KR100491970B1

KR100491970B1 - 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 및 이를 이용한 목적 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR100491970B1
Application number: KR10-2002-0036063A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 서정현; 리린
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2002-06-26
Filing date: 2002-06-26
Publication date: 2005-05-27
Also published as: KR20040001008A

Abstract

본 발명은 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체, 이를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 대장균 세포, 상기 형질전환 대장균 세포를 이용한 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 제조방법, 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 이용한 목적 단백질의 제조방법 및 목적 단백질의 안정화 방법에 관한 것이다.

Description

배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 및 이를 이용한 목적 단백질의 제조방법{A fusion protein of baculoviral polyhedrin protein-target protein and method for producing the target protein using the same}

본 발명은 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체, 이를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현벡터, 이 벡터에 의하여 형질전환된 숙주세포, 상기 융합체의 제조 방법, 상기 융합체를 이용한 목적 단백질의 제조방법 및 목적 단백질의 안정화 방법에 관한 것이다.

배큘로바이러스의 다각체단백질은 자연환경에서 바이러스의 유전정보를 안전하게 보존하기 위해서, 배큘로바이러스를 다각체(polyhedrin) 입자 안에 유지함과 동시에 일반적인 자연환경에서 안정한 능력을 가지고 있다. 상기 다각체 입자는 다수, 보통 12개의 단위 다각체 단백질이 모여 결정을 이루고 있다. 이들 다각체 입자는 곤충의 체내에 삽입되었을 경우, 다각체단백질이 곤충 중장의 조건인 강 알칼리에 의하여 용해되고, 특이 알칼리성 단백질분해효소에 의하여 분해되면서, 배큘로바이러스가 다각체로부터 분리되어 나와 곤충을 감염시키게 한다(T. Suzuki 등, 1997, Journal of Virology 78, 3073-3080; E. Kotani 등, 1999, Insect Molecular biology 8, 299-304). 본 발명은 이러한 특이한 성질을 가지고 있는 배큘로바이러스 유래의 다각체단백질이 대장균에서도 거의 같은 물성을 가지고 응집체형상으로 발현됨을 이용하여(C. Lavallee 등, 1993, Protein Expression and Purification 4, 570-579), 재조합 단백질의 생산을 위한 융합 파트너로서의 응용에 관한 것이다.

종래 미국특허 제4,870,023호에는 외래 아미노산 서열과 융합되어 결정화에 참여하는 다각체 단백질의 일부분을 포함하고, 다른 다각체 단백질과 결정화되어 재조합 폐색체(occlusion body)를 형성할 수 있는 다각체 융합 단백질이 개시되어 있었다. 그러나, 이러한 다각체 융합 단백질은 폐색체를 형성할 수 있는 성질을 가진 것에 한정되며, 폐색체의 형성에 참여하는 것에 관한 것이었다. 또한, 상기 다각체 단백질의 발현은 배큘로바이러스의 비필수 영역에서 다각체 유전자를 치환시켜, 배큘로바이러스 내에 삽입된 외래 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 포함하는 재조합 배큘로바이러스에 의하여 이루어진다. 또한, 상기 재조합 배큘로바이러스를 통하여 융합 단백질을 생산하기 위하여는 곤충세포를 배양하고, 바이러스를 접종하는 과정이 필요하여 비용이 많이 든다.

그러므로, 재조합 배큘로바이러스 및 곤충세포를 배양하는 단계를 거치지 않고, 저비용으로부터 다각체 융합 단백질을 생산할 수 있는 시스템의 계발이 요구되고 있었다.

한편, 대장균 발현시스템은 외래단백질 생산에 많은 장점을 가지고 있는 단백질 생산시스템이다. 대장 발현시스템은 다른 시스템에 비해서 많은 연구가 수행되어 왔고, 낮은 비용으로도 높은 성장률로 배양할 수 있으며, 높은 수율로 단백질을 발현시킬 수 있다. 또한, 다양한 종류의 대장균 균주들, 프로모터 그리고 외래단백질을 발현시키기에 적합한 벡터들이 연구되어 왔다. 대장균 시스템에서 재조합 단백질은 단백질의 물리화학적 특성에 따라 용해성 형태 또는 응집체 형태로 발현되며 각각 장단점을 가지고 있다. 용해성 형태로 발현되는 경우, 일반적으로 생물학적 활성을 가진다는 장점이 있으나, 분리정제가 쉽지는 않고 단백질분해효소에 의한 공격을 쉽게 받을 수 있다는 단점을 가진다. 이에 반하여 응집체(inclusion body) 형상으로 발현되는 경우, 생물학적 활성을 가지지 못하므로 분리정제 후 재접힘(refolding) 공정을 수행하여야 한다는 단점을 가지나, 일반적으로 단백질분해효소에 강하고 분리정제가 쉽다는 장점을 가진다. 특히, 응집체 형상의 단백질은 다른 정교한 정제를 수행하지 않고도 간단하게 높은 순도(purity)로 분리될 수 있다. 특히, 생산하고자 하는 외래 단백질이 숙주세포인 대장균에 해로운 경우, 숙주세포에 주어지는 부담으로 인하여 고효율로 외래 단백질을 생산할 수 없게 된다. 그러므로, 이와 같은 외래 단백질을 대장균 발현 시스템에서 발현시키기 위하여는 숙주세포에 해로운 영향을 주지 않도록 하기 위하여, 응집체의 형태로 발현시키도록 하는 방법의 개발이 요구되고 있다.

이에 따라 본 발명자들은 배큘로바이러스의 다각체단백질을 이용하여 대장균에서 응집체를 형성시킬 수 있는 융합단백질에 관한 연구를 수행한 연구 결과, 배큘로바이러스 유래의 단위 다각체 단백질과 목적 단백질을 융합한 융합 단백질이 대장균에서 발현되는 경우, 응집체의 형태로 발현되어 숙주세포에 해로운 영향을 주지 않아 대량으로 발현시킬 수 있음을 발견하였다. 또한, 융합되어 있는 외래 단백질이 다각체 단백질에 의하여 안정화되고, 배큘로바이러스에서 생성되는 다각체단백질의 물성과 같이 다각체단백질 부분이 알칼리 조건에서 용해되고 곤충 애벌레 중장액의 알칼리성 단백질분해효소에 의하여 선택적으로 분해되어 분리 정제의 면에서도 유리함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 배큘로바이러스로는 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV), Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus(BmNPV) 및 Heliothis zea nuclear polyhedrosis virus(HzNPV) 등이 있다. 이 중에서도 AcNPV가 곤충세포에서 재조합 단백질 생산을 위한 시스템으로 가장 많이 사용되고 있다. AcNPV는 나비목의 파밤나방(Spodoptera exigue), 배추좀나방(Plutella xylostella) 및 담배거세미나방(Spodoptera litura), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 및 배추흰나비(Pieris rapae)와 같은 해충에 특이적으로 작용한다. AcNPV의 게놈은 약 128kb 길이이며, 원형의 이중 DNA로 이루어져 있다. 감염 중에는 세포외 바이러스 입자(extracellular virus particle; ECV)와 폐색 바이러스 입자(occluded virus particle; OV)의 두 가지 형태가 나타난다. OV는 다각체단백질에 배큘로바이러스가 둘러싸여져 보호되는 형태이다. 곤충세포가 배큘로바이러스에 감염되면, 약 1g/liter의 다각체단백질이 발현되는데, 이 양은 전체 단백질의 약 50%를 차지하는 많은 양이다. 세포내에 발현된 다각체단백질은 결정을 이루는 구조로 생성되는데 이를 다각체 입자라고 부른다. 결정화된 다각체 입자는 아직 밝혀지지 않은 기작에 의하여 배큘로바이러스 입자를 포함하게 되며, 이로써 세포가 분해되어 세포 밖 환경으로 나갔을 때 배큘로바이러스를 자연환경에서 보호하는 기능을 가지게 된다. 다각체단백질에 의하여 보호되는 배큘로바이러스 입자는 나뭇잎 등에 붙어 있다가 곤충이 나뭇잎을 먹을 때, 곤충의 중장으로 들어가 중장의 알칼리 조건과 알칼리성 단백질 분해효소에 의하여 다각체단백질이 용해되고 분해될 때 빠져나와 곤충세포를 감염한다.

