PT686197E - Sistema de expressao de genes baseado em geminivirus - Google Patents

Description

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DESCRICÃO “Sistema de expressão de genes baseado em geminivírus”

INTRODUÇÃO

Campo Técnico O presente invento refere-se à introdução de ácido nucleico em células de plantas utilizando um vector baseado num geminivírus. Mais particularmente, este invento refere-se ao uso de vectores de geminivírus que possibilitam a expressão específica num tecido de um transgene em células de plantas transfectadas.

Antecedentes

Para muitas aplicações, é desejável a possibilidade do controlo da expressão genética num estádio particular do crescimento de uma planta ou de uma célula, tecido ou parte da planta em particular. Para este objectivo, são necessários métodos que possam proporcionar a desejada iniciação da transcrição ou expressão em tipos de célula apropriados e/ou na altura certa do desenvolvimento da planta, sem que hajam efeitos deletérios graves no desenvolvimento e na produtividade da planta. Em geral, as técnicas de engenharia genética foram direccionadas para modificar o fenótipo de células individuais procarióticas e eucarióticas, especialmente em cultura. As células de plantas provaram ser mais intransigentes do que outras células eucariotas, pelo menos em parte devido à falta de sistemas de vectores apropriados.

Os geminivírus são vírus de plantas contendo componentes duplos com uma cadeia simples de ADN virai. Eles possuem uma molécula de ADN circular de cadeia simples (ss) como genoma encapsidado em partículas icosaédricas “geminadas” e interligadas. Os ADN ss encapsidados replicam através de ADN intermediários circulares de cadeia dupla no núcleo da célula hospedeira, provavelmente via um mecanismo de círculo rolante. A replicação do ADN virai, que resulta na simulação de ADN virais de cadeia simples e dupla de em larga escala, envolve apenas a expressão de um grupo reduzido de proteínas virais que são necessárias ou para o próprio processo de replicação, ou que facilitam a replicação ou a transcrição virais. Contudo, os geminivírus parecem basear-se principalmente no mecanismo do hospedeiro para copiar os seus genomas e expressar os seus genes.

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Os geminivírus subdividem-se com base na sua gama de hospedeiros ser de monocotiledóneas ou dicotiledóneas, e, se o insecto vector é um cicadelídeo ou uma espécie de mosca branca. A análise molecular do genoma de um número cada vez maior de geminivírus reforça esta divisão. Todos os geminivírus que infectam monocotiledóneas são transmitidos por cicadelídeos e o seu genoma compreende uma componente de ADN de cadeia simples ss de cerca de 2,7 Kb de comprimento; este tipo de genoma, o mais pequeno ADN infeccioso conhecido, é tipificado pelo vírus do trigo anão que é um de vários do subgrupo que foi clonado e sequenciado. Em contraste, a maioria dos membros que infectam hospedeiros dicotiledóneos são transmitidos pela mosca branca Bemisia tabaci e possuem um genoma bipartido que compreende ADN de tamanhos semelhantes (geralmente designados por A e B) como é exemplificado pelo vírus do mosaico da cassava africana (ACMV), pelo vírus do mosaico dourado do tomate (TGMV) e pelo vírus do mosaico amarelo da batata. Para que haja uma infecção de plantas com sucesso são necessários ambos os componentes genómicos. O vírus da ramagem enrolada da beterraba ocupa uma posição intermediária única entre os dois subgrupos anteriores, já que infecta dicotiledóneas mas contém um único componente genómico equivalente a ADN A, possivelmente resultante da adaptação à transmissão por cicadelídeos. O subgrupo bipartido contém só os vírus que infectam as dicotiledóneas. Como exemplo, o vírus do mosaico da cassava africana (ACMV) cujo genoma compreende duas moléculas de ADN circular de cadeia simples cada uma com aproximadamente 2,7Kb, que contêm uma região homóloga (com cerca de 200 nucleótidos) conhecida como região comum. Da análise da sequência e mutacional, sabe-se que o ADN A codifica para quatro estruturas de leitura abertas (ORF). As ORF são designadas de acordo com o componente do genoma e a orientação relativa em relação à região comum, i.e., complementar (c) versus virai (v): AC1, o gene de polimerase essencial à replicação; AC2 que é necessário para o dispersão do vírus; AC3 é um regulador da replicação de ADN; e AV1 é o gene da proteína da cápside. O ADN B tem duas ORF, BC1 e BV1, sendo ambas necessárias à dispersão do vírus. O arranjo das ORF mostra que elas são expressas de uma forma bidireccional. Foram identificados cinco transcritos principais que mapeiam com as ORF AV1, BV1, BC1 e AC1, separadamente, e nas ORF AC2/AC3 juntas. Mostrou-se que AC2 codifica um factor transactuante que estimula a produção do gene da proteína da cápside, AV1. 84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 3

Outro exemplo do grupo bipartido é o vírus do mosaico dourado do tomate (TGMV), que tal como o ACMV é composto por duas moléculas de ADN circular da mesma dimensão, sendo ambas necessárias à infectividade. A análise da sequência dos dois componentes genómicos revela seis estruturas de leitura abertas (ORF); quatro das ORF são codificadas por ADN A e duas por ADN B. Em ambos os componentes, as ORF divergem de uma região intergénica conservada de 230 nucleótidos (região comum) e são transcritas bidireccionalmente a partir da forma replicativa do ADN. As ORF são designadas de acordo com o componente do genoma e a sua orientação relativa em relação à região comum (i.e., esquerda versus direita). O produto do gene AL2 é um transactivador da expressão do gene da proteína da cápside do TGMV. É pequena a analogia de sequências entre os dois componentes de ADN do ACMV e do TGMV, excepto numa região comum praticamente idêntica de cerca de 200 bases, contudo, as ORF nos dois genomas são análogas e têm a mesma necessidade do produto do gene AL2 para a transactivação do gene da proteína da cápside. A análise de sequências de AL2 de vários geminivírus bipartidos revela que esta proteína tem a generalidade das características esperadas de uma proteína reguladora transactuante. É possível que a necessidade da função de AL2 atrase a expressão da proteína da cápside durante um período de tempo suficiente para permitir que ocorra a amplificação de ADNds.

Foram criados vectores em que a ORF da proteína da cápside foi substituída por uma sequência codificante heteróloga, e, esta sequência codificante heteróloga expressa a partir do promotor da proteína da cápside. Contudo, visto que a expressão da proteína da cápside está dependente da síntese da proteína reguladora de transactivação, o momento de expressão da sequência heteróloga do promotor da proteína da cápside depende do momento de expressão da proteína reguladora de transactivação. Por esse facto, teria o máximo interesse o desenvolvimento de vectores em que o momento de expressão da proteína reguladora de transactivação fosse alterado, alterando desse modo o momento de expressão do promotor da proteína da cápside e assim a expressão da sequência heteróloga inserida em lugar da ORF da proteína da cápside. O componente A do genoma contém toda a informação virai necessária à replicação e encapsidação do DNA virai, enquanto que o componente B codifica para funções necessárias ao movimento do vírus através da planta infectada. O componente A do ADN destes vírus é capaz de replicação autónoma em células de

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 4 plantas na ausência de ADN B, quando inserido numa forma maior que a cópia de comprimento total no genoma das células das plantas, ou quando uma cópia é electroporada para dentro das células da planta.

Literatura Relevante

As referências em relação aos geminivírus incluem as seguintes: R.H.A. Coutts et ai, Aust. J. Plant Physiol.(1990) 17:365-75; Ann Haley et ai, Virology (1992) 188: 905-909; Garry Sunter et ai, The Plant Cell (1992) 4:1321-1331; Clare L. Brough et ai, Virology (1992) 187:1-9; Garry Sunter et ai, Virology (1991) 180:416-419; e Garry Sunter et ai, Virology (1990) 179:69-77.

Também foram relatados genes que são expressos preferencialmente em tecidos de sementes de plantas, tais como em embriões ou em revestimentos de sementes. Veja-se, por exemplo, o Pedido da Patente Europeia 87306739.1 (publicada como 0 255 378 em 3 de Fevereiro de 1988) e Kridl et ai (Seed Science Research (1991) 1:209-219).

