NL9001711A - Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat. - Google Patents

Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat. Download PDF

Info

Publication number
NL9001711A
NL9001711A NL9001711A NL9001711A NL9001711A NL 9001711 A NL9001711 A NL 9001711A NL 9001711 A NL9001711 A NL 9001711A NL 9001711 A NL9001711 A NL 9001711A NL 9001711 A NL9001711 A NL 9001711A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
rna
viral
virus
derived
recombinant dna
Prior art date
Application number
NL9001711A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Clovis Matton N V
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from NL8902452A external-priority patent/NL8902452A/nl
Application filed by Clovis Matton N V filed Critical Clovis Matton N V
Priority to NL9001711A priority Critical patent/NL9001711A/nl
Priority to CA002396794A priority patent/CA2396794A1/en
Priority to CA002026703A priority patent/CA2026703C/en
Priority to IE354190A priority patent/IE76133B1/en
Priority to AT90202627T priority patent/ATE142700T1/de
Priority to ES90202627T priority patent/ES2094744T3/es
Priority to EP90202627A priority patent/EP0425004B1/en
Priority to PT95494A priority patent/PT95494B/pt
Priority to DE69028479T priority patent/DE69028479T2/de
Priority to JP2266173A priority patent/JPH03280883A/ja
Priority to DK90202627.7T priority patent/DK0425004T3/da
Publication of NL9001711A publication Critical patent/NL9001711A/nl
Priority to GR960403367T priority patent/GR3021950T3/el
Priority to US08/901,379 priority patent/US6197542B1/en
Priority to US09/234,163 priority patent/US6093554A/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48Nerve growth factor [NGF]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203Virus mediated transformation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/38011Tombusviridae
    • C12N2770/38022New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Genetische manipulaties met recombinant DNA, dat van RNA virus afgeleide sequenties omvat
De uitvinding ligt op het gebied van de genetische manipulatie door middel van DNA-recombinant technieken, meer in het bijzonder op het gebied van de genetische manipulatie van eukaryotische organismen, zoals gisten, schimmels en vooral planten.
Daarbij is de uitvinding in het bijzonder gericht op genetische manipulaties, die tot resistentie van het gastheer organisme tegen een of meerdere RNA virussen leiden, en op genetische manipulaties, welke het gastheer organisme in staat stellen tot een induceerbare of weefselspecifieke produktie van vreemde eiwitten/peptiden of RNAs.
Voor deze genetische manipulaties wordt recombinant DNA gebruikt, dat een of meerdere van RNA virus afgeleide sequenties omvat, of meer in het bijzonder ten minste één nucleotiden-sequentie omvat die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase (d.w.z. een RNA-afhankelijk RNA polymerase, dat ook wel wordt aangeduid met de term replicase). Deze RNA virussen kunnen behoren tot de groep der dubbelstrengs RNA virussen (d.w.z. dat het genoom van het virus uit dubbelstrengs RNA bestaat), tot de groep der positiefstrengs RNA virussen (d.w.z. dat het genoom van het virus uit 'sense' of boodschapper enkelstrengs RNA bestaat), of tot de groep der negatiefstrengs RNA virussen (d.w.z. dat het genoom van het virus uit 'antisense' enkelstrengs RNA bestaat).
Niet alle RNA virussen zijn voor hun replicatie echter afhankelijk van een viraal RNA/RNA polymerase. Dit geldt met name voor de tot de familie der Retroviridae behorende virussen, die voor vermenigvuldiging afhankelijk zijn van DNA replicatie nadat het genomische RNA door middel van reverse transcriptase in DNA is overgeschreven.
Voorbeelden van RNA virussen, die voor hun replicatie afhankelijk zijn van een viraal RNA/RNA polymerase, zijn dubbel-strengsvirussen uit de families der Reoviridae en Birnaviridae, negatiefstrengsvirussen uit de families der Arenaviridae, Bunya-viridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae en Rhabdoviridae, en positiefstrengsvirussen uit de families der Togaviridae, Flavi-viridae, Coronaviridae, Nodaviridae, Picornaviridae en Calici-viridae. Concrete voorbeelden van positiefstrengsvirussen met een plantaardige gastheer zijn Tobacco Mosaic Virus, Tobacco Necrosis Virus, Brome Mosaic Virus, Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Streak Virus, Tobacco Rattle Virus, Cowpea Mosaic Virus, Tomato Black Ring Virus, Potato Y Virus, Turnip Yellow Mosaic Virus, Tomato Bushy Stunt Virus, Southern Bean Mosaic Virus, Barley Yellow Dwarf Virus, Potatovirus X, Sugar Beet Yellows Virus, Carnation Latent Virus, Carnation Ringspot Virus, Barley Stripe Mosaic Virus, Alfalfa Mosaic Virus, Pea Enation Mosaic Virus, en Tomato Spotted Wilt Virus.
Met in acht neming van de bovenstaand genoemde beperking tot RNA virussen die voor hun replicatie afhankelijk zijn van een viraal RNA/RNA polymerase, worden hier met de term 'RNA virus' ook virussen en virusoïden omvat, die voor hun replicatie aangewezen zijn op hulp van een ander (helper) virus. Zoals algemeen bekend is, kunnen RNA virus infecties gepaard gaan met coïnfecties van bijvoorbeeld satellietvirussen met een eigen manteleiwit, satelliet RNA dat in gemengde partikels is verpakt, en virusoïden (een klein circulair RNA genoom, verpakt in gemengde partikels). Ook viroïden, d.w.z. autonome kleine naakte RNA molekulen, worden hierin door de term 'RNA virus' omvat. De nadere toelichting van de uitvinding in het latere experimentele gedeelte zal geschieden aan de hand van een RNA satellietvirus, nl. het Satellite Tobacco Necrosis Virus (STNV), een klein plantevirus (1,85 x 103 kD), dat voor zijn replicatie volledig afhankelijk is van de aanwezigheid van het helper Tobacco
Necrosis Virus (TNV). Het RNA genoom van STNV bevat 1239 nucleo-tiden en codeert voor een manteleiwit van 195 aminozuren.
De uitvinding bestaat uit het door middel van genetische manipulatie inbouwen in het genoom van eukaryoten van genetische informatie, die noch als zodanig, noch door daarvan afgeleide transcriptieprodukten voor de gastheer een belasting betekent, maar toch een zeer doelmatige bescherming van de gastheer tegen virale infecties realiseert, resp. een induceerbare of weefsel-specifieke, zeer efficiënte produktie van vreemde eiwitten (of peptiden) of RNAs mogelijk maakt. De volgens de uitvinding in te bouwen genetische informatie omvat een expressie-cassette voor de te transformeren gastheer met daarin opgenomen twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties met daartussen ten minste één nucleotidensequentie die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat.
Het genoom van RNA virussen, die voor hun replicatie afhankelijk zijn van een viraal RNA/RNA polymerase, bevat verschillende cis-elementen, d.w.z. elementen of functies die alleen functioneren voor het nucleïnezuur waardoor ze gecodeerd worden, zoals struktuurelementen van het nucleïnezuur. Behalve cis-elementen voor replicatie (waartoe in elk geval de bindingsplaats voor een RNA/RNA polymerase behoort) bevat het genoom van RNA virussen veelal ook cis-elementen voor transport (de bindingsplaats van transporteiwitten), cis-elementen voor verpakking van- het nucleïnezuur in faaghulzen tot viruspartikels, en cis-elementen voor translatie van boodschapper RNA in eiwit, in het bijzonder manteleiwit. Voorbeelden van transelementen van het genoom van RNA virussen zijn de genen, die coderen voor manteleiwit, transporteiwit en RNA/RNA polymerase.
Een essentieel element van de uitvinding is, dat de in het genoom van de gastheer ingebouwde expressie-cassette leidt tot transcriptie van de van RNA virus afgeleide sequentie onder vorming van een boodschapper RNA molekuul met een steelpan struktuur. Aan de elementen van de expressie-cassette, die deze transcriptie reguleren, zoals vooral de transcriptie promoter, worden geen hoge eisen gesteld. De promoter mag, en zal in veel gevallen zelfs bij voorkeur een relatief zwakke promoter zijn zodat de gastheer nagenoeg niet door deze transcriptie en de daarbij gevormde transcriptieprodukten wordt belast. Voor veel organismen zijn geschikte promoters bekend. Uiteraard dient de expressie-cassette ook nog een geschikte polyadenylatie site te omvatten, terwijl de expressie-cassette aan beide uiteinden geflankeerd wordt door zg. integratie sites, die integratie in het genoom van de beoogde gastheer mogelijk maken.
Uit verschillende experimenten is gebleken, dat voor een succesvolle expressie in de gastheer van de in het genoom ingebouwde genetische informatie de aanwezigheid noodzakelijk is van twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties die het daartussen gelegen DNA flankeren. Deze geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties kunnen bijvoorbeeld bestaan uit dG-dC baseparen resp. dC-dG baseparen. Het feit dat de aanwezigheid van geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties tot zowel replicatie als expressie in geïnfecteerde cellen van de gastheer leidt, wordt toegeschreven aan de vorming van RNA molekulen met een stabiliserende steelpan struktuur (zie van Emmelo et al, Virology 157, 1987, 480-487). Hiervoor is noodzakelijk, dat de geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties een lengte hebben van ten minste 12 baseparen. Bij voorkeur hebben de geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties echter een lengte van ten minste 15 baseparen. Geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties met een lengte van meer dan 250 baseparen zijn niet erg praktisch. Bij voorkeur zijn ze niet langer dan ongeveer 50 baseparen.
Wezenlijk is verder ook de afwezigheid van RNA/RNA polymerase (of replicase), resp. het daarvoor coderende gen, zodat de ten gevolge van transcriptie in de cellen van de gastheer aanwezige hoeveelheid RNA virus-specifiek boodschapper RNA niet verder wordt vermeerderd. Wanneer de in te bouwen, van RNA virus afgeleide sequentie afgeleid is van een satelliet-virus, zoals STNV, wordt automatisch aan deze eis voldaan omdat het STNV genoom geen RNA/RNA polymerase gen bevat (daarom is het satellietvirus voor zijn replicatie afhankelijk van het helper virus, dat het benodigde RNA/RNA polymerase levert).
Volgens de uitvinding is verder van groot belang, dat geen viraal manteleiwit wordt aangemaakt en dat de van RNA virus afgeleide nucleotidensequentie geen gen bevat, dat voor viraal manteleiwit codeert.
Ten slotte is volgens de uitvinding ook essentieel, dat het van RNA virus afgeleide boodschapper RNA ten minste die elementen bevat die bij aanwezigheid van RNA/RNA polymerase replicatie mogelijk maken. Met andere woorden, dienen ten minste cis-elementen voor replicatie aanwezig te zijn. Afhankelijk van het beoogde doel, kan het gewenst zijn dat ook andere elementen van het virale genoom aanwezig zijn. Zo heeft het vooral in het geval van bescherming van de gastheer tegen virus infecties de voorkeur, dat de in het genoom van de gastheer ingebouwde genetische informatie tevens cis-elementen voor transport omvat.
Daarentegen is volgens de uitvinding niet nodig, dat de van RNA virus afgeleide sequentie in de sense oriëntatie in het genoom is ingebouwd. Hetzelfde geldt voor de oriëntatie van andere, tussen de geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequen-ties gelegen sequenties, zoals een voor een ribozym coderende sequentie en een voor een soortvreemd eiwit/peptide coderende sequentie. Doordat volgens de uitvinding zowel een sense oriëntatie als een anti-sense oriëntatie kan worden gekozen, is het mogelijk om zowel een maximale veiligheid onder normale, infectie-vrije-omstandigheden als ook een adequate reactie bij infectie te realiseren.
De uitvinding verschaft derhalve op de eerste plaats een recombinant DNA, omvattende twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties met daartussen ten minste één nucleotidensequentie die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat.
Om gebruikt te kunnen worden moet het recombinant DNA volgens de uitvinding worden opgenomen in een expressie-cassette voor een te transformeren gastheer waardoor in de gastheer transcriptie kan plaatsvinden onder vorming van een RNA molekuul met een steelpan-struktuur.
Een recombinant DNA volgens de uitvinding, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie zowel cis-elementen voor replicatie als cis-elementen voor transport omvat, heeft de voorkeur.
De uitvinding strekt zich voorts uit over een dergelijk recombinant DNA, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie ook cis-elementen voor verpakking in manteleiwit omvat, en over een dergelijk recombinant DNA, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie tevens cis-elementen voor translatie omvat. In het geval van toepassingen, waarbij deze functies geen rol spelen, zijn ze echter bij voorkeur afwezig, omdat ze een nadelige invloed kunnen uitoefenen op de replicatie efficiency van het door transcriptie gevormde RNA. Dit geldt met name voor de toepassing van de uitvinding ten behoeve van virusprotectie. Dit is een van de redenen dat geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, aanwezig mag zijn. Evenzo zijn bij voorkeur geen andere onnodige trans-elementen aanwezig, zoals een gen, dat voor viraal transporteiwit codeert.
