JP6339206B2 - 害虫に対抗するために使用することができるバキュロウイルスの異なる種のゲノムを含むビリオンを封入するウイルス封入体の製造。 - Google Patents

Description

本発明は、バキュロウイルスの特定の種または株に感受性のある害虫の侵入を制御するための生物学的殺虫剤の製造および使用の分野に関する。より詳しくは、本発明は、同じビリオンにおいて共に包まれる少なくとも２つの異なるバキュロウイルス種からのゲノムを含む混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）、および／または少なくとも１つの前記混合ウイルス封入体由来ビリオンが閉じ込められているウイルス封入体（ＯＢ）を製造する方法、ならびにそのようなＯＤＶおよびＯＢ、それらを含む組成物および害虫に対抗するためにそれらの使用に関する。

バキュロウイルス（バキュロウイルス科）は、農業および医学的または獣医学的に重要な害虫を含む昆虫の多様な種の自然個体群において、重要な死亡因子を表す昆虫病原菌である。バキュロウイルスは、４つ属のいずれかに分類される：アルファバキュロウイルス（鱗翅目の核多角体病ウイルス（ＮＰＶ））、ベータバキュロウイルス（鱗翅目の顆粒ウイルス（ＧＶ））、ガンマバキュロウイルス（双翅目のＮＰＶ）およびデルタバキュロウイルス（膜翅目のＮＰＶ）。特定のバキュロウイルスは、それらの病原性（致死量の指標により測定される）、毒性（殺す速さ）および工業的規模での生物学的殺虫剤の基礎としてのそれらの発展につながった封入体（ＯＢ）の産生など、殺虫剤の特性を有する。これらの製品は、害虫の制御に成功裏に使用されている（Moscardi １９９９年）。生物学的殺虫剤としてアルファバキュロウイルスを使用する害虫制御の特に成功した例は、大豆におけるアンチカルシアゲマタリス（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）（Moscardi １９９９年）または綿におけるオオタバコガ（Sun & Peng、２００７年）を含む。

バキュロウイルスの別の有用な特徴は、それらの高レベルのバイオセキュリティおよび導入遺伝子発現ベクターとしてのそれらの発展につながったインビトロ系の細胞培養での非常に高い特定の遺伝子の発現である(SummersとSmith, 1987; van Oers, 2011)。ほとんどのバキュロウイルス発現系は、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＭＮＰＶの使用に基づく（Rohrmann、2008年）。組換えバキュロウイルス（ｒＢａｃ）は、ヒトを含む高等動物と共通する翻訳後タンパク質修飾系の利点のために昆虫細胞での何百もの真核生物のタンパクの生産のために現在使用されている（Millerら、1997年; Ahnら、2008年）。ｒＢａｃ製造タンパク質は、機能的研究において（van Oers、２０１１年）、これらのウイルスの殺虫剤特性の改善のために(Jiang et al., 2008)、ヒトワクチンの製造において（Harper etら、2009年; Kantoffら、2010年; Madhanら、2010年）、診断ツールや最近の潜在的な遺伝子治療ベクターとしての開発において（Hitchmanら、2011年; Kaikkonenら、2011年）使用されている。

バキュロウイルスは、昆虫細胞の核内で複製する二本鎖ＤＮＡウイルスである。環状ゲノムは、ウイルスの種類に応じて８０〜１８０ｋｂｐの間で変化し、超らせん状であり、タンパク質のヌクレオカプシドで凝縮される（Rohrmann、２００８年）。ヌクレオカプシド（ＮＣ）は、アセンブリと成熟の間、外部膜を取得し、バキュロウイルスの主要な感染実体である、ビリオンの形成をもたらす（図１）。バキュロウイルスの生物学的サイクルは２つの形態学的かつ機能的に区別できるビリオンを含む：（１）感染細胞の膜から昆虫の血体腔の中に芽を出し、感染した昆虫に感染に感受性のある組織と臓器において他の細胞に感染させるために分散する発芽ビリオン（ＢＶ）、（２）閉塞由来ビリオン（ＯＤＶ）は、環境でＯＤＶを保護する封入体（ＯＢ）を形成するタンパク質性マトリックスに閉じ込められ、昆虫間の感染を促進する。アルファバキュロウイルスのＯＢは、ポリヘドリンタンパク質を含み、一般的に数十のＯＤＶを封入する。これらのウイルスは、２つのタイプのいずれかに分類される（図１）：（ｉ）単一ヌクレオカプシド核多角体病ウイルス（ＳＮＰＶ）は、各ＯＤＶ内に単一ヌクレオカプシドを含み、または（ｉｉ）多発性ヌクレオカプシド核多角体病ウイルス（ＭＮＰＶ）は、各ＯＤＶ内に１つまたは様々なヌクレオカプシドを含みうる。

バキュロウイルスは、節足動物宿主においてのみ生産的感染が可能であり、その大半は、鱗翅目である。病原性効果は、脊椎動物、軟体動物または植物中のバキュロウイルスの接種または注射後に観察されていない。そのように、それらの使用が、標的害虫を除き、ヒトの健康または他の動物の健康に対して伴うリスクが最小であったので、バキュロウイルスは、生物農薬の開発に非常に安全であると考えられる（Burgesら、1980年; Leuschnerら、2010年)。

バキュロウイルスに基づく殺虫剤の商業化において１つの重要な問題は、これらのウイルスの高い宿主特異性であり、単一またはいくつかの非常に密接に関連する害虫の種のみに感染しまたは殺すことができる（Groner、１９８６年）。結果として、２つ以上の害虫種の複合体を制御する必要がある農作物保護の状況では、同時にまたは別個の適用において、２つ以上の異なるバキュロウイルスのＯＢを適用することが常に必要である。害虫の複数種の制御のための生物農薬の生産は、ほとんど常に、異なる昆虫コロニーにおいてバキュロウイルスの複数の種の製造を伴い、各生産は、それ自体のコストを含むため、複数のウイルス種を使用する生物学的制御は、広範なスペクトルを有する合成殺虫剤の使用と比較すると制御の費用で競合しない。

バキュロウイルスＯＢはまた、単層培養物および懸濁培養物の両方において、感受性昆虫細胞の培養から得ることができる。バキュロウイルスは、外来遺伝子発現として使用することができ、したがって大量の組換えタンパク質は、比較的簡単に、特に昆虫細胞培養物からだけでなく、昆虫の幼虫からも得られる（http://www.pitt.edu/~super7/32011-33001/32731.pptまたはJarvis DL (2009)で利用できるYadavらのプレゼンテーション「バキュロウイルス発現系」参照）。

他のウイルスからの、宿主昆虫ゲノムからの、または他の生物または合成遺伝子のゲノムからの遺伝子の挿入、削除または交換により、バキュロウイルスの殺虫剤の特性を現在修正することができる（Inceogluら、２００６年）。拡張された宿主範囲を有するバキュロウイルスの開発は、研究の対象となっており、いくつかの場合、遺伝子組み換えは、特定のバキュロウイルスに当然に許容しない宿主種において生産的感染を招くウイルスの能力に影響を与えるために使用されている。最初のステップとして、オートグラファカリフォルニカＭＮＰＶの宿主範囲は、カイコガのカイコガを含むヘリカーゼ遺伝子の範囲において組換えを通じて拡張された（KondoおよびMaeda、1991年; Croizierら、1992年, KamitaおよびMaeda、1996年; Argaudら、1998年）。その後の研究は、バキュロウイルスにおいて宿主範囲を決定する遺伝的因子を研究するために同様のアプローチを採用した（Watanabeら、２０１０年）。全体的に、これらの研究は、宿主範囲で含まれる遺伝子は容易に同定されず、特定の害虫を含む宿主範囲を拡張するのに必要な特定の遺伝子組み換えは不明のままであると結論付けられている。

各昆虫細胞は、１つより多いウイルスにより同時に感染されることができる（GarzonおよびKurstak、1972年; Arellaら、1983年; Kanthongら、2010年）。バキュロウイルスにおいて、１つの野生型および１つの遺伝子学的に修正される、ウイルスの同じ種の２つの遺伝子型によって昆虫の重感染は、環境内で修正される遺伝子型の持続性に有利に働くことができる（Hamblinら、１９９０年）。この後者の場合、同じウイルス種の２つの遺伝子型が含まれた。研究の著者は、共閉塞が発生したことを示唆するが、実際には重感染のみが証明された。

同様のアプローチがＷＯ８８／０２０３０および米国特許第５０７１７４８号のファミリーに記載された（Miller、１９９１年）。前記文書において記載される発明は、少なくとも２つの遺伝子学的に区別できるバキュロウイルスのヌクレオカプシドの混合物を含む多面体封入体（ＰＩＰ、封入体、ＯＢの同義語である）に関する。ＰＢＰの混合組成物（ｍＰＩＰ）は、感染細胞においてポリヘドリンの生産を導くことができる、野生型、変異体または遺伝子学的に修正されるウイルスでありうる少なくとも１つのバキュロウイルスの感染昆虫細胞とヌクレオシドにおいて、ポリヘドリンの製造を導くことができない少なくとも１つの「組換え」バキュロウイルスを含む。原則的に、本発明はバキュロウイルスの異なる種の使用に適合したが、与えられた例のみは、同じ種の２つの遺伝子型、オートグラファカリフォルニカ、ＡｃＮＭＰＶ（ＡｃＮＰＶとして上記文書で短縮される）に感染する核多角体病ウイルスを有する昆虫細胞の感染を記載する。使用されるウイルスの１つは、野生型ウイルスであり、他の１つは、組換えウイルスであり、ポリヘドリン遺伝子はヒト組織型プラスイノーゲン活性化因子でコードされるｃＤＮＡにより置換される、ＡｃＭＮＰＶのＬ−１変異体である。ＷＯ８８／０２０３０の例２によると、得られるｍＰＩＢを有するオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の毛虫の感染は、ＡｃＭＮＰＶの遺伝子型の両方のヌクレオカプシドを含む子孫のＰＩＢを生じさせる。この特定の場合において、野生型のウイルスの割合は、元の比率、その後のｍＰＩＢの子孫の毛虫を介して連続係代後に見つけられる野生型ウイルスの段階的な増加率に関する。記載のアッセイは、取得するＰＩＢはビリオンを含み、得られたＰＩＢが、ビリオンを含んだか否か、両方の遺伝子型のヌクレオカプシドが共に閉じ込められたかまたはされなかったかを明示的に言及しない：この重要な問題は確認されなかった。

したがって、本質的に、Hamblinら（１９９０年）またはMiller (WO 88/02030)によって提示された情報は、使用される両方の遺伝子型が存在し実験的な接種材料に持続されたが、それらは遺伝子型の間の物理的会合の証拠を示さなかった：具体的には、両方の遺伝子型が単一ＯＢ（ＰＩ）に存在したまたは両方の遺伝子型が単一ＯＤＶに存在した。

