JP4521566B2 - 幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子およびその利用法 - Google Patents
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Description
〔非特許文献1〕Nijhout, H.F.:Insect hormones, Princeton University Press, 267pp, 1994
〔非特許文献2〕Herman, W.&Tatar, M.: Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268:2509, 2001
〔非特許文献3〕Cusson, M&Palli, S.R.: Can.Entomol. 132:263, 2000
〔非特許文献4〕深見浩:生物に学ぶ農薬の創製,ソフトサイエンス社、p.19-38,1986
〔非特許文献5〕江藤守総:生物に学ぶ農薬の創製,ソフトサイエンス社、p.1-18,1986
〔非特許文献6〕波多腰ら;住友化学、p.4-20,1997-I
〔非特許文献7〕赤井弘:生理活性物質のバイオアッセイ, 講談社、p.383-388,1984
〔非特許文献8〕深見浩:生物に学ぶ農薬の創製,ソフトサイエンス社、p.19-38,1986
〔非特許文献9〕Hammock, B.D. et al.:US patent, 5098706, 1992
〔非特許文献10〕Schooley, D.A.&Baker,F.C.:Comp.Insect Physiol.Biochem.Pharmacol.,Pergammon Press, Oxford, 7:363-389, 1985
〔1〕 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(a)配列番号:2、4、6、8、または10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1、3、5、7、または9に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2、4、6、8、または10に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1、3、5、7、または9に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
〔2〕 〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
〔3〕 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNA。
(a)〔1〕に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
(b)〔1〕に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
(c)〔1〕に記載のDNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするDNA。
〔4〕 〔1〕または〔3〕に記載のDNAが挿入されたベクター。
〔5〕 〔1〕に記載のDNAまたは該DNAが挿入されたベクターを有効成分として含有する、節足動物の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤。
〔6〕 節足動物が昆虫である、〔5〕に記載の制御剤。
〔7〕 成虫に対する生殖成熟促進剤、休眠解除剤もしくは寿命短縮剤、幼虫および蛹に対する変態抑制剤、または、幼虫に対する休眠誘導剤である、〔6〕に記載の制御剤。
〔8〕 害虫防除剤または増繭剤である、〔6〕に記載の制御剤。
〔9〕 〔3〕に記載のDNAまたは該DNAが挿入されたベクターを有効成分として含有する、節足動物の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤。
〔10〕 節足動物が昆虫である、〔9〕に記載の制御剤。
〔11〕 成虫に対する生殖成熟抑制剤、休眠誘導剤もしくは寿命延長剤、または、幼虫に対する休眠抑制剤もしくは変態誘導剤である、〔10〕に記載の制御剤。
〔12〕 害虫防除剤である、〔10〕に記載の制御剤。
〔13〕 〔1〕もしくは〔3〕に記載のDNAまたは〔4〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔14〕 〔1〕もしくは〔3〕に記載のDNAまたは〔4〕に記載のベクターで形質転換された個体。
〔15〕 昆虫個体である、〔14〕に記載の個体。
〔16〕 〔2〕に記載のタンパク質に結合する抗体。
〔17〕 モノクローナル抗体である、〔16〕に記載の抗体。
〔18〕 〔1〕に記載のDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
〔19〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、〔2〕に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法。
(a)該タンパク質に被験化合物を接触させる工程
(b)該タンパク質と被験化合物との結合を検出する工程
(c)該タンパク質に結合する化合物を選択する工程
〔20〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、〔2〕に記載のタンパク質の活性を制御する化合物のスクリーニング方法。
(a)該タンパク質に被験化合物を接触させる工程
(b)該タンパク質の活性を測定する工程
(c)被験化合物を投与していない場合と比較して、該タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔21〕 以下の(a)〜(d)の工程を含む、〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニング方法。
(a)該タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被験化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(d)被験化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔22〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニング方法。
(a)昆虫個体または培養組織に被験化合物を接触させる工程
(b)該昆虫個体または該培養組織における〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被験化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
本来幼若ホルモンの合成が停止する終齢幼虫において、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、幼若ホルモンの合成・分泌を継続させ、過剰幼虫脱皮を起こすことが可能である。例えば、カイコの過剰脱皮を誘起すると、通常5齢幼虫で蛹になるところが、6齢幼虫を経て大きな蛹になることが知られている。したがって、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、大きな繭を得ることが可能である。すなわち、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAは増繭剤として利用できる。また、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、他の昆虫でも通常より大型の昆虫が得られるので、より巨大で見栄えのする個体の作製に有用である。例えば、オオクワガタなどのペット昆虫や、美麗な蝶(トリバネアゲハなど)などの作製への応用が考えられる。また、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、ミツバチが生産する蜜の生産量や品質の向上が可能である。
幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性が終齢幼虫になると低下する結果、幼若ホルモンの合成・分泌が停止し、血中の幼若ホルモンが消失し、変態が起こることが知られている。よって、昆虫(完全変態昆虫、不完全変態昆虫のいずれも)の終齢以前の幼虫期において、上記DNAにより、幼若ホルモンの合成を抑制することで、早期変態を任意に誘導することができる。例えば、カイコでは幼若ホルモンの分泌器官であるアラタ体を摘出すると、早期変態が誘起され、通常5齢で蛹になるところが、4齢あるいは3齢で蛹になり、著しく小型の成虫が得られることがある。早期変態した成虫は、通常妊性がない。よって、上記DNAにより、害虫の幼若ホルモンの合成を抑制することで、次世代の害虫の駆除が可能となる。例えば、農業害虫、衛生害虫の幼虫に対して早期に変態を誘導して、加害時期を短縮することで、それら害虫の防除を行うことができる。また、成虫に対しては生殖成熟(卵形成など)を抑制することで農業害虫、衛星害虫の防除を行うことが可能である。このように本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を抑制するDNAは害虫防除剤として利用できる。
(1) HPLCによる幼若ホルモン類の検出
逆相カラム(CAPCELL PAK C18 UG80 S-5, 3 x 150 mm, Shiseido)をHPLC装置(JASCO)に取り付け、紫外検出器で217 nmの吸光度を測定することにより、幼若ホルモン類の検出を行った。なお、この際流速は0.5 ml/min、カラム保持温度は40℃で、60%アセトニトリルまたは80%アセトニトリルで20分間サンプルを流した。
アラタ体は極めて微細な組織なため(カイコの終齢幼虫でも直径0.1mm程度)、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子のクローニングに必要な量のアラタ体由来RNAを得るために、多数の個体を解剖してアラタ体を集める必要がある。カイコは、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウやオオタバコガといった害虫に比べて大型で解剖がしやすく、また、アラタ体のサイズも大きい。さらに、人工飼料による大量飼育方法が確立されているので、実験に必要な発育ステージの揃った幼虫を大量に集めることが容易である。そこで、本発明者らは、まずカイコの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子のクローニングを行った。
以上のように、蛍光mRNAディファレンシャルディスプレイ法、5'-RACEおよび3'-RACEによりクローニングした領域を重ね合わせて、カイコの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のcDNAの全長を決定した。
(実施例1)に記載の方法に従って単離した遺伝子のオープンリーディングフレームを含む領域を、カイコ4齢幼虫のアラタ体由来のcDNAを鋳型とし、BMJFプライマー(配列番号:15)とBMJRプライマー(配列番号:16)を用いたPCRによって増幅し、増幅されたDNAを制限酵素NdeIとBamHIで切断後、ヒスチジンタグ融合タンパク質作成用の大腸菌発現ベクターpET-28a(+)(Novagen社)のNdeI-BamHIサイトにクローニングした。
作成したプラスミドをエレクトロポレーション法により、大腸菌株BL21(DE3)に導入し、形質転換された大腸菌株を得た。この形質転換された大腸菌株をカナマイシン50μg/mlを含むLB培地(5ml)で37℃で一晩振とう培養し、その培養液0.2mlを、液体培地200 mlに加えて20℃で24時間、振とう培養した。培養液から増殖した菌体を遠心分離(3500rpm,10分、4℃)により回収し、-30℃で凍結した。凍結した菌体を室温で融解後、培養液50ml当たり5mlのバッファー(50 mM Tris-Cl, pH7.5)を加えてけん濁後、冷却条件下で超音波によって破砕した。これを遠心分離後(14000rpm, 15分,4℃)、上精を採取し、0.45μmのフィルターで濾過後、ヒスチジンタグ融合タンパク質精製キット(HiTrap Kit、Amersham社)によって組換え幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を精製した。溶出した組換えタンパク質は、脱塩カラム(PD-10、Amersham社)を用いて、イミダゾールを除去後、25 mM Tris-Clバッファー、pH7.5、50%グリセロール溶液として-30℃に保存した。収量は、培養液50mlから、約4mg(総液量7ml)であった(図3)。
シリコン処理したガラス試験管(10x150mm)に、トルエンに溶かしたJH I酸、JH II酸、JH III酸、またはファルネセン酸のいずれかの幼若ホルモン酸100μgをガラスキャピラリーで移し、窒素気流下、溶媒を除去する。これに、バッファー(50 mM Tris-Cl, pH7.5)800 μlおよび10 mM S-アデノシルメチオニン溶液100μlを加えてよく混合後、25℃の恒温水槽中で5分間放置する。これに、(実施例3)の方法で得られた組換えタンパク質液100μlを加え、酵素反応を開始した。10分後に、反応停止液(メタノール:水:濃アンモニア水、10:9:1)250μlを加えて酵素反応を停止した後、イソオクタン1mlを加えてよく混合後、遠心分離(2000rpm、15分、室温)によって有機溶媒相と水相を分離し、有機溶媒相100μlを小型のバイアルにグラスキャピラリーで移し、窒素気流により溶媒除去後、残さを100μlのアセトニトリルに溶解し、逆相HPLCを用いた方法により、合成された幼若ホルモンを分析した。その結果、JH I酸、JH II酸、JH III酸およびファルネセン酸を基質とした場合、反応液中にそれぞれに対応した活性型の幼若ホルモン、すなわち、JH I、JH II、JH IIIおよびファルネセン酸メチルが生成することが確認された(図4)。緩衝液:Tris-HCl(50 mM, pH7.5)、反応温度:25℃、基質:S-アデノシルメチオニン 1 mM、各JH酸 100μM条件下で測定した組換えカイコJHAMTのJHI酸、JHII酸、JHIII酸、ファルネセン酸に対する分子活性(1分間に酵素1分子が反応産物に変える基質の分子数)は、それぞれ、1.80±0.32, 1.65±0.23, 0.79±0.06, 0.48±0.07(平均値±標準偏差、n=3)であった。なお、飽和直鎖脂肪酸または不飽和直鎖脂肪酸を基質とした場合、本酵素によるメチルエステル化は認められず、本酵素の反応は幼若ホルモン酸に対して基質特異的であった。
配列番号:2に示したカイコ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列を用いて、BLASTプログラムによってショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)およびマラリアの重要なベクターである蚊(Anopheles gambiae)の全ゲノムデータベースの検索を行った。その結果、ショウジョウバエゲノムからは、カイコ幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列(配列番号:2)と38%の一致率を示す配列番号:4に示すアミノ酸配列をコードするDNA(配列番号:3)を見いだした。