In de meest geprefereerde voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding stemt de van RNA virus afgeleide sequentie, aanwezig in het recombinante DNA, derhalve overeen met een uitgekleed viraal replicon, dat zonder hulp van buitenaf (zoals infectie met een helper virus) niet in staat is om zich te vermenigvuldigen en actief naar andere cellen van de gastheer te verplaatsen, en dat voor geen enkel viraal eiwit codeert. Een dergelijk, in hoge mate uitgekleed viraal replicon vertoont echter bij aanwezigheid van RNA/RNA polymerase een veel efficiëntere replicatie dan het volledige virale genoom. Hieraan is de bruikbaarheid van het recombinante DNA volgens de uitvinding voor de bescherming van de gastheer tegen virus infecties te danken. Wanneer namelijk een infectie van de genetisch gemodificeerde gastheer door een RNA virus met het desbetreffende RNA/RNA polymerase optreedt, zal het aantal van RNA virus afgeleide RNA molekulen, dat reeds in de cellen van de gastheer aanwezig is, zeer snel toenemen en daarbij in steeds sterkere mate beslag leggen op het RNA/RNA polymerase ten koste van de vermenigvuldiging van het infecterende virus. Het verregaand uitgeklede replicon heeft derhalve een belangrijk voordeel in de strijd om het beschikbare RNA/RNA polymerase boven het volledige virale genoom. Dit voordeel kan nog verder worden vergroot wanneer de in het genoom van de gastheer ingebouwde, van RNA virus afgeleide sequentie ook cis-elementen voor transport bevat, doordat dan tevens transport-eiwit van het infecterende virus, verantwoordelijk voor uitbreiding van de infectie naar andere cellen van de gastheer, in beslag wordt genomen door de snel in aantal toenemende, van RNA virus afgeleide RNA molekulen die afgeleid zijn van het ingebouwde DNA.
Een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding, die deze toepassing voor bescherming van de gastheer tegen virale infecties betreft, bestaat uit recombinant DNA, waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens ten minste één nucleotidensequentie bevindt, die voor een ribozym codeert, dat viraal RNA of mRNA kan knippen.
Wanneer in het geval van een virale infectie door een virus dat het desbetreffende RNA/RNA polymerase levert, verder aan te duiden als een compatibel virus, het in de cellen van de aangevallen gastheer aanwezige, van RNA virus afgeleide RNA snel wordt vermenigvuldigd, wordt in deze voorkeursuitvoeringsvorm tegelijkertijd ook de aanwezige hoeveelheid ribozym met specificiteit voor het infecterende virus vergroot. Dit ribozym zorgt voor een actieve vernietiging van het RNA van het infecterende virus, of van daarvan afgeleid boodschapper RNA.
Voor nadere informatie over de struktuur en werking van ribozymen wordt verwezen naar Nature 334, blz. 197, 1988.
Voor nadere informatie over de vorming en eigenschappen van sterk uitgeklede replicons wordt verwezen naar Perrault, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 93, 1981, 152-209; Lazzarini et al, Cell 26, 1981, 145-154; Nayak, Ann. Rev, Microbiol. 34, 1980, 619-644; Barrett en Dimmock, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 128, 1986, 55-84; 'RNA genetics', 1989, E. Domingo et al, Eds., CRC Press, Boca Raton, Florida; Strauss en Strauss, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 105, 1983, 1-89. Ze worden daarin aangeduid als ’defective interfering viruses/particles/RNAs'. Een in hoge mate uitgekleed replicon van een RNA virus kan bijvoorbeeld worden verkregen door een geschikte gastheer te infecteren met naakt viraal RNA, het gerepliceerde viraal RNA te isoleren en voor een volgende infectie te gebruiken. Aldus wordt de behoefte aan manteleiwit op een kunstmatige wijze uitgeschakeld, waardoor deletiemutanten ontstaan die geen manteleiwit gen meer bevatten. Door verdere herhalingen van deze procedure in tegenwoordigheid van telkens een kleine hoeveelheid toegevoegd RNA van deze manteleiwit-deletiemutant kan ook RNA worden geïsoleerd, dat geen RNA/RNA polymerase gen meer bevat (doordat het toegevoegde RNA voor het benodigde RNA/RNA polymerase zorgt ondergaan ook RNA/RNA polymerase-deletiemutanten replicatie). Ook andere bereidingswijzen zijn echter mogelijk, zoals een werkwijze waarbij cellen of weefsels met een zeer hoge dosis viruspartikels (100 of meer per cel) worden geïnfecteerd en RNA-deletiemutanten worden geïsoleerd; of een werkwijze waarbij cellen of weefsels met virus-stocks, die satellietvirussen of virusoïden bevatten, worden geïnfecteerd en RNA-deletiemutanten worden geïsoleerd; of een werkwijze waarbij een subgenoom wordt geïsoleerd van een RNA virus met een bipartiet of tripartiet (of, meer in het algemeen, polypartiet) genoom; of een werkwijze waarbij cellen of weefsels, die een passend RNA/RNA polymerase produceren, worden geïnfecteerd met eventueel reeds partiëel gedeleteerde virale RNAs en verder gedeleteerde RNAs worden geïsoleerd; of een werkwijze waarbij gerichte genetische manipulaties in het cDNA van een viraal, satelliet of virusoïde RNA worden uitgevoerd.
De uitvinding heeft belangrijke voordelen ten opzichte van de eerder voorgestelde methoden voor het beschermen van eukaryotische gastheerorganismen tegen virusinfecties, zoals de vorming van antisense viraal RNA om viraal boodschapper RNA te blokkeren (zie bijvoorbeeld Cuozzo et al, Biotechnology 6, 1988, 549-557), de vorming van viraal manteleiwit (zie het genoemde artikel van Cuozzo et al, en Hoekema et al, Biotechnology 7, 1989, 273-279), of de vorming van viraal satelliet RNA (zie EP-A-0242016). De uitvinding is aan minder beperkingen onderhevig dan de bekende virusprotectie methoden. De uitvinding is bijv. niet beperkt tot virussen, waarvan een satellietvirus bekend is, en is niet beperkt tot het inbouwen van 'sense' of 'antisense' DNA (het door transcriptie gevormde, van RNA virus afgeleide RNA kan zowel in de sense als in de antisense oriëntatie de transfuncties voor replicatie en eventueel transport van het infecterend virus in beslag nemen). De uitvinding biedt ook meer mogelijkheden voor het realiseren van een grotere effectiviteit, zoals de mogelijkheid om een of meerdere ribozym sequenties in te bouwen. De uitvinding combineert een zo gering mogelijke belasting van en een zo hoog mogelijke veiligheid voor de gastheer onder infectie-vrije omstandigheden met een, zodra een infectie door een compatibel virus optreedt, buitengewoon snelle en doeltreffende reactie die de gastheer uitsluitend op de plaatsen, waar dat nodig is, de vereiste bescherming tegen het virus biedt. De door de uitvinding geboden bescherming is van blijvende aard, omdat hij in het genoom van de gastheer is vastgelegd en dankzij zijn geringe belasting van de gastheer nagenoeg geen selectiedruk uitoefent. Doordat de uitvinding vrijwel geen extra belasting voor de gastheer betekent, d.w.z. de gastheer vrijwel geen energie hoeft te verbruiken (voor de transcriptie van het ingebrachte DNA is maar heel weinig energie vereist, terwijl in de voorkeursuitvoeringsvormen geen sprake is van translatie in eiwit), is een gelijktijdige protectie van de gastheer tegen meerdere verschillende virussen een reële mogelijkheid van de uitvinding. Volgens de uitvinding kunnen binnen de geïnverteerd gerepeteerde sequenties meerdere verschillende RNA virus-specifieke sequenties (d.w.z. uitgeklede replicons van verschillende RNA virussen), en/of meerdere verschillende ribozym sequenties (een ribozym sequentie die specifiek is voor een eerste virus, een ribozym sequentie die specifiek is voor een tweede virus, enz.) zijn opgenomen. Uiteraard kunnen echter deze meerdere verschillende RNA virus-specifieke sequenties en meerdere verschillende ribozym sequenties ook elk binnen twee eigen geïnverteerd gerepeteerde sequenties zijn opgenomen. Bij de bekende methoden van virus protectie is een dergelijke gelijktijdige bescherming tegen verschillende virussen niet goed mogelijk, omdat de grote hoeveelheden van bescherming gevende entities, die continu in de hele gastheer moeten worden geproduceerd om een effectieve bescherming te waarborgen, door hun belasting een selectief nadeel van de gastheer ten opzichte van zijn soortgenoten betekenen en/of schadelijk zijn voor zijn groei en ontwikkeling.
De bovengenoemde eigenschappen van het recombinante DNA volgens de uitvinding zijn eveneens verantwoordelijk voor de bruikbaarheid daarvan in het kader van werkwijzen voor het produceren van vreemde eiwitten/peptiden en RNAs met behulp van genetisch gemodificeerde, prokaryotische en vooral eukaryotische organismen. Het gaat daarbij om recombinant DNA volgens de uitvinding, waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere RNAs codeert, en meer in het bijzonder om recombinant-DNA volgens de uitvinding, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie en cis-elementen voor translatie omvat en zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere eiwitten/ peptiden codeert.
De eerder genoemde eigenschappen van het recombinante DNA volgens de uitvinding betekenen, dat de gastheer bij afwezigheid van RNA/RNA polymerase hooguit een verwaarloosbare hoeveelheid van de vreemde RNAs of eiwitten/peptiden produceert, terwijl bij aanwezigheid van RNA/RNA polymerase een sterke vermeerdering van het boodschapper RNA optreedt, die in een aanzienlijke produktie van de gewenste RNAs of eiwitten/peptiden resulteert. Deze zeer sterke produktie kan bovendien op een gewenst moment worden geïnduceerd, of tot bepaalde weefsels van de gastheer worden beperkt, door de aanwezigheid van het RNA/RNA polymerase op een overeenkomstige wijze te reguleren.
Een induceerbare produktie kan bijvoorbeeld worden gerealiseerd door de genetisch gemodificeerde gastheer (of gastheercellen in bijvoorbeeld een celkweek) op het gewenste moment met een compatibel virus te infecteren. Deze methode zal doorgaans echter niet de voorkeur hebben, omdat hij omslachtig is, de efficiency van de infectie zeer variabel kan zijn, de infectie meestal ten koste van de gastheer zal gaan (met als mogelijk gevolg een afbraak van het gewenste produkt) en/of aan het gebruik van het virus gevaren zijn verbonden. Een andere, aantrekkelijkere mogelijkheid, die ook gebruikt kan worden om een weefsel-specifieke produktie te realiseren, bestaat uit een dubbele transformatie van de gastheer, waarbij het genoom van de gastheer niet alleen van het bovenstaand beschreven recombinante DNA volgens de uitvinding wordt voorzien, maar tevens van recombinant DNA, omvattende genetische informatie voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct in een induceerbare of weefselspecifieke expressie-cassette. Hiervoor kan gebruik worden gemaakt van op zichzelf bekende, induceerbare (bijvoorbeeld door warmte, UV straling, of chemicaliën zoals salicylzuur) of weefselspecifieke (bijvoorbeeld patatin voor expressie in de knollen van aardappelen) promoters.
Met de woorden "genetische informatie voor een RNA/RNA polymerase construct" wordt gedoeld op genconstructies, waardoor al dan niet voor een ander RNA/RNA polymerase wordt gecodeerd. Een mogelijke genconstructie bestaat bijv. uit een mutatie, waardoor een intern facultatief stopcodon, dat in genen die voor RNA/RNA polymerasen coderen kan voorkomen, wordt vervangen door een niet meer als stopcodon herkenbare sequentie. Een andere mogelijkheid is een genconstructie, die uit een fusie bestaat van verschillende RNA/RNA polymerase genen, waarbij uiteraard ook weer de bovenvermelde mogelijkheid van een mutatie van een intern stopcodon kan worden toegepast.
De uitvinding wordt mede belichaamd in eukaryotische of prokaryotische cellen of organismen, welke door genetische manipulatie voorzien zijn van recombinant DNA volgens de uitvinding, en desgewenst door genetische manipulatie tevens voorzien zijn van recombinant DNA, omvattende genetische informatie voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct in een induceerbare of weefselspecifieke expressie-cassette.
Voorts wordt de uitvinding belichaamd in een werkwijze voor het beschermen van eukaryotisch organismen, zoals in het bijzonder planten, gisten en schimmels, tegen een RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, door een genetische manipulatie van het te beschermen organisme uit te voeren waarbij in het genoom van dit organisme recombinant DNA wordt ingebouwd dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties met daartussen een van RNA virus afgeleide nucleotidensequentie omvat, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie, maar geen gen, dat voor viraal RNA/RNA polymerase codeert, en geen gen, dat voor viraal manteleiwit codeert, omvat.
De voorkeur heeft een dergelijke werkwijze, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie zowel cis-elementen voor replicatie als cis-elementen voor transport omvat. De van RNA virus afgeleide sequentie kan verder tevens cis-elementen voor verpakking in manteleiwit en cis-elementen voor translatie omvatten.
De grootste voorkeur heeft een dergelijke werkwijze, waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleoti- densequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens ten minste één nucleotidensequentie bevindt, die voor een ribozym codeert, dat viraal RNA of mRNA kan knippen.
De uitvinding wordt verder belichaamd in een werkwijze voor het op een induceerbare wijze produceren van een of meerdere eiwitten/peptiden door een prokaryotisch of eukaryotisch organisme, of cellen van een prokaryotisch of eukaryotisch. organisme, welk organisme door genetische manipulatie is voorzien van recombinant DNA dat in een werkzame expressie-cassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties omvat met daartussen een nucleotidensequentie, die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste ciselementen voor replicatie en cis-elementen voor translatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat, en waarbij zich. tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere eiwitten/peptiden codeert, te kweken en met het virus te infecteren.
