PT95494B - Processo para a producao de dna recombinante compreendendo sequencias derivadas de virus de rna, e manipulacoes geneticas que o utilizam - Google Patents

Processo para a producao de dna recombinante compreendendo sequencias derivadas de virus de rna, e manipulacoes geneticas que o utilizam Download PDF

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Description

invento está relacionado com o campo da. engenharia genética por meio de técnicas de DNA recombinante, mais particularmente com o campo da. engenharia, genética de organismos eucarióticos, tais como leveduras, fungas e particularmente plantas.
invento e particularmente dirigido a manipulações genéticas que levam à resistência do organismo hospedeiro contra um ou mais vírus da RNA, s a manipulações genéticas que tornem o organismo hospedeiro capaz da produção, induzível ou específica de tecido, de proteínas/peptídeos ou RNAs estranhos.
Para tais manipulações genéticas usa-se DMA recombirsante compreendendo uma ou mais sequências derivadas de vírus de RWftj. du, mais particular-mente, pelo menos uma sequência nucleotídica que deriva de um vírus de RNA, cuja, replicação é indepentíennm RNA/RNA-polimerase virai (i.s. uma RíMA-pol imerase
RÍMA-dependente, que é por vezes referida como “replicase >» Estes vírus de RNA podem pertencer ao grupo de vírus de RNA de cadeia dupla Ci»e. o genoma do vírus consiste em RNA de cadeia du pia), ao grupo de vírus de RNA de cadeia positiva Ci.e. o genoma do vírus consiste em RNA de cadeia simples mensageiro ou senss), ou ao grupo dos vírus de RNA de cadeia negativa íi.e. o genonta do vírus consiste em RNA de cadeia simples !,anii-sense5!)„
Porém, nem todos os vírus de RNA estão dependentes de uma RiMA/RNA—pol imerase virai para a sua replicaçSo. isto é particularmente verdadeiro para os vírus pertencentes à família dos Retroviridae, os- quais para a sua replicação, estão dependentes da. reolicação de SNA após o RNA genémiço ser transcrito para DMA por meio da trsnscríptase reversa.
São exemplos ds vírus tíe RNA que para a sua replicação estão dependentes de uma RIMA/RNA··polimerase, os vírus de cadeia
dupla das -famílias Reovirídae & Birnaviridas, vírus de cadeia negativa das famílias Arenaviridae, Bunyaviridae, Orthamyxovxridae, Pa.ramixoviridas e Rhabdovxrxdae e virus de cadeia positiva das famílias de Togsviridse, Flaviridae, Ccrona— vindas, Modavirxdae, Kicornaviridae e Calicivindae. óão exemplos concretos de vírus de cadeia positiva com um hospedeiro vegetal o Virus da Mosaico do Tabaco, Vírus da Necrose do Tabaco, Vírus do Mosaico das- Bromeiiáceas, Vírus do Mosaico do Pepineiro,
Vírus das Riscas do Tabaco, do Mosaico do Feii3o Frades vírus do Chocalhar do tabaco,
Virus
Vírus- dos Anéis Pretos do Tomateiro, 3a Batateira, Vírus do Mosaica Amarela da Nabo, vírus do Retardamento do Crescimento Arbustiforme do Tomateiro, Vírus do Mosaico do Feijão do Sul, Vírus da Nanxsmo Amarelo da Cevada, λ ua
-.atente dos
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i- uíí 1 í-tó!
Batateira, Vírus do Amarelado da Cana Sacarina, Vírus craveiros.
Ju; í_ .
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Virus do Mosaica Excrecê’ncié E mu. r c hec i men to d o T orna beiro.
Sujeita á limitação para as virus de RNA que para a sua replicação estão dependentes de uma RNA/RNA-polimerase virai, o termo vírus ds RNA coma aqui ê-usado inclui vírus e virusóides que para a sua replicação estão dependentes da -ajuda ds um outro vírus- (auxiliar) «Como é- do conhecimento geral, as infecções pelos vírus de RNA podem ser acompanhadas por coinfecçSes pòr exemplo com vírus satélite tendo a sua própria proteína satélite que é encapsidado em partículas mistas s genoma de RNA circular pequeno, encapsidado em tas)» 0 termo vírus de RNA· como aqui é usai viróides, x = e» moléculas pequenas de RNA nuas e autónomas» A explicação do invento na secção experimental que se seque será
LSjJbioe, RNA
irusóides λ Ltfn
rtícuias mis-
também i nc 1 ui
dada com referencia -a um vírus de RNA satélite,
Satélite da. Necrose do ιabaco íSiNV), um pequeno vírus de plantas
(1,85 x í®': kD), □ qual para a sua replicação depende totalmente da presença de Vírus auxiliar da Necrose de Tabaco CTNV)» Q genoma de RNA do STNv contes 1239 nucleotídeos e codifica uma proteína tía cápside de 193 ajninoácidos» invento compreende a incorporação de informação genética no genoma de eucariotas por meio de engenharia, genética., informação essa ue não como tal, nem através dos produtos de transcrição derivados dela, constituem uma sobrecarga. para o hospedeiro, s no entanto consegue uma protecção muito eficaz do hospedeiro contra, in fecções virais ou permite uma. produção muito eficaz, induzível ou epecífíca de tecido, de proteínas (ou •peptídeos) ou RNAs estranhos. A informação genética s. ser incorporada de acordo com o invento compreende uma cassete de expressão para, o hospedeiro e. ser transformado contendo duas sequências de nucleotídeos sendo repetições invertidas, de Í2-25Ô pares de bases de comprimento com pelo menos uma sequência de nucleotídeos entre elas a qual deriva, de um vírus de RNA que paras a sua. replicação está dependente de uma RNA/RNA-polimerase virai, a referidas sequência, derivada, ds vírus de RNA compreendendo ' pelo menos elementos cis para a replicação, mas sem genes que codifiquem a proteína da cápside virai.
D genoma dos vírus de RNA que para a suas replicação está dependente de unias RNA/RNA-ροΙimerase virai compreende vários elementos -cis, i.s. elementos ou funções que funcionam apenas para o ácido nucleico que os codifica, como sejam elementos estruturais do ácido nucleico» Para além dos elementos cis para a replicção (incluindo em qualquer um dos casos o sítio de ligação de uma RNA/RNA-polimerase) □ genoma dos vírus de RNAgeralmente também inclui elementos cis para o transporte (o sítio de ligação de proteínas de transporte), elementos cis para o empacotamento do ácido nucleico em invólucro fagicos para formar partículas
virais e elemntos cis para a tradução de RNA mensageiro em proteína, s<« particular proteína de revestimento, São exemplos de elementos trans do genoma. dos virus de RNA os genes que codificais a proteína da cápside, proteína de transporte s RNft/RNA-polimerass.
Um elemento essencial do invento é que a cassete de expressão incorporada no gsnoma do hospedeiro conduz á transcrição da sequência derivada, do virus de RNA para formar uma molécula de RNA mensageiro com uma estrutura em cabo de frigideira» Não são estabelecidos requesitos específicos para os elementos da cassete de expressão que regulam esta transcrição» como seja em particular o promotor da transcrição» D promotor pode ser e em muitos casos seá mesmo preferencialsente, usí promotor relativamente fraco de tal forma que o hospedeiro não será virtualmente prejudicado por esta transcrição e pelos produtos de transcrição formados no processo» São conhecidos promotores adequados para muitas organismos. Naturalmente a cassete de expressão deverá compreender também um sítio de poliadenilação adequado, enquanto a cassete de expressão έ delimitada em ambos os extremos pelos chamados sítios de integração que permitem a integração no genoma do hospedeiro pretendido»
Várias experiências demonstraram que uma expressão com êxito no hospedeiro da informação genética incorporada no genoma requere a presença de duas sequências de nucleotídeos que são repetições invertidas de í2-250 pares de bases delimitando o DNA entre elas» Estas sequências de nucleotídeos de repetições invertidas podem por exemplo consistir em pares de bases d8~dC ou pares de bases dC-dG« 0 facto da presença das sequências de nucleotídeos de repetições invertidas conduzir á replicação e expressão em células infectadas do hospedeiro, é explicado como sendo devido â formação de moléculas, de RNA com uma estrutura
estabilizadora em cabo de frigideira íver Van Emroelo et al. ;i Vírology Í5’7, 1987, 480-4871. Para este- fim é necessário que as sequências de nucleatídeos das repetições invertidas tenham um comprimento de pelo mepos 12 pares de bases. No entanto, de preferência., as sequências de nucleatídeos das repetições invertidas tem um comprimento de pelo menos 15 pares de bases. As sequências de nucleotídeos das repetições invertidas com um comprimento superior a 250 pares de bases- não são muito práticas. Preferencialmente não têm mais da 5Ô pares de bases.
Uma outra característica essencial é a ausência da RNA/RNA-polimerase Cou replicase) ou do gene que a codifique, de tal forma que a quantidade de RNA mensageiro especifico do vírus de RNA presente nas células do hospedeiro devido à transcrição não aumente mais. Guandoa sequência derivada do vírus de RNA a ser incorporada deriva de um vírus satélite, como seja STNV, estes requesitos estão automátícamente satisfeitos pois o genoma do STNV não contem um gene de RNA/RNA-palimerase <o que explica o motivo pelo qual os vírus satélites dependem de um vírus auxiliar para a sua replicação, o qual proporciona a RNA/RNA-palimerase n ec essá r i -a í =
De acordo com o invento é ainda de grande importância que não seja produzida proteína da cápside virai e que a sequência derivada do vírus de RNA não contenha um gene que codifique a proteína de revestimento virai.
Finalmente· é também essencial de acordo com o invento que o RNA mensageiro derivado de vírus de RNA contenha pelo menos os elementos que na presença de RNA/RMA-polimsrase permitem a reolicação. Por outras palavras, deverão estar presentes pelo menos elementos eis para a replicaçSo. Dependendo do objectivo a atingir, poderá ser desejável que estejam igualmente presentes ϊ; .¾.
outros elementos do genoma virai. protecção do hospedeiro contra as que a. informação genética incor também contem elementos eis para
invento que a ssquSne
1 ado s não
la der Ivada de vírus
3o cor rsc ta com sent
p«ra a urientaçao das out? as sequências do gsnoma sxtuadas entre as sequências de nucleotídeos das repetições invertidas, tais como uma. sequência codificadora de uma ribozima s uma sequência codificadora de uma proteína/peptídeo estranho. Pelo facto de acordo com o invento poderem ser escolhidas orientações com sentido e anti—sentido, A possível conseguir um máximo de protecção em condiçSes normais sem infecção e uma reacção adequada no C «t ~· O O 3. X Π Γ ·£?££ -5.0 aporeiona um DMA recom— nucleotídeos de repeti— de comprimento estando cleotídeos que deriva de estã dependente de uma 'ência derivada de vírus eis para a repiicação., ntsrass e sem qene que
X n
Assim o invento, basicamente pr binante, compreendendo duas sequências de
íyijCí» invertidas de 12-25$ pa? es de bases
íí? ΐϊ c. r s1as pe lo menos uma ssquência de nu
UiTí ví rus de R NA que para a sua repl .1 ca ção
RNA/RNA polimerase virai, a referida sectu da RIMA compreendendo pelo menos elementos mas sem gene que codifique RNA/RNA-poli codifique a proteína de revestimento vira
Parai ser.empregue, o DNA recombinan invento deve ser incorporado numa cassete de hospedeiro ser transformado permitindo que a lugar no hospedeiro de modo a formar uma moléc te de acordo cora o expressão para um transe riçSo ten ha ula tíe RNA com uma estrutura, em cabo d e f r i g i d e i r a«
9'
.. rDe preferência, num DMA recombinante de -acordo com o invento a sequência derivada do vírus de RIMA contem elementos cis para a replicação e elementos cis para o transporte.
invento inclui ainda uma molécula de DNA recombinants ---> em que a sequência derivada do vírus de RNA também compreende elementos cis para o empacotamento na proteína de revestimento e DNA recombinante em que a sequência derivada do vírus de RNA também compreende elementos cis para a tradução. No entanto no caso das utilizações em que estas funções desempenhem uma função, eles devem estar ,de preferência, ausentes- pois podem ter um efeito adverso na eficácia de replicação do RNA formado pela transcrição. Isto é verdadeiro particularmente para a utilização do invento na protecção contra vírus. Esta é um dos motivos porque não pode estar presente nenhum gene que codifique proteína de revestimento virai. De um modo semelhante, de preferência, não estão presentes quaisquer outros elementos trans desnecessários, tais como um gene que codifique proteína de transporte virai.