他の著者（Lopez-Ferberら、２００３年）は、同じ種の異なる遺伝子型の単一ビリオン中で共閉塞を見つけたが、前の場合のように、少なくとも１つの遺伝子型は、生存に不可欠な遺伝子を欠いた欠陥品であった。したがって、欠陥のある遺伝子型は、完全なウイルスの遺伝子型を有する重感染によるものであり、それらの複製と伝達のための後者の遺伝子製品の使用である。より最近では、ウイルスの種の異なる遺伝子型は、ＯＢにその後閉じ込められるＯＤＶに存在することができ（Clavijo、２００９年）、すなわち、ヌクレオカプシド、区別できる遺伝子型を含むそれぞれが、膜中で一緒に包まれ、混合遺伝子型ＯＤＶを形成することができることが証明されている。

バキュロウイルスの２種による単一の昆虫の重感染は、オートグラファカリニカＭＮＰＶ（ＡｃＭＮＰＶ）とシロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）ＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）を含む実験に記載されている（Yanaseら、１９９８年）。この研究は、これらのウイルスの１つは、複製せず、感染昆虫内で組換え型の発生は観察されなかったと結論付けた。同様に、細胞培養研究において、主に含まれる細胞と各ウイルスの病理学的意味の観点からバキュロウイルスの２つの異なる種による重感染が報告されている（McClintock & Dougherty 1987; Saleら、2012年）。

Simonら（２００４年）による後続の研究は、特定の条件下、核多角病ウイルス（シロイチモジヨトウＭＮＰＶおよびツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＭＮＰＶ）の２つの異なる種は、単独で接種したときに、シロイチモジヨトウＭＮＰＶに感受性がなくツマジロクサヨトウの幼虫の重感染を容易にするように作用することができる。しかしながら、その研究は、両方のこれらのウイルスが同一細胞内で同時に複製することができたこと、またはこれらのウイルスによる重感染は、混合ウイルスＯＤＶまたは共閉塞される混合ウイルスＯＢをもたらすことの証拠が存在しなかった。

したがって、やなせおよび共同研究者（Yanaseら、１９９８年）により報告される研究のような先行技術は、異なる種に属するバキュロウイルスは同じ昆虫に重感染できたが、同じＯＢ中に閉じ込められる、両方の種のヌクレオカプシドを含む混合ＯＤＶの製造のために存在している証拠はない。しかしながら、特に１つより多い昆虫の種類が存在するとき、殺虫剤の適用を分けるのを避けて害虫に対抗するために、１つより多い種の昆虫または同じバキュロウイルスの異なる遺伝子型に変わりやすい感受性を示す農作物のために使用することができた、１つ以上の異なる種を含むバキュロウイルスに基づく殺虫剤組成物を調製するのに有用であっただろう。さらに、そのような組成物は、広範なスペクトル合成殺虫剤の使用に関連する費用と競合する組成物を許可する方法を使用して生産されるべきである。好ましくは、その製造方法は、それぞれが独自のコストを含む、異なる昆虫コロニーでバキュロウイルスの複数の種の生産を回避すべきである。

本発明はそのような問題の解決手段を提供する。

本発明は、２つの密接に関連するバキュロウイルス（例えばＡｃＭＮＰＶとＳｆＭＮＰＶ）と同様に、２つの系統発生学的に密接に関連するバキュロウイルス（例えば、ＳｅＭＰＶとＳｆＭＮＰＶ）は、重感染することができ、そして、それぞれが特定の昆虫細胞において生産的感染を生み出す。これは、ＯＢの中に閉じ込められる混合ウイルスＯＤＶになる。混合ウイルスＯＢは、拡張宿主範囲表現型を有し、単一ＯＢの接種材料を使用して標的害虫に対抗するために使用することができる。

したがって、最初の側面において、本発明は、同じビリオンにおいて、共に包まれる少なくとも２つの異なるバキュロウイルス種からのゲノムを含む混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）を製造する方法、および／または少なくとも１つの前記混合ウイルス封入体由来ビリオンが閉じ込められるウイルス封入体を製造する方法に言及する。好ましくは、同じＯＤＶにおいて存在する少なくとも２つ異なるゲノムが、異なるゲノムを含む第２のバキュロウイルスで重感染の必要なしに、感染性バキュロウイルス粒子をそれぞれ生じることができ、細胞内で完全なウイルスサイクルを生成することができるゲノムである。ウイルス封入体が生産されることが好ましい。ウイルス封入体が、下記によって製造されること特に好ましい：
ａ.１つの特定の種に属する各バキュロウイルスゲノムが他のものよりも同一または異なるＯＤＶであることができる、少なくとも１つの製造される閉塞由来ビリオンにおいて共に包まれるバキュロウイルスゲノムを有する昆虫種の幼虫または培養細胞を重感染する；
ｂ．多角体病により死亡するまで感染される幼虫を育てるまたは細胞を培養する；
ｃ．それらの死亡後幼虫または培養される細胞から製造されるＯＢを単離する；
細胞または幼虫は、製造される閉塞由来ビリオンの少なくとも１つにおいて共に包まれるものであるゲノムのバキュロウイルスのいずれかによる感染に感受性がある。

本発明の別の側面は、同じビリオンにおいて共に包まれる少なくとも２つの異なるバキュロウイルス種のゲノムを含む混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）である：本発明のＯＤＶ。本発明の側面の特に好ましい態様は、本発明の方法によって取得されるＯＤＶである。

同様に、また本発明の側面において、同じビリオンにおいて共に包まれる少なくとも２つの異なるバキュロウイルス種のゲノムを含む少なくもＯＤＶを閉じ込めている混合ウイルス封入体（ＯＢ）の本発明の側面である：本発明の混合ＯＢ。本発明の側面の特に好ましい態様は、本発明の方法により取得される混合ＯＢである。

本発明の別の側面は、少なくとも本発明のＯＤＶおよび／または少なくとも本発明のＯＢを含む組成物である。そのような組成物は、本発明の組成物である。

また、本発明の側面は、本発明のＯＢおよび／または害虫の対抗のための本発明の組成物の使用である。

図１は、核多角病体ウイルスの微細構造を示す。 −パネルａ（図の上部）は、封入体（ＯＢ）の顕微鏡写真を示し、その個々の配置図を顕微鏡写真の右側に示す。パネルの右側には、２つの封入体が表され、それらの内部を示し、その中の円や矩形はＯＤＶ（閉塞由来ビリオン）を表す。 −パネルｂ（図の下部）は、２つの異なる型のＯＤＶを表す。左のその１つは、１つの単一ヌクレオカプシド（ＮＣ）を含む単一核多角病体ウイルス（ＳＮＰＶ）に対応し、ゲノムＤＮＡ（らせん状物として表される）と関連するタンパク質により形成される。右の１つは、ＯＣＶごとに１つ以上のヌクレオカプシド（ＮＣ）（それぞれ内側にらせんを有する矩形として示される）を含む１つの多発性核多角体病ウイルス（ＭＮＰＶ）に対応する。 シロイチモジヨトウ核多角体病ウイルス変異体ＳｅＵＳ２−Ａ（レーン１）およびツマジロクサヨトウ核多角体病ウイルス変異体ＳｆＮＩＣ−Ｃ（２）のＰｓｔＩを有するゲノムＤＮＡ処理後、発生する制限エンドヌクレアーゼプロファイル。分子マーカー（Ｍ）は、HyperladderＩ（Bioline社）である。 ＯＢと電気泳動から抽出されるＤＮＡのＰｓｔＩで処理後、ウイルスゲノムＤＮＡの制限断片長多型。レーン： −Ｍ：分子量マーカーHyperladder I（Bioline社） −レーン１：ＳｅＵＳ２−ＡのＯＢから抽出されるＤＮＡのＰｓｔＩ制限プロファイル −レーン２：ＳｆＮＩＣ−ＣのＯＢから抽出されるＤＮＡのＰｓｔＩ制限プロファイル −レーン３：ＳｅＵＳ２−ＡとＳｆＮＩＣ−ＣのＯＤＶでシロイチモジヨトウの幼虫の重感染後、ＯＢから抽出されるＤＮＡのＰｓｔＩ制限プロファイル。ＳｅＵＳ２−Ａのプロファイルのみが観察されたが、ＰＣＴ増幅は、ＳｆＮＩＣ−ＣのＤＮＡの存在を確認した（示されるデータは繰り返し＃１からである）。 −レーン４：ＳｅＵＳ２−ＡとＳｆＮＩＣ−ＣのＯＤＶによる重感染の間、製造されるＯＢを使用してツマジロクサヨトウの第２齢の接種後、製造されるＯＢから抽出されるＤＮＡのＰｓｔＩ制限プロファイル −レーン５：レーン３と同じだが、繰り返し＃２のために示されるデータ −レーン６：レーン４と同じだが、繰り返し＃２のために示されるデータ。 ie-0遺伝子配列で標的にされる特定のプライマーを使用してシロイチモジヨトウまたはツマジロクサヨトウの幼虫において製造されるＯＢから抽出されるＳｅＵＳ２−ＡとＳｆＮＩＣ−ＣのＤＮＡのＰＣＲ検出。 −Ｍ：分子量マーカーHyperladder I（Bioline社） −レーン１：ＳｅＵＳ２−ＡのＯＢから抽出されるＤＮＡ（非特異的増幅産物） −レーン２：ＳｆＮＩＣ−ＣのＯＢから抽出されるＤＮＡ −レーン３：ＳｅＵＳ２−ＡとＳｆＮＩＣ−ＣのＯＤＶでシロイチモジヨトウの幼虫の重感染後、ＯＢから抽出されるＤＮＡ。繰り返し＃１からの結果。 −レーン４：ＳｅＵＳ２−ＡとＳｆＮＩＣ−ＣのＯＤＶで重感染される幼虫からのＯＢを使用してツマジロクサヨトウの第２齢の接種後、生産されるＯＢから抽出されるＤＮＡ。繰り返し＃１からの結果。 −レーン５：レーン３と同じだが、繰り返し＃２からの結果 −レーン６：レーン４と同じだが、繰り返し＃２からの結果。 ＯＢにけるＳｅＵＳ２−ＡとＳｆＮＩＣ−Ｃのウイルスの共閉塞：異なるＯＢ混合物におけるＳｅＵＳ２−Ａの１００ｎｇごとのＳｆＮＩＣ−Ｃゲノムの相対存在量。シロイチモジヨトウの幼虫における対応する継代数（Ｐ０〜Ｐ６）は、以下のｘ軸に示され、ＳｅＵＳ２−ＡとＳｆＮＩＣ−Ｃの混合物の比率１：１から放出されるＯＤＶを使用して重感染に対応する。エラーバーは、標準偏差を示す。 共閉塞混合ウイルスＯＢ（ＡｃＭＮＰＶ＋ＳｆＭＮＰＶ）から抽出されるＡｃＣ６(ＡｃＭＮＰＶ)、ＳｆＮＩＣ−Ｂ(ＳｆＭＮＰＶ)およびＤＮＡから増幅されるＰＣＲ生成物の電気泳動。Hyperladder Iは左側に示される断片長と一緒に分子サイズマーカーを示す。 ＳｆＮＩＣ−ＣとＡｃＣ６ウイルスでツマジロクサヨトウの重感染後、製造される混合ウイルスＯＢに閉じ込められている混合ウイルスＯＤＶの図表の例。正面（サイド）や頂上（エンド）ビューにおける矩形や円はそれぞれＯＤＶを表す。矩形の中の水平線または円の中の点は、ヌクレオカプシドを表し、黒いものは１つの種に属し、明るいものは別の種に属する。 終点希釈サンプルから抽出されるＤＮＡから増幅されるＰＣＲ生成物の電気泳動（３回繰り返し）。Hyperladder Iは、分子サイズマーカーを表す（Bioline社）。最後の２つのレーンは、ＡｃＣ６(ＡｃＭＮＰＶ)およびＳｆＮＩＣ−Ｂ (ＳｆＭＮＰＶ)のゲノムＤＮＡのための陽性コントロールを示す。上のレーンは、ＳｆＮＩＣ−Ｂ特異的プライマーを使用する増幅を示し、下のレーンは、ＡｃＣ６特異的プライマーを使用する増幅を示す。 幼虫の死亡率は、ツマジロクサヨトウの幼虫の単一、同時または遅延する重複感染後に観察した。処置は最初のウイルスの始原細胞、第一と第二の接種の間の時間の間、および接種される第二のウイルスの始原細胞によって示され、例えば、Ａｃ１２Ｓｆは、幼虫はＡｃＣ６のＯＢで最初に感染させ、その後１２時間後にＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢで接種されたことを示す。列より上の値は、ウイルス誘導死亡率の割合を示す。同一の文字に続く値は、有意差はなかった（ＡＮＯＶＡ, Ｔｕｋｅｙ, ｐ>０．０５）。 ＯＢから抽出されるＡｃＣ６(ＡｃＭＮＰＶ)のゲノムＤＮＡとＳｆＮＩＣ−Ｂ(ＳｆＭＮＰＶ)のゲノムＤＮＡの対数比率は、これらのウイルスのそれぞれのＯＢの接種材料を使用して、単一の感染、同時の感染および遅延（１２〜７２時間）重複感染の間、作成した。同一の文字により率いる列は、有意差はなかった（ＡＮＯＶＡ, Ｔｕｋｅｙ, ｐ>０．０５）。 ＯＤＶの組成物は、同時および遅延重感染実験において製造される混合ウイルスＯＢから放出された。