Uma classe de promotores específicos de frutos expressos na, ou durante a antese até todo o desenvolvimento do fruto, pelo menos até ao início do amadurecimento, é discutida no Pedido de Patente Europeia 88.906296.4, sendo a sua descrição aqui incorporada como referência. Foram isolados clones de ADN C que são preferencialmente expressos em fibra de algodão. Um dos clones isolados corresponde ao ARN M e à proteína que estão em maior quantidade durante os estádios de síntese da parede celular primário tardio e da parede celular secundário precoce. John Crow PNAS (1992) 89:5769-5773. Foram isolados e caracterizados clones de ADN C de tomate que apresentam expressão diferencial durante o desenvolvimento do fruto (Mansson et ai, Mol. Gen. Genet. (1985) 200:356-361; Slater et ai, Plant Mol. Biol. (1985) 5:137-147). O ARN M do plastídeo maduro para psbA (um dos componentes do fotossistema II) atinge o seu nível mais elevado tardiamente no desenvolvimento do fruto, enquanto após o início do amadurecimento, os ARN M dos plastídeos para outros componentes dos fotossistemas I e II diminuem para níveis não detectáveis nos cromoplastos (Piechulla et ai, Plant Molec. Biol. (1986) 7:367-376). Recentemente, foram também caracterizados e isolados clones de ADN C que representam genes aparentemente envolvidos no pólen do tomate (McCormick et ai, Tomato Biotechnology (1987) Alan R. Liss, Inc., NY) e em interacções no pistilo (Gasser et ai, Plant Cell (1989), 1:15-24).

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Outros estudos focaram-se em genes com regulação índutivel, isto é, genes que codificam para inibidores da serina-proteinase, que são expressas em resposta a feridas no tomate (Graham et ai, J. Biol. Chem. (1985) 260:6555-6560 : Graham et ai, J. Biol. Chem. (1985) 260:6561-6564) e em ARN M relacionados com a síntese de etileno na fruta amadurecida e nas folhas após as feridas (Smith et ai, Planta (1986) 168:94-100). A acumulação de uma proteína inibidora da metalocarboxipeptidase foi referida nas folhas de plantas de batata feridas (Graham et ai, Biochem Biophys Res Comm (1981) 101:1164-1170).

Em Umbeck, Patentes dos Estados Unidos NoS 5 004 863 e 5 159 135, é descrita a transformação de algodão mediada por Agrobacterium, e a transformação de algodão por bombardeamento de partículas é referida em WO 92/15675, publicado em 17 de Setembro de 1992. Foi descrita a transformação de Brassica por Radke et ai (Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694; Plant Cell Reports (1992) 11:499-505). A transformação de tomate cultivado é descrita por McCormick et ai, Plant Cell Reports (1986) 5:81-89 e por Fillatti et ai, Bio/Tecnology (1987) 5:726-730.

SUMÁRIO DO INVENTO

São proporcionadas novas construções de geminivírus recombinantes, incluindo cassetes de expressão e vectores de transferência, que permitem a transcrição controlada e/ou a expressão numa célula de planta transfectada de proteínas não indígenas ao geminivírus. São também proporcionados métodos para preparar as cassetes de expressão e métodos para a sua utilização de modo a produzir células de planta transfectadas contendo um genótipo e/ou um fenótipo alterados. As cassetes de expressão incluem uma cassete de expressão transactivável e uma cassete de expressão transactuante que podem ser combinadas num plasmídeo binário. A cassete de expressão transactivável tem como componentes ligados operativamente uma unidade de iniciação da transcrição obtida de um gene da proteína da cápside de um geminivírus, um fragmento de ácido nucleico diferente da sequência completa que codifica para a proteína da cápside do geminivírus, e uma região de terminação da transcrição. A cassete de expressão transactuante tem como componentes ligados operativamente uma unidade de iniciação da transcrição obtida de uma região 5’ não codificante de um gene que é expresso que não constitutivamente num ou mais tipos de células, tecidos ou partes de plantas, um fragmento de ADN

84 865 ΕΡ 0 686 197/ΡΤ 6 compreendendo a sequência codificante de um gene de geminivírus que codifica uma proteína reguladora de transactuação, e uma região de terminação da transcrição. Uma célula de planta transfectada pode ser produzida por contacto de uma célula de planta com um vector de transferência de um geminivírus recombinante, em que o vector de transferência pode compreender uma combinação das cassetes de expressão transactivável e transactuante. Alternativamente, pode ser usada uma combinação de vectores de transferência, como por exemplo, um geminivírus em que foi inactivado o equivalente do gene AC2 do ADN A do ACMV, e em que pelo menos a porção da sequência codificante do gene da proteína da cápside no genoma foi substituída por um fragmento de ácido nucleico não indígena ao geminivírus, e a região 5’ não codificante do / equivalente do gene AC2 do ADN B do ACMV foi substituída por um fragmento de ácido nucleico que em combinação com a região 5’ não codificante da proteína da cápside compreende uma unidade de transcrição; e uma cassete de expressão transactuante.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a construção de um plasmideo binário baseado em geminivírus. DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES ESPECÍFICAS De acordo com o presente invento, são descritas novas construções de geminivírus recombinantes incluindo vectores de transferência e métodos para os preparar e utilizar. Quando usados para transfectar uma célula de planta, os vectores de transferência proporcionam células de plantas transgénicas capazes de transcrição ou expressão controladas de um fragmento de ácido nucleico em um ou mais tipos de células de plantas. Dependendo da natureza das sequências reguladoras usadas no vector, a transcrição ou expressão do fragmento de ácido nucleico pode ocorrer num ou mais tipos particulares de células, tais como células de sementes, ou células embrionárias, ou células de grãos de pólen, ou células derivadas de ovários de plantas tais como fibras de algodão, quando comparadas com outras células de planta; em resposta a um estímulo particular, tal como feridas na planta devidas a um ataque por insectos, por exemplo, ou uma pressão ambiental como o calor ou a elevada salinidade. Plantas nas quais tecidos e/ou partes da planta particulares têm um fenótipo alterado, podem ser produzidas pelo método em causa.

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As construções incluem várias formas, dependendo da utilização pretendida para a construção. Assim, as construções incluem vectores, cassetes de transcrição, cassetes de expressão e plasmídeos binários. São necessárias duas construções básicas que podem ser então combinadas de várias maneiras, para transfectar uma célula de uma planta e obter uma célula de uma planta transgénica, capaz de transcrição ou expressão controladas de um fragmento de ácido nucleico. Estas duas construções incluem uma cassete de expressão transactivável e uma cassete de expressão transactuante. A cassete de expressão transactivável tem, como componentes ligados operativamente, uma unidade de iniciação da transcrição, obtenível a partir de um gene da proteína da cápside de um geminivírus, um fragmento de ácido nucleico diferente da sequência codificante total da proteína da cápside dos geminivírus, e uma região de terminação da transcrição. A cassete de expressão pode ser preparada por substituição da região codificante nativa da proteína da cápside por um fragmento de ácido nucleico diferente da sequência codificante total do gene da proteína da cápside do geminivírus, particularmente uma sequência codificante não indígena ao geminivírus, que é a fonte do gene da proteína da cápside. A “unidade de iniciação da transcrição” compreende um fragmento de genoma do geminivírus obtenível da região 5’ não codificante de um gene da proteína da cápside, em que o fragmento tem uma dimensão e uma sequência de ácido nucleico suficientes para proporcionar a transcrição do fragmento de ácido nucleico operativamente ligado, seguindo-se a activação por uma proteína reguladora de transactivação de um geminivírus. Por “obtenível" supõe-se uma unidade de iniciação da transcrição com uma sequência de ADN suficientemente semelhante à da unidade iniciação da transcrição da proteína nativa da cápside do geminivírus, para proporcionar a transcrição do fragmento de ácido nucleico operativamente ligado, seguindo-se a activação por uma proteína reguladora de transactivação dum geminivírus que activa a transcrição a partir da sequência nativa. Ambas as sequências incluídas são obteníveis, a natural e a sintética, bem como as sequências que possam ser uma combinação de sequências naturais e sintéticas. O termo “sequência codificante não indígena” significa uma sequência codificante que não ocorre no genoma não modificado do geminivírus específico que é usado para a preparação das composições do invento reivindicado. Uma sequência codificante modificada dum geminivírus, quer modificada por mutação, por truncagem, por junção a outras sequências, e semelhantes, incluindo uma

84 865 ΕΡ 0 686 197/ΡΤ 8 sequência para além da sequência codificante completa, constitui uma sequência codificante não indígena. A cassete de expressão transactuante tem como componentes operativa mente ligados uma unidade de iniciação da transcrição obtenível de uma região 5' não codificante de um gene que é expresso que não constitutivamente num ou mais tipos de células de plantas, em tecidos de plantas ou em partes de plantas; um fragmento de ADN que compreende uma sequência codificante de um gene de geminivírus que codifica para uma proteína reguladora transactuante, ou, uma sua congénere que tenha a mesma, ou uma actividade de transactivação semelhante; e uma região de terminação da transcrição.