본 발명의 목적은 대장균에서 응집체의 형태로 발현될 수 있는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 융합체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 세포를 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 상기 형질전환 세포는 바람직하기로는 대장균 세포이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 세포를 배양하고, 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 응집체의 형태로 분리하는 단게를 포함하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 형질전환 세포는 바람직하기로는 대장균 세포이다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적 단백질을 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 응집체의 형태로 분리하는 단게를 포함하는 목적 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적 단백질에 다각체 단백질을 융합시켜 목적 단백질을 안정화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체는, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 것을 특징으로 한다. 상기 목적 단백질은 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 실시예에서 보인 녹색형광단백질, 생물농약으로 사용될 수 있는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt) 독성단백질을 포함하는 살충효과를 지니는 모든 단백질 및 항생펩타이드나 DNA 제한효소 등 대장균 숙주세포의 성장에 저해를 일으키는 의약용 및 산업용 단백질이 포함된다. 바람직하기로는, 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체는 목적 단백질이 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 녹색형광단백질 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 바실러스 투린지엔시스 독성 단백질인 것이다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 것을 특징으로 한다. 바람직하기로는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 녹색형광단백질 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 바실러스 투린지엔시스 독성 단백질을 코드하는 것을 포함하는 것이다.

또한, 본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 발현용 벡터는, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 발현 벡터는 적당한 숙주세포에서 상기 융합체를 발현할 수 있는 것이면, 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포 및 식물세포용 발현벡터 중 어느 것이라도 포함될 수 있다. 대장균용 발현벡터로서, 예를 들면 에스케리치아 콜라이에서 복제할 수 있는 벡터인 pET3, pET11(이상 Stratagene사제), pBAD, pThioHis, pTrcHis(이상, Invitrogen사제), pKK223-3, pGEX2T(이상, Amersham Pharmacia Biotech사제) 이외에 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(어느것이나 Boehringer Mannheim사제로부터 시판), pSE280(Invitrogen사제), pGEMEX-1(Promega사제), pQE-8(QIAGEN사제), pKYPl0[일본 공개특허공보 제(소)58-110600호], pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)], pLSA1[Agric. Biol, Chem., 53, 277(1989)], pGEL1[Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pBluescript Ⅱ SK(-)(Stratagene사제), pTrs30[에스케리치아 콜라이 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)로부터 조제], pTrs32[에스케리치아 콜라이 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 조제], pGHA2[에스케리치아 콜라이 IGHA2(FERM BP-400)로부터 조제, 일본 공개특허공보 제(소)60-221091호], pGKA2[에스케리치아 콜라이IGKA2(PERM BP-6798)로부터 조제, 일본 공개특허공보 제(소)60-221091호], pTerm2(US 4686191, US 4939094, US 5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pCl94, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392(1990)], pGEX(Pharmacia사제), pET 시스템(Novagen사제) 등을 들 수 있다. 가장 바람직하기로는 pMPL102(기탁번호 KCTC 10243BP: 2002년 5월 8일 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁됨)이다.

또한, 본 발명의 형질전환 숙주세포는, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리펩티드를 포함하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 발현용 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 한다. 상기 숙주세포로서는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 목적하는 융합체를 발현할수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 상기 숙주세포는, 바람직하기로는 대장균이다.

본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 제조방법은, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리펩티드를 포함하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 발현용 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 배양하여, 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 응집체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 분리단계는 단백질의 분리에 사용되는 통상적인 분리 방법, 예를 들면, 원심분리, 여과, 염석 및 크로마토그래피법 등이 사용될 수 있다. 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 제조방법은, 바람직하기로는, 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 응집체를 원심분리를 이용하여 용해 단백질로부터 분리하는 것이다.

본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 이용한 목적 단백질의 제조방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리펩티드를 포함하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 발현용 벡터로 형질전환된 형질전환 숙주세포를 배양하여, 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 응집체를 분리하는 단계 및

(b) 얻어진 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 응집체를 다각체 부분만을 특이적으로 분해시키는 효소 또는 다각체 단백질과 목적 단백질의 경계 부위를 절단하는 효소를 이용하여 소화시킨 후, 목적 단백질만을 분리하는 단계.

상기 (b) 단계에 있어서, 다각체 부분만을 특이적으로 분해시키는 효소 또는 다각체 단백질과 목적 단백질의 경계 부위를 절단하는 효소는, 곤충 중장액 유래의 특이 알칼리성 단백질 분해효소 또는 키모트립신인 것이 바람직하나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 목적 단백질의 안정화 방법은, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질을 목적 단백질의 N 말단에 부착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기에서, 상기 다각체 단백질을 목적 단백질을 N 말단에 부착시키는 단계는, 다각체 단백질의 C 말단을 목적 단백질의 N 말단에 화학적 방법, 생물학적 방법 또는 화학적인 방법에 생물학적인 방법을 조합하여 이루어질 수도 있다. 바람직하기로는, 서열번호 3의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 목적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결하여 얻어지는 융합체를 코드하는 유전자를 숙주세포 중에서 발현시켜서 얻는 것이다. 여기에서, 상기 목적 단백질은 안정화가 필요한 단백질이면 어느 것이나 상관없으나, 바람직하기로는 자외선에 불안정한 단백질이다. 예를 들면, 상기 목적 단백질에는 녹색형광단백질 또는 바실러스 투린지엔시스 독성 단백질이 포함될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 발명의 실시예에서는 목적 단백질로서, 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 발현 여부를 쉽게 측정할 수 있으며, 많은 종류의 단백질분해효소에 어느 정도 안정한(stable) 해파리 유래의 녹색형광단백질(GFP : green fluorescent protein)을 사용하여, 대장균내에서 상기 융합체의 발현양상을 알아보았다. 해파리 유래의 녹색형광단백질은 기존에 보고된 바와 같이, 세포를 깨거나 따로 분리할 필요 없이 UV(자극 파장: 395nm, 방사 파장: 509nm)에 의해서 쉽게 그 발현정도를 측정할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 대장균내에서 발현되었을 경우에도 재조합 단백질의 발현정도를 쉽게 측정할 수 있다(M. Chalfie 등, 1994, Science 263, 802-805).

