JPH02500402A - 昆虫細胞における異種蛋白質の産生方法 - Google Patents
昆虫細胞における異種蛋白質の産生方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
昆虫細胞における異種蛋白質の産生方法発明の背景
この発明は、昆虫細胞、特に総体昆虫宿主における異種蛋白質の改良された産生
方法に関するものである。
バキュロウィルスの遺伝子工学技術の進歩により、最近ではインビトロ培養で生
長させた昆虫宿主細胞における異種蛋白質の製造が可能となった。ある程度の成
功をおさめたーストラテジーでは、(1)バキュロウィルス多角体(polyh
edrin)プロモーターに機能し得るように連結された異種蛋白質をコードす
るDNA配列を含む組換えバキュロウィルスを製造し、(2)培養された昆虫宿
主細胞を組換えウィルスにより感染させ、(3)ウィルス複製および蛋白質発現
に適した条件下で感染した昆虫細胞を生長させ、(4)その結果発現した所望の
異種蛋白質を昆虫細胞または培養培地から回収する工程が含まれる。例えば、ミ
ラー等、j986(後記)参照。一つの理由として多角体プロモーターはかなり
強力なプロモーターであるため、上述のストラテジーにより所望の蛋白質の比較
的高い発現レベルか達成され得る。
この方法を生物学的に考察する場合、バキュロウィルスが一般的には2形態で包
埋(パッケージ)されることに留意すべきである。ヌクレオカプシドは、その主
構造蛋白質が多角体である「多角体封入体J(P I B)として知られる粒子
の形で感染細胞の核に吸蔵°され得るか、まにはそれらは感染細胞の膜より発芽
状に生長することにより膜エンベロープを獲得し、非吸蔵ウィルス(NOV)粒
子を形成させ得る。多角体構造遺伝子の全部または一部のありふれた欠失、また
は発現ベクターとしてウィルスを使用する場合に起こる多角体遺伝子座内におけ
る異種遺伝子の挿入の結果、上述の方法で使用される組換えバキュロウィルスは
、もは−や感染細胞における機能性多角体の合成を誘導し得ない。生物体レベル
でのウィルス感染の水平伝達(すなわち、昆虫から昆虫への伝達)は、その主構
造蛋白質、多角体が無くては生成され得ないウィルスのFIB形態の非存在下で
は一般的には行なわれない。すなわち、組換えウィルスによる感染の結果、昆虫
から昆虫ではなく、感染しに昆虫まT二は細胞培養内で細胞から細胞への感染を
広げ得る非吸蔵ウィルス(NOV)後代が製造され得る。
従って、上記組換えバキュロウィルスを用いることにより培養昆虫細胞または適
当に接種された個々の昆虫宿主において異種蛋白質を製造することはできるが、
総体昆虫における蛋白質の商業的大量生産および/または組換えバキュロウィル
スの水平伝達には、莫大な数の昆虫個体の接種を必要とする。尋常ではない人力
、時間および費用が要求されるため、これらの方法は非実用的である。
それ自体多角体生産に関して欠損のある組換えバキュロウィルスを用いた、総体
昆虫における生物学的および/または商業的に意義深い量の異種蛋白質の実用的
生産並びに組換えバキュロウィルスの水平伝達を初めて可能にする新規混合ウィ
ルス系がこの時点で発見された。この発明は、有効性および生物学的研究におけ
る安全性の問題の間の均衡をとり得るウィルス系の制御可能な持続性の点で予想
外の利益を提供する。
発明の詳細な記載
この発明は、少なくとも2種の遺伝学的に異なるバキュロウィルスのヌクレオカ
プシドから成る混合物を含む多角体封入体(PIB)を提供する。この混合組成
物P I B(mP I B)は、感染昆虫細胞において多角体の生産を誘導し
得ない少なくとも1種の「組換え」バキュロウィルスのヌクレオカプシド(表現
型としてはrPIB−j)、−および野生型、突然変異型または遺伝的に修飾さ
れたウィルスであり得るが、いずれの場合でも感染細胞において多角体の生産を
誘導し得るものでなくてはならない少なくとも1種のバキュロウィルスのヌクレ
