯化筛选即可。

所述转移载体的多克隆位点表达盒上还插入有外源基因。

所述外源基因是鸡传染性法氏囊病毒VP2基因。

上述方法制备的重组马立克氏病病毒。

上述重组病毒作为疫苗的应用。

用BglII和AvrII酶切pcDNA4.0/His/LacZ，得到5.2kb的酶切的产物；用Bgl II和AvrII酶切pUS2质粒，得到6.7kb的酶切产物，命名为pUSE，经T4 DNA连接酶连接后，BglII和AvrII酶切鉴定结果表明获得了转移载体的质粒，命名为pUS2-LacZ。该质粒含CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40 polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点，该多克隆位点中，NotI、XhoI、ApaI是质粒的其它地方没有的酶切位点，可以用于外源基因的插入，EcoRI和PstI分别在2367bp和3364bp各有一个位点，在不完全酶切的情况下，通过回收大片段的方法也能将外源基因插入。在5’端保留了约3163bp及在3’端保留了602bp的MDV US2基因序列作为和MDV的DNA同源重组的同源臂，与获得重组MDV的要求相一致。

将上述得到的转移载体用于筛选重组马立克氏病病毒，得到纯化的重组病毒。

本发明将1.35Kb的IBDV VP2基因通过EcoR I和Xhol I位点插入到pUS2-LacZ载体中，获得了重组质粒pUS2-LacZ-VP2，再通过同源重组并纯化筛选得到重组病毒rMDV。

以表达传染性法氏囊VP2基因的重组马立克氏病病毒(rMDV)作为疫苗(毒价为5000PFU/ml)，免疫1日龄SPF鸡，同时设以鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗BJ836(毒价为10^6.25TCID₅₀/0.1ml)于14日龄免疫的SPF鸡作为对照，另设2组SPF鸡作为攻毒的阴阳性对照。35日龄时，对重组疫苗接种组、中等毒疫苗接种组及非免疫的阳性对照组以中国标准I型强毒株IBDV CJ801攻击。攻击后6天剖杀所有的鸡，进行肉眼病理观察并称取囊重与体重，然后按Giambrone等的方法(1990)计算保护指数。结果表明，重组疫苗免疫组攻击强毒后大致有2只鸡剖检时可见法氏囊出现轻度萎缩，其余的法氏囊大小、色泽、质量均很正常保护指数为90％，BJ836疫苗的保护指数为93％，其平均囊/体比与非免疫的阴性对照组无显著性差异(P＞0.05)；而非免疫攻毒的阳性对照组鸡只剖检时法氏囊部分100％出现肉眼病变，或萎缩或出现冻胶样水肿、黄色化，其平均囊/体比与非免疫的阴性对照组之间存在显著差异(P＜0.05)。(见表1)

H.E染色的结果也表明，重组疫苗组强毒攻击后其法氏囊淋巴滤泡结构完整，排列紧密，与正常对照组的法氏囊相同.而阳性对照法氏囊组织全部出现病变，组织中淋巴细胞坏死脱落，大部分间质细胞增生，淋巴细胞外益，血管内皮细胞肿胀。(见图10a、10b、10c、10d)

由于转移载体上具有多克隆位点，可插入外源病毒基因，由此获得重组质粒，再通过同源重组并纯化筛选得到重组病毒。该重组病毒制成疫苗，具有抗多种病毒的效果。这种疫苗可通过1次免疫预防多种疾病，明显降低疫苗的成本，简化免疫程序，增加免疫覆盖率。

附图说明

图1真核表达载体pcDNA4.0/His/LacZ的示意图

图2重组马立克氏病病毒转移载体pUS2-LacZ的示意图

图3转移载体pUS2-LacZ酶切鉴定结果

1λDNAHindIIIMaker；2pUS2-LacZ双酶切(BglII、AvrII)

图4含LacZ基因的第一代重组病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)上形成的蓝斑

图5第八代纯化的重组病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)上形成的蓝斑

图6含LacZ基因和法氏囊VP2基因的重组病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)上形成的蓝斑