De voorkeur gaat echter uit naar een werkwijze voor het op een induceerbare wijze of op een weefsel-specifieke wijze produceren van een of meerdere eiwitten/peptiden door een eukaryotisch organisme te kweken, in het genoom waarvan door genetische manipulatie zowel recombinant DNA is ingebouwd dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties omvat met daartussen een nucleotidensequentie, die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie en ciselementen voor translatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat, en waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere eiwitten/peptiden codeert, als ook recombinant DNA is ingebouwd dat genetische informatie voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct in een induceerbare of weefselspecifieke expressie-cassette omvat.
De uitvinding wordt ook belichaamd in een werkwijze voor het op een induceerbare wijze produceren van een of meerdere RNAs, zoals ribozymen, antisense RNAs en dubbelstrengs RNAs, door een prokaryotisch of eukaryotisch organisme, of cellen van een prokaryotisch of eukaryotisch organisme, welk organisme door genetische manipulatie is voorzien van recombinant DNA dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties omvat met daartussen een nucleotidensequentie, die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat, en waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere RNAs codeert, te kweken en met het virus te infecteren.
De voorkeur heeft echter een werkwijze voor het op een induceerbare wijze of op een weefsel-specifieke wijze produceren van een of meerdere RNAs, zoals ribozymen, antisense RNAs en dubbelstrengs RNAs, door een eukaryotisch organisme te kweken, in het genoom waarvan door genetische manipulatie zowel recombinant DNA is ingebouwd dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties omvat met daartussen een nucleotidensequentie, die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis- elementen voor replicatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat, en waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere RNAs codeert, als ook recombinant DNA is ingebouwd dat genetische informatie voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct in een induceerbare of weefselspecifieke expressie-cassette omvat.
Aldus is de uitvinding in brede zin toepasbaar voor de produktie in eukaryoten of cellen van eukaryoten van een of meer produkten zoals eiwitten, oligo en polynucleotiden, oligo- en polypeptiden, enzymen, antilichamen, antigene stoffen, anti-virale verbindingen, anti-kankerstoffen, hormonen, vitaminen, geneesmiddelen en farmaca, primaire en secundaire metabolieten.
Een verder aspect van de uitvinding is recombinant DNA, omvattende een nucleotidensequentie die codeert voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct.
Meer in het bijzonder verschaft de uitvinding volgens een voorkeursuitvoeringsvorm een dergelijk recombinant DNA, omvattende het voor een viraal RNA/RNA polymerase coderende deel van de in fig.4 getoonde nucleotidensequentie, dan wel daarvan afgeleide constructen, zoals een substitutiemutant die op de plaatsen 656-658 volgens de in fig.4 gehanteerde nummering de sequentie TAT heeft i.p.v. de sequentie TAG, en substitutie-mutanten waarin een gedeelte van de in fig.4 getoonde sequentie vervangen is door een overeenkomstig gedeelte van een ander gen, dat voor een viraal RNA/RNA polymerase codeert.
Een dergelijk recombinant DNA, waarbij de nucleotidensequentie, die voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct codeert, gelegen is in een induceerbare of weefselspecifieke expressie-cassette, vormt weer een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding.
De uitvinding zal aan de hand van de hierna volgende voorbeelden nader worden toegelicht.
Voorbeeld I illustreert hoe tabaksplanten door transformatie met een van STNV afgeleid replicon tegen infectie door TNV kunnen worden beschermd. Het van STNV afgeleide replicon is een verregaand uitgekleed replicon, dat niet voor een eiwit codeert en onder infectie-vrije omstandigheden slechts in zeer beperkte mate wordt aangemaakt, d.w.z. er vindt slechts een zwakke transcriptie van het in het genoom ingebouwde DNA plaats. Wanneer de plant besmet wordt met TNV, dat codeert voor een RNA/RNA polymerase dat in staat is om het van STNV afgeleide replicon te vermenigvuldigen, vindt daarentegen een massale reproduktie van het van STNV afgeleide replicon plaats, ongeacht of de STNV informatie in sense dan wel anti-sense oriëntatie in het genoom is ingebouwd. Als gevolg wordt de plant tegen het infecterende virus beschermd. Deze bescherming is nog veel effectiever, wanneer het in het genoom ingebouwde DNA tevens de informatie bevat voor een ribozym, dat gericht is tegen mRNA voor TNV manteleiwit.
Voorbeeld II illustreert hoe de uitvinding gebruikt kan worden om een induceerbare produktie van een soortvreemd eiwit te realiseren. Als model is hiervoor het beta-glucuronidase gen van E. coli gekozen, dat gefuseerd is met het initiatiecodon van het STNV manteleiwit In het gegeven voorbeeld werd de expressie geïnduceerd door de getransformeerde tabaksplanten met TNV te infecteren.
Voorbeeld III beschrijft de isolatie van het replicase gen van TNV en de constructie van een plasmide pSPTNV rep-1, dat dit replicase gen bevat.
Voorbeeld IV beschrijft expressie experimenten waarbij amplificatie van het boodschapper RNA door contact met het TNV replicase plaats vond. Het virale replicon bevatte als vreemd DNA een fusie van een deel van het gen, dat voor het virale manteleiwit van STNV codeert, en het chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gen van E. coli.
Voorbeeld I
(a) Recombinante plasmiden
Uitgaande van het door van Emmelo et al in virology 157, 480-487 (1987) beschreven plasmide pSTNV-413, werden een aantal nieuwe insertiemutanten geconstrueerd. Het uitgangsplasmide werd gelineariseerd met Rsal, dat 9 knipplaatsen heeft in het STNV genoom, door 15 minuten te incuberen bij 28 °C met 0,1 ug enzym per ug DNA. Ligatie met dezelfde 14-meer linker als beschreven door van Emmelo et al: 5' TCCATGGGAATTCT 3' leidde o.a. tot de insertiemutant pBR STNV N162, die de linker met de Ncol site aan het 5' uiteinde bevat op positie 162 van het STNV genoom.
Uit deze insertiemutant en de reeds door van Emmelo et al beschreven insertiemutanten pBR STNV N198, N322 en E531, die alle de leesraam verstorende insertie van bovengenoemde 14-meer linker in het voor manteleiwit coderende gen bevatten, werden mutanten met een hersteld leesraam geconstrueerd. Daartoe werd de 14-meer insertie omgezet in een 18-meer insertie door knippen met Ncol. opvullen van de enkelstrengs-uiteinden met Klenow enzym in tegenwoordigheid van de 4 dNTP's, en religatie van het plasmide. Hierdoor wordt de 14-meer insertie omgezet in de volgende 18-meer insertie: 5' TCCATGCATGGGAATTCT 3', waarin de Ncol site (CCATGG) vervangen is door een Nsil site (ATGCAT). Aldus werden de insertiemutanten pBR STNV N164, N20G, N324 en E533 verkregen, die theoretisch coderen voor een manteleiwit, dat met 6 aminozuren is vergroot.
Verder werd de dubbele insertiemutant pBR STNV N164N843 geconstrueerd door uit pBR STNV N843 het EcoRV fragment van basen 198 tot 962 in het STNV genoom te isoleren en in de plaats te stellen van het overeenkomstige EcoRV fragment van pBR STNV N164 .
Uit de 18-meer insertiemutanten pBR STNV NI64 en N200 werden de mutanten pBR STNV S164 en S200 geconstrueerd door de insertie van een additionele linker van 18 basen als Nsil fragment in de Nsil site van de 18-meer insertie: in S164: 5' TCCATGCAATCGAGGGTAGGCATGCATGGGAATTCT 3r in S200: 5' TCCATGCATGCCTACCCTCGATTGCATGGGAATTCT 3’
Deze mutanten hebben een insertie van 36 basen en coderen theoretisch voor een korter manteleiwit als gevolg van een leesraam-mutatie in het geval van S164, resp. voor een manteleiwit met 12 extra aminozuren in het geval van S200.
Door dezelfde 18-meer in de unieke Nsil site aan het einde van het manteleiwit-gen (base 613) in te brengen werd de mutant pBR STNV S613 verkregen.
Ter hoogte van de Rsal site op positie 162 werd op een zelfde manier als hierboven beschreven voor de 14-meer linker, een linker van 30 basen ingebracht. In het leesraam, dat hierbij ontstaat, codeert deze linker voor het neuropeptide bradykinine: 5' GCGGCCGCCCGGGTTTAGTCCTTTTAGGTT 3'
ArgProProGlyPheSerProPheArg Deze insertiemutant werd pBR STNV Brad genoemd.
Uit pBR STNV NI64 werd door een deletie van het Nsil fragment van 167 tot 631 de deletiemutant pBR STNV Dl gemaakt. Het genoom van deze mutant heeft een lengte van 793 basen tegen 1239 voor wild type STNV.
Voor expressiestudies in E. coli werden de verschillende STNV-constructies als Pstl fragment overgekloneerd in pPLC 2820. Het restrictie—enzym Pstl knipt juist aan het einde van de poly GC gebieden die de 5' en 3' uiteinden van STNV flankeren. Deze constructies in pPLC2820 worden aangeduid als pPLC, gevolgd door de naam van de STNV mutant, verder gevolgd door .1 als het 5' uiteinde van het STNV genoom aansluit op de pL promoter van pPLC 2820, of door .2 als het 3' uiteinde op de promoter aansluit.
Het plasmide pPLC STNV N164.1 is dus het plasmide met de STNV mutant NI64 gekloneerd in pPLC 2820, waarbij de STNV mutant zodanig in het plasmide is ingevoegd, dat bij transcriptie door pL het equivalent van het positiefstrengs genomisch RNA van STNV als mRNA gemaakt wordt.
De als Pstl fragment in pPLC 2820 gekloneerde STNV mutanten worden aan het 5' uiteinde voorafgegaan door een unieke BamHl site en aan het 3' uiteinde gevolgd door een Sall site.
Aangezien noch STNV, noch de daarvan afgeleide mutanten een BamHI of een Sall site bevatten, kunnen de verschillende constructies als BamHI/Sall fragment overgekloneerd worden in pPCV 520 (figuur 1) achter de plantepromoter pTRl'. De aldus verkregen plasmiden worden aangeduid als pPCV, gevolgd door de naam van de STNV mutant, verder gevolgd door .1 als het 5' uiteinde, en door .2 als het 3' uiteinde van STNV naar de promoter pTRl* is gekeerd. De pPCV derivaten werden gebruikt voor transformaties van tabaksplanten als onderdeel van een binair vectorsysteem, zoals beschreven door Hoekema et al in EMBO Journal 3, 2485 (1984) en door de Framond et al in Mol.
Gen. Genet. 202, 125 (1986). De van pPCV 520 afgeleide plasmiden fungeerden als het T-plasmide (d.w.z. het plasmide, dat het T-DNA bevat, dat bij de transformatie in het genoom van de plant wordt geïntegreerd). De voornaamste eigenschappen van pPCV 520 (zie figuur 1) zijn: --- ColEl replicatie in E. coli, waardoor het in alle courante E. coli stammen kan worden gebruikt en een multicopy plasmide is (efficiënte DNA bereiding en kloon analyse) --- bacteriële resistenties tegen de antibiotica ampicilline en chlooramphenicol --- de P-type replicatieoorsprong van pRK2 is actief in E. coli en in Acrobacterium. op voorwaarde dat het RK2-gen trfa tot expressie komt (in Acrrobacterium is bovendien selectie nodig voor stabiliteit) --- de P-type transferoorsprong van pRK2 laat een efficiënte transfer toe van het plasmide uit stammen waarin de pRK2-genen tral, tra2 en tra3 tot expressie komen (dit is voor E. coli het geval voor de stam SM10 en voor Aarobacterium voor stammen die het plasmide pMP90RK bevatten) --- de grenssequenties van het T-DNA flankeren alle elementen van de vector die in planten belangrijk zijn --- het NPT-II kanamycine resistentie gen onder controle van de plantepromoter pTR2' laat selectie van getransformeerde planten toe --- het octopine synthase gen in het T-DNA maakt het mogelijk om de transformatie van kanamycine-resistente planten te bevestigen aan de hand van octopine synthese --- de constitutieve plantepromoters pTRl' en pnos worden resp.
gevolgd door de unieke restrictie sites voor Sall en BamHl en voor ΒσΙΙΙ en Bell, en door de polyadenylatiesequenties van de T-DNA genen 7 en 4 --- terugkloneren van T-DNA sequenties uit getransformeerde planten wordt vereenvoudigd door de pBR322 oriV en ampicilline resistentie in het T-DNA.
