CN1147275A - 生物学昆虫控制剂 - Google Patents

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Abstract

一种用作昆虫控制剂的重组杆状病毒，它具有包含多角体蛋白基因和异源基因的基因组，该异源基因表达杀虫蛋白，其中多角体蛋白基因和异源基因不在同一启动子的控制下，且位于该基因组中使其与活的野生型杆状病毒重组产生的病毒后代不能保持表达多角体蛋白基因和异源基因。

Description

生物学昆虫控制剂
本发明涉及用作昆虫生物学控制剂的杆状病毒，更具体地说涉及包含能表达杀虫蛋白的异源基因的杆状病毒，使用该杆状病毒减少某些病毒后代的生产，以及控制虫害的方法。
关于昆虫生物控制剂，我们指当它与昆虫接触时，该试剂能感染昆虫并干扰其正常的生化和生理过程，最终导致昆虫伤残或死亡。
杆状病毒构成最大和种类最多的一组昆虫病原性病毒，并通常用作有效的异源蛋白表达系统。现在对杆状病毒作为昆虫生物控制剂产生了极大的兴趣。特别是将杆状病毒的病原性与毒素、激素或对昆虫有活性的酶的杀虫作用相结合改进病毒杀死其宿主昆虫花费的时间来进行研究。
关于使用能表达异源性杀虫基因产品以产生增强的和商用活体水平的杀虫活性的观点是重组杆状病毒可能与野生型病毒竞争，因此在该环境内形成，甚至可能对野生型病毒群体占优势。对于野生型杆状病毒，我们指非重组杆状病毒。因此重点放在形成不必在环境中持久传递杀虫效力的重组杆状病毒。
为了减少用作杀虫剂的重组杆状病毒的存活能力，已建议各种或多或少的复合系统。每种建议都有潜在的缺陷。
例如，Miller等(1988年Hedrin等人编，植物保护生物工艺学，第405页)建议用共同包含法生产有效的、安全的重组杆状病毒。在该方法中，重组杆状病毒与提供多角体蛋白的野生型病毒在混合感染中增殖，该重组杆状病毒本身缺乏表达为产生包含体所必需的多角体蛋白基因的能力，而包含体是提供环境稳定性所需要的。因此生产含有重组体和野生型病毒颗粒的多角体。支持这一建议的观点是共同包含方法提供将多角体蛋白阴性(pol-)杆状病毒(即缺乏功能性多角体蛋白基因)以感染形式传递到野外的方法。经过用两种病毒类型共同感染单个幼虫和细胞的概率测定病毒群体中共同包含的pol-杆状病毒的持久性，因为病毒从昆虫传给了昆虫。
Wood等(见总评-微生物年度评论，(1991)，45，第69-87页，特别是第83页)报道了共同包含病毒群体有限野外试验的存活特征。也许相当惊人的是发现杆状病毒群体中多角体蛋白缺陷型基因组下降率变慢。
从生产的观点看，制备共同包含病毒群体也有技术要求，需要非常仔细地控制双重感染方法，且基本上是浪费的，因为产品的相当部分在传递改进的杀虫效应方面是无用的。
使用遗传操作提供在制备多角体能力上有遗传缺陷的杆状病毒群体的一个可供选择的方案是在经过遗传改造表达丢失的多角体蛋白的细胞系/宿主中复制缺乏功能性多角体基因的杆状病毒。在使用中，所得的病毒颗粒本身有活性，但增殖后，野生型病毒不能产生多角体蛋白或包含体。这类感染后代具有非常低的稳定性和/或有很弱的感染能力。
这一方案的缺陷是(i)在天然杆状病毒感染期间多角体蛋白水平在包含体生产时非常大，在细胞系中重复这一表达水平非常困难，(ii)细胞系/宿主必须携带功能性多角体蛋白基因。因此，重组事件导致产生保留生产杀虫蛋白之能力且获得制备多角体蛋白之能力的病毒基因组具有相当大的可能性。一旦释放进环境中，这类杆状病毒将会象遗传改造的多角体蛋白阳性(pol+)病毒(即含有功能性多角体蛋白基因)一样发挥作用。
Wood等(国际专利申请号93/22442)建议多角体蛋白的提供和生产包含的病毒的能力并不总是生产具高水平活性的杆状病毒所必须的。在用多角体蛋白缺陷病毒感染的细胞核中产生的所谓“前包含”病毒据报道有口服活性并期望具有非包含病毒的有限存活特征。然而，实现这一方案取决于制剂技术的发展，该制剂技术应能保护“前包含”病毒颗粒足够的期限以便在其失活前靶害虫在野外遇到和吞入该病毒具有较高机率。在天然包含体中，多角体蛋白实现了这一功能，至少是部分实现。
杆状病毒基因组是封闭的环状双链DNA的超螺旋分子。在一个病毒株内观察到各种各样的基因组结构。DNA序列的区别可能是基因组部分再复制、序列缺失和碱基取代的结果。在基因组内也发现重复DNA序列，例如，据报道AcMNPV基因组具有5个显示出DNA同源性的区域。有一些报道在杆状病毒间有基因间同源性。例如，在感染鳞翅目的核型多角体病毒(NPVs)间多角体蛋白基因和具有p10基因的区域高度保守。
也有报道宿主细胞DNA序列插入病毒基因组的情况。特别是也报道了细胞DNA掺入两个密切相关的病毒AcMNPV和Galleria mellonellaNPV(GmMNPV)的基因组中。不打算用任何理论来限制，据信同源区域可能与这类基因组突变有关。最近，鉴定了与细胞DNA插入SeMNPV基因组有关的5个区域。如需综览参见Arif BM“病毒基因组的结构”，第26-27页，在“微生物学和免疫学中的当今论题-杆状病毒的分子生物学”中，Doerfler和Bohm编。
因此，认识到释放重组杆状病毒的问题是它们在同源重组事件中与野生型相互作用导致产生新的杆状病毒以及与野生型病毒的竞争。在这类同源重组事件中，将出现在与第二种病毒基因组区域同源的基因组两区域间的DNA区域转移或在病毒间交换。尽管与重组杆状病毒释放有关的任何危险已在释放前进行了评价，但与野生型任何这类组合的后代可能较好地改变了昆虫宿主范围和/或改变了对靶害虫的毒力。
根据本发明的一个方面，提供了一种用作昆虫生物控制剂的重组杆状病毒，它具有包含异源基因和多角体蛋白基因的基因组，表达一种杀虫蛋白，其中异源基因和多角体蛋白基因不在相同启动子的控制下且异源基因和多角体蛋白基因有足够的空间隔离以便减少与保留表达多角体蛋白和异源基因的野生型杆状病毒重组产生的活病毒后代。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用作昆虫控制剂的重组杆状病毒，它具有包含多角体蛋白基因和异源基因的基因组，表达杀虫蛋白，其中多角体蛋白基因和异源基因不在相同启动子的控制下并且位于基因组中，以便与活的野生型杆状病毒重组产生的病毒后代不保留同时表达多角体蛋白基因和异源基因。
关于活的，我们指后代不缺乏必须基因。
本发明可参考下面附图进行更好的描述：
图1显示了根据现有技术与重组病毒有关的重组事件的图示，其中F是现有技术重组病毒，B是与其重组的野生型病毒，叉表示同源区域，从而限定了共转移区域，Wh+表示异源性基因，pol+表示多角体蛋白基因。
在F中，Wh+和pol+基因在其常规位置，即两基因互相非常靠近。在两基因间有非常少的序列，因此与另一病毒同源的机会非常少，因此能充当重组的底物。可预料在两个基因的任意一侧出现同源序列的机率非常大，因此在重组期间，两个基因作为一个单位一起移动的机率相应地更大。
图2和3各代表根据本发明的一个方面涉及由A代表的重组病毒的重组事件图示，C和D分别代表野生型病毒。
可预期用本发明的重组体经同源重组将Wh+和pol+基因共同转移到另一病毒的概率比用现有技术重组体要小得多。根据本发明Wh+和pol+基因的分离意味着在发生重组事件的基因间有更多的底物，因此Wh+和pol+基因不会一起转移的机率相应地更大。
如果在由A中Wh+基因占据的位置周围发生重组，如图2所示，那么所得的A含有2个pol+基因，但没有弹头，所得的C有Wh+，但其缺乏pol+基因，意味着它有残缺。
如果在由A中pol+基因占据的位置周围发生重组，如图3所示，所得的A有Wh+，但由于缺乏pol+基因，会出现残缺，所得的后代病毒D不具有弹头。
本发明的另一个特征是，即使Wh+pol+共同转移，其转移的病毒在该过程中失去至少一个必需基因，从而至少失去功能或甚至无活性的概率比现有技术更大，对于远源病毒间的共转移这种情况尤其现实。图4是这种情况的图示，其中X代表必须基因的位置。X位于A和E基因组中的不同位置，以便所示重组导致X从野生型病毒E中丢失。
根据本发明病毒本身是：
-比以更多野生型构建体为基础的构建体更安全；
-对于可能的重组事件更安全；
-易于生产。
优选杆状病毒至少10％的基因组分开异源基因和多角体蛋白基因。甚至更优选大约12％的基因组分开两个基因。这仅以图6为参考就容易说明。在图6中参考0-100图谱单位的规模报道了序列的位置。AcMNPV基因组大小约130/131千碱基对。因此，根据本发明异源基因和多角体蛋白基因优选至少13kb，甚至更优选大约15kb到约16kb。