Para a transfecção, a cassete de expressão transactivável e a cassete transactuante podem ser combinadas para formar um plasmídeo binário ou as duas cassetes de expressão podem ser introduzidas numa célula em dois plasmídeos separados. Por “um gene que é expresso que não constitutivamente’’ pretende-se significar que a transcrição do gene é controlada no tempo, quer positiva quer negativamente, por exemplo relativamente ao estádio de desenvolvimento do tecido tal como da pré-antese ao amadurecimento do fruto numa célula do ovário, e/ou ao tecido da transcrição, por exemplo, preferencialmente no fruto em comparação com as folhas. O vector de transferência é preparado fazendo uma modificação adicional no genoma virai. A sequência codificante do gene da proteína da cápside é substituída por um local de restrição no qual pode ser clonado um fragmento de ácido nucleico para transcrição ou expressão. Este vector de transferência pode ser combinado com a cassete transactuante num vector binário ou ser introduzido nas células em plasmídeos separados.

Um outro vector de transferência com autonomia replicativa pode ser construído, a partir de um geminivírus modificado no qual a região codificante para a proteína da cápside é substituída por um local de restrição onde pode ser clonado um fragmento de ácido nucleico para transcrição ou expressão, e no qual uma região 5’ não codificante de um gene que é expresso que não constitutivamente é inserida preferencialmente a 3’ da região codificante AC1 e a 5’ da região codificante AC2, para permitir a expressão controlada do gene AC2. Para expressão de um AC2 activo, pode ser necessária a reconstrução da porção da região codificante AC2 englobada na região codificante AC1. O vector de replicação

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 9 autónoma pode ser transferido para plantas só ou como parte de um vector binário. Qualquer genoma de geminivírus pode ser utilizado como fonte para um genoma de geminivírus para a preparação de um vector de transferência de geminivírus de replicação autónoma, ou para fragmentos de ADN de geminivírus que compreendem uma sequência codificante de uma proteína reguladora transactuante, ou uma unidade de iniciação da transcrição a partir de um gene de proteína da cápside. Os fragmentos de genoma de geminivírus usados na preparação de cassetes de expressão transactuantes e transactiváveis podem ser do mesmo vírus ou de diferentes vírus, desde que a proteína reguladora da transactivação e a unidade de transcrição da proteína da cápside sejam capazes de interagir, de modo a proporcionar a transcrição do fragmento de ácido nucleico ligado operativamente à unidade de transcrição da proteína da cápside. Exemplos de geminivírus adequados incluem o ACMV, o TGMV, o vírus do mosaico amarelo da batata, o BGMV, o vírus da folha enrolada da beterraba e o vírus da folha enrolada da abóbora. Harrison (1985) Ann. Rev. Phytopath. 23:55-82. A cassete de expressão de transactivação proporciona a expressão controlada da proteína reguladora transactuante por utilização de uma porção suficiente de uma região 5' não codificante obtenível de um gene que é expresso que não constitutivamente numa célula de planta, originando a expressão da sequência codificante da proteína reguladora transactuante, à qual está operativamente ligado. A região de iniciação da transcrição e da tradução (por vezes também referida como “promotor”) compreende, preferencialmente, uma região reguladora da iniciação da transcrição e uma região reguladora da iniciação da tradução de sequências 5’ não traduzidas, "locais de ligação aos ribossomas”, que são responsáveis pela ligação do ARN M aos ribossomas e iniciação da tradução. É preferível que todos os elementos funcionais da transcrição e da tradução da região de controlo da iniciação sejam derivados ou obteníveis do mesmo gene. Em algumas concretizações, o promotor será modificado pela adição de sequências, tais como “potenciadores”, ou deleções de sequências não essenciais e/ou indesejáveis. Por “obtenível” pretende-se designar um promotor com uma sequência de ADN suficientemente semelhante à do promotor nativo para proporcionar a desejada especificidade de transcrição de uma sequência de ADN de interesse. Isso inclui sequências naturais e sintéticas, bem como sequências que podem ser uma combinação de sequências sintéticas e naturais.

As regiões reguladoras são capazes de dirigir uma expressão controlada de uma proteína reguladora transactuante de um geminivírus. Por “expressão

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 10 controlada” pretende-se significar que a expressão ocorre numa ou em poucos tipos de células de plantas, e nunca ou apenas a níveis muito baixos nas outras células. A expressão pode ser o resultado de uma mudança do desenvolvimento, ou de um estímulo externo, ou outra mudança que resulte num “ligar” ou “desligar” da expressão de genes particulares num número limitado de tipos de células. Um promotor que dirige a expressão numa célula tal como uma célula do ovário desde a antese até à floração, mas dirige pouca ou nenhuma expressão após as alterações iniciais que ocorrem numa altura próxima da polinização e/ou fertilização, ou em outros tecidos da planta, é um exemplo de região reguladora capaz de dirigir a expressão controlada. Outros exemplos, incluem um promotor que dirige a expressão nas células da folha a seguir a lesão da folha, por exemplo, por insectos que mastigam as folhas, mas que dirige pouca ou nenhuma expressão nos outros tecidos, regiões reguladoras da transcrição de patatina como exemplo da modificação da expressão em tubérculos, e promotores que dirigem a expressão aumentada em resposta a estímulos ambientais tais como a salinidade aumentada da agrisfera e outros aspectos semelhantes. Em algumas concretizações, será desejável regular selectivamente a expressão num tecido ou tecidos particulares. Por exemplo, a regulação selectiva da expressão no tecido da semente, incluindo embrião ou tecido do revestimento de sementes, é desejável para modificação dos produtos das sementes, incluindo óleos de sementes, amido e proteínas de armazenamento. Para a modificação do óleo de semente, são de interesse uma variedade de alterações de fenótipo. Estas incluem modificações na composição dos ácidos gordos no óleo das sementes, tais como uma mudança na razão e/ou nas quantidades dos vários ácidos gordos, quanto ao comprimento da cadeia, ao grau de saturação e semelhantes. Estes resultados podem ser conseguidos proporcionando uma redução da expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou cofactores, produzindo um produto de transcrição que seja complementar ao produto de transcrição de um gene nativo, de modo a inibir a expressão do produto do gene, ou proporcionando a expressão endógena ou exógena dum gene, associada à síntese de ácidos gordos. Com particular interesse, estão as regiões de iniciação de transcrição associadas a proteínas de armazenamento, tais como a napina, a cruciferina, a β-conglicinina, a faseolina, a zeína ou corpos oleosos, tais como a oleosina, ou genes envolvidos na biossíntese de ácidos gordos, incluindo a proteína portadora de acilo (ACP), a estearoíl-ACP-dessaturase, e sintetases de ácidos gordos, e outros genes expressos durante o desenvolvimento embrionário, tais como o Bce4. Por exemplo, o promotor ACP proporciona um padrão de momentos apropriado para a modificação da biossíntese de ácidos gordos, e os métodos descritos aqui podem

84 865 ΕΡ 0 686 197/ΡΤ 11 ser utilizados para aumentar o nível da transcrição ou da expressão de um produto dum gene desejado ao longo daquele período particular de expressão ACP.

