CN1102659C

CN1102659C - 重组杆状病毒杀虫剂

Info

Publication number: CN1102659C
Application number: CN96193967A
Authority: CN
Inventors: B·F·麦卡琴
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1995-05-17
Filing date: 1996-05-16
Publication date: 2003-03-05
Anticipated expiration: 2016-05-16
Also published as: JPH10509596A; JP3252854B2; US6096304A; BR9608741A; AU5865196A; MX9708798A; AU723612B2; TR199701366T1; EP0826047A1; WO1996036712A1; CN1184504A; NZ308772A; EP0826047B1

Abstract

本发明涉及重组杆状病毒，杆状病毒经过加工可以很好地表达编码昆虫选择性神经毒素的基因。更具体地说，本发明涉及一分离自蝎子Leiurus quinquestriatus hebraeus编码蝎毒素LqhIT2的核酸序列，其中所述的序列经优化后适合于在核多角体病毒感染的细胞中表达基因。本发明还涉及包括一密码子经优化的LqhIT2核酸序列的嵌合基因，以及包括表达一密码子经优化的重组杆状病毒，昆虫选择性神经毒素(比如，LqhIT2毒素基因)的杆状病毒的杀虫组合物。本发明也涉及在农学的和非农学的环境下控制昆虫的方法，其中也包括使用含有密码子经优化的，编码昆虫选择性神经毒素如LqhIT2毒素的核酸序列的昆虫杆状病毒。

Description

重组杆状病毒杀虫剂

发明背景

化学杀虫剂是现代农业的必要部分，并且已经是一种通过控制虫害而减少作物损失的有效方法。然而，由于其对环境污染的潜在作用，对农学上的害虫的抗性群体的筛选，以及对非靶生物的毒性，所以化学试剂正受到不断的审查。结果是，正在寻找一种替代策略，该策略应是有效的，甚至对非靶群体及环境是有益的。其中的一种策略包括使用微生物，该微生物是自然存在的针对昆虫群体的病原体。然而，许多有希望的昆虫控制剂作为候选昆虫病原体都缺少一些经典的化学杀虫剂的特征，而这些特征是农场主或其它从事农业的人已习惯的。例如，杆状病毒科家族的昆虫特异性病毒有许多优点，包括宿主-特异性及惰性环境的特点，但却缺乏在重大的作物损失发生前迅速控制靶群体的能力。幸运的是，现代分子生物学提供了改造这些特性的必要工具，以便能满足现代农业的需要。

杆状病毒对于无脊椎动物是病毒性病原体，其特征是有一双链、环状DNA基因组，大小约80到200千碱基。杆状病毒分为3个亚族，包括无包含体杆状核型病毒(NOVs)，颗粒体病毒(GVs)和核多角体病毒(NPVs)。NOVs的例子是椰二疣独角仙病毒和Helicoverpu zeaNOVs，GVs的例子包括小菜蛾颗粒体病毒，苹果蠹蛾颗粒体病毒，甘蓝粉蝶颗粒体病毒，和粉纹夜蛾颗粒体病毒。NPVs的例子包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，甜菜夜蛾核型多角体病毒，棉铃虫核型多角体病毒，Helicoverpu zea NPV，单地夜蛾核型多角体病毒，粉纹夜蛾核型多角体病毒，甘蓝夜蛾核型多角体病毒，舞毒蛾核型多角体病毒，斜纹夜蛾核型多角体病毒，银纹夜蛾核型多角体病毒，枞色卷蛾核型多角体病毒，梨豆夜蛾核型多角体病毒，和绿棉铃虫核型多角体病毒。

尽管曾认真研究了一些特定的颗粒体病毒和无包含体杆状核型病毒，核多角体病毒是杆状病毒各亚族中定性最为彻底的。NPV的感染周期包括二种病毒粒子。感染昆虫细胞后，出芽病毒粒子(BVs或胞外病毒，ECV)在核衣壳向质膜运动中被制造。这些病毒粒子将核来源的衣壳排入胞质中并通过出芽通过细胞质膜进入宿主昆虫的血腔中。这一过程导致了宿主昆虫的系统感染。在感染阶段的后期，病毒粒子在含有大量多角体蛋白的蛋白基质中被包被，(包含体病毒粒子)，这样形成多角包含体(PIB或包含体，OBs)。这些包含体是病毒的口腔感染形式，并且能在昆虫宿主间水平转移(1，2)。未被感染的幼虫用含病毒的食物喂食并且吞下PIBs。蛋白样基质被昆虫中肠中的酸性pH的活动所溶解这一现象发现于许多鳞翅目幼虫中。释放了的病毒粒子核衣壳，含有病毒基因组DNA，接触并感染幼虫中肠的表皮组织。典型地，被感染昆虫将继续发育并在病毒在宿主内指数扩增中继续消耗植物物质。渐渐地，经常是几周或更长一段时间后，感染的幼虫将完全受害并死亡。

杆状病毒的一个吸引人的特性是其狭窄的宿主特异性。这类病毒仅感染节肢动物，并且即使在一个特别的昆虫目内也具有相对狭窄的宿主范围。宿主特异性曾用电镜，DNA杂交及重组DNA技术检验(3～5)。这些研究表明狭窄的宿主范围至少部分上是由于杆状病毒不能将病毒DNA转入哺乳动物细胞核中。

NPV被用作真核生物表达载体来合成理想的异源蛋白(6，7)，这部分是由于易于得到有效的细胞培养系统及克隆载体。特别是叫苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的一种病毒，是一种已被接受的模型病毒，可用于在杆状病毒表达系统中导入并表达异源基因。该病毒常规上被作为在真核表达系统中生产大量重组蛋白的一种重要的体外方法，并能提供对表达蛋白进行合适的翻译后修饰，AcNPV能够感染鳞翅目昆虫的许多家族，而这些昆虫是重要的经济学害虫。

尽管基于杆状病毒的害虫控制剂有潜在的实用的优点，然后许多缺点却限制了它们在现代农业上的应用。在中耕农业中更广泛运用该类病毒的最大障碍是其在时间上的滞后，即在使用病毒和有效地控制由宿主昆虫引起的作物损失间的时间上的滞后，不象使用经典的化学杀虫剂后可快速地观察到生效，有效的野生型杆状病毒所介导的昆虫控制仅当体内病毒群体达一危及宿主活动的高水平后才发生。然而，通过运用重组DNA技术，可通过导入控制杀虫蛋白表达的基因或通过从病毒基因组中删除一些基因，使得NPV从遗传学上被改造，从而提高其昆虫杀灭速率(8～10)。已经改造成表达昆虫选择性神经毒素的最有效的重组NPVs(11～18)。这些重组病毒杀死宿主用的时间比野生型NPVs至少少20～30％。

现在，已有已构建好的重组NPVs，其致力要远远大于以前构建的NPVs。这些重组NPVs被加工以表达一编码蝎子(Leiurusquinquestriatus hebraeus)的昆虫选择性毒素蝎毒素LqhIT2的异源基因(19，20)。基于目前的研究，带有这种合成基因的重组NPVs可使病毒的杀虫的特性有很大的提高。

发明概述

本发明涉及重组杆状病毒，杆状病毒经过加工可以很好地表达编码昆虫-选择性神经毒素的基因。更具体地说，本发明涉及一分离自蝎子Leiurus quinquestriatus hebraeus的编码蝎毒素LqhIT2的核酸序列，这里所说的序列经优化后适合于在核多角体病毒感染的细胞中表达基因。本发明还涉及包括一密码子经优化的LqhIT2核酸序列的嵌合基因，以及包括表达一密码子经优化，昆虫选择性神经毒素比如LqhIT2毒素基因的杆状病毒的杀虫组合物，本发明也涉及在农学的和非农学的环境下控制昆虫的方法，其中也包括使用含有密码子经优化的，编码昆虫选择性神经毒素如LqhIT2毒素的核酸序列的昆虫杆状病毒。

本例发明中的昆虫杆状病毒选自核多角体病毒，单或多包含体核多角体病毒，和颗粒体病毒组。优选杆状病毒选自多核衣壳核多角体病毒。特别优选的是苜蓿银纹夜蛾多衣壳核型多角体病毒(AcNPV)。

本发明包括一编码LqhIT2蛋白的合成基因，其中该基因密码子选择上是偏向于选择核多角体病毒以及支持病毒复制的细胞所优选的密码子，这一点通过观察-已经表征的核多角体病毒蛋白，多角蛋白的编码基因以及几个鳞翅昆虫蛋白的编码基因的密码子利用而得到确定。带有合成的LqhIT2基因的重组杆状病毒感染细胞后，在细胞中所得的遗传构建物可有效地表达LqhIT2。对烟芽夜蛾使用这些重组病毒后导致幼虫的快速麻痹。更有甚者，带有偏倚性密码子的基因的病毒杀死其昆虫宿主的速度远快于那些带有LqhIT2基因互补DNA(cDNA)拷贝的病毒。附图简述，生物保藏及序列表

图1.蝎子Leiurus quinquestriatus hebraeus的LqhIT2基因的cDNA序列(LqhIT cDNA)以及编码LqhIT2的密码子-偏倚性的合成的结构基因(LqhITNPV)的序列图。黑体字符表示cDNA序列中的无义核苷酸变化，这些变化的引入是为了促进基因表达。

图2.用来构建LqhIT2基因的密码子-偏倚性形式的合成寡核苷酸的序列。寡核苷酸Lq1编码家蚕素的信号肽。寡核苷酸Lq1和Lq10用作合成基因的PCR扩增中的引物。

图3.制备LqhIT2基因的密码子偏倚性形式的策略的流程图。寡核苷酸Lq1和Lq10(以“X”为标记)作为PCR反应的扩增引物。单一的限性酶切位点已给出。

图4.具密码子-偏倚性的LqhIT2基因的核酸序列及相应氨基酸序列。核酸序列中的小写字(核苷酸1～57，编码氨基酸1～19)表示编码家蚕素信号肽的核酸序列。

图5.质粒pTZ18R.LqhIT2(包含合成的具密码子偏倚性LqhIT2基因的中间克隆载体)，pAcUW21(杆状病毒转动载体)和质粒pAcUW21、LqhIT2的衍生物，即一种包含合成的，具密码子-偏倚性的LqhIT2基因的杆状病毒转运载体的图谱。