图7重组病毒PCR鉴定

1，阴性对照；2，VP2基因的PCR结果；3，DL2000Maker

图8Western-blot检测重组病毒中法氏囊VP2基因的表达

1，亲本MDV感染的CEF；2，重组MDV感染的CEF

图9不同试验组鸡的法氏囊大小比较。

图10a重组病毒组(rMDV)攻毒后法氏囊组织H.E染色结果

图10b BJ836疫苗免疫组的法氏囊组织切片H.E染色结果

图10c阳性对照组鸡的法氏囊组织切片H.E染色结果

图10d阴性对照组鸡的法氏囊组织切片H.E染色结果

具体实施方式

下面结合实施例对发明做进一步的详细说明。

实验材料

1病毒毒株和细胞

马立克氏病病毒MDV CVI988/Risepens疫苗，此疫苗为液氮保存的活病毒，北京市农林科学院畜牧兽医研究所保存；按常规方法取9～11日龄SPF鸡胚(购自北京市实验动物中心)，制备鸡胚成纤维细胞单层，增殖重组病毒用；IBDV CJ801株：本所分离鉴定的中国标准I型强毒株由北京市农林科学院畜牧兽医研究所保存，使用F15代囊毒，毒价为10^{6. 56}EID₅₀/0.2ml，鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗BJ836(毒价为10^6.25TCID₅₀/0.1ml)。北京市农林科学院畜牧兽医研究所疫苗中试车间生产，市场有售。

2重组质粒

MDV US区基因与pUC18的重组载体：将MDV的US基因区6.5kb的片段通过SalI和BamHI酶切位点和克隆载体pUC18连接而成，命名为pUS2，由日本国家动物疾病防治研究所病毒室(Department of Virology，National Institute of Animal Health)Kenji Tsukamoto教授赠送，现保存在北京市农林科学院畜牧兽医研究所内。

3真核表达载体pcDNA4.0/His/LacZ含有人巨细胞病毒主要早期启动子(CMV)和转录终止信号SV40 ployA，6个组氨酸标记基因，用于质粒筛选的氨苄青霉素及新霉素基因，LacZ报告基因及多克隆位点，为INVITROGEN公司产品。该载体示意图如图1。

4分子生物学试剂及试剂盒

限制性内切酶(BglII和AvrII)和T4 DNA连接酶：均为New England Biolabs产品；

λDNA/HindIII Marker：购自大连TaKaRa生物工程公司；质粒提取试剂盒：购自QIAGEN公司；DMEM、MEM及转染用营养液opti-MEM：均为Invitrogen产品；凝胶回收纯化试剂盒：购自鼎国公司和天为时代公司；脂质体：Lipofectamine^TM 2000，购自Invitrogen公司。

5试验所用溶液及其配制

10mg/mL EB贮存液：以10mg/mL浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。

50×TAE(Tris-乙酸)：24.2g Tris碱，5.71g冰乙酸，10mL 500mmol/L EDTA(pH8.0)，加去离子水，定容至100mL，工作液为1×TAE。

0.8％琼脂糖凝胶：称取0.8g琼脂糖溶于100mL1×TAE电泳缓冲液，融化后加入5μL10mg/mL EB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5μg/mL

2×YT液体培养基：Tryptone 16g，Yeast Extract 8g，NaCl 5g加入蒸馏水950mL，NaOH调节pH值至7.4，定容至1000mL，115℃，20min。

Amp/2×YT液体培养基：于2×YT液体培养基中，按终浓度100μg/mL加入Amp贮存液。

Amp/2×YT固体培养基：琼脂粉1.5g溶于100mL液体2×YT中，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃左右，加入Amp至终浓度为100μg/mL，浇制平板。