Assim nas realizações mais preferidas do invento a sequência de DNA derivada do vírus de RNA, presente no DNA recombinante, corresponde a um repicão virai nu que sem ajuda externa (como seja a infecção com um vírus auxiliar) é incapaz de se multiplicar e mover-se activaments para outras células do hospedeiro, e que não codifica qualquer outra proteína virai. Tal replicão virai substancialmente nu, apresenta no entanto, na presença de RNA/RNA-~polimerase uma replicação muito mais eficaz — do que o gersma virai completo. £ isto que torna útil o DNA recombinante de acordo com o invento para a protecção do hospedeiro contra infecçSes virais. Assim, quando se dá uma infecção do hospedeiro geneticamente modificado, por um vírus de RNA com a RNA/RNA-polimsrase importante, o número de moléculas de RNA derivadas de vírus de RNA que já estão presentes nas células do
-g.
hospedeiro aumentará rápidamente e ao mesmo tempo aumentará -a RMA/RMA-polimsrase è custa da multiplicação do vírus infeccioso» Assim, o replicSo subst.ancialm.ente nu tem uma vantagem importante relativamente ao genoma virai completo na batalha pela RNA/RNA--polimerase disponível» Esta vantagem pode ser ainda aumentada quando a sequência derivada do vírus ds RÍMA incorporada no genosa do hospedeiro também contem elementos eis para transporte, devido ao facto de de então também a proteína de transporte do vírus infeccioso, responsável pela expansão da infecção a outras células do hospedeiro, ser apropriada! pelas moléculas de RNA derivadas do vírus de RNA aumentando rapidamente, as quais derivam do DMA incorporado»
Uma realização preferida do invento, que diz respeito a tal utilização para a protecção do hospedeiro contra infecçoes virais, consiste era DMA recombinante, no qual entre as duas sequências de repetições invertidas, alem da sequência derivada do vírus de RNA, também está presente pelo menos uma sequência ds nucleotídeos que codifica uma ribozima que pode cortar o RNA ou mRNA virai»
Quando no caso de uma infecção virai por um vírus que fornece a RNA/RNA—poIimerase em questão, a ser referida daqui em diante como um vírus compatível, o RNA derivado do vírus de RNA presente nas células do hospedeiro a ser atacado é ràpidamente multiplicado, neste! realização preferida a quantidade de rifoozíma presente com especificidade para o vírus infectante é também aumentada simultaneamente» Esta ribozima cuida da destruição activa do RNA do vírus infectante ou do RNA mensageiro derivado dele»
Para mais informação sobre a estrutura e acção das ribozimas, é feita referência á Nature 334, página Í97, 1988»
Para mais informação sobre s formaçâo-^-propnedades de replicões substancialmente nus, ê feita referência a Perrault, Current Topics in hicrobiol» and Immunol. 93, 1981, 152-209? Lazzarini et al = , Cell 26, 1981 , 145-154? íMayak, Ann» Rev» Microbiol. 34, 198©, Barrstt e Bimmock, Current Topics in Microbiol» and Immunol» 128, 1986, 55-84? nRNA genetics8*, 1989, E« Domingo et al», Eds», CRC Press, Boca Raton, Florida? Strauss e Strauss, Current Topics in Microbíol. and Immunol» 105, 1983, 1-89» Ali eles são designados como “vírus/partículas/RNfts interferentes defectivos8’» Um replicão altamenie defectivo de um vírus de RNA pode ser obtido por exemplo através da infecção de um hospedeiro adequado com RNA virai nu, isolamento do RNA virai replicado e sua utilização para uma infecção subsequente» Assim a necessidade de uma proteína de revestimento é eliminada artificialmente, como resultado disto formam-se mutantes de delecção que já não têm um gene da. proteína de revestimento» Outras repetições deste processo, sempre na presença de uma pequena quantidade adicionada de RNA deste mutante para a proteína de revestimento, também pode ser isolada RNA que deixou de ter gene da RNA/RNA-poIimerase (devido ao facto de o RNA adicionado proporcionar a RNA/RNft-polimerase necessária, também os mutantes de delecção de RNA/RNft-polimerase sofrem replicação)» No entanto são também possíveis outros métodos de preparação, como seja um método em que as células ou tecidos com uma dose de partículas, virais muito elevada í ICO ou mais por célula) são infectadas e isolados os mutantes de delecção de RNA? ou um método em que células ou tecidos são infectados com lotes de vírus, os quais contêm vírus satélites ou virusáides e isolados os mutantes de delecção? ou um método em que um subgenoma é isolado a partir de virus de RNA com um genoms bipartido ou tripartido (ou, de forma mais generalizada, polipartido)§ ou um método em que as células ou tecidos, que produzem uma RNA/RNA-polimerase são infectados com RNAs virais, facultativamente já com uma delecção parcial e ϊίΠ ÇjLliz? bo-HO iSXlSS manipulações genéticas dirigidas no cDNA de um RNA virai, satélite ou virusóide» invento tem vantagens importantes relativamente aos métodos anteriarnsenfce propostos para protecção de organismos hospedeiros eucarióticos contra infeccões virais, tais como a formação de RNA virai anti-sentido Uanti-sense») -para bloquear o RNA mensageiro virai (ver por exemplo Cuozzo et ah, Biotechnology õ, 1933, 549-557 revestimento (ver ariqo citado d-s Cuqzzo et al e Hoekama et , 1989, 273-2795, ou a satélite virai (ver EP—A—02420165. 0 invento esta sujeito a menos limiaçoes oo que os metooos de protecção de Vírus conhecidos. Ror exemplo, o invento não está limitado a vírus de que se conheça um „, Bxotechnology roí· maçao de íxNh sentido· ou “anti-sentido” (o RNA derivado ds
e conneç a um
de DMA com
rus de RNA
entação coai
sentido como na anti-sentido as funções trans da replicação e possivelmente transporte do vírus infectante), 0 invento também □farcCS ííiêtito pos-sibjL 1 id-sdê?1-CCusQ S*SJ õ?. -5, pOto-tõ.1.Ij.Í. Λ .1.C p~u-& ss conasçmr niaxor sTicacj.a? XnCOí™pOr£iΓ Ufôíã OLi íii-SXí» totíOLtoíD5. 2.âS ÓS ribozima. O invento combina uma pequeníssima possibilidade de perturbação do hospedeiro protecção do- hospedeiro em e uma altíssima, -possibilidade de condicões de não infeccão com uma reacção extremamente rápida e eficaz -assim que lá uma infeccão por um vírus compatível, reacção essa que d-à ao hospedeiro a protecção necessária contra o vírus, exclusivamente nos sítios onde é necessário, A protecção que o invento oferece é de carácter permsnsnte uma vez que ela é integrada no genoma do hospedeiro e, devido a ser uma perturbação muito pequena do hospedeiro, não exerce virtualmente pressão selectiva» Uma protecção simultânea de do hospedeiro contra vários vírus diferentes é uma possibilidade real de invente pele facto de'· éiajhfSo constituir virtualmente uma perturbação-extra para o hospedeiro, i.e. o hospedeiro quase que nSo necessita de qualquer energia Ca transcrição do DNA inserido requere -apenas muito pouca energia, enquanto na realização preferida não está envolvida tradução parai proteína). De acordo com o invento as sequências das repetiçSes invertidas podem conter várias sequências diferentes específicas de vírus de RNA), s/ou várias sequências diferentes de ribozímas íuma sequência de ribozima que é específica para um primeira vírus, uma sequência de ribozima que é específica paira um segundo vírus, etc.). Naturalmente, no entanto, estas várias sequências diferentes específicas de vírus de RIMA e várias sequências diferentes de ribozimas podem também ser incorporadas cada uma entre duas sequências de repetiçSes invertidas. Nos métodos conhecidos de protecçSo contra vírus tal protecçSo simultânea contra diferentes vírus ê dificii devido às grandes quantidades de entidades que conferem protecçSo, as quais devem ser produzidas continuamente no hospedeiro para assegurar protecção eficaz, constituírem, pelo facto de serem prejudiciais, uma desvantaqem serem negativos para, o seu crescimento e desenvolvimento.
A—- proprxedaces atrás referidas do DIMi-í rscuisbinante de acordo com o invento são também responsáveis pela sua utilidade no que respeita aos métodos de produção de peptí-deos/proteínas e RNAs estranhos usando orqauismos procariotas e particularmente
DNA recombinante de acordo com o invento em que entre as duas sequências de nucleotídeos de repetições invertidas, além da sequência derivada do vírus de RNA, está presente uma sequência de nucleotídeos não virai que codifica um ou mais RMAs, e mais particularmente DNA recombinante de -acordo com o invento em que a sequência derivada do vírus de RMA compreende pelo menos elementos cis entre as duas das, além da uma sequência peptídeos/
para a repliceção e elementos cis para a tradução e sequências de nucleotídeos das repetições inverti— •equéncia derivada do vxrus de RNA, está presente de nucleotídeos nâo-viral que codifica um ou mais í te s. nas,
Devido às oropriedad’ nante de acordo com o invento quantidade neglígivel dos RNAna ausência de RIMA / RNA-polimerase iquanto na presença de ’S atrás referidas do DMA recombio hospedeiro produz no máximo um-a • ou proteínas/peptídeos estranhos
RNA/RNA-pol imerase se dá. um o que resulta numa produção tídeos pretendidos, Esta em quaíquet aitura aumento acentuado do RNA mensageiro, considerável dos RiMAs proteinas/peproução muito forte pode ainda ser selada ou ser limitada a tecidoí específicos do hospedeiro pela regulação d ~po1imerase, presença da
RNA/RNAUma produção induzivel pode por exemplo ser conseguida através da infecção do hospedeiro geneticamente modificado (ou células hospedeiras numa cultura celular, por exemplo) com um vírus compatível no momento pretendido. Mo entanto, normalmente, este método, não será preferido pois é trabalhoso, a eficácia da in i eCçao pode ser muito variável, a infecçao geralmente tem lugar á custa do hospedeiro (sendo uma possível consequência a destruição do produto pretendido) e/ou a utilização do vírus envolve riscos. Uma outra opção, mais a escolhida para se conseguir uma consiste numa dupla transformação da hospedeiro possui não só o DMA acordo com o invento como também .rectiva, que pode também ser pFuudÇcíu esueciTica as tecido do hospedeiro, em que o genoma recombinante atrás descrito de tem DNA recombinante compreen— dsndo informação genética uma construção de RNA/RNAexpressão induzivel ou esps
par& um RNA/RNA-pol
Όθ1 3. pr*S5:-t~'íl ’C£?
2. τ í.cí·, d© tecido. Com
Imerase virai •«uma cassete esta finalid ou oe ·- 1 ρ
pade-se fazer usa de promotores bem conhecidos induzíveis Cpor ou agentes químicos tais como 1 , exempla pe.io caiar,
V .—· radiação UV ãcxdo saixcxlxcoí ou especiTxcos de tecxtío vpar exemplo patatina para expressão nos tubérculos da batateira).
A frase informação genética para uma RNA/RNA-polimérase“ refere-se às construções de genes que podem ou não codificar uma outra RNA/RNA-polimerase. Uma possível construção de genes consiste, por exemplo, numa mutação através da qual um codão de paragem interno facultativo que possa ocorrer nos genes codificadores de RNA/RNA-polimerase, é substituido por uma sequência não mais reconhecida como codão de paragem. Uma outra possibilidade é uma construção genética que consiste numa fusão de diferentes genes de RNA/RNA-polimerase, naturalmente com a mesma opção atrás referida de usar uma mutação de um codão de paragem interno.
u invtínto ιοί axnda realxzado em cêiulas eucariotica.s ou procarióticas ou organismos que por meio da engenharia genética são dotados de DMA recombinante de acordo com o invento e facultativamente, através da engenharia genética, são também datados com DMA recombinante compreendendo informação genética para uma RNA/RNft-polimerase virai ou uma construção de RNfi/RNft—polimerase numa cassete de expressão induzivel ou específica de tecido.
invento ê ainda posto em prática num método de protecção de organismos eucarióticos, em particular plantas, leveduras e fungos, contra um vírus de RMA que para a sua repli— cação seja dependente de uma RMA/ENA—,οοΙimerase virai fazendo uma manipulação genética do organismo a ser protegido, compreendendo a Incorporação no genoma deste organismo wue numa, cassete de expressão activa compreende duas sequências de nucleotídeos de repetições Invertidas, com 12—250 ssrss de bases de comprimento,
tende entre elas uma sequência de nucleotídeos derivada de vírus de RIMA, esta sequência derivada de vírus de RNA compreendendo pelo menos elementos cis para replicaçSo, mas nenhum gene que codifique RNA/RNA-po1imerase virai e nenhum gene que codifique proteína de revestimento virai,·
De preferência, neste método a sequência derivada do vírus de RIMA compreende elementos cis para a replicaçSo e elementos cis para o transporte. A sequência derivada do vírus de RNA pode ainda, compreender elementos cis para o empacotamento na proteína de revestimento e elementos cis para a. tradução»
Preferencialmente, neste método, entre as duas sequências de nucleotídeos das repetiçSss invertidas, além da sequência derivada de vírus de RNA,. possui pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma ribozima que pode cortar RNA ou mRNA virai.
invento pode ainda ser posto em prática num método para a. produção induzível de u.m ou mais proteínas/peotídeos por cultura de um organismo procariótico ou sucaríótíco, ou células de um organismo procariótico ou eucariótico, organismo esse que através de engenharia genética, é dotado com DNA recombinante que numa cassete de expressão acitva compreende duas sequências de nucleotídeos de repetições invertidas, com Í2-250 pares de bases, tendo entre elas uma sequência, de nucleotídeos que deriva de vírus de RNA, o qual para a sua replicaçSo depende de uma RNA/— RNA-polimerase virai, esta sequência derivada de vírus de RNA compreendendo pelo menos elementos cis para replieação e elementos cis para tradução, mas nenhum gene que codifique RNA/RNA-po— limerase virai e nenhum gene que codifique proteína de revestimento virai e estando situada entre as duas sequências de núcleo— tídeos das repetições invertidas, além da sequência derivada de
3.7
virus de RNA. uma sequência d-s nucleotídeos não virai que codifique ume ou mais proteínas/peptídeos e infectando os organismos ou suas células com o vírus.
é no entanto preferível um método de produção num modo induzível ou específico de tecida de um ou mais protéinas/peptídeos através da cultura de um organismo eucariótico cujo genoma, através de manipulação genética, incorpora DMA rscorobinsnta que nu.ma cassete de expressão activa compreende duas sequências de nucleocideos de rspetiçoss .invertidas, com i2 z^o0 pares oe bases de comprimento, tendo entre elas uma sequência de nucleotídsos que deriva de vírus de RNA o qual para a sua replicação está dependente de uma RNA/RNA-polimerase virai derivada de virus ds RNA tendo pelo menos replicação e elmentos cis par com esta sequência
Lementos cis oara a a tradução, mas nenhum gene que codifique RNA/RNA-polimerase virai e nenhum gene que codifique proteína· de revestimento virai e estando- situada entre as duas sequências de nucleotídeos das repetições invertidas, para além da sequência derivada de virus de RNA, uma sequência de nucleotí— deos não virai que codifica um ou mais proteínas/peptídeos, assim como DMA recombinante que compreende informação genética para uma construção de RNA/RNA-polimerase numa cassete de expressão induzível ou específica de tecido.
O inventa pode ainda ser posto em prática num método de produção induzível de um ou mais RNAs, como sejam ribozimas, RNAs an ti-sentido e RNAs de cadeia dupla., através da cultura de um organismo procariótico ou eucariótico ou de células de um orqa~ xótico? organismo esse que através de >tado com DNA recombinante que numa
p roç- ariótico ou ; eu·
aria qenética foi
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• de repetições inv<
__Ί _ —
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ieotiúsos que deriva de vírus dc i8
KHA o qual para a sua replicação está dependente de uma RNA/RNAb polímeras© virai, esta sequência derivada de vírus de RNA cospreendendo pela menos elementos cis para a replicaçãomas nenhum pene que codifique RNA/RNA—polimerase virai e nenhum gene que codifique proteína de revestimento virale estando colocada entre as duas sequências de nucleotídeos de repetições invertidas, além da. sequência derivada de vírus os RNA, uma seuqsncia de nucleoti deos não virai que codifica um ou mais- RNAs e infectando o referido organismo ou suas células com o vírus.