图6.用Ac LqhIT2和对照病毒处理后的烟芽夜蛾的3龄幼虫的死亡时间(致死时间)图示。

图7.用野生型和重组杆状病毒处理烟芽夜蛾的幼虫后引起的植物破坏的抑制(即植物保护)的图示。所报道的数据是相对于对照植物(未受侵染的)存留的叶子物质的百分比。

本发明还包括按照布达佩斯条约规定保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)中的重组杆状病毒，ATCC地址为1230/Parklawn DriVe，Rockville，MD20852，这些保藏物的保藏号为：重组杆状病毒保藏号保藏日期Ac LqhIT2 ATCC VR-2501 1995年5月2日CG201-3-1 ATCC VR-2502 1995年5月2日

申请人提供了13个序列的列表。这些序列同“专利申请中核酸和氨基酸序列的标准描述规则”(EPO主席决议的附录I和II，在OF EPO的补充2中出版，1992年12月)以及37C.F.R 1.821-1.825和附录A和B(“含核酸和/或氨基酸序列的申请声明的要求”)中的规定相符合。发明详述

在本文的上下文中，要用到许多术语及缩略语。“NPV”代表核多角体病毒。“PIBs”是多角包涵体。“AcNPV”代表野生型的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒。“LqhIT2”代表源于蝎子Leiurus quinquestriatushebraeus的昆虫选择性神经毒素。“AaIT”表示源于Androctonusaustralis的昆虫选择性神经毒素。“Ac LqhIT2”是AcNPV的缩写形式，而该AcNPV已经过遗传修饰以包含编码LqhIT2的基因，且该基因处于杆状病毒晚期P10启动子的转录控制下。“AcAaIT”是经遗传修饰的包含编码AaIT基因的AcNPV的缩写形式。

“表达”是指一结构基因的转录及转译并最终生成编码的蛋白质。正如本领域的技术人员所理解的，结构基因的表达水平是受调控序列(启动子，多聚腺苷酸位点，增强子等)以及表达结构基因的宿主细胞影响的。

此处所用的，恰当的“调控序列”是指位于结构基因上游(5′)，和/或下游(3′)的核酸序列之间，这些核酸序列同细胞的蛋白生物合成装置一起，潜在地控制编码序列的转录和/或表达。这些调控序列包括启动子，增强元件，转录终止序列，和多聚腺苷酸序列。

“启动子”指的是位于结构基因5′末端并决定转录起始的核酸序列，对于启动下游基因的表达，启动子序列是必需的，但并不总是有效。通常，启动子启动转录的方向优选的是下游方向，虽然当基因被置于启动子上游也可显示出启动活性(表达水平下降)。转录水平由启动子序列调控。这样，在构建异源启动子/结构基因组合时，结构基因被置于启动子的调节控制下以便基因的表达可被启动子序列控制。优选地，启动子位于结构基因的上游并且启动子同转录起始位点的距离应同启动子同其自然条件下控制的基因间的距离差不多。正如本领域所知晓的，能够耐受距离上的一些变异且启动子的功能并不丧失。

“3′非编码序列”指的是一个基因的一部分DNA序列，这段序列包含有多聚腺苷酸信号和能影响mRNA加工或基因表达的任意其它调节信号。多聚腺苷酸信号通常定性为影响向mRNA前体的3′末端加上多聚腺苷酸片段。

此处用到的“基因”指的是参与蛋白合成的全部DNA序列部分。一个基因包括DNA的结构或编码区域，编码区从5′末端的转译起始密码子(通常为ATG)开始直至3′末端的终止密码子(TAG，TGA或TAA)。基因还包括一启动子区域，通常位于结构基因的5′端或上游，其可以起始并调节结构基因的表达。基因中也包括3′非编码序列。“嵌合基因”指的是一包括异源调控序列和编码序列的基因。“异源基因”指的是一段在宿主生物中没有但通过基因转移导入的基因。

“结构基因”是指包含编码蛋白，多肽或其一部分的DNA片段在内的基因的一部分，但不包括参与基因表达调控的5′或3′序列。结构基因可以是通常在细胞中可发现的，或者也可以是通常在细胞中不存在但是是被导入的，在这种情况下，其被称为异源基因。正如本领域所熟知的，一个异源基因可以全部或部分来自任何来源，包括细菌基因组或游离体，真核，核或质粒DNA，cDNA，病毒DNA或化学合成DNA。一个结构基因可以在编码区或非翻译区含有一个或多个修饰，这些修饰可以影响到表达产物的生物学活性或化学结构。也可影响到表达的速率或表达控制方式。这类修饰包括，但不限于突变，插入，删除和1个或多个核苷酸替换，一个结构基因可以构成一个不间断的编码序列或者它也可以包括一个或多个的内含子，通过正确的剪切接合而相连。一个结构基因也可以是来自许多来源的片段的组合，不管是天然存在的或是合成的。结构基因也可以是编码一个融合蛋白。

“合成的基因”指的是结构基因的DNA序列其全部或是绝大部分编码区域是化学合成的。正如此处引出的例子，寡核苷酸构建是用本领域技术人员所知的步骤合成的，然后再连接并通过接合形成基因片段，基因片段再用酶切处理以装配成全基因。正如本领域的技术人员所明白的，功能和结构上同此处所述的合成基因相类似的基因也可以通过本领域中所用的定点突变或其它相关方法来制备。

术语“可操纵相连”指的是单一核酸分子上相互联系的核酸序列，这样一个核酸序列的功能可被另外的核酸序列影响。比例，当一个启动子能影响一个结构基因的表达时，则该启动子同此结构基因可操纵相连，(也就是说，那个结构基因处于此启动子的转录控制下)。

“转染”指将一个带有功能基因的DNA片段稳定地导入到一个以前不含该基因的生物体中。“共转染”指的是向一生物体中同时导入多于一个的DNA片段。

“密码子偏倚性”指的是一特定宿主细胞在用核酸密码编码一给定氨基酸上所表现出的偏倚性。当为在宿主细胞中获得更高的表达而合成一基因时，设计基因时，使得密码子运用的频率接近宿主细胞所偏爱的密码子运用的频率是较理想的。“无密码子偏倚性”指的是无偏倚的，自然的，天然的或是野生型的。

“化学合成”，就其同DNA序列的关系而言，意思是核苷酸成分是在体外组装成的。运用已成熟建立的步骤可以成功地完成DNA的人工化学合成(21)，或用许多种商售的仪器中的一种来完成自动化学合成。

本发明涉及构建和利用重组杆状病毒杀虫剂，通过工程方法来表达昆虫选择性神经毒素。所揭示的是一合成的编码真正的LqhIT2毒素的基因，基因中密码子的运用是倾向于用在鳞翅目昆虫中可高表达的杆状病毒基因所频繁使用的密码子。尽管合成基因的DNA序列同天然的LqhIT2的编码序列不同，其编码的氨基酸序列却与天然毒素的氨基酸序列相同，一个包含杆状病毒启动子，编码一个信号肽以促进表达毒素分泌的核酸片段及编码毒素的合成核酸片段的嵌合基因被插入到核多角体病毒的基因组中。该嵌合基因的表达导致毒素有效的表达并且相对于非重组杆状病毒而言，重组杆状病毒的杀昆虫特性得到增强。这种增强的活性通过对目标昆虫群体更快的控制并且导致了由这些昆虫引起的作用因被取食而造成的损失的大大减少而得到证实。令了吃惊地，这种快速的重组杆状病毒也表现比另一种重组病毒更快的昆虫控制，后者是通过工程处理来表达另一种昆虫选择性毒素，AaIT。

杆状病毒杀虫剂极有可能提供一种对环境有好处的农业有害昆虫控制的办法。然而，为使其能同目前的化学昆虫控制药物竞争，还需提高其效能。提高的一种办法就是通过病毒的遗传改变。比如，通过修饰病毒基因组来提高病毒的宿主范围，来增加其环境稳定性和病毒的持续性，或者可提高其感染性及传播性，这些都是可能的。此外，提高病毒的作用效率以杀死感染的昆虫将会极大地增强杆状病毒杀虫剂作为佐剂或化学害虫控制剂的替代品的魅力。一种提高病毒影响昆虫宿主的速度的办法是导入编码昆虫毒蛋白的外源基因，这样，昆虫的死亡或其能力的丧失将不再单单依靠病毒的感染过程，而是也受到外源蛋白毒性水平积聚的影响。

许多节肢动物生产被称为毒液的一些物质的混合物，从这些物质由特别的腺体组织合成，这些物质通过叮咬或穿刺装置，可导致节肢动物的猎物麻痹。慢速移动或静止的节肢动物发展了一种策略，可利用毒液中的很低浓度的神经毒素成分使得他们的猎物很快瘫痪。这些成分或是神经毒素通过有效地同一些特定的受体位竞争而扰乱昆虫神经组织的功能。许多的这类神经毒素是多肽；它们可以根据宿主特异性的和作用方式被分为不同的类(22)。比如，从许多种蝎子中分离的神经毒肽被分为影响节肢动物类和影响哺乳动物类。

几种节肢动物特异的毒素被认为是昆虫选择性肽。比如，钳蝎表达两类昆虫选择性神经毒素，此两类毒素对于靶昆虫的生物学效应相拮抗。在丽蝇中，那些被分类为兴奋性毒素的可产生立即的，快速的并是可逆的收缩麻痹，这是由于诱导并重复激发运动神经元末梢所致(23～25)。这些毒素是单链多肽，约为70个氨基酸，并且通过四个二硫键相交联。兴奋性效应是由于增加了钠传导性，并使电压依赖性的通道的关闭减慢，结果是在效应神经元中的负电荷排出。AaIT一种产自蝎子Androctonus australis毒液的毒素，是第一个分离自那些正示出这种兴奋行为的生物体昆虫毒素。