オカプシド(表現型としては(−pH3+J)を含む。この明細書で使用されて
いる「組換え」バキュロウィルスなる語は、機能性多角体遺伝子を欠き、少なく
とも1種の異種(「挿入」)遺伝子(表現型としては、rPIB−1挿入+」)
を含むバキュロウィルスを包含する。
ここで使用されている「異種遺伝子」なる語は、通常バキュロウィルスには存在
しないか、または通常存在する場合でも、組換えバキュロウィルスに関して、野
生型バキュロウィルス・ゲノムにおける異なる座もしくは異なるプロモーターの
転写制御下または両条件下に存在する遺伝子を包含する。この明細書で使用され
ている「機能性多角体遺伝子」なる語は、FIBを形成し得る多角体蛋白質をコ
ードする遺伝子を包含する。多数の核多角体病ウィルスおよび対応する昆虫およ
び宿主細胞の生態および生活環は、当業界において公知である。さらに、様々な
トランスプレースメント・ベクターおよびそれらのベクターを用いた組換えバキ
ュロウィルスの製造方法は当業界では現在公知である。例えば、ペノック等およ
びミラー等参照(後記)。
またこの発明は、複数の異種遺伝子を含むため、感染昆虫細胞において複数の異
種蛋白質の発現を誘導し得る組換えヌクレオカプシドを含むmP I Bを包含
する。さらにこの発明は、3種またはそれ以上の遺伝学的に異なるヌクレオカプ
シドを含むmPIBを包含する。それらの具体例において、例えば相異なる各組
換えウィルスが1種またはそれ以上の異なる蛋白質の発現を誘導し得る場合、m
PIBは2種またはそれ以上の組換えヌクレオカプシドを含み得る。
さらに、mPIBは2種まにはそれ以上の異なる種類のバキュロウィルスのヌク
レオカプシドを含み得る。
この発明によるPIB−1挿入+バキユロウイルスのヌクレオカプシドおよびP
IB+バキュロウィルスのヌクレオカプシドを含むmPIBの昆虫宿主による摂
取の結果、両バキュロウィルスが感染細胞において複製される形で昆虫における
混合ウィルス感染が行なわれる。複製進行中、(a)組換え(PIB−1挿入+
)バキュロウィルスおよびその後代は異種遺伝子(「挿入」)の発現を誘導し、
それによりコードされる蛋白質を製造し、(b)P I B+バキュロウィルス
は多角体を生産する。この結果、高頻度で後代ヌクレオカプシドが吸蔵されるこ
とにより、mPIBの追加コピーが製造される。次いで、こうして製造された異
種蛋白質は、昆虫から回収され得、所望によりさらに精製され得る。すなわち、
対応するヌクレオチド配列を得ることができる異種蛋白質が総体昆虫において製
造され得る。
それらの蛋白質には、医学的または獣医学的適用に有用な治療用蛋白質、ワクチ
ン類、機能性酵素、および少なくとも1種の昆虫に対して毒性を示す蛋白質が含
まれる。後者の場合、mPIB含有組成物は、ウィルスに適した宿主であって、
異種蛋白質が毒性を示す昆虫(複数も可)に対する生物学的殺虫剤として使用さ
れ得る。
この発明の一態様では、mP I Bは、2種の遺伝学的に異なるバキュロウィ
ルスのヌクレオカプシドから成る混合物を含む。すなわち、第一のバキュロウィ
ルスは、バキュロウィルスによる感染細胞での多角体生産を誘導させ得る発現制
御配列と機能し得るように連結された多角体コード遺伝子を含む。すなわち、第
一のバキュロウィルスは表現型PIB+として特性を示され得る。FIB+バキ
ュロウィルスは、核多角体病ウィルスc N p V )野生型味、例えば、A
cNPV、BmNPV、RoNPV、0pNPV、DwNPV、TnNPVSS
INPV、5fNPV、LdNPV、HzNPV、HvNPV等であり得るか、
または、それが(i)複製可能であり(例、複製に必要とされる「シス」遺伝的
機能を含む)、(ii)mP I Bにパッケージされ得、そして(iii)感
染昆虫細胞において機能性多角体の生産を誘導し得る限り、その欠失もしくは挿
入変異型であり得る。第二のバキュロウィルスは、そのコードおよび/または調