No entanto, é preferido um método de produção, de modo inducível ou específico de tecido, de um ou mais RNAs, tais como ríbozimas, RNAs anti—sentido s RNAs de cadeia, duo
CUILlVSnGD en q en ha r i a
a. t r a. v e s de um organismo eucariótico, cujo genoma, genética, incorpora DNA recombinante que numa cassete de expressão activa compreenda duas sequências de nucleotídeos de repetições invertidas tendo entre elas uma sequência de nucleotídeos que deriva de vírus de RNA o qual para, a sua replicação esta dependente de uma RNA/RNA—polimerase virai, esta sequência derivada de vírus de RNA compreendendo pelo menos elementos cis para a replicsção, mas nenhum gene que codifique RNA/RNA-polimerase virai e nenhum gene que codifique proteína de revestimento virai e estando situada entre as duas sequências de nucleotídeos de repetições invertidas-, além da sequência derivada do vírus de RNA, uma sequência de nucleotídeos não virai que codifica um ou mais RNAs, assim como DNA recombinante- que compreende informação genética para. uma. RNA/RNA-polimerase víralou uma. construção de i-CMM/RNA—ραΙ imerase virai numa cassete de expressão índuzível ou específica de tecido.
Assim, o invento pode ser usado no sentida lato para a produção, em eucariotas ou células eucarióticas, de um ou mais produtos tais como proteínas, oliqo e polinucleotídeos, oliqo e \'' ' ...
polipeptídeos, enzimas, anticorpos, substâncias antigênicas, compostos antivirais, substâncias anti-tumorais, hormonas, vitaminas, fármacos, metabo1itos primários e secundários.
Um outro aspecto do invento, ê DNft recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma RNA/RNA-polimerase virai ou uma construção de RNA/RMA-polinerase.
Mais particularmente, de acordo com uma realização preferida, o invento proporciona tal DNA recombinante compreendendo a parte da sequência de nucleotídeos mostrada na Fig. 4 que codifica uma RNA/RNAi-pol imerase virai ou construções derivadas dela, como seja um mutante de substituição que tem a sequência TAT em vez da sequência TAS nas posições 656-658 de acordo com a numeração usada na Fia.-. 4 e mu tantas de substituição em que uma parte da sequência mostrada na Fig. 4 foi substituiria por uma parte correspondente de um outro gene que codifica uma RNA/RNA-po 1 iaiersse vi ral»
Tal DNA recombinante em que a sequência de nucleotídeos que codifica uma RNA/RNA-polimerase virai ou uma construção de RNA/RNA-polimerase está situada numa cassete de expressão induzivel ou específica de tecidoconstitui ainda uma outra realização preferida do invento.
D invento será agora explicado nos Exemplos que se seguem.
Exemplo I ilustra como plantas do tabaco podem ser -protegidas contra infecção por TMv através da. transformação com um replicão derivado de STNV. 0 replicão derivado de- STNV é um replicão altamente eficaz que não codifica uma proteína e em condições- de não infecção é produzido apenas numa quantidade
muito 1 imitadaH i«eB apenas se da uma transcrição traça oo una λ s . » t. .. . t * t I- - . .* ti cá com TNV, o qual codifica uma. RNA/RNA-polimerase que é capaz de multiplicar o rsplicão derivado de STNV, dá—se reprodução massiva do replicão derivado de STNV, independentemente da. informação de STNV ser incorporada no genoma na orientação com sentido ou anti-sentido» Como resultado, a. planta, é protegida, contra o vírus iníectante» Esta protecção é muito mais eficaz quando o DNA incorporado no qenoma. também compreende a informação para, uma rihozima que é dirigida contra» mRNA mensageiro da proteína de revestimento de TNV»
D Exemplo II ilustra como o invento pode ser usado para se conseguir uma. produção induzív-el de uma. proteína estranha» Como modelo para esta finalidade seieccionou-se o gene da beta-glucurortida.se de E» coli, o qual foi fundido com o codão de iniciação da proteína de revestimento de STNV» No Exemplo dado a expressão foi induzida por infecção com TNV de plantas do tabaco transformadas«
Exemplo III descreve o isolamento do qene da replicase de TNV e a construção de um plasmídeo pSPTNV rep-1, o qual contem este gene da replicase»
O Exemplo IV descreve experiências de expressão em que foi efectuada amplificação do RNA mensageiro por contaco com a replicase de TNV» 0 replicão virai continha como DNA estranhe» uma fusão de uma parte do 'gene que codifica a proteína de revestimenuu virai de oíNV e o gene da cloranfenicol—acetil—transTerase CCAT) de E» coli» •1'
Exemplo I
a) Plasmídeos recombinantes
Partindo do plasmídeo j
et al» em Virology 1 o 7, 4tí0— 4tí7
novos mutantes de inserção» 0 pl<
do com Rsa1» o qu al tem 9 síti<
,através da incubaç ão a 28*C com
durante Í5 min« A ligação com o ;
descrito por Van Emmelo et ai»?
atre outras coisas , ao mutante di
contem o adaptador com o sitio i
do- genoma do STNV»
A partir deste mutant
x π —· £: r ç o pBH & T N V N198, N322 e E
CDnsiruiu-se uma serie
U-L.-A I ΰΟϋΗΗ í í UT O de STIMV 5 pg de DNA gros como conduziu, 2» o qual síi-Sn 1ΛΟ et al„, todos eles contendo a inserção interferente na grelha de leitura do adaptador de 14“iseros, atrás referido, no gene codificador da proteína de revestimento, construiu-se mutantes com umas grelha de leitura recuperada» Com este fim a inserção de 14-meros foi convertida numa inserção de ÍS-meros cortando com Ncol» preenchendo os extremos de cadeia simples com encima Klenow na presença dos quatro dhHPs e novamente a inserção de 14—meros foi convertida ligação do plasmídeo» Assim na inserção de IS—meros que se segues 55 TCCATGuATGGGAATTCT 35 na qual o sítio Nçql CCCATGG) foi substituído por um sítio Nsií (ATSCAT)« Assim» foram obtidos
64, Ν2Θ0, W324 til f— ζ*“» .**».*’«
i-Jfcf revestimsnto com ma is 6
aminoácidos»
Construiu-se amda o mutanie de dupla inser^Su pBK 55’iNV N164NS43 por isolamento do fragmento EcoRV do oBRSTNV N843 das bases 198 a 882 no genoiRa da STNV e substituindo-o pela correspondente fragmento EcoRV do pBR STNV NI 64»
A partir dos mutantes da inserção de 18-meros pBR STNV NI64 e N200 construiram-ss os mutantes pBR STNV SÍ64 e S200 por inserção de um adaptador adicional de 18 bases como fragmento NsiI no sitio NsiI da inserção ds iS-merass em SI64s 5’ TCGATGCAATCGAGGGTAGGCATGCATGGGAATTCT 3’ em S2@@s 5? TCCATGGATGCCTACCCTCGATTGCATGGSAATTCT 3’
Estes mutantes têm uma inserção de 36 bases e codificam teóricamente uma proteína de revestimento mais curta como resultado de uma mutação na grelha de leitura no caso de SÍ64 e uma proteína ds revestimento com mais 12 aminoácidos no caso de S200»
Ao inserir-se o mesmo 18-meros no único sítio NsiIno extremo do gene da proteína de revestimento íbase 613), obteve-se o mut,ante pBR STNV S613»
Na local do sitio Rsal na posição 162 inseriu-se um adaptador de 30 bases de modo semelhante ao descrito atrás para o adaptador de 14-meros» Na grelha de leitura assim formada este adaptador codifica o neuropeptídeo bratíiguíninas
5:i GCGSCCGCCCGGGTTTAGTCCTTTTAGGTT 3?
ArgProProGliFenSerProFenArg
Esta inserção foi designada pBR STNV Brad»
A partir do pBR STNV N164 fez-se □ mutante de delecção pBR STNV Dl por delecção de umíragmento NsiI de Í67 a 631» □ genoma deste mutante tem um comprimento de 793 bases comparada com 1239 para STNV tipo selvagem»
Para estudos de expressão sm E. coli as várias construções STNV foram transclonadas como fragmento PstI em pPLC 2820»
Os cortes com a enzima de restrição PstΣ precisamente no extremo das regiões poli SC que ladeiam os extremos 5’ s 35 de STNV, Estas construções sní pPLC282© foram designadas por pRLC, seguido do nome do mutante STNV, ainda seguido de =1 quando o extremo 5’ do genoma da -STNV se junta ao promotor pPLC 2S20 ou de »2 quando o extremo 3’ se junta ao promotor. Assim o plasmideo pPLC STNV N 164.1 é o plasmideo coei o mutante N1&4 clonado em pRLC 282©.-, com o mutante STNV sendo inserido no plasmideo de tal forma que quando da transcrição por pL o equivalente ao RNA gent cadeia positiva do STNV é feito como mRNA.
Os mutant.es de STNV clanados como fragmento pRLC 2Θ20 são precedidos no extremo 5* por um sítio Saí extremo 3? seguido de um sítio Sa11. Uma vez que nem SThb mutantes derivados dele, contêm um sitio BamHI ou um sitio 5a 11 as diferentes construções podem ser trane-c lonadas como um fragmento BamHI/SalI em pPCV 52@ (Fig. 1) a seguir ao promotor vegetal pTRl5„ Os plasmídeos assim obtidos foram designados pPCV, seguido do nome do mutante STNV, ainda seguido de ,í quando o extremo 5’ ε de .2 quando o extremo 3’ de STNV è voltado para o promotor pTRl’« Os derivados pPCV foram usados para transformatabaco como parte de um sistema vector bináHoekema et al», em EMBO Journal 3, 2485 ití et al, em tiol. Gen. Genet, 202, 125 íerivados de pPCV 520 funcionaram como o SiRídeo que contem o T—DNA que é integrado As propriedades
Cu de
-L. T • u 1
e no
neni CS
ções de plantas do
rio, como descrito p-
(1584) e por De r r<
(1988). Os plasmideo
plasmideo T í ι, e, o |
no genoma da planta
mais impor tantes de ]
--- ReplicaçSo de ColEl em E.cali, o que o torna adequado para usar em todas as estirpes correntes de E. coli e que o torna um 1
p.iaSiii5.q&í_f muiticópias (preparação de &f í c iente)
DNA a1 analise de clones
----resistências ba.ct.eria.nas contra os antibióticos arapicilina e cloranfenicol
--- a origem de reqlicsção tipo P de pRK2 é aotiva em E. coli e em Aqrqbaçterium, desde que o gene trfa de RK2 seja expresso (ainda em Agrobacterium a. selecção é necessária à estabilidade) ---a origem de transferência tipo P do pRi<2 permite uma. transferência eficaz do plasmideo das estirpes em que os genes pRK2 traí, tra2 e tra-3 são expressos (para E. coli é este o caso para a estirpe 5M10 e para Agrofaacterium para estirpes que contêm o plasmideo pMPRORK)
---- as sequências delimitantas do Ϊ-DNA delimitam todos os elementos do vector que são importantes em plantas
------ o gene de resistência à canamicina NPT-1I sob o controle do promotor vegetal pTR25 permite a selecção de plantas transformadas
------ o gene da octopina sintetase no ΊΓ-DNA torna possível confirmar a transformação de plantas resistentes à. canamicina usando síntese de octopina
-------- os promotores vegetais constitutivos pTRÍ 5 e pnos, são seguidos dos sítios de restrição únicos para Sa1I e BaraHZ e para Bq.ll' e Bc 11. respectivamente e das sequências de poliadenilação dos genes 7 e 4 do T-DNA, respectivamente
---retroclonagem das sequências de T-DNA das plantas transformadas ê simplificada pelo oriV de pBR322 e resistência à ampiciíina no T-DNA.
□ plasmideo T pPCV 52®, pode portanto replicar—se em E. coli e em Agrobacteriu.m. Ds passos de clonagem para a introdução dos rautantes ST1MV neste vector podem ser efectuados sm E. coli.. Em seguida, por conjugação, c- vector ê transferido de E, coli SMÍ® par fiqrobacterium estirpe GV3Í®® ípMPORK), a qual é usada para a transformação de plantas. 0 plasmideo pKPRORK (Fig.2? ver Koncz e Schsll, Hol. Gsn. Genst204, 1986, 383—396) funciona
como plasmideo ds virulência» bis deriva do plasmideo nopalina por (í) uma mutagénese combinada de delecção e inserção, conduzindo a uma delecção completa do í—DNh e -a incorporação de um gene de resistência á gentamicina (a construção assim obtida foi designada como pKP5?©) s (2) a inserção de um fragmento do plasmideo tipo P pRK21©3 contendo os genes de resistência ·= canamicina, os genes actuando em trans para a transferência e replicação dos plasmídeos- tipo P e a origem de transferência tipo P (Figurski e Helinskir, PNkS USA /6, íi-ití (ív/955= As propriedades mais importantes deste plasmideo oHP9©RK (ver Fio» 2) sãos —— uma repiicaçao estável apenas em eiqrogecfor mm
------ compatibilidade com plasmídeos tipo P
-—— gjs codifica todas as funções de virulência de li que sSo necessárias e suficientes para a integração do T-DNA no genoma de tn s f o r maç ão de resistência à gentamicina e à canamicina sao fáceis de ssisccionar
plantas d u rance a tra n-~-‘
ele contem oGne-õ □ G?
como !83! rc as gen- éticas Ψ
------- ele C Ο’Π p I EuYiíSn t -i t Γ-31
pSiS. dos ge noí
------ conjuga muito o
í CIPO
ÍÍH sscnicss
A transformação de plantas (tabaco SR1) foi de acordo tiio por ue Biock st : al. em Science
com o método dos •j^eg men tos ÚC iGlhSSj Cp;o:C-U_ Pl. t„U?
a 1 . em EMBO Jou r nal 3, 1681 (1984 5 e por Horsch
«. 49ú ( 1984? n 0 processo foi como se S-Sgus? s
— fazendo inci sScs con uni bisturi as folhas
f er idas e as foi has feridas de fresco fo rara ino
horas com uma diluição de 1/5© de uma cultura madura fresca de Aqrobacterium. Esta foi efectuada em meio líquida MS para plantas Cnv3i.o tís? rtuΓ’ΰΐΞίΚlos &
,.r ?:··?>·..·· foram lavados duas —— em seguida os fragmentos de folhas foram .lavados duas vezes durante 12 horas em meio liquido MS ao qual se adicionou claíorano (500 gg/ffll) ío claforanc é um antibiótico que actua apenas c or» t ra bac tÉr i a s)
------- Cn~ fragmentos de folhas foram, então incubados em meio MS sólido <·*· 0,3% de agar) ao qual se adicionou citoquinina Có-henzi'1 -amínopurina ou ΒΑΡ, 1 mq/ml e au.xina (ácido α—naftaleno acético ou NhA, 0, x mqz xforam aozcxonados numa proporção que promove a formação ds rebentos nos locais das feridas, canamicina (100 Gg/lí para a selecção de rebentos transformadas e claforano para posterior selecção contra a Aqrobacteria transformante
--- após 4 a 10 semanas os rebentos transformados cresceram a partir deste meio os quais, quando estavam suficientemente desenvolvidos? puderam ser trnsferidos para meio sem hormonas onde se desenvolveram oara dar plantas normais com raízes» íz efectuada em fragmentos este reis de folhas e de caules» Coí? esta finalidade os fraqmentos foram incubados em meio MS sólido (* 0,8% de agar) a que foram adicionados a citoquinina SAP (0,5 mg/I) mg/ml) numa concentração e numa proporçãc e a au»íina NAA (1,0 que promove o crescimento de callus»
Para tecido veqetal (cerca de da octopina pequenas partículas de ? mq) foram incubadas durante a noite numa solução de L-arginina 100 mli b piruvato O0 míi dissolvido em meio MS líquido» Após incubação o meio líquido foi removidos o utíC idu ί ux ϊ íáV cí u o en» ίίίϊΖΧ o Ko» ç»i» aaqu x o a o » r e»q men uU vege» tx τ αχ triturado e centrifugado e 3 a 5 p.I do extracto foram separados por electroforese bs papel» Isto foi efectuada em papel Watt/nan 3MM, numa solução de 15% HAc, 5% HCODH e 80% de H«0» Os pontos de octopina no papel foram visualizados sob luz UV aiz-ós uma reacção ίò í> A \ *· ζ' V' »' de coloração com uma mistura fresca de 1 parte'de fenantrenoqui— nona a ©„©2a pcU Lf1 Wa NauH em 60% EiuB, frade com olasmídeos foi sfec — tuada para averiguar a infecciasidade dos mutantes 3TWV. Com esta finalidade feijão frade foi inoculado- com uma mistura de vírus ί-is ifiTecçoBS d auxiliar TÍMV plasmídsos quiméricos de acordo com o método descrito por Van Emmelo.