第二类的昆虫选择性神经毒素是抑制性毒素，包括BjIT2(27)，LqqIT2(28)和LqhIT2(19)，这些毒素是60到65个氨基酸的多肽，它们有特别的但都是相似的一级氨基酸序列，其序列同兴奋性毒素不同，这些毒素诱导缓慢的，渐进的麻痹并可使昆虫的肌肉系统完全松驰。这些活动是由于诱发性动作电位的阻断造成的(28，29)，并且也是由于钠通道传导的抑制及轴突膜的去极化引起的。

用于制备表达异源基因的重组杆状病毒的方法和策略在本领域内是熟知的(6，7，30)。这些基因表达的方法可以经济地在一真核表达载体系统中制备哺乳动物蛋白，在许多情况下可以使蛋白获得其正确的三级构型并且形成正确的活性必须的二硫键。

向杆状病毒基因组中导入异源基因的方法之一是通过病毒基因组DNA同一合适的含有感兴趣的异源基因的“转移载体”间的同源重组实现。这些转移载体一般是可在细菌宿主中自主复制且可进行多种遗传操作的多种质粒DNA。杆状病毒转移载体还含一遗传盒，该遗传盒包括一经过修饰的，含有下列特征的病毒基因组区(按5′到3′方向列出)：1)含有非必需基因组区域的5′区的病毒DNA；2)病毒启动子；3)一个或多个编码限性酶切位点的DNA序列，以便易于异源DNA序列的插入；4)转录终止序列；和5)含有非必需基因组区域的3′区的病毒DNA。感兴趣的异源基因插入到转移载体上的病毒启动子下游的限性酶切位点上。能得到的盒包括一嵌合基因，其中异源基因在转移载体上的病毒启动子和转录终止序列的转录控制下。另外，该嵌合基因的侧翼区是病毒DNA序列，可促进在病毒基因组的非必需区进行同源重组。通过用病毒基因组DNA和重组转移载体共转染昆虫细胞(能够支持病毒复制)而创建重组病毒。同源重组发生在位于转移载体上的侧翼区的病毒DNA序列及病毒基因组DNA上的同源系列之间，并且导致将嵌合基因插入到病毒基因组的一个区域而不破坏病毒基本的功能。该重组基因组DNA渐渐被包裹入一感染性的重组病毒粒子中。

在一优选的的实施方案中，位于转移载体上的病毒基因组的非必需区包括负责多角体生成的病毒DNA区域。最优选的转移载体应在侧翼序列间包含完整的多角体基因，侧翼序列参与同源重组。用多角体生成缺陷型(由于多角体基因的基因组拷贝的缺陷造成)的病毒基因组DNA进行重组可以导致多角体-阳性表型的恢复。这种策略可加快重组病毒的鉴定与筛选。

在另一个实施方案中，通过向病毒基因组的非必需区中引入一个独特的限制性酶识别序列而对杆状病毒基因组DNA直接修饰。可构建一个包含将要在重组病毒中表达的异源的嵌合基因，异源基因经操作同能够决定在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的调节序列相联，而且可直接将嵌合基因插入到病毒基因组上的独特的限性位点上。这种策略可以不必构建转移载体并能消除对于产生重组病毒的同源重组的依赖。这一技术由Ernst等(31)和WO 94/28114(32)描述。

适合转运遗传上编码的昆虫特异的神经毒素的重组杆状病毒载体需要毒素基因的最佳表达以达到最高的效率。熟练的技术人员可采用多种策略来设计和制备重组杆状病毒。其中的毒素基因在感染中的合适的时刻以一种功能形式表达可以产生足够量的毒素，并且可在昆虫宿主内结合于靶细胞。

获得最佳的基因表达的一个关键是选择一个合适的决定基因转录的启动子元件。已有几种杆状病毒的启动子被描述，它们可在病毒生活史的不同时间介导不同水平的基因表达。例如，多角体启动子是一个非常强的决定多角体蛋白的产生的杆状病毒启动子，最基本的蛋白包含病毒核衣壳。该基因在病毒生活史的晚期表达，并且该基因编码的信使RNA可占到感染细胞中的总的多聚腺苷酸信使RNA的20％或更多。也可选其它启动子，它们在病毒生活史晚期表达并有类似的强度，包括P10和基本启动子。另外，有报道表明杆状病毒启动子可在病毒生活史早期被转录因子诱导(33～36)，启动子包括立早启动子IEI和IEN，延迟-早期启动子39K或发现于AcNPV基因组Hind III-K片段上的一个启动子(49)。这些启动子可提供另外的手段来加速杆状病毒杀虫剂对于害虫的控制能力。

相对于由非重组病毒产生的杀虫效果而言，合成毒素从重组杆状病毒感染的细胞中分泌出来是在感染昆虫中产生更快的杀虫效果的前提(16，18)。胞外分泌的真核蛋白一段用一段短的信号肽来控制蛋白进入内质网。然后信号肽在内质网膜的腔面被一信号肽酶切去，成熟蛋白，本案中为一昆虫毒素，被包装以便从细胞中分泌。O’Reilly等(6)的结果显示在杆状病毒表达系统中信号序列是有功能的。合适的信号序列可选自黑腹果蝇的表皮信号序列，家蚕的绒毛信号序列，烟草天蛾的载脂蛋白的信号序列，家蚕的性特异性信号序列，烟草天蛾的脂动激素的信号序列，家蚕的pBMHPC-12信号序列，黑腹果蝇的酯酶-6的信号序列和病毒的蜕皮激素糖基转移酶的信号序列。此外，许多天然发生的位于异源真核蛋白上的信号序列在杆状病毒感染的昆虫细胞中也起作用以介导向胞外分泌。

编码信号肽和毒素蛋白核酸序列也可对毒素产生的量产生影响，并因而影响到效率和用工程化后的病毒处理昆虫后，感染昆虫死亡的速度。包括编码生长的毒素多肽链的氨基酸密码子在内的核酸序列的改变允许了编码基因的序列的变化(37)。因为每个密码子包括三个核苷酸，而组成DNA的核苷酸是严格的四种特定碱基，这样有64种核苷酸的可能组合，其中的61种编码(氨基酸剩下的3个密码子编码转录终止信号)。结果是许多氨基酸由不止一种密码子决定。比如，丙氨酸和脯氨酸由4个三联体密码编码，丝氨酸和精氨酸由6个编码，然而色氨酸和蛋白酶仅由一个三联体密码编码。这种简并性允许DNA碱基组成可在很广的范围内变化而不改变该DNA编码蛋白的氨基酸序列。这种简并性的进化发展和维持的一种假设就是由于这种几个密码子编码一个单一氨基酸的灵活性而使得核酸序列中的点突变的潜在的有害结果变得最小。照此而言，并非所有的一个密码子中的点突变都导致一个非期望氨基酸的引入并且因此而合成一错义蛋白，或当引入一转译终止密码时，导致转译的不成熟终止并产生一个截短的蛋白。

在肽链的生长中，许多生物体有一种偏爱，即用一特定的密码子来引入一特定的氨基酸，密码子优选性或密码子偏倚性，在生物体间的密码子应用有差异，是由于遗传密码的简并性造成的，并且在许多生物体中的该特性均已被很好地记录(38～43)。密码子偏倚性通常同信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，除了其它因素之外转而言之翻译效率被认为是依赖于被转译的密码子的特性以及特别的转运RNA(tRNA)分子的存在。细胞中选中的占绝对优点tRNAs一段是在肽合成中利用频率最频繁的密码子的反映。照此而论，基于对这些转译因素的优化，在杆状病毒表达系统中，基因可以被加工以便获得最佳的表达。为了利用病毒基因组所展现的密码子偏倚性，可以构建合成基因。技术人员都明白，如果密码子的运用是倾向于用那些病毒或病毒复制于其中的细胞所喜欢的密码子，那么就可能进行成功的基因表达。优选的密码子的确定可通过详尽地调查可得到的病毒或昆虫基因的序列而定。然而，若昆虫同病毒的天然宿主在进化上相差甚远时，则从昆虫得到的序列信息是有疑问的数据。比如，用黑腹果蝇基因组中的偏倚性密码在AcNPV中表达异源基因是不合理的，因为蝇(比如，果蝇)和蛾(比如鳞翅目)的最近的共同祖先约在2亿五千万年前(44，45)。用于帮助在NPVs中基因表达的密码子选择的更有用也更具说服力的信息可通过检查病毒的天然宿主(也就是说，鳞翅目昆虫)基因的密码子偏倚性以及通过检查编码高表达病毒蛋白的基因而得到。

决定多角体蛋白和P10蛋白表达的NPVs的启动子已知是一非常晚期的强大的启动子，因而常被选作用于在杆状病毒表达系统中表达异源基因。事实上，AcNPV感染昆虫宿主细胞27到48小时后，昆虫细胞中的多聚腺苷酸化RNA总量的20％约是多角体蛋白mRNA(46，47)。再者，多角体蛋白mRNA可被有效翻译，导致大量的多角体蛋白。由于启动子的强大及多角体蛋白在NPV生活史中的重要性，基于NPV多角体基因中的密码子频度构建了一个合成形式的LqhIT2基因，包括来自AcNPV和黄杉毒蛾NPV的多角体基因。基于在此5种NPV基因中密码子的显现频率来选择密码子。