節領域内のいずれにしても多角体遺伝子座内に変形、例えば欠失、置換または挿
入が存在するため、機能性多角体遺伝子を欠いている。しかしながら、第二のバ
キュロウィルスは、バキュロウィルスに感染昆虫細胞での異種遺伝子によりコー
ドされる異種蛋白質の生産を誘導させ得る発現制御配列に機能し得るように連結
された前述の異種遺伝子を含む。第二のバキュロウィルスはPIB−2挿入十と
して特性を示され得る。
一般的に、宿主または標的昆虫がmPIB内の各ウィルスに対して全体的または
少なくとも部分的に複製を許容するものであることが好ましい。
目下好ましい一態様においては、異種遺伝子を多角体プロモーターの転写制御下
に置く形で異種遺伝子を多角体遺伝子領域に挿入する。別法として、異種遺伝子
は、多角体プロモーター以外のプロモーター、例えばR6V−LTR,TED−
LTRまたは多角体プロモーター以外のバキュロウィルス・プロモーター(ただ
し、このプロモーターは感染昆虫細胞において機能性を有する)と機能し得るよ
うに連結された形であるが、多角体遺伝子領域内のバキュロウィルス・ゲノムに
挿入され得る。同様に、生成した組換えバキュロウィルスが複製可能で、異種遺
伝子発現可能でmP I Bに包埋され得るが、単独ではFIBを形成し得ない
限り、異種遺伝子は多角体遺伝子座以外の部位に挿入され得る。
この発明のmPIBは、mPIBに包埋されるべき各バキュロウィルスのN O
V(すなわち、FIB+ウィルスおよびFIB−1挿入+ウイルス)とインビト
ロ生長中の昆虫宿主細胞との同時接触により製造されたものである。別法として
、この接触は、総体昆虫にインプット・ウィルスを注入することにより実施され
得る。この接触は、宿主または宿主細胞のバキュロウィルス感染を可能にする条
件下で行なわれるべきである。共感染(co−infection)に用いられ
るウィルスを以後総括的に「インプット」ウィルスと称する。昆虫宿主細胞は、
当業界において周知の常用方法を用いて、例えばスピナー・フラスコもしくは発
酵容器に入れた懸濁培養中または組織培養フラスコもしくは皿における容器表面
に付着した形で培養される。昆虫および昆虫細胞を培養し、バキュロウィルスに
より感染させ、ウィルス複製を行わせ、スクリーンし、ウィルス後代を採取する
のに使用される様々な方法は、当業界において公知の方法であり、例えばミラー
等、「ジェネティック・エンジニアリング」、第8巻、277−298頁、セッ
トローおよびホーレンダ−編(プレナム・プレス、1986)に本質的に記載さ
れている。加えられるウィルスの合計量およびこの初回感染において使用される
P I B+(例、野生型)対PIB−1挿入+(改g)ウィルスの割合は、製
品mPIBの所望の組成により異なり得る。一般的には、この割合は約1:l〜
約10=1(改編、野生型)であるが、特別な適用法に対しては他の割合も使用
され得る。
多くのバキュロウィルス株および変異型および対応する許容昆虫宿主が同定され
ている。それらの様々な株、例えばアウトグラファ・カリフォルニカNPVのL
−1変異型およびボンビクス・モリNP■のBm−5株は市販されており、この
発明のmPIBにおけるPTB+ウィルスとして使用され得る。挿入子PIB−
バキュロウィルスは、当業界で知られている幾つかのトランスプレースメント・
ベクターおよび方法のいずれかを用いて製造され得る。例えば、ヨーロッパ公開
出願第0155416号、ペノック等、1984、[Mo1. Ce11. B
iol、j、±(3):399−406、前出等、1985、「ネイチャー」l
上5:592−594参照。バキュロウィルス、アウトグラファ・カリフォルニ
カのゲノムの多角体座へのパらセンジャーcDNAの挿入に常用な一トノンスプ
レースメント・ベクター、pI V E vは、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに寄託されており、受託番号ATCC第39991号により入