多くの農作物を加害する重要害虫であるハスモンヨトウ(Spodoptera litura)およびオオタバコガ(Helicoverpa armigera)の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子は以下のようにしてクローニングした。
本発明者らは、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、オオタバコガ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列の比較を行った(図5)。その結果、保存されているアミノ酸配列として、以下の(1)〜(7)の7つのモチーフを見出した。このうち(2)は、メチルトランスフェラーゼのコンセンサス配列(S-アデノシルメチオニン結合配列の一部)(L(D/E)oGsGsG(配列番号:29); oは疎水性アミノ酸、sは低分子量中性アミノ酸;Gomi, T et al.,Int. J. Biochem. 24:1639, 1992; Kagan, R.M. &Clarke, S., Arch. Biochem.Biophys. 310:417, 1994; Vidgren, J. et al., Science, 368:354, 1994)と一致しており、 S-アデノシルメチオニンの結合に関与すると推定される。
(1)1 MNNAXLY(Q/E)(H/K/Q)ANSoQKRDA(配列番号:30)
(2)38 (L/V/I)LD(L/V/I)GCGDG(配列番号:31)
(3)62 (Q/R/K)L(L/V)GCDISE(Q/K)MV(配列番号:32)
(4)104 FDHVFSFY(C/T/A)LHWV(配列番号:33)
(5)145 P(V/I)FD(V/I/L)YR(I/V)L(配列番号:34)
(6)165 DVE(K/R)YISPYHDS(配列番号:35)
(7)263 YKL(I/V/L)VVYARK(配列番号:36)
(1)〜(7)の先頭の番号は各モチーフに対応するカイコの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸残基の番号である。
Claims (18)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(a)配列番号:2、4、6、8、または10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1、3、5、7、または9に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2、6、8、または10に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1、5、7、または9に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 - 請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
- 請求項1に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
- 請求項1または3に記載のDNAが挿入されたベクター。
- 請求項1に記載のDNAまたは該DNAが挿入されたベクターを有効成分として含有する、節足動物の脱皮・変態または寿命の制御剤。
- 節足動物が昆虫である、請求項5に記載の制御剤。
- 成虫に対する寿命短縮剤、または、幼虫および蛹に対する変態抑制剤である、請求項6に記載の制御剤。
- 害虫防除剤である、請求項6に記載の制御剤。
- 請求項1もしくは3に記載のDNAまたは請求項4に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
- 請求項1もしくは3に記載のDNAまたは請求項4に記載のベクターで形質転換された個体。
- 昆虫個体である、請求項10に記載の個体。
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAによりコードされるタンパク質に結合する抗体。
(a)配列番号:2、6、8、または10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1、5、7、または9に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2、6、8、または10に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1、5、7、または9に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 - モノクローナル抗体である、請求項12に記載の抗体。
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号:2、6、8、または10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1、5、7、または9に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2、6、8、または10に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1、5、7、または9に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項2に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法。
(a)該タンパク質に被験化合物を接触させる工程
(b)該タンパク質と被験化合物との結合を検出する工程
(c)該タンパク質に結合する化合物を選択する工程 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項2に記載のタンパク質の活性を制御する化合物のスクリーニング方法。
(a)該タンパク質に被験化合物を接触させる工程
(b)該タンパク質の活性を測定する工程
(c)被験化合物を投与していない場合と比較して、該タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する工程 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む、請求項2に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニング方法。
(a)該タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被験化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(d)被験化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項2に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニング方法。
(a)昆虫個体または培養組織に被験化合物を接触させる工程
(b)該昆虫個体または該培養組織における請求項2に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被験化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
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