一般来说，杆状病毒基因组范围从大约90到200kb。因此可预期基因间合适的分隔距离取决于本发明所用的杆状病毒。
优选的是多角体蛋白基因在p10启动子的控制下，异源基因在任何其它启动子的控制下，例如多角体蛋白启动子。
尽管这是优选的实施方案，但为避免产生疑问，我们将提出多角体蛋白基因可以是在基因组中除其天然位置外的任何其它位置，并且其位置不破坏必需基因。异源基因的情况也相同。
还建议在正常情况下由p10基因占据的位置上有多角体蛋白基因的重组体为已减低稳定性的病毒提供一简单的解决方法，其中p10基因失去功能或缺失且可遗传修饰以容纳在通常由多角体蛋白基因占据的位置编码杀虫蛋白的基因。这种p10缺陷型病毒具有许多特征，可导致它们有效地杀虫且对于野生型病毒还能被遗传失活。
因此，根据本发明的另一个优选的实施方案，基因组可修饰成失活或缺失p10基因。
还发现根据本发明的缺失p10基因的杆状病毒具有下列特征：
-用这种病毒感染的昆虫在死亡时产生的病毒后代与在相同发育阶段用野生型病毒感染的昆虫相比产率更低；
-与野生型多角体相比，产生的多角体较小且是畸形的。因此它们很可能存活能力下降；
-然而多角体与野生型多角体一样具有感染性意味着生产仍是容易的。
本发明的特征在图5(其中Magn＝放大率)中说明。图5a显示了缺乏p10基因的AcUW1杆状病毒。与图5b的p10+AcUW1杆状病毒相比，易于发现p10-杆状病毒的多角体是不完整的。失活的p10-AcUW1杆状病毒簇在图5c中表示。图5c表明不仅多角体不完整，而且这些杆状病毒失去病毒颗粒。图5c中失活的杆状病毒可与图5d中所示的更健康非失活的杆状病毒相比。
为了制备这些照片，将多角体在含30％戊二醛的0.05M磷酸缓冲液中4℃固定90分钟，在缓冲液中洗3次，在含1％四氧化锇的0.05M磷酸缓冲液中后固定。经过脱水和浸润后，样品在Spurr’s树脂(Spurr，1969)中包埋，切片并在2％的乙醇乙酸铀中染色15分钟，接着在含0.2％柠檬酸铅的0.1N氢氧化钠中染色5分钟。
本发明的一个优选的实施方案在图6b中以更详细的方式说明，其构建体在下面实施例中描述。本图可与图6a中所示的重组体杆状病毒特征进行有益的比较。图6a显示了异源基因的常规位置，名义上与多角体蛋白基因十分接近。
现在将以更详细的方式描述本发明的各种优选的特征和实施例。
为了便于描述本发明，参考涉及使用芋螺毒素作为异源基因，特别是软体动物和甲壳动物活性“King Kong”芋螺毒素(Hillyard等人(1989)生物工艺学)，后来命名为KK-0[SEQ ID 16](Woodward等人(1990)，EMBO J.91015-1020)，以及在the ConferencesJacques Monod on Toxines Animales(Aussois，France)on 24-28 October 1988中报道的两个相关肽KK-1[SEQ ID 17]和KK-2[SEQ ID 18]。正如在下面实施例1中详细描述的，制备与KK-0，KK-1和KK-2(见图12)报道序列相应的合成肽并经过注射进成体Periplanata  americana(目：Dictyoptera)和幼虫Heliothis  virescens和Trichoplusia  ni(目：Lepidoptera)进行试验。在试验各种类中KK-0和KK-1制品显示出明显的杀虫和/或麻痹诱导活性。还可见利用设计的合成基因〔SEQ ID 1〕编码mRNA分子，而该mRNA分子又编码“King Kong”(KK-0)芋螺毒素假定的天然前体，它是一个78个氨基酸的蛋白质，很可能在合成过程中进入分泌途径并且可能开始以前体毒素的形式产生，随后最终在Conus textile中加工产生成熟KK-0(Woodward等人(1990)EMBO J.91015-1020)。用于本研究的合成基因设计时没有考虑Conus textile  KK-0基因的天然核苷酸序列。尽管它编码天然KK-0前体，但设计该基因时确保它既在昆虫细胞系统中有效表达，又便于操作(见实施例2的详细描述)。因此，尽管我们没有使用来自Conus textile的天然KK-0基因或cDNA，然而，没有理由预期这一序列或另一能编码KK-0前体的合成基因不能同样有效地增强杆状病毒宿主作用的速度。我们使用的合成基因(sKK-0)与编码天然KK-0 mRNA的序列实际上只有77％的核苷酸序列相同性。这一毒素的进一步的细节在我们共同末决的国际专利公开号WO 94/23047中给出。
本发明可应用于可获得的或形成的表达杀虫蛋白质的其它异源基因，这对本领域的技术人员而言是显而易见的。这类基因的例子是北非蝎子Androctonus australis Hector(AaIT)表达毒素的基因，枯草疥螨Pyemotes tritici 表达Tox 34毒素的基因(Tomalski MD andMiller LK，Nature，(1991)，352，82-85)。
杆状病毒可以是Autographa  caifornica多包膜核型多角体病毒(AcMNPV)或适于遗传工程或操作技术的任何其它可获得的或形成的病毒种类。其它的例子包括Bombyx mori NPV. Spodoptera exiguaMNPV，Galleria mellonella MNPV，Trichoplusia ni MNPV，Choristoneura  fumiferana MNPV，Orgyia pseudotsugata MNPV，Spodoptera frugiperda MNPV，Mamestra brassicae MNPV，所谓的Celery Looper病毒(命名为HPV-85-CLMEV，在国际专利公开号WO 90/10387中提到)，所谓的NC-1病毒(在我们共同未决的国际专利申请号PCT/GB 94/02438中提及)和Heliothis zea SNPV(单包膜核型多角体病毒)。
任何适用于与杆状病毒基因组之修饰相联系的pol-传递载体可用于制备本发明的昆虫控制剂。实施例包括pVL1392和pVL1393。其它合适的载体在本领域是已知的。
以pVL1392为基础的掺入图7和图8的DNA序列的质粒已导入大肠杆菌并于1993年3月12日保藏在国家工业和海洋细菌保藏中心(Aberdeen UK)，保藏号为NCIMB 40540。
可根据已知技术构建根据本发明的重组杆状病毒。如上所述，以一般方式构建合适的转移载体。这种转移载体含有与野生型病毒基因组DNA序列适当同源的序列。由于病毒DNA和质粒载体共转染，很可能因同源重组产生重组后代。然后使用常规技术从亲本病毒中分离重组病毒。
现在借助于下列实施例说明本发明的各个优选的方面。
                        实施例1
“King Kong”(KK-0)，KK-1和KK-2肽合成制备物的生物学评价
使用成体蟑螂(Periplaneta americana：Blattidae：Dictyoptera)和五龄烟草蚜虫幼虫(Heliothis virescens：Noctuidae：Lepidoptera)在系列注射研究中进行KK-0、KK-1和KK-2肽合成制备物的生物学活性初步评价。
这些蛋白质证实不溶于蒸馏水和正常用于注射的标准水缓冲液。KK-0和KK-1以10mg/ml的浓度悬浮于0.1M的碳酸氢铵中。轻轻搅拌1小时后，悬液通过0.2μm滤膜过滤。肉眼观察表明大约50％的KK-0产物溶解，而溶解的KK-1产品较少。这使得难以精确定量和比较不同蛋白质的直接剂量比率。然而，可以估计传递的最大剂量。KK-2疏水性极强并且以每ml 10mg粗制品的浓度溶于DMSO。
使用配有15mm 33号针头的10μl Hamilton注射器注射烟草蚜虫幼虫(TBW)。平均体重大约为300mg的早期五龄幼虫以每次处理1-4μl进行注射。典型地，每次处理至少5份。使用配有15mm 27号针头的50μl Hamilton注射器注射成年雄性蟑螂。每只动物接受1-10μl试验溶液的剂量；平均体重是大约840mg。对照昆虫用等体积的合适溶剂进行注射。
注射后，处理的昆虫单独在具有食物供应的容器中在控制条件(25C，65％RH)下饲养多达72小时。定期观察以检查任何异常症状。烟草蚜虫