실시예1: 다각체단백질-녹색형광단백질 융합단백질 생산을 위한 벡터 제작

먼저, pTrcHisC 벡터(Invitrogen, 미국)의 경우, 설계한 인서트의 제한효소위치가 너무 가까워 이용하기가 어려웠기 때문에, pSE420 벡터(Invitrogen, 미국)에서 BamHI과 PstI 제한효소자리를 이용하여 수퍼링커(superlinker) DNA 단편을 잘라내어 이를 pTrcHisC 벡터에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 벡터를 pMPL100(4543 bps)이라 명명하였다(도 1, 도 4A). 녹색형광단백질을 코드하는 GFPuv 유전자(707 bp)는 pGFPuv 벡터(Clontech, 미국)에서 LL103(상류), LL104(하류) 프라이머(도 5 참조)를 이용하여 PCR 반응을 통하여 대량 증폭시켜서 얻어낸 후, pMPL100 벡터에 BglII와 PstI의 제한효소자리를 이용하여 삽입하였다. LL104 프라이머의 설계 시 녹색형광단백질의 경우에는 마지막에 위치하기 때문에 번역을 마칠 수 있도록 정지 코돈(TAA)을 첨가하였다. 이렇게 하여 만들어진 벡터를 pMPL101(5131bp)이라 명명하였다(도 2). 다각체단백질을 코드하는 다각체(polyhedrin) 유전자(751bp)는 AcNPV 배큘로바이러스 염색체에서 LL101(상류)과 LL102(하류) 프라이머(도 5 참조)를 이용하여 PCR기법을 통하여 얻어낸 후, pMPL101 벡터에 NheI과 BglII의 제한효소자리를 이용하여 삽입하였다. LL102 프라이머의 설계 시 다각체단백질의 경우는 융합 파트너로서의 역할을 가지고 계속적인 번역이 수행되도록 하여야 하므로 정지 코돈을 첨가하지 않았다. 이렇게 만들어진 벡터를 pMPL102(5795bp)라 명명하고(도 3), 2002년 5월 8일 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 KCTC 10243BP). pMPL102 벡터는 널리 이용되는 대장균 발현용 프로모터인 trc 프로모터를 포함하고 있어, IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside, Sigma, 미국)를 이용하여 발현을 유도할 수 있다.

실시예 2: 대장균 형질전환체(transformant)의 제조

통상적으로 클로닝으로 많이 쓰이는 대장균 TOP10(Invitrogen, 미국)의 경우와 단백질 발현용으로 사용된 대장균 BL21의 경우 모두, CaCl₂ 버퍼를 사용, 컴피턴트(competent) 세포를 만든 후 열충격(42℃에서 2분간 방치) 방법에 의해 플라스미드를 숙주세포에 넣는 방법을 사용하였다. 형질전환된 콜로니의 선별은 사용된 플라스미드의 특성상 앰피실린(ampicillin, Sigma)을 사용하여 수행하였다.

실시예 3: 재조합 대장균의 배양 및 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 발현 생산

상기 실시예2에서 얻어진 pMPL102 벡터로 형질전환된 BL21 균주를 이용하여, 단각체 단백질-녹색형광단백질 융합체를 발현시키기 위한 배지로서 M9(6g/liter Na₂HPO₄, 0.5g/liter NaCl, 1g/liter NH₄Cl, 1% 포도당, 2mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂) 배지를 이용하였다. M9 배지는 세포가 자라는데 필요한 최소한의 영양분이 들어있는 배지로 LB 배지와는 달리 투명하기 때문에 분석을 하는데 배지의 영향을 최소화 할 수 있다. 배양실험을 하기 위해서 50ml 멸균된 튜브에 8ml의 LB 배지를 넣고(400㎍의 앰피실린 첨가) 12시간 키운 배양액을 100ml의 M9배지가 들어있는 500ml 플라스크에 넣어 접종하였다. 단백질의 발현을 위하여 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.5가 되었을 때, 유도물질인 IPTG를 첨가(1mM)하여 재조합 단백질인 다각체 단백질-녹색형광 단백질 융합체의 발현을 유도하였다(도 6).

그 결과, 녹색형광단백질만을 발현시키는 pTrcGFPuv 벡터로 형질전환된 대장균에 비하여, 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체를 발현하는 대장균이 더 높은 세포의 성장을 보임을 알 수 있었다(도 6). 이는 재조합 단백질이 용해성 형태로 발현되는 경우보다, 응집체 형태로 발현되는 것이 숙주세포의 성장에 저해를 적게 일으키는 결과로 보여진다.

실시예 4: 다각체 단백질-녹색형광단백질의 융합체 발현 측정 및 분석

다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 발현은 목적 단백질인 녹색형광단백질의 특성을 이용하여 형광강도와 실제 발현양의 두 가지를 측정하였다. 발현강도는 실시간으로 매시간 형광광학측정기(fluorescence spectrophotometer; Shimazu, 일본)를 이용하여 조사(excitation) 395nm, 방출(emission) 509nm의 조건에서 측정하였다(도 7). 실제 발현의 정량분석을 SDS-PAGE와 웨스턴블랏(Western blot) 방법을 수행하였다(도 8). 매시간 마다 배양액으로부터 얻은 1ml의 시료를 4℃, 10,000rpm에서 10분간 원심분리 후, 상등액을 제거한 전세포 시료를 -80℃에서 보관하여 두었다가 분석 시 사용하였다. 전세포 시료를 적절한 희석을 통하여 600nm의 흡광도를 1로 맞추고, 이를 SDS-PAGE용 버퍼(0.5M Tris-HCl(pH 6.8), 10% glycerol, 5% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 0.25% bromophenol blue) 100㎕에 희석 후, 100℃에서 5분간 끓여 변성시켰다. SDS-PAGE의 경우 시료를 15% SDS-폴리 아크릴아마이드 겔에 전기영동한 후, 쿠마시블루(Coomasie blue) 염색 또는 실버 염색(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 웨스턴블랏의 경우는 시료를 순수한 녹색형광단백질(Clontech)과 함께 15% SDS-폴리 아크릴아마이드 겔에 전기영동한 후, 나이트로셀룰로즈 막에 15V전압 하에 이동시켰다. 단백질이 전이된 나이트로셀룰로즈 막을 녹색형광단백질용 항체(Boche, 독일)를 이용, 녹색형광단백질을 검출하고 발색반응 후 영상분석소프트웨어(Gel-Pro Analyzer, Media Cybernetics, 미국)를 이용하여 정량화하였다(도 9).

그 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 녹색형광단백질 유전자만을 포함하는 pTrcGFPuv 벡터를 갖는 대조균주 대장균의 경우, 녹색형광단백질이 대부분 용해성 형태로 발현되므로 형광강도는 발현유도 후 계속적으로 증가되었다. 이에 비하여 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체를 발현하는 대장균의 경우, 형광강도가 어느 정도 측정은 되나 비교균주와 비교하면 매우 미미하게 나타남으로써, 응집체 형성에 의하여 녹색형광단백질도 대부분 불활성인 상태로 발현됨을 알 수 있었다.