Por exemplo, quando usado em conjunto com uma sequência 5’ não traduzida capaz de iniciar a tradução, expressão no tecido definido do ovário, incluindo os tegumentos do ovário (também conhecidos como ‘‘células epidérmicas do óvulo”), o tecido central ou do pericarpo, e semelhantes, a região de iniciação da transcrição pode dirigir uma mensagem desejada codificada por uma sequência de ADN com interesse, num tecido particular, para efectuar mais eficientemente uma modificação fenotípica desejada. Por exemplo, a expressão no tecido do pericarpo do ovário, também conhecido como tecido da parede do ovário e/ou tecido central do ovário, poderia resultar em modificações úteis para as porções comestíveis de muitos frutos, incluindo as bagas verdadeiras como o tomate, a uva, o mirtilo, a uva-do-monte, a groselha e a beringela; os frutos com caroço (drupas), tais como a cereja, a ameixa, o damasco, o pêssego, a nectarina e o abacate; e os frutos compostos (drupéolas), tais como a framboesa e a amora silvestre. No hesperídeo (laranjas e citrinos), espera-se que tais cassetes de expressão sejam expressas na porção sumarenta do fruto. Nos pepónios, (tais como a melancia, o cantalupo, o melão, o pepino e a abóbora-menina) o tecido equivalente é, muito provavelmente, a porção comestível interna. Noutros frutos, tais como os legumes, o tecido equivalente é o das vagens de sementes. A modificação de estruturas análogas de frutos não comestíveis pode também ser interessante. Assim, são de interesse especial as regiões de iniciação da transcrição, expressáveis pelo menos no tecido do pericarpo exterior do ovário. Por exemplo, no algodão a estrutura análoga ao ovário é o ouriço da cápsula do algodão, na colza é a vagem de sementes. De modo semelhante, a regulação da expressão nos tegumentos e/ou nos tecidos centrais do ovário pode resultar em modificações úteis do fruto análogo e estruturas relacionadas envolvidas, por exemplo pelos de cobertura da semente, como as fibras de algodão. A fibra de algodão é uma célula epidérmica única diferenciada do tegumento externo do óvulo. Há quatro fases distintas de crescimento; iniciação, elongação (síntese da parede celular primária), síntese da parede celular secundária e maturação. A iniciação do desenvolvimento da fibra parece ser despoletado por hormonas. A parede celular primária é delineada durante a fase de elongação, com a duração de 25 dias após a antese (DPA). A síntese da parede secundária começa antes da cessação da fase de elongação e continua até 40 DPA aproximadamente, formando uma parede de celulose quase pura. Para além dos promotores dos

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 12 tecidos do ovário, regiões de iniciação da transcrição de genes expressos preferencialmente em tecidos de sementes, e, em particular, em tecidos de revestimento de sementes são também de interesse para aplicações em que a modificação da fibra de algodão é considerada.

Um exemplo de um gene que é expresso em altos níveis nas células de revestimento de sementes de Brassica é o gene EA9 descrito em EPA 0 255 378. É aí proporcionada a sequência de ácido nucleico de uma porção de ADN C de EA9, e pode ser utilizada para obter sequências correspondentes, incluindo a região promotora. Um gene adicional da semente que é expresso no embrião da semente e nas células do revestimento da semente é o gene Bce4 de Brassica. A região promotora deste gene também se utiliza no objecto deste invento; este gene e a correspondente região promotora são descritos em WO 91/13980, que foi publicado em 19 de Setembro de 1991. As proteínas específicas da fibra são reguladas durante o desenvolvimento. Assim, têm também interesse as regiões de iniciação da transcrição de proteínas expressas em células de fibra. Um exemplo de uma proteína da célula de fibra regulada no desenvolvimento, é a E6 (John e Crów Proc. Nat. Acad. Sei. (USA) (1992) 89:5769-5773). O gene E6 é o mais activo na fibra, embora se encontrem níveis baixos de transcrição na folha, no óvulo e na flor.

Para obter uma região de iniciação da transcrição especificamente derivada, podem ser empregues os passos que se seguem. O ARN mensageiro (ARN M) é isolado de um tecido no estádio de desenvolvimento desejado. Este ARN M é então usado para construir clones de ADN C que correspondam à população de ARN M tanto em termos da sequência primária de ADN dos clones como em termos de abundância dos diferentes clones na população. O ARNm é também isolado de um tecido num estádio de desenvolvimento diferente no qual o gene alvo não deve ser expresso (tecido alternativo). O ADNc radioactivo do tecido desejado ou do tecido alternativo é utilizado para pesquisar cópias duplas de clones de ADNc. A pesquisa preliminar permite a classificação dos clones de ADNc como os correspondentes aos ARNm que são abundantes em ambos os tecidos; os que correspondem a ARNm que não são abundantes em qualquer tecido; os que correspondem a ARNm que são abundantes num tecido e relativamente pouco abundantes noutro. São então seleccionados os clones que correspondem a ARNm que são abundantes apenas no tecido desejado, sendo estes clones seleccionados para posterior caracterização.

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Visto que a sonda para a hibridação para a pesquisa preliminar acima esboçada é o ADNc total de um determinado tecido, este híbrida principalmente com as sequências mais abundantes. Para determinar o nível real de expressão, particularmente em tecidos em onde o ARNm não é abundante, a sequência clonada é usada como sonda de hibridação à(s) população(ões) de ARNm total do(s) tecido(s) desejado(s), e em vários tecidos indesejados. Isto é feito mais vulgarmente por “Northern blot", que fornece informação sobre a abundância relativa dos ARNm nos tecidos particulares e sobre o tamanho do transcrito de ARNm. É importante saber se a abundância do ARNm é devida à transcrição de um único gene, ou, se o produto da transcrição provém de uma família de genes. Isto pode ser determinado sondando por “Southern blot” genómico com o clone de ADNc. O ADN genómico total é digerido com várias enzimas de restrição e hibridado com o clone de ADNc radioactivo. Do padrão e da intensidade da hibridação, pode-se distinguir entre as possibilidades de o ARNm ser codificado por um ou dois genes, ou por uma grande família de genes relacionados. Pode ser difícil determinar qual de entre vários genes que hibridam de forma cruzada codifica para o ARNm abundantemente expresso encontrado no tecido desejado. Neste caso, é importante usar uma sonda que seja capaz de distinguir um gene particular dos remanescentes de uma família de membros. O ADNc obtido como foi descrito pode ser sequenciado para determinar a estrutura de leitura aberta (provavelmente a região codificante da proteína) e a direcção da transcrição de tal modo que uma desejada sequência de ADN alvo possa mais tarde ser inserida no local correcto e na orientação correcta numa cassete de transcrição. A informação sobre a sequência do clone de ADNc também facilita a caracterização dos correspondentes clones genómicos, incluindo o mapeamento e a subclonagem como descritos abaixo. Ao mesmo tempo, uma biblioteca genómica pode ser pesquisada quanto a clones que contenham a sequência completa do gene, incluindo a região de controlo que flanqueia as sequências transcritas. Os clones genómicos contêm geralmente grandes segmentos de ADN (aproximadamente com 10-20 kb), e podem ser mapeados usando enzimas de restrição, depois subclonados e parcialmente sequenciados para determinar que segmentos contêm o gene regulado no desenvolvimento.

Usando o método descrito acima, foram identificadas várias regiões reguladoras da transcrição. Um exemplo, é a região de iniciação da transcrição

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 14 derivada do tomate, que regula a expressão da sequência correspondente ao clone de ADNc pZ130. As sequências hibridáveis ao clone pZ130, por exemplo, a sonda pZ7, mostra ARNm abundante, especialmente nos estádios precoces da antese. A mensagem é expressa no tegumento do ovário e no tecido exterior do pericarpo do ovário, e não é expressa, ou pelo menos não é facilmente detectável, noutros tecidos ou em qualquer outro estádio do desenvolvimento do fruto. Assim, a região de iniciação da transcrição do pZ130 é considerada específica do ovário para os objectivos deste invento. A região de iniciação da transcrição de pZ130 está descrita em USPN 5 175 095.