Het T-plasmide pPCV 520 kan dus zowel in E. coli als in Aarobacter-ium repliceren. De kloneringsstappen voor het in deze vector introduceren van de STNV mutanten kunnen in E. coli plaats vinden. Daarna wordt de vector door conjugatie uit E. coli SM10 overgebracht in de Acrrobacterium stam GV3100(pMP90RK), waarmee de plantentransformaties worden uitgevoerd. Het plasmide pMP90RK (figuur 2; zie Koncz en Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 1986, 383-396) fungeert als virulentie plasmide. Het is afgeleid van het nopaline Ti-plasmide pGV3100 door (1) een gecombineerde deletie- en insertiemutagenese, leidende tot een volledige deletie van het T-DNA en tot de inbouw van een gentamycine resistentie gen (de aldus verkregen constructie wordt aangeduid als pMP90), en (2) de insertie van een fragment van het P-type plasmide pRK2013 met daarop de genen voor kanamycine resistentie, de in trans werkende genen voor transfer en replicatie van P-type plasmiden en de P-type oorsprong van transfer (Figurski en Helinski, PNAS USA 76, 1648 (1979)). De belangrijkste eigenschappen van dit plasmide pMP90RK (zie figuur 2) zijn: :---een stabiele replicatie alleen in Aarobacterium --- compatibiliteit met P-type plasmiden --- het codeert voor alle Ti-virulentiefuncties die nodig en voldoende zijn voor de integratie van het T-DNA in het genoom van planten bij transformatie --- het bevat gentamycine en kanamycine resistentie genen als gemakkelijk te selecteren genetische merkers --- het complementeert transfer en replicatie van P-type mutanten door de expressie van de pRK2-genen tral, tra2 en tra3 en trfa --- het conjugeert zeer efficiënt dankzij de P-type oriT.
(b) Technieken
De transformatie van planten (tabak SRI) geschiedde volgens de bladschijfmethode, beschreven door de Block et al in EMBO Journal 3, 1681 (1984) en door Horsch et al in Science 223, 496 (1984). De procedure was als volgt: --- door insnijdingen met een scalpel worden tabaksbladeren verwond en de vers verwonde bladeren worden gedurende 48 uur geïncubeerd met een 1/50 verdunning van een verse volgroeide cultuur van de transformerende Agrobacteria. Dit gebeurt in vloeibaar MS-plantenmedium (Murashige en Skoog medium, Gibco) --- daarna worden de bladfragmenten 2 keer gedurende 12 uur gewassen in vloeibaar MS-medium waaraan claforan (500 ug/ml) is toegevoegd (claforan is een antibioticum dat alleen tegen bacteriën werkt) --- vervolgens worden de bladfragmenten geïncubeerd op vast MS- medium (+ 0,8 % agar) waaraan cytokinine (6-benzyl-aminopurine of BAP, 1 mg/1) en auxine (α-naftaleenazijnzuur of NAA, 0,1 mg/1) zijn toegevoegd in een verhouding die scheutvorming ter hoogte van de wondvlakken stimuleert, kanamycine (100 ug/ml) voor de selectie van getransformeerde scheuten en claforan voor de verdere selectie tegen de transformerende Aarobacteria --- na 4 tot 10 weken groeien dan getransformeerde scheuten uit op dit medium die, wanneer ze voldoende ontwikkeld zijn, overgezet kunnen worden op hormoonvrij medium waarop ze zich tot normale planten met wortels kunnen ontwikkelen.
Callusinductie werd uitgevoerd aan steriele blad- en stengelfragmenten. Daartoe werden de fragmenten geïncubeerd op vast MS-medium (+ 0,8 % agar) waaraan het cytokinine BAP (0,5 mg/1) en het auxine NAA (1,0 mg/1) zijn toegevoegd in een concentratie en verhouding die callusgroei stimuleert.
Voor octopinetesten werden kleine stukjes planteweefsel (ongeveer 50 mg) overnacht geïncubeerd in een oplossing van 100 mM L-arginine en 50 mM pyruvaat opgelost in vloeibaar MS-medium. Na incubatie werd de vloeistof verwijderd en werd het weefsel gewassen in MS-medium. Daarna werd het plantefragment verbrijzeld en afgecentrifugeerd, en werden 3 tot 5 ul van het extract door papierelectroforese gescheiden. Dit vond plaats op Wattman 3MM papier, in een oplossing van 15 % HAc, 5 % HCOOH en 80 % H2O. Octopine spots op het papier werden onder UV belichting zichtbaar gemaakt na een kleurreactie met een vers mengsel van 1 deel 0,02 % phenanthrequinone in 95 % EtOH en 1 deel 10 % NaOH in 60 % EtOH.
Plasmide-infecties van cowpea werden uitgevoerd om de infectiviteit van de STNV mutanten te onderzoeken. Daartoe werd cowpea geïnoculeerd met een mengsel van TNV helpervirus en chimere plasmiden volgens de door van Emmelo beschreven methode.
Northern analyses werden in essentie op de door van Emmelo beschreven wijze uitgevoerd. Voor de analyses van de getransformeerde planten werden enkel- en dubbelstrengs RNA niet door LiCl-precipitatie gescheiden voor gelelectroforese. Naast denaturerende glyoxal agarose gels werden ook denaturerende formamide agarose gels gebruikt, zoals beschreven door Lechrach et al in-Biochemistry 16, 4743 (1977) en door Maniatis et al in Molecular Cloning: a laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., USA. Bij deze methode worden de RNA monsters eerst gedurende 15 minuten gedenatureerd bij 55 °C in een mengsel van 50 % formamide, 17,5 % formaldehyde, 20 mM morfolinopropaansulfonzuur (MOPS) (pH 7,0), 5 mM NaAc en 1 mM EDTA (pH 8,0). Gelelectroforese gebeurde in een 1,2 % agarose gel in 20 mM MOPS (pH 7,0), 5 mM NaAc en 1 mM EDTA (pH 8,0) als loopbuffer. De verdere behandeling van de monsters voor blotting en hybridisatie geschiedde op de door van Emmelo beschreven wijze.
Western analyses voor het detecteren van TNV en STNV manteleiwit werden als volgt uitgevoerd. Geïnfecteerde bladeren werden na twee dagen geoogst en met behulp van een potter bij 4 °C gemalen in 1 volumehoeveelheid PBS (PBS= 0,13 M NaCl, 10 mM natriumfosfaat buffer pH 7,4) die 100 ug/ml PMSF bevatte.
Celrestanten werden door centrifugeren verwijderd en de eiwitten werden met trichloorazijnzuur (TCA, eindconcentratie 10 %) neergeslagen. Het neerslag werd gewassen in ethanol, ethanol-ether (1:1) en ether, gedroogd en opnieuw gesuspendeerd in lx Laemmli-buffer (Nature 227, 680-685, 1970) . Fracties daarvan werden door electroforese op een 10 % PAG gescheiden en via electrotransfer gedurende anderhalf uur bij 0,5 A overgebracht op Pall-biodyne filter in een transfer buffer (1 mM natrium-acetaat, 5 mM MOPS pH 7,5 in 20 % ethanol) . Het filter werd gedurende een nacht geblokkeerd in PBS dat 10 % magere melkpoeder bevatte en geïncubeerd met anti-STNV manteleiwit serum van konijnen, verdund 1:200 in PBS, 2 % magere melkpoeder gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Het filter werd vier keer gewassen met PBS, 0,1 % Triton-X-100 en geïncubeerd met anti-konijn alkalisch fosfatase gelabelde antilichamen uit geiten, verdund 1:250 in PBS, 2 % magere melkpoeder. Na wegwassen van niet gebonden antilichamen werd een kleurreactie uitgevoerd onder toepassing van Nitro Blue Tetrazolium (NBT) en 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat (BCIP), waarbij de condities van de producent (Promega Biotec) werden aangehouden.
(c) Experimenten en de resultaten daarvan (cl) expressiestudies ir. E. coli NF1
Een aantal pPLC STNV plasmiden met het gemodificeerde STNV genoom in de sense oriëntatie (de .1 constructies) alsmede de plasmiden pPLC STNV NI64.2 en Brad.2 (met de antisense oriëntatie) werden in E. coli NF1 getransformeerd. Deze stam bezit een ts (temperatuurgevoelige) mutatie van het cl repressor gen van pL, waardoor de pL promoter gerepresseerd wordt wanneer de bacteriën bij 28 °C worden gegroeid. Bij een temperatuur van 42 °C is de repressor instabiel en geeft de promoter pL transcriptie.
Met behulp van Western blotting werd de synthese van manteleiwit onderzocht, d.w.z. de aan- of afwezigheid van manteleiwit alsmede het verschil in grootte van de door de verschillende STNV mutanten gecodeerde eiwitten. De resultaten zijn samengevat in Tabel 1. Daaruit blijkt, dat --- de STNV mutanten met een leesraam mutatie (+14 of +36 basen) een verkort manteleiwit geven waarvan de lengte groter is naarmate de insertie verder naar het 3' uiteinde ligt --- de insertie mutanten met. een hersteld leesraam (+18, +30 of +36 basen) een groter manteleiwit geven dan het wild type, terwijl de onderlinge mobiliteit (+18 > +30 > +36) overeenkomt met het hogere molekuulgewicht, dat verwacht wordt op grond van het aantal toegevoegde aminozuren (+6, +10 en +12) --- alleen de plasmiden, waarbij het gemodificeerde STNV in de .1 oriëntatie ten opzichte van de promoter is ingevoegd, manteleiwit geven.
(c2) plasmide infecties
Voor de plasmide infecties werden, tenzij anders is aangegeven, pBR STNV plasmiden gebruikt. Het plasmide pSTNV 413 werd bij de infecties als positieve controle gebruikt om de verschillende experimenten te kunnen correleren. Als negatieve controle werd pBR STNV N843 toegepast, die reeds eerder als replicatie-deficiënt was vastgesteld. Wanneer de signalen na de primaire infectie zeer zwak of afwezig waren, werden op cowpea secundaire infecties met RNA-extracten uitgevoerd om duidelijker RNA en eiwit signalen te verkrijgen.
Bij de analyse van het geïnoculeerde bladmateriaal werden de synthese van manteleiwit door Western blotting en die van RNA door Northern blotting bepaald. Voor het RNA werden enkel- en dubbelstrengs RNA gescheiden en de aanwezigheid ervan afzonderlijk bepaald. De resultaten zijn eveneens in Tabel 1 samengevat. Daaruit blijkt, dat --- dsRNA (dubbelstrengs RNA) aanwezig is bij alle mutanten met een insertie in het manteleiwitgen en alleen ontbreekt bij de mutanten met een insertie op positie 843 --- manteleiwit en normale hoeveelheden ssRNA (enkelstrengs RNA) alleen gevonden worden bij de mutanten N164, N200 en Brad --- bij de insertie mutanten waarbij geen manteleiwit wordt gevonden, de planten ook veel minder ssRNA bevatten ---de lengte van het manteleiwit dat voor de mutanten NI64, N200 en Brad in de planten en in E. coli NF1 gemaakt wordt, gelijk is.
Door hybridisatie met een strengspecifieke probe (met een SP 6 RNA transcript van STNV of met de geschikte enkelstrengs linker voor de verschillende mutanten) werd vastgesteld dat het bij de verschillende infecties geïsoleerde ssRNA positiefstrengs is en derhalve overeenkomt met het genomisch RNA (ook wanneer geen manteleiwit, geen partikels en slechts kleine hoeveelheden ssRNA aanwezig zijn).
Naast de verschillende pBR STNV plasmiden werden voor de mutanten NI64.1, NI64.2, Brad.l en Brad.2 ook de pPLC en pPCV plasmiden voor plasmide infecties gebruikt, met gelijke resultaten.
(c3) expressie van STNV mutanten in getransformeerde planten
Transformaties van tabak SRI werden uitgevoerd met de volgende T-plasmiden: pPCV 520 pPCV STNV NI64.1 en .2 pPCV STNV N164N843.1 en .2 pPCV STNV Brad.l en .2
Transformatie met pPCV 520 werd uitgevoerd als controle op het transformatie experiment zelf. Door het gebruik van de infectieve STNV mutant N164 met een linker insertie in het manteleiwitgen kan bij de analyse van de resultaten zowel het manteleiwit (+6 aminozuren) van de mutant als het RNA (door hybridisatie met de specifieke linker) van het wild type worden onderscheiden.-De mutant N164N843 werd gekozen als replicatie-deficiënt genoom. Bij deze mutant wordt de insertie N164 gebruikt om het manteleiwit te kunnen identificeren en te onderscheiden van het wild type, terwijl de twee ingebrachte linkers identificatie van het RNA mogelijk maken. De mutant STNV Brad werd gebruikt voor transformatie om vast te stellen of de expressie van het fusie-eiwit tussen het STNV manteleiwit en het bradykinine geamplificeerd wordt door een infectie van de transformanten met het helpervirus TNV. De getransformeerde planten worden aangeduid met SRI, gevolgd door de identificatie van de STNV mutant en verder gevolgd door een nummer waarmee de onafhankelijke transformanten met dezelfde mutant geïdentificeerd worden.
De kanamycine resistente planten die na transfer op hormoonvrij medium met kanamycine normaal wortels ontwikkelden, werden vermeerderd voor verder onderzoek. Van deze planten werden ook callusculturen aangelegd om de transformatie van de kanamycine resistente planten te kunnen bevestigen door octopine tests. Het octopine synthase gen in het T-DNA van pPCV 520 staat namelijk onder controle van een weefselspecifieke promoter van T-DNA gen5, die alleen in stengelfragmenten (erg zwak) en in callusweefsel tot expressie komt, zodat de octopine tests bij voorkeur op callusweefsel worden uitgevoerd. Meer dan 90 % van de kanamycine resistente planten bleek inderdaad getransformeerd te zijn.