手され得る。
一実験例として、スピナー・フラスコ中懸濁培養において生長中のスポドブテラ
・フルギペルダ(Sr)細胞を野生型および組換えインプット・バキュロウィル
スの両方に接種した。野生型ウィルスは、核多角体病ウィルス、アウトグラファ
・カリフォルニカのL−1変異型であった。組換えウィルスは、機能性多角体遺
伝子の代わりにヒト組織型プラスミノゲン活性化因子(tpA)をコードするc
DNAを含む遺伝子型的に工学操作されたA cN P V L 1変異型であ
った。この組換えバキュロウィルスは3h8と命名され、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(ATCC)にATCC第VR2096号として寄託
された。このウィルスは、表現型PIB−1t−PA+として特性を示され得る
。Sf細胞の共感染は、l:lおよびl:10の野生型二組換え体圧、すなわち
2タイプの割谷により異なるが、いずれかのウィルスについてIまたは10の感
染の多重度で行なわれた。
この感染によりインプット・ウィルスの各タイプのN OVの生産が誘導された
。また、両インプット・ウィルスのヌクレオカプシドを含むmP I Bの生産
も行なわれた。これらの結果は下記に示した。
存在するNOVのタイプを分析するために、後代NOVを含む細胞上清をSf細
胞の単層上にプラーク化し、生成し1こプラークの表現型をスコアした。FIB
を含むプラークは野生型ウィルスにより生成され、FIBを欠くプラークは組換
えtPA含宵ウィルスにより生成され1こ。mPIBの組成を測定するために、
まずmP I Bを細胞培養中に存在する他の物質から単離した。これは、スピ
ナー・フラスコ内容物を遠心分離にかけて、大きな物質、例えばPIBを小さな
物質、例えばNOVから分離することにより行なわれた。次いで、FIB含有含
有物澱物DS含有溶液で数回洗浄することにより、溶解させ、PIB沈澱物を汚
染する細胞片を除去した。PIBはこの処理に耐え、実質的に細胞片を含まない
状態で単離される゛。FIBは、以下の通りウィルスD N Aの生産に適して
いる。FIB沈澱物を炭酸ナトリウムに再懸濁する。この処理によりFIBが溶
解し、封入され1こウィルス・ヌクレオカプシドを溶液中に放出させる。ヌクレ
オカプシドを回収し、超遠心分離により濃縮する。カプシド沈設物をSDS、)
リスおよびEDTA溶液に再懸濁し、プロテイナーゼKを加えた。溶液を37℃
でインキュベーションした。この処理はカプシドからウィルスD N Aを遊離
させた。さらにD N Aを常用のフェノール抽出およびエタノール沈澱により
精製した。
まず精製DNAを慣用的制限エンドヌクレアーゼ(RE N )消化に付すこと
により精製DNAの遺伝子型分析を行った。REN消化DNAをアガロース・ゲ
ル電気泳動により分離し、サザーン法に従い分離され1こDNAをメンブランフ
ィルタ−に移し1こ(マニアチス等、「モレキュラー・クローニングーア・ラボ
ラトリ−・マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−11
982)。ゲルを2方向的にプロットするのが、現時点では最も好都合である。
この方法では、ゲルの2つのフィルター・レプリカが、ど己らかのウィルス・ゲ
ノムに特徴的な配列の一方または他方によりプローブされ得る。この方法は、m
PIB内に含まれるウィルス粒子の遺伝子型性質、すなわち多角体遺伝子および
外性DNA挿入体の存在または不存在を明らかにする。
すなわち、上述の方法により、適当な昆虫宿主に摂取されると、その宿主におい
て混合ウィルス感染を誘発する結果、その感染宿主において後代NOV、後代m
PIBおよび異種蛋白質を生成させ得るバキュロウィルスmPIBが製造され得
る。好ましくはバキュロウィルスmPIBは、所望の昆虫宿主が用いられた特定
のバキュロウィルスにより感染し、そのウィルス複製を助長し得るように上記方