발현유도 후, 시간에 따른 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 발현양상을 SDS-PAGE를 통하여 분석한 결과, 다른 대장균 단백질에 비하여 약 58kDa 크기 단백질이 매우 진한 밴드로 과발현됨을 알 수 있었다(도 8, 위쪽 도면). 시간에 따른 정량적인 발현양을 조사하기 위하여, 녹색형광단백질 항체를 이용한 웨스턴블랏을 수행하고(도 8, 아래쪽 도면), 정량화한 발현양을 그래프로 나타내었다(도 9).

그 결과, 발현유도 후 2시간 이후 급격히 발현이 되다가 거의 일정하게 유지되고, 8시간 이후에는 감소하는 양상을 나타내었다.

실시예 5: SDS-PAGE에 의한 응집체 형태로의 발현 여부 확인

실제로 다각체단백질-녹색형광단백질의 융합체가 대장균에서 응집체로 형성되는 지를 직접적으로 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다(도 10). 전세포 시료와 세포파쇄(초음파 방법의 이용) 후 세포 파쇄물과 상등액으로 나눈 시료를 각각 실버 염색을 통하여 분석하였다. 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포 파쇄물에는 다각체 단백질-녹색형광 단백질 융합체 밴드가 진하게 검출되었으나, 상등액의 경우에는 거의 매우 미미한 양만이 검출되었다. 이는 다각체 단백질-녹색형광 단백질 융합체가 대장균에서는 응집체의 형태로 발현됨을 나타내는 것이다.

실시예 6: 현미경을 통한 대장균내의 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 관찰

2,000배의 확대율을 가지는 형광현미경(Olympus, 일본)을 사용하여 대장균을 관찰하였다(도 11). 도 11의 왼쪽의 그림과 같이, 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체를 발현시키는 대장균의 경우, 응집체의 형성이 관찰되었다. 비록 형광의 발현이 작아 현미경에 부착된 디지털 카메라로 이미지를 찍는 것은 성공하지 못하였으나, 390nm 영역의 자외선을 쪼였을 경우, 응집체가 어느 정도는 형광을 띄움으로써 발현시키고자 한 다각체단백질-녹색형광단백질의 융합체가 제대로 응집체를 형성함을 확인할 수 있었다. 또한, 대장균을 알칼리 용액에 넣었을 때, 도 11의 오른쪽과 같이, 응집체를 형성하였던 다각체단백질-녹색형광단백질의 융합체가 사라짐을 관찰할 수 있었다. 이로부터 간접적으로나마 대장균에서 응집체로 형성된 다각체단백질도 곤충세포에서 생성되는 다각체단백질처럼 알칼리 조건에서 용해가 이루어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 분리

발현된 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체는 대장균내에서 응집체 형태로 발현이 되기 때문에, 세포를 용해시킨다고 해서 분리되지 않는다. 즉, 응집체 형상으로 발현이 되었을 경우, 원심분리기로 상등액과 세포 파쇄물을 분리하면 파쇄물과 함께 나오기 때문에 응집체 분리 방법을 이용하여 분리해 낼 수 있다. 세포 파쇄물의 분리는 다음의 과정을 통하여 수행하였다. 먼저, 4℃, 5500rpm으로 미리 무게가 측정된 튜브에 배양액을 넣고, 약 15분간 원심분리하였다.

원심분리 후, 얻어진 상등액은 버리고, 세포의 무게를 측정하고 세포의 무게당 3ml의 용해버퍼(50mM Tris-Cl, pH 8.0; 1mM EDTA, pH 8.0; 100mM NaCl)를 넣고 부드럽게 세포조각을 소생시켰다. 세포 각각의 무게당 4㎕의 100mM PMSF(단백질분해효소 활성 저해제; Sigma)를 넣고, 10mg/ml 의 리소자임(lysozyme)을 80㎕ 넣었다. 약 20분 동안 부드럽게 저어주면서(일반적으로 이 과정에서 PMSF를 넣었지만, 단백질 분해효소 절단 실험의 경우에는 단백질 분해효소 활성 저해제의 영향이 없어야 하기 때문에 PMSF를 첨가하지 않았다) 세포 무게당 4mg의 데옥시콜릭산(deoxycholic acid)를 넣어주었다. 앞의 과정은 모두 4℃에서 이루어졌다. 추출물을 더 이상 끈적거리지 않을 때까지 37℃ 배양기에 넣어 두었다(점도가 커지는 경우는 1mg/ml DNase I을 20㎍ 넣었다).

세포 파쇄물로부터의 응집체의 분리는 다음의 과정을 통하여 수행하였다. 최고속도로 원심분리하여 상등액을 버리고 1ml의 물에 현탁시켰다. 다시 최고속도로 원심분리한 후 상등액을 버리고 0.1M Tris-Cl(pH 8.5) 버퍼로 씻어주었다(실험에서는 융합체의 변성 및 용해를 방지하기 위해서 우레아를 버퍼에 넣지 않았다). 위 과정을 여러 번 반복하여 응집체만을 되도록 높은 순도로 분리되도록 하였다.

실시예 8: 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 응집체의 알칼리 용액에서의 용해

실시예7에서와 같이, 세포파쇄에 의하여 분리된 응집체 형상의 다각체 융합단백질의 알칼리 조건에서의 용해를 조사하였다(도 12). 도 12a에서 볼 수 있는 바와 같이, pH 7.5의 PBS 버퍼에 현탁시킨 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체는 용해가 되지 않고 침전되었으나, pH 12의 버퍼에 넣었을 경우 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체는 매우 빨리 용해되는 것을 볼 수 있었다. 이는 대장균에서 응집체 형상의 융합단백질로 발현된 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체가 배큘로바이러스 유래의 천연 다각체단백질과 같이 알칼리 조건에서 분해되는 물성을 가짐을 의미하는 것이다. 각 pH에 따른 용해 정도를 600nm의 흡광도를 이용하여 측정한 결과, 알칼리 조건에서 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체는 거의 용해되어 용해성 상태로 되는 것을 확인할 수 있었다(도 12b).

분리된 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체를 용해 전과 용해 후의 단백질의 크기에 차이가 있는지를 알아보기 위하여 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 분리된 시료는 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 응집체가 주된 밴드(약 60% 이상의 분리순도)로서 제대로 분리되었음이 확인되었다. 이는 녹색형광단백질용 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석에서도 확인되었다(데이터는 나타내지 않았음). 같은 양의 분리된 다각체 단백질-녹색형광단백질 응집체를 pH 12의 알칼리 버퍼에서 용해시킨 경우, 밴드 위치의 변화는 없었으나 융합체의 농도가 진해짐을 확인 할 수 있었다.

