CN1321064A

CN1321064A - 病毒蛋白介导的植物对虫害的抗性

Info

Publication number: CN1321064A
Application number: CN99810808A
Authority: CN
Inventors: W·A·米勒; B·C·伯宁
Original assignee: Iowa State University Research Foundation ISURF
Current assignee: Iowa State University Research Foundation ISURF
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2001-11-07
Also published as: WO2000015758A2; US20030217385A1; ZA200101805B; WO2000015758A9; JP2002525040A; BR9914495A; US7312080B2; WO2000015758A3; TR200200727T2; AU6144899A; TR200100753T2; EP1148782A2; CA2340583A1

Abstract

本发明涉及将有效抵抗昆虫(包括但不局限于牧草虫、叶蝉和甲虫)的肽毒素与能帮助肽毒素从昆虫肠转移到血腔的运输肽组合起来。该组合可通过编码肽毒素以及运输肽的遗传物质的融合来实现,从而使该遗传物质融合物的表达导致合成将毒素和运输肽的功能组合起来的融合蛋白。刺吸式昆虫摄取融合蛋白,将融合蛋白转移到昆虫的肠中,再靠运输肽的功能活性转移到血腔内,毒素在血腔内对昆虫发挥其毒性作用。在一个较佳的实施方案中,本发明有效地防治了此类刺吸式昆虫(如蚜虫、粉虱等),以及以循环性方式传播病毒的其它病媒。

Description

病毒蛋白介导的植物对虫害的抗性相关申请交叉文献

本申请要求了1998年9月14日提交的美国临时申请No.60/100,132的优先权。

联邦研究赞助声明

本发明至少是部分靠美国农业部合同No.97-34340-3987的基金而完成的。因此，美国政府在本发明中享有一定的权利。

发明背景

大多数植物病毒由昆虫载体传播。其它病毒是通过螨、真菌或线虫来传播的。感染昆虫的病毒如杆状病毒也通过病毒外壳蛋白作用从肠进入昆虫血腔。循环性传播的植物病毒进入昆虫传媒的血腔(体腔)。感染昆虫的病毒也进入血腔。在任何情况下，病毒都进化产生特化的蛋白以确保其在传媒体内存活。本发明打算利用这些病毒蛋白以及编码这些蛋白的基因来提呈和输送毒素或其它蛋白给病媒或有关的生物体。这可能适用于非病媒以及病媒的场合，因为在一些情况下，病毒通常与非病媒的血腔相互作用并进入血腔。而且，病毒蛋白可经修饰而能与自然界存在的众多生物体相互作用。通过有效地输送毒素，本发明可用来基因工程改造抗害虫的植物或用来构建生物杀虫剂。

植物病毒可以循环或非循环方式传播。我们将循环性传播广义地定义为“任何植物病毒必须以主动方式输送通过病媒的膜并在待传播的病媒中存活”(Gray,S.M.[1996]Trends in Microbiology 4:259-264)。通过该定义，即使是某些真菌也可认为是循环性传播的病媒。通常，在本领域中，病毒被理解为可分类成具有共同遗传特征、结构等的组。运输通过昆虫病媒膜的病毒组的例子包括：托斯泊病毒组(tospovirus)、植物呼肠弧病毒、植物棒状病毒组、水稻条纹叶枯病毒组、玉米雷亚多非纳病毒组、黄矮病毒组、双生病毒组、伊奈莫病毒组(enamoviruses)、芜菁黄花叶病毒组、豇豆花叶病毒组和南方菜豆花叶病毒组(同上：Gergerich,R.C.和Scott,H.A.[1991]Advances inDisease Vector Research.Harris,K.F.编辑，114页，Springer-Verlag)。通过真菌传播的病毒包括bymoviruses和真菌传棒状病毒组(前引书；Jianping等人[1991]Annals ofApplied Biology 118:615-622)。本发明包括所有这些病毒以及能获得这些病毒的病媒和非病媒。

本文所用的术语“黄矮病毒”包括黄矮病毒科(Luteoviridae)的所有病毒，包括主要的病毒属：黄矮病毒属(Luteovirus),Polerovirus和Enamovirus。本文实施例中描述的大麦黄矮病毒(BYDV)的RPV病毒株也称为“谷类黄矮病毒-RPV”，分类在Polerovirus属中(最近命名有变化)。然而，由于大多数相关领域称为BYDV，因此本文中保留该命名。

非循环性传播的病毒“与昆虫的口器或前肠的表皮衬层结合，当昆虫开始进食时，昆虫将消化性分泌物排入植物中。这些病毒既不主动运输通过病媒的细胞膜，病媒内部也不携带这些病毒。昆虫(以及线虫)的外部表皮衬层深深地延伸入口器和前肠，但在动物蜕皮时脱落(Gray,S.M.[1996]Trends in Microbiology 4:259-264)。尽管本申请列举了用植物病毒蛋白来向血腔输送毒素，但是非循环性传播的病毒也可以类似方式将毒素呈递到肠或口器的表面。理论上，如本文所述的能通过病毒蛋白的作用从肠进入昆虫血腔的病毒均可用来向昆虫输送毒素。

本发明列举了黄矮病毒及其蚜虫病媒。它们具有经彻底了解的循环性传播的病毒病媒相互作用。然而，相同的原理可应用于任何病毒-病媒相互作用，它们在开发昆虫抗性植物上的应用包括在本发明中。

黄矮病毒只能通过蚜虫来传播。传播机制是持续性和循环性的。病毒进入蚜虫的体腔(血腔)，并在蚜虫的一生中保持在哪里。蚜虫通过摄食受感染植物而获得该病毒。病毒颗粒(毒粒)通过假定的受体介导过程穿过后肠上皮细胞从蚜虫后肠输送到血腔内。然后，病毒穿过两个以上的膜屏障从血腔输送到副唾液腺(ASG)(Gildow,F.E.等人，[1993]Phytopathology 83:1293-1302；Power,A.G.等人[1995]《大麦黄矮病：40年的进展》St.Paul:APS Press,259-289页)(图1,2)。随后，蚜虫每次摄食时，将充满病毒的唾液分泌到植物细胞中来传播病毒。

对不同黄矮病毒株存在者高度的病媒特异性(Power,A.G.等人[1995]同上)。然而，在许多非病媒蚜虫种类中，许多黄矮病毒被输送穿过后肠膜进入血腔(Gildow,F.E.等人[1993]同上)。因此，认为病媒特异性是在ASG屏障处执行的。其它病毒如土豆卷叶病毒，传播通过的是中肠膜。非黄矮病毒被消化或排泄而不被摄入血腔中。因此，后肠上皮受体似乎对黄矮病毒有特异性(图2)。本发明中利用了这一事实。

黄矮病毒基因组由5.7kb单链正义RNA组成。病毒颗粒、蚜虫传播和病毒在植物中移动所需的蛋白均表达自病毒感染时产生的但未包壳在毒粒中的亚基因组RNA(sgRNA1)(图3)(Miller,W.A.等人[1997]Plant Disease 81:700-710)。黄矮病毒毒粒含有180拷贝的外壳蛋白(CP)。大约5-10％的CP亚基含有自毒粒伸出的长的羧基末端延伸物(Filichkin,S.A.等人.[1994]Virology 205:290-299)。该延伸物是这样的产生的：在sgRNA1翻译期间，当核糖体连读至CP开放读框(ORP)的终止密码子时，使下游ORF5翻译，结果产生融合的CP连读结构域(RTD)产物(Brown,C.M.等人.[1996]J.Virol.70:5884-5892)。

RTD中部(氨基酸242附近)含有一个不稳定的肽键，引起纯化的病毒制备物中的C端一半断裂(Filichkin等人[1994]同上)。由于蚜虫易传播纯化的毒粒，因此蚜虫传播不需要C端部分。另一方面，蚜虫传播(从蚜虫到植物)需要RTD的N端一半(Brault,J.等人[1995]EMBO J.14:650-659；van den Heuvel,J.F.J.M.等人[1997]J.Virol.71:7258-7265)，但是毒粒装配和通过后肠膜输送到血腔却不需要(Chay,C.A.等人.[1996]Virology 219:57-65)。

传播还需要较大的CP本身，因为需要完整的毒粒来保护病毒RNA。在血腔中，RTD的N端一半与内共生细菌产生的称为共生素(symbionin)的丰富蛋白结合(van denHeuvel等人.[1997]同上；Filichkin,S.A.等人[1997]J.Virol.71:569-579)。该蛋白很象细菌陪伴蛋白groEL，该蛋白确保许多不同蛋白的正确折叠。然而，与共生素的结合与groEL和其底物蛋白的结合不相似(Hogenhout,S.A.等人[1998]J.Virol.72:348-365)。共生素结合黄矮病毒毒粒的能力与该毒粒在血淋巴中半衰期增加相关(van den Heuvel等人.[1997]同上)。

已经惊奇地发现，紧靠CP ORF终止密码子3’的序列(近端RT元件)以及位于更下游的700-750碱基的序列(远端RT元件)是sgRNA1翻译期间CP ORF终止密码子连读所必需的(Brown,C.M.等人.[1996]同上)(图3)。即使是在远端RT元件和近端元件之间插入一报道基因使远端RT元件位于CP终止密码子下游2kb的3′非翻译区(UTR)中后，远端RT元件仍然有助于连读(Brown,C.M.等人.[1996]同上)。

当前的蚜虫防治很大程度上依赖于使用化学杀虫剂。施加杀虫剂来控制蚜虫传播病毒可能有意想不到的相反效果，由于蚜虫因亚致死剂量杀虫剂而骚动以及蚜虫捕食者被杀死，会增加蚜虫从植物到植物的移动，从而增加病毒的扩散(Schepers,A.[1989]《蚜虫：它们的生物学、天敌和防治》，Minks,A.D.等编，Elsevier,Amsterdam,C卷，123-139页)。另外，化学物质对蚜虫的作用有限，因为蚜虫迅速进化产生对杀虫剂的抗性。另外，需要有对环境无害的蚜虫防治方法来维持农业产量。

采用蚜虫抗性作物栽培品种可有效地减少蚜虫的危害(Auclair,J.L.[1989]Minks等人，同上，225-265页；Thackray,D.J.等人，[1990]Ann.Appl.Biol.116:573-582)。已经用常规的植物育种技术开发出了蚜虫抗性玉米系(Walter,E.V.等人.[1946]J.Am.Soc.Agron.38:974-977)以及对俄国小麦蚜虫(Diuraphis noxia)有抗性的小麦系(Quisenberry,S.S.等人[1994]J.Econ.Entomol.87:1761-1768)。用在昆虫肠中有活性的试剂，已经构建出抗昆虫的转基因植物。最值得注意的例子是苏云金芽孢杆菌毒素(Bt)基因的使用，但是已知没有一种Bt毒素能影响蚜虫。经工程改造的表达凝集素的转基因烟草已显示能提供抵抗蚜虫的保护作用(Hilder,V.A.等人.[1995]TransgenicRes.4:18-25)，利用病毒衍生的转基因已经产生了众多抵抗蚜虫传播的病毒的转基因植物(Miller,W.A.等人[1997]同上；Anon[1995]Genetic Engineering News 15∶1；Wilson,T.M.A.[1993]Proc.Natl.Acad.Sci.90:3134-3141)。

防治虫害的第二种方法是用杆状病毒，它是昆虫特异性病毒。这些病毒中有一些已被用来输送各种在血腔中有活性、但在昆虫肠中无活性的昆虫特异性毒素。例如，已经开发出重组的杆状病毒来控制鳞翅类(蛾)害虫(Bonning,B.C.等人[1996]Annu.Rev.Entomol.41:191-210)。这些杆状病毒已经工程改造，用来产生昆虫激素如利尿激素(Maeda,S.[1989]Biochem Biophys Res Comm。165:1177-1183)、酶如幼激素酯酶(Bonning B.C.等人[1997]Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:6007-6012)以及衍生自有毒种类(如蝎和寄生蜂)的昆虫特异性毒素(McCutchen,B.F.和Hammock,B.D.[1994],《天然和衍生的害虫处理试剂》，Hedin,P.等编，#551编，Washington,D.C.:Am.Chem.Soc.,348-367页，ACS Symposium Series；Hughes,P.R.等人.[1997]J.Invert.Pathol.69:112-118；Lu,A.等人.[1996]《生物学控制：理论和应用》1996,7:320；Gershburg,E.等人.[1998]FEBS Lett.422:132-136；Jarvis,D.L.等人.[1996]《生物学控制：理论和应用》，1996,7:228)。这些杀虫蛋白和肽目前不能用来防治蚜虫，因为尚没有系统能将它们输送到血腔内。杆状病毒不感染蚜虫，尽管已知诸如Rhopalosiphum padi等病毒能感染蚜虫，但是欲工厂改造用于控制蚜虫对于它们的生物学和遗传结构的知识还不够。另外，如本文所公开的，复制性转基因病毒的释放对生态系统所具有的危险比局限于种植物的非复制性病毒基因表达更大。在本发明中，转基因表达的非复制性植物病毒结构蛋白可将杀虫蛋白或肽输送到蚜虫血淋巴中。