法により設計および製造される。既に述へに通り、多くのバキュロウィルスおよ
び対応する許容宿主昆虫は当業界において公知である。
mPIBは、治療用蛋白質、ワクチン用免疫原、酵素および他の有用な蛋白質の
総体昆虫における大規模製造に使用され得るが、こと同様、生物殺虫剤mP I
Bは、標的(宿主)昆虫において感染性のあるPIB+およびPIB−1挿入
+バキユロウイルスを含む。上述しに通り、生物殺虫剤mPIBのPIB−1挿
入+バキユロウイルスは、標的昆虫に対して毒性を示す蛋白質をコードするDN
A(挿入体)を含む。毒素は、標的昆虫に対して致命的、麻ひ性または有害なも
のであり得る。それらの毒素は、植物または標的もしくは類縁昆虫の天然寄生体
もしくは捕食体から回収および精製され得る。
昆虫の天然寄生体または捕食体には、細菌、ウィルス、真菌および他の昆虫が含
まれる。候補の毒素は、標的昆虫における毒性に関してスクリーニングされ、次
いで常法によりクローニングされ得る。
毒性の例としては、多くのバンルス・ツリンギエンシス株由来の毒性蛋白質があ
る。ま1ニ、ヒメノブテラ、さそりおよび蜘もから単離された毒素も適している
。さらに、この毒素は、感染に対する感受性を高めることが知られている酵素ま
たはそれ自体標的昆虫に対して有害である酵素、例えばキチナーゼであり得る。
それらの場合、mPIBは、その毒素の転写単位を単独で、まには第二毒兎の転
写単位と一緒に含み得る。
さらにこの発明は、上述の生物殺虫剤mPIBを、農業上許容し得る賦形剤、例
えば当業界において公知の賦形剤、担体、結合剤、U■遮断薬、接着剤、湿潤剤
、昆虫誘因剤等と混合し1こ形で含む組成物を包含する。それらの組成物は、乾
燥状態または@濁液、エマルジョンもしくは泡状形態で標的昆虫の一般的食物摂
取頌域、例えば草木、果実、種子、土壌または木場に適用され得る。また、これ
らの組成物は、常用殺虫剤を含有および/まfコは常用殺虫剤と共に適用され得
る。
二の発明のmPIBの一利点は、昆虫宿主を通じた連続継代後におけるそれらの
有効持続性が限られていることである。さらに具体的には、この発明の根拠とな
った研究の過程において、mP I Bの組成は昆虫内での連続継代後に世代間
で変化し、PIB+対PIB−1挿入+の割合が後の後代において一貫して増加
していることが観察された。すなわち、PIB+バキュロウィルスが野生型ウィ
ルスである場合、mPIBの連続世代が含む組換え(PIB−1挿入+)ウィル
スは徐々に少なくなり、最後には野生型PIBのみへの復帰変異が完了する。P
IB−1挿入+遺伝子型が失われるまでの世代数は、好都合には、mPIBを製
造するための培養細胞の共感染に使用されるインプットNOVの割合の調節およ
び/または総体昆虫に摂取されるmPIBの数の調節により修正され得る。PI
B−1挿入+インプツトNOV対PIB+インプツトNOVの比率が大きい場合
、および/または昆虫に摂取されるmP I Bの数か多い場合、nP I B
のPIB−1挿入+遺伝子型の(連続世代に関する)有効持続性は長くなり得る
。組換え遺伝子型が徐々に失われるということは、環境中へのmPIBの偶発的
または計画的放出により起こり得る危険が制限されるため有利なことである。持
続性が観察される限りでは有効な生物殺虫剤にとって実際に充分長いものである
ことも、持続期間が好都合にも制御可能であり、有効性および生物学的研究にお
ける安全性の間の均衡を保ち得ることも予想されなかった。
この発明の別の利点は、特定バキュロウィルスの宿主範囲を変更または回避でき
る可能性である。例えば、工学技術により異種遺伝子を組み込まれた組換えウィ
ルスは、天然宿主範囲が限られているため特定宿主において複製または充分には
複製し得ない。従って、異種遺伝子は多数のコピーに複製される機会をもたない
か、またはウィルス後代はPTHにおいて完全には吸蔵され得ない。宿主範囲に
対するそれらの制限は、多くの場合、非感受性または一部分のみの感受性宿主に