6细胞培养用溶液

15％NaHCO₃：15gNaHCO₃溶于100mL双蒸水中，经115℃灭菌20min，置4℃备用

MEM原液：按1000mL双蒸水溶解1包MEM粉，15％NaHCO₃调节pH为7.4，过滤除菌，4℃保存。

犊牛血清：Hyclone公司产品，-20℃保存备用。

2×10⁴U/mL青链霉素液(双抗)：青霉素、链霉素各2×10⁶U溶于100mL双蒸水中，过滤除菌，分装后，-20℃保存备用。

7.5％NaHCO₃：7.5g NaHCO₃溶于100mL双蒸水中，经115℃灭菌20min，置4℃备用。

MEM营养液：于100mL 1×MEM溶液中无菌加入5mL犊牛血清，1mL浓度为2×10⁴U/mL双抗液，用7.5％NaHCO₃溶液调节pH至7.2左右。

MEM维持液：于100mL 1×MEM溶液中无菌加入2mL犊牛血清，1mL浓度为2×10⁴U/mL双抗液，用7.5％NaHCO₃溶液调节pH至7.2左右

10×EDTA-胰酶溶液(2.5％)：Na₂EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂02.89g，KH₂PO₄ 0.2g，1％酚红溶液1.5mL，胰酶2.5g，溶于100mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.2～7.5，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。使用时1∶10稀释。

0.01mol/L pH7.4PBS：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，NaH₂PO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，溶于900mL双蒸水中，HCl调pH值至7.4，定容至1000mL，分装后121℃高压灭菌20min，存于室温。

7实验动物

1日龄SPF雏鸡，购自中国农业大学实验动物所，饲养于负压隔离器中。

实施例1  转移载体的构建

1.1pcDNA4.0/His/LacZ和pUS2质粒的提取

将带有质粒pcDNA4.0/His/LacZ和pUS2的大肠杆菌JM109 Amp/2xYT固体培养基平皿上划线，37℃培养20h，挑取单个白色菌落接种于Amp/2xYT液体培养基中37℃振荡培养16h，然后按博大泰克生物工程公司质粒提取试剂盒操作说明进行：

收集1.5~3mL菌液的沉淀于1.5mL的Eppendorf离心管中，加入100μL溶液I，振荡至彻底悬浮；

加入150μL溶液II，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管放置于冰上2min；

加入150μL溶液III，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5min。12000r/min离心12min；

将420μL结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤3中的上清加入离心吸附柱中(尽量去除杂质)，混匀，12000r/min离心30s。倒掉废液，收集管中的废液；

加入750μL洗涤缓冲液于离心吸附柱中，12000r/min离心30s，倒掉废液收集管中的废液；

重复步骤5一次。再次于12000r/min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液；

小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5mL的Eppendorf离心管中，加入适量的洗脱缓冲液，室温放置5min后，12000r/min离心1min；将得到的产物进行0.8％琼脂糖电泳鉴定并用分光光度计测定DNA的含量。

1.2BglII和AvrII酶切pcDNA4.0/His/LacZ和pUS2质粒

按如下比例建立100μL的反应体积：

10×NEB Buffer2                            5μL

BglII                                      5μL

AvrII                                      5μL

pcDNA4.0/His/LacZ或pUS2                    20μL

无菌去离子水                               64μL

100×BSA                                   1μL

37℃水浴反应4h后，0.8％琼脂糖凝胶电泳回收酶切pcDNA4.0/His/LacZ后5.2kb的产物及pUS2质粒酶切后约6.7kb的基因片段pUS。回收步骤按天为时代试剂盒操作说明进行：