方法は、異なるバキュロウイルス種のゲノムを含むビリオンによって発現され、同じウイルス封入体（ＯＢ）内に閉じ込められ、バキュロウイルスの特徴である構造的および形態学的特徴と一緒に得ることができる。本発明の方法により取得される混合ゲノムＯＢは、バキュロウイルスの異なる種または株から２つ以上の異なるゲノムの混合物を含む。

ヤナセおよび共同研究（Yanaseら、１９９８年）のような以前の研究で見出される結果に反して、本出願で提示されるアッセイは、２種のバキュロウイルス、特に多発性核多角体病ウイルスによって単一の昆虫の重感染を示し、同じ閉塞由来ウイルス（ＯＤＶ）において異なるウイルスゲノムを含むヌクレオカプシドの包装に対しても、同じ細胞で両方のウイルスの複製をもたらすことができる。

したがって、異なるゲノムは、各ＯＤＶにおいて同時に存在することができ、病原性、毒性、ＯＢの製造および宿主範囲などの殺虫剤特性の異なる２種以上のバキュロウイルスにより感染に感受性がある昆虫種の重感染により製造することができる。それらは、ウイルス封入体（ＯＢ）において正常な形態およびサイズで閉じ込めることができ、それらの構成成分バキュロウイルスのいずれかにより感染に感受性のある昆虫の種を感染することができる。

単一核多角体病ウイルスは、各ＯＤＶにおいて唯一１つのヌクレオカプシドの存在によって特徴付けられる一方、１つより多いヌクレオカプシドを含む（ＯＤＶ）（および、したがって、１つより多いバキュロウイルスゲノム）は、多発性核多角体病ウイルスの特徴である。したがって、本発明の方法を実施するために、少なくとも１つの使用されるバキュロウイルスは、多発性核多角体病ウイルス（ＭＮＰＶ）でなければならない。

本願の例は、本発明の方法は、バキュロウイルスに系統発生学的に密接に関連するバキュロウイルス（例えば、ＳｅＭＮＰＶとＳｆＭＮＰＶ）、および遠縁の関連するバキュロウイル（例えば、ＡｃＭＮＰＶとＳｆＭＮＰＶのような）の両方に働くことができることを示す。両方の場合において、バキュロウイルスは、重感染することができ、それぞれが、特に昆虫細胞において生産的感染を生じさせる。バキュロウイルスに関する利用可能な知識に従って、本発明の方法は、バキュロウイルスのいずれかの組み合わせで実施することができ、それらの少なくとも１つは、多発性核多角体病ウイルスであることを条件とされる。本願の例のように、同一の幼虫を接種される全てのバキュロウイルスは、アルファバキュロウイルスであることが好ましい。アルファバキュロウイルスは、同じ系統発生学的グループ（例１のように、グループＩＩに属する２つのアルファバキュロウイルスが使用される）または異なるグループ（例２および３のように、グループＩの１つのアルファバキュロウイルスおよびグループＩＩの１つのアルファバキュロウイルスが使用される）に属することができる。

可能な組み合わせの例は、前記例で見つけることができる：ツマジロクサヨトウは、いくつかの経済的に重要な作物の破壊的な鱗翅目害虫である。ツマジロクサヨトウ多発性核多角体病ウイルス（ＳｆＭＮＰＶ）は非常に狭い宿主範囲を有し（実際、ツマジロクサヨトウ、ハスモンヨトウおよびシロイモジヨトウにおける致死的感染を引き起こすことができる）、単一の制御剤でより害虫種を制御する広範なスペクトル有する殺虫剤と組み合わせてそれを使用することが望ましい。その目的のため、オートグラガカリフォルニカ多発性核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）は、感染し、ツマジロクサヨトウを含む少なくとも３２の鱗翅目種の幼虫を殺すことができ、興味深いパートナーであるように思われる。しかしながら、全ての宿主種がＡｃＭＮＰＶによる致命的な感染に高い感受性があるわけではない。例３はＳｆＭＮＰＶを有するＡｃＭＮＰＶの同時感染はＡｃＭＮＰＶで処理される昆虫で取得される死亡率を増加させることができる；したがって、前記２つのウイルスのそれぞれのゲノムを有する混合ＯＤＶを含むＯＢを含む組成物は、得られる結果を改善することができる。

本発明の方法は、少なくとも１つ閉塞由来ビリオン（ＯＤＶ）において共に包まれるバキュロウイルスゲノムを有する昆虫の幼虫または昆虫細胞培養物を重感染することにより実施されることができる。

本発明の方法において、バキュロウイルスゲノムは、昆虫の幼虫または好ましくはヌクレオカプシドを形成しながら昆虫細胞培養物に提供（接種）される。接種されるヌクレオカプシドは、ＯＤＶを形成しながらエンベロープにより包まれるグループに関連付けることができ、それは、上述のように、発芽ビリオン（ＢＶ）が感染された昆虫内でまたは細部培養物において感染の細胞間伝達のためにインビトロで製造されるウイルス粒子である。次に、接種されるＯＤＶは、遊離ＯＤＶであることができ（封入体に閉じ込められていない）またはそれらは、封入体（ＯＢ）を形成しながらタンパク性マトリックスに閉じ込めることができ、各ＯＢはいくつかのＯＤＶを含む。

昆虫および細胞培養物は、ＢＶを使用して接種されることができる。ＢＶが接種されるとき、いくつかの異なるＢＶのセットが、接種されなければならない；ＢＶの各セットは、特定のバキュロウイルス種のゲノムを有するヌクレオカプシドを含む。接種されるＢＶセットの数は、同じＯＤＶにおいて共に包まれる異なるバキュロウイルス種の数に等しいであろう。したがって、接種材料としてのＢＶの使用は、同じＯＤＶにおいて、共に包まれる他のウイルス型（または複数の型）のゲノム（ヌクレオカプシド）を含むウイルス型の１つおよびＢＶのゲノム（ヌクレオカプシド）を含むＢＶは接種されるべきであることを必然的に示す。

各ＢＶが単一ヌクレオカプシドを含み、各ヌクレオカプシドが単一のゲノムコピーを含むように、異なるバキュロウイルス種のＢＶの型であるバキュロウイルスの異なる種のヌクレオカプシドの接種により、本発明の方法を実施することは、別の可能な態様に類似し、特定のウイルス種ゲノムの各コピーを含むヌクレオカプシドは、昆虫宿主（昆虫の幼虫）または昆虫細胞培養物を接種するために使用される。本発明の方法のこの態様において、１つの特定のウイルス種に属するバキュロウイルスゲノムを有するＯＤＶは、最初のものと異なる別のウイルス種のゲノムを含むヌクレオカプシドを含むＯＤＶまたはＢＶと一緒に、昆虫の幼虫または昆虫細胞培養物を同時にまたは以下の時間間隔で、接種するために使用さる。そのような態様が好ましく、特に本発明の方法が最初に実施されるときが好ましいであろう。

しかし、後者の状況は、本発明の方法を実施するために必要ではなく、例３で見られるように、本発明の方法のステップの適用により得られるＯＢに閉じ込められる、ＯＤＶは、新しいＯＤＶおよびＯＢを得るために健康な幼虫に接種するために使用され、例や対応する図で見ることができるように、接種の追加ラウンドに使用されるＯＤＶのいくつかおよびＯＢの製造は、１つより多いゲノムの型を含み、すなわち、最初のラウンドにおいて接種される２つ以上の異なるバキュロウイルス種に属するゲノムは、感染の最初のラウンドから得られるＯＤＶのいくつかにおいて共に包まれ、幼虫を接種するために使用することができ、本発明の方法を再び実施する。

すでにコメントしたように、ＯＤＶ（および、したがって、ＯＤＶ中で包まれるヌクレオカプシド）は、昆虫の幼虫を接種するために使用することができ、封入体（ＯＢ）に閉じ込められまたは封入体に閉じ込められていない（後者の場合において、ＯＤＶは、遊離ＯＤＶとして本明細書で言及する）。昆虫細胞培養物の場合において、ＯＤＶはＯＢから放出された後、接種のために使用されることができる。ＯＢから放出されるＯＤＶは、遊離ＯＤＶとして以下、言及する。

ＯＢが接種のために使用されるとき、同じ封入体に閉じ込められる全てのＯＤＶは、単一の種に属し、すなわち、全てのＯＤＶは、単一ウイルス種のゲノムを有するヌクレオカプシドを含み、そして全てのＯＤＶは同じ種のゲノムを有するヌクレオカプシドを含む。しかしそれはまた、同じ封入体に閉じ込められるＯＤＶは、それらのヌクレオカプシドのゲノム内部、単一種のゲノムを含むそれらのいくつか、同じ種にも属するゲノムを含む他のものに関する異なる組成物を有することができるが、最初のものと異なり、そしてさらに異なるヌクレオカプシドは一緒に包まれてＯＤＶを形成するまた他のものであり、少なくとも１つ、またはいくつかのＯＤＶは、同じＯＤＶの他のヌクレオカプシドの種ゲノムから異なる１つの種に属するゲノムを含む。ＯＢの両方の種類は、本発明の方法を実施するために接種されることができる。したがって、本発明の可能な態様は、接種されるヌクレオカプシドは、封入体に閉じ込められるＯＤＶを形成するために包まれ、少なくとも１つの閉じ込められた封入体は、ヌクレオカプシドが１つより多いバキュロウイルス種を含むヌクレオシドが共に包まれる少なくとも１つのＯＤＶを含む。