As análises Northern foram sfectuadas essencialmente como descrito por Van Emmelo. Para a análise das plantas trans— formadas RNA de cadeia simples dupla hSo furma recipitação com LiCl para a electroforese em qel. Para além de géis desnaturantes de glioxal-agarose, foram usados géis desnaturantes de formamida—agarose como descrito por Lachrach et al. em Biochemistry 16, 4743 (1977) e por Maniatis et al. sai Molecular Clonings a Laboratory Manual, Cold Soring Harbor separado por ρ
Labora spring Harbor, N.V
US
IMBS método as amostras de RNA foram primeiro desnaturadas a durante 15 mm numa mistura de
11*” íTi i H «L O ct
Z&Ât 1 rormaldeído a
8,0) como um tarns:
ulfónico CMGPS) í pH 7,0) , Ό mM Na.Ac e 1 mlj
FlectroforssB em ge i T Dl realizada num gel de
20 mM MQPS C pH 7 ,0) , 3 mM Na.Ac e 1 mM EDTA CpH
ío de transporte . 0 rest ante tratamento das
síerência e hi Pri d ação foi efsctuado. como
descrito por Van Emmelo, revestí mento Colheram~se ΐρο
NaCl, tampão pgZml de
As análises Western para a deteccão de proteí: TNV e STiMV foram sfectuadas como se o?
infectadas após do «potter» trituraram-se a 4°C em
3ão fosfato de sódio 10 m.M pH 7,,4 5 f oram e as folha?
PMSF = Us resíduo:
volume n.M pH s celulares , s d i a.s- e usan de PBS (PBS= © que continha eroovxdos
100 por '< centrifugação e as proteínas foram precipitadas'com ácido tricloroacêtico ÍTCA, concentração final 10%). 0 precipitado foi lavado επί etanol, etanoi—eter m«1í e ecsr, seco e ressuspsnso em tampão
Laemmli Ix (Nature 22/, 680-655, 1970) separadas por electrofarsse em 10% PAS ΐ suas· fraccoes 'roram
tran-
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imen
em
PKS pó com baixo teor de tampão de transferência (acetato de sódio em etanol a 20%). 0 filtro foi bloqueado que continha 10% de leite em pó com te incubado com soro coelhos anti-proteína diluído a ís2O0 em PBS, 2% de leite em gordura à temperatura ambiente durante 1 h= 0 filtro foi lavado quatro vezes com PBS, ©,1% Triton X-100 e incubado com anticorpos de cabra anti-coelho marcados com fosfatase alcalina, diluído a ls250 em PBS, 2% de leite em pó com baixo teor de gordura. .Após remoção dos anticorpos não ligados por lavagem fez—se uma reacção de coloração usando Nitro Blue Tetrazolium CNBT) s 5-bromo-4-cloro~3—indolil—fosfato (BCIP), nas condições indicadas pelo fahri— (c) Experiências e resultados (cí) estudos- de expressão em E. coIi NF1
Uma série de plasmídeos pPLC STNV com o genoma de STNV modificado na orientação com sentido ías construções . í) s os plasmídeos ρ-PLC STNV NÍ64.2 e Brad.2 (com a orientação anti—sentido) foram usados para transformar E» coli NF1. Esta estirpe tem uma mutação ts (sensível â temperatura) do gene repressor cí de pL, pelo qual o promotor pL_ foi reprimido quando as bactérias são :ul ti vadas hdoC = A uma temperatura de 42°C o repressor instável e o promotor dá transcrição pL, tJeanoo trs.n 3 sr'á icxss proteína de revestimento, i.e.
Western estudou-se a síntese da
?. presença eu ausência da proteína de revestimento a diferença no tamanho das proteínas codificadas pelos diferentes mutantes STNV. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Ele revelou que
------- os mutantes- STIMV com uma mutação na grelha de leitura C + Í4 ou +36 bases) dá uma proteína de revestimento encurtada cujo comprimento ê tanto maior quanto a localização da inserção estiver mais deslocada para o extremo 3?
--- os mutantes de inserção com uma grelha de leitura recuperada
C+18, +30 ou +36 bases) deram uma proteína de revestimento maior do que o tipo selvagem, enquanto a mobilidade reciproca C + 18 > +30 > + 36) corresponde ao peso molecular mais alto, o que é sperado com base no numero de asiinoâcidos adicionados í+6, +10 e ir) i r i nnarfnç (+6.. -ί·-1 0
---- apenas os plasmídeos em que o STNV modificado é inserido na orientação . 1 relativamente ao promotor, dão proteína de revestimento.
Cc2) infecções com plasmídeos
A menos que de outra for -ma
in f ecç-Ões c 0m ρ1asmíd50 usaram—se os pl.
pSTlMV 4 i 3 foi usado como testemunha pQ'
indicado.
par i £) X ·3.χ>ίΠ X Q-pfCÍ tiva nas infecções para permitir correlação entre as várias experiências. Como testemunha negativa usou-se pSR STIMV N843, o qual foi préviamente estabelecido como deficiente para a replicação.Quando se observaram sinais muitos fracos ou não se observaram quaisquer sinais após infseção primária, as infecções secundárias com extractos ds RNA foram sfectuadas- em feijão frade para se obter RNA e sinais proteicos mais claros.
*ϊ
Na análise do material foliar inoculado a síntese da a do RNA por transferência Northern, para o RNA seoarou-se RNA de cadeia simples e de cadeia dupla e a sua presença foi determinada secaradaiBente. Ds resultados estão também resumidos os Tabela 1» Ela revela que
----dsRMA (RNA de cadeia dupla) está. presente em todos os mutantes com uma .inserção no gene da proteína de revestimento e está, ausente apenas nos mutantes com uma inserção na. posição 643 a proteína de revestimento e quantidades normais ssRNA
ÍRNA de cadeia, simples) foram apenas encontrados nos mutantes Ml64,, M2ôô s Brad
------ nos, mutantes de inserção em que não foi encontrada, qualquer piantas oamoêm concem muito menos proteína de revestimento, aí ssRNA
------- a5 proteínas de revestimento que foram proouziaa rf f·'·mutantes NlòT,, N2O0 e Brad nas plantas e em h comprimento igual.
coli NR! t@m
Através da hibridaeão com cadeia (com um RNA SP6 produto da transcrição ?spec 11 íca o e de STNV ou com o adaptador de cadeia simples adequado para os diferentes mutsntes) foi estabelecido que o ssRNA isolado nas diferentes infecções é de cadeia positiva e portanto corresponde ao RNA genómíco (também quando não está presente proteína de revestimento não existe partículas e apenas pequenas quantidades de ssRNA estão presen-*t.£í «S 3 Rara além do>s vários plasmídeos píáR b'TNV, para os mutantes ÍM164.1, NÍ64.2, Brad.i e Brad.2 também os plasmídeos pPLC e pRCV foram usados para infecções com plasmídeos, com os mesmos resultados.
Íc3) expressão de mutantes STNV em plantas transformadas
As transformações de tabaco Skí. foram efectuadas com osseguintes plasmídeos Ts pPCV 526 pPCV STNV Níó4»l e -2 pPCV STNV WÍÓ4NB43»! e .2 pPCV STNV Brad.í e =2
A transformação com pPCV 520 foi efectuada para testar a própria experiência de transformação. A utilização o mutante de STVN infeccioso Níó4 com uma inserção de adaptador no gene da proteína de revestimento permite distinguir na análise dos resultados a proteína de revestimento do mutante (-*· 6 aminoácidos e o RNA Cpor hibridação com o adaptador específico) a serem distinguidos do tipo selvagem. 0 mutante NÍ64NS43 foi seleccionado como genoma deficiente para a, replicação. Neste mutante a inserção N164 foi usada para identificar a proteína de revestimento e para a distinguir do tipo selvagem, enquanto os dois adaptadores inseridos permitem a identificação do RNA» O mutante STNV Brad foi usado para transformação para estabelecer se a expressão da proteína de fusão entre a proteína de revestimento de STNV e a bradiquinina é amplificada por uma infecção dos transformantes com o vírus auxiliar TNV. As plantas transformadas foram designadas por SRÍ, seguido da identificação do mutante STNV e -ainda seguido de um número usado para identificar os transformantes independentes com o mesmo mutante»
As plantas com resistência à canamicina que após transferência para meio sem hormonas com canamicina desenvolveram raízes de forma normal, foram expandidas para posterior investigação» Destas plantas também foram produzidas culturas ds callus para permitir a confirmação da transfarmação das plantas
resistentes à canamicina por testes com actopina. 0 ponto é que o actopina sintetase no í-DNA de pPCV 52S estã sob
u) controle de um promotor especifica de tecido do gene 3 do f-DNA, o qual ã expresso apenas em fragmentos de caule (muito fracamente) e em tecido de callus, de tal forma que os testes da actopina das plantas resistentes a canamicina provou—se estarem de facto transformadas.
As plantas transformadas foram obtidas em condiçSes de crescimento estéreis. Para a infecção com TNV deixou-se pequenas rebentos apicais crescerem in vitro e depois foram transferidos pa? a usrrs de vasos para serem oosoeriormenoe cm eivados numa estufa. Deixou-se as plantas desenvolverem mais e infectaram-se com TMV quando estavam suficiente.·?,ente grandes. A infecção mecânica foi realizada com um inóculo fresco de TNV. isolado de tabaco SR1. Após 72 h as folhas infectadas foram colhidas, congeladas em azoto líquido & preservadas a -7®°C. Para além das folhas infectadas com TMV. as folhas não infectadas da mesma planta foram, também colhidas e analisadas.
A presença de RNA de STNV e de proteína do revestimento nas várias amostras foram determinadas p«or transferância Northern & Western respectivamente, a Tabela 2. resume os resultados. A tabela revela, que • — a irtT&cção com ΓsmV de plantas cransTormadas com óitvV soo o controle de um promotor vegetal constitutivo e delimitada por regiões invertidas poli-SC conduz à repiicação e expressão do -qenoma de STNV e ã formação de partículas de STNV
----- o mutante de inserção N164N343 caracterizado como deficiente na reolicação reolica—se normalmente em plantas transfarmadas
----- a construção de STNV coo uma fusão entre ã proteína, de revestimento e a bradiquinina, após infscção com TNV, dá replicação do mRNA e síntese amplificada da proteína de fusão
---- o RNA de STNV tíetectadode acordo com as hibridações com os vários adaptadores corresponde ao genoma mutante cem o qual a planta foi transformada
------- as plantas com o oersoma STNV na orientação »2, i»a» elas produzem o m.RNft anti-sentido, após infscção com TNV também dão origem a reolicação e expressão de STNV, sem diferenças observáveis com as plantas ,i
------ as diferenças na intensidade dos sinais de RNA e proteína, não correspondem ao tipo ou orientação dos genomas STNV mutantas, mas são típicos do carácter individual de transformantes independentes com o mesmo genoma»
Devido ao facto de se ter usado apenas 1® mg de material vegetal, não se conseguiu detectar nem RNA nem proteína de revestimento nas plantas transformadassem infecção com TNV»
Experiências repetidas deram todas resultados qualitativa e quantitativamente semelhantes» Foram observadas variações· significativas apenas para a eficácia da infecção cora TNV, dependendo de vários factores tais como idade e nível de diferenciação das plantas infectadas, da qualidade do inóculo, da temperatura, da humidade, etc.» Quando a infecção cos TNV foi insuficientemente forte, obtiveram-se apenas sinais fracos de RNA e não se obtiveram sinais de proteína» Com a infecção correcta de TNV, por outro lado, obtiveram-se sinais muito mais fortes de STNV do que no caso das infecçSes cosplasmídeos-» Com. base na intensidade dos sinais obtidos na análise Western, a quantidade de proteína de revestimento foi calculada como sendo de aproximadamente 1Θ© ng numa amostra preparada a partir de 10 mg de material foliar» Tendo em consideração -a limitação da síntese da
proteína oe revestimento õe SiNV em que o TNV também está presente, lesões essas que constituem apenas cerca de 5% da folha, total, pode ser calculado a partir disto que d sinal STNV constitui cerca de ©,02% do peso total molhado da folha ou cerca de ©,5% do peso seco» Esta, quantidade relativamente grande de proteína ã formada apenas em três dias, após ser induzida a expressão por infecçãío com TNV» :om STNV Mló4 a com os mutantes Brad
Os resu11ad os revelam que a influenciam a replicabi1 idade e a expressão do STNV-RNA» Isto prova que a proteína de revestimento pode ser substituída na totalidade ou em parte ser efeitos adversos na replicação a expressão do STNV—RNA» Ver também o Exemplo 2 que se seque» inserção de 13—meros e a fusSo com bradiquinina não η i & r i □' a ç â o meros na huito mssperaoamente, enconerou—se que o murante N164N843, ao contrário do caso das infecções com plasntídeos, replicou—se normaImante em plantas transformadas de adaptadores provou—se que que a inserção de 14posiçâo W343 estava ds facto presente no RNA detecta do)» Aparentemente, a ausência de ssRNA e de dsRNA nas qe plasmxoec com STimv hIts4-> náo resulta de uma replicação deficiente» Ainda, parece que a replicação do STNV—RNA não está ade e tepliusde pendente da presença ou ausência da proteína de revestimento
STNV ou de partículas STNV» Uma vez que nestes mutantes o alastramento da infecção por STNV de célula para célula ocorre de modo normal» apenas o RNA virai pode ser responsável por isto» No entanto, o comportamento diferente do mutante MB43 nas infecções com plasmídeo e em plantas transformadas pode ser explicado assumindo que esta mutação .evita que se alastre a infecçSo normal por STNV de célula a célula através cio RNA» Nas infecções com plasmídeo este mutante- não ê infeccioso» No entanto nas plantas tra.ns formadas, o STNV-mRNA ocorre eo todas células e o
X
alastramento não é necessário para se obter replicação normal= Para além dos elementos estruturais para a replicação o STNv-RNA contem também elementos estruturais que são necessários ao transporte de célula para célula» Provávelmente uma proteína codificada por TNV desempenha aqui um papel activo»
Nos transiormantes ec que STNV á inserido na orientação 2 relativamente ao proaiotor vegetal, o RNA anti-sentido ou de cadeia negativa é formado como RMft mensageiro» Tentativas anteriores para iniciar uma infecção com STNV com o RNA de cadeia negativa usando produtos de transcrição SPó falharam» Nas plantas transformadas isto carece ser possível após indução e tão eficazmente como com os transformantss STNV»'!» È portanto possível reprimir comcletamente a expressão de um gene durante toda, a fase de crescimento da planta devido ao facto de ser produzido apenas o RNA mensageiro anti—sentido de uma proteína e limitar a expressão ao período em que as funções auxiliares da replicação estão presentes, ao mesmo tempo que pode ser obtida uma forte expressão num curto período de tempo por replicação e amplificação do anti-senliou ge? a coox ricar RNA com sentioo» Es-gecia. lmen*c.e pa.ra. a síntese de produtos tóxicos pode ser de grande importância reprimir totalmente a sua expressão durante o período de crescimento de forma a evitar uma influência negativa no desenvolvimento das olantas»
Cc4) DeleçSes in vive
©C;S· corn STNV, tipo sel vagem e
c tua d as intecções undárias
para RNA e proteína Π<3. análise
am τ ei ta· s com RNA to ta 1 Cds e
fnra;
para se coter sinais mais claros dos mutantes» Estas infeçções 1 ss5 destas plantas, enquanto ao mesmo tempo que a infeccão cosm STNV e TMV foram transferidas» Continuando desta forma a mesma
infecção três a quatro vezes consecutivamente, foram isoladas mutantes ds deleção do STNV. Transferências Northern tornaram o RNA destes routantes claramente vísivel como bandas discretas migrando mais rapidamente. Em linhas de infecção diferentes formaram-se routantes diferentes independentemente uns dos outros, o comprimento do RNA replicstiyo variando entre cerca de &0& e 900 bases. Parece que quando numa linha ds infecção se formam tais mutantes de deleção de STNV, o genoma original tipo selvagem desaparece após mais 1 ou 2 infecções. Também, nos mutantes de deleção existentes- e razoavelmente grandes, deleçSes adicionais podem conduzir a formação de derivados mais pequenos. Quando da continuação de tal linha de infecção, o mutante maior desaparece. De um modo geral foi estabelecido que uma repetição suficiente destas infecçSes conduziu à formação de mutantes de delecção STNV com um genoma de aproximadamente 600 bases. As transferências Western demonstraram que os mutantes de deleção deixam de codifi— Através de hibridaçSes com diferentes fragmentos- do genoma de STNV determinou-se que a deleção estã situada no extremo 5’ do genoma.