切取含DNA片断的琼脂糖(100～300mg)捣碎按比重1∶3(DNA片断：溶液B体积重量比)加入溶液B；

50℃水溶10min，直至胶完全融化，其间漩涡3次，琼脂糖必须完全融化。如果体积大于500μL，可适当增加溶胶时间，如此时溶液变红，可加15μL NaAc；

将溶液置于离心柱中，静置1min，8000r/min离心60s，分两次离；

倒掉液体，加入500μL溶液C(用无水乙醇1∶1稀释)于离心柱中8000r/min 60s离心，到掉液体；

用溶液C(用无水乙醇1∶1稀释)500μL再洗一遍，8000r/min离心60s；

15000r/min再次离心60s，以甩干剩余液体；

将离心柱置于新的离心管中，(若此时离心管盖不住，不影响试验结果)加入56℃预热的30μL溶液D，混匀，静置2min，1500r/min离心60s，管底即为所需DNA1.3按顺序加入下列试剂建立10μL的连接体系，将纯化回收后的DNA连接：

10×T₄DNA连接酶缓冲液                              1μL

pUS2质粒酶切后约6.7kb的基因片段                     100ng

pcDNA4.0/His/LacZ酶切后5.2kb的产物                  100ng

T₄DNA连接酶(3U/uL)                                 1μL

用无菌双蒸水补至10μL，离心混匀于管底，16℃连接9h。

1.4连接物的转化

将构建的重组表达质粒转化BL21感受态细胞，涂布于Amp+/LB平板，37℃培养过夜，利用Amp抗性筛选重组转化体。

将连接产物转化感受态DH5α，按天为时代试剂盒操作说明进行：

分别取感受态细胞和SolutionA，SolutionB，置于冰浴上融化；

每支感受态细胞(100μL)加入10μL SolutionA 8μL，SolutionB 95μL，冰预冷的无菌去离子水，混合均匀；

用冷却的无菌吸头将上述悬液分装到新的预冷的离心管中；加入目的DNA，轻轻旋转以混匀内容物，在冰浴中放置30min；

将管放在室温(＞25℃)10min，或者放在42℃水浴放置75s，不要摇动；

快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3min。

每管加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振摇培养，温育45min，使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；

取100μL已转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB琼脂培养基上。用一无菌弯头玻璃棒轻轻的将细胞均匀涂开；

将平板置于室温，直至液体被吸收；

倒置平板，于37℃培养12～16h。

1.5用QIAGEN试剂盒提取阳性重组质粒

用QIAGEN公司Plasmid Mini Purification Kit试剂盒提取阳性重组质粒，按试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

5000r/min离心10min沉淀10mL培养物菌体，倒尽上清液，加1mL PBS液重悬菌体，转移至一新的1.5mL离心管中，12000r/min离心30s，倒尽上清液；

加入300μL的Buffer P1，充分悬浮菌体；

加入300μL的Buffer P2，轻轻混匀溶液，并轻柔颠倒离心管4～6次，然后于室温下孵育5min；

加入300μL冰浴中预冷的Buffer P3，立即轻轻混匀溶液，然后于冰浴中孵育5min；

12000r/min离心10min，取上清液备用；

取一QIAGEN-tip 20柱子，直立于试管架上，加入1mL的Buffer QBT，在重力作用下使溶液流尽；

将上述取得的上清液加入QIAGEN-tip 20柱子中，在重力作用下使溶液流尽；

加入1mL的Buffer QC洗涤QIAGEN-tip 20柱子，在重力作用下使溶液流尽，重复4次；

加入800μL的Buffer QF溶解DNA，在重力作用下使溶液流尽至一新的1.5mL离心管中；

加入0.7倍体积的异丙醇，室温下沉淀DNA；12000r/min离心30min，小心倒尽上清液；

加入1mL的70％乙醇洗涤DNA，为保证质粒无菌，在超净工作台中吹干后，加入适当体积的70℃水浴过的pH 8.0的TE Buffer溶解DNA；此DNA即为转移载体的质粒。转移载体示意图如图2。