別の可能な態様は、同じ封入体に閉じ込められる全てのＯＤＶは、同じ種のゲノムを有するヌクレオカプシドを含むものである。後者の場合、ＯＢのいくつかのセットは、昆虫の幼虫を接種するために使用されるべきであり、各セットは、特定のウイルス型または種のゲノムを含むヌクレオカプシドを含む。

上述のように、ＢＶまたは遊離ＯＤＶは、本発明の目的のために昆虫細胞を接種するために使用されることができる。これは、接種されるゲノムの複製および新しいウイルス粒子の製造のために使用されるシステムによるものである。異なるバキュロウイルス種ゲノムと一緒にインビトロで培養される昆虫細胞の接種のために、ＢＶまたは遊離ＯＤＶは細胞を感染するために使用されることができる。

異なるバキュロウイルスゲノムで重感染される昆虫細胞である場合、ゲノムは、昆虫宿主（昆虫の幼虫）の組織の一部であり、ＢＶ、または遊離ＢＶまたは異なるバキュロウイルス種のＯＢまたは異なるバキュロウイルス種のゲノムの混合物を含むＯＢはまた、接種のために使用されることができるが、接種経路は使用する粒子の種類を選択するために留意しなければならない：
−バキュロウイルスゲノムを含むウイルス粒子が注射される場合、ＢＶまたは遊離ＯＤＶを使用することができる。血体腔注射が好ましい。
−ヌクレオカプシドを経口的に昆虫の幼虫に接種する場合、ＢＶ、遊離ＯＤＶまたはＯＢを使用することができる。ＢＶはこの経路による感染の最少限に効果的な粒子である。遊離ＯＤＶを使用することができるが、封入体は自然に昆虫の幼虫によって取り込まれ、それらは自然感染性粒子であるので、これらは封入体に閉じ込められることが好ましい。経口接種が使用される場合、封入体を昆虫に供給される水性懸濁液で投与することができ、またはそれらは、食事または昆虫の幼虫により摂取される他の物質と混合される、固体または半固体の形態で投与されることができる。

幼虫の昆虫細胞または昆虫培養細胞に感染されると、それらは、その後ＯＤＶおよびＯＢに組み込まれる他のヌクレオカプシドを生じさせる。本発明に従うと、昆虫または昆虫細胞が異なるバキュロウイルス種のゲノムで重感染される場合、製造されるＯＤＶ画分はウイルスＯＤＶに混合され、少なくとも１つのヌクレオカプシドは、同じＯＤＶにおいて共に包まれる他のゲノムコピー（他のヌクレオカプシド）と異なり、すなわち、異なるバキュロウイルス種のゲノムは、同じＯＤＶにおいて共に包まれる。

上記で説明したように、それらが閉じ込められる混合ウイルスＯＤＶまたはＯＢは、害虫に対抗する生物農薬として使用されることができる大量の混合ゲノムＯＢを製造する感受性のある昆虫に感染するために使用することができる。これは、バキュロウイルスを含む殺虫剤を使用して扱われることができる昆虫種の数を増加することを許すため、２つ以上の害虫が、同じ植物、農作物または栽培地で存在する（または制御されることを有する）場合、それぞれが異なるバキュロウイルスを含む、２つの異なる殺虫剤を適用する必要はない。重要なことは、そのような混合ウイルスＯＢは、同じ昆虫コロニーから得ることができ、異なる昆虫コロニーでバキュロウイルスの多くの種の製造に関連する現在のコスト増大を防止し、それぞれがそれら自体のコストを含む。これは、本発明で記載される殺虫剤の型の製造のコストを減らす。

本願の例３に示すように、いくつかの場合において、２つの異なるバキュロウイルスの同時感染のように、感染される幼虫で得られる死亡率は、特定のバキュロウイルス種単独で得られるより高かった（例えば、ＳｆＭＮＰＶの遺伝子型ＳｆＩＣ−Ｂとの混合物においてＡｃＣ６で同時に重感染で得られる死亡率とＡｃＭＮＰＶの遺伝子型ＡｃＣ６で得られる死亡率を比較する）。したがって、２つのウイルス種は、害虫を殺す確率を増加させるので、または害虫の死亡率の有用率を増加させそして、よって制御措置の効果を増加させることを試みるために、本発明の方法と前記方法により得られる本発明の混合ウイルスＯＶＢを有する組成物はまた、１つの害虫種のみが植物または農作物に出没しているおよび特定のバキュロウイルス種に対して昆虫の感受性について疑いがある特定の場合において有用であることができる。

さらに、宿主昆虫の重感染は、同時にまたは最初の接種と第２のバキュロウイルス種および／またはその後の接種の接種の間の時間の特定の間隔で実施され得る。この手順は、ＯＤＶおよび重感染昆虫において製造されるＯＢにおいて、各種のゲノムの異なる割合をもたらす。さらに、本願の例はまた、各バキュロウイルス種の接種の順番は、最終ＯＢ組成物において各種ゲノムの割合に影響を及ぼすことができることを示す。したがって、本発明の方法が実施される下での条件（接種と異なるバキュロウイルスの接種の順番の間の時間）を単に変化させるので、各バキュロウイルスの異なる割合を有するＯＢ組成物を得ることができる。

本発明の方法で変化することができる別の変数は、昆虫を接種するために使用される各バキュロウイルスの割合である。各バキュロウイルスの接種されるゲノムの数の割合は、１：１または異なることができ、得られる混合ＯＤＶまたは混合ＯＢに存在するゲノムコピーを有さなければならない全てのバキュロウイルスが接種されることを条件とされる。

したがって、所望のように、最初のバキュロウイルスの接種と第２の（または次の）バキュロウイルスの接種の間の時間の間隔、および／または異なるバキュロウイルスの接種の順番（ウイルスが時間的に別々に接種される場合）および／または昆虫に接種するために使用される各バキュロウイルスのゲノムコピーの割合を変化させることにより、本発明の方法はまた各バキュロウイルス遺伝子型の異なる割合を有するＯＢ組成物の製造を許す。したがって、同時接種およびバキュロウイルスの接種と第２の（または次の）バキュロウイルスの接種の間の時間の間隔での別々の接種の両方、並びに、各バキュロウイルス種のためのゲノムコピーの同量（割合１：１）の接種または１：１と異なる割合の接種は、本発明の方法の態様である。

特定の種に属するバキュロウイルスゲノムを含むヌクレオカプシドは、他のバキュロウイルスゲノムを含むヌクレオカプシドに関して時間的に別々に昆虫の幼虫または培養細胞（または２つより多い種が接種され、製造される混合ＯＤＶにおいてそれらのゲノムの少なくとも１つのコピーを有することが期待される場合、他のバキュロウイルスゲノム）を接種するために使用されることができる。本発明の方法の態様は、昆虫の幼虫または培養細胞が他の接種される種の異なる特定の種に属するバキュロウイルスゲノムを有するヌクレオカプシドを含むＢＶまたはＯＤＶを接種される場合に可能である。昆虫が各特定の種に属するヌクレオカプシドの続く接種により２つ以上のバキュロウイルス種を重感染される場合、最初と最後の接種の間の時間の遅れは、最初の感染の徴候の発現に必要な時間より短いべきである。死亡前の感染の通常の徴候は、不活発、減少摂食率、外皮の色の変化およびいくつかのウイルスにおける宿主植物の先端部の置換を含む；そのような徴候の存在は、明らかな疾患の指標として考えることができる。

したがって、そして例３で示されるアッセイの結果に従って、異なるバキュロウイルスは時間的に別々に接種されるとき、時間は第２の（または最後の）接種が異なるバキュロウイルス種のゲノムを有するヌクレオカプシドの接種に関して４８時間より短いことが好ましく、最初のバキュロウイルスの接種後２４時以下であることがさらに好ましく、さらに１６時間以下であることが好ましい。これは、最初の接種（感染）後の時間として、細胞が第２のバキュロウイルスに受容可能でないと思われるからである。したがって、ビリオンおよび／または封入体が１つより多いバキュロウイルス種のヌクレオカプシドを含むことを得られる場合、第２のバキュロウイルスの接種を遅延する最初のバキュロウイルスの感染後１６〜２４時間より大きくないことが特に好ましい。

また、特定の種に属するバキュロウイルスゲノムを有するヌクレオカプシドは、少なくとも１つの閉塞由来ビリオンにおいて最初のものと一緒に閉じ込められる他のバキュロウイルスゲノムを有するヌクレオカプシドと一緒に培養昆虫細胞または昆虫の幼虫に同時に接種して使用される、本発明の方法の態様である。この態様は、ＢＶ、ＯＤＶまたはＯＢ、そしてこの場合、同じ種の遺伝子型のみおよび混合ＯＤＶを含むＯＤＶ（遊離またはＯＢに閉じ込められる）（異なるバキュロウイルス種のゲノムを含むＯＤＶであって、少なくとも１つのゲノムは、他のものと異なる）の両方の形態であるヌクレオカプシドに適合する。全ての閉塞ＯＤＶは、唯一１つの種に属するゲノムを含むＯＢと同様に、混合ＯＢはまた、使用されることができる。

本発明の方法が昆虫細胞培養物を用いて実施される場合、いずれの昆虫細胞株は、そのゲノムが製造されるＯＤＶまたはＯＢが存在しなければならないバキュロウイルスの両方（または２つより多い）の種によって感染に感受性があるときはいつでも使用することができる。それらが感受性のある昆虫細胞株およびウイルスのリストは、Lynn（２００７年）で利用可能である。ツマジロクサヨトウからの細胞株Ｓｆ９とＳｆ２１およびイラクサギンウワバからのＨｉｇｈ５は最も一般的に使用されるが、いずれの他の昆虫細胞株は、混合ＯＤＶと混合ＯＢを得るために使用することができる。バキュロウイルスの特定の種のＯＤＶまたはＢＶおよびバキュロウイルスの異なる種のＯＤＶまたはＢＶ、細胞株に感染しやすいそれらの両方を有する細胞株を感染することは、混合ＯＤＶと混合ＯＢの製造を行うだろう。ほとんどの感染細胞（使用される細胞株とウイルスに依存する感染後５〜７日）の内側の多面体を見ることができる場合、細胞と培地の両方は、採取されなければならない。混合ＯＢは次いで低速遠心分離により回収されるだろう（Kingら、１９９２年）。

昆虫宿主がＯＢを製造するために使用される場合、本発明の方法で使用される昆虫種は、それらのゲノムが製造されるＯＢに存在しなければならないバキュロウイルスの２つ（または２つより多い）の種に感受性のあるいずれかの昆虫であることができる。昆虫は幼虫の段階であるべきであり、それは昆虫がバキュロウイルス感染に通常感受性である段階である。昆虫は通常、さなぎの段階に到る前に数回脱皮する；２つの連続脱皮の各段階（またはサブステージ）は通常、齢として知られ、その種類はまた特定の齢において各幼虫に適用される。昆虫が受ける齢の数は、種や環境条件による。それらの大きなサイズは、ＯＢの大量の製造を可能にするので、最後の可能な齢における幼虫（もし可能なら、少なくとも第４齢）は、ＯＢを製造するために通常好まれる。