KK-0和KK-1注射进H.virescens幼虫导致特征性“软垂麻痹”(表I)。典型地，在注射后几乎立即观察到症状，幼虫似乎变得“麻醉”。感染的幼虫不能站立或进行协调步态。而且将它们仰面放置时不能翻转过来且口器和抱握器仅能进行有限的无力的活动以对刺激作出反应(用木质鸡尾棍轻刺)。在“麻醉”高峰时，感染的幼虫软垂且易弯曲。然而这些效应的时间相当短，注射后5-10分钟完全恢复正常。在处理后24小时(24HAT)全部幼虫活跃且状况良好。注射更高剂量导致症状严重性和持续时间增加。用KK-0时症状似乎更显著。
用单次以相当于每只幼虫大约10μg蛋白质(即33μg蛋白质/mg幼虫)的最大剂量注射KK-2蛋白质进H.virescens幼虫后未观察到异常效应。蟑螂
所有3种蛋白质在蟑螂中产生明显的衰弱效应(表II)。在每种情况下，效应的严重性随注射的蛋白质悬液的体积而增加。
将KK-0蛋白质悬液注射进蟑螂开始引起严重的发抖、接着失去协调，麻痹和跌倒。这些效应开始在后腿观察到，但迅速扩散到中部，最后到前腿，导致昆虫跌倒。其它症状包括背部弓曲。感染的昆虫不能恢复并在22HAT内死亡。用KK-1蛋白质注射的昆虫显示出相似的症状，尽管在1μl蛋白质悬浮液的最低剂量时效果严重性似乎略轻。
在用2和5μl  KK-2肽注射的昆虫中也容易观察到短暂的异常效应。症状包括背部弓曲，翅膀变平和失去协调运动并在注射后几分钟内发生。效应似乎是暂时的，且感染的昆虫似乎在注射后20分钟内完全恢复。然而，在这些处理中的全部动物在72HAT死亡。在用最低剂量(1μl体积)处理的昆虫中记录不到异常症状，所有昆虫在72HAT时存活且状况良好。
在随后的实验中证实了这些观察且证实芋螺毒素蛋白质对蟑螂和TBW幼虫具有杀虫活性。
                实施例2
合成的King Kong(sKK-0)芋螺毒素基因设计
由于没有现有理由相信天然KK-0基因密码子用途对于在昆虫细胞中表达特别有优势，所以我们决定设计一个新的合成(sKK-0)基因。这借助于诸如TRANSL、RESTRI和MUTSITE的PCGeneTM(Intelligenetics，700East  Camino  Real，Mountain  View，California)程序进行。
sKK-0基因的特征是：
·它准确地编码Woodward等通过其cDNA克隆研究((1990)EMBO  J.91015-1020)描述的KK-0前肽的氨基酸序列〔SEQ ID2〕。
·选择用于编码KK-0前肽的密码子是根据它们在昆虫(Drosophila melanogaster)和酵母(Saccharomyces cerevisiae)中常用或至少经常遇到，因为期望表达研究还可以在后来的生物中进行(Ashburner等人(1984)基因发展4 295-312；Ikemura(1985)分子生物学进展2 13-34；Sharp(1986)核酸研究14 5125-5143)。
·位于翻译起始密码子(ATG)之前的核苷酸序列与Kozak限定的动物mRNAs优选序列(ckozak(1981)核酸研究9  5233-5252；Kozak(1984)核酸研究12 857-873；Kozak(1986)细胞44 283-292；Kozak(1987)分子生物学杂志196 947-950)密切相配。
·根本不考虑用Conus textile的密码子编码KK-0前肽。(结果sKK-0与天然KK-0基因的总同源性仅77.2％)。
·将侧翼限制性酶识别位点(上游是BglII，下游是XmaIII和BamHI)插入设计物中便于直接克隆进初始选择的杆状病毒转移载体pVL1392(InVitrogen Corporation，3985 Sorrento Valley Boulevard，SanDiego，California)。期望用这些酶克隆导致能从这一转移载体携带的AcMNPV多角体蛋白启动子上有效地直接转录该基因(见图10)。
·将一些其它的单一六核苷酸识别序列位点在基因全长的位置上插入sKK-0序列但不影响编码的氨基酸序列。这些位点包括利于重组体鉴定和可能的基因随后操作(见实施例14)。没有一个插入的位点会引起包含特别不利的密码子。
所得的sKK-0序列〔SEQ ID 1〕在图7中显示，突出了KK-0前肽的编码序列，在图8中突出了限制性酶识别位点的位置。
                         实施例3sKK-0基因的合成
选择装配sKK-0基因的方案涉及编码图7和8所示的DNA片段之重叠互补的寡核苷酸的合成，随后用DNA聚合酶介导补齐单链区域并经聚合酶链式反应(PCR)扩增产生充足量的完整基因片段(见图9)。
于是用标准方法在Applied Biosystems 380B DNA合成仪上合成4个寡核苷酸(ConoA，ConoB，ConoC，ConoD)〔SEQ ID 3，4，5，6〕，它们一起编码完整的sKK-0 DNA片段。还合成了2个其它更短的寡核苷酸ConoPCR1和ConoPCR2〔SEQ ID 7，8〕，它们与ConoA和ConoD 5′30和28个核苷酸相同，用作PCR引物。各寡核苷酸经过在55℃保温大约8小时去保护，接着在真空中干燥。然后溶于200μl TE缓冲液(10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)中，以紫外分光术测定浓度(1OD260单位/ml等于大约20μg/ml)，用TE稀释产生大约10μM贮液。它们贮存于-20℃备用。sKK-0合成反应包含：
1)将10μM  ConoA和ConoB各5μl在无菌的500μl圆锥形聚丙烯微量离心管中与5μl  10mM  dGTP，10mM  dATP，10mMdCTP，10mM  TTP和5μl  500mM  KCl，100mM  Tris-HCl(pH8.5)，15mM  MgCl2，0.1％明胶混合，加水至49μl，加入1μl(5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin/Elmer，Cetus)，接着用2滴轻石蜡油(Sigma)覆盖。然后盖上小管，放入Techne PHC-1 ProgrammableDri-BlockR中进行下面的温度循环：-
1.1′94℃；1′55℃；4′73℃
循环5次后，接着在73℃最后保温7′。
2)将10μM  ConoC和ConoD各5μl混合，完全按上面(1)处理。
3)取0.5μl反应液(1)产物与0.5μl反应液(2)产物混合，5μl反应液(1)产物与反应液(2)产物混合。然后向各混合物中加入10μl10μM ConoPCR1；10μl 10μM ConoPCR2；10μl 500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH 8.5)，15mM MgCl2，0.1％明胶；10μl10mM dGTP，10mM dATP，10mM dCTP，10mM TTP，然后加水至99μl，接着加入1μl(5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin/ElmerCetus)，最后用2滴轻石蜡油覆盖。平行地进行对照反应，其中缺少PCR引物、反应液1或反应液2产物。然后反应物在TechneProgrammable Dri-BlockR：中进行下述温度循环：1.1′94℃，1′68℃，4′73℃。
循环25次后，接着最后在73℃保温7′时间。
然后在反应3产物的10μl等份试样中进行琼脂糖凝胶电泳分析证实仅在含有全部必须DNA片段和寡核苷酸的反应液中产生了大约270bp的片段。在经乙醇沉淀回收前，各DNA片段的残余物用等体积的水饱和酚进行酚提物(2次)且用等体积的水饱和的n-丁醇提取(2次)。
                       实施例4
            pVL1392/sKK-0重组体转移载体的装配