a proteína de revestimento.
□s elementos que parecem desempenhar um papel importante na formação destes mutantes de deleção sãos
--- a ausência de uma proteína de revestimento devido à qual os mutantes deixam de ser encapsulados e todo o RNA de cadeia positiva nas células infectadas permanece disponível para a replicação e possivelmente para o alastramento da infecção --- uma vez que mutações miares (sem gene da proteína de revestimento evoluem para genomas ainda mais pequenos, pode-se assumir que os mutantes se replicam mais rapidamente e sofrem uma infec— ção mais eficaz uma vez que são mais pequenos (invariavelmente encontra-se mais STNV-RNA nas plantas mutantes da deleção do que nas plantas tipo selvagem e a quantidade aumenta à medida que os mutantes se tornam mais pequenos)=
No entanto a observação siais importante no comportamento destes mutantes de deleção é a sua forte interferência com o vírus auxiliar TNV» Quando numa linha de infecção de RNA se formam mutantes de deleção de STNV, a quantidade de TNV decresce muito rãpidamente» Este decréscimo é tão forte após mais í ou 2 infecçSes que sem a adição de TNV ou TNV—RNA fresco ao inóculo de RNA não podem ser mais efsetuadas novas infecçSes» Assim, os mutantes SíNV que são formados aqui artificiais de RNA parecem produzir uma infecção por TNV»
-através das reoressão muito eficaz da
Para um estudo comparativo o mutante de dslscção STNV Di construído in vitro foi infectado em feijão frade por infecção com plasmídeo» Suando este mutante foi propagado por inoculação de RNA de acordo com as tíeleçSes in vivo» a sua reolicação provou ser mais eficaz do que a do mutants original Níó4« Tal como os outros mutantes que se formam ifA„.yiyo?. STNV .01 reprime a replicaçâo de TNV» Isto é evidenciado por uma pequeníssima infscciosida— de de um inóculo de RNA derivado destas plantas» mutante de deleção STNV Dl construído in vitro investigar se protecção também usado para transformar tabaco SRi para rep li cação de TNV conduziria r.. __________
4-..-= = infecção por TNV» Para determ influência na rep ρIantas transformadas con tr xpressão do RNA do o efeito esenvolvimento e no cuf plantas que
ANA do mutante de deleção SsNV foram cultivadas at, r oossível idênticas-, infectadas e observ
------- SR1 STNV N164NB43»i/1 s1NV9 rsspectivamsnte o da infecção com TNV, para coinpar gusm ar condiçSes o adas subsequentemente s e Z2S cor··-· expressão forte e fraca
SR 1 S t N V D1«1Z1
que tiveram um desenvolvimento e diferenciação de natureza semelhante, Na infecção usou-se um inóculo fresco, preparado a partir de feijão frade infectado com TMV, e um inóculo congelado inóculo 1 e 3, respsctivamente) s í/10 (inóculo 2 e 4), Duas meias folhas das várias plantas foram infectadas cc:ts cada um dos quatro inóculos em locais ssmlbantes^ estas folhas foram designadas a., b, c e d de baixo para cima. Assim fizeram-se as seguintes combxnaçaess ax e a./, bo e hm, c2 e c4, e ox e do.
Após 72, Ri e 1/0 h observou-se e reoistou—se fahoqm
Ticamen >.« desenvolvimento da infecção, iambém, após retiraram—se partículas de cada uma das folhas e fotografaram—se sob iluminação UV para investigar a resposta de hipersensibilidade das plantas, Após 9ó h a meia folha de cada planta cxom lesões melhor desenvolvidas Íb3> foi colhida. Uma parte dela foi congelada e guardada para posterior análise da composição em RNA e proteína, A outra parte foi usada para a preparação de um inóculo para infectar folhas de feijão frade. Para cada uma das plantas τ a x j ã o f r a d s ;í
com um extracto de uma. ώπ ica .1 esão <1 tdI ha 5
com um ex t rac to de 200 tecido de folha (2 folhas)
com uma , diluiçãc 5 deles 3. 1 /3 ti folha)
AS i Otoçr'iVÍ'ã.SS 'líi-SD 3?ρ?“ζ-?3ΕΊΊ tSCÍSS) Ttc‘VS'1 Sf -SHf -S OCOrr’*E*rr“ cia de uma grande diferença no desenvolvimento da infecção por T1MV nas várias plantas do tabaco, fts diferenças .sais importantes foram § ——— o numero de lesões nas vânas foi nas oxTeriram de acorde com o inóculo usado (3 > 4 > 1 > 2), com uiiís. pequena diferença entre as plantas tSRl > SFcl W164N343»1/1 e /2 > SR1 Dl, 1/1)
noutras plantasj tabaco SRÍ e N1Ó4N843»i/í são as que diferem mais, enquanto NÍ&4M843» 1/2 é intermédia» As diferenças em tamanho das lesões numa mesma planta dependendo da folha são normais Ca > b > c > tí) s estão associadas à fase do desenvolvimento das folhas
---- particularmente após Í70 h é claro que porções razoávelmente grandes das folhas infectadas de SRl % SRl N164N843»1/lnecrotizam completamentE·*, enquanto as folhas correspondentes de Dí/í apresentam lesões, mas permanecem normalments verdes
--- a iluminação UV torna visiv&l anéis fluorescsntes que são resultado da reacção de hipersensihi1 idade da planta» Devido a esta reacção as partes infectadas das plantas são isoladas por um anel de tecido que faz com que estas partes sequem» Para SRÍ Dl »1/1 estas partes são muito mais pequenas do que para outras plantas» Isto aponta para uma infecção menos extensa da folha»
Após 96 h usou-se uma parte da meia folha b3 ds cada planta para preparar um inóculo para as folhas de feijão frade para serem sufosequentemente infectadas com ele» Após 72 h foram observadas diferenças muito claras no grau de infecção das folhas ds feijão frade» A planta que tinha sido infectada com os inóculos preparados a partir da planta com deleção deu lesões mas cada, uma das folhas estava ainda verde» Após 72 ha necrotização das outras plantas tinha progredido muito mais e várias folhas estavam tão infectadas que estavam quase completamsnte secas e quase a cair»
Para comparar a quantidade de TNV-RNA nas várias plantas,, tentou-se demonstrar a presença de ds e ssRNA de TNV em géis de agarose corados com brometo ds etidio» A quantidade da proteína de revestimento de TNV foi determinada por transferências Western» Encontrou-se que a quantidade de TNV-RNA sm SRl % ~
Dl.1/1 era inferior à das outras plantas» A quantidade de proteína de revestimento em SRÍ Dl»1/1 era cerca, de 20 vezes mais- baixa, do que em tabaco SRÍ, enquanto a quantidade em SRl N164M843.1/1 e /2 estava entre as duas. As folhas de feijão fra.de cem infeccão secundária foram também examinadas quanto à. presença de TNV-RNA e isto deu o mesmo quadro das plantas do tabaco.
No caso da infecção em grande escala da planta ou porções dela, a presença de RNA de mutantes de deleção STNV conduziu á ausência, menos ou nacrotização completa retardada e perda das porções infectadas» Nas plantas infectadas mas protegidas produziu-se muito menos TNV, o qual tem um efeito inibidor no alastramento da infecção a outras plantas» 0 efeito protector total foi conseguido com a síntese ds uma quantidade negligivel de RNA. Apenas quando a infecção ocorre de facto as funções de replicação codificadas por virus produzem concentrações elevadas e protectoras de RNA com deleção» Ainda isto ocorre apenas nas células infectadas, de tal forma que o gasto qivel» energia ê neyli·
E x em pio II |S}^e. G'-·ίϋ&Γi/ênCÍ.-SS tóOLlá.
íescmas o q©ns glucuronidase de t».......co.li, pois a enzima glucuronidase mantém a sus. actividade como proteína de fusão, não se conhece actividade de glucuronidase vegetal e a actividade enzimática pode ser detectada num ensaio quantitativo e muito sensível» D gene da glucuronidase (6US) (uidfi) usado nas várias construções foi isolado como um fragmento Pstl-EcoRí do plasmídeo pRftJ255, descrito por usfferson et al» em PNAS 83, 8447-8451 (1986)» Para permitir que o gene SUS seja inserido na posição pretendida e na grelha de leitura correcta no cDNA de STNV, foram efectuadas os seguintes acertoss
321.
ΠΟΓ SUPStl tUXÇSsQ «w 4* .·
Ά ΐ peio correspondente fragmento do plasmídeo pr’LC 2820 (o qua ã. remoção do sítio FstI no gene da a.mpicilina) construiu-se α piasmxdeo pFILo o22
------- pOr inserção no sítio único NcoZ do pPLC 322 de um adaptador sintético da estruturas CATBSCTASCAõCTBCABBAATTCATBCATC
CGATCGTCGACGTCCTTAAGTACSTA8GTAC obteve-se o plasmídeo pPLC 323
--- por clonage® do fragmento Fstl-EcoRl contendo o gene SUS de pRA0255 em pPLC 323, obteve-se o plasmídeo pPLC GUS1, em que o gene GL5S está delimitado por por dois sítios de corte Ncol
----- em pPLC GUS1 um sitio único de corte por PstI está situado imediatamente antes da fracçSo codificadora do gene SUS? cortando o plasmídeo com PstI e removendo os extremos salientes 3? de 4 bases de comprimento por meio de T4-polimerase, obteve-se o plasmídeo pPLC GUS dPstl.l, o qual contem ainda os dois sítios Ncol »
As inserções do gene BUS foram sfectuadas nos seguintes ρ1asmxoeos 8 ímV»
---- pPLC STNV NI60»1 s .2 Ca orientação com sentido e anti-sentido relativamente ao promotor pL>, com um genoma STNV completo, tendo uma inserção oe adaptador ds 14 pb- na posição Í6feL-. u adaptador inserido contem um único sítio tíe corte Ncol através ds mutaqéness? com adaptador na posição 28 do genoma 1 eva A do STNV a base A foi substituída pela base C, o que formação de um sítio ds corte; Ncol que se sobrepõe ao codão de iniciação do gene da proteína de revestimento. A introdução desta mutação em STNV N160 deu os plasmídeos pPLC STNV N160Ncol»l e .2» Após corte com Ncol e ligação o fragmento Ncol de 134 pb de comprimento destes ptas-míde-os ρ-ode ser eliminado, o que leva aos nlasmídeos pPLC STNV dNcol=í e .2.
se segue s
----o gene BUS foi clonado como fragmento Ncol de pPLC BUS! em pPLC STNV NlóO.l e »2» Na orientação correcta isto deu os plasmídeos pPLC STIMV SUS.i e »2, o gene SUS sendo fundido na grelha de leitura correcta com a íraccSo 5S da proteína de revestimento de STNV» Ά tradução da proteína de fusão pára no local do codão de paragem do gene SUS,, a fracção 3’ da proteína de revestimento não é traduzida.» De facto- estas construções representam a inserção pura do gene BUS em STNV
-------- o gene BUS foi clonado como um fragmento Ncol do pPLÍ sus dPsti»1 no sítio de corte Ncol de pAuC STNV dNcol deu os plasmídeos pPLC STIMV BUS dNcol»! e »2» A inserção foi gue o codão de iniciação AUS do STNV codões do adaotador sintéti<
do STNV í’ G .1 man tido 5 segu ido da 7
e 1igação do codão de inic isScSo do
correcta» A £ radução f >ára igualmen-
i8· í— SUÍ3 : e assim dá à glucuro-
gene BUS na grelha de leitui te no sítio do codão de par< nitíass mais B aminoãcidos no ex cremo aisina
------ os plasmídeos pF'LC STNV BUS»! e »2 e pPLC STNV SUS dNCOi » i e »2 foram cortadas com Nsí I (esta enzima de restrição corta .imediatamente antes do gene BUS e exactemente no extremo do gene da proteína de revestimento) e ligados» Assim uin fragmento Nsil de 468 pb foi eliminado e obtidos os plasmídeos pPLC -STNV BUS dNsií»! e »2 e pPLC STGUS»! a ,2, respectivamente» Estes dois últimos plasmídeos pPLC STSUS.Í e =2 contêm as construções em que o gene da proteína de revestimento está totalmente pelo gene BUS»
Começando com os plasmídeos pPLC consrrucôe;
STNV
SUS e STSLíS foram transclonadas como fragmento um fragmento
BamHI—SalI no vsctor vegetal pPCV 52®» imedistemente: a seguir ao promotor píRj.5 » No processo >a oriencação relaxiva no promofor ã
iestou-se a expressão em piantas por aniecções com plasmideos de feijão frade coe as várias construções STNV SUS.