当组成多角体蛋白的20种氨基酸及终止信号的编码密码子被调查后，优选密码子很容易地被找出。比如，对于甘氨酸，GGC是优势密码子，利用率为60％，而GGA和GGG的利用率仅分别为14％和4％。其它优选密码子也轻易被鉴别出，包括：天冬氨酸，GAC(74％)对GAT(26％)；精氨酸，GGC(37％)或CGT(33％)对CCG(1％)或CGA(1％)；天冬酰胺，AAC(86％)对AAT(14％)；异亮氨酸，ATC(69％)对ATA(6％)；苏氨酸，ACC(53％)对ACA(4％)或ACC(13％)，半脱氨酸，TGC(73％)对TGT(27％)；酪氨酸，TAC(81％)对TAT(19％)；苯丙氨酸，TTC(65％)对TTT(35％)；谷氨酰胺，CAA(94％)对CAG(6％)；组氨酸，CAC(83％)对CAT(17％)和脯氨酸，CCC(58％)对CCA(10％)。基于密码子运用中的优势及明显的差异，我们设计并合成了一个LqhIT2的合成基因。

事实上，在NPV多角蛋白基因中观察到的密码子运用的差异在宿主细胞及病毒感染的生物体中也存在。考虑了下列鳞翅昆虫基因：昆虫基因查阅号¹烟芽夜蛾细胞色素P-450 U23506烟芽夜蛾保幼激素结合蛋白 U22515烟芽夜蛾气味结合蛋白 S62226烟芽夜蛾外激素结合蛋白 S62222烟芽夜蛾线粒体p63分子伴侣 X56034烟芽夜蛾 ATP酶 L16884烟芽夜蛾保幼激素酯酶 J04955粉蚊夜蛾 Preproattacin A U46130粉蚊夜蛾溶菌酶前体蛋白 U38782粉蚊夜蛾杀菌肽A前体蛋白 U38645粉蚊夜蛾热休克蛋白70 U23504粉蚊夜蛾碱性保幼激素^s血液蛋白² L03281粉蚊夜蛾碱性保幼激素^s血液蛋白¹ L03280草地夜蛾内切蛋白酶FURIN Z68888草地夜蛾免疫亲合蛋白FKBP46 U15038

¹基因库

在许多例子中，多角体基因同鳞翅目昆虫基因间有相似的密码子优选性。比如，对于天冬氨酸，多角体基因(polh)和鳞翅昆虫(lep)基因的密码子GAC的利用率分别为74％和64％。其它优选密码子的频率包括，异亮氨酸，ATC-polh69％和ATC-lep52％；苏氨酸，ACC-polh53％和ACC-lep36％；半胱氨酸，TGC-polh73％和TGC-lep57％；酪氨酸，TAC-polh81％和TAC-lep73％；及苯丙氨酸，TTC-polh65％和TTC-lep73％。除了这些观察到的平行性外，比较多角体基因和鳞翅昆虫基因的密码子频率，在这二个基因群体间还未发现某一特定密码子的运用是明显冲突的。表1总结了从观察到的5个核型多角体病毒的多角体基因及15个鳞翅昆虫基因中推断的密码子运用的频率。

表1 在NPV多角体基因和鳞翅昆虫基因中密码子利用频率

频率¹

氨基酸密码子多角体鳞翅目昆虫

丙氨酸 GCA 0.08 0.19

GCC 0.38 0.32

GCG 0.25 0.20

GCT 0.30 0.29

精氨酸 AGA 0.12 0.17

AGG 0.15 0.23

CGA 0.01 0.09

CGC 0.37 0.26

CGG 0.01 0.08

CGT 0.33 0.16

天冬酰胺 AAC 0.86 0.66

AAT 0.14 0.34

天冬氨酸 GAC 0.74 0.64

GAT 0.26 0.36

半胱氨酸 TGC 0.73 0.57

TGT 0.27 0.43

谷氨酰胺 CAA 0.94 0.51

CAG 0.06 0.49

谷氨酸 GAA 0.46 0.51

GAG 0.54 0.49

甘氨酸 GGA 0.14 0.29

GGC 0.60 0.26

GGG 0.04 0.09

GGT 0.23 0.35

组氨酸 CAC 0.83 0.66

CAT 0.17 0.34

异亮氨酸 ATA 0.06 0.17

ATC 0.69 0.52

ATT 0.25 0.31

亮氨酸 CTA 0.13 0.09

CTC 0.28 0.18

CTG 0.27 0.27

CTT 0.14 0.16

TTA 0.07 0.12

TTG 0.11 0.17

赖氨酸 AAA 0.46 0.36

AAG 0.54 0.64

甲硫氨酸 ATG 1.00 1.00

苯丙氨酸 TTC 0.65 0.73

TTT 0.35 0.27

脯氨酸 CCA 0.10 0.26

CCC 0.58 0.26

CCG 0.16 0.18

CCT 0.15 0.30

丝氨酸 AGC 0.29 0.15

AGT 0.14 0.13

TCA 0.06 0.17

TCC 0.08 0.21

TCG 0.29 0.14

TCT 0.14 0.20

苏氨酸 ACA 0.04 0.23

ACC 0.53 0.36

ACG 0.13 0.14

ACT 0.30 0.27

色氨酸 TGG 1.00 1.00

酪氨酸 TAC 0.81 0.73

TAT 0.19 0.27

缬氨酸 GTA 0.12 0.23

GTC 0.28 0.30

GTG 0.43 0.24

GTT 0.16 0.23

终止子 TAA 1.00 0.48

TAG 0.00 0.33

TGA 0.00 0.19

频率值1.00＝100％

在有些情况下，选择变化的密码子是为了加快遗传操作。编码LqhIT2毒素的密码子偏倚性型的基因(序列号SEQ ID NO：12)同天然的LqhIT2(序列号SEQ ID NO：11)编码区的cDNA拷贝相比，186个核苷酸中有41个被改变。

为了制备插入到杆状病毒载体中的密码子经优化的LqhIT2基因，设计并用标准合成手段合成了5套寡聚核苷酸(图2；SEQ ID NO：1～10)，每套编码毒素蛋白的一个特定区域，每套寡核苷酸经退火后均形成双链核酸片段，并且具有特定的单链突出。设计突出部分是为了，有连接酶存在时，核酸片段在合适温度下温育，片段可以以定向的，而非随机的方式连接到一起，这样就会形成一编码连有信号多肽的LqhIT2毒素多肽的单个核酸片段。此外，其5′和3′末端还有一个限性内切酶识别位点，用适当的酶消化后，形成的DNA片段可容易地插入到先前制备的克隆载体的插入位点上。连接后的片段用多聚酶链式反应扩增，分离扩增后的DNA并用合适的限性酶消化，消化得到的片段克隆到中间质粒载体上。该中间载体可方便插入毒素基因的操作及测序，这样就加快了插入片段的识别鉴定，并且可以为以后的亚克隆入一合适的杆状病毒转移载体做准备。

经确证的编码毒素的片段从中间克隆载体切下并用标准的分子克隆技术将之亚克隆入一杆状病毒转移载体。在一个实施方案中，插入到转移载体中发生在杆状病毒的强大的晚期P10启动子的下游。该P10-LqhIT2嵌合基因的5′和3′端侧翼序列与杆状病毒基因组编码内源多角体基因的DNA序列同源。在转化合适的细菌宿主后，插入方向正确的转化子的筛选是用限性内切酶消化DNA，通过观察消化后得到的不对称的DNA片段的电泳迁移而确定。选出插入方向正确的克隆，制备该重组转移载体的质粒DNA。在另一实施方案中，合成的编码LqhIT2毒素的结构基因被插入到杆状病毒转移载体的早期IE1启动子和hr5增强子的下游区域。相对于启动子和增强子而言插入方向正确的合适的遗传构建物的鉴定按在P10-LqhIT2转移载体中所描述的方法进行。

通过共转染含有处于P10或IE1启动子转录控制下的嵌合的信号肽-毒素基因，处于多角体启动子转录控制下的多角体基因，以及杆状病毒侧翼DNA，和来自多角体-阴性杆状病毒的经纯化的，线性化后的基因组DNA，成功地将合成的LqhIT2基因导入到杆状病毒基因组中。这些DNA通过本领域熟知的技术导入到感受态的昆虫细胞中。观察单层转化细胞中的噬菌斑形成，并从噬菌斑中观察多角体包含体的存在。包含体的存在表明含有多角体基因及编码LqhIT2嵌合基因的转移载体的区域同多角体-阴性杆状病毒DNA成功地发生了重组。在转移载体中存在有多角体基因可弥补杆状病毒DNA中的多角体基因的功能缺失，这样就为筛选重组病毒提供了方便的方法。

向杆状病毒基因组中插入LqhIT2基因形成重组杆状病毒可被Western证明，用的是兔的LqhIT2毒素特异性的多克隆抗体。SDS-PAGE分离感染细胞抽提物后再转至适当的介质上作免疫印迹分析。令人惊讶的是，同其它人所报道的数据不同，感染细胞抽提物中含有一分子量同LqhIT2相同的多肽，而特异性识别LqhIT2的抗体是用纯化的LqhIT2毒素免疫获得的。这是编码LqhIT2蛋白的基因成功表达的首例报道。

用重组及野生型AcNPV口腔感染烟芽夜蛾的一龄或三龄幼虫后，测其存活，以所来估计表达LqhIT2的重组杆状病毒控制靶昆虫群体的能力。昆虫幼虫用接种表达LqhIT2毒素的重组病毒的食物饲喂。此外，对照昆虫用未接种的食物或含有1)野生型，非重组病毒或2)表达AaIT，一个广泛运用的昆虫特异性蝎毒素的重组病毒的食物饲喂。观察幼虫的行为变化，直至死亡。用含有Ac LqhIT2或CG201-3-1饲喂的昆虫的死亡较那些喂以野生型病毒的昆虫的死亡快得多。令人吃惊的是，表达在晚期P10启动子或早期IEI启动子转录控制下的LqhIT2的重组病毒显示出比表达AaIT的重组病毒更快杀昆虫效应。植物保护实验也显示了Ac LqhIT2的昆虫控制成效。昆虫幼虫用掺入了待测病毒或对照病毒的食物饲喂。感染后的幼虫放于大豆植物上，并且培养一段适当时间后，定量植物物质的破坏。实验结果显示相对于野生型病毒和表达AaIT的重组病毒而言，Ac LqhIT2处理可以很大地减少植物被破坏。