回收后，根据厂家建议用BglII和EclXI(XmaIII的一种同切点酶)限制性酶消化各个上述PCR产物。平行地同样处理大约5μg等份试样的pVL1392(一种以商业途径可获得的杆状病毒(AcMNPV)转移载体(In Vitrogen))。限制性消化产物在含0.5μg/ml溴化乙锭的制备性0.8％琼脂糖/Tris-乙酸电泳凝胶上进行电泳。在紫外光照下从凝胶上切下PCR产物和线性化载体DNA片段。然后经离心通过硅烷化玻璃绒和乙醇沉淀回收它们。然后将分离的插入片段等分试样与载体DNA片段以及T4连接酶在合适的缓冲条件下混合(Sambrook J.，Fritsch  E.F.&Maniatis T.(1989)“Molecular Cloning：A Laboratory Maunal”。Cold Spring Harbor Press.)。然后经标准方法将连接混合物用于转化感受态DH5α细胞(Sambrook et al.出处同上)。经过在含100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂板上生长过夜选择后代转化子。
然后以标准方法经过在HyBond-N(Amersham International)滤膜上进行菌落杂交筛选存在与sKK-0基因互补之序列的转化子(Sambrook et al.出处同上。)。使用的杂交探针是寡核苷酸ConoB，它已经过用g32P-ATP(Amersham International)和T4多核苷酸激酶(Northumbria Biological Ltd.)处理5′磷酸化。从6个强烈杂交菌落中制备质粒DNA。这些DNA的限制性分析表明，存在三个含有插入片段的pVL1392衍生物，这些插入片段具有sKK-0预期的近似大小和特征。
然后使用SequenaseTM(USB，Cleveland，Ohio)试剂盒和设计成与pLV1392侧翼BglII和XmaIII识别位点杂交并允许测序这些位点之间导入的任何插入片段(见图10)的2个合成的寡核苷酸引物(pVL1392FOR和pVL1392 REV)〔SEQ ID 13，14〕检查存在于pVL1392重组子(#2.2，#5.2和#6.1)中的插入片段的序列。在3个重组子中一个(#2.2)的插入片段序列〔SEQ ID 15〕与以预期方式克隆的期望的sKK-0序列精确配对(见图11)。其它质粒含有具少量序列变异(突变)的插入序列。
因此在随后的全部研究中选用重组体#2.2，它是一种含有在AcMNPV多角体蛋白启动子转录控制下的基因sKK-0的转移载体pVL1392的衍生物。携带重组体质粒pVL1392/sKK-0 #2.2的大肠杆菌DH5α培养物保藏在国家工业和海洋细菌保藏中心，(Aberdeen，UK)，保藏号为NCIMB 40540。
                      实施例5
    携带sKK-0重组体(多角体蛋白阴性)AcMNPV的生产
使用标准杆状病毒技术，如在King & Possee(1992)“杆状病毒表达体系：实验室指南”(Champan & Hall)中所述，经过用大约200ng SauI(Boehringer，Mannheim)线性化AcMNPV lacZ(Possee & Howard(1987)核酸研究15 10233-10248)和1μgpVL1392/sKK-0 #2.2DNA共转染Sf21细胞产生携带在多角体蛋白启动子转录控制下的sKK-0而缺乏功能性多角体蛋白基因的重组体AcMNPV病毒。重组体病毒的选择最初是根据重组体lacZ-病毒在Sf21细胞单层培养物中产生的噬斑中失去代谢X-gal(GIBO/BRL，GrandIsland，New York)的能力进行的。挑出6个这种lacZ-病毒(“CONO-A”，“CONO-B”，“CONO-C”，“CONO-D”，“CONO-D”和“CONO-E”)并在Sf21细胞上再次涂布以纯化至均一并证实它们不能合成β半乳糖苷酶。然后，经过接种在25cm2组织培养瓶(Bibby，Stone，Staffs.)中的4ml.TCl00/7.5％胎牛血清培养基(均来自GIBCO/BRL)中的1.5×106Sf21细胞中制备各纯化病毒的小批量(大约4ml)培养物，28℃培养过夜，加入经过挑选单个纯化的噬菌斑并在28℃下继续培养另外6天回收的病毒的50％。然后取各病毒贮液的等份试样进行生物测定(见实施例6)。平行的等份试样用于制备病毒DNA的小样品进行物理分析(King & Possee(1992)出处同上)。
用预期的sKK-0/AcMNPV重组体进行的诊断学物理分析是：
a)用sKK-0并平行地用β半乳糖苷酶基因特异性引物进行PCR试验。
b)病毒DNA用ClaI和BglII处理，在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，转移到HyBond-N滤膜上并用分离的、随机引物α32P-dCTP标记的sKK-0探针杂交进行Southern印迹分析。
这些研究证实了病毒“CONO-C”含sKK-0基因，具有全部预期的物理特征，并缺乏β-半乳糖苷酶基因。其它预期的重组病毒缺乏sKK-0基因。
                     实施例6
    预期的AcMNPV/pVL1392/sKK-0重组体病毒的生物测定
使用晚期Heliothis virescens幼虫在一系列注射研究中评价推定的AcMNPV/pVL1392/sKK-0病毒的生物学活性。使用装有15mm 33号针头的10μl Hamilton注射器将纯化的非包含病毒的等份试样注射进四龄或五龄H.virescens幼虫中。典型地，每次处理用1μl标准体积病毒悬液注射至少5只幼虫。用等体积的AcMNPV/pVL1392/lacZ病毒AcMNPV野生型病毒或无菌水注射对照昆虫。注射后，幼虫单独以人工食谱喂养，以24小时的间隔进行检查另外7天。在每次评价中记录活的和死的幼虫数。检查存活幼虫的任何异常症状和/或行为反应。
起初，对实施例5所述产生的6个推定的AcMNPV/pVL1392/sKK-0克隆的等份试样进行试验。只有一个AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C表现出一些异常效应。生物学观察证实了在实施例5所述的物理分析中所显示的仅CONO-C病毒携带具有全部预期物理特征的sKK-0基因。使用病毒的已调定贮液进行鉴定AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONOC生物学特征的进一步注射试验。
比较AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C和AcMNPV/pVL1392/lacZ病毒抗早期四龄H.virescens幼虫生物学效力的资料在表III中提供。处理72小时后(72HAT)，用AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONOC处理的4/11幼虫显示出完全或部分松驰麻痹。分类为“完全麻痹”的幼虫是垂死的，不能站立，翻转或行走，口器和抱握器仅能进行非常无力的运动以对刺激作出反应。“部分麻痹”的幼虫显示出身体中部和后部区域局部麻痹，尽管包括头部和口器的前部区域能对刺激作出正常反应。当仰面放置时，这些幼虫能翻转并能进行有限的运动，尽管活动缓慢且协调性差。在96HAT，用AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C病毒处理的全部幼虫死亡或显示出反常症状。与此相反，用AcMNPV/pVL1392/lacZ对照病毒注射的全部幼虫在96HAT存活并行为正常，这些幼虫的1/10在120HAT死亡，6/10的幼虫在144HAT死亡。携带lacZ基因的AcMNPV/pVL1392衍生物比野生型病毒杀死速度更慢。典型地，野生型AcMNPV在120HAT和以后开始引起明显的死亡率。因此可以推断：AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C构建体比AcMNPV野生型和AcMNPV/pVL1392/lacZ对照病毒具有更快的作用速度并因此提高了杀虫效力。
                         实施例7
            pAcUW21/sKK-0重组体转移载体的装配
为了制备多角体蛋白+(包含的)重组体AcMNPV/sKK-0衍生物，它本身具有感染性，因此能现实地对剂量反应效力的评价和对庄稼保护效力的评价，我们开始选择使用pAcUW21转移载体(AMSBiotechnology(UK)Ltd.)。该转移载体是以前成功地用于制备重组体病毒的转移载体pAcUW2b的简单衍生物(Possee R.D.，Personalcommunication)制备的重组体病毒因为在有效的晚期p10启动子的控制下表达昆虫选择性毒素基因而能够传递加速的生物学效应(Stewart etal.(1991)自然352 85-88；McCutchen et al.(1991)生物工艺学9848-852)。