BglII和AvrII酶切后，5.2kb的pcDNA4.0/His/LacZ酶切的产物和6.7kb的pUS2质粒酶切片段，经T4 DNA连接酶连接后，BglII和AvrII酶切鉴定结果(如图3)表明获得了转移载体的质粒，命名为pUS2-LacZ。该质粒含CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40po1yA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点，该多克隆位点中，NotI、XhoI、ApaI是质粒的其它地方没有的酶切位点，可以用于外源基因的插入，EcoRI和PstI分别在2367bp和3364bp各有一个位点，在不完全酶切的情况下，通过回收大片段的方法也能将外源基因插入。在5’端保留了约3163bp及在3’端保留了602bp的MDV US2基因序列作为和MDV的DNA同源重组的同源臂，与获得重组MDV的要求相一致。

实施例2.转移载体在构建和筛选重组鸡马立克氏病病毒中的应用

2.1重组鸡马立克氏病病毒的构建和筛选

按常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，待其长成80％单层后，以MDV的稀释液洗2遍，再接种MDVCVI988/Rispens疫苗病毒，接种剂量为24孔板中每孔50PFU(以MDV稀释液稀释)，37℃作用4h后，用不含抗生素的MEM洗涤两次，按照Lipofectamine^TM2000说明书，将转移载体质粒转染细胞，作用2h后，倒掉转染液，加入含5％牛血清的MEM培养液于37℃ CO₂培养箱中培养4～5d后，待出现典型的细胞病变，加入含有X-gal(200μg/ml)营养液，观察蓝色蚀斑，将24孔中感染的CEF细胞用0.25％胰酶消化，接种到有新鲜CEF细胞单层的96孔培养板上。观察蓝斑，将有蓝色孔消化并接到新的细胞上，如此重复多个循环，直至确信所有的蚀斑都是蓝色(如图4)，通过蓝斑筛选获得纯化的重组病毒。

2.2重组马立克氏病病毒的生长特性及稳定性

将纯化的重组病毒在CEF中传5代以上，显微镜观察重组病毒在CEF上的病变形态，并与MDVCVI988/Rispens的形态相比较，并观察重组病毒的生长特性。对第八代病毒用X-gal处理，观察蓝斑形成情况，以确证重组体的稳定性。结果表明，如图5所示，重组体MDV在CEF中的生长特性与MDVCVI988/Rispens相似，且重组MDV能稳定表达β-半乳糖苷酶。

实施例3.表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2基因的重组马立克氏病病毒的构建及应用

3.1表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2基因的重组马立克氏病病毒的构建和筛选

将1.35kb的IBDV VP2基因通过EcoR I和Xhol I位点插入到pUS2-LacZ载体中，获得了重组质粒pUS2-LacZ-VP2，将转移质粒pUS2-LacZ-VP2用质脂体包裹转染MDVCVI988/Rispens株感染的CEF细胞，按照2.1的方法，转染后4～5d，开始加底物X-gal，观察到有蓝斑的出现，(如图6)通过蓝斑纯化筛选重组MDV。

3.2重组病毒的鉴定

提取纯化获得的稳定的重组病毒的DNA，用传染性法氏囊VP2基因的特异性引物扩增出大小约1.35kb的PCR产物。(如图7)

3.3重组病毒在CEF上表达IBDV VP2蛋白的分析

含有重组病毒的细胞裂解物的Western-blot分析表明，在分子量大约40KD处有特异的反应条带，说明VP2蛋白在重组病毒中表达。(如图8)

3.4重组病毒(rMDV)应用效果试验

1日龄雏鸡共54只，分A、B、C、D四组，A组为基因工程重组疫苗组，20只；B组为BJ836疫苗接种组，15只；C组为非接种的阳性对照组，15只；D组为非接种的阴性对照组，4只。A组对1日龄雏鸡免疫重组病毒，剂量为0.1ml/只；B组BJ836疫苗接种组，在鸡14日龄时接种，接种途径为点眼滴鼻，剂量为0.2ml/只；非接种的阳性对照组鸡和非接种的阴性对照组鸡在1日龄注射马立克病毒稀释液，剂量为0.2ml/只。分别在14、21、28、35日龄时采血，测定IBDV抗体的ELISA效价。35日龄时，对重组疫苗接种组、中等毒疫苗接种组及非免疫的阳性对照组进行IBDV强毒CJ801攻击，观察，攻击后6天剖杀所有的鸡，进行肉眼病理观察。结果表明，重组疫苗免疫组经强毒攻击后，只有2只鸡剖检时可见法氏囊出现轻度萎缩，其余的法氏囊大小、色泽、质量均很正常，而非免疫攻毒的阳性对照组，剖检时法氏囊部分100％出现肉眼病变，或萎缩或出现冻胶样水肿、黄色化。(如图9)