Com esta final.idade e pPCV STNV BUB»Í e das com o plasmideo usaram-se os plasmideos pPLC SíNV SUS»Í e , »2» As folhas de feijão frade foram infectafe? UU1HluSS ap<2
Inoculação» Uma folha, colhida de fresco foi incubada durante noite numa soíuç’ão 2
X~Glut_ (âuido b—bromo* loro-d-indolil-beta-D-glucurónico) em tampão fosfato 4® mM, pH 7,4 a 37°C. Então as folhas foram fixadas em glutaraldeído (6 h) e descoradas com uma. série de etanol (de 3® a 95%)» A conversão de X-Sluc pela qlucuronidase leva a. formacso ds um
Mj· :xpxtado âzui insoíuvsi
Com os quatro plasmideos atrás referidos foram efectua— das quatro séries de infecçõss independentes em feijão frade, em dois desses casos foi observada uma reacção azul localizada nas folhas incubadas. Com pPLC STNV SUS.1 observou-se cor azul na margem de uma lesão» 0 exame ao microscópio do material fixado revelou que a reacçao de coloração estava localizada nas celuias vegetais- mesmo na margem d-a lesão» Com pPLC STNV BUS»2 a reacção era vísivel na forma de uma banda corada de 0,3 mm. Um exame ao microscópio não consequiu estabelecer se a reacção era intracelular, pois as células vegetas foram demasiadamente danificada-?
pela infecção através de contaminação bacteriana durante xncuaaçáo com uO« IMO :dSfl ΙΣ-ζΒ.Π CG r. dfeViQu -à COF” «HZU.1 Ofeíf preservada durante a fixação» descoloração, embehição © corte, pode ser assumido com uma certeza relativamente grande que a reacção foi específica da planta»
Axndaj zamoém a ansformação do tabaco, foi efectuada.
usando os plasmideos T pPCV STNV BUS»1 e =2» Para ambas
construções obtiveram—se trans formantes. Os apos as mfecçoes com TNV dos transforroantes tes tes odS an C.es e desenvo1vi dos provou ir ao encontro das espectativas.
Exempio 1II
Isolamento do qgné da replicase do Vírus da Necrose do Tabaco
Tabaco (TNV) Kassanis multiplicar o Vírus Satélite (SV-serotipo A), Esta Phy topacno 1 o zc csborstory obtido como descriti' (1987)„
material de partida o : Vírus do Necrose
·*·*·»_ È i C**·** i***i serotipo A, a qual e capaz
í C.ê 1 õ„ tlSd d 3 Necrose do , Tabaco (STNV) SV
*. s t á. r o ç? í o i obtida do D r = W i s r ϊ n q a B r a n t
>ry ? Baarn 5 Holanda, TNV, sem .STNV, f
ír V-~tn Emnfô! o et al» , Vírology 157, 480—4
Í.Ji.J de
ÍU i
487 vírus fMV foi multiplicado em ·.v,i.qna uηquxoulata. feijão frade) pof carborundum. Preparou-ss RNA genómico pur.i Tiçadas de TNV e converteu-se em folhas de Phaseolus
1ΠΤecçáo oartir com vírus e de oartículas unA com transcnptase reversa de AliV (Boehringer) usando iniciadores ao acaso, A síntese da segunda cadeia foi efectuada por DMA—polimorasa I de Ei_Jã£LL=. (fragmente Klenow) e RNase H CBoehrinqer) de acordo com o méotodo de Subitjr t* HoTfuian cSt^iS 25,
Em sequida adicionou-se DNA-polimerase de T4 para tornar cerses- os extremos. Após clonagem no plasmideo pSPé4 (Promega), corte com Smal com tratamento simultâneo dos extremos com fosfatase, os clones foram transferidos para E« coli MC1861 por transformação e as colónias forma testadas por hibridscão de colónias com ds RNA de TNV marcado com ‘“‘^P e fragmentado.
Preparou-ss ssRNA subgenómico a partir de folhas de Phasealus infectadas com TNV e usou—se em hibridacSes Northern com os clones de TNV selaccionados, Os comprimentos destes RNAs
LUTí *Τ 5 £5 suogenoiuicos ioram ΐ»25 ϊ·-..5, i ,ο
Após electroforese ew gel de imobilizado num filtro de membrana de «nylon» (Pall Bicdyne) «J· hibridado com DNA de clone marcado com Selsccionou-se dons κ põr t NV12 /), o quai nioridou com dois RvxAs suogenomicos de TNV e continha um fragmento situado entre as posições 1700
23Ô0 do RNA de TNV. A análise ds restrição demonstrou que este fragmento continha um fragmento interno Hpal1 que podia ser usado como iniciador para a. síntese de cDNA do gene da. replicase que está situado na região do extrema 5’ do RNA de TNV. Para a clonagem preparativa de cDNA, no entanto, usou-seum oligonucleo-tídeo sintético, derivado da sequência de pSPTNV127s 55 8CTTBTEAGTATCA 3s. Esta sequência é complementar do RNA genómico.
A síntese do cDMA foi efectuada como descrito atrás mas na presença de hidróxido de metil-mercúrio para tornar mais fácil a cópia do RNA (Lenstra et al., Sen. Anal, Techn. 5, 57-úí,
19SS). Assim obteve-se uma cadeia de 2,2 kb que corresponde à região do gene da replicase de TNV» Após clonagem em pSPó4, a partir de 1500 clones seleccicnaram-se três clones que contêm um fragment de 2,2 kb na orientação com sentido relativamente ao promotor BP6.
Usando a polimerase partindo do clone pSPTMV94, preparou-se RNA que, num ext.ract.s3 de germen de trigo, levou inter aiia â síntese de uma proteína de 73 molecular esperado da replicase de TNV.
qual tem o peso fx?p?5 L-S síntese proteica e auto-radioqrafia= experiência usou—se ? e a prtsína de 73 kD foi metionina durante detectada após SBS-PASE
Ι-Μ)
A sequência de pSPTMV94 foi. determinada pelo método didesoxi ds Sarsger et al« (Proc. NatI. Acad = Sei. USA 74, 54-63·-5467, 1977) após c.lonagem de fragmentos no plasmídeo pUC18= fi estratégia para determinação da sequência de nucleotídeos está apresentada na. Fig. 3 e a. sequência na. Fig. 4.
fragmento em pSPTNV127 pareceu conter o extremo 3P' do gene da replicase. Para se obter um cions completo do gene da reolicase de TNV, utilizou-se um sitio único SacI no poli-adaptador de pSP64« Através de uma ligação do fragmento pequeno Xmal-Saci de p3TMV127 com o fragmento grande pSPTNV94 com os extremos Xrea I e Sac I „ absteve-se pSTNv rep-1. Q clone tem 2236 bases ds comprimento, a. grelha de leitura aberta maior sendo encontrada desde a base 52 até à base 2221 (grelha de leitura absoluta relativamente à primeira basesz) com um codão de paragem interno na posição 656. Esta grelha ds leitura aberta, após tradução e utilização de u.m tRNA supressor na posição 656-638, -codifica uma replicase de 724 aminoácidos» Para outras utilizações, o codão de paragem interno TAG, por meio de mutagénese específica, foi alterado para um codão TAT, codificador de Tir.
Uma E.......çoli estirpe MC1061 CpSPTNV rep-113, a qual contem o plasroítíeo pSPINV rep-1, foi registada em 26 de Julho, 1990 no Centraal Bureau voor Scbiromelculturen CCBS), Baarn, Holanda, cora o número de acesso CBS 336.90.
ExgfflSlff.....I-V
E2í£QsggSS.5.......PPffll,.. amplificação do_SNA_mgnsactei.ca......pela, repliçase_.........de lNVjL.-de,.um.-gene da ..cloranfenicol--açetil-.transferase.; fundido com
u.roÃ_...pa..rt§ do cena da...p.rgtgína......de revestimento de STNV
í. Construção de uma sequência de UNA em que uma parte do gene da proteína de revestimento á fundida com gen •τ
t-1 i 7Ή’Π tli tlF“àíi í*» f tSF-tíix-®
de 14 pb no sítio EcoRV
STN íV» l»Ui •tando-se com Ncj
de E» coli β retrc-I
plasmídeo pSiNV N19S foi descrito por Van Emmelo et al« CVirology 157, 480-487, 19875» Ele contem um -adaptador Ncol i gene da proteína de revestimento do preenchendo os extremos com polímera— indo,a grelha de leitura, foi novamente recuperada s Asp (56) /Ser-Net-His-8 1 i-Asn -Ser /11 e (57 5 =
U plasmídeo obtido dá origem a formação de partículas infecciosas de STNV em coinfecçSes com TNV de folhas de Phaseolus Ç V i G na ungu1cu1ata, feijão frade)» Este plasmídeo foi designado po Π‘4 N.2®2 » G fragmento Ps11, contenao o DhIA de oTNv r‘V2r-2» τοι transelonado em pSF*65 CPromega)» O plasmídeo obtido foi designado pSPSTNV N202 (Fig» 55» Tirou-se o gene da cloranfenicol-acetí1-transferass (gene CAT) do pBR325 como um fragmento TaqI, o- qual fragmenco Kienow da foi então dotado de extremos cerses com o DNA— pol imerase de E,çoli» pSPSTNV N202 foi cortado com Nsil e datado de extremos cerses» Em seguida o fragmento TaqI foi clonado no plasmídeo pSPSTNV N2®2 sem Nsil»
A orientação com sentido relativamente ao promotor SF‘6 foi designado pSPSTNV CAT—1 e a orientação sem sentido pSPSTNV CAT—2 (ver Fig» 55»
2« Expressão do gene quimérico CAT usando o vírus TNV em folhas de Phaseolus CVigna unquiculata)
Folnas αε Te j. 3-ao frade soram ίητεο usdâs com íNV e plasmídeo STNV, ou TNV e pSPSTNV CAT—1, Quarenta horas após inoculação as folhas foram extraídas com tampão PSS com 0,1% Triton X-Ι©© ε o extracto foi tratada com soro anti arateína de
revestimento de SiNV. A xmunoprscxpitação com proteína A~sefarose foi seguida de lavagem abundante.
ioranfenxcoi-acetxi—transferase tox , 14r η autxvxdade de deter minada nos complexos com 1— C—acetix ‘Coenzxma A e cloranTe** nicol como descrito por Borman et al.5 (Mol. Cell. Biol.. 2
1044-1081., 1982) e por líe Blocfc et al. , CENHO 3 folhas que foram infectadas com iNV s pSKSiNV CAT-1 e o extracto do qual foi tratado com anti-soro anti-STNV (os resultados não estão aqux apresentados)
3. Multiplicação do RNA de STNV—CAT
isolada a fracção de xhr 4 5 íUuIhíuO - 13
I sem RNAse e o RNA toí anl isado por hi
específico de CAT m arcado com ··'·=“ p (f r
ianto na fracção de SSKríA como na de
de feijão frade com TNV e DNA de pBPSTNV CAT-i, as folhas foram colhidas e foi. removido com DNAse iação Northern com DNA ?nto TagI do pBR325). (NA foi tietectada uma banda de aproximadamente 175® nucleotídeos (os resultados não estão aqui apresentados)» .Isto demonstra claramente que o DNA do plasmideo pBPSTNV CAT—1 á convertido por TNV em ssRNA e dsRNA de
STNV CAT—1.
Descrição das Figuras
A rxq, erra o mapa do plasmideo pACv ,20.
deste plasmideo está indicado por uma linha a. cn.Eiu
D T-DNA f-^f}
Eí Qi’f Ei delimitado por sequências delimitantos esquerda CL (HB}q os sixios de restrição micoa para 8a11 e BamHl podem ser usados para clonagem de fragmentos entre o /promotor vegetal pTRÍ5 ,ν e ο sinal de ροιladenilação ρΑα7 dc1I para clonagem encre pnos e e cs sítios de restrição SgIII s resistência pnq4. U qene canamicina NPí-il e expresso por ρ
T-r-.^i S ϊ Γ'-.Ι.
e pAocs. u gene da octopina fox expresso coo os promotores específicos de tecido pgo e pAocs. í%s sequências ds pBR-i'2’2 com a origem ds repiicação (onV, ί smpicilina CAp) estão situados no T-DNA. de pRK2 (ori V) e de transferência (ori de resistência ao cloranfenicol (Cm) e os extremos colhi) e a resistência A origem oe repiicação T), o qene :oesivos de lambda Ccos) estão situados fora do i-DNA,
A Fig» 2 mostra o mapa do plasmídeo pMP?0RK. No local em em que os fragmentos ΚρηI 9 e 12 de pBV 3ÍÔ0 se ligam um ao outro,, o T-DNA incluindo as sequências delimitant.es foi eliminado. A região de virulência está totalmente intacta. Por recombinaçSo foram inseridos o gene de resistência à gentamicina CGm) e um fragmento de pRK 2@Í3, o qual ê portador dos genes de traneferência (trai, tra.2 uâiiasuuina ΐ ,*-.m) .
e traõ) . reolícaçao Ctrfa) e resistência
A Fig. 3 mostra esquematicamente o mapa de restrição região do gene da replicase ds TNV e os fragmentos usados na determinação da sequência. Após clonagem em ρ-UCiS os fragmentos foram analisados em ambas as direcçGes ou duas vezes de acordo com o método de didesoxi de c'-1 nucleotideos.