Getransformeerde planten werden onder steriele groei-condities verkregen. Voor TNV infectie werden kleine topscheuten eerst in vitro beworteld en daarna overgezet in potgrond om onder serre condities verder gekweekt te worden. De planten werden verder opgegroeid en, wanneer ze voldoende groot waren, geïnfecteerd met TNV. De mechanische infectie geschiedde met een vers TNV-inoculum, geïsoleerd uit tabak SRI. Na 72 uur werden de geïnfecteerde bladeren geoogst, ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -70 °C. Naast de met TNV geïnfecteerde bladeren werden ook niet-geïnfecteerde bladeren van dezelfde planten geoogst en geanalyseerd.
De aanwezigheid van STNV RNA en manteleiwit in de verschillende monsters werden resp. bepaald door Northern en Western blotting, waarvan de resultaten in Tabel 2 zijn samengevat. Uit de tabel blijkt, dat
--- TNV infectie van planten, die getransformeerd zijn met STNV
onder controle van een constitutieve plantepromoter en geflankeerd door geïnverteerde poly-GC-gebieden, leidt tot de replicatie en expressie van het STNV genoom en tot de vorming van STNV partikels --- de als replicatie-deficiënt gekarakteriseerde insertiemutant N164N843 normaal in getransformeerde planten repliceert --- de STNV constructie met een fusie tussen het manteleiwit en het bradykinine na infectie met TNV replicatie van het mRNA en geamplificeerde synthese van het fusie-eiwit geeft --- het gedetecteerde STNV RNA volgens de hybridisaties met de verschillende linkers overeenkomt met het mutante genoom waarmee de planten waren getransformeerd --- de planten met het STNV genoom in de .2 oriëntatie, die dus het anti-sense mRNA aanmaken, na infectie met TNV eveneens STNV replicatie en expressie geven, zonder waarneembare verschillen met de .1 planten --- de verschillen in de sterkte van de RNA en eiwit signalen niet gecorreleerd zijn met het type of de oriëntatie van de mutante STNV genomen, maar typisch zijn voor het individuele karakter van onafhankelijke transformanten met hetzelfde genoom.
Doordat slechts 10 mg plantenmateriaal werd gebruikt voor de bepalingen, kon in de getransformeerde planten zonder TNV infectie noch RNA, noch manteleiwit worden gedetecteerd.
Bij herhaling van de experimenten werden telkens kwalitatief en kwantitatief dezelfde resultaten verkregen. Significante variaties werden alleen voor de efficiency van de TNV infectie waargenomen, in afhankelijkheid van diverse factoren zoals de ouderdom en het differentiatieniveau van de geïnfecteerde planten, de kwaliteit van het inoculum, de temperatuur, de vochtigheid, enz. Wanneer de TNV infectie onvoldoende sterk was, werden alleen zwakke RNA signalen en geen eiwit signalen-verkregen. Bij een goede TNV infectie werden daarentegen veel sterkere STNV signalen verkregen dan in het geval van de plasmide infecties. Op basis van de intensiteit van de bij Western analyse verkregen signalen kon de hoeveelheid manteleiwit worden geschat op ongeveer 100 ng in een uit 10 mg bladmateriaal bereid monster. Rekening houdende met de beperking van de synthese van het STNV manteleiwit tot het gebied van de necrotische lesies waar ook TNV aanwezig is, welke lesies slechts ongeveer 5 % van het totale blad uitmaken, kan hieruit worden berekend dat het STNV signaal ongeveer 0,02 % van het totale, natte bladgewicht of ongeveer 0,5 % van het drooggewicht uitmaakt. Deze relatief grote hoeveelheid eiwit wordt in slechts 3 dagen gevormd, nadat expressie door TNV infectie is geïnduceerd.
Uit de resultaten met de STNV NI64 en Brad mutanten blijkt, dat de 18-meer insertie en de fusie met bradykinine geen invloed op de repliceerbaarheid en de expressie van het STNV-RNA hebben. Dit bewijst dat het manteleiwit geheel of gedeeltelijk kan worden vervangen zonder nadelige gevolgen voor repliceerbaarheid en expressie van het STNV-RNA. Zie ook het hierna volgende voorbeeld 2.
Geheel onverwacht bleek dat de mutant N164N843, anders dan in het geval van de plasmide infecties, in getransformeerde planten normaal repliceerde (door linker hybridisatie werd bewezen dat de 14-meer insertie op positie N843 inderdaad aanwezig was in het gedetecteerde en gerepliceerde RNA). De afwezigheid van ssRNA en dsRNA bij plasmide infecties met STNV N843 is dus kennelijk niet het gevolg van een deficiënte replicatie. Verder is gebleken dat replicatie van het STNV-RNA niet afhankelijk is van de aan- of afwezigheid van STNV mante-'.-.eiwit of STNV partikels. Aangezien bij deze mutanten de spreiding van STNV infectie van cel tot cel normaal plaats vindt, kan hiervoor alleen het virale RNA (ds of ss) verantwoordelijk zijn. Het verschillend gedrag van de mutant N843 bij plasmide infecties en in getransformeerde planten kan echter worden verklaard door aan te nemen dat deze mutatie de normale cel tot cel verspreiding van de STNV infectie door RNA verhindert. Bij plasmide infecties is deze mutant niet infectief. In getransformeerde planten komt het STNV-mRNA echter in alle cellen voor en is verspreiding niet nodig om normale replicatie te krijgen. Het STNV-RNA bezit derhalve naast structurele elementen voor replicatie ook structurele elementen die nodig zijn voor cel tot cel transport. Waarschijnlijk zal daarbij een TNV-gecodeerd eiwit een actieve rol spelen.
In de transformanten waar STNV in de .2 oriëntatie ten opzichte van de plantepromoter is ingevoegd, wordt het anti-sense of negatiefstrengs RNA als boodschapper RNA gevormd. Eerdere pogingen om met behulp van SP6-transcripten een STNV infectie te initiëren met het negatiefstrengs RNA waren mislukt. In getransformeerde planten blijkt dit na inductie wel te gaan, en wel even efficiënt als met de STNV .1-transformanten. Het is derhalve mogelijk om de expressie van een gen gedurende de gehele groeifase van de plant volledig te onderdrukken doordat alleen het anti-sense boodschapper RNA van een eiwit wordt geproduceerd, en om expressie te beperken tot de periode dat de helper functies voor replicatie aanwezig zijn, waarbij in een korte tijd door replicatie en amplificatie van het anti-sense tot coderend sense-RNA een sterke expressie kan worden verkregen. Vooral voor de synthese van toxische produkten kan het van groot belang zijn om de expressie daarvan gedurende de groeiperiode volledig te onderdrukken om een negatieve invloed op de ontwikkeling van de planten te vermijden.
(c4) In vivo deleties
Bij plasmide infecties met STNV, wild type en mutanten, werden vaak secundaire infecties uitgevoerd om bij de analyse van de mutanten duidelijker signalen voor RNA en eiwit te krijgen. Deze infecties gebeurden met totaal RNA (ds en ss) uit deze planten, waarbij zowel de STNV als de TNV infectie werden overgedragen. Door aldus dezelfde infectie drie tot vier maal na elkaar voort te zetten konden deletiemutanten van het STNV worden geïsoleerd. Bij Northern blotting was het RNA van deze mutanten zichtbaar als duidelijke, sneller migrerende discrete banden. In verschillende infectielijnen ontstonden onafhankelijk van elkaar verschillende mutanten, waarbij de lengte van het replicerende RNA variëerde van ongeveer 600 tot 900 basen. Wanneer in een infectielijn dergelijke deletiemutanten van STNV ontstonden, bleek het oorspronkelijke wild type genoom na 1 of 2 verdere infecties te verdwijnen. Ook konden bij bestaande en vrij grote deletiemutanten bijkomende deleties leiden tot de vorming van kleinere derivaten. Bij voortzetting van een dergelijke infectielijn verdween dan de grotere mutant. Algemeen werd vastgesteld, dat bij voldoende herhaling van deze infecties STNV deletiemutanten ontstonden met een genoom van ongeveer 600 basen. Door Western blotting werd aangetoond, dat de STNV deletiemutanten niet meer coderen voor het manteleiwit. Door hybridisaties met verschillende fragmenten van het STNV genoom werd bepaald dat de deletie aan het 5* uiteinde van het genoom ligt.
Elementen die een rol lijken te spelen bij het ontstaan van deze deletiemutanten zijn: --- het ontbreken van een manteleiwit waardoor de mutanten niet meer ingekapseld worden en al het positiefstrengs RNA in de geïnfecteerde cellen beschikbaar blijft voor replicatie en eventueel voor verspreiding van de infectie --- aangezien grotere deleties (zonder manteleiwitgen) verder evolueren naar nog kleinere genomen, kan worden aangenomen dat de mutanten sneller repliceren en een meer efficiënte infectie doormaken naarmate ze kleiner zijn (bij de deletiemutanten wordt in de planten steeds meer STNV-RNA aangetroffen dan bij het wild type, en de hoeveelheid stijgt naarmate de mutanten kleiner worden).
De belangrijkste waarneming bij het optreden van deze deletiemutanten is echter hun sterke interferentie met het TNV helpervirus. Wanneer in een RNA infectielijn STNV deletiemutanten ontstaan, neemt de hoeveelheid TNV zeer sterk af. Deze afname is na 1 of 2 verdere infecties zo sterk, dat zonder toevoeging van vers TNV of TNV-RNA aan het RNA-inoculum geen nieuwe infecties meer uitgevoerd kunnen worden. De STNV mutanten die hier door de onnatuurlijke RNA-inoculaties ontstaan, blijken derhalve een zeer efficiënte onderdrukking van de TNV infectie te geven.
De in vitro geconstrueerde deletiemutant STNV Dl werd ter vergelijking door plasmide infectie op cowpea geïnfecteerd. Wanneer deze mutant overeenkomstig de in vivo deleties door RNA inoculatie werd gepropageerd, bleek zijn replicatie efficiënter dan van de oorspronkelijke N164 mutant. Evenals de mutanten die in vivo ontstaan, onderdrukt STNV Dl de TNV replicatie. Dit komt tot uiting in een geringe infectiviteit van een RNA inoculum uit deze planten.
De in vitro geconstrueerde deletiemutant STNV Dl werd ook naar tabak SRI getransformeerd om te onderzoeken of de invloed op TNV replicatie tot bescherming van de getransformeerde planten tegen TNV infectie zou leiden. Om het effect van de expressie van het RNA van de STNV deletiemutant op de ontwikkeling en het verloop van de infectie met TNV te bepalen, werden ter vergelijking de volgende planten onder zoveel mogelijk gelijke omstandigheden gegroeid, geïnfecteerd en verder geobserveerd:
---SRI
--- SRI STNV N164N843.1/1 en /2, met resp. sterke en zwakke expressie van STNV --- SRI STNV Dl.1/1
Bij elk van deze planten werden 4 bladeren geïnfecteerd die een gelijkaardige ontwikkeling en differentiatie hadden.
Voor de infectie werden een vers inoculum, bereid uit TNV-geïnfecteerde cowpea, en een ingevroren inoculum uit geïnfecteerde tabak gebruikt, beide 1/1 (resp. inoculum 1 en 3 genoemd) en 1/10 (inoculums 2 en 4) verdund. Met elk van de 4 inoculums werden 2 halve bladeren op gelijksoortige plaatsen bij de verschillende planten geïnfecteerd; deze bladeren werden van onder naar boven a tot en met d genoemd. Op deze manier ontstonden de volgende combinaties: al en a2, b3 en b4, c2 en c4, en dl en d3.
Na 72, -96 en 170 uur werd de ontwikkeling van de infectie geobserveerd en fotografisch vastgelegd. Na 96 uur werden eveneens deeltjes van elk blad genomen en onder ÜV belichting gefotografeerd om de hypersensitiviteitsrespons van de planten te onderzoeken. Na 96 uur werd het halve blad van elke plant met de best ontwikkelde lesies (b3) geoogst. Een deel hiervan werd ingevroren en bewaard voor verdere analyse op RNA en eiwit samenstelling. Het andere deel werd gebruikt voor de bereiding van een inoculum om cowpea bladeren te infecteren.
Voor elk van de tabaksplanten werden 4 cowpea bladeren geïnfecteerd: --- met een extract uit één enkele lesie (1 blad) --- met een extract uit 200 mg bladweefsel (2 bladeren) --- met een 1/5 verdunning hiervan (1 blad)
Uit de foto's (niet getoond) bleek dat er een groot verschil optrad in de ontwikkeling van de TNV infectie bij de verschillende tabaksplanten. De belangrijkste verschillen waren: --- het aantal lesies op de verschillende bladeren verschilde volgens het gebruikte inoculum (3 > 4 > 1 > 2), met een gering onderscheid tussen de planten (SRI > SRI N164N843.1/1 en /2 > SRI Dl.1/1) --- de lesies bij SRI Dl.1/1 zijn duidelijk kleiner dan bij de andere planten; het grootste verschil is er met tabak SRI en N164N843.1/1, terwijl N164N843.1/2 tussen beide in ligt. De grootteverschillen van de lesies op 1 plant afhankelijk van het blad (a > b > c > d) zijn normaal en hangen samen met het ontwikkelingsniveau van de bladeren --- vooral na 170 uur is het duidelijk dat vrij grote delen van de geïnfecteerde bladeren van SRI en SRI N164N843.1/1 volledig necrotiseren, terwijl de overeenkomstige bladeren van Dl/1 weliswaar lesies vertonen maar verder normaal groen blijven --- bij UV belichting worden fluorescerende ringen en vlekken zichtbaar die een gevolg zijn van de hypersensitiviteitsreactie van de plant. Hierdoor worden aangetaste delen van de plant door een ring van weefsel afgesloten, leidende tot het afsterven van deze delen. Voor SRI Dl.1/1 zijn deze veel kleiner dan voor de andere planten: Dit wijst op een minder vergaande aantasting van het blad.