从北非蝎(Androctonus australis Hector)毒液衍生的毒素AaIT对昆虫以及其它一些节肢动物(如甲壳类动物)的神经系统有独特的特异性(Zlotkin,E.[1986]《神经药物学和杀虫剂作用》，Chicester:Horwood；DeDianous S，等人，[1987]Toxicon 25:411-417)。AaIT对哺乳动物没有毒性。毒性试验、电生理学研究和结合试验已经记载了其对昆虫的严格选择性(Zlotkin[1986]同上)。AalT对测试的所有种类昆虫均有毒性。这些昆虫包括15种以上代表5个目的完全变态和半变态昆虫(双翅目、鞘翅目、网翅目、直翅目和鳞翅目)(Gershburg,E.等人.[1998]同上；Zlotkin[1986]同上；Herrmann,R.等人.[1990]Insect Biochemistry 20:625)。AaIT对各骨骼肌产生广泛而不协调的刺激导致反复刺激昆虫的运动神经，结果诱导了迅速的刺激性瘫痪(Walther,C.等人.[1976]J.Insect Physiol.22:1187-1194)。注入的AaIT的杀虫活性表明该毒素是对昆虫最强效的毒性化合物之一。AaIT的分子量仅8kDa，它具有四个二硫桥键，提供了高度组织化的构型(Darbon,H.等人，[1982]Int.J.Peptide Protein Res.20:320-332)。

AaIT不穿透昆虫的亲脂性甲上皮(DeDianous,S.等人.[1988]Pestic.Sci.23:35-40)。为了利用该毒素控制虫害，已经对各种杆状病毒进行了工程改造来表达AaIT(Gershburg,E.等人.[1998]同上；Jarvis,D.L.[1996]同上；Maeda,S.等人.[1991]Virology 184:777-780；McCutchen,B.F.等人.[1991]Bio/Technol.91:848-852；Stewart,L.M.D.等人.[1991]Nature 352:85-88)。这些病毒感染鳞翅目幼虫组织，且病毒产生的重组AaIT从病毒感染的细胞输出到体腔内，导致昆虫瘫痪。AaIT的表达对于鳞翅目种类害虫的控制是高度有效的，并且显著减少所引起的摄食破坏量。由于鳞翅目的神经(AaIT的靶部位)独特之处在于被起毒素屏障作用的神经胶质细胞覆盖。AaIT对非鳞翅目种类的毒性更高。然而，由于杆状病毒不感染蚜虫，因此它们不经修改不能用于控制蚜虫。另外，由于毒素的作用部位是神经，因此只表达AaIT的转基因植物将不是蚜虫抗性的，因为摄入的毒素将通过昆虫。

发明概述

本发明涉及将有效抵抗昆虫(包括但不局限于牧草虫、叶蝉和甲虫)的肽毒素与能帮助肽毒素从昆虫的肠转移到血腔的运输肽组合起来。这种组合可通过编码肽毒素以及运输肽的遗传物质的融合物来实现，使该遗传物质融合物的表达导致合成一种将毒素和运输肽的功能组合起来的融合蛋白。刺吸式昆虫摄取该融合蛋白，将融合蛋白转移到昆虫的肠中，再靠运输肽的功能活性转移到血腔内，毒素在血腔内对昆虫发挥其毒性作用。在一个较佳的实施方案中，本发明有效地防治了此类刺吸式昆虫(如蚜虫、粉虱等)，以及以循环性方式传播病毒的其它病媒。可采用各种运输肽，包括植物病毒的外壳蛋白或其具有运输功能的结构域，而刺吸式昆虫是将该病毒从植物传播到植物的病媒。例如，某些蚜虫传播的黄矮病毒的外壳蛋白和连读结构域在蚜虫情况下提供运输功能，而粉虱传播的双生病毒的外壳蛋白在粉虱情况下提供运输功能。

任何在靶昆虫循环系统中存在时具有毒性作用的肽理论上可插入毒性融合蛋白中。可以利用能穿过昆虫或其它害虫肠屏障的病毒蛋白来直接输送各种仅在害虫体腔内有活性的毒性因子。这些毒性因子的需求包括：(1)该因子应对目标害虫有特异性，而对哺乳动物没有毒性；(2)该因子在低水平下有活性；(3)该因子对宿主应有迅速的作用。这些毒性因子包括作用于昆虫神经系统的毒素，以及破坏昆虫体内稳态调节、导致进食受抑制和/或死亡的生理效应因子。各种此类毒素和生理效应因子已被具体用来通过重组杆状病毒表达来控制鳞翅目(蛾)害虫(目前的清单见表1和2)。昆虫特异性神经毒素通常被认为比生理效应因子更有效，其部分原因是昆虫对后者有反馈调节系统。在商业、政府和院校的实验室内，正在努力从利用毒液来固定其猎物的各种生物体中分离出了特异性靶向昆虫神经系统的毒素。病毒外壳蛋白输送系统可用来在一系列害虫种类中输送所有这些因子。

表1

表达神经毒性肽的重组杆状病毒毒素来源毒素病毒名称病毒效果测试的鳞翅目害虫参考文献

ET₅₀的减少进食减少螨 (Tomalski和Miller,1991；Pyemotes tritici TxP-1^a vSp-Tox34 40％粉纹夜蛾 Tomalski和Miller,1992)稻壁虱 (Lu等人，1996)

vp6.9tox34 60％粉纹夜蛾

草地夜蛾 (Popham等人，1997)

HzEGTDA 40％

-26tox34 Aelicopverpa zea蝎子Androctonus AaIT AcST-3 10-38％ 55-62％粉纹夜蛾 (Cory等人，1994；Hoovcraustralis AcAaIT 烟芽夜蛾等人，1995；Maeda等人，北非(阿尔及利亚)蝎子 BmAaIT 家蚕 1991；McCutchen等人，

1991；Stewart等人，1991)

Bonning和Harrison4

Ro6.9AaIT 35％玉米螟Leiurus LqhIT1 AcLIT1.p10 24％ Helicoverpa armigera (Gershburg等人，1998)quinquestriatus LqhIT2 AcLIT2.po1 32％ H.armigera (Gershburg等人，1998)hebraeus BmLqhIT2 家蚕c Imai,Aly&Macdad以色列黄蝎 LahIT3 AcLahIT3 20％烟芽夜蛾 (Herrmann等人，1995)

LqhαIT^b AcLα22 35％ H.armigera (Chejanovsky等人，1995)海葵Anemonia sulcata AsⅡ vSAt2p+ 38％ 48％粉纹夜蛾 (Prikhod’ko等人，1998；

Prikhod’ko等人，1996)Stichadactyla ShⅠ vSShlp+ 36％粉纹夜蛾 (Prikhod’ko等人，1996)helianthus蜘蛛Agelenopsis sulcata μ-Aga-Ⅳ vMAg4p+ 37％ 50％草地夜蛾 (Prikhod’ko等人，1998；美国漏斗网状蜘蛛粉纹夜蛾 Prikhod’ko等人，1996)(American funel web spider)Tegenaria agrestis TalTX-1 vTalTX-1 18-33 16-39％粉纹夜蛾 (Hughes等人，1997)

甜菜夜蛾

烟芽夜蛾Diguetia canities DTX9.2 vAcDTX9.2 9-24 30-40％粉纹夜蛾 (Hughes等人，1997)原始编织蜘蛛甜菜夜蛾primitive weaving spider) 烟芽夜蛾毒素组合 μ-Aga-Ⅳ+ vMAg4Sat2 43％ 63％粉纹夜蛾 (Prikhod’ko等人，1998)

AsⅡ 草地夜蛾a目前未知的作用机理b非选择性神经毒素。对哺乳动物的毒性弱。c注射感染的幼虫d未公开的数据

表2通过生理效应因子表达优化杆状病毒杀虫剂因子病毒靶标生理作用效果/ST50的减少测试的鳞翅目宿主参考文献利尿激素 BmDH5 马尔丕基氏管破坏水平衡 20％家蚕^a (Maeda,1989)信息素生物合成 AcBX-PBAN 信息素生物合成未知(表达5个肽) 19-16％粉纹夜蛾 (Ma等人，1998)激活神经肽(PBAN)幼激素酯酶(改进的) AcJHE-SG 未知破坏蜕皮或 30％粉纹夜蛾 (Bonning等人，

收缩麻痹进食破坏减少60％烟芽夜蛾 1995)

AcJHE-KK 幼激素破坏心胞细胞中的进食破坏减少50％烟芽夜蛾 (Bonning等人，

溶酶体靶向 1997)壳多糖酶 vAcMNPV.chi 壳多糖 22-23％草地夜蛾^a (Gopalakrishnan等

人，1995)玉米 BV13T 线粒体蛋白质与细胞膜结合 40％粉纹夜蛾^a (Korth和Levings,

BV13.3940 1993)反义c-myc MycAS 细胞调控 15-20％草地夜蛾^a (Lee等人，1997)

进食抑制egt缺失 vEGTDEL 未知-病毒egt基因马尔皮基氏管的分解 20％草地夜蛾 (Flipsen等人，

的缺失除去了病毒 1995a；Flipsen等人，

蜕皮甾体失活 1995b；O’Reilly和

Miller,1991)

a注射了病毒的幼虫

所有毒素列于表1，它们破坏昆虫神经系统中钠通道的调控，只有TxP-1和TalTX-1的作用机理目前未知。这些神经毒素作用于钠通道的几个不同的部位，一些作用是兴奋性的，导致收缩性麻痹，而其它是抑制性的，导致缓慢的弛缓性麻痹。昆虫选择性神经毒素的共注射显示，作用于钠通道不同部位的毒素能协同作用(Hermann,R.等人，[1995]Toxicon 33:1099-1102)，因此向目标害虫输送多个毒素能进一步提高本发明的杀虫效果。另外，施加低水平的拟除虫菊酯杀虫剂(靶向钠通道)或氨基甲酸酯杀虫剂(靶向神经系统中的乙酰胆碱酯酶)可与至少一种昆虫特异性神经毒素协同作用(McCuthen B.F.,[1997]J.Ec.Entomol.901171-1180)。因此，施加剂量非常低(LC₁₀-LC₂₀)的某些化学杀虫剂也能在使用这些神经毒素时增加病毒外壳蛋白输送系统的效果。

本发明使本领域普通技术人员能构建运输肽和昆虫毒性肽组合而成的融合蛋白，用来防治大范围的破坏各种商业上重要的植物的昆虫。这些植物包括，但不局限于，小麦、大麦、燕麦、大米、玉米(尤其是非洲的玉米条纹病毒和美国的甜玉米)、土豆、甜菜、大豆、西红柿、柑橘(桔子、柠檬、酸橙、柚子)、蔷薇科(玫瑰)、果树(李树、苹果树、樱桃树、桃树、梨树)、莴苣、法国菜豆、甘蔗、木瓜、南瓜、葫芦、香蕉、木薯、甘薯、葡萄、所有装饰植物等，包括属于前述植物家族的其它成员。

粉虱科(Aleyrodidae)，半翅目，包括蚜科(蚜虫)、根瘤蚜科(葡萄的根瘤蚜害虫)、腊蝉总科(半翅目，叶蝉科(叶蝉))、缨翅目(牧草虫)和鞘翅目，尤其是叶甲科(叶甲)和叶甲属(玉米根叶甲)。对于甲虫，如玉米根叶甲，已知其成虫能传播循环性病毒，该病毒的运输肽可用来控制这些昆虫。

可用各种方法将该融合蛋白输送给目标昆虫。然而，较佳的方法是在昆虫的自然摄食活动期间输送来自植物本身的融合蛋白。因此，本发明包括植物可表达的基因构建物，它能用来转化植物，使得该植物在被昆虫摄食的汁液或组织中表达融合蛋白。因此，能表达运输肽-毒素肽融合蛋白的转基因植物被赋予了抵抗昆虫引起的破坏以及昆虫传播的疾病的能力。植物可表达的基因构建物可以组成型表达，或以可诱导的方式表达，例如在所需的发育阶段，在所需的组织中，在所需的时间内或所需的环境条件下表达。构建物可由稳定整合的转基因或由瞬时载体来表达。也可用改进的植物病毒喷洒作物表面，通过目标昆虫摄食将毒性蛋白导入昆虫肠内。

本发明参照黄矮病毒外壳蛋白和蝎子毒素的组合来控制蚜虫作了描述。然而，应理解根据本文提出的原理并结合本领域已知的技术，所获得其它实施方案和变化方案均为本发明的一部分。因此，本发明包括将任何蛋白输送给任何节肢动物或以循环或非循环方式摄取并传播病毒的其它生物体(线虫)的血腔内。