Um promotor de um gene do tomate, referido como 2A11, foi isolado utilizando os métodos descritos acima. O promotor 2A11 proporciona um mensageiro abundante, sendo activado na ou pouco depois da antese, e permanecendo activo até ao estádio do fruto vermelho. A expressão do gene 2A11 sob o promotor 2A11 ocorre apenas no fruto; em geral, não há expressão detectável obtida na raiz, folhas ou caules. O gene codifica para uma sequência de aminoácidos ricos em enxofre, semelhante a proteínas de armazenamento de plantas, em teor de enxofre e dimensão. A região de iniciação da de 2A11 transcrição está descrita em USPN 4 943 674, concedida em 24 de Julho de 1990 e no pedido PCT W090/04063. A transcrição específica de tecidos sugere que as proteínas reguladoras do gene podem ser ligadas a sequências potenciadoras e a outros elementos promotores a mantante, nas células específicas. Elemento potenciador (“potenciador”) define-se como uma sequência de ADN regulatora, que seja capaz de activar a transcrição a partir de um promotor que lhe esteja ligado e cuja síntese, comece no local habitual de início do ARN; o que é capaz de operar em ambas as orientações (normal e inversa); e aquele que é capaz de funcionar mesmo quando movido a montante ou a jusante do promotor. Tanto os potenciadores como outros elementos promotores a montante ligam-se a proteínas de ligação a ADN específicas de sequências que medeiam os seus efeitos.

Como um exemplo, para identificar as sequências nucleotídicas exactas, importantes para a função do(s) potenciador(es) e de outros elementos a montante, fragmentos da região 5’ de 2A11 foram pesquisados quanto à sua capacidade de se ligarem a proteínas nucleares e quanto á sua capacidade de funcionarem num promotor heterólogo. Ensaios de ligação a proteínas nucleares do tecido de frutos, ou de outro tecido, como a folha, podes ser usados para determinar a presença de

84 865 ΙΞΡ0 686 197/ΡΤ 15 potenciadores e sequências silenciadoras; os estudos de ligação a proteínas podem ser usados para apontar sequências nucleotídicas específicas que se ligam a uma série correspondente de proteínas reguladoras dos genes. A actividade de cada potenciador e de outros elementos promotores a montante, geralmente está presente num segmento de ADN que pode conter locais de ligação para múltiplas proteínas. Os locais de ligação podem geralmente ser dissecados por preparação de versões mutadas menores que a sequência potenciadora ligada a um gene “repórter” cujo produto seja facilmente medido, como o gene Gus. O efeito de cada mutação na transcrição pode então ser testado. Altemativamente, podem ser preparados fragmentos desta região. Cada uma das versões mutadas da sequência potenciadora, ou dos fragmentos, pode ser introduzida numa célula hospedeira apropriada e pode ser medida a eficiência da expressão do gene repórter. Os nucleótidos necessários para a função potenciadora neste teste são então identificados como locais de ligação para as proteínas específicas, por meio de ensaios de desvio de mobilidade em geles e de impressão “digital” de ADN. Meios alternativos para examinar a capacidade de fragmentos isolados aumentarem a expressão do gene repórter consistem em procurar sub-domínios da região a montante, que sejam capazes de aumentar os níveis de expressão de um promotor que compreende a caixa TATACAAT, mas apresentam pouca ou nenhuma actividade detectável. Um exemplo de um tal promotor, é o promotor truncado 35S (veja por exemplo, Poulsen e Chua, Mol. Gen. Genet. (1988) 214:16-23 ; Benfey et al., EMBO J. (1990) 9:1677-1684 e 1685-1696; Gilmartin, Plant Cell (1990) 2:369-378). Um fragmento da região 5’ é inserido numa cassete de expressão em frente ao promotor truncado, e o efeito na expressão do gene repórter é avaliada. O pedido PCT W090/04063 cuja descrição é aqui incorporada por referência, revela como preparar e utilizar sequências reguladoras a montante como exemplificado utilizando o gene 2A11.

Outras regiões promotoras de interesse incluem as que regulam a expressão da enzima poligalacturonase, uma enzima que tem um papel importante no amadurecimento do fruto. O promotor da poligalacturonase é activo, pelo menos até ao estádio do aparecimento do fruto vermelho. Na determinação das quantidades óptimas de outras regiões 5’, tais como as do gene PG, que são necessárias para dar expressão a uma sequência de ADN de interesse preferencialmente no fruto, pode ser efectuada uma pesquisa como descrito acima para a região 5' do 2A11, utilizando um gene repórter como o Gus. O gene da poligalacturonase está descrito em USPN 4 535 060 concedida em 13 de Agosto de

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 16 1985, em USPN 4 769 061 concedida em 6 de Setembro de 1988, em USPN 4 801 590 concedida em 31 de Janeiro de 1989 e em USPN 5 107 065 concedida em 21 de Abril de 1992. Têm também interesse as regiões 5’ não codificantes dos seguintes genes: factor de elongação EF-1, que está activo no tecido meristemático, e é revelado em USPN 5 177 011 concedida em 5 de Janeiro de 1993; MAC, que é revelado em USPN 5 106 739 concedida em 21 de Abril de 1992; choque térmico, revelado em USPN 5 187 267 concedida em 16 de Fevereiro de 1993 ;e ACC/napina que está activa na semente e é revelada em EP 255 378. A cassete de transcrição transactivável incluirá como componentes ligados operativamente no sentido da transcrição, a região de iniciação da transcrição da proteína da cápside do geminivírus e, opcionalmente, uma região de iniciação da tradução, a sequência de ácido nucleico de interesse, e uma região de terminação da transcrição e, opcionalmente, da tradução, funcional na célula da planta. Quando a cassete proporciona a transcrição e a tradução de uma sequência de ácido nucleico de interesse, então é considerada uma cassete de expressão. Podem também estar presentes na cassete um ou mais intrões. Outras sequências podem também estar presentes na cassete transactivável, incluindo os que codificam para péptidos de trânsito e, como desejável, para sequências de comando se secreção. Como obter e usar estas sequências é bem conhecido dos são peritos nessa área. A jusante, e sob o controlo regulador, da região de controlo da iniciação da transcrição/ tradução da proteína da cápside está uma sequência nucleótidica de interesse. A sequência de nucleótidos pode ser qualquer estrutura de leitura aberta, codificando para um polipéptido de interesse, por exemplo, uma enzima ou uma sequência complementar a uma sequência, onde a sequência genómica pode ser uma estrutura de leitura aberta, um intrão, uma sequência de comando não codificante, ou qualquer outra sequência, em que a sequência complementar iniba a transcrição, o processamento do ARN mensageiro, como por exemplo, o união ou tradução. As sequências nucleotídicas deste invento podem ser sintéticas, derivadas naturalmente ou uma combinação de ambas. Dependendo da natureza da sequência nucleótidica de interesse, pode ser desejável sintetizar a sequência com os codões preferidos da planta. Os codões preferidos da planta podem ser determinados a partir dos codões de mais alta frequência nas proteínas expressas em maior quantidade na espécie particular da planta de interesse. 17 84 865 ΕΡ 0 686 197/ΡΤ A modificação fenotípica pode ser atingida por modulação da produção de um produto endógeno da transcrição ou da tradução, por exemplo, como a quantidade, a distribuição relativa, ou semelhante, ou um produto exógeno da transcrição ou da tradução para proporcionar, por exemplo, uma nova função ou novos produtos numa célula ou tecido hospedeiro transgénicos. Têm particular interesse as sequências de ADN que codificam para a expressão de produtos associados ao desenvolvimento do fruto da planta, incluindo genes envolvidos no metabolismo de citoquininas, auxinas, etileno, ácido abcíssico e outros semelhantes. Métodos e composições para a modulação da expressão de citoquinina estão descritos na Patente dos Estados Unidos N°5 177 307.

Altemativamente, podem ser utilizados vários genes de fontes que incluem outras células eucarióticas e procarióticas, incluindo bactérias, tais como produtos dos genes biossintéticos da citocinina e da auxina de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, e mamíferos, por exemplo interferões.