실시예 9: 특이 단백질 분해효소를 이용한 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 절단

대장균에서 발현된 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체에서 다각체단백질 부분이, 배큘로바이러스 유래의 다각체단백질 자체가 가진 물성에 의하여 선택적으로 특이 알칼리성 단백질분해효소에 의하여 분해되는지를 알아보기 위하여, 곤충 중장액을 이용하여 다각체 다각체 단백질-녹색형광단백질의 절단실험을 수행하였다(도 14). 이용된 곤충은 배추좀나방으로서, 그 알이 깨어 애벌레가 약 4령(알에서 부화후 4일) 정도 되었을 때, 중장액 분리를 위하여 이용하였다. 배추좀나방 애벌레는 크기가 매우 작으므로(약 5mm) 중장액만을 선택적으로 분리가 거의 불가능하였으므로, 애벌레를 으깬 상등액을 중장액 시료로 간주하기로 하였다. 특이 알칼리성 단백질 분해효소가 들어 있는 중장액 시료의 준비를 위하여, 애벌레(약 50마리)를 자르고, 즉시 냉각된 PBS 버퍼(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄) 5ml에 넣고 균질기로 으깼다. 원심분리하여 상등액만을 중장액 시료로 간주하고 이용하였다. 절단실험을 위하여, 분리한 응집체 형상의 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체를 강알칼리 상태에서 3시간 동안 용해시킨 3ml 시료를 200mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 약 1/8로 희석을 시킨 다음, 애벌레 중장액 300㎕를 넣고 반응시켰다. 절단실험을 마친 후에는 단백질 분해효소 활성 저해제인 100mM PMSF를 5㎕넣어서 반응을 정지시켰다.

그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 중장액 처리 후 15분과 3시간의 시료를 실버 염색을 이용한 SDS-PAGE 분석(도 14, 왼쪽 도면)을 하였을 경우, 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체가 분해되어 사라짐을 알 수 있었다. 절단 된 아미노산 절편들은 밴드 아랫부분의 진한 부분으로 확인할 수 있었다. 대신에 녹색형광단백질 밴드가 나타나는 것을 볼 수 있었다. 확인을 위하여 웨스턴블랏 분석(도 14, 오른쪽 도면)을 수행한 결과, 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체는 반응 15분 정도에서에서 대부분이 분해되며 3시간에서는 모두 사라짐을 알 수 있었고, 다각체단백질 부분의 빠른 분해에 의하여 어느 정도 단백질분해효소에 저항할 수 있는 녹색형광단백질 부분만이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 반응 15분에서 가장 진한 녹색형광단백질 밴드가 검출되었으나, 3시간 정도 되었을 경우 중장액의 단백질분해효소에 의하여 녹색형광단백질도 어느 정도는 분해됨을 알 수 있었다.

곤충의 단백질분해효소의 성분이 키모트립신(chymotrypsin)과 비슷한 물성을 가지고 있다는 연구 결과(C. Novillo 등, 1997, Archives of Insect Biochemistry and Physiology 36, 181-201; M.J. Lee 등, 1995, Insect Biochem. Molec. Biol. 25, 49-61; K.A. Johnston 등, 1995, Insect Biochem. Molec. Biol. 25, 375-383)를 토대로, 키모트립신 단백질분해효소를 이용한 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체의 절단실험을 수행하였다(도 15). 키모트립신은 페닐알라닌, 트립토판 그리고 타이로신과 같은 아미노산이 존재할 경우, 펩타이드의 결합을 자르는 단백질 분해효소이다.

절단 실험 과정은 곤충 중장액을 이용한 과정과 동일하였다. 사용된 키모트립신의 농도는 0.2mg/ml이었다. 도 14의 경우와 마찬가지로, 도 15에서도 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체 밴드는 다각체단백질 부분이 키모트립신 처리에 의하여 분해됨에 따라 사라짐을 알 수 있었고, 녹색형광단백질 부분이 나타남을 볼 수 있었다. 키모트립신의 경우, 3시간의 오랜 반응 후에도 녹색형광단백질 밴드는 거의 감소하지 않고 유지되는 것을 볼 수 있었다. 이는 녹색형광단백질이 키모트립신 분해에 대한 더 큰 저항성을 가지고 있음을 암시한다.

실시예 10: 다각체 단백질-녹색형광단백질의 자외선에서의 안정성 실험

배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과의 융합하는 경우, 목적 단백질의 안정성이 증가되는지를 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 녹색형광단백질과 다각체단백질-녹색형광단백질의 융합체를 각각 1,200J/m²의 자외선을 조사하면서 2분씩 샘플링하면서 단백질의 분해 정도에 따른 재조합 단백질의 안정도를 측정했다(도 16). 채취된 샘플들은 녹색형광단백질의 항체로 웨스턴블랏을 수행하였다(도 16a). 그리고, 영상분석소프트웨어를 이용하여 정량 분석하여 그래프로 나타내었다(도 16b).

그 결과, 시간이 지날수록 단백질의 양이 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 또한, 다각체단백질과의 융합된 상태로 있을 경우보다는 녹색형광단백질만의 경우, 그 분해 정도가 더 크다는 것을 알 수 있었다. 약 80%의 녹색형광단백질이 자외선 노출 8분만에 분해되는 것에 비하여 다각체 융합단백질의 경우 약 40%만이 분해되는 것으로 나타났다. 다시 말해서, 다각체단백질이 목적 단백질인 녹색형광단백질이 자외선에 의하여 분해되는 것을 방지하는 보호기능한다. 이는 다각체단백질을 목적 단백질에 융합시키므로써, 목적 단백질을 안정성화시킬 수 있음을 의미한다.

상기 실시예 5, 6, 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 배큘로바이러스 유래의 다각체단백질을 융합체 중의 한 파트너로 이용하여 대장균에서 발현하였을 경우, 응집체의 형성이 유도되었다. 응집체 형상으로 발현이 되기 때문에 재조합 단백질 본래의 활성이 크게 감소하게 된다(도 7). 이는 단백질 본래의 구조를 제대로 갖추지 못하기 때문에 활성이 감소하게 되는 것으로 보여진다. 이러한 점은 대장균 내에서 생물학적 활성을 억제해야만 하는 세포에 커다란 저해를 주는 재조합 단백질들을 다각체 단백질과 융합하여 발현시켰을 경우, 세포에 많은 영향을 미치지 않으면서도 쉽게 얻어낼 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 대장균 내에서 용해성 상태로 발현이 되었을 경우, 분리정제의 과정뿐만 아니라 농축을 시켜서 이용해야 하는 경우, 상당한 문제점이 발생하게 된다. 그러나, 본 발명에서 생산된 융합단백질의 경우, 응집체 형태로 발현되기 때문에 분리정제가 쉽고 농축시키는 과정도 쉽게 해결할 수 있다. 그 결과 높은 순도의 목적 단백질을 얻어낼 수 있었다(도 13).

도 12, 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 8의 강알칼리 조건에서 세포파쇄 후 분리된 응집체 형상의 다각체 단백질-녹색형광단백질 융합체는 용해됨으로써 융합 파트너인 다각체단백질이 대장균에서도 배큘로바이러스에서 발현되는 경우와 같은 물성을 가짐을 확인할 수 있었다. 또한, 도 14, 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 9의 알칼리성 단백질 분해효소와의 반응 후 다각체단백질 부분이 선택적으로 분해제거됨으로써 목적 단백질인 녹색형광단백질만 남는 것을 통하여, 대장균에서 생산되는 다각체단백질의 물리, 화학적 성질은 크게 변하지 않음을 입증하였다.