附图简述

图1是蚜虫在植物上进食时的矢状径面示意图，该图显示了黄矮病毒传播的整个途径。

图2是黄矮病毒从后肠到蚜虫血腔的受体介导内吞过程的示意图。

图3是BYDV-PAV的基因组组织的框图。

图4是本文描述的不同的CP-RTD-AaIT融合蛋白的框图。

图5显示了野生型以及表达AaIT的病毒对蚜虫死亡率的作用。

图6说明了Northern印迹杂交显示燕麦原生质体中积累的野生型和表达AaIT的病毒RNA。图6A显示出溴化乙锭染色的凝胶表明核糖体RNA位置。图6B显示出用32P标记的BYDV-特异性反义RNA探测的RNA的位置。

发明详述

术语“肽”用来指任何多氨基酸，对其大小或分子量没有限制。本文所用的术语“肽”包括本领域中常用的术语“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”。

本文中的术语“运输肽”定义为将循环性传播的病毒从昆虫肠运输至血腔所需的肽片段。运输肽可包括所有或一部分病毒外壳蛋白或其它病毒蛋白，也可包括所有或部分连读结构域。外壳蛋白或其它病毒蛋白中构成运输肽的部分称为外壳蛋白或其它蛋白的一组分。在本领域中应该理解，病毒的运输肽与病毒昆虫宿主之间存在着特异性的相互作用。如本领域中所知道的，从已知能感染昆虫的循环性传播的病毒可获得针对给定种类昆虫的运输肽。

术语“昆虫毒性肽”指当输送至合适的昆虫作用部位时对昆虫有毒性的肽。本发明涉及在输送至昆虫血腔后发挥作用的毒性肽。表1中给出了已知的昆虫毒性肽的例子；然而，此类肽为人所知的数量越来越多，所有这些肽均可用于本发明。

“连读结构域”(RTD)用来表示在终止密码子下游(在翻译方向上)的DNA编码片段或开放读框，它的存在导致合成由终止密码子上游编码的氨基酸和终止密码子下游编码的氨基酸组成的融合蛋白。RTD的存在表现为具有终止密码子ORF下游编码氨基酸的蛋白质(连读)的合成频度比不存在RTD的合成频度增加来表示。对于位于外壳蛋白基因下游的RTD而言，RTD的存在导致产生了具有C端肽延伸物的一部分病毒外壳蛋白。对于BYDV而言，RTD为构建含有昆虫毒性肽的融合蛋白提供了一种简便的方法。由BYDV的RTD编码的肽是运输蛋白发挥功能所非必需的，但是它可能在运输功能中起作用。

如果DNA被转录，或其转录产物被翻译，则说编码DNA的片段在体内或体外“表达”。表达能导致合成mRNA或编码性DNA所编码蛋白质。

“与……连接/操作性相连”指核酸序列在物理上或功能上相关联。例如，如果两个序列操作性相连，或它们的位置使得DNA调控序列能影响编码或结构DNA序列的表达水平，则称启动子或DNA调控序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相连接”。

“嵌合基因”是一种重组核酸序列，其中启动子或核酸调控序列与编码mRNA或表达成蛋白质的核酸序列操作性相连或相连接，从而使核酸调控序列能调节与其连接的核酸序列的转录或表达。嵌合基因的核酸调控序列通常并不与其在自然界中发现的相连的核酸序列操作性相连。具有操作性相连的编码和表达控制片段的嵌合基因在本文中也称为“表达盒”。

“控制(防治)昆虫”指通过毒性作用抑制虫害存活、生长、进食和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的作物破坏或损失。“防治”昆虫可能意味杀死或不杀死昆虫，但是较佳的是指杀死昆虫。

“输送”毒素指使毒素与昆虫接触，从而导致产生毒性作用并防治昆虫。毒素可以许多认同的方式输送，例如通过转基因植物表达、配制的蛋白质组合物、可喷洒的蛋白质组合物、诱饵基质或其它任何本领域认同的毒素输送系统由昆虫经口摄入或与昆虫接触。

“植物”是处于任何发育阶段的植物，尤其是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构单元和生理学单元，它包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞形式或培养的细胞形式，或是较高组织化单位(如植物组织、植物器官或整个植物)的一部分。

本文所用的术语“植物组织”指组织成结构单元和功能单元的一群植物细胞。其包括在植物或培养物中的任何植物组织。该术语包括，但不局限于，整个植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构单元和/或功能单元的任何植物细胞群体。该术语与上述的或包括该定义内的任一具体类型的植物组织合用(或没有植物类型)并不意味着排斥其它的植物组织。

“启动子”是在编码区上游的非翻译的DNA序列，它含有RNA聚合酶Ⅱ的结合位点，并启动DNA的转录。启动子区域还可包括作为基因表达调控序列的其它元件。

“原生质体”是没有细胞壁或只有部分细胞壁的分离的植物细胞。

“调控元件”指参与控制核苷酸序列表达的序列。调控元件包括与感兴趣的核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。

“转化的/转基因/重组”指其中导入了异源核酸分子的宿主生物体(如细菌或植物)。核酸分子可以稳定地整合到宿主基因组中，或核酸分子可作为染色体外分子存在。这种染色体外的分子可以自主复制。转化的细胞、组织或植物被理解成不仅包括转化过程的最终产物，而且还包括其转基因后代。“非转化的”、“非转基因”或“非重组的”宿主指不含异源核酸分子的野生型生物体(如细菌或植物)。

由于黄矮病毒CP和CP-RTD被有效地摄入血腔，因此它们成为了运输与它们翻译融合的蛋白的理想载体。图1用来显示黄矮病毒传播的循环途径(来自Chay等人，[1996] Virol.219:57-65)。HG=后肠；MG=中肠；ASG=副唾液腺；PSG=主唾液腺。

图2是已经提出的黄矮病毒从后肠进入蚜虫血腔的受体介导的内吞机理的框图(来自Gray,[1996]Trends Microbiol.4:259-264)。该病毒与后肠上皮细胞上的特异性受体结合，并由内吞作用摄入。然后，含有病毒的泡囊与上皮细胞的基底质膜融合，病毒被释放到蚜虫血淋巴中。我们利用这些性质来输送已知仅在蚜虫血腔内才有毒性的非病毒蛋白。这种毒素的一个例子是AaIT。这种基因融合产生了一种有效的杀蚜虫转基因产物，因为该蛋白在血淋巴中的毒性水平较低(Gershburg,E.等人.[1998]同上；Jarvis,D.L.[1996]同上)。同样重要的是，该方法不可能伤害非目标生物，因为该毒素仅在昆虫体内有活性，且黄矮病毒的CP-RTD对蚜虫有特异性。该毒素对哺乳动物也没有伤害。该策略不仅能抵抗蚜虫直接引起的破坏，而且还能有效地抵抗众多由蚜虫传播的病毒。例如，通过蚜虫载体(Myzus persicae)的死亡，可以控制由黄矮病毒和非黄矮病毒引起的各种疾病。利用靶向蚜虫种类的抗性基因，本发明对蚜虫的防治以及蚜虫传播疾病的控制有明显的作用。

蚜虫是温带农业中经济上最为重要的害虫之一。它们以下方式导致产量下降：直接摄食；其产生的蜜汁促进了有害烟霉的生长；最重要的是，它们传播植物病毒(Harris,K.F.和Maramorosch,K.编，[1977]《作为病毒载体的蚜虫》，Academic Press,New York；Sylvester,E.S.[1989]《蚜虫：它们的生物学、天敌和防治》，Minks等人.[编辑])，Amsterdam:Elsevier,C卷，65-88页)。在英国，由于蚜虫本身引起的损失平均为每年1亿5千万美元(Tatchell,G.M.[1989],Crop Protection 8:25-29)。在美国，单单由最近引入的俄国白蚜(Diuraphis noxia)引起的损失到1989年就高达2亿美元(Burton,R.L.[1989]，“白蚜”，农业研究站第2年度报道，USDA,28页)。蚜虫传播的病毒也导致相似数量级的损失。在美国，BYDV引起的谷物损失通常为5％，其价值接近5亿美元(1989年的价格)(Hewings,A.D.等人.[1995]《大麦黄矮病毒：40年的进展》，D’Arcy,C.J.等编，APS Press,75-106页)。其它蚜虫传播的病毒在各种作物和树木中引起了甚至更高的损失(Miles,P.W.[1989]《蚜虫：它们的生物学、天敌和防治》，Minks,A.K.等编，Amsterdam:Elsevier,C卷，23-47页)。这些实施例说明了蚜虫问题的规模很大。

尽管化学、遗传和生物学的防治策略获得了成功，但是它们均有其限制和缺点。在生产和施加杀虫剂来特异性防治蚜虫及其传播的病毒性疾病时，消耗了许多吨的矿物燃料。化学喷雾剂的散布使用会伤害野生生物。因此需要别的环境上可接受的蚜虫防治方法来维持农场的收入和足够的食物产量。

生物学防治方法局限于特异的蚜虫-寄生虫相互作用，且对多年生作物最有效。遗传性蚜虫抗性基因的使用减少了化学防治的需要，但是天然抗性基因很有限。获得蚜虫抗性的转基因方法能将新的基因种类迅速导入流行品系中而不产生常规育种导入基因所需的返交。相同的构建物可用来工程改造所有易受蚜虫攻击的作物，因为黄矮病毒被摄入病媒和非病媒蚜虫的血腔中。本发明为避免使蚜虫对现有防治措施产生抗性而丧失控制的一组必须策略提供了新工具。

表3和SEQ ID NO:1(核苷酸序列)和SEQ ID NO:2(氨基酸序列)中给出了大麦黄矮病毒外壳蛋白和连读结构域的DNA序列和翻译的氨基酸序列。此外壳蛋白具有编码的前198个氨基酸的序列。紧跟在氨基酸200的密码子后的是TAG(琥珀密码子)终止密码子，紧接着是在同一读框内的编码缬氨酸的GTA。此外壳蛋白-连读融合物从氨基酸1延伸至669。在表3中，核苷酸数和对应编码的氨基酸数用成对的斜杠分开的数字表示。例如，在表3的第一行中，数字31/11代表第31个核苷酸(C在数字3的正下方)以及由核苷酸#31开始的密码子(CGC)编码的第11个氨基酸。

实施并评价本发明实施方案的步骤包括下列：

1．在下列系统中构建并表达CP-RTD-AaIT融合物：

A．在作为瞬时表达系统的复制性BYDV-PAV中。

B．在用来纯化重组蛋白的杆状病毒表达系统中。

2．测定CP-RTD-AaIT融合蛋白的蚜虫毒性。测定：

A．摄入的CP-RTD-AaIT融合蛋白的杀蚜虫效果。

B．注射的CP-RTD-AaIT融合蛋白的杀虫效果。

C．蚜虫血腔中AaIT的存在。

表3

DAN序列 1956碱基对 ATGAATTCAGTA…CAATTCCAGTGA 线性1 / 1 31 / 11ATG AAT TCA GTA GGT CGT AGA GGA CCT AGA CGC GCA AAT CAA AAT GGC ACA AGA AGG AGGmet asn ser val gly arg arg gly pro arg arg ala asn gln asn gly thr arg arg arg61 / 21 91 / 31CGC CGT AGA ACA GTT CGG CCA GTG GTT GTG GTC CAA CCC AAT CGA GCA GGA CCC AGA CGAarg arg arg thr val arg pro val val val val gln pro asn arg ala gly pro arg arg121 / 41 151 / 51CGA AAT GGT CGA CGC AAG GGA AGA GGA GGG GCA AAT TTT GTA TTT AGA CCA ACA GGC GGGarg asn gly arg arg lys gly arg gly gly ala asn phe val phe arg pro thr gly gly181 / 61 211 / 71ACT GAG GTA TTC GTA TTC TCA GTT GAC AAC CTT AAA GCC AAC TCC TCC GGG GCA ATC AAAthr glu val phe val phe ser val asp asn leu lys ala asn ser ser gly ala ile lys241 / 81 271 / 91TTC GGC CCC AGT CTA TCG CAA TGC CCA GCG CTT TCA GAC GGA ATA CTC AAG TCC TAC CATphe gly pro ser leu ser gln cys pro ala leu ser asp gly ile leu lys ser tyr his301 / 101 331 / 111CGT TAC AAG ATC ACA AGT ATC CGA GTT GAG TTT AAG TCA CAC GCG TCC GCC 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关于CP-RTD性质及编码它的基因必需考虑的几个因素：(1)CP和RTD表达所需的基因区域；(ⅱ)CP-RTD蛋白中有助于在肠中稳定、进入血腔以及在血淋巴中稳定的结构域；(ⅲ)是整个病毒颗粒对在蚜虫消化系统中存活并进入血淋巴有作用，还是融合蛋白本身就足够了；和(ⅳ)CP-RTD和AaIT的不同融合物对于AaIT毒性的影响。可用各种方法来表达和测试该构建物。一种方法是从受感染细胞中的复制性BYDVRNA表达出BYDV-AaIT融合物，然后纯化该蛋白。另一种方法是用杆状病毒表达系统来表达融合蛋白。前一方法的优点是，它可作为植物细胞中的快速高水平瞬时表达系统，该植物细胞是构建物将作为转基因表达的天然环境。后一方法能使胞核中DNA的基因表达于其病毒成分之外(在转基因植物情况下)，从而能迅速纯化蛋白产物，直接评价其与蚜虫的相互作用。这两种方法可同时进行。