本願で使用されるように、用語「接種」は、昆虫に対するウイルス（本発明の方法の「病原体」）の投与を意味する。そのような投与は、直接接種によるものであることができ（ウイルスが遊離ビリオンの形態であり、封入体に閉じ込められない場合が好まれる）または接種により起こることができ、自然に起こるように、幼虫は、葉に存在するバキュロウイルスＯＢを摂取し、そして汚染された葉組織で摂取される：これは、「経口接種」または「口からの接種」である。接種のこの第２の種類のために、ＯＢを含む液体懸濁液（好ましくは水性）は、HughesとWood、１９８６年の液滴供給法によって幼虫に経口で投与され、例えば、本願の例２と３のように、またはＯＢは昆虫の幼虫によって消費される基質を汚染するために使用され、それらが投与されるように、例えば、固体または半固体型で、食事に混合して幼虫に提供される。

次に、本発明の方法はまた以下のステップを含む混合ＯＢの製造方法として定義することができる：
ａ）同時接種または最初の感染の徴候の発現のために必要な時間に劣る時間の遅延による逐次接種により、２つの異なるバキュロウイルス種で昆虫の幼虫に重感染する、そして
ｂ）多角体病による明らかな病気または死まで必要な条件で接種される幼虫を飼育する。

当技術分野で公知の技術によって、死んだ幼虫により製造されるＯＢは、死んだ幼虫から単離精製することができ、水中に死んだ幼虫をつぶし、得られた懸濁液をろ過し、懸濁液からＯＢを分離することを許す若しくは分離させる（沈殿させる）ことを含み、そして沈殿、遠心分離または関連技術（好ましくは、ＯＢの分離を加速し、遠心分離により液体を残す）および上澄みからＯＢのペレットを分離することにより単離する。単離されるＯＢは、水性懸濁液で再懸濁することができ、室温または冷蔵下（０〜６℃）または凍結条件下（−８０℃〜０℃）で保存するこができるＯＢの水性懸濁液を生じさせる。凍結条件は、ＯＢが長期間保存されることが意図される場合に好ましい。また、ＯＢの水性懸濁液は凍結乾燥することができ、室温または冷蔵で保存することができる。

遊離（閉じ込められない）ＯＤＶを取得する場合、それらは、例２のように、例えば、アルカリ性溶液を使用して、アルカリ溶解をそれらに提示することによって製造されるＯＢから放出されることができる。

前述のように、この発明は、最初に、異なるバキュロウイルス種のゲノムを含むビリオンを封入するバキュロウイルス封入体（ＯＢ）を製造する方法を提供する。生物学的殺虫剤として現在市販される１つのウイルス種のみのゲノムを含むＯＢに比べる代替の解決策として、そのようなＯＢは、害虫の生物学的防除のための使用であることができる。したがって、ＯＤＶの少なくともいくつかは異なるバキュロウイルス種のゲノムを含むそのようなＯＢはまた、本発明のもう一つの側面である。また、そのようなＯＢを含む組成物は、本発明のもう一つの側面である。害虫の生物学的防除のためにそのようなＯＢ、およびまたそれらを含む組成物の使用は、本発明の別の側面であり、特に、本発明のＯＢは害虫に対抗するために使用される意図される処方の活性成分である。

本発明の方法を実施する際に、例２で見られるように、混合ＯＢに閉じ込められる全てのＯＤＶは、遺伝子型の混合物を必ずしも有さない：それらのいくつかは、１つの種のゲノムを有するヌクレオカプシドのみを含み、他のＯＤＶは全てのゲノムがバキュロウイルスの第２の種に属するヌクレオカプシド含み、および第３の型は混合ウイルスＯＤＶであり、少なくとも２つの異なる種のゲノムは同じビリオンに存在するだろう。ＯＤＶの混合物などを有するＯＢは、本発明のＯＢの例のように、図７に示されている。同じＯＢ内に存在する全てのＯＤＶは本発明のＯＢであるＯＢのために異なるゲノムを含むことを必要としないが、２つ以上の異なる種のゲノムが閉じ込められる少なくとも１つのＯＤＶを含む全てのＯＢは、本発明の範囲により包含される。また、各閉じ込められるＯＤＶが単一の種のみのゲノムを含むが、少なくとも２つの異なる種のゲノムを含むＯＤＶが共に閉じ込められるＯＢは、本発明のＯＢである。

同様に、本発明の組成物は、共に包まれる２つ以上の異なる種のゲノムを含む少なくとも１つのＯＤＶを封入する少なくとも１つのＯＢを含むものであり、そしてまた、単一種のゲノムを有するヌクレオカプシドを含むＯＤＶは共に閉じ込められるが、各ＯＤＶは異なる種に属する少なくとも１つのＯＢを含む組成物である。全てのＯＢは本発明の範囲に包含される組成物のために異なる種のバキュロウイルスを共に封入することは必要ではない。実際には、例２および３に見られるように、本発明の方法を実施することは、それらの少なくとも画分はウイルス種ゲノムの単一型を含むことができる子孫のＯＢをもたらし、すなわち、ＯＢのいくつかは閉じ込められるバキュロウイルス種の１つのみのゲノムを含むことができ、ＯＢのいくつかはＯＤＶを含むことができ、各ＯＤＶは１つ遺伝子型のゲノムのみを含むが、同じゲノムに閉じ込められる異なるＯＤＶの遺伝子型は異なることができるＯＤＶを含むことができる。さらに、本発明の混合ＯＤＶを含む組成物はまた、本発明の組成物であり、本発明の範囲内に包含される。

本発明の方法により取得される封入体はバキュロウイルスのＯＢの特徴である特徴を有するように、それらは本願の例で使用されるろ過および分画遠心法の技術のような任意の当技術分野で公知の技術により製造された感染された幼虫から抽出および／または精製されることができる。それらは固体または液体製剤として処方することができ（例えば、水性、粉末または顆粒状製剤として）、害虫の蔓延に対抗するために使用されるのに適する、所望の異なる組成物を生じさせる。

本発明の組成物は、単独で成分ウイルスのいずれかと比較してＯＢ接種材料の単独型を使用して感染しそして殺すことができる昆虫種の数の特性を有する。これは、単独でそれらの成分ウイルス種のいずれかのものと異なる宿主範囲を有する異なるウイルス種の混合物を含むＯＤＶとＯＢを使用して達成される。したがって、本発明のＯＢおよび／または本発明の組成物は、害虫に対抗するために使用することができる。特に、それらは混合ウイルスＯＢまたは混合ウイルスＯＤＶを使用して２つ以上の害虫種に対抗するために使用することができる。害虫蔓延からの保護または制御を要求する基質は、植物、農作物、栽培地、または保存製品などであることができ、または別の基質は、害虫のための食料源である。通常、ＯＢまたは本発明および／または本発明の組成物は、害虫に対抗するために使用され、それらは殺虫剤製剤の活性成分（または活性成分のうちの１つ）だろう。

例えば、ＯＢ組成物が水性懸濁液の形態である場合、それらを植物に噴霧することができる。生物学的殺虫剤に使用されるＯＢ組成物はまた、他の方法、空中散布、接地散布、粉末適用、灌漑水中の適用などの他の方法、雲霧、噴霧により、またはウイルス死昆虫または害虫自体の接種により適用されることができる。

本発明のＯＢ組成物において、それらは、所望の適用方法に応じて適切な形で適用される組成物の調製を促すため、他の化合物は、農業上適切な賦形剤および／またはアジュバントのような、特にアジュバントと考えることができるそれらの化合物は、存在することができる。また、組成物は、例えば、肥料または他の殺虫剤またはＯＢの感染性を促進することが知られている化合物を含むことができる。

上述したように、それらを経口的に接種する場合、遊離ＯＤＶはまた感染症を生じさせることができる。したがって、本発明の混合ウイルスＯＤＶを含む組成物はまた、生物学的殺虫剤、ならびに混合ウイルスＯＢと混合ウイルスＯＤＶを含む組成物として使用することができる。害虫と対抗する本発明のＯＢ組成物の死油について与えられる詳細はまた、遊離混合ウイルスＯＤＶを含む組成物および混合ウイルスＯＢおよび遊離混合ウイルスＯＤＶを含む組成物など、本発明の他の組成物を適用可能である：適用の方法、害虫の蔓延からの保護する基質または害虫蔓延に対抗するところ、同じ組成物に存在できる他の化合物。

本願の例で見られるように、それらは、本発明のＯＢを製造するために昆虫に接種して（好ましくは注射により）使用することができるように、異なる種のゲノムを含むビリオンは、本願発明の方法を実施するために有用であることができる。それらはまた重感染アッセイのための使用であることができ、またはそれらは、適用の所望の条件による混合ＯＢ組成物を達成する各ウイルス種の割合を決定する有用な情報を提供することができるアッセイおよび各バキュロウイルスの投与の順番またはＯＢの取得される組成物において各バキュロウイルスの所望の割合で混合ＯＢを得るために適切である２つのバキュロウイルスの投与の間の遅延の結果であることができる。したがって、２つ以上のバキュロウイルス種のゲノムを含む閉塞由来ビリオン（ＯＤＶ）はまた、本発明の側面である。

本発明を今、以下の例と図を用いてより詳細に説明する。

−ＰＣＲ
ＰＣＲアッセイを下記の表１に示されるプライマーを使用して実施した。

−ＤＮＡ抽出、消化および分析
ビリオンは最終容量５００μｌで１００μｌの０．５ＭのＮａ_２ＣＯ_３、５０μｌの１０% (ｗ/ｖ)ドデシル硫酸ナトリウムを用いて１０^９のＯＢｓ/ｍｌを含む１００μｌのＯＢ懸濁液を混合および１０分間、６０℃でインキュベートすることによりＯＢから放出された。未溶解のＯＢと他の破片を低速遠心分離（3,800 x g、５分）により取り除いた。ビリオンを含む上清を１時間、５０℃で２５μlのプロテイナーゼＫ(２０ｍｇ/ｍｌ)で処理した。ウイルスＤＮＡを２回飽和フェノールと１回クロロホルムで抽出し、アルコール沈殿により水相から分離した。ペレットを１０分間、６０℃で５０〜１００μｌの0.1xＴＥ緩衝液（トリスＥＤＴＡ、pH8）中に懸濁させた。ＤＮＡ濃度を２６０nmで光吸収を読み取ることにより評価した。

制限エンドヌクレアーゼ分析のために、２μgのウイルスＤＮＡを10Uの酵素PstI(たから)と混合し、１２時間、３７℃でインキュベートした。反応は４μlのローディングバッファー（０．２５% ｗ/ｖのブロモフェノールブルー、４０% ｗ/ｖのスクロース）の追加により停止した。電気泳動を１０〜２４時間、２０ＶでＴＡＥ緩衝液（0.04 Mのトリス−酢酸、０．００１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）において、水平の１％のアガロースゲルを用いて実施した。ＤＮＡ断片を臭化エチジウムで染色し、ＵＶトランスイルミネーター（Ｃｈｅｍｉ−Ｄｏｃ、バイオラッド、カリフォルニア州、ＵＳＡ）で可視化した。