또한, 상기 실시예 10의 매우 강한 자외선에 의한 안정성 실험으로부터 다각체단백질과 융합된 목적 단백질이 본래의 목적 단백질만의 경우에 비교하여, 안정성이 증대되는 것을 알 수 있었으므로 다른 자연환경에서도 안정성이 어느 정도는 유지가 될 것으로 생각된다. 이러한 결과는 자외선 등의 외부환경에 약한 목적 단백질의 안정성 증가를 위하여 본 발명이 성공적으로 이용될 수 있음을 입증하는 것이다.

이러한 연구들로부터 특이한 물성을 가지는 배큘로바이러스 유래의 다각체단백질을 융합단백질 파트너로 이용함으로써 목적 단백질을 대장균에서 안정적인 응집체 형상으로 생산하고, 간단한 분리와 알칼리성 조건에서의 용해 및 특이 알칼리성 단백질분해효소에 의한 다각체단백질 부분만의 선택적 분해를 통하여 목적 단백질만을 획득할 수 있는 방법이 가능함을 알 수 있었다.

본 발명의 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체에 의하면, 목적 단백질이 안정화되고, 대장균에서 발현될 경우, 응집체의 형태로 발현되므로 분리정제의 관점에서 유리하다.

본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 의하면, 상기 단백질-목적 단백질 융합체를 코드할 수 있다.

본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현용 벡터에 의하면, 상기 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다.

본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현용 벡터로 형질전환된 숙주세포에 의하면, 상기 단백질-목적 단백질 융합체를 발현하여 생산할 수 있다.

본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 제조방법에 의하면, 분리정제 과정을 효율적으로 진행시킬 수 있어 효율적이다.

본 발명의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 이용한 목적 단백질의 제조방법에 의하면, 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 효율적으로 분리정제하고, 이를 다각체 단백질과 목적 단백질로 선택적으로 분리시키므로써 효율적으로 생산할 수 있다.

본 발명의 목적 단백질의 안정화 방법에 의하면, 목적 단백질의 N 말단에 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질을 부착시키므로써 목적 단백질을 안정화시킬 수 있다.

도 1은 여러 가지 제한효소를 이용하기 위해서, 본래 벡터에서 부족한 제한효소자리를 pSE420 벡터로부터 떼어내어 다중 클로닝자리에 삽입하여 pMPL100 벡터를 제작하는 과정을 나타내는 도면이다.

도 2는 만들어진 pMPL100 벡터에 녹색형광단백질을 코드하는 유전자를 삽입하여 pMPL101 벡터를 제작하는 과정을 나타내는 도면이다.

도 3은 만들어진 pMPL101 벡터에 다각체단백질과 녹색형광단백질 유전자가 융합되도록 다각체단백질 유전자를 삽입하여 pMPL102 벡터를 제작하는 과정을 나타내는 도면이다.

도 4는 벡터 pMPL100을 만드는데, pSE420으로부터 잘라내어 여러 제한효소자리들이 들어있는 수퍼링커(superlinker) 부분의 염기서열 정보(A)이다. 또한, 본 발명에 사용된 다각체단백질의 염기서열(B) 및 이 염기서열에 의하여 코드되는 아미노산 서열(C)를 나타낸 도면이다.

도 5는 pMPL101과 pMPL102 벡터를 만들 때 사용된 4가지의 PCR용 프라이머들의 서열을 나타낸 도면이다.

도 6은 배양 시간에 따른 다각체단백질과 녹색형광단백질이 융합된 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체의 응집체를 생산하는 BL21 대장균 세포의 성장을 비교균주인 녹색형광단백질만이 용해성(soluble) 형태로 발현되는 pTrcGFPuv 벡터로 형질전환된 대장균과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 발현 유도 후의 시간에 따른 다각체단백질과 녹색형광단백질이 융합된 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체의 응집체를 생산하는 BL21 대장균 배양에서의 녹색형광단백질의 형광강도를 측정하여 비교균주인 녹색형광단백질 유전자만을 가지고 있는 pTrcGFPuv 벡터로 형질전환된 대장균과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 8은 발현 유도 후의 시간에 따른 다각체단백질과 녹색형광단백질이 융합된 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체의 응집체의 발현을 SDS-PAGE(위쪽 도면)와 웨스턴블랏(아래쪽 도면)으로 분석한 도면이다.

도 9는 도 8의 웨스턴블랏 분석결과로부터 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체의 시간에 따른 발현을 정량화한 그래프이다.

도 10은 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체의 응집체로의 발현여부를 확인하기 위하여, 전세포, 세포파쇄물, 그리고 세포 상등액으로 나누어서 SDS-PAGE한 결과를 나타내는 사진이다.

도 11은 다각체단백질-녹색형광단백질의 융합체가 응집체로 대장균에서 발현되는 것을 광학현미경으로 찍은 사진과(왼쪽 도면) 다각체단백질-녹색형광단백질의 융합체를 pH 12의 강 알칼리 조건에서 처리하여 응집체가 용해되는 것을 찍은 사진(오른쪽 도면)이다.

도 12는 세포파쇄 후 분리한 다각체단백질-녹색형광단백질의 융합체의 응집체 형상을 pH 12의 알칼리 버퍼에 용해시켰을 때의 용해가 됨을 시험관에서 보여주는 사진(도12a)과 용해의 정도를 흡광도를 측정함으로써 나타낸 그래프(도12b)이다.

도 13은 세포파쇄 후 분리한 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체의 응집체의 용해 전(pH 7.5)과 용해 후(pH 12)의 SDS-PAGE 사진이다.

도 14는 pH 12의 알칼리로 용해된 분리된 다각체단백질-녹색형광단백질 융합 체를 배추좀나방 애벌레 중장액의 알칼리성 단백질분해효소로 처리한 후의 SDS-PAGE(왼쪽 도면)와 웨스턴블랏(오른쪽 도면) 결과를 나타내는 사진이다.

도 15는 분리, 용해된 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체를 곤충 중장액의 단백질분해효소와 비슷한 물성을 가지는 키모트립신 단백질분해효소를 이용해서 처리한 후의 SDS-PAGE(왼쪽 도면)와 웨스턴블랏(오른쪽 도면)한 결과를 나타내는 사진이다.

도 16은 다각체단백질-녹색형광단백질 융합체의 응집체의 자외선에서의 안정성을 녹색형광단백질만의 경우와 비교하여 나타낸 웨스턴블랏(도16a) 결과를 나타내는 사진과 이를 정량화한 그래프(도16b)이다.