1．CP-RTD-AaIT融合蛋白的表达

A．BYDV-PAV复制表达系统。

BYDV-PAV瞬时表达系统使人能鉴定出对蚜虫毒性最大的CP-RTD-AaIT融合物。这就减少了在稳定的植物转化前要测试的构建物数量。图3是BYDV-PAV的基因组组织的框图。粗线表示基因组(g)和亚基因组(sg)RNA。ORF如Chay等人，(1996)Virol.219:57-65中那样编号。外壳蛋白(CP)和连读结构域(RTD)翻译来自sgRNA1。蚜虫传播(AT)所需的RTD部分在蛋白水解切割位点(剪刀处)的上游。其它功能是聚合酶(POL)和体系移动蛋白(MP)。

在一个实施方案中，我们除去了指定AaIT分泌的信号序列(Maeda,S.等人.[1991]Virology 184:777-780；Adachi,T.等人.[1989]J.Biol.Chem.264:7681-7685)，并将编码成熟AaIT蛋白的200核苷酸区域置于pPAV6的ORF5(编码RTD)中(Di,R.等人.[1993] Molec.Plant-Microbe Interactions6:444-453；Mohan,B.R.，等人.[1995]Virology 212:186-195)。用噬菌体T7聚合酶体外转录pPAV6产生在燕麦原生质体中有感染性的全长BYDV-PAV基因组RNA(Mohan,B.R.等人.[1995]Virology 212:186-195)。在质粒pTZ-AaHIT中侧接AaIT基因端部引物的5’端加入HpaⅠ位点(McCutchen,B.F.[1991]同上)。在PCR和HpaⅠ消化后，将片段克隆到pPAV6中独特的H.a.Ⅰ位点内，使AaIT编码区与ORF5的读框相符，在近端和远端RT元件之间。图4显示了待测试的CP-RTD-AaIT融合物的例子。剪刀表明了RTD蛋白水解切割的大概部位(Filichkin等人，[1994]Virol.205:290-299；van der Heuvel等人，[1997]J.Virol.71:7258-7265)。制得有和没有AaIT终止密码子以及有和没有CP终止密码子的构建物(图4A,E)。对应于图4A的具有CP终止密码子、AaIT插入物侧接有RTD片段的构建物命名为AaIT6,SEQ ID NO:4给出了其序列。对应于图4E的第二个构建物具有CP终止密码子，但还含有AaIT终止密码子，其命名为AaIT11,SEQ ID NO:6给出了其序列。AaIT6和AaIT7的翻译的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6中。测试它们的表达。完全复制并翻译此构建物，如pPAV6所示。含ORF 5中插入了大得多的1.8kb GUS基因的转录物在燕麦原生质体中有效复制，RTD-GUS融合物表达所需的连读是有效的(Brown,C.M.dr.[1996]同上)。

当该融合蛋白在血淋巴中的稳定需要RTD的整个未切割部分时，我们将AaIT基因置于该区域的3’端远端。这对破坏RTD蚜虫的传播功能的可能性比内部插入的可能性低。RTD中的蛋白水解切割位点定位于大约氨基酸242处(Filichkin,S.A.[1994]同上；van den Heuvel,J.F.J.M.[1997]同上)，它对应于ORF5中的碱基4237(图3、4)。切割位点紧靠远端连读元件3’端的下游(碱基4219)(Brown C.M.等人.[1996]同上)。应当理解，将AaIT插入蛋白水解切割位点的下游可能会导致毒粒在到达后肠前丧失AaIT。我们将AaIT插入紧靠切割位点的上游，从而在蛋白水解切割后，它非常靠近RTD的C端(图4C,D)。用PCR诱变方法(Landt,O.等人.[1990]Gene 96:125-128；Kuipers,O.P.等人.[1991]19:4558)向该构建物导入常规限制性位点。

可以测定各种构建物的相对效果，以优化它们在不同条件下的活性。例如，可通过与病毒蛋白的N端和C端融合来影响AaIT的活性，如图4A,C中的构建物那样。将AaIT ORF置于成熟RTD末端的构建物(图4C,D,E,F)增加了AaIT保留神经毒性的可能性，因为AaIT将仅有一个N端融合。对于插入AaIT的所有位置，我们描述了具有和没有AaIT终止密码子的构建物。然而，AaIT终止密码子的存在会导致RTD表达较少，尤其是在AaIT OFR接近CP终止密码子的构建物中(图4E)。因此，效果的优化可包括在病毒和AaIT功能之间权衡。另外，可以测到RTD和CP ORF大量缺失。结果使人能对CP ORF终止密码子连读所需的RNA结构域以及在蚜虫中的稳定性和CP-RTD运输通过后肠上皮所需的蛋白质结构域进行作图。上述作图能更精确地确定提供有效连读的序列，还能确定适合插入昆虫毒性肽编码序列的其它区域。

原生质体接种和病毒纯化

如前所述(Koev,G.等人.，[1999]J.Virol.73:2876-2885；Mohan,B.R.等人.，[1995] Virology 212:186-195)，制得感染性RNA转录物和原生质体。用具有6毫秒300V单脉冲的BTX Electro Square Porator T820(San Diego,CA)进行电穿孔，用15微克病毒RNA转录物转染燕麦原生质体。对于每个构建物，各转染6个样品。电穿孔48小时后，600xg离心6分钟，收获原生质体。除去上清液，将沉淀重悬于400微升10nM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中。超声处理该悬液2-3秒。经超声处理的原生质体4℃18000xg离心(微量离心)30分钟。将上清液转移到新的1.5毫升管中，于冷室内冰上放置过夜或多达48小时。然后再次以18000xg(4℃)微量离心上清液30分钟。根据需要重复该离心步骤，直至上清液充分澄清。将上清液转移到3毫升超离心管中，加入10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，使体积增加至3毫升。然后4℃90000rpm离心该试管30分钟(Beckman TL100超离心机，转头66iB)。弃去上清液，将沉淀重悬于80微升10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中。用该粗制的病毒制备物来给蚜虫喂食。

膜进食试验

在燕麦植物(品系Clintland64)上培养禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)。用于给蚜虫喂食的容器用具有黑色不透明表面的6×15毫米培养皿制成。在下方培养板中央开一个18毫米的孔。每个培养皿可容纳最高150只蚜虫。用50％蔗糖1∶1或1∶2稀释上述部分纯化的病毒抽提物，通过将80-100微升的该稀释液置于两个Parafilm膜之间来给无病毒的蚜虫喂食，该膜伸展通过下方培养板中的孔。将平板置于用黄色滤光片覆盖的荧光灯盒上方7厘米以上。在室温下进食过夜(16小时)后，计数存活的和死亡的蚜虫数。进食期越长，自然死亡率增加越显著。

最初的困难在于开发一种蚜虫摄食而不会因厌恶或不能摄食而饿死的令人满意的蚜虫摄食系统。在上述摄食装置中，蚜虫能有效进食，存活率很高。其它摄食系统或将蚜虫靠光源太近，结果导致在没有病毒或毒素时有过多的蚜虫死亡。其次，未感染的原生质体的抽提物最初导致大量蚜虫死亡，这很有可能是因为粗制细胞抽提物中的某组分导致蚜虫讨厌进食。通过上述差速离心步骤部分纯化病毒，克服了该问题。

在两个实验中，当喂给CP连读结构域中携带AaIT的病毒抽提物时(图5)，蚜虫的死亡明显多于喂给阴性对照溶液时的蚜虫死亡数。阴性对照溶液包括(ⅰ)蔗糖溶液和(ⅱ)接种了野生型病毒的原生质体抽提物。肉眼观察显示，以AaIT6(图4A)或AaIT11(图4E)病毒为食的大多数蚜虫的死因不象厌恶进食那样，因为许多蚜虫死在膜上。厌恶进食使蚜虫爬向培养皿周围，远离膜死亡。最重要的是，AaIT基因显然与蚜虫死亡有关。当用编码AaIT6和AaIT11的病毒喂食时，死亡的蚜虫比用以野生型病毒为食的死亡数多得多，该野生型病毒来自pPAV6，其与AaIT6和AaIT11构建物的不同之处仅在于缺少AaIT基因(图5)。用于测试每一转录物的进食液中的两种蔗糖稀释度之间没有差别。用单向ANOVA对图5的数据进行统计分析，然后对缓冲液、PAV6、AaIT6和AaIT11进行Tukeys两两多重比较检验(pairwise multiple comparison test)(每一处理的n=4)：用50％蔗糖作1∶1和1∶2稀释分别导致最终浓度为25％(w/v)和12.5％的蔗糖。所有比较均有显著性差别p＜0.05，即存活等级如下：缓冲液处理＞PAV＞AaIT6＞AaIT11。

在Northern印迹杂交中观察到有AaIT mRNA。细胞经用于进食试验的相同构建物接种后48小时，分离出总RNA。接种后48小时，如Koev，等人.(1999)(同上)所述的那样，从经上述实验2所用每种构建物接种的原生质体等份中抽提出总RNA。用变性琼脂糖凝胶电泳分离RNA，并用溴化乙锭染色，以便通过核糖体RNA的显色来验证加载了总RNA(图6A)。然后，将RNA印迹到尼龙膜上，如上所述用32p标记的BYDV特异性反义RNA探测(Koev，等人.1999)。磷显影计检测到放射活性带(图6B)。表明病毒感染期间产生的基因组RNA(gRNA)和三个亚基因组RNA(sgRNA)具有移动性。sgRNA1是CP-RTD-AaIT融合蛋白的mRNA。亚基因组RNA3和4是从病毒基因组3’端转录的小的sgRNA。如预计的那样，AaIT6和AaIT11感染细胞的sgRNA1和gRNA比PAV6感染细胞的稍大(迁移更缓慢)，这是因为RTD中插入了210nt的AaIT基因(图6B)。AaIT6和AaIT11的亚基因组RNA1与大量丰富的核糖体RNA共同迁移，这些核糖体RNA使亚基因组RNA在Northern印迹杂交中显得模糊。然而，仍然检测到了显著的水平(图6A，泳道AaIT6和IAIT11)。AaITmRNA(亚基因组RNA1)的存在提示正在表达AaIT融合蛋白。这些水平稍稍低于野生型的事实(图6B，泳道PAV6)表明蚜虫死亡率并不是简单地与病毒复制量成正比，而是与AaIT基因的存在相关。

AaIT11比AaIT6引起的死亡率更高可以解释为AaIT11中缺少与AaIT蛋白的羧基端融合。AaIT6的氨基和羧基端均与CP的RTD融合(图4A和SEQ ID NO:4)，而AaIT11有其自己的终止密码子(图4E和SEQ ID NO:6)。因此，AaIT11仅有氨基端与RTD融合。额外的氨基酸序列与蛋白质融合会引起错误的折叠或使感兴趣结构域折叠而不暴露在表面。这些结果暗示，大多数RTD(AaIT的下游部分)是AaIT输送至血腔所不需要的。这与以前的工作相符合，即RTD是蚜虫传播病毒所需的，但病毒输送至血腔并不需要RTD(Chay，等人.，[1996]同上；van den Heuvel，等人，[1997]同上)。

这些实验使人能评价高比例的CP:RTD的效果，与除去CP终止密码子使100％的连读翻译成CP-RTD-AaIT融合物作比较。也有可能所有应用都不需要RTD。完全阻止连读的突变仍能使毒粒被摄入血淋巴中(Chay，等人.[1996]同上)，但是RTD的缺少表明会降低黄矮病毒毒粒在血淋巴中的半衰期(van den Heuvel，等人.[1997]同上)。当需要将整个毒粒输送到血淋巴中时，需要CP终止密码子，和通过连读表达AaIT，因为100％的连读阻止了毒粒的装配(Mohan,B.R.[1995]同上)。当后肠上皮受体识别以及随后内吞进入血腔中需要CP中的小肽时，可以删除CP中不需要的序列。

所有构建物的表达均用标准的在原生质体中的复制试验来监测，用Northern印迹杂交检测病毒基因组和亚基因组RNA(Mohan,B.R.[1995]同上；Rasochova,L.等人.[1996]Molecular Plant-Microbe Interactions 9:646-650)，用Western印迹检测CP和CP-RTD，用ELISA测定毒粒的积累(Brown,C.M.[1996]同上)。如上所述，使蚜虫以原生质体抽提物为食，测定蚜虫毒性。

B．杆状病毒表达系统

为了测定CP-RTD-AaIT融合蛋白的剂量反应，给蚜虫喂食杆状病毒表达系统中产生的纯化的重组融合蛋白。从编码仅仅那些ORF(CP、RTD和AaIT)的DNA(而不是整个复制性BYDV基因组)表达出上述各种CP-RTD-AaIT融合物。较佳的是用本领域中已知的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)和标准技术(O’Reilly,D.R.等人.[1992]《杆状病毒表达载体：实验指南》，W.H.Freeman and Company,New York)。将该融合蛋白序列插入pAcMP1的Bgl Ⅱ克隆位点(Hill-Perkins,M.S.等人.[1990]J.Gen.Virol.71:971-976)。用每个重组的转移载体和含有lacZ基因的病毒AcUW1-PH的线性化DNA共转染昆虫细胞(草地夜蛾；Sf21:Vaughn,J.L.等人.[1977]In Vitro13:213-217)(Weyer,U.等人.[1990]J.Gen.Virol.71:1525-1534；Kitts,P.等人.[1993]Biotechniques 14:810-817)。得到的重组病毒在杆状病毒晚期强启动子p6.9控制下表达每种融合蛋白(Bonning,B.C.等人.[1994]J.Gen.Virol.75:1551-1556)。纯化重组病毒(通过在底物X-gal存在下没有β-半乳糖苷酶活性来鉴定)，扩增并用来感染Sf21细胞，用于生产融合蛋白(O’Reilly等人.[1992]同上)。

从昆虫细胞培养物纯化重组融合蛋白的方法取决于细胞中是否产生病毒颗粒。前面已经在杆状病毒系统中表达了黄矮病毒外壳蛋白基因，结果导致在受感染的昆虫细胞胞核中形成病毒颗粒(Tian,T.等人.[1995]Virology 213:204-212；Blanc,S.等人.[1993]Virology 197:283-292)。如果病毒颗粒在AaIT融合构建物中产生，则可通过改进常规用来纯化BYDV的纯化技术来纯化病毒颗粒：超声处理使杆状病毒感染的细胞裂解，并用差速离心然后是蔗糖梯度离心纯化BYDV颗粒(Rasochova,L.等人.[1996]同上)。由于重组病毒颗粒是空缺的，它们在梯度中的位置高于正常毒粒。如果杆状病毒表达系统中不发生颗粒装配，则可用经典的蛋白纯化技术纯化重组蛋白。具体地说，可用多组氨酸尾以及用咪唑洗脱的Probond镍柱(Invitrogen)来纯化重组蛋白。多组氨酸融合尾以及镍柱层析技术是本领域中熟知的。可用抗AaIT抗血清或抗CP抗血清通过ELISA或Western印迹来检测柱级分中的重组蛋白。

2．生物试验测定融合蛋白的麻痹效果

A．摄入的CP-RTD-AaIT融合蛋白的杀蚜虫效果

如上所述，给禾谷缢管蚜若虫(每份样品30只)经膜喂食下列之一：(ⅰ)上文1A所述的接种了表达AaIT的PAV6转录物的原生质体的病毒抽提物；(ⅱ)从杆状病毒表达系统(上文1B)纯化的融合蛋白；(ⅲ)单纯重组AaIT；(ⅳ)未修饰的BYDV-PAV毒粒；(v)单纯缓冲液。喂食的样品还含有上述的蔗糖。在标准的蚜虫喂食试验中将该培养基置于两张伸展的Parafilm之间(Rasochova,L.[1996]同上)。给蚜虫喂食过夜，监测死亡率并同时在膜上喂食。用第二种农业上重要的蚜虫——桃蚜(Myzus persicae)重复生物试验。该种蚜虫是其它几种经济上重要的黄矮病毒(包括土豆卷叶病毒、甜菜西方黄化病毒、甜菜轻性黄化病毒和葫芦蚜虫携带黄化病毒)以及其它病毒组(如大豆花叶土豆Y病毒组)的主要病媒。

上述喂食研究已经证实BYDV-AaIT融合物的两种所需性质是功能性的：(ⅰ)输送至血腔和(ⅱ)神经毒性。如果需要，这两个性质可分别测定。如上所述，某些融合构建物能改变这些活性中的一种或两种。直接注射融合蛋白(章节2B)揭示了AaIT是否作为融合蛋白起作用与病毒蛋白提供的运输功能无关。喂食以及随后血淋巴中蛋白质的分析(章节2C)能证实蛋白质被运输入血腔，并且表明在肠和血淋巴中稳定。所述研究的数据对于优化目的是有价值的。

B．注射的CP-RTD-AaIT融合蛋白的杀虫效果

作为阳性对照，可通过将融合蛋白注射入丽蝇(Sarcophaga falculata)幼虫来测定与BYDV蛋白融合的AaIT的活性。这种指示昆虫对蝎子毒素特别敏感，可用来评价蝎子毒液的效力(zlotkin,E.等人.[1971]Biochimie 53:1073-1078)。将引起丽蝇幼虫收缩所需的融合蛋白量与非融合的量相比，收缩所需的野生型AaIT表明了与BYDV蛋白融合的AaIT的相对毒性。

为了测定蚜虫毒性，宜注射无翅的蚜虫(容易注射，因为其角质层较软)，而不是有翅的蚜虫。拉出Drummond毛细管(20微升)，用细镊子剪断，形成直径越为10微米的尖端。每支拉出的毛细管用来注射一只蚜虫，以免与毛细管上的污染性血淋巴蛋白发生免疫反应。通过与抽吸系统相连的毛细管的抽吸，将蚜虫固定在微孔滤膜上。用显微注射装置和解剖显微镜进行注射。注射的体积根据施加的压力(标准化的)以及每只蚜虫的内部压力(可变化的)而异。可注射10-20毫微升的体积而对蚜虫无害(Gildow,F.E.dr.[1993]Phytopathology 83:1293-1302)。

C．蚜虫中AaIT的检测

为了测定章节2A中喂食给蚜虫并输送到蚜虫血腔内的重组融合蛋白或对照蛋白(未修饰的BYDV-PAV毒粒)的量，在每一处理组中收集5只蚜虫的血淋巴样品，方法是取下每只蚜虫的一条腿并将血淋巴收集到微细管中(Chay,C.A.[1996]同上)。合并每组蚜虫的血淋巴样品用SDS PAGE、然后用Western印迹检查蛋白质。用针对AaIT和/或CP的抗血清检测血淋巴中的重组蛋白质。以单纯AaIT或单纯缓冲液为食并用AaIT抗血清检查的蚜虫血淋巴为测试处理提供了阴性对照。以BYDV为食的并用CP抗血清检查的蚜虫血淋巴为测试处理提供了阳性对照。

章节2中描述的试验表明了：(ⅰ)与BYDV结构蛋白融合的AaIT的毒性；(ⅱ)哪个摄入的融合蛋白构建物对于蚜虫的毒性是最优的，哪个对于减少探测行为是最优的；(ⅲ)哪个融合蛋白构建物输送进入蚜虫血腔的效果最优。这些信息表明了适用于生产转基因植物的最佳构建物。

植物可通过本领域已知的各种技术来赋予转基因性。“转基因植物”是在遗传上经过修饰而含有并表达异源DNA序列(以调控性RNA分子或蛋白质的形式)的植物。转基因植物经过基因修饰而含有并表达至少一种异源DNA序列，该序列与在植物细胞或组织或整个植物中起作用的转录控制序列操作性相连，并在其调节控制下。本文所用的术语“转基因植物”还指初始转基因植物的后代，它们的后代含有并能在本文所述的植物可表达的转录控制序列的调控下表达异源编码序列。含有转基因胚胎的种子也包括在该定义内。

当希望植物表达感兴趣的异源基因或编码序列时，该编码序列宜在有义方向上与合适的启动子操作性相连，较佳的与启动子相同取向、在植物细胞、组织或植物中定量调节下游序列转录的DNA序列的调控下，从而产生有义的(即对于翻译表达有功能)mRNA。转录终止信号(例如在植物细胞中有功能的聚腺苷酸化信号)宜在CP-RTD编码序列下游，能在植物中表达的可选择标记可与可诱导的表达单元共价相连，从而在该DNA分子导入植物细胞或组织中后，可以选择它的存在，而未转化的植物细胞或组织将被杀死或不让其生长。当希望组成型基因表达时，合适的植物可表达的启动子包括花椰菜花叶病毒的35S或19S启动子、根癌农杆菌Ti质粒的Nos、ocs或mass启动子，以及本领域已知的其它启动子。当希望植物可表达的昆虫抗性编码序列组织特异性表达时，本领域技术人员可在许多熟知的序列选择，以介导该形式的基因表达。从甘蔗杆状badnavirus获得了可在植物脉管组织中表达启动子。该启动子(ScBV3m)在单子叶植物和双子叶植物(Olzsewski,N.[1997]Plant Mol.Biol.)中均有活性。表4和SEQ ID NO:3中给出了该启动子的序列。受环境调控的启动子也是本领域中熟知的，本领域技术人员可从熟知的转录调控序列中选择来实现所需的结果。

应理解表3以外的核酸序列也可作为与所列举的CP-RTD编码序列同义的编码序列起作用。如果核酸序列编码的氨基酸序列是相同的，则那些核酸序列是同义的。遗传密码的简并性是本领域中熟知的；即，对于许多氨基酸，可以有一个以上的核苷酸三联体作为该氨基酸的密码子；为了在植物细胞或组织中表达，希望密码子的使用反映了植物基因的简并性，且CpG二核苷酸在编码序列中的频度保持较低。在蛋白质序列中置换某些氨基酸不会影响蛋白质功能也是生物领域中熟知的。通常，保守的氨基酸置换或相似氨基酸的置换是能容忍的，不会影响蛋白质功能。相似的氨基酸可以是在大小和/或电荷性质上相似的那些氨基酸，例如天冬酰胺和谷氨酰胺以及异亮氨酸和缬氨酸是两对相似的氨基酸。氨基酸对之间的相似性在本领域中可用多种方式来确定。例如，Dayhoff等人.(1987)在《蛋白质序列和结构图集》第5卷第3增补本345-352页中(该文纳入本文作为参考)提供了氨基酸置换的频度表，它可作为氨基酸相似性的量度。Dayhoff等人的频度表根据的是对各种进化上不同来源的具有相同功能的蛋白质氨基酸序列的比较结果。

如本领域技术人员所知道的，植物可表达的转录和翻译调控序列可以与任何在植物中起作用的启动子序列操作性相连；当调控元件与启动子相连时，通常采用的是截短的(或最小的)启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的截短的35S启动子。其它组成型启动子的截短形式也可用来提供CAAT和TATA-同源区域；这些启动子序列可从根癌农杆菌T-DNA基因的启动子衍生获得，例如Nos,ocs和mas，以及植物病毒基因如CaMV 19S基因。应理解，本领域技术人员的目的是确定特定转录(和翻译)调控序列的选择。

最小启动子含有RNA聚合酶结合和转录开始所需的DNA序列信号。对于RNA聚合酶Ⅱ启动子，该启动子由转录起始位点上游大约20-50bp的TATA同源序列基序和转录起始位点上游50-120bp的CAAT同源序列基序来确定。按照惯例，本领域技术人员通常用越来越大的数字来给转录起始位点上游的核苷酸编号(从起始位点上游(5’方向)延伸)。通常，最小启动子指导的转录很低，对植物组织中的环境或发育信号没有阳性和阴性反应。适用于植物的典型的最小启动子是截短的CaMV 35S启动子，它含有35S基因的-90到+8的区域。当采用最小启动子时，为了获得高水平的基因表达，希望使上调基因表达水平的转录调控序列与该启动子操作性相连。这些定量调控的序列的例子有转录增强调控序列，如增强子。

在植物细胞中起作用的在启动子上游的操作性相连的转录和翻译调控序列，使得操作性融合于启动子下游的CP-RTD毒素融合物编码序列表达，本领域技术人员知道此编码序列翻译性表达对间隔和核糖体结合位点的要求。

或者另外，可以诱导受调控的构建物表达，例如通过用适合调节本发明的植物可表达的昆虫抗性编码序列表达的诱导物来处理转基因植物或组织。CP-RTD毒素融合物编码序列的表达也可通过组织特异性转录调控序列来调节。具体地说，用表4的甘蔗杆状badnavirus启动子(ScBV3m)来指导单子叶植物和双子叶植物韧皮部组织中转基因的表达。