Na 96 uur werd van elke plant een deel van het halve blad b3 gebruikt om een inoculum te bereiden, waarmee dan cowpea bladeren werden geïnfecteerd. Na 72 uur waren er zeer duidelijke verschillen in het niveau van infectie van de cowpea bladeren te zien. De plant, die geïnfecteerd was met de uit de deletieplant bereide inoculums, gaf lesies maar elk van de bladeren was nog groen. De andere planten hadden na 72 uur veel verder gevorderde necrotisering en verschillende van de bladeren waren zo ver aangetast dat ze reeds volledig verdroogd waren en er bijna afvielen.
Om de hoeveelheid TNV-RNA in de verschillende planten te vergelijken werd getracht om de aanwezigheid van TNV ds en ssRNA aan te tonen in EtBr-gekleurde agarose gels. De hoeveelheid TNV-manteleiwit werd door Western blotting bepaald. Gevonden werd, dat de hoeveelheid TNV-RNA in SRI Dl.1/1 minder was dan bij de andere planten. De hoeveelheid manteleiwit was in SRI Dl.1/1 ongeveer 20 keer lager dan in tabak SRI, terwijl de hoeveelheid in SRI N164N843.1/1 en /2 tussen beide in lag. Ook de secundair geïnfecteerde cowpea bladeren werden onderzocht op de aanwezigheid van TNV-RNA en dit gaf hetzelfde beeld als bij de tabaksplanten.
De aanwezigheid van RNA van STNV deletiemutanten leidt er bij massale infectie van de plant of delen daarvan toe, dat geen, minder of pas later volledige necrotisering en verlies van de aangetaste delen optreedt. In aangetaste maar beschermde planten wordt veel minder TNV geproduceerd, wat remmend werkt op de verspreiding van de infectie naar andere planten. Het gehele beschermende effect wordt gerealiseerd met de synthese van een verwaarloosbare hoeveelheid RNA. Pas wanneer inderdaad infectie optreedt, worden door de viraal gecodeerde replicatiefuncties hoge en beschermend werkende concentraties deletie-RNA gemaakt. Dit geschiedt bovendien alleen in de geïnfecteerde cellen, waardoor de energiebelasting voor de plant verwaarloosbaar is.
Voorbeeld II
In de hierin beschreven experimenten werd gebruik gemaakt van het glucuronidase gen van E. coli, omdat het enzym glucuronidase zijn activiteit behoudt als fusie-eiwit, geen plantaardige glucuronidase activiteit bekend is en de enzym-activiteit op een kwantitatieve en zeer gevoelige wijze kan worden gedetecteerd. Het in de verschillende constructies gebruikte glucuronidase (GUS) gen (uidA) werd als Pstl-EcoRI
fragment geïsoleerd uit het plasmide pRAJ255, beschreven door
Jefferson et al in PNAS 83, 8447-8451 (1986). Om het GUS gen op
de gewenste positie en in het juiste leesraam in het STNV-cDNA
te kunnen.invoegen, werden de volgende aanpassingen uitgevoerd: --- door substitutie van het 1549 bp Scal-Ndel fragment van het plasmide pPLC 321 door het overeenkomstige fragment van plasmide pPLC 2820 (hetgeen leidt tot verwijdering van de PstI site in het ampicilline gen) werd het plasmide pPLC 322 geconstrueerd --- door insertie in de unieke Ncol site van pPLC 322 van een synthetische linker met de structuur:
CATGGCTAGCAGCTGCAGGAATTCATGCATC
CGATCGTCGACGTCCTTAAGTACGTAGGTAC
werd het plasmide pPLC 323 verkregen --- door het GUS gen bevattende Pstl-EcoRI fragment van pRAJ255 in pPLC 323 te kloneren werd het plasmide pPLC GUS1 verkregen, waarin het GUS gen door twee Ncol knipplaatsen wordt geflankeerd --- in pPLC GUS1 bevindt zich juist voor het coderende gedeelte van het GUS gen een unieke PstI knipplaats; door het plasmide met PstI te knippen en de 4 basen lange 3'-overhangende uiteinden met behulp van T4-polymerase te verwijderen werd het plasmide pPLC GUS dPstl.l verkregen, dat nog steeds de twee Ncol sites bevat.
De inserties van het GUS gen werden uitgevoerd in de volgende STNV-plasmiden: --- pPLC STNV N160.1 en .2 (de sense en de anti-sense oriëntatie ten opzichte van de pL promoter), met een volledig STNV genoom, voorzien van een 14 bp linker insertie op positie 160. De ingevoegde linker bevat een unieke Ncol knipplaats --- door linkermutagenese werd op positie 28 van het STNV genoom de base A vervangen door de base C, hetgeen leidt tot het ontstaan van een Ncol knipplaats die overlapt met het startcodon van het manteleiwit gen. De introductie van deze mutatie in STNV N160 gaf de plasmiden pPLC STNV N160Ncol.l en .2. Na knippen met Ncol en ligeren kan het 134 bp grote Ncol fragment van deze plasmiden worden gedeleteerd, leidende tot de plasmiden pPLC STNV dNcol.l en .2.
De inserties van het GUS gen in STNV werden als volgt tot stand gebracht: --- het GUS gen werd als Ncol fragment uit pPLC GUS1 gekloneerd
in pPLC STNV N160.1 en .2. In de goede oriëntatie gaf dit de plasmiden pPLC STNV GUS.1 en .2, waarbij het GUS gen in het juiste leesraam is gefuseerd met het 5'-gedeelte van het STNV manteleiwit. Translatie van het fusie-eiwit stopt ter hoogte van het stopcodon van het GUS gen, het 3'-gedeelte van het manteleiwit wordt niet vertaald. Deze constructies vertegenwoordigen in feite de zuivere insertie van het GUS gen in STNV
--- het GUS gen werd als Ncol fragment uit pPLC GUS dPstl.l gekloneerd in de Ncol knipplaats van pPLC STNV dNcol.l en .2, waarbij de plasmiden pPLC STNV GUS dNcol.l en .2 werden verkregen. De insertie was zodanig, dat het AUG startcodon van STNV bewaard bleef, gevolgd door 7 codons uit de synthetische linker en in het juiste leesraam aansluitend op het startcodon van het GUS gen. Translatie stopt eveneens ter hoogte van het stopcodon van het GUS gen en levert dus het glucuronidase met 8 extra aminozuren aan het aminoterminale uiteinde --- de plasmiden pPLC STNV GUS.l en .2 en pPLC STNV GUS dNcol.l en .2 werden geknipt met Nsil (dit restrictie-enzym knipt juist achter het GUS gen en precies aan het einde van het manteleiwit gen) en geligeerd. Aldus werd een Nsil fragment van 468 bp gedeleteerd en werden resp. de plasmiden pPLC STNV GUS dNsil.l en .2, en pPLC STGUS.l en .2 verkregen. Deze laatste plasmiden pPLC STGUS.l en .2 bevatten de constructies, waarin het manteleiwit gen volledig is vervangen door het GUS gen.
Uitgaande van de pPLC plasmiden werden de constructies STNV GUS en STGUS als BamHI-Sall fragment overgekloneerd in de plantevector pPCV 520, achter de pTRl' promoter. Hierbij draait de oriëntatie ten opzichte van de promoter om, zodat bijv. uit pPLC STGUS.l het plasmide pPCV STGUS.2 ontstaat.
Expressie in planten werd getest door plasmide infecties van cowpea met de verschillende STNV-GUS constructies. Daarvoor werden de plasmiden pPLC STNV GUS.l en .2, en pPCV STNV GUS.l en .2 gebruikt. Cowpea bladeren werden geïnfecteerd met plasmide en helpervirus en 3 dagen na inoculatie geoogst. Een vers geoogst blad werd een nacht geïncubeerd in een 2 mM oplossing van X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronzuur) in 40 mM fosfaatbuffer, pH 7,4, bij 37 °C. Daarna werden de bladeren gefixeerd in glutaaraldehyde (6 uur) en ontkleurd met een ethanol reeks (van 30 tot 95 %). Omzetting van het X-Gluc door het glucuronidase leidt tot de vorming van een onoplosbaar blauwgekleurd neerslag.
Met de vier bovenstaand genoemde plasmiden werden vier onafhankelijke infectiereeksen uitgevoerd op cowpea, waarbij in twee gevallen bij de gexncubeerde bladeren een gelocaliseerde blauwe reactie werd waargenomen. Met pPLC STNV GUS.l werd ter hoogte van een lesie een blauwe rand waargenomen. Na een microscopisch onderzoek van het gefixeerde materiaal bleek de kleurreactie gelocaliseerd in de plantecellen die juist aan de rand van de lesie lagen. Met pPLC STNV GUS.2 was de reactie zichtbaar in de vorm van een 0,3 mm grote vlek. Bij een microscopisch onderzoek kon niet worden vastgesteld of de reactie intracellulair was, omdat de plantecellen gedurende de incubatie met het substraat te sterk beschadigd waren door aantasting door bacteriële contaminatie. Omdat de blauwe kleur tijdens fixatie, ontkleuring, inbedding en snijden bewaard bleef, kan echter met vrij grote zekerheid worden aangenomen dat de reactie plant-spscifiek was.
Voorts werd ook een transformatie van tabak uitgevoerd, waarbij de T-plasmiden pPCV STNV GUS.l en .2 werden gebruikt. Voor beide constructies.werden transformanten verkregen. GUS tests vóór en na TNV infecties van de opgegroeide transformanten bleken aan de .verwachtingen te voldoen.
Voorbeeld III
Isolatie van het gen voor replicase van Tobacco Necrosis Virus
Als startmateriaal werd Tobacco Necrosis Virus (TNV) Kassanis stam A en serotype A, dat Satellite Tobacco Necrosis Virus (STNV) SV-1 (SV-A serotype) kan vermenigvuldigen, gebruikt. Deze stam werd verkregen van Dr. Wieringa Brants, Phytopathologisch Laboratorium, Baarn, Nederland. TNV, vrij van STNV, werd verkregen zoals beschreven door van Emmelo et al., Virology 157, 480-487 (1987).
TNV virus werd vermeerderd in Phaseolus bladeren (Vigna unguiculata, cowpea), door infectie met virus en carborundum. Genomisch RNA werd bereid uit gezuiverde TNV-partikels en met AMV reverse transcriptase (Boehringer) onder toepassing van random primers omgezet in cDNA. De tweede streng synthese werd verricht door E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment) en RNAaseH (Boehringer) volgens de methode van Gubler en Hoffman (Gene 25, 263-269, 1983). Hierna werd T4 DNA polymerase toegevoegd om de einden blunt te maken. Na klonering in plasmide pSP64 (Promega), geknipt met Smal waarbij tevens de uiteinden met phosphatase werden behandeld, werden de kloons door transformatie naar E. coli MC1061 overgebracht en de kolonies getest door kolonie-hybridisatie met gefragmenteerd 32P ds TNV RNA.
Subgenomisch ssRNA bereid uit met TNV geïnfecteerde Phaseolus bladeren werd gebruikt voor Northern hybridisatie met de geselecteerde TNV kloons. Deze subgenomische RNAs waren resp. 1,25 kb, 1,5 kb en 3,8 kb lang. Het subgenomische RNA werd na agarosegel-electroforese geïmmobiliseerd op een nylon membraan filter (Fall Biodyne) en gehybridiseerd met 32P gemerkt kloon DNA. Geselecteerd werd een kloon (pSPTNV127), die hybridiseerde met de twee 3' subgenomische TNV RNAs en een fragment, gelegen tussen positie 1900 en 2300 van het TNV RNA, bevatte.
Restrietie-analyse toonde aan dat dit fragment een intern Hpall fragment bevatte dat gebruikt kon worden als primer voor de cDNA synthese van het replicase gen dat 5' terminaal gelegen is op het TNV RNA. Voor de preparatieve cDNA klonering werd echter gebruik gemaakt van een synthetisch oligonucleotide, afgeleid uit de sequentie van pSPTNV127: 5' GCTTGTGAGTATCA 3'. Deze sequentie is complementair aan het genomisch RNA.
De synthese van het cDNA werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven maar in aanwezigheid van methyl-kwik-hydroxide om het RNA beter kopieerbaar te maken (Lenstra et al., Gen. Anal.
Techn. 5, 57-61, 1988). Men verkreeg aldus een 2,2 kb streng die overeenkomt met het gebied van het replicase gen van TNV. Na klonering in pSP64 werden uit 1500 kloons, drie kloons geselecteerd die een 2,2 kb fragment in de sense oriëntatie ten opzichte van de SP6 promoter bevatten.
Met behulp van SP 6 polymerase en uitgaande van de kloon pSPTNV94 werd RNA bereid dat in een tarwekiem extract onder andere aanleiding gaf tot synthese van een 73 kD eiwit, wat het verwachte molecuulgewicht is van de TNV replicase.
Bij dit experiment werd 35S methionine gebruikt tijdens de proteïne synthese en het 73 kD eiwit werd gedetecteerd na SDS PAGE en autoradiografie.