おける完全なウィルス複製周期を支える能力の欠損に起因する。
この問題に対する一つの解答は、混合FIB方法による、所望の宿主/標的種に
おいて複製し得る非工学技術処理バキュロウィルスの利用である。宿主/標的に
おいて優れに複製能を示すウィルスのNOVを用いることにより、それらがまた
優れた複製能を示すセルラインを感染させる。上記方法によりこのセルラインを
工学技術処理ウィルスと共に同時感染させる。適格ウィルスは(相補性により)
非能力ウィルスにより必要とされる機能を提供し、その結果両ウィルスは増殖す
ることが予期される。工学技術処理ウィルスを野生型ウィルスにより形成された
FIBに封入する。この処理により、生成されたmPIBは、遺伝子工学技術に
よるウィルスを宿主/標的昆虫に送達する手段として使用され得る。この状況で
は、mP I Bは昆虫の牛腸で溶解し、細胞は両ウィルスにより同時感染され
る。
再び相補性現象により、宿主/標的昆虫における工学技術処理ウィルスの複製お
よび異種遺伝子の発現が行なわれるべきである。非工学技術処理ウィルスが複製
し得るセルラインが存在しない場合、この方法は生きた昆虫において実施され得
る。その場合、昆虫に2タイプのウィルスのNOVによる注射を行う。生成した
PIBは混合組成を有する。
以下、実施例によりこの発明をさらに詳しく説明するが、それらは後記請求の範
囲に定義された発明の範囲を制限するものではなく、そのように解釈されるべき
でもない。
寒敷劇
実施例!+ mPIB:3h8/L−1の製造および使用。
(a)mP I B:3h8/L−1の製造に使用される2種のウィルスは以下
の通りであった。
FIB+バキュロウィルス:AcNPVのL−1変異型アウトグラフア・カリフ
オルニカ核多角体病ウィルス(AcNPV)のL−1変異型は、感染細胞におけ
るFIBの生産性故に光学顕微鏡下で高いを屈折性を有する典型的NPVプラー
クを生産する。AcNPVまたは他のN P Vの他の多角体生産変異型もまた
使用され得る。
PIB−1挿入+バキュロウィルス=3h8組換えNPV、3h8は、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション(ロックビル、メリーランド)からAT
CC第VR2096号の受託番号下で入手され得る。3h8は、多角体構造遺伝
子の大部分が欠失され、AcNPV多角体プロモーターの転写制御下でヒト組織
プラスミノゲン活性化因子(t−FA)をコードするcDNAと置き換えられた
AcNPVの組換え変異型である。3h8は多角体またはFIBの生産を誘導し
得ないため、屈折性のないウィルス・プラークを生産する。
(b)ウィルスD N Aの制限エンドヌクレアーゼ(REN)分析L−1変異
型および組換え体3h8は、それらの相異なるプラーク形態およびアガロース・
ゲル電気泳動により分析されたそれらのRENパターンにより区別され得る。こ
の後者の区別を行う常法は、REN分解DNAの慣用的サザーン・プロットの実
施である。EcoRIはこの分析に充分適しており、EcoRI lフラグメン
トとして称される約7 、5 kbのAcNPV RENフラグメントは適当な
プローブである。野生型L−1変異型は無傷の単−EcoRI lフラグメント
を含むことが判る。組換えウィルス、3h8は、挿入されたt−PA遺伝子が複
数のEcoR1部位を含むため、4 、 s kbおよび3 、5 kbの2種
の挿入フラグメントを生ずる。これら2種のウィルス、[1および3h8の混合
物は、EcoRIにより生成され1ニDSAフラグメントの分析後に3つのバン
ド全部を生じさせる。3つのバンドの相対オートラジオグラフィー強度は、組換
えウィルス対野生型ウィルスの割合の指標である。
(c)mP I Bの製造および分析
混合組成物FIBを製造するため、スポドブテラ・フルギペルダ細胞のスピナー
・フラスコを常法により感染させるが、野生型L−1および組換え3h8ウイル