表4

C TGCAGGAAGTTGAAGACAAA AGAAGGTCTT AAATCCTGGC TAGCAACACT GAACTATGCCAGAAACCACA TCAAAGATAT GGGCAAGCTT CTTGGCCCAT TATATCCAAAGACCTCAGAG AAAGGTGAGC GAAGGCTCAA TTCAGAAGAT TGGAAGCTGATCAATAGGAT CAAGACAATG GTGAGAACGC TTCCAAATCT CACTATTCCACCAGAAGATG CATACATTAT CATTGAAACA GATGCATGTG CAACTGGATGGGGAGCAGTA TGCAAGTGGA AGAAAAACAA GGCAGACCCA AGAAATACAGAGCAAATCTG TAGGTATGCC AGTGGAAAAT TTGATAAGCC AAAAGGAACCTGTGATGCAG AAATCTATGG GGTTATGAAT GGCTTAGAAA AGATGAGATTGTTCTACTTG GACAAAAGAG AGATCACAGT CAGAACTGAC AGTAGTGCAATCGAAAGGTT CTACAACAAG AGTGCTGAAC ACAAGCCTTC TGAGATCAGATGGATCAGGT TCATGGACTA CATCACTGGT GCAGGACCAG AGATAGTCATTGAACACATA AAAGGGAAGA GCAATGGTTT AGCTGACATC TTGTCCAGGCTCAAAGCCAA ATTAGCTCAG AATGAACCAA CGGAAGAGAT GATCCTGCTTACACAAGCCA TAAGGGAAGT AATTCCTTAT CCAGATCATC CATACACTGAGCAACTCAGA GAATGGGGAA ACAAAATTCT GGATCC

可用本领域已知的任何方法来生产转基因植物，这些方法包括但不局限于，根癌农杆菌介导的DNA转移(较佳的用去臂的T-DNA载体)、电穿孔、直接DNA转移、和颗粒轰击以及随后选择并再生(见Davey等人.[1989]Plant Mol.Biol.13:275；Walden和Schell[1990]Eur.J.Biochem.192:563；Joersbo和Burnstedt[1991]Physiol.Plant.81:256；Potrykus[1991]Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.42:205；Gasser和Fraley[1989]Sci.244:1293；Leemans[1993]Bio/Technology.11:522；Beck等人.[1993]Bio/Technology.11:1524；Koziel等人.[1993]Bio/Technology.11:194；Vasil等人.[1993]Bio/Technology.11:1533)。将DNA导入单子叶植物和双子叶植物的技术，以及培养这些植物组织并再生这些组织的技术是本领域熟知的。已经成功转化并再生的单子叶植物包括小麦、玉米、黑麦、水稻、燕麦、大麦和芦笋。为了有效地再生转基因植物，希望用于转化的植物组织具有产生枝条的高生产能力。例如，白杨茎干切片具有很好的再生能力。(Devillard,C.Ⅲ等人.[1992]C.R.Acad.Sci.Ser.VIE314:291-298K；Nilsson等人.[1992]Transgenic Research 1:209-220；Tsai等人.[1994]Plant Cell Rep.14:94-97)。白杨已经被成功转化(Wilde等人.[1992]Plant Physiol.98:114-120)。

导入异源DNA并在植物组织中选择异源DNA的存在的技术是已知的。例如，对于各种植物，熟知的方法是用根癌农杆菌介导DNA转移入植物组织，然后选择和体外生长，随后将转化的植物组织再生成植物。

还可用其它技术来基因工程改造植物组织，以使植物组织含有表达盒，该表达盒包含与昆虫抗性编码序列融合的启动子和相连的转录调控序列，并任选地含有转录终止区，通过电穿孔、共培育、显微注射、颗粒轰击和本领域已知的其它技术将该表达盒整合到植物细胞基因组中。昆虫抗性植物表达盒还含有允许在植物细胞中选择表达盒的标记，例如携带对抗生素(如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或博来霉素)有抗性的基因。标记使人能选出在含有某些抗生素的培养基中生长的成功转化的植物细胞，因为它们携带了具有抗生素抗性基因的表达盒。

本领域技术人员应当理解，可以对融合构建物的活性进行优化，以实现所需的转移至血腔的水平和所需的毒素剂量。另外，转基因植物中的启动子活性可用本领域已知的技术启动子来改变，以实现达到所需蚜虫防治水平的最优表达水平。这些改进、优化和构建物均在本发明的范围内。

序列表<110>衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司<120>病毒蛋白介导的植物对虫害的抗性<130>41-98 WO<140>未指定<141>1999-09-14<150>US 60/100,132<151>1998-09-14<160>7<1 70>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1956<212>DNA<213>大麦黄矮病毒<400> 1atgaattcag taggtcgtag aggacctaga cgcgcaaatc aaaatggcac aagaaggagg 60cgccgtagaa cagttcggcc agtggttgtg gtccaaccca atcgagcagg acccagacga 120cgaaatggtc gacgcaaggg aagaggaggg gcaaattttg tatttagacc aacaggcggg 180actgaggtat tcgtattctc agttgacaac cttaaagcca actcctccgg ggcaatcaaa 240ttcggcccca gtctatcgca atgcccagcg ctttcagacg gaatactcaa gtcctaccat 300cgttacaaga tcacaagtat ccgagttgag tttaagtcac acgcgtccgc caatacggca 360ggcgctatct ttattgagct cgacaccgcg tgcaagcaat cagccctggg tagctacatt 420aattccttca ccatcagcaa gaccgcctcc aagaccttcc ggtcagaggc aattaatggg 480aaggaattcc aggaatcaac gatagaccaa ttttggatgc tctacaaggc caatggaact 540accactgaca cggcaggaca atttatcatt acgatgagtg tcagtttgat gacggccaaa 600taggtagact cctcaacacc ggaaccaaaa cctgcaccgg aaccaacacc aaccccccag 660ccaacgccgg ctccacagcc cacacctgaa ccaactcctg cacctgtccc caaaagattc 720ttcgagtata tcggaactcc taccggtaca atctcgacta gagagaacac tgacagtata 780tctgtcagca agctcggtgg acagtcgatg cagtacattg agaatgagaa atgtgaaacg 840aaagtcatcg attccttttg gagcactaac aacaacgttt ctgcgcaagc agctttcgtt 900tatccagtgc cagagggatc atacagcgtt aacatttcgt gcgaaggctt ccagtcagtt 960gaccacatcg gtggcaacga ggacggctat tggattggtt taattgccta ctccaattcg 1020tctggcgata attggggagt tggcaattac aaagggtgca gttttaagaa tttcttggca 1080accaacactt ggagaccagg ccacaaagat ctcaagttga ctgattgcca gttcacagat 1140ggacaaatag ttgaaaggga cgccgtgatg tctttccacg tagaagcaac aggcaaggat 1200gccagcttct acctcatggc tcccaaaaca atgaaaactg acaaatacaa ctatgttgtc 1260tcatatggag ggtacacaaa caagcgaatg gaattcggta ccatatctgt gacatgtgat 1320gaatccgatg ttgaggcaga acgaataaca aggcacgctg aaacgcccat acgttctaaa 1380catattcttg tttctgagcg gtatgcggaa ccattgccca ccatagtcaa ccaaggcttg 1440tgtgatgtga aaactcccga gcaagaacaa acactggtgg atgaagatga cagacaaact 1500gtttctactg aatctgatat agcactcctg gagtatgagg ctgcaacagc tgagattccg 1560gatgctgaag aggacgtttt gccctccaag gaacagttgt cttcaaaacc aatggatacg 1620tctggcaata taataccaaa acccaaggaa cctgaagtac ttgggacata ccaaggacag 1680aacatttatc ctgaagacgt acctccaatg gcgcggcaga aattgagaga agccgcgaat 1740gcgccttcca cgetactcta tgaaagaaga accccaaaga agagtggcaa ctttttatcc 1800agacttgtag aagcgaatag gtcccctact actcccactg ccccatccgt gtcaactact 1860tcaaacatga caagggagca gctccgggag tacactagga ttagaaattc cagcggaatc 1920acagcagcaa aggcgtacaa ggcgcaattc cagtga 1956<210>2<211>651<212>蛋白质<213>大麦黄矮病毒<220><221>不确定<222>(199)<223>在201位，氨基酸(或其潜在缺失)没有被确定；本序列中显示的蛋白质是通过SEQ ID NO:1的琥珀密码子的连读翻译产物<400>2Met Asn Ser Val Gly Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ala Asn Gln Asn Gly1 5 10 15Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Thr Val Arg Pro Val Val Val Val Gln

20 25 30Pro Asn Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Asn Gly Arg Arg Lys Gly Arg

35 40 45Gly Gly Ala Asn Phe Val Phe Arg Pro Thr Gly Gly Thr Glu Val Phe

50 55 60Val Phe Ser Val Asp Asn Leu Lys Ala Asn Ser Ser Gly Ala Ile Lys65 70 75 80Phe Gly Pro Ser Leu Ser Gln Cys Pro Ala Leu Ser Asp Gly Ile Leu

85 90 95Lys Ser Tyr His Arg Tyr Lys Ile Thr Ser Ile Arg Val Glu Phe Lya

100 105 110Ser His Ala Ser Ala Asn Thr Ala Gly Ala Ile Phe Ile Glu Leu Asp

115 120 125Thr Ala Cys Lys Gln Ser Ala Leu Gly ser Tyr Ile Asn Ser Phe Thr

130 135 140Ile Ser Lys Thr Ala Ser Lys Thr Phe Arg Ser Glu Ala Ile Asn Gly145 150 155 160Lys Glu Phe Gln Glu Ser Thr Ile Asp Gln Phe Trp Met Leu Tyr Lys

165 170 175Ala Asn Gly Thr Thr Thr Asp Thr Ala Gly Gln Phe Ile Ile Thr Met

180 185 190Ser Val Ser Leu Met Thr Ala Lys Xaa Val Asp Ser Ser Thr Pro Glu

195 200 205Pro Lys Pro Ala Pro Glu Pro Thr Pro Thr Pro Gln Pro Thr Pro Ala

210 215 220Pro Gln Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Ala Pro Val Pro Lys Arg Phe225 230 235 240Phe Glu Tyr Ile Gly Thr Pro Thr Gly Thr Ile Ser Thr Arg Glu Asn

245 250 255Thr Asp Ser Ile Ser Val Ser Lys Leu Gly Gly Gln Ser Met Gln Tyr

260 265 270Ile Glu Asn Glu Lys Cys Glu Thr Lys Val Ile Asp Ser Phe Trp Ser

275 280 285Thr Asn Asn Asn Val Ser Ala Gln Ala Ala Phe Val Tyr Pro Val Pro

290 295 300Glu Gly Ser Tyr Ser Val Asn Ile Ser Cys Glu Gly Phe Gln Ser Val305 310 315 320Asp His Ile Gly Gly Asn Glu Asp Gly Tyr Trp Ile Gly Leu Ile Ala

325 330 335Tyr Ser Asn Ser Ser Gly Asp Asn Trp Gly Val Gly Asn Tyr Lys Gly

340 345 350Cys Ser Phe Lys Asn Phe Leu Ala Thr Asn Thr Trp Arg Pro Gly His

355 360 365Lys Asp Leu Lys Leu Thr Asp Cys Gln Phe Thr Asp Gly Gln Ile Val

370 375 380Glu Arg Asp Ala Val Met Ser Phe His Val Glu Ala Thr Gly Lys Asp385 390 395 400Ala Ser Phe Tyr Leu Met Ala Pro Lys Thr Met Lys Thr Asp Lys Tyr

405 410 415Asn Tyr Val Val Ser Tyr Gly Gly Tyr Thr Asn Lys Arg Met Glu Phe

420 425 430Gly Thr Ile Ser Val Thr Cys Asp Glu Ser Asp Val Glu Ala Glu Arg

435 440 445Ile Thr Arg His Ala Glu Thr Pro Ile Arg Ser Lys His Ile Leu Val

450 455 460Ser Glu Arg Tyr Ala Glu Pro Leu Pro Thr Ile Val Asn Gln Gly Leu465 470 475 480Cys Asp Val Lys Thr Pro Glu Gln Glu Gln Thr Leu Val Asp Glu Asp

485 490 495Asp Arg Gln Thr Val Ser Thr Glu Ser Asp Ile Ala Leu Leu Glu Tyr

500 505 510Glu Ala Ala Thr Ala Glu Ile Pro Asp Ala Glu Glu Asp Val Leu Pro

515 520 525Ser Lys Glu Gln Leu Ser Ser Lys Pro Met Asp Thr Ser Gly Asn Ile

530 535 540Ile Pro Lys Pro Lys Glu Pro Glu Val Leu Gly Thr Tyr Gln Gly Gln545 550 555 560Asn Ile Tyr Pro Glu Asp Val Pro Pro Met Ala Arg Gln Lys Leu Arg

565 570 575Glu Ala Ala Asn Ala Pro Ser Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Arg Thr Pro