为了释放导入pAcUW21中的合适的sKK-0插入片段，用EcoRI和BglII限制性酶消化20μg pVL1392/sKK-0 #2.2质粒DNA的等份试样。平行地同样处理10μg pAcUW21转移载体DNA的等份试样。然后将限制性消化产物在含0.5μg/ml溴化乙锭制备的1％琼脂糖/Tris-乙酸电泳凝胶中电泳。在紫外光照下从凝胶上切下释放的sKK-0插入片段(大约282个碱基对)和线性化的载体DNA。然后经离心通过硅烷化玻璃绒和乙醇沉淀回收它们。
然后将分离的sKK-0插入片段和pAcUW21载体DNA片段的等份试样与T4连接酶在合适的缓冲条件下混合(Sambrook et al.(1989)在“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(Cold SpringHarbor Press))。然后以标准方法(Sambrook et al.出处同上)将连接混合物用于转化感受态DH5α细胞。经过在含100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂板上生长过夜选择后代转化子。从6个推断的重组体菌落中制备质粒DNA。这些DNA的限制性分析表明这6个全部是含具有sKK-0预期大小和特征的pAcUW21衍生物。
然后使用SequenaseTM(USB，Cleveland，Ohio)试剂盒和设计成与sKK-0插入片段杂交的2个合成寡核苷酸引物检查存在于上面6个重组体的2个(#A1和#A2)中的插入片段的序列。两个克隆的插入片段的序列与以所需方式克隆的期望的sKK-0准确配对。
重组体#A1是一个含有在AcMNPV p10启动子转录控制下的基因sKK-0的转移载体pAcUW21的衍生物，因此选择它用于随后的研究。这种重组转移载体还具有在天然多角体蛋白启动子控制下的完整AcMNPV多角体蛋白基因。
                        实施例8
        携带p10启动子/sKK-0基因表达单位的重组体
            (多角体蛋白阳性)AcMNPV的产生
使用标准杆状病毒技术(King & Possee(1992)“杆状病毒表达体系：实验室指南”(Chapman & Hall))生产携带在p10启动子转录控制下之sKK-0基因的多角体蛋白+(包含的)AcMNPV衍生物。这经过用200ng SauI(Boehringer Mannheim)线性化的AcMNPV.lacZ(Possee & Howard(1987)核酸研究15 10233-10248)和1μgpAcUW21/sKK-0重组体#A1 DNA共转染Sf21细胞来实现。然后经过在Sf21细胞单层(King & Possee(1992)出处同上)上以显微镜判断病毒失去代谢X-gal(GIBCO/BRL，Grand Island，New York)的能力和产生多角体(病毒包含体)的能力进行噬菌噬纯化来选择候选的重组体AcMNPV/sKK-0病毒。挑选出6个这种lacZ-病毒(AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1，AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #2，AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #3，AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #4，AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #5和AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#6)。然后用上述6个克隆在Sf21细胞单层上进行第二噬菌斑试验以纯化至均一并证实它们不能合成β-半乳糖苷及能产生多角体。
然后按实施例5所述制备各纯化病毒的小量培养物。然后取各病毒贮液的等份试样进行生物测定(见实施例9)。平行的等分试样用于制备病毒DNA的小样品以进行物理分析。
在预期的AcMNPV/pAcUW21/sKK-0病毒DNA中进行Southern印迹分析。这些DNA用(a)HindIII和(b)EcoRI和BamHI处理，经过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，转移到Hybond-N滤膜上并用分离的、随机引物α32P-dCTP标记的sKK-0探针杂交。
这些研究证实病毒AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1，AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #4和AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #5各含有sKK-0基因，具有全部预期的物理特征，缺少β-半乳糖苷酶基因并且产生多角体蛋白+病毒颗粒。
选择病毒AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1用于全部随后的研究。
                      实施例9
   预期的AcMNPV/pAcUW21/sKK-0重组体病毒的生物测定
在对H.virescens的一系列注射和口服剂量研究中评价了推断的AcMNPV/pAcUW21/sKK-0病毒的生物学特征。使用实施例6列出的方法进行使用纯化的非包含病毒贮液的注射试验。使用Hughes和Wood((1981)J.Inverteber.Pathol. 37，54)建立的新生幼虫逐滴取食方法的修改版本进行用纯化多角体的口服剂量试验。
对按实施例8所述产生的6个推断的AcMNPV/pAcUW21/sKK-0病毒进行初步的注射试验表明只有3个克隆(AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#1，#4和#5)携带sKK-0基因。用这些病毒处理的一些幼虫表现出异常症状，出现的症状与在用AcMNPV/pVL1329/sKK-0 CONO C病毒处理的昆虫中观察到的症状初始相似。然而随后在AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1上的研究证实这些“异常”效力一般不太明确且不是特别弱，AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1在作用速度或杀虫效力方面并不显示出显著优于野生型AcMNPV。比较AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1和野生型AcMNPV生物学效力的口服剂量研究证实了这些观察。
                     实施例10
     产生重组体AcMNPV的AcUW1-PH DNA的制备
根据将从多角体蛋白启动子表达sKK-0基因的多角体蛋白阴性AcMNPV衍生物的不同行为(实施例4，5和6)与从p10启动子表达sKK-0基因的多角体蛋白阳性AcMNPV衍生物(实施例7，8和9)进行比较，我们决定构建从多角体蛋白启动子表达sKK-0基因的多角体蛋白阳性衍生物以确定用多角体蛋白启动子/sKK-0表达单位而不用p10启动子/sKK-0表达单位是否能实现增强杀虫效力。
选择作为多角体蛋白启动子/sKK-0表达单位的受体的病毒是AcUW1-PH(见Weyer et al.(1990)J.Gen.Virol.71 1525-1534和图6)。该病毒在由野生型AcMNPV p10基因占据的基因座上携带p10启动子/多角体蛋白基因表达单位，且在正常情况下由多角体蛋白基因占据的位置上携带一个多角体蛋白启动子/lacZ指示基因表达单位。因此在Sf21细胞单层上形成噬菌斑，该单层含有携带AcMNPV包含体的细胞，在X-Gal指示剂(GIBCO/BRL，Grand Island，New York)存在的条件下染成蓝色。因此预期用pVL1392/sKK-0 #2.2重组体转移载体的多角体蛋白启动子/sKK-0表达单位代替多角体蛋白启动子/lacZ表达单位是制备携带多角体蛋白启动子/sKK-0基因表达单位的多角体蛋白阳性AcMNPV衍生物的便利方式。
未知滴度的AcUW1-PH病毒贮液由Dr R.D.Possee(NERCInstitute of Virology and Environmental Microbiology，MansfieldRoad，Oxford)赠送。该病毒的小批量扩增培养物的制备是经过接种3份在含4ml TC100/10％胎牛血清培养基(均来自GIBCO/BRL)的25cm2组织培养瓶的1.5×106Sf21细胞上，28℃培养过夜，接着在每瓶中加入50μl，5μl和5μl 1/10稀释的贮液病毒的等份试样并在28℃再培养6天。使用标准噬菌斑试验技术(King & Possee(1992)“杆状病毒表达体系：实验室指南”(Chapman & Hall))滴定这些小批量扩增产物。获得的全部噬菌斑含有包含体且在X-Gal存在下成蓝色。从起始50μl输入培养物产生的病毒贮液具有2.3×107pfu/ml的滴度并用于产生更大的200ml AcUW1-PH的旋转贮液培养物，按标准方法(King & Possee(1992)出处同上，和Possee & Howard(1987)核酸研究15 10233-10248)制备随后的病毒DNA。然后根据厂家建议用SauI(Boehringer Mannheim)消化3μg病毒DNA制备线性化的AcUW1-PH DNA的贮液，因为该酶仅在β-半乳糖苷酶基因内裂解，与AcMNPV.lacZ一样，预期该方法利于生产和检测重组体AcMNPV后代(King & Possee(1992)，出处同上)。
                       实施例11
       携带多角体蛋白启动子/sKK-0基因表达单位的
          重组体(多角蛋白阳性)AcMNPV的生产
使用标准杆状病毒技术(King & Possee(1992)，出处同上)，经过使用SauI线性化的AcUW1-PH病毒DNA作为来自pVL1392/sKK-0#2.2的多角体蛋白启动子/sKK-0表达组件的受体生产携带在多角体蛋白启动子转录控制下的sKK-0的具有活性多角体蛋白基因的重组病毒。这是经过用200ng实施例10所述制备的SauI线性化AcUW1-PH DNA和1μg pVL1392/sKK-0 #2.2DNA共转染Sf21细胞实现的。使用噬菌斑试验技术(其中病毒在Sf21细胞单层培养物中产生噬菌斑)，经过初始筛选缺乏代谢X-gal(GIBCO/BRL，Grand Island，New York)的能力但保留产生包含体(多角体)的能力的病毒来选择重组病毒。挑出了6个这种lacZ-病毒(AcUW1-PH/KKO #1，AcUW1-PH/KKO #2，AcUW1-PH/KKO #3，AcUW1-PH/KKO #4，AcUW1-PH/KKO #5，AcUW1-PH/KKO #6)。然后在Sf21上对上述6个克隆中的每一个进行第二次噬菌斑试验以纯化至均一，并证实它们没有合成β-半乳糖苷酶的能力以及具有产生多角体的能力。然后以实施例5所列的方法制备各纯化病毒的小批量培养物。然后取各病毒贮液的等份试样进行生物测定(见实施例12)。在平行实验中用小批量病毒贮液的等份试样制备病毒DNA的小样品用于物理分析。
对预期的AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0病毒DNA进行Southern印迹分析。用BglII和BscI(ClaI的同切点酶)处理这些DNA，在1.4％琼脂糖凝胶上电泳分离、转移到Hybond-N滤膜上并用分离的随机引物α32P-dCTP标记的sKK-0探针杂交。这些研究证实病毒AcUW1-PH/sKK-0 #2，AcUW1-PH/sKK-0 #4，AcUW1-PH/sKK-0 #5和AcUW1-PH/sKK-0 #6各含有一个sKK-0基因，具有全部预期的物理特征，缺乏β-半乳糖苷酶基因并产生多角体蛋白+病毒颗粒。
选择病毒AcUW1-PH/sKKO #2用于随后的研究。
                     实施例12
    预期AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0重组病毒的生物测定
在对Heliothis virescens幼虫的一系列注射和口服剂量研究中评价推断的AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0重组体病毒的生物学效力。使用实施例6中所述的方法用纯化的非包含病毒贮液进行注射试验。使用实施例9所述逐滴取食试验的修改版本用纯化的多角体进行口服剂量研究。
比较按实施例11所述生产的6个推断的AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0病毒的生物学活性的初步注射研究表明与野生型病毒相比只有病毒AcUW1-PH/sKK-0 #2，AcUW1-PH/sKK-0 #4，AcUW1-PH/sKK-0#5和AcUW1-PH/sKK-0 #6可增强杀虫效力。选择AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0 #2进行扩增并进一步鉴定。
注射试验资料表明：用AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0#2病毒处理的幼虫从72HAT起表现出异常症状(表IV)。到96HAT时，大多数幼虫死亡且唯一的幸存者麻痹。所有幼虫在144HAT时死亡。与此相反，在用野生型AcMNPV处理的幼虫中观察不到异常效应，直到120HAT时50％的幼虫死亡；对于野生型AcMNPV在144HAT时记录到100％的死亡率。
使用纯化的多角体进行一系列口服剂量研究以比较AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0和野生型AcMNPV的生物学效力。在所有情况下，AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0 #2比野生型明显显示出具有更快速度的杀虫力，因此提高了杀虫效力。用AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0病毒处理幼虫开始显示出麻痹症状并从72HAT起死亡(表V)。剂量反应资料的概率分析证实AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0 #2的杀伤速度在72和96HAT明显比野生型AcMNPV快，但到120HAT时野生型病毒赶上。
本发明的杆状病毒可根据已知的或建立的本领域的技术应用于昆虫或昆虫生长地区。优选的是配制杆状病毒。可使用任何已知的或建立的合适配方。应优化配方使杀伤速度最大并优选保护杆状病毒抵抗紫外照射。
杆状病毒的施用可以气体(特别是对森林害虫)，以喷发型喷雾用于农作物，或以高压装置首先用于水果和蔬菜作物。一般以喷雾的形式施用而不以尘埃或颗粒制剂施用，可湿性粉末是优选的施用方式。可加入佐剂，例如表面活性剂如展布剂，粘着剂和乳化剂，日光屏蔽剂，缓冲液和味觉刺激物。
使用常规方法可证实根据本发明发生同源重组的事实。特别是使用例如核酸内切酶限制或测序可考查病毒基因组中的精确变化。使用已知的生物测定方法还可评价在宿主范围内的任何变化。使用基因组标记还可以追踪病毒的遗传构建。
对改造的病毒和其它病毒之间的遗传交换的起始研究或甚至对宿主细胞的了解应在实验室内进行，其中幼虫组用野生型和重组病毒感染。其它的幼虫可作为连续传代的代表加入。
使用包含的野外试验可进行进一步的研究。在这类试验中，导入野外前在实验室感染幼虫，其中在一定时间内监测病毒群体。表I：经注射进Heliothis  virescens幼虫初步评价KK-0，KK-1和KK-2蛋白质的合成制备物的生物活性1。
  处理  每只昆虫的剂量                    效   果