Outros genes de interesse incluem genes da biossíntese dos ácidos gordos, incluindo tioesterases de cadeias médias e longas (WO 91/16421 publicado em 31 de Outubro de 1991), dessaturase (WO 91/13972 publicado em 19 de Setembro de 1991), sintetases ( WO 92/03564 publicado em 5 de Março de 1992); genes de aromatizantes tais como SPS (WO 91/19808 publicado em 26 de Dezembro de 1991); genes de amadurecimento, tais como a poligalacturonase anti-sentido (USPN 4 801 540), os genes de etileno anti-sentido, tais como ACCD, a ACC-sintase, a enzima formadora de etileno (EFE) (WO 91/02958). Outras modificações fenotípicas incluem modificação da cor de partes da planta que se desenvolvem dos tegumentos do ovário e/ou do tecido interno, como por exemplo os pêlos do revestimento de sementes, tais como as fibras de algodão. Têm interesse os genes envolvidos na produção de melanina e os genes envolvidos na produção de índigo. As melaninas são pigmentos castanho escuro encontrados em animais, plantas e microorganismos, podendo qualquer um deles servir como fonte de sequências para inserção em construções do presente invento. A cor do algodão, e a cor e a qualidade do fruto, podem ser modificadas por utilização dos genes da via dos carotenóides ( EP 0 393 690 e WO 91/13078).

Cassetes de transcrição transactiváveis podem ser usadas quando se deseja a transcrição de uma sequência anti-sentido. Quando se deseja a expressão de um polipéptido, serão usadas as cassetes de expressão transactiváveis que

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 18 proporcionam a transcrição e a tradução da sequência de nucleótidos de interesse. Há várias mudanças com interesse; essas mudanças podem incluir modulação (aumento ou diminuição) da formação de sacáridos, hormonas, enzimas particulares ou outros parâmetros biológicos. Estes incluem também modificações na composição final do fruto ou da fibra, por exemplo, modificação da razão e/ou quantidades de água, de sólidos, de fibra ou de açúcares. Modificações desejáveis da semente incluem o teor de óleo, a composição em ácidos gordos e o teor de proteínas armazenadas. Outras modificações de interesse de propriedades fenotípicas incluem a resposta à pressão, a organismos, a herbicidas, aquebra de ramos, a reguladores do crescimento e outros semelhantes. Estes resultados podem ser conseguidos proporcionando a expressão reduzida de um ou mais produtos endógenos, particularmente uma enzima ou um cofactor, quer seja pela produção de um produto de transcrição que é complementar (anti-sentido) ao produto de transcrição de um gene nativo, de modo a inibir a maturação e/ou a expressão do produto de transcrição, ou proporcionando a expressão de um gene, endógeno ou exógeno, a ser associado ao desenvolvimento de um tecido particular ou de uma parte da planta. A região de terminação que é utilizada nas cassetes de expressão transactiváveis e transactuantes será principalmente a que é conveniente, visto que as regiões de terminação parecem ser relativamente intermutáveis. A região de terminação que é usada pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, nativa com a sequência de ADN de interesse, ou pode ser derivada de outra fonte. A região de terminação pode ocorrer naturalmente, ou ser total ou parcialmente sintética. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação da octopina-sintetase e da nopalina-sintase. Em algumas concretizações, pode ser desejável usar a terminação da região nativa 3’ para a região de iniciação da transcrição usada numa construção particular.

Normalmente, as várias construções são ligadas a um marcador para a selecção em células de plantas. Convenientemente, o marcador pode ser a resistência a um biócido, particularmente um antibiótico, como por exemplo, a canamicina, o G418, a bleomicina, a higromicina, o cloranfenicol ou outro semelhante. O marcador particular utilizado será apenas um que permitirá a selecção de células transformadas em relação às células que não têm o ADN que foi introduzido. Os componentes das construções de ADN, incluindo as cassetes de transcrição deste invento, podem ser preparadas a partir de sequências nativas

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 19 (endógenas) ou estranhas (exógenas) ao hospedeiro. Por estranha, entenda-se que a sequência não se encontra no hospedeiro do tipo selvagem no qual se introduziu a construção. Construções heterólogas contêm pelo menos uma região que não é nativa ao gene a partir do qual é derivada a região de iniciação da transcrição.

Na preparação das construções, os vários fragmentos de ADN podem ser manipulados de modo a originarem sequências de ADN na orientação correcta e, no enquadramento de leitura correcto para expressão, conforme conveniente; podem ser usados adaptadores ou ligantes para juntar fragmentos de ADN, ou poder-se-ão usar outras manipulações para proporcionar locais de restrição convenientes, para a remoção de ADN supérfluo, para a remoção de locais de restrição ou outros. Podem ser utilizados mutagénese in vitro, reparação por iniciadores, restrição, hibridação, nova clivagem, ligação ou outros, onde podem estar envolvidas inserções, deleções ou substituições, como por exemplo transições e transversões. Convenientemente, um vector ou cassete pode incluir um local de clonagem múltipla a jusante da região de iniciação da transcrição relacionada com o ovário, de tal modo que a construção possa ser utilizada de um modo eficiente para uma variedade de sequências.

Ao realizar os vários passos, a clonagem é utilizada para amplificar a quantidade de ADN e permitir a análise do ADN para assegurar que as operações ocorreram de maneira correcta. Por manipulações adequadas, tais como restrição, retrodigestão ou preenchimento com saliências para originar extremidades lisas, ligação de ligantes ou semelhantes, podem ser proporcionadas as extremidades complementares dos fragmentos para união e ligação. Está disponível uma grande variedade de vectores de clonagem, incluindo o vector de clonagem um sistema funcional de replicação em E. coli e um marcador, que permita a selecção da célula transformada. Vectores ilustrativos incluem o pBR332, as séries de pUC, as séries de M13mp, o pACY184, etc. Assim, a sequência pode ser inserida num local ou locais de restrição apropriados no vector, sendo o plasmídeo resultante utilizado para transformar o hospedeiro E. coli, crescendo a E. coli num meio com nutrientes apropriados e sendo as células colhidas e lisadas e o plasmídeo recuperado. A análise pode envolver análise da sequência, análise de restrição, electroforese ou semelhantes. Após cada manipulação, a sequência de ADN a ser usada na construção final pode ser restrita e ligada à sequência seguinte. Cada uma das construções parciais pode ser clonada no mesmo plasmídeo ou em plasmídeos diferentes.

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Estão disponíveis e são conhecidas dos peritos na arte várias técnicas para introduzir construções numa célula de planta hospedeira. Estas técnicas incluem transfecção com ADN utilizando A. tumefaciens ou A. rhizogenes como agentes transfectantes, fusão de protoplastos, injecção, electroporação, aceleração de partículas, etc. Para a transformação com Agrobacterium, os plasmídeos podem ser preparados em E. coli que contém ADN homólogo ao plasmídeo Ti, particularmente o T-ADN. O plasmídeo pode ou não ser capaz de replicação em Agrobacterium, ou seja, pode ou não ter um sistema de replicação procariótico de largo espectro tal como o tem, por exemplo, o pRK290, que depende em parte do facto de a cassete de transcrição ser integrada no plasmídeo Ti ou ser retida num plasmídeo independente. O hospedeiro Agrobacterium conterá um plasmídeo contendo os genes vir necessários para a transferência do T-ADN para a célula da planta, e, pode ou não ter o T-ADN completo. Pelo menos do lado direito, e, frequentemente de ambos os lados, direito e esquerdo, do T-ADN dos plasmídeos Ti e Ri, estarão juntas como regiões flanqueadoras da construção de transcrição. A utilização de T-ADN para a transformação das células de plantas foi objecto de intenso estudo que está amplamente descrito na Série EPA N° 120 516, Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Capítulo V, Knauf, et ai, Genetic Analysis of Host Expression by Agrobacterium, In: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A. ed., Springer-Verlag, NY, 1983, p. 245, e An et ai, EMBO J. (1985)4:277-284.