−例１：シロイチモジヨトウＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）とツマジロクサヨトウＭＮＰＶ（ＳｆＮＭＰＶ）のpif遺伝子間の適合性
この例では、バキュロウイルスの２種は同じ細胞で複製することができ、ＯＤＶ中に位置する２つのタンパク質(ＰＩＦ１およびＰＩＦ２)を共有することができ、バキュロウイルスの経口伝達に不可欠であるという証拠を示す。

Ａ）本例のアッセイで使用される２つのウイルスは以下の通りである：
−シロイチモジヨトウＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）、ＳｅＵＳ２−Ａ変異体
ＳｅＭＮＰＶのＳｅＵＳ２−Ａ変異体は、核多角体病ウイルスＳｅＭＮＰＶの少なくとも４つの遺伝子型変異体（Munozら、１９９９年）のヘテロ遺伝子混合物を含む殺虫剤Spod-X（登録商標）（Certis USA, LLC）生物殺虫剤に基づくフロリダからのＳｅＵＳ−２分離株から生じ、それは感染し、シロイチモンジョトウ、シロイチモジウヨトウの幼虫を殺す。ＳｅＵＳ２−Ａは、処理される幼虫の約１０％を殺したＯＢの低用量（ＬＤ_１０）を摂取したシロイチモジヨトウの幼虫においてインビボクローニングにより得られた。ＳｅＵＳ２−Ａは、ＳｅＵＳ２分離株に存在する最も豊富な変異体であり、シロイチモジヨトウに唯一感染性である。この変異体はまたＳｅ３０１細胞株においてインビトロで複製すことができる。

−ツマジロクサヨトウＭＮＰＶ（ＳｆＭＮＰＶ）、ＳｆＮＩＣ−Ｃ変異体
ＳｆＮＩＣ−Ｃ変異体は、少なくとも９つの遺伝子型変異体（Simonら、２００４年ｂ）のヘテロ遺伝子混合物を含むＳｆＭＮＰＶニカラグア分離株から生じ、それは遺伝的および表現型的特徴を有している（Simonら、２００５年a,b;２０１１年;２０１２年）。ＳｆＮＩＣ−ＣをＳｆ９細胞においてインビトロクローニングによって単離した（Simonら、２００４年b）。感受性宿主昆虫への摂取材料の注射後に生産的感染を製造することができるが、この変異体は、ｐｉｆ１およびｐｉｆ２遺伝子を取り除く〜１６ｋｂのゲノム欠失を有し、この変異体は摂取により感染性でないことを意味する。この変異体はまた細胞株Ｓｆ２１およびＳｆ９において複製することができる。

ＳｅＭＮＰＶとＳｆＭＮＰＶの両方は、アルファバキュロウイルスの系統発生学的に関連するグループに属するが（グループＩＩ：Herniouら、２００４年)、それらが感染することができる宿主種で異なる。ＳｆＭＮＰＶは通常ツマジロクサヨトウの幼虫に感染するがシロイチモジヨトウの幼虫に感染することができないのに対して、ＳｅＭＮＰＶは、シロイチモジヨトウの幼虫に特異的である。ＳｆＭＮＰＶによるシロイチモジヨトウの致死的感染は、いくつかのＯＢの製造をもたらし、昆虫外皮は死後、崩壊しない（Simonら、２００４年a）。

Ｂ）ゲノムＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析によるＳｅＵＳ２−ＡおよびＳｆＮＩＣ−Ｃの分化
ＳｅＵＳ２−ＡおよびＳｆＮＩＣ−Ｃは、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ（たから）でゲノムＤＮＡの処理により分化されることができ、アガロースゲル中の電気泳動に続いた。各ゲノムＤＮＡから取得されるこの制限プロファイルは、明確に区別され、サンプル中において前記ゲノムの１つ（または両方）の存在の識別を許す（図２参照）。

Ｃ）ＳｅＵＳ２−Ａおよび欠失遺伝子型ＳｆＮＩＣ−Ｃを使用するｐｉｆ１/ｐｉｆ２相補性アッセイ
シロイチモジヨトウの第４齢は、ＳｅＵＳ２−ＡとＳｆＮＩＣ−ＣのＯＤＶの混合物（各ウイルスのＯＢの等しい数を混合することにより得られる）の血体腔内注射により接種された。死亡および得られたＯＢが前述の方法（Caballeroら、１９９２年）により回収されるまで、注射された幼虫は、Greeneら（１９７６年）により記載されるように、小麦胚芽、酵母および大豆に基づく半合成飼料でそれぞれ飼育された。簡単に言えば、滅菌水中で死体の均質化およびろ過と分画遠心法による得られた懸濁液の精製後、それらを死んだ幼虫から抽出した。

これらのＯＢから抽出されるＤＮＡの分析は、ＳｅＵＳ２−Ａ変異体の存在と一致したが、ＳｆＮＩＣ−Ｃの証拠は制限プロファイルで観察されなかった（図３、同じアッセイの第１および第２の複製に対応するレーン３および５）。しかしながら、変異体特異的プライマー（図１：Sfie0.1およびSfie0.2、すなわち、配列番号３および配列番号４）を使用するＰＣＲ増幅は、ＳｆＮＩＣ−ＣゲノムＤＮＡの少量が接種されるシロイチモジヨトウの幼虫において製造されるＯＢから抽出されるＤＮＡに存在したことを明らかにした。（図４、レーン３および５）。

これらのＯＢを１０^７および１０^９のＯＢｓ/ｍＬの濃度でツマジロクサヨトウの第２齢に供給した。接種される幼虫を飼料で個別に飼育した場合、３０％と５０％の多角体病による死亡率がそれぞれ観察された。ウイルス死ツマジロクサヨトウの幼虫から回収されたＯＢからのＤＮＡのＰＣＲとＰｓｔＩ分析は、単独でＳｆＮＩＣ−Ｃ遺伝子型の存在と一致した：ＳｅＵＳ２−ＡのＤＮＡの存在を示す証拠は観察されなかった。この結果は、遺伝子型特異的プライマー（Seie0.1およびSeie0.2、それぞれ、配列番号１および配列場号２）を用いて高感度の定量的（リアルタイム）ＰＣＲ技術を使用して確認された：ＳｅＵＳ２−Ａのゲノム断片の増幅は検出されなかった（図４、レーン１０および１２参照）。

これらの結果は、ＳｅＵＳ２−Ａがツマジロクサヨトウの幼虫において複製することができなかったことを証明し、それは、実験的な混合ウイルス集団からＳｅＵＳ２−Ａ変異体の排除をもたらした。これらの結果はまた、ＳｆＮＩＣ−Ｃ遺伝子型は、経口接種ツマジロクサヨトウの幼虫の中腸細胞において一次感染を開始するＳｅＵＳ２−Ａにより製造されるＰＩＦ１およびＰＩＦ２タンパク質の利点をとることができたことを証明し、それは、これらのタンパク質の非存在下で不可能であったであろう。したがって、ＳｆＮＩＣ−Ｃを含むＯＤＶがＰＩＦ１およびＰＩＦ２タンパク質を取得していることができた唯一の方法は、ＳｆＮＩＣ−ＣおよびＳｅＵＳ２−Ａの両方が同じシロイチモジヨトウ細胞中で同時に複製されたかどうかであっただろう。（単独でＳｆＮＩＣ−Ｃ遺伝型を含む）ツマジロクサヨトウの幼虫で製造されたＯＢの第２の発生は、ツマジロクサヨトウの幼虫で経口で感染性を有しなかったので、これらのウイルスのそれぞれのゲノム間のｐｉｆ−１/ｐｉｆ−２領域の組換えを含む対立仮説は否定され、ＰＩＦ１およびＰＩＦ２タンパク質は、重感染シロイチオジヨトウの幼虫で製造されたＯＢの接種後、ＳｆＮＩＣ−Ｃ遺伝子型により製造されなかったことを示す。

したがって、この方法において、本発明者らは、バキュロウイルスの２つの密接に関連する種によりシロイチモジヨトウの重感染を証明した：ＳｅＭＮＰＶおよびＳｆＭＮＰＶ。
これらの結果から、それは以下に結論付けることができる：
（ａ）シロイチモジヨトウの細胞は、２つのウイルスにより同時に感染することができ、それらの両方は複製できる。
（ｂ）ＰＩＦ１およびＰＩＦ２タンパク質は、ツマジロクサヨトウの幼虫において（これらのｐｉｆ遺伝子を欠く）ＳｆＮＩＣ−Ｃの経口感染性を救うことができる。

Ｄ）シロイチモジヨトウの幼虫において連続継代後に混合ウイルスＯＢに閉じ込められるＳｅＵＳ２−ＡおよびＳｆＮＩＣ−Ｃの持続性
ＳｅＵＳ２−ＡおよびＳｆＮＩＣ−Ｃの混合物を注射した幼虫において製造される混合ウイルスＯＢは（セクションＣ参照）、シロイチモジヨトウの幼虫の経口で６連続継代（Ｐ_１〜Ｐ_６）を含む実験において接種材料（継代０、Ｐ_０：ＳｅＵＳ２−ＡのＯＢとＳｆＮＩＣ−ＣのＯＢの１：１の比率から放出されるＯＤＶを使用するシロイチモジヨトウの重感染に得られる）として使用された。

各継代（Ｐ_１〜Ｐ_６）で収集されるＯＢでこれらのウイルスのそれぞれの相対的存在度の変化を決定するために、ＤＮＡをＯＢの試料から抽出し、ABI PRISM 7900HTサーモサイクラーにおいてＳＹＢＲグリーン（たから）を用いてｑＰＣＲにかけた。ＤＮＡを各継代でサンプリングされたＯＢから抽出し、ｑＰＣＲ定量に付した：結果は、ＳｅＵＳ２−ＡｎのゲノムＤＮＡの１００ナノグラムごとにＳｆＮＩＣ−ＣのゲノムＤＮＡのナノグラムとして示す。

ＳｅＵＳ２−Ａの増幅のために、ＤＮＡ特異的プライマーは使用され（qSe5.FおよびqSe5.R、それぞれ、配列番号５および配列番号６）、ＳｅＭＮＰＶに固有のse5遺伝子を標的とした。ＳｆＮＩＣ−ＣのＤＮＡの増幅は、このウイルスにおいて、１６ｋｂ欠失の５０ヌクレオチド（nt）の上流と下流を増幅した特異的プライマー（qSfCcath.2Fおよび qSfCsf36.2R、それぞれ、配列番号７と配列番号８）を使用して達成された。検量線は、プライマーの前述のペアを使用して、ＳｅＵＳ２−ＡまたはＳｆＮＩＣ−ＣのＤＮＡのクローニングされた断片を含むプラスミドＤＮＡの増幅により作成した。プラスミドＤＮＡは分光光度法により定量され、１０倍連続希釈に付し、領域10^-1 ng、10^-9ＤＮＡで検量線を作成した。プライマーハイブリダイゼーション温度は６０℃であり、伸長時間は３０秒であった。