本发明的组合物一般可同农业上适宜的载体包括液体或固体溶解物共同使用。可用的制剂包括尘土、颗粒、饵、块、悬液、浊液、湿粉、十的流动剂及类似物，需同活性组分的物理特征，使用方式和环境因子如土壤类型，湿度及温度相一致，并能同病毒相容。可喷洒制剂可溶于一种合适的介质中，喷洒量从每亩1到几百升。高强度的组分主要用作进一步配制的中间物。制剂中应典型包括有效剂量的活性成分，溶剂和表面剂，其范围如下，各物质加和为100重量百分比。

重量百分比

活性成分溶剂表面活性剂湿粉 5-90 0-74 1-10油状悬液，乳液 5-50 40-95 0-15溶液(包括乳化浓度)粉末 1-25 70-99 0-5颗粒、饵、块 0.01-99 5-99.99 0-15高强度组分 90-99 0-10 0-2

典型的固体溶剂在Western等的《杀虫剂粉尘溶剂和载体手册》第二版，Dorland Books Caldwell.新泽西，中有叙述。典型的液体溶剂在Marsclen的《溶剂指南》第二版，Interscience，纽约，(1950)中有叙述。Allured Corp.，Ridgewood，新泽西，出版的《MoCutcheon’s洗涤剂和乳化剂年鉴》以及Chemical Publ.Co.Inc.，纽约，(1964)，出版的由Sisely和Wood编写的《表面活性剂百科全书》列出了表面活性剂并推荐了其应用。所有制剂中均包含少量添加剂以减少泡沫，成块，腐蚀，微生物的生长及诸如此类的事，应注意保证所有的组合物中的成分应是相互相容的且不能导致病毒感染活性的丧失。

好的固体组合物应是在一锤击磨或液体能量磨中通过混合和研磨制得。水分散颗粒可通过凝聚一好的粉末组合物生产；参见Cooss等《杀虫剂配方》，华盛顿D.C.(1988)251～259页的实例悬液可通过湿磨制备，参见U.S.3,060,084中的实例。颗粒和丸可通过向颗粒状载体上喷洒活性物质或通过凝集技术制作。参看Browning，“凝集反应”，化学工程，12月4日，1967，147～148页，《Perry’s化学工程师手册》第四版，McGraw-Hill，纽约，(1963)，8～57页及其后，以及WO 91/13546。

若想进一步了解配方工艺方面的信息，参见U.S.3,235,361，6卷16行到7卷19行以及实例10～41；U.S.3,309,192，5卷43行或7卷62行及实例8，12，15，39，41，52，53，58，132，138～240，162～164，166，167和169～182；U.S.2,891,855，3卷66行到5卷17行以及实例1～4；Klingman的《杂草控制科学》，JohnWiley和Sons，Inc.，纽约，(1961)，81～96页；以及Hance等的《杂草控制手册》，第八版，Blackwell Scientific Publications，剑桥，(1989)。

下面的例子中，均是重量百分比且所有配方均按常规方法制备。

实施例A 湿粉

杆状病毒 65.0％

十二烷基苯酚聚乙二醇醚 2.0％

木素碳酸钠 4.0％

硅铝酸钠 6.0％

蒙脱石(煅烧过的) 23.0％

实施例B 颗粒

杆状病毒 10.0％

硅镁土颗粒(低挥发物质，0.71/0.30mm；

U.S.S.No.25～50筛)

实施例C 挤出的丸

杆状病毒 25.0％

脱水硫酸钠 10.0％

粗木素磺酸钙 5.0％

烷基萘磺酸钠 1.0％

钙/镁皂土 59.0％

本发明的组合物展示出广谱的抗鳞翅目害虫的活性，这些害虫为食叶的，食果实的，食茎的和食种子的，它们对农业、林业、温室作物、观赏作物、苗圃作物及纤维产品影响严重。本领域的技术人员会理解并非所有组合物对于所有害虫的所有发育阶段同样有效。然而，本发明中的所有组合物均显示出抗鳞翅目幼虫的活性。特别地，这些组合物可抗秋天的粘虫(草地夜蛾)，烟草芽虫(烟芽夜蛾)，玉米铃虫(HelicoverpaZea)，美洲棉铃虫(棉铃虫)，甜菜粘虫(甜菜夜蛾)，钻石背蚕蛾(小菜蛾)和卷心菜尺蠖(粉纹夜蛾)。

本发明的组合物还可同一种或多种其它的杀虫剂，杀真菌剂，杀螨剂或其它生物活性复合物混在一起形成一各组分的杀虫剂，这就有了更广的农业防护谱。能同本发明的重组病毒相配使用的其它农业保护剂的例子有杀虫剂：钠通道激动剂(即拟除虫菊酯类)，钠通道阻断剂(即，吡唑啉类)，乙酰胆碱酯酶抑制剂(即，有机磷类及氨基甲酸类)、尼古丁乙酰胆碱结合剂，gabaergic结合剂，Octapine激动剂或拮抗剂(即甲脒类)及带氧体解偶联剂(即，吡咯杀虫剂)。特定的可同本发明的重组杆状病毒混合杀虫剂的例子有：avermectin B，久效磷，杀虫威，马拉松，对硫磷-甲基，地亚农，溴丙磷，乙丙硫磷，triflumuron，氟脲杀，蒙五一五，buprofezin，thiodicarbf，杀虫灵，甲基谷硫磷，毒死蜱，乐果，fipronil，flufenprox，地虫磷，丙胺磷杀扑磷，甲胺磷，亚胺硫磷，磷胺，伏杀磷，抗蚜威，甲拌磷，特丁磷，敌百虫，甲氧氯，bifenthrin，biphenate，tefluthrin，分扑菊酯，fluvalinate，imidacloprid，四聚乙醛和鱼藤酮。此外，杀真菌剂也可同本发明的重组病毒混合，其中包括：多菌灵，福灵联，十二烷胍、代森锰，地茂散，苯菌灵，cymoxanil，fenpropidine，fenpropimorph，triadimefon，克菌丹，甲基托布津，涕必灵，phosethyl-Al，百菌清，氯硝胺，氨丙灵，敌菌丹，二氯苯甲乙基二氧咪唑烷羟酰胺，oxadixyl，烯菌酮，春雷霉素，myclobutanil，tebuvnazole，difenoconazole，diniconazole，fluquincorazole，ipconazole，metconazole，penconazole，propiconazole，uniconzole，flutriafol，prochloraz，pyrifenox，fenarimol，氯苯氧基二甲乙基三唑乙醇，diclobutrazol，氯氧化铜，呋氨丙灵，灭菌丹，flusilazal，杀稻瘟菌素S，diclomezine，克瘟散，富士一号，iprobenfos，mepronil，新一硫甲胂，pencycuron，噻菌灵，pyroquilon，tricydazole，有效霉素，和flutolanil。

在一些特定例中，因其它杀虫剂配合使用有相近的控制范围但对抗性处理而言，不同的作用方式都有特定的好处。

通过向害虫的包括农学和/或非农学的感染部位的环境中，向需预防的地区，或者直接向受控害虫施用有效剂量的本发明的一种或多种组合物，可使鳞翅目害虫得到控制，并保护了农艺，园艺和特种作物，以及人类健康。优选的施用方法是喷雾，可替代地，这些化合物的颗粒制剂也可施于植物的叶子或土壤中。施用的其它方法包括直接或滞留喷雾，空中喷雾，种子包被，微囊，系统摄取，雾剂，气溶胶，粉尘或其它多种方法，该组合物可渗入到昆虫要吃的食物(饵)中或放入诸如捕捉器之类的装置中。

该组合物可以其纯的形式施用，但最常用的还是以一种含有杆状病毒及合适的载体，稀释剂和表面活性剂的制剂使用而且根据深思熟虑后的最终用途，很可能同一种食物(饵)结合使用。施用的优选方法包括喷洒节肢动物杀灭剂的水分散剂或精炼的油悬液。同喷雾油、浓缩喷雾油、喷洒剂杆、佐剂、溶剂和协同剂的联用常能增强杀灭节肢动物的效率。

有效控制所需的施用率依赖于诸如受控昆虫的种类，害虫的生活史，生活阶段，大小，分布，一年中所处时间，宿主作物或动物，取食行为，交配行为，环境湿度，温度及类似的因素的影响。在正常环境下，每亩约0.01到0.05kg的活性成分的施用率足以在农学生态系统中控制害虫，但也可能少至0.001kg/公顷的用量就足够或者是每公顷需要1kg。对于非农学施用，有效使用率在1.0到50mg/平方米的范围内，但也可能少至0.1mg/平方米就足够或是要用到150mg/平方米。

实施例1

构建合成的LqhIT2结构基因

为了制备NPV-偏倚性形式的LqhIT2基因，设计并用标准的磷亚酰胺化学合成成了10个寡核苷酸(图2：SEQ ID NO：1～10)。这些寡核苷酸按照图3中所描述的流程，采用厂商推荐的方案，用Gibco/BRL(Gaithersburg)公司的激酶磷酸化，退火结合并用Gibco/BRL的连接酶连接。连接所得片段用PE公司AmpliTaq^TM聚合酶(Norwalk，CT)按照厂商方案用聚合酶链式反应扩增，其修改在下文描述。寡核苷酸Lq1(SEQ ID NO：1)被用作正向引物而Lq10(SEQ ID NO：10)用作逆向引物。这些方案的详述见下。

进行了10个独立的磷酸化反应(每个寡核苷酸一个反应)。每种寡核苷酸(SEQ ID NO：1～10)取250pmol各放于一个1.5mL微量离心管中。5μl的10×激酶缓冲液，1μl的1mM ATP，6μl的激酶(Gibco/BRL，10单位/μl)，以及足量的水随后加入到每管中以使总的反应体积为50μl。10个管于37℃温育1小时。温育后，每种磷酸化后的寡核苷酸取5μl(25pmol)放于同一个微量离心管中，将该管置于95℃的干热加热块上。关闭加热块并使之冷却到室温以加速磷酸化的寡核苷酸的退火结合。50μl的磷酸化的，退火结合的寡核苷酸移于另一微量离心管中，再加入15μl的5×连接酶缓冲液，3μl的10mM ATP，4μl的连接酶(Gibco/BRL，5单位/μl)和3μl的去离子水。于37℃将此管温育30分钟然后于室温下过夜。