Para a infecção aceleração de partículas e electroporação, pode ser introduzido na célula da planta um plasmídeo Ti desarmado a que faltam particularmente os genes de tumor encontrados na região do T-ADN. Por meio de um plasmídeo ajudante, a construção pode ser transferida para A. tumefaciens e o resultante organismo transfectado pode ser usado para transfectar uma célula de planta; podem ser cultivados explantes com A. tumefaciens ou A. rhizogenes transformadas, para permitir a transferência da cassete de transcrição para as células da planta. Alternativamente, para aumentar a integração no genoma da planta podem usar-se repetições terminais de transposões como margens em conjunção com a transposase. Nesta situação, a expressão da transposase deve ser indutível, de tal modo que uma vez que a construção da transcrição esteja integrada no genoma, essa integração esteja relativamente estável. As células das plantas transgénicas são colocadas em meio selectivo apropriado para a selecção das células transgénicas que crescem então para calosidades, rebentos crescidos e pequenas plantas, derivadas dos rebentos por crescimento em meio para a raiz.

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Para confirmar a presença dos transgenes nas células e plantas transgénicas, pode ser realizada uma análise Southern blot usando métodos conhecidos dos peritos na arte. Os produtos de expressão dos transgenes podem ser detectados de uma série de formas variadas, dependendo da natureza do produto e incluem imunoensaios, ensaios enzimáticos ou inspecção visual, para detecção, por exemplo, da formação de pigmento na porção apropriada da planta ou nas células da planta. Uma vez obtidas as plantas transgénicas, estas podem crescer para produzir tecidos ou partes de planta com o fenótipo desejado. Podem ser recolhidos tecido da planta ou partes da planta e/ou a semente. A semente pode servir como fonte para o crescimento de plantas adicionais com tecidos ou partes possuindo as características desejadas. Os termos plantas transgénicas ou células transgénicas incluem plantas e células derivadas de plantas transgénicas ou de células transgénicas.

As várias sequências aqui proporcionadas podem ser usadas como sondas moleculares para o isolamento de outras sequências que podem ser úteis no presente invento para, por exemplo, obter regiões de iniciação da transcrição relacionadas, da mesma ou de diferentes fontes de plantas. Regiões 5’ não codificantes relacionadas e obtidas de sequências proporcionadas por este invento mostram pelo menos 60% de homologia, e, outras regiões mais preferidas demonstram uma percentagem ainda maior de homologia com as sondas. É de particular importância á capacidade de obtenção de regiões de controlo da iniciação da transcrição relacionadas, tendo o tempo e os parâmetros do tecido aí descritos. Por exemplo, utilizando a sonda pZ130, foram identificados pelo menos 7 clones adicionais, mas não foram posteriormente caracterizados. Assim, utilizando as técnicas descritas neste pedido e outras técnicas conhecidas no meio (tal como Maniatis et ai, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York) 1982), podem ser determinadas outras regiões de iniciação da transcrição capazes de direcção controlada da transcrição e/ou expressão, como se descreve neste invento. As construções podem também ser utilizadas em conjunto com os sistemas de regeneração da planta, para a obtenção de células de plantas e de plantas; as construções podem também ser usadas para modificar o fenótipo dos tecidos da planta ou de partes da planta produzidas por esse meio. O invento encontra uso particular no controlo da transcrição ou da expressão de um fragmento de ácido nucleico para proporcionar expressão preferencial ou, pelo menos, substancialmente específica, num tecido particular, por exemplo, no fruto ou nas sementes em comparação com outros tecidos tais como a folha, os

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 22 caules ou as raízes. Por “pelo menos substancialmente” entenda-se que a expressão dum fragmento de ácido nucleico de interesse num tecido particular, ou tecidos, ou partes, é cerca de 100 vezes maior do que a expressão do fragmento de ácido nucleico noutros tecidos ou partes da planta. Por “fruto” entenda-se a parede do ovário amadurecida duma flor e de qualquer de outras partes estreitamente associadas. (Veja Weirer; T.E. et ai, ed., Botany: An Introduction to Plant Biology (6th ed.) (John Wiley & Sons, 1982); Tootill & Backmore, eds., The Facts on a File Dictionary of Botany (Market Home Books, Ltd., 1984). Os exemplos seguintes são oferecidos como ilustração.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de cassetes de expressão de ACMV

As sequências nucleotídicas completas do ADN 1 e ADN 2 do ACMV (antes designado CLV) estão publicadas (Stanley e Gay, 1983, Nature 301, 260-262). Para construir um vector binário para a transformação de plantas, contendo o factor transactuante virai AC2 sob o controlo dos elementos reguladores ACP, uma tioesterase específica de C12 do loureiro sob o controlo dos elementos reguladores da proteína da cápside virai e um gene de resistência à canamicina sob o controlo do promotor de CaMV 35S, foram feitas as construções seguintes.

As sequências reguladoras (marcadas CP5’ e CP3’) da proteína da cápside (AV1) foram obtidas por PCR usando os seguintes oligonucleótidos e pETA092 como molde. O pETA092 (obtido de J. Stanley, John Innes Inst., Norwich, RU), é um clone completo do ADN 1 do ACMV no local Mlul do vector de clonagem plB120 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT). Os oligonucleótidos para a região 5’ da proteína da cápside foram o #3558, 5’-CT GG AGCT CAT GTT G ACCAAGT CAATT GG-3’ e o #3560, 5’-GCTACTAGTGGATCCCACATTGCGC-3’ e foram concebidos para amplificar sequências do ADN 1 do ACMV entre os nucleótidos 2752 e 299, que inclui a região comum e o local de início da transcrição da proteína da cápside. O oligonucleótido #3558 incorpora um local de restrição da Saci na extremidade 5’ do fragmento de PCR e o oligo #3560 que incorpora um local Spel na extremidade 3’ do fragmento para subclonagem. Os oligonucleótidos 3’ foram o #3564, 5’-CCACT GCAGCGACGTT G AAAATACG-3’ e o #3559, 5’-CACACTAGTCAATGTAATTAGAGCTGC-3’. Estes foram concebidos para

84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 23 amplificarem ο ADN 1do ACMV dos nucleótidos 1175 a 1315, com um local Pstl e um local Spel, respectivamente, nas extremidades 5’ e 3' do fragmento. Este fragmento contém o sinal de poliadenilação potencial para o gene da proteína da cápside. As condições de PCR foram: 94°C, 10 min, 72°C, 7 min, para adição da polimerase Taq, e depois, trinta ciclos de 94°C, 15 s, 50°C 30 s e 72°C durante 30 s.