単一ウイルスＯＢから抽出されるＤＮＡは、対応するウイルスを標的としたプライマーを含むｑＰＣＲ反応で陽性の増幅を生じた。Ｐ_０のＯＢから抽出されたＤＮＡ試料は、ＳｅＵＳ２−ＡのＤＮＡの９５．１３±１．２５％（平均±標準誤差［ＳＥ］）およびＳｆＮＩＣ−ＣのＤＮＡの４．８７±１．２５％を含むと推定された。Ｐ_１、Ｐ_２、Ｐ_３、Ｐ_４、Ｐ_５およびＰ_６でＯＢ試料から抽出されたＳｆＮＩＣ−ＣのＤＮＡの割合は、それぞれ１．１７±０．４５％、０．２３±０．０４％、０．１０±０．０６、０．０９±０．０４％、０．０３±０．０１％および０．０１±０．００４％の値で漸進的に減少した（図５）。

−例２：２つのバキュロウイルス種のゲノムの共閉塞および共包装
これらの実験で使用された２つのウイルスは以下の通りであった：
−オートグラファカリフォルニカ多発性核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）
ＡｃＭＮＰＶは、アルファバキュロウイルス族のタイプ種である。それは、ＢＶ膜において糖タンパク質（ＧＰ６４）の存在により特徴付けられる、グループＩのＮＰＶに属するマルチカプシドウイルスである。本研究では、クローン化された遺伝子型ＡｃＣ６が使用され、それは完全に配列決定された最初のバキュロウイルスゲノムであった（GenBank信託番号L22858：Ayresら、１９９４年）。このウイルスは、Ｓｆ２１およびＳｆ９においてよく複製し、ツマジロクサヨトウの幼虫に生産的致死感染を生じさせることができる。

−ツマジロクサヨトウ多発性核多角体病ウイルス（ＳｆＭＮＰＶ）
これは、ＢＶでＦタンパク質の存在により特徴付けられるグループＩＩのＮＰＶであり（Herniouら、２００４年）、したがって、ＡｃＭＮＰＶからの系統発生学的に離れている。本研究で、ＳｆＩＣ−Ｂと命名されたインビトロクローンが使用され、ニカラグア（ＳｆＮＩＣ）からの野生型分離株の存在する最も豊富な遺伝子型であった（Simonら、２００４年ｂ）。ＳｆＮＩＣ−Ｂは、完全なゲノムであり（GenBank信託番号HM595733.1、Simonら、２０１２年）、ツマジロクサヨトウの幼虫に経口で感染性がある。

Ａ）ＳｆＮＩＣ−ＢおよびＡｃＭＮＰＶのゲノムを含む混合ウイルスＯＤＶとＯＢの製造
混合ウイルスＯＤＶとＯＢを製造するために、ツマジロクサヨトウ第４齢は、液滴供給方法を使用して、各ウイルスの５×１０^７ＯＢ/ｍｌの濃度で１：１の割合でＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢとＡｃＭＮＰＶのＯＢの混合物を接種した（Hughes & Wood、１９８６年）。ツマジロクサヨトウ幼虫は両方のウイルスに感受性がある。２４の幼虫のグループを接種し、実験を３回行った。接種された幼虫を死亡まで制御された温度（２５℃）で例１でまた用いた半合成実験用飼料で飼育した。ＯＢは感染した死体から採取され、前述のろ過および遠心分離により精製された（Munozら、１９９８年）。

これらのＯＢにおいて両方のウイルスの存在を確認するために、ゲノムＤＮＡを抽出し、SfDNApol.3（配列番号１５）およびSfDNApol.4（配列番号１６）のプライマーを用いてＰＣＲ増幅に付し、ＳｆＮＩＣ−ＢのＤＮＡ、またはAcDNApol.1（配列番号１３）およびAcDNApol.2（配列番号１４）のプライマーを増幅し、ＡｃＭＮＰＶのＤＮＡを増幅した。

ＳｆＮＩＣ−ＢのＤＮＡの増幅は９６４ｂｐの生成物を生じた一方、ＡｃＭＮＰＶのＤＮＡの増幅は７０４ｂｐの生成物を生じた（図６）。ＯＢから抽出されたＤＮＡ試料において両方のウイルスのゲノムＤＮＡの存在の検出は、両方のウイルスが接種された昆虫で複製したことを証明する。

ＯＤＶにおける両方のウイルスの共包装とＯＢにおける共閉塞を証明するため、ＯＤＶは２８℃で３０分間０．１Ｍの炭酸ナトリウム溶液の等量を用いて、アルカリ溶解によってＯＢ懸濁液（１０^８ＯＢ/ｍｌ）の処理によって放出された。ＯＤＶは、前述のように、Ｓｆ９細胞を（Invitrogen、カタログ暗号ＢB825-01）使用してプラークアッセイに付された（Kingら、１９９２年）。このため、連続希釈（１０^−１〜１０^−６）が実施され、各懸濁液の２００μlの体積を細胞培養皿のウェルにおいて１０^６個のＳｆ９細胞上に置いた。接種された細胞を１時間オービタルシェーカー上でインキュベートした。その後、培地を除去し、１０％の牛胎児血清を有するＴＣ１００において２mlの１％のアガロースを各ウェルに入れた。次に細胞培養プレートを５〜６日間２８℃でインキュベートした。明らかに孤立したプラークを採取し、プロテイナーゼＫで処理し、ＳｆＮＩＣ−Ｂ特異的プライマー（SfDNApol.3およびSfDNApol.4）またはＡｃＭＮＰＶ特異的プライマー（AcDNApol.1およびAcDNApol.2）を用いて、ＰＣＲにより分析した。

プラークの約４８．１±８．９％は単独でＳｆＮＩＣ−Ｂを含み、プラークの残りの約４８．１±６．５％は両方のウイルスの混合物を含むのに対し、全体的に、以下の３つの繰り返しに続いて、クローンの３．８２±２．７３％（平均±標準偏差）は単独でＡｃＭＮＰＶを含んだ。結果はアッセイの各繰り返しで得られ、その平均（±標準偏差）を以下の表２に示す。

実施された繰り返しのそれぞれにおいて、ｎはＡｃＭＮＰＶ、ＳｆＭＮＰＶまたは両方のウイルスのいずれかの分析された細胞培養プラークの数である。Ｓ．Ｄ．は標準偏差を示す。

得られた混合ウイルスＯＤＶを封入する混合ウイルスＯＢの図表例を図７にみることができる。これは両方のウイルスが同じＯＤＶに存在したかどうかのみ可能であり、それは両ウイルスが同じ細胞で複製されたこと、同じＯＤＶで共に包まれたことおよび同じＯＢで共に閉じ込められたことを証明する。

これらの結果は、Ｓｆ９細胞で終点希釈アッセイにより統計的に確認された（Kingら、１９９２年）。単一ＯＤＶによる感染は、ＯＤＶの低濃度でＳｆ９細胞の感染後に達成された。したがって、ウェルがＯＤＶの感染用量を接種されなかった確率は、ポアソン分布に従って計算することができる。このため、ＯＤＶは、両ウイルスの接種後に死亡したツマジロクサヨトウの幼虫から得られた１０^９ＯＢ/ｍｌの懸濁液から放出された。これらのＯＤＶの終点希釈アッセイの結果を表３に示す。

表３ 終点希釈アッセイの結果

陽性ウェルは、バキュロウイルス感染（ＯＢ）の病理学的徴候を有する少なくとも１つの細胞に含まれたものである。Ｐ（０）は、感染の徴候なしにウェルを有する各繰り返しで計算された確率である。Ｐ（１）、Ｐ（２）およびＰ（３）は、ポアゾン分布により推定され、それぞれ１つ、２つまたは３つのＯＤＶにより感染するために特定のウェル中で細胞のための確立を指す。

希釈は、非感染ウェルの約９０％でもたらされたことが選択され、単一ＯＤＶ中の状況を反映することは、感染ウェルの約１０％で感染を開始する責任があり、２つ以上のＯＤＶはウェルの１％未満で感染の責任があるだろう。

選択された希釈（非感染ウェルの９０％）で感染された全てのウェルは上記のようにＰＣＲによって分析された。全ての場合で、両ウイルスの存在が確認され（図８）、確率理論の状況では、両ウイルスはこれらの感染を開始した単一ＯＤＶに存在したことが必要である。

−例３：第１および第２のウイルスの接種間隔は、感染される昆虫で異なるウイルス種の共包装および共閉塞の有病率に影響する。
Ａ）これらの実験で使用された２つのウイルスは以下の通りであった：
−オートグラファカリフォルニカ多発性核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）：クローン化遺伝子型ＡｃＣ６
−ツマジロクサヨトウ多発性核多角体病ウイルス（ＳｆＭＮＶＰ）：クローン化遺伝子型ＳｆＮＩＣ−Ｂ

Ｂ）二重感染ツマジロクサヨトウにおける感受性の時間的な窓：幼虫の死亡率に及ぼす影響
昆虫の死亡率上の２つの異なるウイルス種による感染の間隔の影響を決定するために、最近、脱皮ツマジロクサヨトウ第４齢は、液滴供給方法を使用して最初のウイルスの５ ｘ １０^７ＯＢ/ｍｌの懸濁液を経口的に接種された（Hughes & Wood、１９８６年）。接種された昆虫は、最初の接種後１２、２４、４８または７２時間で２５℃で半合成実験食で別個に飼育し、これらの幼虫は第２のウイルスのＯＢの同じ濃度で供給するようにされた。全ての場合において、２４の幼虫のグループは、各処理で使用され、実験は３回実施され、第１のウイルス接種材料としてＡｃＣ６のＯＢ、第２の接種材料としてＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢ、逆もまた同様に使用した。１回または２回接種さていた幼虫は、個別にふ化または死亡まで半合成実験食で飼育された。

多角体病による死亡率の有病率は実験的処理の間で有意に異なり（分散分析：F_10,672=230; p<0.001）死亡率の割合で有意に異なる３つのグループのうちの１つに分類された治療を許した
（図９）：
−（ｉ）単独でＡｃＣ６のＯＢで処理された幼虫：この処理は、ウイルス死亡率の最も低い有病率をもたらした。
−（ｉｉ）単独でＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢ、混合物中で両ウイルスのＯＢの同時投与、またはＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢの後に続いてＡｃＭＮＰＶのＯＢで処理された幼虫：これらの処理の全ては、死亡率の同様に高い有病率を得た。
−（ｉｉｉ）ＡｃＣ６のＯＢで最初に処理され、その後ＳｆＭＮＰＶのＯＢで処理された幼虫：死亡率の有病率は、わずかだが単独でＡｃＣ６のＯＢで処理された幼虫で観察されたよりも有意に高かった。

これらの結果は、同時に両方のウイルスの同時感染を比較することを証明し、１２〜７２時間の遅延は、ＡｃＣ６のＯＢで事前に処理さていた幼虫でＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢの致死的効果の顕しい減少をもたらした。感染間の遅延は、混合ＯＢの製造において得られる死亡率を最適化するための重要な因子である。

Ｃ）ＯＢの組成物は異なる間隔で、ウイルスの異なる種により接種された幼虫で製造された。
前記のように、ＤＮＡ抽出物により決定されることに続きウイルス特異的プライマーを用いる各ウイルスＤＮＡのｑＰＣＲ定量のように（表１参照）、第１と第２の接種処理の間の時間的間隔は、子孫のＯＢで各ウイルスの割合に影響を与えた。これらの結果の統計的分析は、５つの区別できるグループの存在を同定した（分散分析：F_10,75 =187.57; p<0.001）：
−（ｉ）ＡｃＣ６単独
−（ｉｉ）ＳｆＮＩＣ−Ｂ単独
−（ｉｉｉ）同時に両方のウイルスで処理された幼虫とおよびＳｆＮＩＣのＯＢで初期処理を含む全ての処理
−（ｉｖ）ＡｃＣ６のＯＢで最初におよび４８または７２時間後にＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢで処理された幼虫
−（ｖ）ＡｃＣ６のＯＢで最初におよび４８または７２時間後にＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢで処理された幼虫。

幼虫は最初にＡｃＣ６のＯＢで感染させ、２４または４８時間後ＳｆＮＩＣ−ＢのＯＢで、各ウイルスの約１：１の比率を含む子孫のＯＢを製造した。幼虫が２つの異なるウイルス種を接種された場合、両方のウイルスはウイルス死昆虫から回収された子孫ＯＢに常に存在した。

Ｄ）ＯＤＶで異なるウイルスの共包装およびＯＢで共閉塞の効果
ＯＤＶのウイルス組成物は、例２で記載されるように、プラークアッセイにより分析された。第１と第２の接種の間の時間が増加すると、単一種のゲノム（ビリオン）または両方の種の割合は、接種の間隔および第１または第２のウイルスの同一性に従って一緒に変化した（図１１）。例えば、ＡｃＣ６のＯＢの接種に続き２４時間後のＳｆＮＩＣ−Ｂの接種は、混合ウイルスビリオン内に両方のウイルスを含むＯＤＶの約５０％で、約５０％のＡｃＣ６ゲノムと５０％のＳｆＮＩＣ−Ｃゲノムを含む子孫のＯＢをもたらした。

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Claims (28)

1. ａ．昆虫の幼虫または昆虫細胞を、少なくとも１つは多発性核多角体病ウイルスである、２つ以上の異なるバキュロウイルス種で重感染し、
   ｂ．前記感染した昆虫の幼虫または昆虫細胞からウイルス封入体（ＯＢ）を単離し、または場合によっては更に前記ウイルス封入体（ＯＢ）からビリオンを遊離し、
   ｃ．同じビリオンに、異なるバキュロウイルスゲノムが存在することを確認することを含む、
   同じビリオンに少なくとも２つ以上の異なるバキュロウイルス種からのゲノムを含む混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）、または少なくとも１つの前記混合ウイルス封入体由来ビリオンが閉じ込められている混合ウイルス封入体（ＯＢ）を製造する方法。
2. ａ.同じ封入体由来ビリオンに共に包まれる２以上の異なるバキュロウイルスゲノムで昆虫種の幼虫または昆虫種の培養細胞を重感染し；
   ｂ．多角体病による明らかな病気または死亡まで、前記感染した幼虫を飼育、または前記感染した細胞を培養し；
   ｃ．前記幼虫または前記培養された細胞から、ウイルス封入体（ＯＢ）を単離し、
   ｄ．同じビリオンに、異なるゲノムが存在することを確認することを含む、
   同じビリオンに少なくとも２つ以上の異なるバキュロウイルス種からのゲノムを含む混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）、または少なくとも１つの前記混合ウイルス封入体由来ビリオンが閉じ込められている混合ウイルス封入体（ＯＢ）を製造する方法。
3. 前記バキュロウイルス種の全てが、多発性核多角体病ウイルスである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記同じビリオンに含まれる前記異なるゲノムの少なくとも２つが、それぞれ感染性バキュロウイルス粒子を生じることができ、細胞内で完全なウイルスサイクルを形成することができるゲノムである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記バキュロウイルスゲノムが、封入体に閉じ込められている封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）を形成しながら包まれ、前記封入体の少なくとも１つは、１つより多い種のゲノムが共に包まれる少なくとも１つの混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記重感染は、前記バキュロウイルス種、前記ウイルス種のゲノムまたは前記ゲノムを有するヌクレオカプシドを、昆虫細胞または昆虫の幼虫に、
   a. 他の前記バキュロウイルス種、前記ウイルス種のゲノムまたは前記ゲノムを有するヌクレオカプシドと同時に、或いは
   b. 他の前記バキュロウイルス種、前記ウイルス種のゲノムまたは前記ゲノムを有するヌクレオカプシドに対して別々の時間で
   接種することで実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記バキュロウイルス種、前記ウイルス種のゲノムまたは前記ゲノムを有するヌクレオカプシドが、他の前記バキュロウイルス種、前記ウイルス種のゲノムまたは前記ゲノムを有するヌクレオカプシドの摂取に対して４８時間より短い時間間隔内で前記昆虫細胞または昆虫の幼虫に接種される、請求項６に記載の方法。
8. i)前記バキュロウイルス種のヌクレオカプシドが、発芽ビリオン（ＢＶ）または遊離ＯＤＶの形態で、注射により昆虫の幼虫に接種され、或いは
   ii)前記ヌクレオカプシドが、発芽ビリオン（ＢＶ）、遊離ＯＤＶまたはウイルス封入体（ＯＢ）の形態で、経口で昆虫の幼虫に接種され、それらは、封入体に閉じ込められているＯＤＶを形成しながら包まれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ａ．２つ以上の異なるバキュロウイルス種で昆虫の幼虫を、同時接種、または最初の感染の徴候の発現に必要な時間より短い時間の遅延での順次接種により、重感染し、
   ｂ．多角体病による明らかな病気または死亡まで必要な条件で、前記接種された幼虫を飼育し、
   ｃ．前記幼虫から、ウイルス封入体（ＯＢ）を単離し、
   ｄ．同じビリオンに、異なるゲノムが存在することを確認することを含む、
   請求項１〜８のいずれか一項に記載の混合ウイルスウイルス封入体（ＯＢ）の製造方法。
10. シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）多発性核多角体病ウイルス（ＳｅＭＮＰＶ）のバキュロウイルス変異体ＳｅＵＳ２−Ａおよびツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）多発性核多角体病ウイルス（ＳｆＭＮＰＶ）の変異体ＳｆＮＩＣ−Ｃの混合ウイルス封入体（ＯＢ）の製造方法であって、
    ａ．前記変異体の両方で、シロイチモジヨトウの幼虫を重感染し、
    ｂ．多角体病による明らかな病気または死亡まで、前記シロイチモジヨトウの幼虫を飼育し、
    ｃ．前記幼虫から、ウイルス封入体（ＯＢ）を単離し、
    ｄ．同じビリオンに、異なるゲノムが存在することを確認することを含む、方法。
11. オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多発性核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の変異体ＡｃＣ６およびツマジロクサヨトウ多発性核多角体ウイルス（ＳｆＭＮＰＶ）の変異体ＳｆＮＩＣ−Ｂの混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）または混合ウイルス封入体（ＯＢ）の製造方法であって、
    ａ．ツマジロクサヨトウの幼虫を前記変異体の両方で重感染し、
    ｂ．前記幼虫を、多角体病による明らかな病気または死亡まで飼育し、
    ｃ．前記幼虫から、ウイルス封入体（ＯＢ）を単離し、
    ｄ．同じビリオンに、異なるゲノムが存在することを確認することを含む、方法。
12. 前記製造される混合ウイルス封入体（ＯＢ）は、水中で前記病気または死んだ幼虫をつぶし、得られた懸濁液をろ過し、ウイルス封入体（ＯＢ）を懸濁液から分離することを可能とし若しくは分離を引き起こし、沈殿、遠心分離または関連する技術により沈殿することを可能とし若しくは沈殿を引き起こし、上澄みからＯＢのペレットを分離することにより単離される、請求項１〜１１のいずれか一項に係る方法。
13. 遊離の前記封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）は、前記単離したウイルス封入体（ＯＢ）にアルカリ溶解を施すことにより得られる、請求項１〜１２のいずれか一項に係る方法。
14. 同じビリオンに共に包まれた少なくとも２つの異なるバキュロウイルス種からのゲノムを含む、遊離の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）。
15. 前記ゲノムの少なくとも１つは、多発性核多角体病ウイルスのゲノムである、請求項１４に記載の遊離の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）。
16. 少なくとも、ＡｃＭＮＰＶの変異体ＡｃＣ６のゲノムコピーとＳｆＭＮＰＶの変異体ＳｆＮＩＣ−Ｂのゲノムコピーとを含む、請求項１５に記載の遊離の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）。
17. 少なくともＳｅＭＮＰＶの変異体ＳｅＵＳ２−ＡのゲノムコピーとＳｆＭＮＰＶの変異体ＳｆＮＩＣ−Ｃのゲノムコピーとを含む、請求項１５に記載の遊離の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）。
18. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって得られた単離した混合ウイルス封入体（ＯＢ）にアルカリ溶解を施すことを含む、同じビリオンに少なくとも２つの異なるバキュロウイルス種からのゲノムを含む、遊離の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）の製造方法。
19. 前記遊離の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）は、少なくともＡｃＭＮＰＶの変異体ＡｃＣ６のゲノムコピーとＳｆＭＮＰＶの変異体ＳｆＮＩＣ−Ｂのゲノムコピーとを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記遊離の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）は、少なくともＳｅＭＮＰＶの変異体ＳｅＵＳ２−ＡのゲノムコピーとＳｆＭＮＰＶの変異体ＳｆＮＩＣ−Ｃのゲノムコピーとを含む、請求項１８に記載の方法。
21. 同じビリオンに共に包まれた少なくとも２つの異なるバキュロウイルス種からのゲノムを含む、混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）が少なくとも１つ閉じ込められている、単離された混合ウイルス封入体（ＯＢ）。
22. 前記混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）は、少なくとも、ＡｃＭＮＰＶの変異体ＡｃＣ６のゲノムコピーとＳｆＭＮＰＶの変異体ＳｆＮＩＣ−Ｂのゲノムコピーとを含む、請求項２１に記載の単離された混合ウイルス封入体（ＯＢ）。
23. 前記混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）は、少なくとも、ＳｅＭＮＰＶの変異体ＳｅＵＳ２−ＡのゲノムコピーとＳｆＭＮＰＶの変異体ＳｆＮＩＣ−Ｃのゲノムコピーとを含む、請求項２１に記載の単離された混合ウイルス封入体（ＯＢ）。
24. 請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の混合ウイルス封入体（ＯＢ）、及び／又は
    請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）を含む、害虫の制御のための組成物。
25. それぞれが単一ウイルス種のゲノムを含む複数のウイルス封入体（ＯＢ）を更に含む、請求項２４に係る組成物。
26. ２つ以上の害虫種の駆除に用いる、請求項２４または２５に記載の組成物。
27. 害虫の制御のための、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の混合ウイルス封入体（ＯＢ）、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の混合ウイルス封入体由来ビリオン（ＯＤＶ）および／または請求項２４又は２５に記載の組成物の使用。
28. ２つ以上の害虫種の駆除に用いる、請求項２７に記載の使用。