  KK-0     1μl 在注射后30秒内失去协调。在注射2-4分钟内全部幼虫显示出虚弱麻痹并不能站立、翻转或对刺激作出反应；软垂和易弯曲。4-6分钟后效应开始消除，在注射后10分钟大多数幼虫显示正常。在24HAT全部幼虫存活且健康状况良好。
    2μl 症状如上但更严重和持久。在注射后45分钟全部幼虫逐渐恢复出现正常，在24HAT全部存活且健康。
  KK-1     1μl 在注射30秒内首先观察到症状。在2-4分钟内大多数幼虫显示出虚弱麻痹：症状如KK-0。效应是暂时的且在注射后6-10分钟全部幼虫出现正常。在24HAT全部幼虫存活并正常。
  KK-2     1μl 即使在24HAT也未观察到有害效应。
  对照2      - 实验期间观察不到有害效应。
1每次处理注射6只五龄幼虫；平均体重：300mg。2对照：2μl 0.1M碳酸氢铵。表II：经注射初步评价KK-0，KK-1和KK-2蛋白质合成制品对Periplaneta americana1的生物活性
  处理  每只昆虫剂量                   效  果
  KK-0     1μl 在注射1分钟内观察到后腿暂时麻痹但注射后6分钟时效应消失。从注射20分钟到3h对刺激能正常反应但活动缓慢且协调性差。到21HAT时垂死，在22HAT死亡。
    5μl 在注射后30秒内颤抖，接着后腿麻痹。到注射后20分钟时跌倒，中部和后腿麻痹但前腿仍正常行动。不恢复-在1HAT内完全麻痹，在21HAT时垂死，在22HAT时死亡。
    10μl 颤抖并开始在后腿但迅速扩散到中部和前腿失去协调，接着全部麻痹。不恢复-在22HAT垂死/死亡。
  KK-1     1μl 在注射后15秒内颤抖，接着在后腿失去活动；在注射后5分钟时前腿仍活跃地活动。在注射后20分钟时垂死。其它症状包括后背弓曲。一些在1.5-3HAT间恢复。在21HAT时，昆虫跌倒并不能翻转，到52HAT不恢复。
    5μl 注射后后腿立即失去协调并麻痹，迅速扩散到中部和前腿。在注射后5分钟内完全麻痹。在21HAT不恢复且昆虫死亡。
    10μl 在注射后30秒内迅速失去协调接着完全麻痹。随后偶尔观察到颤抖，但后来实验中昆虫一直跌倒。在21HAT不恢复并全部死亡。
  K-2     1μl 实验中观察不到异常效应
    2μl 在注射后1分钟内的异常症状包括弓背和协调运动差。注射后20分钟起观察到一些恢复，但在69HAT时昆虫死亡。
    5μl 注射后立即暂时失去协调；其它症状包括背部弓曲。到1.5HAT时昆虫似乎恢复但在45HAT时死亡。
 对照2      - 通过实验观察不到异常效应。
1成年雄体蟑螂平均体重840mg2对照：10μl 0.1M碳酸氢氨溶液表III：经过注射进Heliothis virescens幼虫6评价AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C的生物学效力
    处理1                                  死亡数(+感染的)
    24hr   48hr       72hr       96hr       120hr      144HR
AcMNPV/pVL1392/lacZ1     0/10    0/10       0/10       0/10       1/10       6/10
AcMNPV/pVL1392/sKK-0Cono C1     0/11    0/11     0/11(+3FP3，1PP4)     3/11(+1FP，3PP，4AF5)    5/11(+5FP，1PP)       11/11
    对照     0/7    0/7       0/7       0/7       0/7       1/7
1剂量＝1.5×104pfu/幼虫。2对照＝无菌水。3FP-完全软弱麻痹：昆虫垂死，不能站立，行走或翻转，仅口器和抱握器能对刺激作出反应进行有限的无力的活动，软垂且易弯。4PP-部分麻痹：身体中部/后部部分麻痹；幼虫仍能有一些运动活性并能翻转且运动协调性差。5AF-感染的：幼虫对刺激反应缓慢但不能/不愿行走或取食。6四龄幼虫：平均体重＝100mg。表IV：经过注射进Heliothis virescens幼虫6评价AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0 #2和AcMNPV野生型病毒的生物学活性
    处理1                               昆虫死亡数(+感染的)
    1     2        3       4      5     6    7
AcMNPV wt    0/6    0/6      0/6      0/6     3/6    6/6   6/6
AcUW1-PH/pVL1392/KK0-2    0/6    0/6     0/6(+1PP4，1AF5)   5/6(+1FP3)     6/6    6/6   6/6
AcUW1-PH/pVL1392/lacZ    0/7    0/7      0/7      0/7     0/7    3/7   7/7
     对照    0/5    0/5      0/5      0/5     0/5    0/5   0/5
1剂量＝～1×104pfu/幼虫。2对照＝无菌水。3FP-软弱麻痹：垂死且不能站立、翻转、行走或对刺激正常反应，生命的唯一迹象是口器/抱握器对刺激作出反应为非常无力的运动。4PP-部分麻痹：不能翻转或行走；身体中部和后部完全不动但身体前部分仍能活动且前腿和后腿仍能缩回以对刺激作出反应。5AF-感染的：幼虫不能站立，翻转并对刺激正常反应但不能协调运动。6五龄幼虫，平均体重＝300mg。表V：经口服给药评价AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0 #2和AcMNPV野生
型病毒对H.virescens幼虫的生物学效力1
    处理      剂量(PIBs/mi)                          杀伤％(+％感染2)
72hr 96hr 120hr 144hr 168hr
 AcMNPV WT     1.0×107       3       33        67       70       70
    3.3×106       0       7        17       20       20
    1.1×106       0       13        20       20       20
    3.7×105       0       0        7       10       10
    1.2×105       0       0        3       3       3
    4.1×104       0       0        4       4       4
  AcUW1-PHpVL1392sKK-0 #2     1.0×107       7     37(+30)        67       73       73
3.3×106 3 17(+10) 31 31 34
    1.1×106      4(4)     18(+7)        32       32       32
    3.7×105       3     10(+3)        14       14       14
    1.2×105      7(+3)       10      13(+3)     17(3)       20
    4.1×104       3       3        3       3       3
    对照        -       0       0        0       0       0
   处理后的时间(hr)        AcMNPV  野生型LC50 3            95％C.I.   AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0 #2LC50             95％C.I.