580 585 590Lys Lys Ser Gly Asn Phe Leu Ser Arg Leu Val Glu Ala Asn Arg Ser

595 600 605Pro Thr Thr Pro Thr Ala Pro Ser Val Ser Thr Thr Ser Asn Met Thr

610 615 620Arg Glu Gln Leu Arg Glu Tyr Thr Arg Ile Arg Asn Ser Ser Gly Ile625 630 635 640Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Lys Ala Gln Phe Gln

645 650<210>3<211>747<212>DNA<213>甘蔗杆状病毒<400>3ctgcaggaag ttgaagacaa aagaaggtct taaatcctgg ctagcaacac tgaactatgc 60cagaaaccac atcaaagata tgggcaagct tcttggccca ttatatccaa agacctcaga 120gaaaggtgag cgaaggctca attcagaaga ttggaagctg atcaatagga tcaagacaat 180ggtgagaacg cttccaaatc tcactattcc accagaagat gcatacatta tcattgaaac 240agatgcatgt gcaactggat ggggagcagt atgcaagtgg aagaaaaaca aggcagaccc 300aagaaataca gagcaaatct gtaggtatgc cagtggaaaa tttgataagc caaaaggaac 360ctgtgatgca gaaatctatg gggttatgaa tggcttagaa aagatgagat tgttctactt 420ggacaaaaga gagatcacag tcagaactga cagtagtgca atcgaaaggt tctacaacaa 480gagtgctgaa cacaagcctt ctgagatcag atggatcagg ttcatggact acatcactgg 540tgcaggacca gagatagtca ttgaacacat aaaagggaag agcaatggtt tagctgacat 600cttgtccagg ctcaaagcca aattagctca gaatgaacca acggaagaga tgatcctgct 660tacacaagcc ataagggaag taattcctta tccagatcat ccatacactg agcaactcag 720agaatgggga aacaaaattc tggatcc 747<210>4<211>2175<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：大麦黄矮病毒外壳蛋白与病毒外壳后的北非蝎毒素以及

连读区的融合物<400>4atgaattcag taggtcgtag aggacctaga cgcgcaaatc aaaatggcac aagaaggagg 60cgccgtagaa cagttcggcc agtggttgtg gtccaaccca atcgagcagg acccagacga 120cgaaatggtc gacgcaaggg aagaggaggg gcaaattttg tatttagacc aacaggcggg 180actgaggtat tcgtattctc agttgacaac cttaaagcca actcctccgg ggcaatcaaa 240ttcggcccca gtctatcgca atgcccagcg ctttcagacg gaatactcaa gtcctaccat 300cgttacaaga tcacaagtat ccgagttgag tttaagtcac acgcgtccgc caatacggca 360ggcgctatct ttattgagct cgacaccgcg tgcaagcaat cagccctggg tagctacatt 420aattccttca ccatcagcaa gaccgcctcc aagaccttcc ggtcagaggc aattaatggg 480aaggaattcc aggaatcaac gatagaccaa ttttggatgc tctacaaggc caatggaact 540accactgaca cggcaggaca atttatcatt acgatgagtg tcagtttgat gacggccaaa 600taggtagact cctcaacacc ggaaccaaaa cctgcaccgg aaccaacacc aaccccccag 660ccaacgccgg ctccacagcc cacacctgaa ccaactcctg cacctgtccc caaaagattc 720ttcgagtata tcggaactcc taccggtaca atctcgacta gagagaacac tgacagtata 780tctgtcagca agctcggtgg acagtcgatg cagtacattg agaatgagaa atgtgaaacg 840aaagtcatcg attccttttg gagcactaac aacaacgttt ctgcgcaagc agctttcgtt 900tatccagtgc cagagggatc atacagcgtt gttaacaaaa aaaacggcta cgctgttgac 960tcttctggca aagctccgga atgcctgctg tctaactact gcaacaacca gtgcactaaa 1020gttcattacg ctgacaaagg ctactgctgc ctgctgtctt gctactgctt cggcctgaac 1080gacgacaaaa aagttctgga aatctctgac actcgtaaat cttactgcga cactactatc 1140atcaacgtta acatttcgtg cgaaggcttc cagtcagttg accacatcgg tggcaacgag 1200gacggctatt ggattggttt aattgcctac tccaattcgt ctggcgataa ttggggagtt 1260ggcaattaca aagggtgcag ttttaagaat ttcttggcaa ccaacacttg gagaccaggc 1320cacaaagatc tcaagttgac tgattgccag ttcacagatg gacaaatagt tgaaagggac 1380gccgtgatgt ctttccacgt agaagcaaca ggcaaggatg ccagcttcta cctcatggct 1440cccaaaacaa tgaaaactga caaatacaac tatgttgtct catatggagg gtacacaaac 1500aagcgaatgg aattcggtac catatctgtg acatgtgatg aatccgatgt tgaggcagaa 1560cgaataacaa ggcacgctga aacgcccata cgttctaaac atattcttgt ttctgagcgg 1620tatgcggaac cattgcccac catagtcaac caaggcttgt gtgatgtgaa aactcccgag 1680caagaacaaa cactggtgga tgaagatgac agacaaactg tttctactga atctgatata 1740gcactcctgg agtatgaggc tgcaacagct gagattccgg atgctgaaga ggacgttttg 1800ccctccaagg aacagttgtc ttcaaaacca atggatacgt ctggcaatat aataccaaaa 1860cccaaggaac ctgaagtact tgggacatac caaggacaga acatttatcc tgaagacgta 1920cctccaatgg cgcggcagaa attgagagaa gccgcgaatg cgccttccac gctactctat 1980gaaagaagaa ccccaaagaa gagtggcaac tttttatcca gacttgtaga agcgaatagg 2040tcccctacta ctcccactgc cccatccgtg tcaactactt caaacatgac aagggagcag 2100ctccgggagt acactaggat tagaaattcc agcggaatca cagcagcaaa ggcgtacaag 2160gcgcaattcc agtga 2175<210>5<211>724<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>人工序列的描述：大麦黄矮病毒-北非蝎毒素-BYDV连读结构域的融合物<220><221>不确定<222>(1)..(724)<223>Xaa是缺失或未知的残基<400>5Met Asn Ser Val Gly Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ala Asn Gln Asn Gly1 5 10 15Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Thr Val Arg Pro Val Val Val Val Gln

20 25 30Pro Asn Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Asn Gly Arg Arg Lys Gly Arg

35 40 45Gly Gly Ala Asn Phe Val Phe Arg Pro Thr Gly Gly Thr Glu Val Phe

85 90 95Lys Ser Tyr His Arg Tyr Lys Ile Thr Ser Ile Arg Val Glu Phe Lys

100 105 110Ser His Ala Ser Ala Asn Thr Ala Gly Ala Ile Phe Ile Glu Leu Asp

115 120 125Thr Ala Cys Lys Gln Ser Ala Leu Gly Ser Tyr Ile Asn Ser Phe Thr

165 170 175Ala Asn Gly Thr Thr Thr Asp Thr Ala Gly Gln Phe Ile Ile Thr Met

180 185 190Ser Val Ser Leu Met Thr Ala Lys Xaa Val Asp Ser Ser Thr Pro Glu

195 200 205Pro Lys Pro Ala Pro Glu Pro Thr Pro Thr Pro Gln Pro Thr Pro Ala

245 250 255Thr Asp Ser Ile Ser Val Ser Lys Leu Gly Gly Gln Ser Met Gln Tyr

260 265 270Ile Glu Asn Glu Lys Cys Glu Thr Lys Val Ile Asp Ser Phe Trp Ser

275 280 285Thr Asn Asn Asn Val Ser Ala Gln Ala Ala Phe Val Tyr Pro Val Pro

290 295 300Glu Gly Ser Tyr Ser Val Val Asn Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp305 310 315 320Ser Ser Gly Lys Ala Pro glu Cys Leu Leu Ser Asn Tyr Cys Asn Asn

325 330 335Gln Cys Thr Lys Val His Tyr Ala Asp Lys Gly Tyr Cys Cys Leu Leu

340 345 350Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asn Asp Asp Lys Lys Val Leu Glu Ile

355 360 365Ser Asp Thr Arg Lys Ser Tyr Cys Asp Thr Thr Ile Ile Asn Val Asn

370 375 380Ile Ser Cys Glu Gly Phe Gln Ser Val Asp His Ile Gly Gly Asn Glu385 390 395 400Asp Gly Tyr Trp Ile Gly Leu Ile Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Gly Asp

405 410 415Asn Trp Gly Val Gly Asn Tyr Lys Gly Cys Ser Phe Lys Asn Phe Leu

420 425 430Ala Thr Asn Thr Trp Arg Pro Gly His Lys Asp Leu Lys Leu Thr Asp

435 440 445Cys Gln Phe Thr Asp Gly Gln Ile Val Glu Arg Asp Ala Val Met Ser

450 455 460Phe His Val Glu Ala Thr Gly Lys Asp Ala Ser Phe Tyr Leu Met Ala465 470 475 480Pro Lys Thr Met Lys Thr Asp Lys Tyr Asn Tyr Val val Ser Tyr Gly

485 490 495Gly Tyr Thr Asn Lys Arg Met Glu Phe Gly Thr Ile Ser Val Thr Cys

500 505 510Asp Glu Ser Asp Val Glu Ala Glu Arg Ile Thr Arg His Ala Glu Thr

515 520 525Pro Ile Arg Ser Lys His Ile Leu Val Ser Glu Arg Tyr Ala Glu Pro

530 535 540Leu Pro Thr Ile Val Asn Gln Gly Leu Cys Asp Val Lys Thr Pro Glu545 550 555 560Gln Glu Gln Thr Leu Val Asp Glu Asp Asp Arg Gln Thr Val Ser Thr

565 570 575Glu Ser Asp Ile Ala Leu Leu Glu Tyr Glu Ala Ala Thr Ala Glu Ile

580 585 590Pro Asp Ala Glu Glu Asp Val Leu Pro Ser Lys Glu Gln Leu Ser Ser

595 600 605Lys Pro Met Asp Thr Ser Gly Asn Ile Ile Pro Lys Pro Lys Glu Pro

610 615 620Glu Val Leu Gly Thr Tyr Gln Gly Gln Asn Ile Tyr Pro Glu Asp Val625 630 635 640Pro Pro Met Ala Arg Gln Lys Leu Arg Glu Ala Ala Asn Ala Pro Ser

645 650 655Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Arg Thr Pro Lys Lys Ser Gly Asn Phe Leu

660 665 670Ser Arg Leu Val Glu Ala Asn Arg Ser Pro Thr Thr Pro Thr Ala Pro

675 680 685Ser Val Ser Thr Thr Ser Asn Met Thr Arg Glu Gln Leu Arg Glu Tyr

690 695 700Thr Arg Ile Arg Asn Ser Ser Gly Ile Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Lys705 710 715 720Ala Gln Phe Gln<210>6<211>2178<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：大麦黄矮病毒外壳蛋白编码序列连读通过北非蝎cds.序