包含退火结合的和经连结的合成核酸片段用PCR扩增，以不同的模板DNA(含有经磷酸化，退火结合并联结后的寡核苷酸)稀释度做3个PCR反应。所用PCR反应混合物如下：

61.5μL去离子水

10μL10×PCR缓冲液(Perkin-Elmer Cetus)

2μL dATP，dCTP，dGTP，dTTP(每种200μM)

0.5μL Ampli Taq^TM聚合酶(2.5单位/100μL)模板DNA用去离子水稀释为1∶100，1∶1,000和1∶10,000(体积比)。分别向3个0.5ml微量离心管中移入80μl反应混合物。再分别向每管中加入5μl(100pmol)的寡核苷酸Lq1(SEQ ID NO：1)和5μl(100pmol)的寡核苷酸Lq10(SEQ ID NO：10)(用作PCR的正向及逆向引物)。向每管中加入经适当稀释后的10μl模板。用PE公司的DNA热循环仪按下列扩增方案进行PCR反应：

步骤1 96℃ 3分钟

1个循环 75℃ 3分钟

步骤2 95℃ 30秒

25个循环 75℃ 2分钟

步骤3 95℃ 30秒

1个循环 75℃ 5分钟

扩增产物用2％琼脂糖胶电泳分析。每个反应均可见一约为300碱基对的扩增片段。

LqhIT2基因及侧翼序列经PCR扩增后，用1.2％琼脂糖胶分离该300bp带并用SpinBind DNA回收系统(FMC，Rockland，ME)按厂商说明纯化此带，分离的片段用BamHI消化以使含有LqhIT2基因及信号序列的合成寡核苷酸产生5′和3′的粘性末端。消化后的片段用常规的分子克隆技术插入到质粒pTZ-18R(发玛西亚，Piscataway，NJ)的BamHI克隆位点上。将pTZ-18R转化大肠杆菌XL1 BLue(Stratagene，Menasha，WI)后，筛克隆并制备质粒DNA。鉴定出8个阳性克隆并且用市售的pTZ-18R的正向逆向引物(发玛西亚)测序。有一个克隆(16号)被发现含有编码合成基因及信号序列的正确序列。所得质粒含有2个BamHI位点：一个接近毒素基因5′末端，另一个在终止密码子后。按常规办法制备质粒DNA，并用BamHI消化以切下含有LqhIT2基因及信号序列的300碱基对片段。通过在1.6％琼脂糖胶上电泳将此片段同载体分离，将对应于该片段的带切去并用SpinBind^TM DNA回收方法(FMC)纯化之。

实施例2

含有处于杆状病毒晚期启动子转录控制下的合成的

LqhIT2结构基因的重组AcNPV的构建及检测

经纯化的LqhIT2基因片段用常规的分子克隆技术插入到杆状病毒转移载体pAcUW21(Pharmingen，圣迭戈，加州)的Bgl II位点上，该亚克隆导致了合成基因插入到载体所带的P10启动子的3′端，而且在位于转移载体上的非-功能LacZ片段的5′端，连接后，DNA转化大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)。连接后，BglII和BamHI位点均被破坏，所得质粒用位于LqhIT2基因3′末端的非对称Sph I位点筛选。二十三个转化子的质粒DNA的电泳分析表明有3个阳性克隆。用Sph I(切割LqhIT2基因3′末端)和BamHI(切割位于转移载体上的多角体基因的编码序列区)同时消化质粒来验证插入的方向。鉴定出一个带有LqhIT2基因且插入方向正确的克隆。该构建物使得LqhIT2合成的结构基因插入到P10启动子下游且在多角体基因上游(pAcUW21.LqhIT2；见图5)。

草地夜蛾细胞(sf-9)用含有3.0％胎牛血清的ExCell^TM 401培养基(TRH Biosciences，Lenexa，KS)扩增培养。向50μl的pAcUW21.LqhIT2(500μg)和线性化的多角体基因-缺陷型AcNPV(2.5μg，Baculogold^TM病毒DNA，pharmingen)中加入Lipofectin^TM(50μl，浓度0.1mg/ml，Gibco/BRL)。用病毒DNA/转移载体溶液其转染sf-9细胞(约50％单层时)。共转染后5天收集上清液并用常规的噬斑纯化方法，其中仅能选中多角体-阳性噬斑(12)分离重组病毒。

总共选出7个斑块；每个都悬于500μl的含有2.5％胎牛血清的ExCell^TM培养基中。用100μl的病毒悬液接种长于35mM碟子中的sf-9细胞(50％单层时)，并于感染后5天收集上清液。为了制备大量病毒用于定性，这些上清液用于接种更大量的组织培养物以使重组病毒大规模扩增。

用免疫印迹及生物方法证明LqhIT2基因插入到杆状病毒基因组中。sf-9细胞用野生型AcNPV(对照)或Ac LqhIT2(5个不同的分离物)感染。三天后，收集感染细胞并且用离心细胞悬液以去除生长培养基。倾去消耗过的培养基，剩余细胞用Branson Sonifier^TM(450型)在装置2裂解30秒。用一冷冻微量离心机(4℃)有15,000rpm离心10分钟以去除细胞碎片。

根据厂商的说明用BCA蛋白测定(Pierce，Rockford，IL)对感染的经超声裂解的细胞的蛋白浓度进行定量。制作基于已知浓度的牛血清白蛋白标准曲线。样品和标准在37℃温育30分钟。用分光光度计测量562nm的光吸收。用线性回归分析来确定每个样品的蛋白浓度。

各个定量样品的蛋白用蛋白电泳分离。用去离子水将样品稀释至324mg/ml蛋白。向75μl的电泳上样缓冲液(3.8ml去离子水，1.0ml 0.5MTris-HCl，pH6.8，0.8ml甘油，1.6ml 10％(重量/体积)SDS，0.04ml β-巯基乙醇；0.4ml 0.5％溴酚蓝)中加入25μL的样品。用100μl上样缓冲液稀释1μl生物素化的蛋白分子量标准(Gibco)以制备分子量标准。然后将样品及标准在95℃加热2分钟。向15％小蛋白IITris-HCl制成胶(伯乐，Melvile，NY)上样(20μl/孔)。向已装好的电泳装置中加入电泳缓冲液(1升去离子水中含3g Tris碱，14.4g甘氨酸，1.0g SDS)，样品在40mA电流下电泳约1.5小时。

电泳后，用Western印迹法将分离的蛋白从胶上转至硝酸纤维素膜上。将印迹纸(3MM；Schleicher和Schuell，Keene，NH)和硝酸纤维素膜切得同胶差不多大小并浸于Western转移缓冲液(11.6g Tris碱，pH 8.3，5.8g甘氨酸，0.74g SDS，400毫升甲醇，1.6L去离子水)中。印迹纸，硝酸纤维素膜和胶按下列顺序放置：3层印迹纸，胶，硝酸纤维素膜；和3张印迹纸。这种“三明治”结构放在转移仪上，使得胶向着负极而硝酸纤维素膜向着正极。通过向转移仪通电4小时，60mA，而将蛋白转移。转移后，拆除转移仪并于空气中干燥硝酸纤维素膜。

转移蛋白的免疫印迹分析按下步骤进行，所有操作均在室温下于一转动振荡器中进行。硝酸纤维素膜上未被转移蛋白覆盖的位点用溶于TTBS(20mM Tris，500mM NaCl，pH7.5，0.05％吐温-20)中的3％(重量体积比)的胶原封闭30分钟，移去封闭液并用100mlTTBS润洗5分钟膜。向10ml TTBS中加入10μl免抗体以制备LqhIT2-特异的免多克隆抗体(从Bruce Hammock博士处得到，U.C.Davis.Dauis，CA)一抗溶液加到已经封闭的硝酸纤维素膜上并温育1小时。然后，硝酸纤维素膜用100mL TTBS洗10分钟，重复三次。向20ml TTBS中加入10μl过氧化物酶联结的羊抗兔IgG(Sigma & Louis，MO)和10μl过氧化物酶标记的链霉亲合素以制成二抗。将膜同二抗温育1小时。温育后，用100ml TTBS洗膜10分钟，重复三次。向硝酸纤维素膜上加上检测试剂(ECL检测试剂盒；Amersham，ArlingHeighos，IL)并温育60秒。控干膜上的检测试剂，向膜上盖一层SaranWrap膜。将处理后的膜对X-线片(柯达X-OMAT AR，Rochester，NY)曝光2到10秒以检测膜上的信号。所有的5个AcLqhIT2分离物于7,000Mr处均有阳性的免疫印迹反应，而AcAaIT的信号则未能检测到。

筛选了5个独立的Ac LqhIT2分离物以测其生物学活性。这种方法包括比较Ac LqhIT2重组病毒和野生型AcNPV(对照)及表达AaIT毒素的重组AcNPVs的生物学活性。烟芽夜蛾的三龄幼虫由于取食含有待检病毒及对照病毒的食物而被口腔感染，然后观测其行为变化及死亡。

富集感染了Ac LqhIT2，AcNPV及AcAaIT的细胞，通过0.5％重量/体积的十二烷基磺酸钠，5M NaCl及去离子水的逐渐洗涤使得PIBs释放。水洗后，将游离的PIBs悬于小量的去离子水中，并用血球计数法计数，值得注意的是感染四天后，以Ac LqhIT2感染的Sf-9细胞产生的PIBs及细胞碎片要比感染了野生型病毒AcNPV及AcAaIT的细胞产生的少得多。