De sequentie van pSPTNV94 werd bepaald door de dideoxy methode van Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 54 63-5467, 1977) na klonering van fragmenten in pUCl8 plasmide. De strategie voor het bepalen van de nucleotidensequentie is weergegeven in fig.3 en de sequentie in fig.4.
Het fragment in pSPTNV127 bleek het 3' uiteinde van het replicase gen te bevatten. Om een volledige kloon van het replicase gen van TNV te verkrijgen werd gebruik gemaakt van een unieke Xmal site in pSPTNV94 en pSPTNV127 DNA en een unieke SacI site in de polylinker van pSP64. Door een ligatie van het kleine Xmal-SacI fragment van pSPTNV127 in het grote pSPTNV94 fra met Xmal en SacI uiteinden werd pSPTNV rep-1 verkregen. De kloon is 2236 basen lang, waarbij het langste open leesraam te vinden is van base 50 tot base 2221 (absoluut leesraam t.o.v. de eerste base: 2) met een intern stopcodon op positie 656. Dit open leesraam, na vértaling en gebruik van een suppressor tRNA op positie 656-658, codeert voor een replicase van 724 aminozuren. Voor verdere toepassingen werd het interne stopcodon TAG, d.m.v. specifieke mutagenese, veranderd in een codon TAT, coderend voor Tyr.
Een E. coli stam MC1061 [pSPTNV rep-1], die het plasmide pSPTNV rep-1 bevat, is op 26 juli 1990 bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Nederland, gedeponeerd onder nummer CBS .... 90.
Voorbeeld IV
Expressie, met amplificatie van het boodschapper RNA door TNV reolicase. van een chloramphenicol-acetvl-transferase gen, gefuseerd met een deel van het STNV manteleiwit gen 1. Constructie van een DNA sequentie, waarin een deel van het STNV manteleiwit gen gefuseerd is met het chloramphenicol-acetyl-transferase gen
Het plasmide pSTNV NI98 werd beschreven door Van Emmelo et al. (Virology 157, 480-487, 1987) . Het bevat een 14 bp Ncol linker in de EcoRV site van het manteleiwit gen van STNV. Door knippen met Ncol. invullen van de uiteinden met E. coli polymerase en terug ligeren werd het leesraam weer hersteld: . Asp(56)/Ser-Met-His-Gly-Asn-Ser/Ile(57).
Het verkregen plasmide geeft aanleiding tot vorming van STNV infectieve partikels in coïnfecties met TNV van Phaseolus bladeren (Vigna unguiculata, cowpea). Dit plasmide werd pSTNV N202 genoemd. Het PstI fragment, bevattende het STNV cDNA N202, werd overgekloneerd in pSP65 (Promega). Het verkregen plasmide werd pSPSTNV N 202 genoemd (fig.5). Uit pBR325 werd het chloramphenicol-acetyl-transferase gen (CAT gen) gehaald als een Taql fragment, dat vervolgens blunt end werd gemaakt met het Klenow fragment van E. coli DNA polymerase. pSPSTNV N202 werd geknipt met Nsil en blunt end gemaakt. Vervolgens werd het Taql fragment gekloneerd in het Nsil gedeleteerde pSPSTNV N202 plasmide.
De sense oriëntatie t.o.v. de SP6 promoter werd pSPSTNV CAT-1 en de non-sense oriëntatie pSPSTNV CAT-2 genoemd (zie fig.5).
2 . Expressie van het chimeer CAT gen met behulp van TNV
virus in bladeren van Phaseolus (Vigna unguiculata)
Bladeren van cow pea werden geïnfecteerd met hetzij TNV en STNV-plasmide, hetzij TNV en pSPSTNV CAT-1. Veertig uur na inoculatie werden de bladeren geextraheerd met PBS buffer met 0,1% Triton X100 en werd het extract behandeld met anti-STNV manteleiwit serum. Immunoprecipitatie met proteïne A-sepharose werd gevolgd door veelvuldig wassen.
De chloramphenicol-acetyl-transferase activiteit werd op de complexen bepaald met l-14C-acetyl-coenzyme A en chloramphenicol zoals beschreven door Gorman et al. (Molec.
Cell. Biol. 2, 1044-1081, 1982) en door De Block et al. (EMBO J. 3, 1681-1689, 1984) .
CAT activiteit kon alleen aangetoond worden in de bladeren die met TNV en pSPSTNV CAT-1 werden geïnfecteerd en waarvan het extract met STNV antiserum werd behandeld (de resultaten worden hier niet getoond).
3. Vermenigvuldiging van het STNV-CAT RNA
Twee dagen na inoculatie van cow pea bladeren met TNV en pSPSTNV CAT-1 DNA werden de bladeren geoogst en de nucleinezuur-fractie geïsoleerd. DNA werd verwijderd met RNAase-vrije DNAase I en het RNA werd geanalyseerd door Northern hybridisatie met CAT specifiek, 32P gemerkt DNA (Tad fragment uit pBR325) . Zowel in de ss RNA als de ds RNA fractie werd een band van ca. 1750 nucleotiden gedetecteerd (de resultaten worden hier niet getoond). Hieruit blijkt dus duidelijk dat het pSPSTNV CAT-1 plasmide DNA door TNV omgezet wordt in ss en ds STNV CAT-1 RNA.
Fiauurbesprekinq
Figuur 1 toont de kaart van het plasmide pPCV 520. Het T-DNA van dit plasmide is aangeduid met een dikke lijn en wordt begrensd door linker (LB) en rechter (RB) grenssequenties; de unieke restrictiesites voor Sall en BamHI kunnen worden gebruikt voor klonering van fragmenten tussen de plantepromoter pTRl1 en het polyadenylatiesignaal pAg7, en de restrictiesites BqlII en
Bell voor klonering tussen pnos en pAg4. Het kanamycine resistentie gen NPT-II wordt tot expressie gebracht door pTR2' en pAocs. Het octopine gen wordt tot expressie gebracht met de weefselspecifieke promoter pg5 en pAocs. De pBR322-sequenties met de replicatie-oorsprong (oriV, colEl) en de ampicilline resistentie (Ap) liggen in het T-DNA. De pRK2 oorsprong van replicatie (ori V) en transfer (ori T), het chlooramphenicol resistentie gen (Cm) en de cohesieve uiteinden van lambda (cos) liggen buiten het T-DNA.
Figuur 2 toont de kaart van het plasmide pMP90RK. Op de plaats waar de Kpnl fragmenten 9 en 12 van pGV 3100 elkaar raken werd het T-DNA inclusief de grenssequenties gedeleteerd. Het virulentiegebied is volledig intact. Door uitwisselings-recombinatie werden het gen voor gentamycine resistentie (Gm) en een fragment van pRK 2013, dat de genen voor transfer (tral, tra2 en tra3), replicatie (trfa) en kanamycine resistentie (Km) draagt, ingebracht.
Figuur 3 toont schematisch de restrictiekaart van het gebied van het TNV replicase gen en de voor de sequentiebepaling gebruikte fragmenten. De fragmenten werden na klonering in pUC18 in beide richtingen of twee keer geanalyseerd volgens de dideoxy methode van Sanger teneinde de nucleotidensequentie te bepalen.
Figuur 4 toont de volledige sequentie van het replicase gen van TNV. De ammozuursequentie vertoont homologie roet de replicase genen van CarMV (Carnation Mottle Virus) en TuCV (Turnip Crinkle Virus). Het amber stopcodon op positie 656 is in het natuurlijke genoom aanwezig. Voor verdere toepassingen werd dit stopcodon vervangen door TAT dat codeert voor het aminozuur Tyr. De start-,en stopcodons zijn resp. met
Figure NL9001711AD00421
en
Figure NL9001711AD00422
aangegeven. De aminozuursequentie start op nucleotide positie 50 en stopt op positie 2221.
Figuur 5 toont schematisch de constructie van de plas-miden pSPSTNVCATl en pSPSTNVCAT2. Details over deze constructie zijn beschreven in voorbeeld IV.
Tabel 1 STNV E. coli NF1 cowpea
mutant manteleiwit manteleiwit ssRNA dsRNA
wild type + + ++ ++ N162 + (kort) - + ++ N164 + (+6 a.z.) + (+6 a.z.) ++ ++ S164 + (kort) - + ++
Brad + (+10 a.z.) + (+10 a.z.) ++ ++ N198 + (kort) - + ++ N200 + (+6 a.z.) + (+6 a.z.) ++ ++ S200 + (+12 a.z.) - + ++ N320 + (kort) - + ++ N322 + (+6 a.z.) - + ++ N531 + (kort) - + ++ N533 + (+6 a.z.) - + ++ S613 + (+6 a.z.) - + ++ N843 + - - - N164N843 + (+6 a.z.) - -
Met "a.z." wordt aminozuren bedoeld; "kort" duidt op een verkort manteleiwit. De aanwezigheid en grootte van het manteleiwit werd door Western blotting bepaald. RNA werd gehybridiseerd met een STNV-DNA probe, die gemerkt was met 32P.
Tabel 2
STNV en STNV manteleiwit STNV RNA (ds en ss) controle - TNV + TNV - TNV + TNV
planten met STNV DNA 14 18 30 N164.1 — + tot +++ — + tot +++ — + — N164.2 - + tot +++ - + tot +++ + N164N843.1 - ++ tot +++ - ++ tot +++ + + - N164N843.2 - + tot +++ - + tot +++ + +
Brad.l - + tot +++ - + tot +++ - - +
Brad. 2 ++ ++ + tabak SRI - 520 - - - -
Van de getransformeerde planten werden per STNV mutant meerdere onafhankelijk geïsoleerde planten getest. STNV manteleiwit (+6 en +10 aminozuren) werd door Western blotting, RNA door Northern hybridisatie met 32P-gemerkt STNV-DNA bepaald. Onafhankelijke transformanten met hetzelfde mutante genoom gaven verschillend sterke signalen, wat met het aantal + tekens wordt aangegeven. Voor de Western en Northern blottings werd per monster 10 mg bladmateriaal gebruikt. Door hybridisatie met de verschillende linkers (14-, 18- en 30-meer) werd de identiteit van de STNV genomen bevestigd.

Claims (22)

1. Recombinant DNA, omvattende twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties met daartussen ten minste één nucleotidensequentie die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie, maar geen gen, dat voor viraal RNA/RNA polymerase codeert, en geen gen, dat voor viraal manteleiwit codeert, omvat.
2. Recombinant DNA volgens conclusie 1, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie zowel cis-elementen voor replicatie als cis-elementen voor transport omvat.
3. Recombinant DNA volgens conclusie 1 of 2, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie ook cis-elementen voor verpakking in manteleiwit omvat.
4. Recombinant DNA volgens een der conclusies 1-3, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie tevens cis-elementen voor translatie omvat.
5. Recombinant DNA volgens een der conclusies 1-4, waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens ten minste één nucleotidensequentie bevindt, die codeert voor een ribozym, dat viraal RNA of mRNA kan knippen.
6. Recombinant DNA volgens conclusie 1, waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere RNAs codeert.
7. Recombinant DNA volgens conclusie 6, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie en cis-elementen voor translatie omvat en zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere eiwitten/ peptiden codeert.
8. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 1-7, opgenomen in een expressie-cassette voor een te transformeren gastheercel waardoor in de gastheercel transcriptie kan plaatsvinden onder vorming van een RNA molekuul met een steelpan-struktuur.
9. Eukaryotische of prokaryotische cellen of organismen, welke door genetische manipulatie voorzien zijn van recombinant DNA volgens conclusie 8.
10. Eukaryotische of prokaryotische cellen of organismen volgens conclusie 9, welke door genetische manipulatie tevens voorzien zijn van recombinant DNA, omvattende genetische informatie voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct in een induceerbare of weefselspecifieke expressie-cassette.
11. Werkwijze voor het beschermen van eukaryotische organismen, zoals in het bijzonder planten, gisten en schimmels, tegen een RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, door een genetische manipulatie van het te beschermen organisme uit te voeren waarbij in het genoom van dit organisme recombinant DNA wordt ingebouwd dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties met daartussen een van RNA virus afgeleide nucleotidensequentie omvat, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie, maar geen gen, dat voor viraal RNA/RNA polymerase codeert, en geen gen, dat voor viraal manteleiwit codeert, omvat;
12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie zowel cis-elementen voor replicatie als ciselementen voor transport omvat.
13. Werkwijze volgens conclusie 11 of 12, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie tevens cis-elementen voor verpakking in manteleiwit omvat.
14. Werkwijze volgens een van de conclusies 11-13, waarbij de van RNA virus afgeleide sequentie tevens cis-elementen voor translatie omvat.
15. Werkwijze volgens een van de conclusies 11-14, waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotiden-sequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens ten minste één nucleotidensequentie bevindt, die voor een ribozym codeert, dat viraal RNA of mRNA kan knippen.
16. Werkwijze voor het op een induceerbare wijze produceren van een of meerdere eiwitten/peptiden door een prokaryotisch of eukaryotisch organisme, of cellen van een prokaryotisch of eukaryotisch organisme, welk organisme door genetische manipulatie is voorzien van recombinant DNA dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties omvat met daartussen een nucleotidensequentie, die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie en cis-elementen voor translatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat, en waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere eiwitten/peptiden codeert, in sense dan wel in anti-sense oriëntatie, te kweken en met het virus te infecteren.