<110> Pohang University of Science and Technology (POSTECH) <120> A fusion protein of baculoviral polyhedrin protein-target protein and method for producing the target protein using the same <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The nucleotide sequence of the superlinker fragment <400> 1 atatggatcc aattgcaatg atcatcatga cagatctgcg cgcgatcgat atcagcgctt 60 taaatttgcg catgctagct atagttctag aggtaccggt tgttaacgtt agccggctac 120 gtatactccg gaatattaat aggcctagga tgcatatggc ggccgcctgc ag 172 <210> 2 <211> 738 <212> DNA <213> Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV) <220> <221> CDS <222> (1)..(735) <223> The amino acid sequence of the polyderin protein <400> 2 atg ccg gat tat tca tac cgt ccc acc atc ggg cgt acc tac gtg tac 48 Met Pro Asp Tyr Ser Tyr Arg Pro Thr Ile Gly Arg Thr Tyr Val Tyr 1 5 10 15 gac aac aag tac tac aaa aat tta ggt gcc gtt atc aag aac gct aag 96 Asp Asn Lys Tyr Tyr Lys Asn Leu Gly Ala Val Ile Lys Asn Ala Lys 20 25 30 cgc aag aag cac ttc gcc gaa cat gag atc gaa gag gct acc ctc gac 144 Arg Lys Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu Asp 35 40 45 ccc cta gac aac tac cta gtg gct gag gat cct ttc ctg gga ccc ggc 192 Pro Leu Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro Gly 50 55 60 aag aac caa aaa ctc act ctc ttc aag gaa atc cgt aat gtt aaa ccc 240 Lys Asn Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Ile Arg Asn Val Lys Pro 65 70 75 80 gac acg atg aag ctt gtc gtt gga tgg aaa gga aaa gag ttc tac agg 288 Asp Thr Met Lys Leu Val Val Gly Trp Lys Gly Lys Glu Phe Tyr Arg 85 90 95 gaa act tgg acc cgc ttc atg gaa gac agc ttc ccc att gtt aac gac 336 Glu Thr Trp Thr Arg Phe Met Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val Asn Asp 100 105 110 caa gaa gtg atg gat gtt ttc ctt gtt gtc aac atg cgt ccc act aga 384 Gln Glu Val Met Asp Val Phe Leu Val Val Asn Met Arg Pro Thr Arg 115 120 125 ccc aac cgt tgt tac aaa ttc ctg gcc caa cac gct ctg cgt tgc gac 432 Pro Asn Arg Cys Tyr Lys Phe Leu Ala Gln His Ala Leu Arg Cys Asp 130 135 140 ccc gac tat gta cct cat gac gtg att agg atc gtc gag cct tca tgg 480 Pro Asp Tyr Val Pro His Asp Val Ile Arg Ile Val Glu Pro Ser Trp 145 150 155 160 gtg ggc agc aac aac gag tac cgc atc agc ctg gct aag aag ggc ggc 528 Val Gly Ser Asn Asn Glu Tyr Arg Ile Ser Leu Ala Lys Lys Gly Gly 165 170 175 ggc tgc cca ata atg aac ctt cac tct gag tac acc aac tcg ttc gaa 576 Gly Cys Pro Ile Met Asn Leu His Ser Glu Tyr Thr Asn Ser Phe Glu 180 185 190 cag ttc atc gat cgt gtc atc tgg gag aac ttc tac aag ccc atc gtt 624 Gln Phe Ile Asp Arg Val Ile Trp Glu Asn Phe Tyr Lys Pro Ile Val 195 200 205 tac atc ggt acc gac tct gct gaa gag gag gaa att ctc ctt gaa gtt 672 Tyr Ile Gly Thr Asp Ser Ala Glu Glu Glu Glu Ile Leu Leu Glu Val 210 215 220 tcc ctg gtg ttc aaa gta aag gag ttt gca cca gac gca cct ctg ttc 720 Ser Leu Val Phe Lys Val Lys Glu Phe Ala Pro Asp Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 act ggt ccg gcg tat taa 738 Thr Gly Pro Ala Tyr 245 <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV) <400> 3 Met Pro Asp Tyr Ser Tyr Arg Pro Thr Ile Gly Arg Thr Tyr Val Tyr 1 5 10 15 Asp Asn Lys Tyr Tyr Lys Asn Leu Gly Ala Val Ile Lys Asn Ala Lys 20 25 30 Arg Lys Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu Asp 35 40 45 Pro Leu Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro Gly 50 55 60 Lys Asn Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Ile Arg Asn Val Lys Pro 65 70 75 80 Asp Thr Met Lys Leu Val Val Gly Trp Lys Gly Lys Glu Phe Tyr Arg 85 90 95 Glu Thr Trp Thr Arg Phe Met Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val Asn Asp 100 105 110 Gln Glu Val Met Asp Val Phe Leu Val Val Asn Met Arg Pro Thr Arg 115 120 125 Pro Asn Arg Cys Tyr Lys Phe Leu Ala Gln His Ala Leu Arg Cys Asp 130 135 140 Pro Asp Tyr Val Pro His Asp Val Ile Arg Ile Val Glu Pro Ser Trp 145 150 155 160 Val Gly Ser Asn Asn Glu Tyr Arg Ile Ser Leu Ala Lys Lys Gly Gly 165 170 175 Gly Cys Pro Ile Met Asn Leu His Ser Glu Tyr Thr Asn Ser Phe Glu 180 185 190 Gln Phe Ile Asp Arg Val Ile Trp Glu Asn Phe Tyr Lys Pro Ile Val 195 200 205 Tyr Ile Gly Thr Asp Ser Ala Glu Glu Glu Glu Ile Leu Leu Glu Val 210 215 220 Ser Leu Val Phe Lys Val Lys Glu Phe Ala Pro Asp Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Thr Gly Pro Ala Tyr 245 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LL101(upstream) <400> 4 aagctagcat gccggattat tcataccgtc 30 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LL102(downstream) <400> 5 gtagatctat acgccggacc agtgaacag 29 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LL103(upstream) <400> 6 gagatctatg agtaaaggag aagaactttt cactg 35 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LL104(downstream) <400> 7 gctgcagtta tttgtagagc tcatccatgc c 31 <210> 8 <211> 717 <212> DNA <213> gellyfish <220> <221> CDS <222> (1)..(714) <223> amino acid sequence of green fluorescence protein <400> 8 atg agt aaa gga gaa gaa ctt ttc act gga gtt gtc cca att ctt gtt 48 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 gaa tta gat ggt gat gtt aat ggg cac aaa ttt tct gtc agt gga gag 96 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 ggt gaa ggt gat gca aca tac gga aaa ctt acc ctt aaa ttt att tgc 144 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 act act gga aaa cta cct gtt cca tgg cca aca ctt gtc act act ttc 192 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 tct tat ggt gtt caa tgc ttt tcc cgt tat ccg gat cat atg aaa cgg 240 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 cat gac ttt ttc aag agt gcc atg ccc gaa ggt tat gta cag gaa cgc 288 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 act ata tct ttc aaa gat gac ggg aac tac aag acg cgt gct gaa gtc 336 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 aag ttt gaa ggt gat acc ctt gtt aat cgt atc gag tta aaa ggt att 384 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 gat ttt aaa gaa gat gga aac att ctc gga cac aaa ctc gag tac aac 432 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 tat aac tca cac aat gta tac atc acg gca gac aaa caa aag aat gga 480 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 atc aaa gct aac ttc aaa att cgc cac aac att gaa gat gga tcc gtt 528 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 caa cta gca gac cat tat caa caa aat act cca att ggc gat ggc cct 576 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 gtc ctt tta cca gac aac cat tac ctg tcg aca caa tct gcc ctt tcg 624 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 aaa gat ccc aac gaa aag cgt gac cac atg gtc ctt ctt gag ttt gta 672 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 act gct gct ggg att aca cat ggc atg gat gag ctc tac aaa taa 717 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 9 <211> 238 <212> PRT <213> gellyfish <400> 9 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 10 <211> 1836 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <220> <221> CDS <222> (1)..(1836) <223> amino acid sequence of Bacillus thuringiensis toxoid protein <400> 10 atg gat aac aat ccg aac atc aat gaa tgc att cct tat aat tgt tta 48 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 agt aac cct gaa gta gaa gta tta ggt gga gaa aga ata gaa act ggt 96 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly 20 25 30 tac acc cca atc gat att tcc ttg tcg cta acg caa ttt ctt ttg agt 144 Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser 35 40 45 gaa ttt gtt ccc ggt gct gga ttt gtg tta gga cta gtt gat ata ata 192 Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile 50 55 60 tgg gga att ttt ggt ccc tct caa tgg gac gca ttt ctt gta caa att 240 Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 gaa cag tta att aac caa aga ata gaa gaa ttc gct agg aac caa gcc 288 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 att tct aga tta gaa gga cta agc aat ctt tat caa att tac gca gaa 336 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 tct ttt aga gag tgg gaa gca gat cct act aat cca gca tta aga gaa 384 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 gag atg cgt att caa ttc aat gac atg aac agt gcc ctt aca acc gct 432 Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 att cct ctt ttt gca gtt caa aat tat caa gtt cct ctt tta tca gta 480 Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 tat gtt caa gct gca aat tta cat tta tca gtt ttg aga gat gtt tca 528 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 gtg ttt gga caa agg tgg gga ttt gat gcc gcg act atc aat agt cgt 576 Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 tat aat gat tta act agg ctt att ggc aac tat aca gat tat gct gta 624 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val 195 200 205 cgc tgg tac aat acg gga tta gaa cgt gta tgg gga ccg gat tct aga 672 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 210 215 220 gat tgg gta agg tat aat caa ttt aga aga gaa tta aca cta act gta 720 Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 tta gat atc gtt gct ctg ttc ccg aat tat gat agt aga aga tat cca 768 Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 att cga aca gtt tcc caa tta aca aga gaa att tat aca aac cca gta 816 Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val 260 265 270 tta gaa aat ttt gat ggt agt ttt cga ggc tcg gct cag ggc ata gaa 864 Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu 275 280 285 aga agt att agg agt cca cat ttg atg gat ata ctt aac agt ata acc 912 Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr 290 295 300 atc tat acg gat gct cat agg ggt tat tat tat tgg tca ggg cat caa 960 Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln 305 310 315 320 ata atg gct tct cct gta ggg ttt tcg ggg cca gaa ttc act ttt ccg 1008 Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro 325 330 335 cta tat gga act atg gga aat gca gct cca caa caa cgt att gtt gct 1056 Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala 340 345 350 caa cta ggt cag ggc gtg tat aga aca tta tcg tcc act tta tat aga 1104 Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg 355 360 365 aga cct ttt aat ata ggg ata aat aat caa caa cta tct gtt ctt gac 1152 Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp 370 375 380 ggg aca gaa ttt gct tat gga acc tcc tca aat ttg cca tcc gct gta 1200 Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val 385 390 395 400 tac aga aaa agc gga acg gta gat tcg ctg gat gaa ata ccg cca cag 1248 Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln 405 410 415 aat aac aac gtg cca cct agg caa gga ttt agt cat cga tta agc cat 1296 Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His 420 425 430 gtt tca atg ttt cgt tca ggc ttt agt aat agt agt gta agt ata ata 1344 Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 aga gct cct atg ttc tct tgg ata cat cgt agt gct gaa ttt aat aat 1392 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 ata att gca tcg gat agt att act caa atc cct gca gtg aag gga aac 1440 Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn 465 470 475 480 ttt ctt ttt aat ggt tct gta att tca gga cca gga ttt act ggt ggg 1488 Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly 485 490 495 gac tta gtt aga tta aat agt agt gga aat aac att cag aat aga ggg 1536 Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly 500 505 510 tat att gaa gtt cca att cac ttc cca tcg aca tct acc aga tat cga 1584 Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg 515 520 525 gtt cgt gta cgg tat gct tct gta acc ccg att cac ctc aac gtt aat 1632 Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn 530 535 540 tgg ggt aat tca tcc att ttt tcc aat aca gta cca gct aca gct acg 1680 Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr 545 550 555 560 tca tta gat aat cta caa tca agt gat ttt ggt tat ttt gaa agt gcc 1728 Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala 565 570 575 aat gct ttt aca tct tca tta ggt aat ata gta ggt gtt aga aat ttt 1776 Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe 580 585 590 agt ggg act gca gga gtg ata ata gac aga ttt gaa ttt att cca gtt 1824 Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val 595 600 605 act gca aca ctc 1836 Thr Ala Thr Leu 610 <210> 11 <211> 612 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 11 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser 35 40 45 Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile 50 55 60 Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val 195 200 205 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 210 215 220 Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val 260 265 270 Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu 275 280 285 Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr 290 295 300 Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln 305 310 315 320 Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro 325 330 335 Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala 340 345 350 Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg 355 360 365 Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val 385 390 395 400 Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln 405 410 415 Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His 420 425 430 Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn 465 470 475 480 Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly 485 490 495 Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly 500 505 510 Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg 515 520 525 Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn 530 535 540 Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr 545 550 555 560 Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala 565 570 575 Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe 580 585 590 Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val 595 600 605 Thr Ala Thr Leu 610