sanger para oererminar a sequência de
A Fig. 4 mostra a sequência completa do gene da replicase de TNV. A sequência de aminoácidos apresenta homologia com os genes da replicase tíe CarMV (Vírus- das Manchas na Carne (Carnation Mottle Virus)) e TuCV (Vírus das Rugas do NaboCTurnip Crinkle virus)). 0 codão de paragem amber na posição 656 está ρ,· ,íO gSítoma natural. Rara ouoras utxnzaçQSS este codão de paragem foi substituído por TAT que codifica o aminoácido Tir. Os codões de iniciação e paragem estão indicados por A eV 3 respectivamente» A sequência de aminoácidos começa na posição de nucleotídeos 50 e pàra na posição 2221»
A Fig» 5 mostra esqusmàtícamsnts a construção dos plasmídeos pRPSTNVCATl e pSPSTNVCAT2. Ds detalhes acerca desta construção estão descritos no Exemplo IV»
TaPe1a 1
Proteína de revesti men to
Proteína ds revestimsn to tiutan te
STÍMV de E» coli NFí do feijão frade ssRNA i
tipo selvagem 4- 4* 4-4- 4-4-
N162 -f- (curta) - 4· 4-3-
Ni 64 + (4-6 a a } 4- (4-6 aa) 4-4- 4-4-
SI64 + (curta) - - 4- 4-4-
Brad + (+ í 0 aa) 4 (4-10 aa) +4- 4-4-
Ni 98 4- (curta) - 4- 4-4-
N200 + t +6 aa) 4“ (4-6 aa) 4-4-
S200 4- í*12 aa) - 4- 4-4-
N320 4· (curta) - 4- 4-4-
N322 -r (4-6 a a) - 4- 4-4-
N53Í + (curta) - 4- 4-4-
M533 4· {4-6 aa.) - 4- 4-4-
3613 4- (4-6 aa) - 4- t r,
NS43 4- - -
NÍ64NS43 4- (4-6 aa) — — —
dsRNA aaH significai aminoácidos? curta” revestimento encurtada» A presença e indica uma o tamanho da proteína proteína de de revestimento foram determinados por transferência Western» □ RNA r
foi hibridado com uma sonda
s. quai
703
STMV-DNA marcada com tfoeL·
STNV e plantas rrotEiOs de revesziiDento testemunha — TNV + TNV
RNA SfWV <ds e ss)
-TNV +TNV com STNV DNA 14
N1 ó4» X — 4 444 — + a — + —
N1 ô4 » zí - + a +++ - + a 44.4. - 4 --
N í Ò4NH43 ir 1 - 4-r 4-4-4 - ++ 3 444 + + --
1MXÓ4MS43.2 - 4 & 444 - + a 444 + + -
Brad.i ... 4 £ 444 + a 444 - - +
Brsd»2 - 4.4 - 4.4 -
Tabaco SRi —
Das plantas transformadas, por mutante STNV foram testadas várias plantas isoladas indepsndentemente. A proteína de revestimento de STNV <+ò e +10 aminoácidos) foi determinado por transferência Western, o RIMA por hihridação Northern com STWV-DWA marcado com '‘T. Transformsntss independentes com a mesmo genoma mutante deram sinais de intensidade diferente, o que estã indicado pelo número de sinais +« Para as transferências Western e Northern usou-se 10 mq de material foliar por amostra.. Por hihridaeão com os vários adaotadores <14.ifej—meroe- í tos.
confirmada a identidade dos qenomas STNV.

Claims (7)

  1. íâ. ~ Método para a preparação de um DNA recombinante, que compreende duas sequências de nucleotídeos de repetiçSes invertidas de 12-25® pares de bases, com pelo menos uma sequência de nucleotídeos entre elas derivada de um vírus de RNA que para a sua replicação está dependente de uma RNA/RMA-polimerase virai, compreendendo a referida sequência derivada de vírus de RNA pelo menos elementos cis para & replicação mas nenhum gene que codifique -a RNA/RNA-polimerase virai e nenhum gene que codifique a proteína da cápside virai, caracterizado por compreender a construção do referido DNA recombinante a partir das suas partes constituintes por meio de técnicas de preparação do referido DNA recombinante síntese química de DNA, s o isolamento do referido DNA recombi nante a partir de células ou de meios que o contêm.
    DNA recombinante, ou a por meio de técnicas de
  2. 2ã« - Processo de acordo com a reivindicação i, caracterizado por a sequência derivada do vírus de RNA compreender elementos cis para a replicação e elementos cis para transporte.
  3. 3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a sequência derivada do vírus de RNA também compreender elementos cis para a encapsidação na proteína da cápside.
  4. 4ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a sequência derivada do vírus de RNA também compreender elementos cis para a tradução.
    Sã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4. caracterizado por entre as duas sequências de nucleotídeos das repetiçSes invertidas, além da sequência derivada do vírus de de nucleotídeos que cortar o RNA ou mRNA virai» óê» - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por entre as duas sequências de nucleotídeos das repetições invertidas, além da sequência derivada do vírus de RNA, estar situada uma sequência de nucleotídeos não virai que codifica um ou mais RNAs»
  5. 7â„ - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a sequência derivada do vírus de RNA compreender pelei menos elementos cis para a replicaçSo e elementos cis para a tradução s por, entre as duas sequências de nucleotídeos das repetições invertidas, além da sequência derivada do vírus de RNA, estar situada uma sequência de nucleotídeos não-yiral que codifica uma ou mais proteínas/peptídeos»
    Sê» - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o referido DNA recombinants estar incorporado numa cassete de expressão para uma célula hospedeira a ser transformada permitindo que a transcrição decorra na célula hospedeira, formando uma molécula de RNA com uma estruturai sm raquete„
  6. 9ê = - Células ou organismos eucarióticos ou procarióticos, caracterizados por serem providos ds DNA recombinants obtido de acordo com a reivindicação 8» l@ê» - Células ou organismos eucarióticos ou procarióticos de acordo com a reivindicação 9, caracterizados por serem também providos de DNA recombinante compreendendo informação genética para uma RNA/RNA-polimerase virai ou para uma construção específica de tecido» de bases de comorimento, derivada de vírus de RNA
    Jlêi» Método para a protecção de orqanismos eucarióti— cós, como sejam particularmente plantas, leveduras e fungos, centra um vírus de RNA qu© para a sua replicação esta, dependente de uma RNA/RNA-polimerase virai, realizando uma manipulação genética, do organismo a ser protegido, ca.racteriza.do por compreender a. incorporação de DNA recombinante no genoma do referido organismo o qual numa, cassete de expressão activa compreende duas sequências de nucleotídeos ds repetições invertidas, 12—25© pares com uma sequência de nucleotídeos entre elas, coiBpreenoenoo a referioa.
    sequência derivada de vírus de RNA pelo menos elementos- cis para a replicação mas nenhum gene que codifique RNA/RNA-polimerase virai e nenhum qene que codifique proteína da câpsitíe virai»
    12sL - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a sequência derivada de vírus- de RNA compreender elementos cis para a replicação e elementos cis para o transporte =
    13ã» - Método ds acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado por a sequência derivada de vírus de RNA também compreender elementos cis para a encapsidação na proteína da cápside.
    14ã» - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado por a sequência derivada de vírus de RNA também compreender elementos cis para a tradução»
    15ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado por entre as duas sequências d# nucleotideos idas repetições invertidas, além da sequência derivada do vírus de RNA, estar situada pelo menos uma sequência de nucleotideos que codifica uma ribozima que é capaz de cortar RNA ou mRNA virai»
    16s» - Método para a produção de uma ou mais proteínas/peptídeos numa forma induzIvel, caracterizado por compreender a cultura de um organismo procariótico ou eucariótico ou de células de um organismo procariótico ou eucariótico, organismo este que através de técnicas de engenharia genética é provido de um DNft rscombinante que numa cassete de expressão activa compreende duas sequências de nucleotideos de repetições invertidas, 12-250 pares de bases de comprimento com uma sequência de núcleotídeos entre elas derivada de vírus de RNA que para a sua replicação está dependente de uma RNA/RNA-polimerase virai, compreendendo a referida sequência derivada de vírus de RIMA pelo menos elementos eis para a replicação -s elementos cis parai a tradução, mas nenhum gene que codifique RNA/RNft-polimerase virai s nenhum gene que codifique proteína da çãpsitie virai, e estando situada entre as duas sequências ds nucleotideos das repetições invertidas, além da sequência derivada do vírus de RNA, uma sequência de nucleotideos não virai que codifica uma ou mais proteínas/peptítíeos, na orientação dos codões ou dos anti-cadSes, e infecção do referido organismo ou suas células com o virus»
    17S» - Método para a produção de uma ou mais proteínas/peptídeos numa forma induzível, caracterizado por compreender a cultura de um organismo eucariótico cujo genoms, através de técnicas de engenharia genética incorpora um DNft rscombinante que numa cassete de expressão -activa compreende duas sequências de nucleotideos de repetições invertidas, 12-250 pares de bases de comprimento com uma sequência de nucleotideos entre elas derivada de virus ds RNA que para a sua replicação está dependente ds uma
    RNAZRNA-polimerase virai, compreendendo a referida sequência derivada de vírus de RNA pelo menos elementos cis para a replicação e elementos cis para a tradução, mas nenhum gene que codifique RNAZRNA-polimerase virai e nenhum gene que codifique proteína da cápside virai, e estando situada entre as duas sequências de nucleotídeos das repetições invertidas, além da sequência derivada do vírus de RNA, uma sequência de nucleotídeos não virai que codifica uma ou mais proteínasZpeptídeos, na orientação dos codões ou dos anti-codões, assim como DNA recombinante que compreende informação genética para uma RNAZRNA-polimerase virai ou uma construção de RNAZRNA-polimerase numa cassete de expressão induzivel ou específica de tecido.
    Í8s= - Método para a produção numa forma induzivel um ou mais RNAs, tais como ribozimas, RNAs anticodão s RNAs de cadeia dupla, caracterizado por compreender a cultura de um organismo procariótico ou eucariótico ou células de um organismo procariótico ou eucariótico, organismo este que através de técnicas de engenharia genética é provido de um DNA recombinante que numa cassete de expressão activa compreende duas sequências de nucleotídeos de repetições- invertidas, Í2-250 pares de bases de comprimento com uma sequência de nucleotídeos entre elas derivada de vírus de RNA que para a sua replicação está dependente de uma' RNA/RNA-pol imera.se virai, compreendendo a referida sequência derivada de vírus de RNA pelo menos- elementos cis para a replicação e elementos cis para a tradução, mas nenhum gene que codifique RNAZRNA-polimerase virai e nenhum gene que codifique proteína da cápside virai, e estando situada entre as duas sequências de nucleotídeos das- repetições invertidas, além da sequência derivada do vírus de RNA, uma sequência de nucleotídeos não virai que codifica um ou mais RNAs, na orientação codão ou anticodão, e infecção do referido organismo ou suas células com o vírus» anticodão e RNAs de cadeia dupla, caracterizado per compreender Ά cultura de um organismo eucariótico cujo genoma através de técnicas ds engenharia genética incorpora DNA recombinante que numa cassete ds expressão activa compreende duas sequências de nucleotídeos de repetições invertidas, 12-25© pares ds bases ds comprimento com uma sequência de nucleotídeos entre elas derivada de vírus de RNA que para a sua replicação estã dependente de uma RNA/RNA-polimerase virai, compreendendo a referida sequência derivada de vírus de RNA pelo menos elementos cis para a replicação s elementos cis para a tradução, mas nenhum gene que codifique RNA/RNA-polimerase virai e nenhum gene que codifique proteína da cápside virai, e estando situada entre as duas sequências de nucleotídeos das repetições invertidas, além da sequência derivada do vírus de RNA, uma sequência de nucleotídeos não virai que codifica um ou mais RNAs, na orientação cotíão ou anticodão, assim como DMA recombinante que compreende informação genética para uma RNA/RNA-polimerase virai ou uma construção de RNA/RNA-polimerase numa cassete de expressão induzível ou específica de tecido»
    2©â= - Método para a preparação de um DNA recombinante, que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma RíMA/RNA-poI imerase virai ou uma construção de RNA/RNA-pol imerase, caracterizado por compreender a construção do referido DNA recombinante a partir das suas partes constituintes por meio de técnicas de DNA recombinante, ou a preparação do referido DNA recombinante por meio de técnicas de síntese química de DNA, e οχ so lamento do referido DNA recombinante a partir de células ou. de meios que o contêm»
    J>4 Jii1·* ?todo de acordo com a reivinâíÊ^çao 2«rizado por da sequênc se preparar uír UNA recomhínante que compreende a de nucleotídeos apresentada na Figura 4s aracte— pa r te
    -J t
    CCAAGAATACCAAATAGGTGCAAGGCCTTA<. icagctaaagagtctaaaatggagctacc
    G1 nG 1 uTy rG1 n11 eG 1 yA 1 nAi qrroTyrlerA 1 aLysG 1 uSerLysMETG 1 uLeuPro ▲
    I
    I
    100
    I
    110 120 i !
    AAACCAACACAAGCAATCAGCCGCCGAGGGTíTTGTATCITTCCTAAACTGGCTATGCAA
    AanG 1 nlli sLysG 1 uSer Λ1 aA 1 aGluG1 yPheVa 1 SerPheLeuAsnTrpLeuCysAsn
    130 140 150 160 170 180
    1 - j I J J J
    CCCATGGAGACGACAGCGAACAGTCAACGCTGCAGTTGrGTrCCAAAAAGATCTTCTAGC
    ProTrpArgArgG 1 nArgThrVa 1 AsnA 1 aA 1 aVa 1 Va 1 PlieG 1 nLysAspLeuLeuA 1 a
    190 200 210 220 230 · 240 i i i â li
    I I I t » »
    CATTGAGGATTCCGAGCAITTGGATGATATCAATGAGTGTITCGAAGAATCTGCTGGGGC 11 eG 1 llAspSerG 1 uIlisLeuAspAsp 11 eAsnGl uCysPheG 1 uGl uSerAl aGl yAl a
    250 260 270 2Θ0 290 300
    I I < I I I
    I « t i t I
    ACAATCCCAGCGAACTAAGGTrGTCGCCGACGGAGCATATGCCCCCGCAAAATCCAATAG G1nSerG1nArgThrLysVa1Va1Λ1aAspG1yAlaTyrA1aProA J aLysSerAsnArg
    360
    I
    310 320 330 340 350
    I I I j I
    GACCCGCCGAGTTCGTAAGCAGAAAAAGCACAAGTTTGTCAAATATCTTGTCAACGAAGC ThrArgAigVa 1 ArgLysG l nLysLysIli sLysPhe Va 1 LysTyrLeuVa 1 AsnG I uA 1 a
    370 380 390 400 410 420 • ! ! : I !