17. Werkwijze voor het op een induceerbare wijze of op een weefsel-specifieke wijze produceren van een of meerdere eiwitten/peptiden door een eukaryotisch organisme te kweken, in het genoom waarvan door genetische manipulatie zowel recombinant DNA is ingebouwd dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties omvat met daartussen een nucleotidensequentie, die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie en cis-elementen voor translatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat, en waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere eiwitten/peptiden codeert, in sense dan wel in anti-sense oriëntatie, als ook recombinant DNA is ingebouwd dat genetische informatie voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct in een induceerbare of weefselspecifieke expressie-cassette omvat.
18. Werkwijze voor het op een induceerbare wijze produceren van een of meerdere RNAs, zoals ribozymen, antisense RNAs en dubbelstrengs RNAs, door een prokaryotisch of eukaryotisch organisme, of cellen van een prokaryotisch of eukaryotisch organisme, welk organisme door genetische manipulatie is voorzien van recombinant DNA dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties omvat met daartussen een nucleotidensequentie, die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat, en waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere RNAs codeert, in sense dan wel in antisense oriëntatie, te kweken en met het virus te infecteren.
19. Werkwijze voor het op een induceerbare wijze of op een weefsel-specifieke wijze produceren van een of meerdere RNAs, zoals ribozymen, antisense RNAs en dubbelstrengs RNAs, door een eukaryotisch organisme te kweken, in het genoom waarvan door genetische manipulatie zowel recombinant DNA is ingebouwd dat in een werkzame expressiecassette twee, 12-250 baseparen lange, geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties omvat met daartussen een nucleotidensequentie, die afgeleid is van RNA virus, dat voor zijn replicatie afhankelijk is van een viraal RNA/RNA polymerase, waarbij deze van RNA virus afgeleide sequentie ten minste cis-elementen voor replicatie, maar geen gen, dat codeert voor viraal RNA/RNA polymerase, en geen gen, dat codeert voor viraal manteleiwit, omvat, en waarbij zich tussen de twee geïnverteerd gerepeteerde nucleotidensequenties behalve de van RNA virus afgeleide sequentie tevens een niet-virale nucleotidensequentie bevindt, die voor een of meerdere RNAs codeert, in sense dan wel in anti-sense oriëntatie, als ook recombinant DNA is ingebouwd dat genetische informatie voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct in een induceerbare of weefselspecifieke expressie-cassette omvat.
20. Recombinant DNA, omvattende een nucleotidensequentie die codeert voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct.
21. Recombinant DNA volgens conclusie 20, omvattende het voor een viraal RNA/RNA polymerase coderende deel van de in fig.4 getoonde nucleotidensequentie, dan wel daarvan afgeleide constructen, zoals een substitutiemutant die op de plaatsen 656-658 volgens de in fig.4 gehanteerde nummering de sequentie TAT heeft i.p.v. de sequentie TAG, en substitutiemutanten waarin een gedeelte van de in fig.4 getoonde sequentie vervangen is door een overeenkomstig gedeelte van een ander gen, dat voor een viraal RNA/RNA polymerase codeert.
22. Recombinant DNA volgens conclusie 20 of 21, waarbij de nucleotidensequentie, die voor een viraal RNA/RNA polymerase of een RNA/RNA polymerase construct codeert, gelegen is in een induceerbare o'f weefselspecifieke expressie-cassette.
NL9001711A 1989-10-03 1990-07-27 Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat. NL9001711A (nl)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9001711A NL9001711A (nl) 1989-10-03 1990-07-27 Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat.
CA002396794A CA2396794A1 (en) 1989-10-03 1990-10-02 Genetic manipulations with recombinant dna comprising sequences derived from rna virus
CA002026703A CA2026703C (en) 1989-10-03 1990-10-02 Genetic manipulations with recombinant dna comprising sequences derived from rna virus
DK90202627.7T DK0425004T3 (nl) 1989-10-03 1990-10-03
EP90202627A EP0425004B1 (en) 1989-10-03 1990-10-03 Genetic manipulations with recombinant DNA comprising sequences derived from RNA virus
AT90202627T ATE142700T1 (de) 1989-10-03 1990-10-03 Genetische manipulationen mit von rna-viren abgeleiteten sequenzen enthaltendem rekombinantem dna
ES90202627T ES2094744T3 (es) 1989-10-03 1990-10-03 Manipulaciones geneticas con el adn recombinante que contiene secuencias derivadas de los virus arn.
IE354190A IE76133B1 (en) 1989-10-03 1990-10-03 Genetic manipulations with recombinant DNA comprising sequences derived from RNA virus
PT95494A PT95494B (pt) 1989-10-03 1990-10-03 Processo para a producao de dna recombinante compreendendo sequencias derivadas de virus de rna, e manipulacoes geneticas que o utilizam
DE69028479T DE69028479T2 (de) 1989-10-03 1990-10-03 Genetische Manipulationen mit von RNA-Viren abgeleiteten Sequenzen enthaltendem rekombinantem DNA
JP2266173A JPH03280883A (ja) 1989-10-03 1990-10-03 Rna型ウイルス由来の配列を包含する組換えdnaおよびそれを用いる遺伝子操作方法
GR960403367T GR3021950T3 (en) 1989-10-03 1996-12-10 Genetic manipulations with recombinant DNA comprising sequences derived from RNA virus
US08/901,379 US6197542B1 (en) 1989-10-03 1997-07-28 Genetic manipulations with recombinant DNA comprising sequences derived from RNA virus
US09/234,163 US6093554A (en) 1989-10-03 1999-01-21 Genetics manipulations with recombinant DNA virus comprising sequences derived from RNA virus

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8902452 1989-10-03
NL8902452A NL8902452A (nl) 1989-10-03 1989-10-03 Genetische manipulaties met recombinant dna, dat rna-virus-specifieke sequenties omvat.
NL9001711 1990-07-27
NL9001711A NL9001711A (nl) 1989-10-03 1990-07-27 Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL9001711A true NL9001711A (nl) 1991-05-01

Family

ID=26646589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL9001711A NL9001711A (nl) 1989-10-03 1990-07-27 Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6197542B1 (nl)
EP (1) EP0425004B1 (nl)
JP (1) JPH03280883A (nl)
AT (1) ATE142700T1 (nl)
CA (2) CA2026703C (nl)
DE (1) DE69028479T2 (nl)
DK (1) DK0425004T3 (nl)
ES (1) ES2094744T3 (nl)
GR (1) GR3021950T3 (nl)
IE (1) IE76133B1 (nl)
NL (1) NL9001711A (nl)
PT (1) PT95494B (nl)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7033835B1 (en) 1988-02-26 2006-04-25 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US6054566A (en) 1988-02-26 2000-04-25 Biosource Technologies, Inc. Recombinant animal viral nucleic acids
US5977438A (en) * 1988-02-26 1999-11-02 Biosource Technologies, Inc. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
US6660500B2 (en) 1988-02-26 2003-12-09 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
ES2171398T3 (es) * 1991-08-01 2002-09-16 Large Scale Biology Corp Acidos nucleicos viricos vegetales recombinantes.
EP0612208B1 (en) * 1991-10-04 2004-09-15 North Carolina State University Pathogen-resistant transgenic plants
ATE207957T1 (de) * 1992-02-19 2001-11-15 Oregon State Produktion virus-resistenter pflanzen durch einführung von nicht-translatierbarer viraler plus-strang-rna
CA2135643A1 (en) * 1992-05-14 1993-11-25 Brent V. Edington Virus resistant plants
EP0677113B1 (en) * 1992-12-30 2003-03-12 Biosource Genetics Corporation Viral amplification of recombinant messenger rna in transgenic plants
IL108241A (en) * 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
US6008436A (en) * 1993-01-21 1999-12-28 North Carolina State University Nematode-resistant transgenic plants
US5981236A (en) * 1993-02-26 1999-11-09 Calgene Inc Geminivirus-based gene expression system
PT686197E (pt) * 1993-02-26 2000-11-30 Calgene Llc Sistema de expressao de genes baseado em geminivirus
US5650303A (en) * 1993-02-26 1997-07-22 Calgene, Inc. Geminivirus-based gene expression system
DE4315109A1 (de) * 1993-05-06 1994-11-10 Inst Pflanzengenetik & Kultur Verfahren und Vektorkonstrukt zur Expressionssteigerung von Transgenen
GB9311593D0 (en) * 1993-06-04 1993-07-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
GB9401780D0 (en) * 1994-01-31 1994-03-23 Nickerson Biocem Ltd Modified plants
AU3409295A (en) * 1994-08-18 1996-03-14 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Regulatable elimination of gene expression, gene product function and engineered host cells
IT1283631B1 (it) * 1996-05-09 1998-04-23 Metapontum Agrobios Srl Metodo per la preparazione di piante transgeniche resistenti ad in- fezioni virali e piante cosi' ottenute
GB9615349D0 (en) * 1996-07-22 1996-09-04 Zeneca Ltd Virus resistance in plants
GB9703146D0 (en) * 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
GB9720148D0 (en) * 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
US6632980B1 (en) 1997-10-24 2003-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
AU731330B2 (en) * 1997-10-24 2001-03-29 E.I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
US6077992A (en) * 1997-10-24 2000-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
EP1115870A2 (en) * 1998-09-23 2001-07-18 E.I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
US7220893B1 (en) 1999-05-19 2007-05-22 Cornell Research Foundation, Inc. Plasmids and methods for construction of non-redundant, indexed, saturation, gene-disruption plant and animal libraries
WO2005019449A2 (en) * 2003-07-03 2005-03-03 Board Of Trustees Operating Michigan State University Expression of a recombinant transgene
CN110144338A (zh) * 2019-05-29 2019-08-20 通用生物系统(安徽)有限公司 一种以rna为模板的rna聚合酶制备方法及该聚合酶的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2624342B1 (fr) * 1987-12-14 1991-11-08 Agronomique Inst Nat Rech Procede d'obtention de plantes transgeniques, vecteur d'integration utilise et plantes obtenues
EP0999281A1 (en) * 1988-02-26 2000-05-10 Biosource Technologies, Inc. Non-nuclear chromosomal transformation
CN1033645A (zh) * 1988-10-22 1989-07-05 中国科学院上海植物生理研究所 控制植物病毒病的基因工程方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2094744T3 (es) 1997-02-01
EP0425004A2 (en) 1991-05-02
GR3021950T3 (en) 1997-03-31
IE76133B1 (en) 1997-10-08
DK0425004T3 (nl) 1997-03-10
IE903541A1 (en) 1991-04-10
CA2026703A1 (en) 1991-04-04
DE69028479D1 (de) 1996-10-17
PT95494A (pt) 1991-09-13
US6197542B1 (en) 2001-03-06
JPH03280883A (ja) 1991-12-11
EP0425004B1 (en) 1996-09-11
CA2396794A1 (en) 1991-04-04
DE69028479T2 (de) 1997-04-03
ATE142700T1 (de) 1996-09-15
EP0425004A3 (en) 1991-08-07
CA2026703C (en) 2002-11-26
PT95494B (pt) 1997-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL9001711A (nl) Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat.
DE68929521T2 (de) Nicht-nukleare chromosomale Transformation
JPH0773498B2 (ja) 植物感染性キャップ化rna分子
KR20010112952A (ko) 바이러스 유전자 발현의 조절
JPH03172173A (ja) スルホンアミド耐性遺伝子およびその用途
WO1985004899A1 (en) Methods and vectors for transformation of plant cells
Thomas et al. A mutation of cauliflower mosaic virus gene I interferes with virus movement but not virus replication
CA2095109C (en) Process for production of exogenous gene or its product in plant cells
AU3618300A (en) Multiple component rna vector system for expression of foreign sequences
EP0938574B1 (en) Method for inducing viral resistance into a plant
Radian-Sade et al. Transgenic Nicotiana benthamiana and grapevine plants transformed with grapevine virus A (GVA) sequences
US6093554A (en) Genetics manipulations with recombinant DNA virus comprising sequences derived from RNA virus
HUT58794A (en) Process for producing rns of endonuclease- and antisense activity
NL8902452A (nl) Genetische manipulaties met recombinant dna, dat rna-virus-specifieke sequenties omvat.
Ravin et al. Complete sequencing of potato virus X new strain genome and construction of viral vector for production of target proteins in plants
Gupta et al. Agrobacterium-mediated co-inoculation of okra plants with cloned okra enation leaf curl virus DNA and bhendi yellow vein mosaic beta-satellite DNA furthers Koch’s postulates for enation leaf curl disease
US10308946B2 (en) Expression cassette for transformation comprising a modified viral sequence driven by a suitable promoter
KR102280018B1 (ko) 십자화과 작물에서 유용 유전자의 기능 분석을 위한 RaMV 유래의 재조합 VIGS 벡터 및 이의 용도
WO1999061597A9 (en) Expression cassette for transformation comprising a modified viral sequence driven by a suitable promoter
US5959181A (en) Method of preparation of transgenic plants resistant to viral infections and so obtained plants
US5428144A (en) Maize dwarf mosaic virus cDNA
Arif et al. FUROVIRUS IS ASSOCIATED WITH ACQUISITION
Ravelonandro et al. Transgenic tobacco plants that contain the plum pox virus (PPV) coat protein gene.
Klöti Genetic transformation of rice (Oryza sativa L.) to confer resistance to rice tungro bacilliform virus (RTBV)
Wang Isolation of phloem specific gene promoters for use in genetic engineering of insect resistance in rice

Legal Events

Date Code Title Description
BV The patent application has lapsed