    96     -                  -   6.1×106   3.3×106-1.7×107
    120   7.6×106   4.4×106-1.9×107   5.2×106   2.7×106-1.6×107
    144   6.6×106   3.9×106-1.5×107   4.3×106   2.3×106-1.2×107
    168   6.6×106   3.9×106-1.5×106   4.0×106   2.2×106-1.0×107
1使用逐渐取食试验的修改版本(Hughes & Wood，1981)处理新生幼虫，30个幼虫/剂量。2( )％麻痹的幼虫。3使用标准对数剂量反应程序(Ashton，1972)评价LC50值(PIBs/ml病毒悬浮液)。
                   序列表(1)一般资料：
(i)申请人：
  (A)姓名：ZENECA Limited
  (B)街道：15 Stanhope Gate
  (C)城市：伦敦
  (E)国家：英国
  (F)邮编：W1Y6LN
(ii)发明题目：生物控制剂
(iii)序列数：18
(vi)计算机可读形式：
  (A)媒体类型：Floppy盘
  (B)计算机：IBM PC兼容性
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：269碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(ix)特征：
  (A)名称/键：CDS
  (B)位置：17..250
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TTAGATCTAA TTCACC ATG AAG CTG ACA TGT ATG ATG ATC GTG GCC GTG           49
              Met Lys Leu Thr Cys Met Met Ile Val Ala Val
                1               5                  10CTG TTC CTG ACC GCC TGG ACC TTC GCC ACT GCA GAC GAT CCC CGC AAC         97Leu Phe Leu Thr Ala Trp Thr Phe Ala Thr Ala Asp Asp Pro Arg Asn
         15                  20                  25GGC CTG GGC AAC CTG TTC TCC AAC GCC CAC CAC GAA ATG AAG AAC CCC        145Gly Leu Gly Asn Leu Phe Ser Asn Ala His His Glu Met Lys Asn Pro
     30                  35                  40GAG GCA TCC AAG CTT AAC AAG CGC TGG TGT AAG CAG TCC GGA GAG ATG        193Glu Ala Ser Lys Leu Asn Lys Arg Trp Cys Lys Gln Ser Gly Glu Met
 45                  50                  55TGT AAC CTG CTG GAC CAG AAC TGT TGT GAC GGC TAC TGT ATC GTG CTG        241Cys Asn Leu Leu Asp Gln Asn Cys Cys Asp Gly Tyr Cys Ile Val Leu60                  65                  70                  75GTG TGC ACC TAGTGACGGC CGGATCCTT                                       269(2)SEQ ID NO：2资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：78氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Lys Leu Thr Cys Met Met Ile Val Ala Val Leu Phe Leu Thr Ala1               5                  10                  15Trp Thr Phe Ala Thr Ala Asp Asp Pro Arg Asn Gly Leu Gly Asn Leu
         20                  25                  30Phe Ser Asn Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Lys Leu
     35                  40                  45Asn Lys Arg Trp Cys Lys Gln Ser Gly Glu Met Cys Asn Leu Leu Asp
 50                  55                  60Gln Asn Cys Cys Asp Gly Tyr Cys Ile Val Leu Val Cys Thr65                  70                  75(2)SEQ ID NO：3资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：84碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：TTAGATCTAA TTCACCATGA AGCTGACATG TATGATGATC GTGGCCGTGC TGTTCCTGAC             60CGCCTGGACC TTCGCCACTG CAGA                                                   84(2)SEQ ID NO：4资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：89碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GGATGCCTCG GGGTTCTTCA TTTCGTGGTG GGCGTTGGAG AACAGGTTGC CCAAGGCCGTT     60GCGGGGATCG TCTGCAGTGG CGAAGGTCC                                        89(2)SEQ ID NO：5资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：89碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CACGAAATGA AGAACCCCGA GGCATCCAAG CTTAACAAGC GCTGGTGTAA GCAGTCCGGA          60GAGATGTGTA ACCTGCTGGA CCAGAACTG                                            89(2)SEQ ID NO：6资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：73碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：AAGGATCCGGG CCGTCACTAG GTGCACACCA GTGCACACCA GCACGATACA GTAGCTACAG TAGCCGTCTG         60GTCACTAGGT TAC                                                                        73(2)SEQ ID NO：7资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：30碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：TTAGATCTAA TTCACCATGA AGCTGACATG                                                        30(2)SEQ ID NO：8资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：26碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：AAGGATCCGG CCGTCACTAG GTGCAC                                                            26(2)SEQ ID NO：9资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：45碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：(2)SEQ ID NO：10资料：(i)序列特征：
(A)长度：45碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：GATCCCGGGT ACCTTCTAGAATTCCGGAGC GGCCGCTGCA GATCT                           45(2)SEQ ID NO：11资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：19碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：TATAAATATG CCGGATTAT                                                       19(2)SEQ ID NO：12资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：49碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：TATAAATATT CCGGATTATT CATACCGTCC CACCATCGGG CGCGGATCC   49(2)SEQ ID NO：13资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：15碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：(2)SEQ ID NO：14资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：15碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：CGGATTTCCT TGAAG                                                       15(2)SEQ ID NO：15资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：282碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：GGCGCGGATC AGATCTAATT CACCATGAAG CTGACATGTA TGATGATCGT GGCCGTGCTG     60TTCCTGACCG CCTGCACCTT CGCCACTGCA GACGATCCCC GCAACGGCCT GGGCAACCTG     120TTCTCCAACG CCCACCACGA AATGAAGAAC CCCGAGGCAT CCAAGCTTAA CAAGCGCTGG     180TGTAAGCAGT CCGGAGAGAT GTGTAACCTG CTGGACCAGA ACTGTTGTGA CGGCTACTGT     240ATCGTGCTGG TGTGCACCTA GTGACGGCCG CTCCAGAATT CT                        282(2)SEQ ID NO：16资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：78氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Met Lys Leu Thr Cys Met Met Ile Val Ala Val Leu Phe Leu Thr Als1               5                   10                  15Trp Thr Phe Ala Thr Ala Asp Asp Pro Arg Asn Gly Leu Gly Asn Leu
        20                  25                  30Phe Ser Asn Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Lys Leu
    35                  40                  45Asn Lys Arg Trp Cys Lys Gln Ser Gly Glu Met Cys Asn Leu Leu Asp
50                  55                  60Gln Asn Cys Cys Asp Gly Tyr Cys Ile Val Leu Val Cys Thr65                  70                  75(2)SEQ ID NO：17资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：77氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：Met Lys Leu Thr Cys Met Met Ile Val Ala Val Leu Phe Leu Thr Ala1               5                   10                  15Trp Thr Phe Ala Thr Ala Asp Asp Ser Ser Asn Gly Leu Glu Asn Leu
        20                  25                  30Phe Ser Lys Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Lys Leu
    35                  40                  45Asn Lys Arg Cys Ile Glu Gln Phe Asp Pro Cys Glu Met Ile Arg His
50                  55                  60Thr Cys Cys Val Gly Val Cys Phe Leu Met Ala Cys Ile65                  70                  75(2)SEQ ID NO：18资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：77氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：Met Lys Leu Thr Cys Met Met Ile Val Ala Val Leu Phe Leu Thr Alal               5                   10                  15Trp Thr Phe Val Thr Ala Asp Asp Ser Gly Asn Gly Leu Glu Asn Leu
        20                  25                  30Phe Ser Lys Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Asn Leu
    35                  40                  45Asn Lys Arg Cys Ala Pro Phe Leu His Pro Cys Thr Phe Phe Phe Pro
50                  55                  60Asn Cys Cys Asn Ser Tyr Cys Val Gln Phe Ile Cys Leu65                  70                  75

Claims (14)

1.一种用作昆虫控制剂的重组杆状病毒，其具有包含多角体蛋白基因和异源基因的基因组，它表达一种杀虫蛋白质，其中多角体蛋白基因和异源性基因不在相同启动子的控制下且位于基因组中以便与活的野生型杆状病毒经重组事件产生的病毒后代不能同时保留多角体蛋白基因和异源性基因的表达。
2.根据权利要求1的重组杆状病毒，其中与野生型病毒基因组的一个区域同源的基因组中的至少一个区域在多角体蛋白基因和异源性基因之间出现。
3.根据权利要求1和2中任意一项的重组杆状病毒，其中多角体蛋白基因和异源性基因位于基因组的两个区域之后，其中的区域与野生型病毒基因组的区域同源，且该位置缺乏存在于野生型病毒同源区之间的一个必需基因。
4.根据权利要求1至3中任意一项的重组杆状病毒，其中多角体蛋白基因在p10启动子的控制下。
5.根据前面任一权利要求的重组杆状病毒，其中异源基因在多角体蛋白启动子的控制下。
6.权利要求前面任一权利要求的重组杆状病毒，其中基因组修饰成失活或缺失p10基因。
7.根据前面任一权利要求的重组杆状病毒，其中杆状病毒基因组的至少10％分开多角蛋白基因和异源性基因。
8.根据权利要求7的重组杆状病毒，其中分离间隔是基因组的大约12％。
9.根据前面权利要求中任意一项的重组杆状病毒，其中多角体蛋白基因和异源性基因以至少13千碱基对分离。
10.根据权利要求9的重组杆状病毒，其中分离间隔是大约15千碱基对。
11.根据前面任意一项的重组杆状病毒，它具有与图6b所示的重组体类似的基因组结构和特征。
12.一种后代杆状病毒，它来自根据前面权利要求中任意一项的杆状病毒重组体。
13.根据前面任意一项权利要求的重组杆状病毒的用途，其经过在重组病毒和野生型病毒之间的重组事件来防止或减少活的并保留多角体蛋白和异源性基因的表达的病毒后代的生产。
14.一种消灭某一地区的害虫的方法，其包含用根据权利要求1到12中任意一项的重组杆状病毒处理害虫或该地区。
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CN1064407C (zh) * 1997-11-24 2001-04-11 中山大学 杆状病毒全期启动子盒及含该全期启动子盒的载体系统

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