スNOVの両方が使用され、感染の多重度は比較的高いものとする。両ウィルス
はいずれか1個の細胞において感染を確立する。感染周期の最終的段階で多角体
が普通に生成されると、組換え3h8ウイルスは外来遺伝子の発現を誘導し[そ
れは(t−FA)を含む]、野生型は多角体蛋白質の発現およびPIBの生産を
誘導する。PIBが多角体蛋白質から凝縮し、野生型ウィルスを吸蔵すると、そ
れらは同時に組換え3h8ウイルスを吸蔵する。インプット野生型L−1対組換
え3h8 NOVの割合を変えることにより、後代FIBにおける2種のウィル
スの割合に影響を与えることができる。
この方法は、以下の要領で実験的に立証され得る。感染周期の最後に、スピナー
・フラスコの上滑に存在する後代NO〜7を新しい細胞においてプラーク化する
ことによりそれらの特性を明らかにする。
得られた力価における増加は、ウィルスが生長しているごとを立証する。プラー
ク検定におけるPIB+対PIB〜後代ウィルスの割合は、インプット・ウィル
スの割合を反映する。
感染細胞における後代FIBの組成は、後代FIB内に含まれるウィルス粒子の
ゲノム構造を分析することにより測定され得る。これらのFIBを感染細胞の遠
心分離により集め、続いて中に含まれるPIBの精製を行う。FIB内に含まれ
るウィルス・ヌクレオカプシドはアルカリ溶解により遊離する。ウィルスDNA
を精製し、EcoRIにより分解し、こうして製造された制限フラグメントをア
ガロース・ゲル電気泳動により分離する。ゲルのサザーン・プロッティングを行
い、常法でウィルスEcoRI ]フラグメントを用いてプロットのブロービン
グを行うことにより、両ウィルス・ゲノムの存在が示された。バンドの強度はそ
れらの相対数度を示す。
実施例2: 混合ウィルス感染の水平伝達実施例1の方法により2通りの異なる
L −] :3h8moi(感染の多重度)割合、すなわち】:1および】;1
0の割合でmP TB:3h8/L−1を製造した。感染周期の最後にmPIB
を採取し、採取したmFIBをヘリオチス・ビレセンス毛虫に摂取させた。毛虫
が飼われている人工食餌の表面にmPIBを散布することにより、摂取を行わせ
た。一般的には、毛虫1匹当たり105−10’のmPIBを食物供給源上に置
いた。通常5日以内に毛虫はウィルス感染により死亡した。完全またはほぼ死亡
した毛虫を集め、システィン中5ミリモルに調節した細胞培養培地、TC−10
0(約5毛虫15iQ培地)中でホモジナイズした。ホモジネートを11000
0Xの遠心分離にかけてPIB含有破片を沈澱させた。N OVを含む上清を0
.45ミクロンのフィルターによりろ過して微生物汚染物質を除去し、新鮮なス
ボドブテラ・フルギベルダ細胞においてプラーク化した。
約5日後、プラークを充分展開することにより、それらの形態(PIB+対PI
B−5挿入+)が確認され、L−1:3h8比が測定され得1こ。
FIBを精製スルf二メ、1100OOX沈澱物を20xQノO、l %SDS
に再懸濁し、ホモジナイズし、2層のチーズクロスによりろ過しfコ。ろ液を1
0分間6000Xgの遠心分離にかけ、°沈澱物を0.1%SDSに再懸濁した
。遠心分離を反復し、沈澱物を水に再懸濁した。この懸濁液を再び遠心分離にか
け、沈澱物を再び水に再懸濁してPIB懸濁液を製造した。こうして製造された
(細胞培養において製造されたmPIBに関して上述した方法により)P I
Bのヌクレオカプシド内容物の分析結果は、これらの後代PIBが両インプット
・ヌクレオカプシドを含むことを示した。しかしなから、野生型対3h8ウイル
ス比は、最初のインプット比と比べて増加していに0また、毛虫を通じて連続継
代により製造された後続後代mPIBは、両タイプのヌクレオカプシドを含むが
、やはり野生型対3h8ウイルス比が徐々に増加していることが見出された。
補正室の写しく翻訳文)提出書
(特許法第184条の8)
平成1年3月8日
Claims (19)