Claims

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서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 발현용 벡터로 형질전환된 형질전환 대장균 세포를 배양하여, 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 응집체를 분리하는 단계를 포함하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 응집체를 원심분리를 이용하여 용해성 단백질로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 제조방법.
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체 발현용 벡터로 형질전환된 형질전환 대장균 세포를 배양하여, 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 응집체를 분리하는 단계 및

(b) 얻어진 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 응집체를 다각체 부분만을 특이적으로 분해시키는 효소 또는 다각체 단백질과 목적 단백질의 경계 부위를 절단하는 효소를 이용하여 소화시킨 후, 목적 단백질만을 분리하는 단계를 포함하는 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 이용한 목적 단백질의 제조방법.
제10항에 있어서, 다각체 단백질 부분만을 특이적으로 분해시키는 효소 또는 다각체 단백질과 목적 단백질의 경계 부위를 절단하는 효소는 곤충 중장액 유래의 특이 알칼리성 단백질 분해효소 또는 키모트립신인 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 3의 배큘로바이러스 다각체 단백질을 목적 단백질의 N 말단에 융합시킨 융합체를 코딩하는 유전자를 대장균에서 응집체 (inclusion body)의 형태로 발현시키는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 안정화 방법.
제12항에 있어서, 상기 다각체단백질-목적단백질 융합체의 응집체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 안정화 방법.
제12항에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 녹색형광단백질 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 바실러스 투린지엔시스 독성 단백질인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 안정화 방법.
제8항 또는 제10항에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 녹색형광단백질 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 바실러스 투린지엔시스 독성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 또는 제10항에 있어서, 상기 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 녹색형광단백질 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 바실러스 투린지엔시스 독성 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 또는 제10항에 있어서, 상기 벡터는 pMPL102 (수탁번호 KCTC 10243BP)인 것을 특징으로 하는 방법.