各单独的标准的昆虫食物栓(Plugs)接种大约5000PIBs。在开始本生物方法前，先将幼虫饥饿12小时，然后让其取食这种食物24小时。将幼虫转至一取食盘的不同的孔中并每天观测其症状及死亡。这种初始的生物方法显示了取食含有AcLqhIT2和AcAaIT病毒的食物后诱发的瘫痪。令人吃惊地，AcLqhIT2显示出比野生型AcNPV或AcAaIT病毒快得多的杀死幼虫的现象。选取三个经检测的Ac LqhIT2分离物及最好的AcAaIT病毒以做下一步测试。又一次地，结果显示出AcLqhIT2病毒可导致比任一种对照病毒快得多的死亡。

已着手进行该重组病毒的杀虫效果的总体评价。早期观察显示AcNPV表达的LqhIT2在昆虫细胞中可产生细胞毒作用。进而，由于细胞毒作用，同野生型AcNPV及AcAaIT相比，AcLqhIT2使每细胞产生的PIBs大大减少。事实上，用AcLqhIT2感染后的细胞培养物PIB的平均生成量为5.03×10⁷/100ml的细胞培养基，而AcAaIT及野生型AcNPV的每100ml细胞培养基中PIB的量为大于1.9×10⁹。为了制备更大量的Ac LqhIT2重组PIBs，将病毒于体内增殖。为得到体内产生的AcLqhIT2，AcAaIT和野生型AcNPV的PIBs，将从初始生物方法中得到的昆虫死尸在去离子水中匀浆，然后用探头超声并过滤以去除细胞碎片。然后，PIBs用标准的血球计数器计数。

用一些实验来整体分析病毒诱导的昆虫的死亡，其中烟芽夜蛾的三龄幼虫用受试病毒及对照病毒感染，然后观察死亡的发生。概率单位分析方案(48)用于获得时间-死亡和剂量-死亡曲线(表2)，并且用于测试重组于(AcLqhIT2和AcAaIT)和野生型AcNPVs的重要生物活性差异。致死时间(LTs)是通过让饥饿昆虫于接种有2500PIBs/栓的食物栓上取食24小时而得到。这些昆虫然后将移至单独的食物孔中并进行常规监测(至少一天二次)其死亡和/或瘫痪。AcLqhIT2、AcAaIT和野生型AcPNV的大致的LT₅₀(杀死暴露于病毒的昆虫的50％的时间；8次重复，每次重复16个幼虫，n＝128昆虫/每次处理)分别为感染后82.7，97.9和118小时。相似率测验(相等的斜率和截距，C.I.＝0.95)表明在各种处理间有很大的差异：用重组病毒，AcLqhIT2和AcAaIT处理的，同感染野生型AcNPV相比，有低得多的LT值。进一步，重组病毒AcLqhIT2和AcAaIT的斜率和截距的直接比较证明AcLqhIT2的LT₅₀值要远远低于AcAaIT的LT₅₀值。

在第二组实验中，确定了致死量(LDs)。烟芽夜蛾的三龄幼虫用接种了AcLqhIT2，AcAaIT，野生型AcNPV和共接种的食物饲喂。制备的融化食物中含有不同剂量的病毒以在样品群中建立一剂量曲线。食物栓中的PIB浓度范围为每mL食物中对数剂量从1×10²到1×10⁴PIB。喂食后94到160小时间，监测试验中的死亡。AcLqhIT2，AcAaIT和野生型AcNPV大致的LD508(杀死50％的暴露于病毒的昆虫所需的PIBs数量；4次重复，25个幼虫每次重复，n＝100昆虫/每次处理)分别为8.29×10²、9.15×10²和1.19×10³PIB/mL。相似率测试(同样的斜率和距，C.I.＝0.95)显示这三种病毒处理的效力没有明显的差异(表2)。

表2

重组病毒对烟草夜蛾三龄幼虫的致死剂量和致死时间

病毒 LD(PIBs×10²/mL) LT(小时)

10 50 90 10 50 90AcLqhIT2 1.03 8.29 66.6 66.8^a 82.7^a 102^aAcAaIT 1.55 9.15 53.9 76.7^b 97.9^b 125^b野生型AcNPV 2.52 11.9 56.1 95.6^c 118^c 145^c

a，b，c 同其它处理有重要区别-POLO概率单位分析程序(C.I.0.95)

PIBs＝多角包含体

LD＝致死剂量

LT＝致死时间

进一步的病毒效率的评估是在二周的大豆(Williams)植株上做的，植株植于盛有METROMIX 350生长培养基(Grace-Sierra，Milpitas，CA)的4平方寸盆中。这些植株生长于26℃的温室中。烟芽夜蛾的二龄幼虫暴露于病毒处理24小时，即将病毒以已经计算的，可导至超过99％的被处理昆虫产生致命感染的浓度渗入到食物中。暴露期后，感染后的昆虫被转至植株上。植株检测单位的结构中包含一包在一顶部开放的透明塑料管中的大豆植株。一层白色石英砂撒在培养基上以便能很容易地辨别出落于其上的昆虫。向植株上放三只处理过的昆虫并盖上塑料管上的盖，每次处理用十株植株。

检测单位放于一房间中，房中按16小时照光和8小时黑暗循环，并且供以需要的水分。实验的最后(所有处理过的昆虫均死亡)，拆下检测单位并且用Li-Cor叶子面积计(Li-Cor，Lincoln，NE)称量植株的物质。对于野生型AcNPV，AcAaIT和AcLqhIT2残留的平均植株面积分别为154，199，223cm²，同时，未经处理的植株(对照)的物质的平均量为243cm²。这些数据显示了相对于未感染植株而言，野生型AcNPV，AcAaIT和AcLqhIT2的植株保护百分比分别为63.6，82.2和92.1(图7)。很明显，表达毒素的重组病毒可提供更强的保护，并且AcLqhIT提供的保护以远强于AcAaIT提供的。

实施例3

含有合成的，处于杆状病毒早期启动子转录控制下的

AcLqhIT2结构基因的重组AcNPV的构建和测试

用实施例2中所述的办法，将实施例1中的纯化的AcLqhIT2结构基因片段插入到杆状病毒转移载体PAcP+IE1TV3(由Donald Jarvis博士提供，德克萨斯农业实验站，德克萨斯A & M大学，学院站，德州)的BglI克隆位点上。该转移载体质粒是描述于美国专利第5,162,222号中的杆状病毒早期启动子转移载体的一个衍生物，此专利引入这里作为参考。这一构建物使得编码AcLqhIT2毒素的合成的结构基因插入到杆状病毒早期IE1启动子和hr5增强子区域下游连接后，将质粒DNA转化大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)。连接的结果使得Bal II和BamHI位点均被破坏，得到的转化子因含有一位于AcLqhIT2基因3′末端的包含独特的非对称的Sph I位点的质粒而得到筛选。

从24个转化子分离的质粒DNA经电泳分析，鉴定出23个Sph I阳性克隆。通过同时用Sph I(切割AcLqhIT2基因3′末端)和Stu I(切割位于Bgl II克隆位点下游的转移载体的多克隆位点的编码序列内部)消化质粒而证明插入的方向。分析了8个克隆，相对于从早期IEl启动子/hr5增强子区域转录的方向而言，其中的四个克隆含有方向正确的AcLqhIT2基因。从其中的一个克隆即CG201-3，分离得到的DNA通过共转染用来创建重组杆状病毒表达载体，基本上按照实施例2中描述的方案进行。分离噬斑并用组织培养扩增，并用实施例2中描述的方案，用生物方法确定其杀昆虫活力。

用受试和对照病毒感染烟草夜蛾的新生幼虫并观察死亡的产生。在这套生物学方法中，病毒在1.0×10⁴PIBs/ml的浓度渗入到昆虫食物中。概率单位分析方法(98)用来获得时间-死亡曲线并用于检测重组病毒(CG201-3-1和AcLqhIT)和野生型AcNPV的生物活性的重要的差异。CG201-3-1，AcLqhIT和野生型AcNPV的大致的LT₅₀(50％被处理昆虫死亡的时间)分别为44.4，61.5和91.0(4次重复，每次重复用25个幼虫，每次处理n＝100昆虫；表3)。相似率测试(C.I.＝0.95)表明处理间存在显著差异，揭示了使用任一种重组病毒均可导至比用野生型AcNPV更快的死亡。更具体地说，CG201-3-l的LT值较AcLqhIT要低得多，表明这种重组病毒可更快地杀死被处理的昆虫。这些数据显示了运用早期启动子来驱动一个密码子偏倚性的，合成的编码昆虫毒素的结构基因的表达可以减少所需死亡时间27.8％。这是同运用晚期启动子控制的表达相同的结构基因的病毒相比而得出的值。进一步，这些数据显示了同用非重组的，野生型AcNPV处理的对照相比，用表达-受到早期启动子转录调控的合成的毒素基因的病毒可使受处理的昆虫幼虫的死亡时间缩短50％以上。

表3

重组病毒对烟芽夜蛾1龄幼虫的致死时间

病毒 LT(小时)

10 50 90

CG201-3-1 32.7^a 44.4^a 60.3^a

AcLqhIT 47.4^b 61.5^b 79.6^b

野生型AcNPV 75.9^c 91.0^c 109^c

a，b，c同其它处理有重要区别-POLO概率单位分析程序(C.I.0.95)

LT＝致死时间

实施例4

包含合成的AcLqhIT2结构基因的重组AcNPV的构建

和检测，该基因是基于分离自蝎子Leurus quinquestriatus

hebraeus的LqhIT2基因的互补DNA

为了评估由NPV-密码子倾向的AcLqhIT2基因提供的较其cDNA形式所增加的有效性，合成了cDNA基因并用类似于实施例1，2和3中所描述的方法将其插入到AcNPV病毒基因组中。