- (1)少なくとも2種の遺伝的に異なるバキュロウイルスのヌクレオカプシドの 混合物を含む混合組成多角体封入体(PIB)であって、バキュロウイルスの少 なくとも一つが、少なくとも1つの異種遺伝子を含むように遺伝子工学的に製造 されたものであり、前記混合組成PIBが昆虫宿主によるその摂取後に前記昆虫 において混合ウイルス感染を生じさせることにより、感染昆虫における混合組成 PIBの追加コピーの生産およびバキュロウイルスの少なくとも1つに存在する 異種遺伝子によりコードされる異種蛋白質の生産が行われ得るPIB。
- (2)バキュロウイルスが、 a)バキュロウイルスに感染細胞での多角体生産を誘導させ得る発現制御配列に 機能し得るように連結された多角体をコードする遺伝子を含む第一バキュロウイ ルス、およびb)単独ではPIBの生産を誘導し得ないが、バキュロウイルスに 感藻細胞での異種遺伝子によりコードされる異種蛋白質の生産を誘導させ得る発 現制御配列に機能し得るように連結された異種遺伝子を含む第二バキュロウイル ス を含む、請求項1記載のPIB。
- (3)第一バキュロウイルスが野生型核多角体病ウイルス(NPV)である、請 求項2記載のPIB。
- (4)第二バキュロウイルスが、多角体遺伝子座に挿入され、発現制御配列に機 能し得るように連結されている異種遺伝子を含む、請求項2記載のPIB。
- (5)発現制御配列が多角体プロモーターを含む、請求項4記載のPIB。
- (6)第二バキュロウイルスが多角体遺伝子の少なくとも一部の欠失を含む、請 求項2記載のPIB。
- (7)異種蛋白質が酵素または治療用蛋白質をコードする、請求項2記載のPI B。
- (8)異種蛋白質が1種またはそれ以上の昆虫種の細胞に対して毒性を示す、請 求項1記載のPIB。
- (9)バキュロウイルス許容細胞の細胞培養を遺伝的に異なるバキュロウイルス の非吸蔵形態により感染させ、ウイルス複製およびPIB生産を可能にする適当 な条件下で感染細胞を培養することを含む請求項1記載のPIBの製造方法。
- (10)さらに、前足方法で製造されたPIBを感染昆虫細胞培養から回収する ことを含む、請求項9記載の方法。
- (11)感染昆虫細胞におけるウイルス複製およびPIB製造を可能にする適当 な条件下で遺伝的に異なるバキュロウイルスの非吸蔵形態により昆虫を感染させ ることを含む、請求項1記載のPIBの製造方法。
- (12)さらに、前記方法で製造されたPIBを感染昆虫から回収することを含 む、請求項11記載の方法。
- (13)感染細胞での多角体生産を誘導し得る第一バキュロウイルスおよび機能 性多角体コード遺伝子は欠くが異種蛋白質をコードする異種遺伝子を含む第二バ キュロウイルスとの昆虫宿主の共感染方法であって、昆虫宿主において混合ウイ ルス感染を発生させ得る請求項1記載のPIBの有効量を昆虫宿主に摂取させる ことを含む方法。
- (14)請求項13記載の方法により昆虫宿主を共感染させ、ウイルス複製およ びPIB生産を可能にする適当な期間および適当な条件下で昆虫を生長させるこ とを含む、異種蛋白質の生産に有用なPIBの製造方法。
- (15)さらに、前記方法で製造されたPIBを感染昆虫から回収することを含 む、請求項14記載の方法。
- (16)請求項13記載の方法により昆虫を共感染させ、ウイルス複製およびバ キュロウイルスの一つに存在する異種遺伝子によりコードされる異種蛋白質の生 産を可能にする有効な期間および適当な条件下で昆虫を生長させることを含む、 昆虫における異種蛋白質の製造方法。
- (17)さらに、異種蛋白質を、それが製造される昆虫から回収することを含む 、請求項16記載の方法。
- (18)さらに、前記方法で回収された異種蛋白質の精製工程を含む、請求項1 7記載の方法。
- (19)異種蛋白質が治療用蛋白質または酵素である、請求項16記載の方法。
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