    TCGTGCCGAGITTGGATTGCCTAAACCAACTGAGGCAAACAGACTCATGGTCCAACATTT ArgA 1 aG 1uPheGlyLeurroLysProThrGluAlaAsnAr gLeuMETVa1GJ nHJsPhe
    FIG.4
    430
    440
    I
    450
    I
    4Θ0
    CriGCTCAGGGTGTGTAAGGATIGGGGCGTTGTTACAGCCCACGTACACGGCAACGTTGC LeuLettAr gVa 1 CypLysAspTrpG1yVa 1 Va 1 '11 u AI allisVa UlisG 1 yAsnVa IΛ1 a
    490
    500
    I
    510
    I
    520
    530
    540
    ACTAGCnTGCCACTGGTGTTCATTCCAACGGAAGATGATCTGCTATCACGAGCATTGAT LeuΛ1aLeuProLeuVa J Phe J1eProThrGluAspAspLeuLeuSerArgA1aLeuMET
    550 560 570 580 590 600
    I i t · } }
    I t t I I '
    GAACACACATGCIACTAGAGCTGOGTACGAGGCATGGACAA1GTCCAAGGCCAAGGGTG
    AsnTht HisA I alhrArgA1 aΛ1aVa1 Ai gG1yMETAspAsnVa1G1uGlyG1nGlyTrp
    610
    620
    630
    640
    650
    660
    GTGGAACAATAGGTTGGGGATTGGGGGCCAGATCGGACTGGCCTTCCGGTCCAAATAGGG TrpAsnAsnAr gLeuGly1leGlyGlyGlnl1eGlyLeuAlaPheAt gSerLys---Gly
    670
    680 t
    690
    700
    710
    720
    I
    GTGCC1TGAAAGGAGGCCAGGATI ClCCACGTCCGTI TCGCGIGGGGAACATCCTGATCT
    CysLeuG 1 uArgAj grroG 1 yTheSerThrSerVa 1 SerArgG 1 yG 1 uHisProAspLeu
    730 740 750 760 770 780 ! ! ί ! ! !
    GGTGGTCATACCATCAGGGCGCCCTGAGAAACAGCGTCAGTTGITACGCTACAGTGGTAT Va1Va111eProSerG1yArgProG1uLysG1nArgG1nLeuLeuArgTyrSerG1yI1e
    790
    800
    810
    820
    830
    I
    Θ40 » I I * II
    I I » I I ·
    AGGCGGCCATTTATTAATCGGCATCCACAACAACTCTCTTTCCAACTTGCGTAGGGGCTT
    GlyGlyllisLeuLeulleGlyIlellisAsnAsnSerLeuSerAsnLeuArgArgGlyLeu
    850
    I
    860
    870
    880 ι
    890
    I
    900
    GATGGAGAGAGTAITCTACGTCGAGGGGCCCAATGGGCTCCAAGACGCCCCTAAGCCCGT
    MEIG1uArgVaIPheTyrVa1G1uG1yProAsnG1yLeuG1nAspAlaProLysProVa1
    910
    920
    930
    CAAGGGAGCTTTCCGGACCCTTGATAAGTTTCGTGATCTCTATACTAAAAATAGTTGGCG LysG1yA1aPheArgThrLeuAspLysPheArgAspLeuTyi ThrLysAsnSerTrpArg
    970 980 990 1000 1010 1020
    III II *
    TCATACCCCTGTAACTAGTGAACAATTCCTAATGAATTACACGGGCAGGAAACTGACTAT
    HisThrProValThrSerGluGlnPheLeuMETAsnTyrThrG1yArgLysLeuThrl1e
    1030 1040 1050 1060 1070 1080
    I I I I I I
    I t I I » »
    TTACAGAGAGGCGGTTGATAGTTTGTCGCATCAACCCCTTAGCTCACGAGATGCGAAGCT
    TyrArgG1uA1 aVa1AspSerLeuSerHisGlnProLeuSerSerArgAspA1aLysLeu
    1090 1100 1110 1120 1130 1140
    III III i i i I I I
    AAAGACATTCGTGAAGGCCGAAAAATTAAACCTTTCTAAGAAGCCTGACCCTGCTCCCAG
    LysThrPheVa1LysA1aG1uLysLeuAsnLeuSerLysLysProAspProA1aProArg
    1150 1160 1170 1180 1190 1200
  7. 11(111 I I I I I I
    GGTCATACAACCTAGATCGCCTCGGTATAACGTTTGTTTGGGCAGGTACCTCCGACATTA
    Va111eG1nProArgSerProArgTyrAsnVa1CysLeuG1yArgTyrLeuArgHi sTyr
    1210 1220 1230 1240 1250 1260 ; i i i i i
    TGAACATCACGCGTTTAAAACCATTGCCAAGTGCTTTGGGGAAATCACGGTCTTCAAAGG GluHisHisAlaPheLysThrlleAlaLysCysPheGlyGluIleThrValPheLysGly
    1270 1280 1290 1300 1310 1320 !'!!!!
    GTTTACTCTGGAGCAACAAGGGGAAATCATGCGCTCGAAGTGGAATAAATATGTTAATCC
    PheThrLeuG1 uG 1 nG 1 nG 1 yG 1 u 11eMETAigSerLysTrpAsnLysTyrVa1AsnPro
    1330 1340 1350 1360 1370 1380
    I 1 I I I I • I I I I I
    CGTTGCGGTCGGACTTGACGCCAGTCGTTTCGACCAACACGTGTCTGTTGAAGCACTCGA
    ValAlaValGlyLeuAspAlaSerArgPheAspGlnHisValSérValGluAlaLeuGlu
    1390 1400 1410 1420 1430 1440 ! ! ! j 1 1
    GTATGAGCATGAATTTTATCTCAGAGATTACCCAAATGATAAACAGCTAAAATGGCTGCT
    TyrG1uIlisG1uPheTyrLeuArgAspTyrProAsnAspLysG1nLeuLysTrpLeuLeu
    LysG1nG1nLeuCysAsnVa1G]yThrA1aPheA1aSerAspG1yVa111eLysTyrLy3
    1510 1520 1530 1540 1550 1560 ! ! 1 ! ! '
    GAAGAAGGGTTGTAGAATGAGCGGAGACATGAACACGAGTTTGGGCAACTGCATTTTAAT LysLysG1yÇysArqMETSerGlyAspMETAsnThrSerLeuG1yAsnCysI1eLeuMET
    1570 15Θ0 1590 1600 1610 1620 .'!!!!'
    GTGCGCCATGGTCTACGGGTTGAAAGAACACTTAAACATCAATTTGTCCCTTGCAAATAA CysA1aMETValTyrGlyLeuLysGluHisLeuAsnl1eAsnLeuSerLeuAIaAsnAsn
    1630 1640 1650 1660 1670 1680 *·»**· i i i i - i i
    TGGGGATGACTGCGTCATTGTCTGTGAGAAAGCGGATTTAAAGAAATTGACGAGCAGCAT GlyAspAspCysVal I1eVaICysG1uLysA1aAspLeuLysLysLeuThrSerSerIle
    1690 1700 1710 1720 1730 1740 iii i i ;
    CGAGCCATATTTCAAGCAGTTTGGAITCAAGATGGAAGTGGAAAAACCCGTGGATATCTT
    G1uProTyrPheLysG1nPheG1yPheLysMETG1uVa1G1uLysProVa1AspI1ePhe
    1750 1760 1770 1780 1790 .1800 ’ I I 1 I I
    I I » ( I »
    TGAGCGTATAGAATTTTGCCAAACCCAGCCTGTGTTTGATGGATCCCAATATATCATGGT G1uArgI1eG1uPheCysG1nThrG1nProVa1PheAspG1ySerG1nTyrI1eMETVa1
    1810 1820 1830 1840 1850 1860 ! ! ! ! '
    ACGCAAACCTTCAGTTGTAACATCCAAAGACGTCACCAGCCTCATCCCATGTCAAACGAA ArgLysProSerVa1ValThrSerLysAspVa ÍThrSerLeuJ1eProCysGlnThrLys
    1870
    1880
    1890
    1900
    1910
    1920
    AGCACAATACGCAGAATGGCTGCAAGCTGTGGGTGAGTGTGGCATGAGCATCAATGGTGG A1 aG 1nTyrA1aG1uTrpLeuG 1nA1 aVa1G1yG1uCysG1yMETSer11eAsnG1yG1y
    1930
    1940
    1950
    I
    1960
    1970
    1980
    GATTCCTGTTATGCAGAATTTCTACCAGATGCTCCAAACTGGCATCCGCCGCACAAAATT
    11 eProVa1METG1 nAsnPheTyrG 1 nMETLeuG 1 nThrG 1 y 1 1 eArgArgThrLysPhe
    1990 2000 2010 2020 2030 2040
    I t I I IJ
    CACCAAGACCGGCGAGTTCCAGACGAACGGATTGGGGTATCACTCTAGATTTATGCATAG
    ThrLysThrG 1 yG 1 uPheG 1 nThrAsnGlyLeuG 1 yTyrH i sSer ArgPheMETHisArg
    2050
    2060
    2070
    2080
    2090
    2100
    AGTGGCCCGGGTCCCTTCGCCTGAAACCCGTTTATCCTTCTATCTAGCTTTCGGTATCAC
    ValAlaArgValProSerProG1uThrArgLeuSerPheTyrLeuA1aPheG 1 y11eThr
    2110 2120 2130 2140 2150 2160
    I « I I II i i i i ι i
    ACCAGACCTCCAAGAAGCAATGGAGATCTTCTATGATACTCACAAGCTTGATTTGGATGA ProAspLeuG 1nG1uA1 aMETG 1 u J1 ePheTyrAspThrH i sLysLeuAspLeuAspAsp
    2170 2180 2190 2200 2210 2220 «III | I
    TGTTATCCCGACTGATACCTACCAAGTGTCAGGAGAGCATTTGATCAATGGATTACCAAA Va111eProThrAspThrTyrG1nVa1SerGlyG luHisLeu11 eAsnG1yLeuProAsn
    2230
    CTGATGTAACGGAGGA
    ---CysAsnGlyGly
    Fl G.4 «’.,ίΛΛ •v •,A '•5 ~ X 'xXX' que codifica uma RNA/KiMft-ραΙ imerase, ou cohètruçSes derivadas dela, como seja um mutante de substituição que tem a sequência TAT em vez ds sequência TAG na posição 656—658 de acordo com a ríi'uTrCot·—~-r-'Z>fr í-coHo r-» λ Γϊπ Zl tss mn^anftac rica ecsi!
    parte correspondente ds um outro gene qu* -polimerase virai=
    itiçao em que UfT{«í ubst i buída OOf* unis fique uma RNA/ í—, ». i .1 fí/MH-
    2zs= Pfucbssd □ feí auordo co»í a reivindicação zM ou zx, caracterizado por a. sequência de nucleotídeos que codificai uma RNA/RMA-polimerase virai ou uma construção de RWA/RNA-polimerase estar situada huíss cassete de expressão induzível ou específica ds tecido»
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6054566A (en) 1988-02-26 2000-04-25 Biosource Technologies, Inc. Recombinant animal viral nucleic acids
US6660500B2 (en) 1988-02-26 2003-12-09 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US7033835B1 (en) 1988-02-26 2006-04-25 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US5977438A (en) * 1988-02-26 1999-11-02 Biosource Technologies, Inc. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US5922602A (en) * 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
WO1993003161A1 (en) * 1990-10-22 1993-02-18 Biosource Genetics Corporation Recombinant plant viral nucleic acids
PT100930B (pt) * 1991-10-04 2004-02-27 Univ North Carolina State Plantas transgenicas resistentes aos agentes patogenicos e metodo para a sua producao
ATE207957T1 (de) * 1992-02-19 2001-11-15 Oregon State Produktion virus-resistenter pflanzen durch einführung von nicht-translatierbarer viraler plus-strang-rna
WO1993023532A1 (en) * 1992-05-14 1993-11-25 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. VIRUS RESISTANT PLANTS CONTAINING INDUCIBLE CYTOTOXIC mRNAs
IL108241A (en) * 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
ES2194865T3 (es) 1992-12-30 2003-12-01 Biosource Genetics Corp Amplificacion viral de arn mensajero recombinante en plantas transgenicas.
US6008436A (en) * 1993-01-21 1999-12-28 North Carolina State University Nematode-resistant transgenic plants
US5650303A (en) * 1993-02-26 1997-07-22 Calgene, Inc. Geminivirus-based gene expression system
ATE193729T1 (de) * 1993-02-26 2000-06-15 Calgene Llc Geminivirus-basiertes-genexpressionsystem
US5981236A (en) * 1993-02-26 1999-11-09 Calgene Inc Geminivirus-based gene expression system
DE4315109A1 (de) * 1993-05-06 1994-11-10 Inst Pflanzengenetik & Kultur Verfahren und Vektorkonstrukt zur Expressionssteigerung von Transgenen
GB9311593D0 (en) * 1993-06-04 1993-07-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
GB9401780D0 (en) 1994-01-31 1994-03-23 Nickerson Biocem Ltd Modified plants
CA2197242A1 (en) * 1994-08-18 1996-02-29 Joan S. Brugge Regulatable elimination of gene expression, gene product function and engineered host cells
IT1283631B1 (it) * 1996-05-09 1998-04-23 Metapontum Agrobios Srl Metodo per la preparazione di piante transgeniche resistenti ad in- fezioni virali e piante cosi' ottenute
GB9615349D0 (en) * 1996-07-22 1996-09-04 Zeneca Ltd Virus resistance in plants
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
GB9720148D0 (en) * 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
US6077992A (en) * 1997-10-24 2000-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
EP1025234A1 (en) * 1997-10-24 2000-08-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
US6632980B1 (en) 1997-10-24 2003-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
CA2339595A1 (en) * 1998-09-23 2000-03-30 Narendra S. Yadav Binary viral expression system in plants
US7220893B1 (en) 1999-05-19 2007-05-22 Cornell Research Foundation, Inc. Plasmids and methods for construction of non-redundant, indexed, saturation, gene-disruption plant and animal libraries
CA2530956A1 (en) * 2003-07-03 2005-03-03 Board Of Trustees Operating Michigan State University Expression of a recombinant transgene
CN110144338A (zh) * 2019-05-29 2019-08-20 通用生物系统（安徽）有限公司 一种以rna为模板的rna聚合酶制备方法及该聚合酶的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2624342B1 (fr) * 1987-12-14 1991-11-08 Agronomique Inst Nat Rech Procede d'obtention de plantes transgeniques, vecteur d'integration utilise et plantes obtenues
AU638411B2 (en) * 1988-02-26 1993-07-01 Large Scale Biology Corporation Non-nuclear chromosomal transformation
CN1033645A (zh) * 1988-10-22 1989-07-05 中国科学院上海植物生理研究所 控制植物病毒病的基因工程方法

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Publication number Publication date
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