列<400>6atgaattcag taggtcgtag aggacctaga cgcgcaaatc aaaatggcac aagaaggagg 60cgccgtagaa cagttcggcc agtggttgtg gtccaaccca atcgagcagg acccagacga 120cgaaatggtc gacgcaaggg aagaggaggg gcaaattttg tatttagacc aacaggcggg 180actgaggtat tcgtattctc agttgacaac cttaaagcca actcctccgg ggcaatcaaa 240ttcggcccca gtctatcgca atgcccagcg ctttcagacg gaatactcaa gtcctaccat 300cgttacaaga tcacaagtat ccgagttgag tttaagtcac acgcgtccgc caatacggca 360ggcgctatct ttattgagct cgacaccgcg tgcaagcaat cagccctggg tagctacatt 420aattccttca ccatcagcaa gaccgcctcc aagaccttcc ggtcagaggc aattaatggg 480aaggaattcc aggaatcaac gatagaccaa ttttggatgc tctacaaggc caatggaact 540accactgaca cggcaggaca atttatcatt acgatgagtg tcagtttgat gacggccaaa 600taggtagact cctcaacacc ggaaccaaaa cctgcaccgg aaccaacacc aaccccccag 660ccaacgccgg ctccacagcc cacacctgaa ccaactcctg cacctgtccc caaaagattc 720ttcgagtata tcggaactcc taccggtaca atctcgacta gagagaacac tgacagtata 780tctgtcagca agctcggtgg acagtcgatg cagtacattg agaatgagaa atgtgaaacg 840aaagtcatcg attccttttg gagcactaac aacaacgttt ctgcgcaagc agctttcgtt 900tatccagtgc cagagggatc atacagcgtt gttaacaaaa aaaacggcta cgctgttgac 960tcttctggca aagctccgga atgcctgctg tctaactact gcaacaacca gtgcactaaa 1020gttcattacg ctgacaaagg ctactgctgc ctgctgtctt gctactgctt cggcctgaac 1080gacgacaaaa aagttctgga aatctctgac actcgtaaat cttactgcga cactactatc 1140atcaactagg ttaacatttc gtgcgaaggc ttccagtcag ttgaccacat cggtggcaac 1200gaggacggct attggattgg tttaattgcc tactccaatt cgtctggcga taattgggga 1260gttggcaatt acaaagggtg cagttttaag aatttcttgg caaccaacac ttggagacca 1320ggccacaaag atctcaagtt gactgattgc cagttcacag atggacaaat agttgaaagg 1380gacgccgtga tgtctttcca cgtagaagca acaggcaagg atgccagctt ctacctcatg 1440gctcccaaaa caatgaaaac tgacaaatac aactatgttg tctcatatgg agggtacaca 1500aacaagcgaa tggaattcgg taccatatct gtgacatgtg atgaatccga tgttgaggca 1560gaacgaataa caaggcacgc tgaaacgccc atacgttcta aacatattct tgtttctgag 1620cggtatgcgg aaccattgcc caccatagtc aaccaaggct tgtgtgatgt gaaaactccc 1680gagcaagaac aaacactggt ggatgaagat gacagacaaa ctgtttctac tgaatctgat 1740atagcactcc tggagtatga ggctgcaaca gctgagattc cggatgctga agaggacgtt 1800ttgccctcca aggaacagtt gtcttcaaaa ccaatggata cgtctggcaa tataatacca 1860aaacccaagg aacctgaagt acttgggaca taccaaggac agaacattta tcctgaagac 1920gtacctccaa tggcgcggca gaaattgaga gaagccgcga atgcgccttc cacgctactc 1980tatgaaagaa gaaccccaaa gaagagtggc aactttttat ccagacttgt agaagcgaat 2040aggtccccta ctactcccac tgccccatcc gtgtcaacta cttcaaacat gacaagggag 2100cagctccggg agtacactag gattagaaat tccagcggaa tcacagcagc aaaggcgtac 2160aaggcgcaat tccagtga 2178<210>7<211>382<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>不确定<222>(1)..(382)<223>Xaa是未鉴定的(或缺失的)残基。<400>7Met Asn Ser Val Gly Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ala Asn Gln Asn Glyl 5 10 15Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Thr Val Arg Pro Val Val Val Val Gln

20 25 30Pro Asn Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Asn Gly Arg Arg Lys Gly Arg

35 40 45Gly Gly Ala Asn Phe Val Phe Arg Pro Thr Gly Gly Thr Glu Val Phe

85 90 95Lys Ser Tyr His Arg Tyr Lys Ile Thr Ser Ile Arg Val Glu Phe Lys

100 105 110Ser His Ala Ser Ala Asn Thr Ala Gly Ala Ile Phe Ile Glu Leu Asp

115 120 125Thr Ala Cys Lys Gln Ser Ala Leu Gly Ser Tyr Ile Asn Ser Phe Thr

165 170 175Ala Asn Gly Thr Thr Thr Asp Thr Ala Gly Gln Phe Ile Ile Thr Met

180 185 190Ser Val Ser Leu Met Thr Ala Lys Xaa Val Asp Ser Ser Thr Pro Glu

195 200 205Pro Lys Pro Ala Pro Glu Pro Thr Pro Thr Pro Gln Pro Thr Pro Ala

245 250 255Thr Asp Ser Ile Ser Val Ser Lys Leu Gly Gly Gln Ser Met Gln Tyr

260 265 270Ile Glu Asn Glu Lys Cys Glu Thr Lys Val Ile Asp Ser Phe Trp Ser

275 280 285Thr Asn Asn Asn val Ser Ala Gln Ala Ala Phe Val Tyr Pro Val Pro

325 330 335Gln Cys Thr Lys Val His Tyr Ala Asp Lys Gly Tyr Cys Cys Leu Leu

340 345 350Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asn Asp Asp Lys Lys Val Leu Glu Ile

355 360 365Ser Asp Thr Arg Lys Ser Tyr Cys Asp Thr Thr Ile Ile Asn

370 375 380

Claims

1．一种融合蛋白，它基本上由第一多肽片段和第二多肽片段组成，所述第一片段是循环性传播病毒的运输肽，所述第二片段是昆虫毒性肽。

2．根据权利要求1所述的融合蛋白，其中循环性传播病毒是选自托斯泊病毒组、植物呼肠弧病毒组、植物棒状病毒组、水稻条纹叶枯病毒组、玉米雷亚多非纳病毒组、黄矮病毒组、双生病毒组、伊奈莫病毒组、芜菁黄花叶病毒组、豇豆花叶病毒组和南方菜豆花叶病毒组的病毒。

3．根据权利要求1所述的融合蛋白，其中病毒选自黄矮病毒组。

4．根据权利要求1所述的融合蛋白，其中病毒选自双生病毒组。

5．根据权利要求3所述的融合蛋白，其中病毒是大麦黄矮病毒。

6．根据权利要求1所述的融合蛋白，其中运输肽是病毒外壳的组分。

7．根据权利要求3所述的融合蛋白，其中运输蛋白包括黄矮病毒外壳蛋白和至少一部分连读结构域。

8．根据权利要求4所述的融合蛋白，其中运输肽是病毒外壳的组分。

9．根据权利要求7所述的融合蛋白，其中黄矮病毒是大麦黄矮病毒。

10．根据权利要求1所述的融合蛋白，其中昆虫毒性肽选自稻壁虱Pyemotes tritici的TxP-1、北非蝎Androctonus australis的AaIT、以色列黄蝎Leiurus quinquestriatushebraeus的LqhIT1、LghIT2、LghITT3和LghαIt、Anemonia sulcata的AsⅡ、Stichadactylahelianthus的ShⅠ、Agelenopsis sulcata的μ-Aga-Ⅳ、Tegenaria agrestis的TalTX-1，以及Diguetia canities的DTX9.2。

11．根据权利要求1所述的融合蛋白，其中毒素对半翅目的昆虫有毒性。

12．根据权利要求1所述的融合蛋白，其中毒素对蚜虫有毒性。

13．根据权利要求1所述的融合蛋白，其中毒素对粉虱有毒性。

14．根据权利要求3所述的融合蛋白，其中对昆虫有毒性的肽是北非蝎的AaIT。

15．根据权利要求7所述的融合蛋白，其中对昆虫有毒性的肽是北非蝎的AaIT。

16．根据权利要求1所述的融合蛋白，它具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

17．根据权利要求1所述的融合蛋白，它具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

18．编码融合蛋白的DNA，所述DNA具有编码第一多肽片段的第一核苷酸序列和编码第二多肽片段的第二核苷酸序列，所述第一多肽片段是循环性传播病毒的运输肽，所述第二片段是对昆虫有毒性的肽。

19．根据权利要求18所述的DNA，其中循环性传播的病毒是选自托斯泊病毒组、植物呼肠弧病毒组、植物棒状病毒组、水稻条纹叶枯病毒组、玉米雷亚多非纳病毒组、黄矮病毒组、双生病毒组、伊奈莫病毒组、芜菁黄花叶病毒组、豇豆花叶病毒组和南方菜豆花叶病毒组的病毒。

20．根据权利要求18所述的DNA，其中病毒选自黄矮病毒组。

21．根据权利要求20所述的DNA，其中病毒选自双生病毒组。

22．根据权利要求20所述的DNA，其中病毒是大麦黄矮病毒。

23．根据权利要求18所述的DNA，其中运输蛋白含有病毒外壳组分。

24．根据权利要求20所述的DNA，其中运输蛋白包括黄矮病毒外壳蛋白和在该外壳蛋白下游的至少一部分连读结构域。

25．根据权利要求24所述的DNA，其中编码运输肽的核苷酸序列在编码外壳蛋白部分和编码连读结构域部分之间具有内部终止密码子。

26．根据权利要求24所述的DNA，其中编码运输肽的核苷酸序列在编码外壳蛋白的部分与编码连读结构域的部分之间缺少终止密码子。

27．根据权利要求24所述的DNA，其中编码运输肽的核苷酸序列包含至少一个连读元件。

28．根据权利要求18所述的DNA，其中第二核苷酸序列编码的昆虫毒性肽选自稻壁虱Pyemotes tritici的TxP-1、北非蝎Androctonus australis的AaIT、以色列黄蝎Leiurus quinquestriatus hebraeus的LqhIT1、LghIT2、LghITT3和LghαIt、Anemoniasulcata的AsⅡ、Stichadactyla helianthus的ShI、Agelenopsis sulcata的μ-Aga-Ⅳ、Tegenaria agrestis的TalTX-1，以及Diguetia canities的DTX9.2。

29．根据权利要求18所述的DNA，其中昆虫毒性肽对半翅目昆虫有毒性。

30．根据权利要求18所述的DNA，其中昆虫毒性肽对蚜虫有毒性。

31．根据权利要求28所述的DNA，其中昆虫毒性肽对粉虱有毒性。

32．根据权利要求28所述的DNA，其中昆虫毒性肽是北非蝎的AaIT。

33．根据权利要求18所述的DNA，它具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

34．根据权利要求18所述的DNA，它具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

35．一种嵌合基因，它包含DNA以及与编码融合蛋白的DNA操作性相连的异源启动子序列，所述DNA具有编码第一多肽片段的第一核苷酸序列和编码第二多肽片段的第二核苷酸序列，所述第一多肽片段是循环性传播病毒的运输肽，所述第二片段是昆虫毒性肽。

36．根据权利要求35所述的嵌合基因，其中所述异源启动子序列是ScBV3m启动子。

37．一种重组载体，它包含权利要求35所述的嵌合基因。

38．一种转基因宿主细胞，它包含权利要求35所述的嵌合基因。

39．一种转基因植物细胞，它包含权利要求35所述的嵌合基因。

40．一种转基因植物或植物组织，它包含权利要求39所述的转基因植物细胞。

41．一种生产对昆虫有活性的融合蛋白的方法，该方法包括：

用嵌合基因转化宿主细胞，该嵌合基因包含DNA以及与编码融合蛋白的DNA操作性相连的异源启动子序列，所述DNA具有编码第一多肽片段的第一核苷酸序列和编码第二多肽片段的第二核苷酸序列，所述第一多肽片段是循环性传播病毒的运输肽，所述第二片段是昆虫毒性肽，从而获得转基因宿主细胞，和

给转基因细胞提供适合在转基因细胞中表达嵌合基因的条件，从而产生对昆虫有活性的融合蛋白。

42．根据权利要求40所述的方法，其中所述转基因宿主细胞是转基因植物细胞。

43．一种产生昆虫抗性植物的方法，该方法包括将编码融合蛋白的DNA导入所述植物，所述DNA具有编码第一多肽片段的第一核苷酸序列和编码第二多肽片段的第二核苷酸序列，所述第一多肽片段是循环性传播病毒的运输肽，所述第二片段是昆虫毒性肽，其中所述DNA可在所述植物中表达出防治所述昆虫的有效量。

44．根据权利要求43所述的方法，其中昆虫是半翅目的成员。

45．根据权利要求43所述的方法，其中昆虫是蚜虫。

46．根据权利要求43所述的方法，其中昆虫是粉虱。

47．一种防治昆虫的方法，该方法包括给昆虫输送有效量的融合蛋白，该融合蛋白基本上由第一多肽片段和第二多肽片段组成，所述第一片段是循环性传播病毒的运输肽，所述第二片段是昆虫毒性肽。

48．根据权利要求47所述的方法，其中昆虫是半翅目的成员。

49．根据权利要求47所述的方法，其中昆虫是蚜虫。

50．根据权利要求47所述的方法，其中昆虫是粉虱。

51．一种防治昆虫的方法，该方法包括给昆虫喂食有效量的转基因植物或包含转基因植物的植物组织，所述植物或植物组织包含嵌合基因，该嵌合基因包含编码融合蛋白的DNA以及与编码融合蛋白的DNA操作性相连的异源启动子序列，所述DNA具有编码第一多肽片段的第一核苷酸序列和编码第二多肽片段的第二核苷酸序列，所述第一多肽片段是循环性传播病毒的运输肽，所述第二片段是昆虫毒性肽。

52．根据权利要求51所述的方法，其中昆虫是半翅目的成员。

53．根据权利要求51所述的方法，其中昆虫是蚜虫。

54．根据权利要求51所述的方法，其中昆虫是粉虱。

55．一种保护植物抵抗昆虫的方法，该方法包括在所述植物中表达嵌合基因，该嵌合基因包含DNA以及与编码融合蛋白的DNA操作性相连的异源启动子序列，所述DNA具有编码第一多肽片段的第一核苷酸序列和编码第二多肽片段的第二核苷酸序列，所述第一多肽片段是循环性传播病毒的运输肽，所述第二片段是昆虫毒性肽。

56．根据权利要求55所述的方法，其中昆虫是半翅目的成员。

57．根据权利要求55所述的方法，其中昆虫是蚜虫。

58．根据权利要求55所述的方法，其中昆虫是粉虱。