剖杀时称体重和囊重，计算囊/体比，评价疫苗免疫保护指数。然后计算保护指数(％)：保护指数(％)是指IBDV免疫攻毒组中法氏囊正常大小鸡的百分率，所谓正常大小的法氏囊是指不显著小于阴性对照组的法氏囊。再进行统计分析(按生物统计中的方差分析)，结果表明进行平均囊/体比，显著水平为P＜0.05.重组病毒(rMDV)的保护指数为90％，BJ836疫苗的保护指数为93％，其平均囊/体比与非免疫的阴性对照组无显著性差异(P＞0.05)。(如表1)

             表1不同组鸡的平均囊/体比、平均囊指数及保护指数

疫苗	雏鸡数(只)	平均囊/体比(SAS 8.02统计)a	保护指数(％)b
				重组疫苗免疫组BJ836疫苗免疫组阳性对照组阴性对照组	1915154	0.00671000±0.00074081a0.00677973±0.00143142a0.00516671±0.00108150b0.00723000±0.00089941a	90930100

a：囊体/比(B/B)指：囊重÷体重×1000。

b：保护指数，即不同的攻毒组中法氏囊正常大小鸡的百分率(这里所谓正常大小的法氏囊是指不显著小于未接种未攻毒组的法氏囊)。

采集所有的法氏囊组织，用10％甲醛固定。将采集的法氏囊组织按常规的石蜡包埋切片技术处理，进行H.E染色，显微镜下进行组织病理学观察。(见图10a、10b、10c、10d)

图10a为重组病毒组(rMDV)攻毒后法氏囊组织H.E染色结果，其结构完整，排列致密；图10b为BJ836疫苗免疫组的法氏囊组织切片H.E染色结果，其结构完整，排列致密，出现中性粒细胞密集团；图10c为阳性对照组鸡的法氏囊组织切片H.E染色结果，法氏囊组织松散，淋巴细胞坏死脱落，间质细胞增生，中性粒细胞集团中的淋巴细胞严重脱落，出现空泡化；图10d为阴性对照组鸡的法氏囊组织切片H.E染色结果，其结构完整，排列致密。

Claims (7)

1.一种转移载体pUS2-LacZ，其特征在于重组质粒pUS2上的US2基因片段由CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40 polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因替换。

2.权利要求1所述的转移载体pUS2-LacZ的制备方法，用BglII和AvrII酶切pcDNA4.0/His/LacZ质粒，回收CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因；用BglII和AvrII酶切pUS2质粒，回收pUSE片段；将CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40 polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因插入pUSE片段BglII和AvrII之间，即得上述转移载体。

3.重组马立克氏病病毒制备方法，包括如下步骤：

(1)MDV CVI988/Rispens疫苗病毒感染鸡胚成纤维细胞，

(2)权利要求1所述的转移载体pUS2-LacZ质粒转染，

(3)加底物X-gal显色，

(4)通过蓝斑纯化筛选即可。

4.根据权利要求3所述的重组马立克氏病病毒的制备方法，所述转移载体pUS2-LacZ的多克隆位点表达盒上还插入有外源基因。

5.根据权利要求4所述的重组马立克氏病病毒的制备方法，所述外源基因是鸡传染性法氏囊病毒VP2基因。

6.根据权利要求3-5所述任一方法制备的重组马立克氏病病毒。

7.权利要求6所述的重组马立克氏病病毒作为疫苗的应用。

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