合成的cDNA AcLqhIT2基因的生成，分离，亚克隆和检测按照实施例1中描述的类似于密码子偏倚性的AcLqhIT2基因的方式进行。为了制备AcLqhIT2基因的cDNA，设计并用常规的磷酰亚胺化学法合成了10个寡核苷酸。这些寡核苷酸按照图3中描述的流程用Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)的激酶磷酸化，退火结合并用Gibco/BRL的连接酶连接，用的方法是厂商所推荐的方法。连接后的片段用聚合酶链式反应(PCR)扩增，用的酶是Perkin-Elmer Cetus的AmpliTaq聚合酶(Norwalk，CT)，扩增方案是厂商提供的方案并作了下述的一些修改。

PCR扩增后，按照Origimal TA克隆试剂盒(Invitrogen圣地亚哥，加州)中所提供的办法将基因产物克隆到PCRTMII载体上。连接后，转化并作限性酶图谱分析，对几个克隆测序并且有一个克隆被证明是编码家蚕素信号序列和AcLqhIT2基因的cDNA。将此基因插入到杆状病毒转移载体pAcP+IE1TV3的Sac I/Not I克隆位点上。按照实施例2中详述的方案构建重组AcNPVs。

5个编码AcLqhIT2基因cDNA(IC735)的重组病毒候选者经增殖后，检测病毒的效应，按照致死时间值选出最好的病毒分离物，密码子偏倚性AcLqhIT2(CG201-3-1)，AcLqhIT2(IC735-1)的CDNA及野生型AcNPV(IC200-27)的致死时间特性通过进行对烟芽夜蛾新生幼虫和三龄，四龄幼虫的感染实验而得知，并确定任何的在致死时间上的重要差异(表4)。

对于三龄和四龄幼虫，用食物药丸法来确定其LT₅₀值。存贮的病毒制备物用Reichert-Jung明线血球计数计来量化。用去离子水将病毒悬液配成终浓度为1000～2000PIBs/ml。向十六孔聚苯乙烯板的每孔中均放50μl食物药丸。50000 OBs的剂量施用于每个50μl食物药丸的表面使该病毒处理干燥。每孔中放入一幼虫；将孔封闭并于28℃温育。完全吃光一个食物药丸后(约24hrs)，将幼虫转入未经处理的昆虫培养基并且每日三次定值其死亡。

对于新生幼虫，用食物掺入法来确定LT₅₀值。存贮的病毒制备物用Reichert-Jung明线血球计数计量化并用去离子水稀释成1.0×10⁵PIBs/ml的浓度。最终，1∶10稀释液用于昆虫培养基中。这一含病毒的培养基混匀30秒以保证浓度为1.0×10⁴PIBs/ml的病毒包含体悬液形成均一悬液。将此培养基倒入聚苯乙烯板的孔中，每板含25孔。每孔中约加入了2ml的食物。接种培养基固化后，向每孔中放入一烟草夜蛾新生幼虫。封闭孔并于28℃温育。每天二次定值幼虫的死亡。

这些实验中所得数据用Vistat统计分析包(50)来分析。对于所有受试的三个阶段的幼虫，编码密码子偏倚性AcLqhIT2基因的CG201-3-1杀死昆虫幼虫要比IC73501(LqhIT2的cDNA)以及IC200-27(野生型AcNPV)快得多。同IC735-1相比，密码子优化的CG201-3-1的LT₅₀值的减少在统计学上是重要的，对于三龄和四龄的烟芽夜蛾幼虫而讲，致死时间分别减少22％和9％(表4)。对于新生幼虫和三龄幼虫，LT_90s的差异则更加明显，用密码子优化的构建物，CG201-3-1(48)可使死亡时间分别减少约15％和32％。

表4

重组或野生型病毒对烟芽夜新生

及各龄幼虫的致死时间(LT ₅₀ )病毒 LT₅₀(小时)

新生三龄四龄CG201-3-1 61.7 62.9 69.3IC735-1 65.0 81.0 76.1野生型AcNPV 102 113 111参考文献(1)Granados，R.R.，Lawler，K.A.病毒学(1981)，108，297-308。(2)Vlak，J.M.，Rohrmann，G.F.生物控制中的病毒杀虫剂Maramorosch，K.，Sherman，K.E.，Eds.，Academic Press，NewYork，NY.(1985)，489-542。(3)Carbonell，L.F.，Klowden，M.J；Miller，L.K.病毒学杂志(1985)，56，153-160。(4)Carbonell，L.F.，Miller，L.K.应用环境微生物学(1987)，53，1412-1417。(5)Brusca，J.，Summers，M.，Couch，J.，Courtney，L.国际病毒学(1986)，26，207-222。(6)O’Reilly，D，R.，Miller，L.K.，Luckow，V.A.(1992)，杆状病毒表达载体：实验手册，W.H.Freeman and Company，NewYork。(7)King，L.A.，Possee，R.D.(1992)，杆状病毒表达系统，Chapmanand Hall，London。(8)O’Reilly，D.R.Miller，L.K.病毒学杂志(1990)，64，1321-1328。(9)O’Reilly，D.R.Miller，L.K.科学(1989)，245，1110-1112。(10)O’Reilly，D.R.Miller，L.K.生物技术(1991)，9，1086-

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序列表(1)一般信息：(i)申请人：

(A)名称：E.I.DU PONT DE NEMOURS AND

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(B)街道：MARKET街1007

(C)城市：威明顿

(D)州：特拉华

(E)国家：美国

(F)邮编：19898

(G)电话：302-892-8112

(H)电报：302-773-0164

(I)电传：6717325(ii)发明名称：重组杆状病毒杀虫剂(iii)序列数：13(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：3.5寸盘

(B)计算机：IBM

(C)操作系统：微软Window 3.1

(D)软件：微软WORD FOR Windows 6.0(vi)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日期：

(C)分类：(viii)代理人/事务所信息：

(A)姓名：FLOYD，LINDA AXAMETHY

(B)登记号：33,692

(C)文献/目录号：BA-9063-A(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：75碱基对

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(A)长度：51碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：AACGAGGGCT GCGACAAAGA GTGCAAAGCC TACGGCGGCA GCTACGGCTA C 51(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：51碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TGCTGGACCT GGGGCCTCGC ATGCTGGTGC GAGGGCCTCC CCGACGACAA A 51(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：

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(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：ACCTGGAAAA GCGAGACCAA CACCTGCGGC TAAGGATCCT CTAGAGTC 48(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：

(A)长度：69碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CACCCACATC ACGGTGCTAA GCATAAGGGC AATAGCAAGG AGGATCTTCA TAGGATCCGA 60ATTCATCGT 69(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：

(A)长度：51碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：AAGGCAGGCC ACTTTGCAGC CGTCGCGGCG TTTGATGTAG CCGTCGGTGC T 51(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：

(A)长度：51碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GTAGCTGCCG CCGTAGGCTT TGCACTCTTT GTCGCAGCCC TCGTTGCCGA T 51(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：

(A)长度：51碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GTCGGGGAGG CCCTCGCACC AGCATGCGAG GCCCCAGGTC CAGCAGTAGC G 51(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：

(A)长度：54碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：1O：GACTCTAGAG GATCCTTAGC CGCAGGTGTT GGTCTCGCTT TTCCAGGTTT TGTC 54(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：186碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GACGGATATA TAAAAAGACG AGACGGATGC AAGGTTGCAT GCCTGATCGG AAATGAGGGC 60TGCGATAAAG AATGCAAAGC TTATGGTGGC TCTTATGGAT ATTGTTGGAC CTGGGGACTT 120GCCTGCTGGT GCGAAGGTCT TCCGGATGAC AAGACATGGA AGAGTGAAAC AAACACATGC 180GGTTAA 186(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：186碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GACGGCTACA TCAAACGCCG CGACGGCTGC AAAGTGGCCT GCCTTATCGG CAACGAGGGC 60TGCGACAAAG AGTGCAAGGC CTACGGCGGC AGCTACGGCT ACTGCTGGAC CTGGGGCCTC 120GCATGCTGGT GCGAGGGCCT CCCCGACGAC AAAACCTGGA AAAGCGAAAC CAACACCTGC 180GGCTAA 186(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：243碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：ATGAAGATCC TCCTTGCTAT TGCCCTTATG CTTAGCACCG TGATGTGGGT GAGCACCGAC 60GGCTACATCA AACGCCGCGA CGGCTGCAAA GTGGCCTGCC TTATCGGCAA CGAGGGCTGC 120GACAAAGAGT GCAAGGCCTA CGGCGGCAGC TACGGCTACT GCTGGACCTG GGGCCTCGCA 180TGCTGGTGCG AGGGCCTCCC CGACGACAAA ACCTGGAAAA GCGAAACCAA CACCTGCGGC 240TAA 243

Claims

1.一种编码昆虫选择性神经毒素的合成基因，该基因包含经过优化从而有利于基因表达的编码核苷酸序列，这种优化是基于杆状病毒的密码子偏倚性或是杆状病毒复制所在的细胞中的密码子的偏倚性，其中所述合成基因包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列。

2.一种合成基因，该基因包含与权利要求1的合成基因框内融合的编码合适的信号肽的核苷酸序列。

3.权利要求2的合成基因，其中合适的信号肽来源于家蚕素。

4.权利要求3的合成基因，该基因包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列。

5.一种嵌合基因，该基因包含与一种或多种指导昆虫细胞中嵌合基因编码序列表达的调控序列可操纵连接的权利要求2的合成基因。

6.权利要求5的嵌合基因，其中调控序列包含选自早期启动子、立早启动子、晚期启动子及极晚期启动子的杆状病毒启动子。

7.一种重组杆状病毒，它包含权利要求1的合成基因。

8.一种重组杆状病毒，它包含权利要求2的合成基因。

9.一种重组杆状病毒，它包含权利要求5的嵌合基因。

10.权利要求9的重组杆状病毒，它选自命名为ATCC保藏号VR-2501和ATCC保藏号VR-2502的重组杆状病毒。

11.一种杀虫组合物，该组合物包含权利要求7-10中任一项的重组杆状病毒及合适的载体。

12.一种控制节肢动物的方法，该方法包括对节肢动物或其周围环境施用杀虫有效量的权利要求7-10中任一项的重组杆状病毒。