As sequências 3’ da proteína da cápside foram subclonadas a partir da reacção de PCR (descrita acima) para criar o pCGN3289, cortando o ADN do PCR com Pstl e com Spel e ligando a um pCGN565 modificado resistente a cloranfenicol (pCGN3288) também clivado com Pstl e Spel. O pCGN3288 foi construído por digestão do pCGN565 (descrito em outros pedidos de patente) com Hind III e Pstl e ligação de um ligante sintético contendo locais Hindlll, Spe I e Pstl. O ligante foi preparado por hibridação de oligonucleótidos sintéticos 5’-AGCTTCCACTAGTGGCTGCA-3’ e 5’-GCCACTAGTCCA-3’. A sequência que codifica para a tioesterase do loureiro foi isolada do pCGN3826 (descrito no pedido de patente CGN82-4WO) por uma digestão completa com BamHI e uma digestão parcial com Pstl. A sequência isolada da tioesterase de 1,27kb foi então clonada a montante da região 3 da proteína da cápside por ligação do fragmento isolado da tioesterase com o pCGN3289 digerido com BamHI e Pstl. O plasmídeo contendo as sequências de tioesterase e o CP3’ é designado por pCGN3291. A sequência 5’ da proteína da cápside foi subclonada a partir de ADN de PCR por digestão com Saci e Spel e ligação a um vector Bluescript II KS(-) (Stratagene, La Jolla, CA) modificado, designado por pCGN3290, cortado com Saci e Spel. O pCGN3290 foi preparado por digestão do pBluescript II KS(-) com BamHI e Spel e ligação ao pCGN3291 clivado com BamHI e Spel. O plasmídeo resultante contém uma cassete de expressão que consiste na CP5’, no gene da tioesterase e no CP3’ numa estrutura resistente à ampicilina. A estrutura de leitura aberta de AC2 foi obtida por PCR utilizando iniciadores com as seguintes sequências: 5’-TGCTGAATTCAGAATGCAATCTTCATCACCC-3’ e 5’-TGCTCTGCAGCTAAAGACCCTTAAGAAAAGACC-3’ correspondendo aos nucleótidos 1774 a 1754 que rodeiam o codão de iniciação ATG da estrutura de leitura aberta de AC2, e aos nucleótidos 1386 a 1364 que rodeiam o codão de paragem. Os iniciadores têm locais EcoRI e Pstl, respectivamente, nas extremidades para os passos de clonagem seguintes. O molde para a PCR foi de 30 ciclos, depois 10min a 72 graus centígrados. O fragmento de PCR resultante 24 84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ (410 pb) foi subclonado em pBluescript II SK(-) por digestão com EcoRI e Pstl. A estrutura de leitura aberta AC2 é inserida na cassete de expressão ACP, pCGN1977 (Scherer et ai, 1992, Plant Molecular Biology 18, 591-594), por digestão com EcoRI e Pstl e ligação ao pCGN1977 clivado com EcoRI e Pstl. A cassete CP57TE/CP3’ é combinada com a cassete ACP57AC2/ACP3’ por digestão respectiva com Saci e Spel e com Asp718 e Saci, e ligação dos plasmídeos com um vector binário clivado com Asp718 e com Xbal tal como o pC2GN1557 (McBride e Summerfelt, 1990, Plant Molecular Biology 14, 269-276). O resultante vector binário contém: no lado esquerdo - 35S/NPT11/tm1 -ACP57AC2/ACP3 - CP57TE/CP3’ numa cassete de expressão do lado direito num fundo de resistência à gentamicina. O vector binário pode transformar Agrobacterium tumefaciens e ser utilizado para produzir plantas Brassica. O invento acima refere-se à utilização de vectores de geminivírus para a expressão controlada de um fragmento de ácido nucleico por utilização da região 5’ codificante de genes que proporcionam a regulação do desenvolvimento nas células de plantas no lugar do promotor nativo do gene do geminivírus que codifica uma proteína reguladora transactuante. Deste modo, as cassetes de transcrição e as cassetes de expressão podem ser produzidas de modo a permitirem a produção de células diferenciadas do produto desejado a partir do promotor da proteína da cápside do geminivírus. Assim, o fenótipo de uma parte particular da planta pode ser modificado, sem necessidade de o produto regulado ser produzido em todos os tecidos, o que pode resultar em vários efeitos adversos no crescimento, saúde e capacidades de produção da planta. Particularmente, é proporcionada a capacidade de iniciação da transcrição em tecidos específicos para modificar as propriedades fenotípicas de uma variedade de tecidos.

Lisboa, ^ ^

Por Calgene LLC e THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA

EMG.· ANTÓNIO JOÃO A CUNHA FERREIRA Âg. Of. Pr. Ind.

Sbq das Flores, 74 - 4.° 1B0O LISBOA

Claims (24)

1. 84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Vector de transferência de um geminivírus compreendendo um genoma de geminivírus em que a sequência codificante da proteína da cápside no referido genoma está delecionada e substituída por um local de restrição e onde a região de iniciação da transcrição do gene do factor transactuante do geminivírus no referido genoma é substituído por uma região de iniciação da transcrição de um gene que é expresso que não constitutivamente numa ou mais células de planta.
2. 2. Vector de acordo com a reivindicação 1, no qual a sequência de ADN de interesse é inserida no referido local de restrição.
3. 3. Vector de acordo com a reivindicação 2, no qual um produto de expressão da referida sequência de ADN de interesse é capaz de modificar o fenótipo da planta.
4. 4. Vector de acordo com a reivindicação 2, no qual um produto de transcrição da referida sequência de ADN de interesse é capaz de modificar o fenótipo da planta.
5. 5. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o referido genoma de geminivírus é repetido pelo menos 1,2 vezes.
6. 6. Vector de acordo com a reivindicação 5 compreendendo um T-ADN na margem direita.
7. 7. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que o referido geminivírus é um vírus do mosaico da cassava africana.
8. 8. Célula de planta compreendendo um vector de transferência de geminivírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. 9. Cassete de expressão transactuante compreendendo componentes operativamente ligados no sentido 5’ para 3’ da transcrição: uma região de iniciação da transcrição obtida de uma região 5’ não codificante de um gene duma planta que é expresso que não constitutivamente numa ou mais células de plantas; 84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 2/4 um fragmento de ADN que codifica para um factor transactuante da proteína da cápside de um geminivírus; e uma região de terminação da transcrição.
10. 10. Cassete de expressão transactuante de acordo com a reivindicação 9, em que o referido gene da planta, que é expresso que não constitutivamente, é um gene que codifica para um polipéptido seleccionado de ACP, Bce4, napina, poligalacturonase, 2A11, pZ7, hsp80, EF-1, ssu e EA9.
11. 11. Cassete de expressão transactuante de acordo com a reivindicação 9 ou 10 em que o referido geminivírus é um vírus do mosaico da cassava africana.
12. 12. Célula de planta que compreende uma cassete de expressão transactuante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11.
13. 13. Plasmídeo binário compreendendo: (i) uma cassete transactivável consistindo essencialmente numa região de iniciação da transcrição obtida dum gene da proteína da cápside de um geminivírus; uma sequência de ADN de interesse que seja outra que não a sequência codificante de comprimento total do referido gene da proteína da cápside e que é capaz de modificar um fenótipo da planta; uma região de terminação da transcrição; e (ii) uma cassete de expressão transactuante que consiste essencialmente numa região de iniciação da transcrição obtida de uma região 5’ não codificante de um gene duma planta que é expresso que não constitutivamente numa ou mais células de plantas; um fragmento de ADN que codifique um factor transactuante da proteína da cápside, e uma região de terminação da transcrição.
14. 14. Plasmídeo binário de acordo com a reivindicação 13 compreendendo adicionalmente T-ADN na margem direita.
15. 15. Plasmídeo binário de acordo com a reivindicações 13 e 14 compreendendo adicionalmente um marcador seleccionável de plantas.
16. 16. Célula de planta compreendendo um plasmídeo binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15.
17. 17. Vector binário compreendendo: 84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ 3/4

    (i) um genoma de geminivírus em que uma sequência codificante num gene da proteína da cápside no referido genoma está delecionado e substituído por um local de restrição e uma sequência de ADN que codifica para um factor transactuante dum geminivírus está modificada para impedir o referido geminivírus de produzir um factor proteico transactuante funcional; (ii) uma cassete de expressão transactuante consistindo essencialmente numa região de iniciação da transcrição obtida de uma região 5’ não codificante de um gene de uma planta que seja expresso que não constitutivamente numa ou em mais células de plantas, um fragmento de ADN codificando para um factor transactuante da proteína da cápside do geminivírus e uma região da terminação da transcrição; e (iii) uma região T-ADN marginal direita.
18. 18. Método para produzir um vector de transferência de um geminivírus, compreendendo o referido método: num genoma de geminivírus, a substituição de uma sequência codificante de um gene da proteína da cápside por uma sequência de ADN de interesse capaz de modificar um fenótipo da planta; e substituição da região de iniciação da transcrição do gene que codifica para o factor transactuante da proteína da cápside com uma região de iniciação da transcrição de um gene que seja expresso que não constitutivamente numa ou mais células de plantas..
19. 19. Planta transgénica que compreende uma célula de acordo com a reivindicação 12 ou 16.
20. 20. Método de produção de uma planta transgénica por selecção de uma célula transgénica de acordo com a reivindicação 12 ou 16, formando calosidades a partir daí, crescendo rebentos a partir das calosidades e gerando pequenas plantas a partir dos rebentos, permitindo então que das referidas pequenas plantas formem plantas.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20 compreendendo ainda a colheita de tecido da planta ou partes da planta compreendendo células de acordo com a reivindicação 12 ou 16, e/ou a colheita da semente da referida planta.
22. 22. Tecido de planta ou parte de planta, de uma planta de acordo com a reivindicação19. 84 865 ΕΡ Ο 686 197/ΡΤ ΑΙΑ
23. 23. Semente de uma planta de acordo com a reivindicação 19.
24. 24. Semente de planta transgénica compreendendo uma célula de acordo com a reivindicação 12 ou 16. 31. /:00. 2000 Lisboa, Por Calgene LLC e THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA