JPS62201527A - ウイルス感染に対する植物保護 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術的背景］ 本発明は、ウィルス病に耐性である植物を生産する方法
と、そのようなウィルス耐性の付与に用いる遺伝物質と
、その方法の産物とに関する。従って、本発明は、植物
分子生物学、植物ウィルス学および植物遺伝子工学の分
野の応用を含んでいる。

植物においてウィルス感染は、成長阻害、形態変化およ
び収穫減少などの種々の不利な効果の原因となる。更に
、ウィルス感染はしばしば植物を他の害虫や病原菌によ
る損傷に対してより影響され易くする。植物ウィルスに
ついての一般的な知見は、文献（例えば、Ｍ　ａｔｔｈ
ｅｗｓ　　（１９８１）、Ｌ　ａｕｒｆｅｒ　（１９８
１）　　および　Ｋａｄｏ　＆　　Ａｇｒａｗａｌ（１
９７２）　）に記述されている。

植物は、動物のように抗体が関与する免疫系を持たない
。しかし、植物は病原菌による感染に抵抗するために、
幾つかの方法を発達させてきた。

例えば、ある型の植物は、侵入する真菌の表面の糖部分
に結合して真菌を不動化するレクチンを産生する。更に
、ある型の植物は、明らかに、細菌、昆虫、それに多分
ウィルスによる攻撃に応答して植物中を循環する種々の
分子を産生ずる。

ある型の植物では、幼若な植物に「減衰させた（ａｔｔ
ｅｎｕａｔｅｄ）　Ｊウィルス株、つまり、重大な症状
を起こさないウィルス株を感染させることによって、あ
る程度のウィルス耐性を誘導することができる（例えば
、Ｒａｓｔ　　（１９７２）および　Ｃｏｓｔａ（１９
８０）を参照）。この方法には次のような幾つかの限界
がある。つまり、（１）一定の型の農作物（ｃｒｏｐ　
）中でのみ都合良く行うことができる。

（２）一定の型のウィルスに対してのみ行うことができ
る。（３）感染ウィルスの適切な減衰株が同定されてい
るかまたは単離されている場合にのみ、行うことができ
る。（４）この方法によって与えられる保護は、限られ
た数の種々のウィルスに対してのみ効果があり得る。（
５）減衰感染は第２の関連の無いウィルスによる感染を
、相乗効果によって更に深刻に悪化する可能性がある。

それで、上述した問題が解決されていて、しかも、減衰
ウィルスの同定、単離および使用を必要としないような
ウィルス感染から植物を保護する方法が必要とされてい
る。また、天然の遺伝的耐性または交叉免疫（ｃｒｏｓ
ｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）耐性が利用できないときに
ウィルス耐性を与える必要がある。

［発明の概要］ 従って、本発明の目的は、減衰ウィルスの使用、耐性を
与える遺伝的決定基の存在、または、交叉免疫の利用可
能性のいずれにも依存しないウィルス耐性植物を生産す
る方法を提供することである。

また、本発明の目的は、工学的に処理した植物が植物ウ
ィルスに対して耐性を示すように、植物のゲノムに、植
物ウィルスのゲノムの小部分を他のものと共に含むＤＮ
Ａ構成物（ｃ０ｎ５ｔｒｔｌＣｔ　）を挿入することに
より、植物を遺伝子工学的に処理する方法を提供するこ
とである。

また、本発明の他の目的は、遺伝的に形質転換されたウ
ィルス耐性植物の生産に使用できる組換体ＤＮＡ分子を
提供することである。

更に、本発明の他の目的は、植物ウィルスのＲＮＡ配列
の生産を起こすＤＮＡ配列の存在をそれぞれコードする
、遺伝的に形質転換された細胞および分化植物を提供す
ることである。

上述の目的を達成する中で、本発明の一つの観点として
、植物ウィルスによる感染に耐性である遺伝的に形質転
換された植物を生産する方法が提供された。この方法は
次の工程を包含する。

（ａ）　　植物細胞のゲノムに、 （１）　植物細胞中で機能して、植物ウィルスのＲＮＡ
配列の生産を起こすプロモーターと、（ｉｉ）　　植物
ウィルスから誘導したＤＮＡ配列であって、植物ウィル
スのＲＮＡ配列の生産を起こすＤＮＡ配列と、 （ｉｉｉ　）　　植物細胞中で機能して、ＲＮＡ配列の
３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を起こ
す３′非翻訳（ｎｏｎ　−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）ＤＮ
Ａ配列と を包含する組換体２本！ｌＤＮＡ分子を、挿入する工程
。

（ｂ）　　形質転換された植物細胞を１ワる工程。

（ｃ）　　形質転換された植物細胞から、植物ウィルス
による感染に対する耐性が増した遺伝的に形質転換した
植物を再生する工程。

一つの好ましい具体例では、植物ウィルスのＲＮＡ配列
はそのウィルスのコートたんぱく質をコードする。

本発明の他の観点として、配列中に次のものを包含する
組換体２本鎖ＤＮＡ分子が提供された。

（ａ）　　植物細胞中で機能して、植物ウィルスのＲＮ
Ａ配列の生産を起こすプロモーター、（ｂ）　　植物ウ
ィルスから誘導されたＤＮＡ配列であって、植物ウィル
スのコートたんぱく質をコードするＲＮＡ配列の生産を
起こすＤＮＡ配列、および、 （ｃ）　　植物細胞中で機能して、ＲＮＡ配列の３′末
端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を起こす３′
非翻訳領域。

また、本発明の他の観点として、上述の（ａ）、（ｂ）
および（ｃ）の要素を包含するＤＮＡを、それぞれ含む
細菌細胞および形質転換された植物細胞が提供された。

更に、本発明の他の観点として、上述のように形質転換
された植物細胞を包含し、植物ウィルスに対して耐性を
示す分化した植物が提供された。

また、本発明の他の観点として、そのような植物を栽培
すること、外植片（ｅｘｐｌａｎｔｓ）　、挿木および
サッド（ｓｕｄｓ）などの胎芽（むかご、ｐｒｏｐａｇ
ｕ　１ａＳ）を用いてそのような植物を繁殖させること
、または、この植物を他の植物と交雑（ｃｒｏｓｓ　）
させて同じくこの植物ウィルスに対して耐性を示す後代
（ｐｒｏａｅｎｙ　）を生産することを伴う方法を提供
する。

本発明の他の目的、特質および利点は、本明細書の以下
の説明から明らかとなるだろう。しかし、本明細書中の
詳しい説明および特定の具体例は、本発明の好ましい具
体例を示してはいるが、説明のためだけのものであり、
本発明の技術的範囲を定めるものではない。本発明の技
術的範囲内で成される種々の変形および修正は、この詳
細な説明から当業者には明らかであろう。

［図面の説明］ 第１図はトランスジェニック植物におけるウィルス病耐
性の生物試験の概略を示す。

第２図はダイス　モザイク　ウィルス　フートたんぱく
質（ＳＭＶ　　ＣＰ）の部分アミノ酸配列を示す。

第３図は、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯ８構成
物を含む植物形質転換ベクター、１）ＭＯＮ３１９を示
す。このベクターは植物細胞に構成物を挿入するために
使用した。

第４図は、制限エンドヌクレアーゼＢｏｌＩＩとＥＣＯ
ＲＩに対する唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）開裂部位を有する
合成マルチリンカ−に隣接してＣａＭＶ３５Ｓ　　プロ
モーターを含む発現ベクター、ｐＭＯＮ３１６を示す。

このマルチリンカ−の後には、ツバリン　シンターゼ遺
伝子アデニル化シグナルをコードする２６０塩基対の断
片が続いている。

第５図は、第４図に示したＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモー
ター、マルチリンカ−およびツバリン　シンターゼ断片
の完全配列を示している。

第６図および第７図は、本発明によってそれぞれ生産し
たトランスジェニックなタバコ植物とトマト植物に対す
る異なる水準のウィルス接融（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）の効
果を含む例３（Ａ）と３（Ｂ）に記述した実験からのデ
ータを、それぞれ示している。

第８図は、遺伝的に耐性な系のトマト植物と、本発明に
よって生産したトランスジェニック植物の間のウィルス
耐性の比較を含む例３（ｃ）に記述した実験からのデー
タを示している。

第９図は、タバコ　モザイク　ウィルスの種々の株に対
して効果的である、本発明に従ったトマト植物中への交
叉免疫の導入を含む例４に記述した実験からのデータを
示す。

第１０図は、例５で使用したペチュニア由来の５ｓＲＬ
ＩＢＩｓｃＯプロモーターの最初の単離と中間体ベクタ
ーへの導入を示している。

第１１０は、例５で使用したペチュニア由来の５ｓＲＵ
ＢＩｓｃｏ　　プロモーターの部分ヌクレオチド配列を
示している。

第１２図は、ＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーターをペチュ
ニアの５ｓＲＵＢ　ｌ５ＣＯプロモーターに置換したＤ
ＮＡ構成物の生産の概略を示す。

第１３因は、アルファルファ　モザイク　ウィルスのコ
ートたんぽ＜ｆｆ　（ＡＭＶ　　ＣＰ＞をコードするｃ
ＤＮＡを製造するために使用した方法を示す。

第１４因は、ポテト　ウィルス　Ｘ　のコートたんぱく
質遺伝子（ＰＶＸ　　ＣＰ）を含む植物ベクターを製造
するために使用した方法を示す。

第１５因は、ｐｖｘ　　ｃｐ遺伝子のヌクレオチド配列
を示す。

第１６図は、トマト　ゴールデン　モザイク　ウィルス
　コートたんぱく質（ＴＧＭＶ　　ＣＰ）をコードする
ヌクレオチド断片を単離するための工程を示す。

第１７図は、ＴＭＶ　　ＲＮＡに対するアンチセンス相
補体をコードするＤＮＡを含む植物ベクターを生産する
ために例９で使用した工程の概略を示す。

［好ましい具体例の説明］ 本発明は、植物細胞中で機能し、ウィルス耐性を生じる
ＤＮＡ構成物の製造を含む。以下に詳細に説明するよう
に、「ウィルス耐性」という語は、ここでは、一つまた
はそれ以上の型の植物ウィルスに抵抗する植物の能力を
意味している。

多数の植物ウィルスが世界的に重大な農作物の損失を引
起こしている。本発明は、植物ウィルスに感染され易い
植物を保護する方法を提供する。

そのようなウィルスには、例えば、ダイズ　モザイク　
ウィルス、ビーン　ボッド　モトル（ｂｅａｎＤＯｄ　
　ｍｏｔｔ＋ｅ）　　ウィルス、タバコ　リングスポッ
ト　ウィルス、バーレイ　イエロー　ドウワーフ（ｂａ
ｒｌｅｙ　　ｙｅｌｌｏｗ　　ｄｗａｒｆ　）　　ウィ
ルス、コムギ　スピンドル　ストリーク（Ｓｐｉｎｄｌ
ｅｓｔｒｅａｋ）　　ウィルス、ソイル　ボーン（ｓｏ
ｉｌｂｏｒｎ）　　モザイク　ウィルス、コムギ　スト
リーク　ウィルス　イン　メイズ（ｉｎ　　ｌ１ａｉＺ
ｅ　）　、メイズ　ドウワーフ　モザイク　ウィルス、
メイズクロロティック（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ　）　　ド
ウワーフウィルス、キューリ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ）　　
モザイク　ウィルス、タバコ　モザイク　ウィルス、ア
ルファルファ　モザイク　ウィルス、ポテト　ウィルス
Ｘ、ポテト　ウィルス　Ｙ１ポテト　リーフロール（Ｉ
ｅａｆｒｏｌｌ）　　ウィルス、トマト　ゴールデン　
モザイク　ウィルスがある。これらの中で、メイズ　ド
ウワーフ　モザイク　ウィルス、バーレイ　イエロー　
ドウワーフ　ウィルス、コムギストリーク　モザイク　
ウィルス、ソイル　ボーン　モザイク　ウィルス、ポテ
ト　リーフロール　ウィルス　および　キューリ　モザ
イク　ウィルス　に対する保護が特に重要である。

本発明の実施によりウィルス耐性となる植物には、ジャ
ガイモ、トマト、コシヨウ、タバコ、ダイズ、コムギ、
コーン、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）　、スカッシュ（Ｓ
ＱｕａＳｈ）　、キューりおよびビート＜　ｂ８ｅｔ　
＞などがある。しかし、これらに限られるわけではない
。

２本鎖ＤＮＡ中に存在する植物遺伝子の発現（ｅｘｐｒ
ｅｓｓｒｏｎ）は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤＮ
Ａの一つの鎖からのメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
の転写と、核の中でのｍＲＮＡ−次転写体のその後のプ
ロセッシングを含んでいる。

このプロセッシングは、ウィルスＲＮＡの３′末端にポ
リアデニル化　ヌクレオチドを付加する３′非翻訳領域
を含んでいる。

ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、普通「ブ０−Ｅ−ター」
と称されるＤＮＡ領域によって制御されている。プロモ
ーター領域はＲＮＡポリメラーゼに対してＤＮＡと会合
し、更に、ＤＮＡ鎖の一つを鋳型（ｔｅｍｐｌｅｔｅ）
として使用してｍＲＮＡの転写を始め、対応するＲＮＡ
鎖をつくるように合図する配列を含む。

植物細胞中で活性な多数のプロモーターが文献に記載さ
れてきた。これらには、例えば、ツバリン　シンターゼ
（ｎｏｐａｌｉｎ　　５ｙｎｔｈａｓｅ　）　　（ＮＯ
８）トオクトビン（０ＣｔＯｐｉｎＣり　　シンターゼ
（ＯＣ８＞プロモーター（これらは、アグロバクテリウ
ムタメファシエンス　（へ１■１旦工虹土凹−ｔｕｍ８
ｆａｃｉｅｎｓ　）の腫瘍誘導プラスミドに保有されて
いる）、カリフラワー　モザイク　ウィルス（ｃａＭＶ
）　　１９８　　および　３５８　　プロモーター、リ
ブロース２リン酸　カルボキシル化酵素の小サブユニッ
ト（ｓｓＲＵＢ　ｌ５ＣＯ１非常に豊富な植物ポリペプ
チド）からの光誘導プロモーター、および、ヒドロキシ
プロリンに富む糖たんぱく質をコードする遺伝子のプロ
モーターなどがある。これらのプロモーターの全てが、
植物中で発現される種々の型のＤＮＡ構成物をつくるた
めに使用された（　　ＰＣＴ公報　ＷＯ８４１０２９１
３（Ｒｏｇｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｎ５ａｎｔｏ
　）を参照）。

植物細胞中でウィルスＲＮＡの転写を起こすことが知ら
れているあるいは見出されているプロモーターを、本発
明で使用することができる。そのようなプロモーターは
植物またはウィルスから得ることができ、例えば、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓプロモーター、５ｓＲＵＢ　ｌ５ＣＯ遺伝子
などの植物遺伝子から単離されたプロモーターがある。

しかし、これらに限定されるわけではない。後述するよ
うに、好ましくは、選んだ特定のプロモーターは、植物
を実質的にウィルス感染に対して耐性にする有効量のコ
ートたんぱく賀の生産をもたらすための十分な発現を引
起こすことができなければならない。耐性を誘導するた
めに必要なコートたんぱく賀の糟は、植物および／また
は　保護の目標となるウィルスの型に応じて変化する。

従って、ＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーターが好ましい。

しかし、このプロモーターが本発明の全ての具体例で最
適なプロモーターであるとは限らない。

本発明のＤＮＡ構成物中で用いられるプロモーターは、
必要ならば、修飾してその制御特性を変化させることが
できる。例えば、ＣａＭＶ３５８プロモーターを、光の
ないところで５ｓＲＬＩＢＩＳＧＯの発現を抑制する５
ｓＲＬＩＢＩｓｃｏ遺伝子の一部分に連結させ、葉では
活性であるが根では活性でないプロモーターをつくるこ
とができる。生成のキメラ　プロモーターをここに示す
ように使用することができる。ここでの説明では、ｒｃ
ａＭＶ３５ｓＪの語ハ、例えば、オペレーターｍ域との
連結、無作為のまたは制御を伴った突然変異生成（＋ａ
ｕｔａｇ８ｎｅＳｉＳ　）によって誘導されたプロモー
ターなどの、ＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーターの変形も
含む。

本発明のＤＮＡ構成物は、２本鎖ＤＮＡ形の中にウィル
スのコートたんぱく質をコードするウィルス　ゲノムの
一部分を含むことが好ましい。多くの型の植物ウィルス
はＤＮＡではなくＲＮＡを含んでいるが、１本鎖または
２本鎖のＤＮＡを含むものもある。ＲＮＡを含むウィル
スは、標準の転写プロモーター　および／または　３′
制御配列を含まない。この場合には、ポリペプチドまた
はたんぱく質は、ウィルスに保有されるＲＮＡ鎖または
その相補体（ｃ０１ｌｌＩｅｌｅｎｔ）から直接翻訳さ
れる。コートたんぱく質をコードしているウィルス　ゲ
ノムの部分は、当業者によく知られている幾つかの方法
のいずれかによって決定できる（後述の例１を参照）。

例えば、ある場合には、コートたんぱく質をシーフェン
シング（５ｅａｕｅｎｃｉｎｏ）　Ｌ／、ウィルスのコ
ートたんぱく質をコードするＤＮＡ配列の合成を選択す
ることができる。その代わりに、コートたんぱく貿をコ
ードするウィルスからのＲＮＡを同定し、生成すること
もできる。ＲＮＡを含む植物ウィルスの大部分では、コ
ートたんぱく￥！遺伝子はウィルスＲＮＡの３′末端に
位置している。ある場合には、コートたんぱく質遺伝子
は、その配列がウィルスのコートたんぱく質のアミノ酸
配列を反映しているオリゴヌクレオチド　プローブを用
いて位置を定めることができる。ウィルスがＲＮＡを保
有している場合には、ＤＮＡコード配列は逆転写酵素を
用いて相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を形成することによ
って得られる。上述したように、多くの型の植物ウィル
スはＲＮＡを含んでいる。これらには、例えば、タバコ
　モザイク　ウィルス、トマト　スボッティド（ｓｐｏ
ｔｔｅｄ　）　　ウィルｌ−（ｗｉｌｔ）　　ウィルス
、キューリ　モザイクウィルス、アルファルファ　モザ
イク　ウィルス、ポテト　ウィルス　Ｘ　などのボテツ
クスウイルス（１）ＯｔｅＸＶｉｒＵＳｅＳ）　、ポテ
ト　ウィルス　Ｙなどのボティウイルス（ＤＯｔＶＶｉ
ｒｕＳｅＳ　）　、ポテト　リーフロール　ウィルス　
などがある。

ボティウイルスなどの一定のウィルスの場合には、コー
トたんぱく質は、プロセッシングを受けてコートたんぱ
く質を放出するポリプロティンの一部である。当業者は
、次の例１に詳述するように、コートたんぱく質をコー
ドするウィルス　ゲノムの領域を単離し、翻訳開始シグ
ナルを導入するためには、これらのことを考慮しなけれ
ばならない。

それほど好ましくはないが、ウィルスＲＮＡ配列の生産
を起こす本発明のＤＮＡ構成物で用いられる配列はアン
チセンス（ａｎｔ　ｉ　−５ｅｎｓｅ　）の配置をとる
ことができる。例えば、ＤＮＡの転写によって生産され
るＲＮＡは、最終的には、天然のウィルス　コートたん
ぱく質ｍＲＮＡの相補的配列を持つＲＮＡ分子を生産す
ることができる。（アンチセンス配置が使用される場合
は、ＤＮＡ配列は、コートたんぱく質ｍＲＮＡの５′領
域に相補的なアンチセンスＲＮＡをつくるために短くな
ると、信じられている。）　その代わりに、アンチセン
スＤＮＡはウィルス　ゲノムの他の断片から誘導できる
。好ましい領域には、試験管中でウィルスＲＮＡの翻訳
を阻害することが示されている（Ｂｅａｃｈｙ　　ｅｔ
　　ａｌ、（１９８５）　）ウィルスＲＮＡの５′末端
などがある。いずれの場合も、アンチセンス転写体は安
定性が低く、あるいは、宿主植物中でのより高い水準で
の発現を必要とすると信られているので、この配置はあ
まり好ましくない。

本発明のＤＮＡ構成物中で用いられるコード配列は、必
要ならば、当業者に既知の方法を使用して、無作為のま
たは制御を伴った突然変異生成のいずれかにより修飾し
て突然変異体をつくることができる。それで、そのよう
な突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ　）と変異体（ｖａｒｉ
ｅｎｔＳ）は本発明の範囲に含まれる。従って、「コー
トたんぱく質」の語は、ここでは、トランケートされた
たんぱく質、融合（ｆｕｓｉｏｎ）たんぱく質、並びに
、無修飾のコートたんぱく質を含んでいる。

３′非翻訳領域は、植物中で機能してウィルスＲＮ△の
３′末端へのポリアデニル化　ヌクレオチドの付加を起
こすポリアデニル化シグナルを含む。適切な３′領域は
、例えば、（１）アグロバクテリウム（Ａ　ｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｕ　）のツバリン　シンターゼ（ＮＯ３）
遺伝子などの腫瘍誘導（Ｔ１）プラスミド遺伝子の、ポ
リアデニル化シグナルを含む３′転写非翻訳領域、およ
び、（２）ダイズ貯蔵たんぱく質遺伝子およびＲｕＢＰ
カルボキシル化酵素遺伝子の小サブユニットなどの植物
遺伝子である。好ましい３′領域は、例えば、ＮＯ８遺
伝子のものである。これについては後述の例に詳しく述
べる。

本発明のＤＮＡ構成物によって生産されるＲＮＡは、ま
た、５′非翻訳のリーダー（１ｅａｄｅｒ）配列を含む
。この配列は、遺伝子を発現するために選んだプロモー
ターから誘導できるし、また、ｍＲＮＡの翻訳を増加さ
せるために特別に修飾することができる。また、５′非
翻訳領域は、ウィルスＲＮＡから、適当な真核細胞の遺
伝子から、または、合成遺伝子配列から得ることができ
る。

本発明は、後述の例に示すように、非翻訳領域が、プロ
モーター配列に伴う５′非翻訳配列、および、ウィルス
　コートたんぱく質遺伝子の５′非翻訳領域の部分の両
者から誘導される構成物には限定されない。そうではな
くて、非翻訳リーダー配列は、ウィルス　コートたんぱ
く質に対するコード配列の非翻訳領域の５′末端の部分
、または、プロモーター配列の部分であってよく、ある
いは、関連のないプロモーター配列または上述のような
コード配列から誘導できる。

本発明のＤＮＡ構成物は任意の適当な方法によって植物
のゲノムに挿入できる。適当な植物形質転換ベクターに
は、例えば、アゲＯバクテリウムタメファシエンスのＴ
ｉプラスミドから誘導したもの、並びに、文献に開示さ
れたものがある（例えばＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ
ｌａ　　（１９８３）　、Ｂｅｖａｎ（１９８３）　、
Ｋ　ｌｅｅ　　（１９８５）およびＥＰＯ公報第１２０
５１６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ　　ｅｔ　　ａｌ
、）　）。

アグロバクテリウムのＴｉまたは根誘導（Ｒｉ　）プラ
スミドから誘導した植物形質転換ベクターに加えて、本
発明のＤＮＡ構成物を植物細胞へ挿入する他の方法を用
いることができる。そのような方法には、例えば、リボ
ゾームの使用、エレクトロボーレーション（ｅｌｅｃｔ
ｒｏＩ）Ｏｒａｔｉｏｎ　）　、遊離ＤＮＡ取込みを増
加させる化学物質、および、ウィルスまたは花粉を使用
する形質転換などがある。

本発明の一つの具体例では、２本ｌＡｃ０Ｎ八は、タバ
コ　モザイク　ウィルス（ＴＭＶ）のコートたんぱく質
をコードするＲＮＡ断片　（ｃＰ−ｍＲＮＡ）から製造
される。このコード配列をＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモー
ター　および　ＮＯ３３′非翻訳領域に連結して、本発
明のＤＮＡ構成物を形成することができる。ＤＮＡ構成
物を、　　　　一部分的にアグロバクテリウム　タメフ
ァシエンスのＴ１プラスミドから誘導した中間体プラス
ミドに挿入して、プラスミド　ｏＭＯＮ３１９をつくる
。それから、ベクターを、弱めた（ｄｉｓａｒｎ＋ｅｄ
）Ｔｉプラスミドを含む培ＩＡ、タメフ７シェンスに挿
入する。二つのプラスミドは、交叉（ｃｒｏｓｓｏｖｅ
ｒ　　ｅｖｅｎｔ　）によりコインテグレート（ｃｏｉ
ｎｔｅｇｒａｔｅ　）　　プラスミドを形成する。

コインテグレート　プラスミドを含む細菌細胞を、タバ
コ植物から誘導した細胞と共に培養し、形質転換した植
物ｗａｒｍをカナマイシンを含む栄養培地を用いて選汰
する。それから、その細胞をカルス組織に培養し、分化
した植物に再生する。生成した本発明の植物は、ウィル
ス耐性を与えるＤＮＡ構成物を含む。

本発明の実施においては、特定のウィルスに由来するＣ
Ｐコード配列を含むＤＮＡ構成物が持つ耐性付与能力を
、第１の例としてそのウィルスに対する全身性の（５ｙ
ＳｔｅｌｉＣ）宿主を用いて利用することが好ましい。

「全身性の」宿主植物中では、ウィルスは、複製し、依
然として非特定的な方法で接種部位（典型的には、葉上
）から植物中を移動して、局部的でない全身的な感染の
症状を起こすことができる。（逆に、「非全身的な」宿
主は、壊痘性斑点の発達のような、接種部位の周辺領域
に制限された症状を示す。）　特定のウィルスとそれに
対して全身性である宿主とのベアリングは、植物病理学
ではよく認められている。例えば、多くのトマトおよび
タバコの変種並びにアルファルファは、アルファルファ
　モザイク　ウィルス（ＡＭＶ）に対して全身性である
。また、キューリ　モザイク　ウィルス（ｃｕＭＶ）は
、トマト、タバコ、キューりおよび他のメロン作物に全
身性の感染を起こし、タバコ、トマトおよび多数のラン
の変種は、ＴＭＶに対する全身性の宿主である。

一般的には文献を参照　（ＩＮＤＥＸ　　０ＦＰＬＡＮ
Ｔ　　　ＶＩＲＵＳ　　　ＤＩＳＥＡＳＥＳ。

Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　　Ｎ
ｏ、３０７（ＡＲ８−Ｕ　Ｓ　ＯＡ　　　１９６Ｂ）　
　。

特に、本発明によって１造されたＤＮＡ構成物は、ＲＮ
Ａ配列の生産を起こす構成物中のＤＮＡ配列を与える源
として使用するウィルスに対して、全身性であるような
植物から誘導した植物細胞またはプロトプラストに、上
に述べた適当なベクターを介して導入される。ＤＮＡ配
列がウィルスのコートたんぱく賀をコードしている場合
には、このように修飾された植物物質は、例えば、ノー
ザン　ブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　ｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ　）によりＣＰ−ｍＲＮＡの存在を試験される
。ＣＰ−ｍＲＮＡが検出されない（または力価が低すぎ
る）場合には、ＣＰをコードする断片を制御するために
構成物中で使用されているプロモーターを、より強力な
可能性のある他のプロモーターと置換えて、この変化し
た構成物を再び試験することができる。

その代わりに、この監視を全体（ＷｉｌＯＩ８　）の再
生した植物に行うことができる。いずれの場合も、ウィ
ルスｍＲＮＡの適切な生産が行われたときには、形質転
換細胞（またはプロトプラスト）は全植物に再生され、
後者（植物）をウィルスに対する耐性に関してスクリー
ニングする。再生工程のための方法論の選択は重要では
なく、マメ科（アルファルファ、ダイス、クローバ−な
ど）、セリ科にンジン、セロリ−、アメリカボウフウ）
、アブラナ科（キャベツ、ハツカダイコン、ナタネなど
）、ウリ科（メロンとキューリ）、イネ科（コムギ、イ
ネ、コーンなど）、ナス科（ジャガイモ、タバコ、トマ
ト、コシヨウ）および種々の植物作物の宿主に対する適
当なプロトコルが利用できる。文献（例えば、Ａ　ｍｍ
１ｒａｔｏ　　ｅｔ　　ａｌ。

（１９８４）　）を参照。上記の科のそれぞれの植物に
、本発明によってウィルス耐性を与えることができる。

ウィルス耐性を試験される再生植物は、病気の発達の速
度が接種物中のウィルス濃度と線形に相関する範囲の濃
度で、ウィルスに接させることが好ましい。この線形の
範囲は、一定のウィルスと宿主種のベアリングに関して
、形質転換していない植物を用いて経験的に決定するこ
とができる。

ウィルス接種の方法は当業者にはよく知られており、文
献（Ｋ　ａｄｏ　　＆　　Ａ　ｇｒａｗａｌ　（１９７
２）　）にまとめられている。一つの方法は、カルボラ
ンダム（ｃ１ａｒｂＯｒｌＪｎｄＵｌｌ　＞またはケイ
ソウ土などの研磨剤とウィルスとを含む水性懸濁液（典
型的にはｐＨ７〜８に！１衝化する）を用いて、葉表面
を研磨する工程を含む。この方法での接種はその簡便さ
のために一般に好まれているが、一定の植物ウィルスに
対しては他の方法が好ましい可能性があることは当業者
には認められるだろう。例えば、アフィドボーン（ａｐ
ｈｉｄ　−ｂｏｒｎ）　　ポテト　リーフロール　ウィ
ルスは機械的な研磨によっては容易に接種されないこと
が、知られている。これは適当な昆虫ベクターを用いて
移入される。一般的には文献（Ｔｈｏｍａｓ　　（１９
８３）　）を参照。

再生物の後代に接種を行い、形質転換されていない植物
、および／または、ウィルスＲＮＡ配列の生産を起こす
ＤＮＡ配列を欠いている構成物を用いて形質転換された
植物である、同様に処理した対照と共に観測し、例えば
、症状の発生の時期について群の間の相違に反映される
比較耐性を測定する（第１図参照）。例えば、本発明に
よるウィルス　コートたんぱく質をコードする配列を含
む植物は、ウィルス感染の症状を示すとしても、対照の
植物に比較して相当に長い期間の後にのみ、症状を示す
ことが見出された。トランスジェニック（ｔｒａｎｓＱ
ｅｎｉｃ）植物の間で観測された耐性は、ウィルスｍＲ
ＮＡまたはコートたんぱく質の測定された水準と相関し
ている。このように、ウィルス　ゲノムの小部分の発現
は、ウィルス感染に対する耐性を与えることができるこ
とが見出された。

ある場合には、ウィルスｍＲＮＡまたはコートたんぱく
質の発現は検出することができない。これは多分ｍＲＮ
Ａまたはたんぱく質の不安定性のためと思われる。しか
し、ｍＲＮＡまたはたんぱく質を安定化する方法が当業
者には知られている。

例えば、安定なｍＲＮＡの形成には、イントロンのスプ
ライシングが重要な役割を果たすことが知られている（
　）−１ａｍｅｒ　　＆　　ｌ　ｅｄｅｒ　（１９７９
）　）　。ウ　−イルス　コートたんぱく質遺伝子の発
現は、イントロンをコード配列または非コード配列に挿
入することにより十分に高められる。更に、ｍＲＮＡの
３′非翻訳配列が、対応するｍＲＮＡの安定性を決定す
ることが知られている（３ｈａｗ　　＆Ｋ　ａｍｅｎ　
（１９８６）　）。工学的に処理したコートたんぱく質
ｍＲＮＡの安定性は、その３′非翻訳領域の交替によっ
て十分に増加させることができる。

最後に、幾つかのたんぱく質はたんぱく質分解の際にそ
の機能活性を保持することが知られている（　　Ｍｏｏ
ｒｅ（１９８１）　、Ｓａｎｄｍｅｉｅｒ（１９８０）
、Ｚｕｒｉｎｉ　　（１９８４）　）。

本発明によって生産されたトランケートされたコートた
んぱく質は、トランスジェニック植物中に高水準で発現
されたときに、その生物活性を保持しウィルス耐性を与
えることができた。

例１　交叉免疫で使用するためのウィルス　コートたん
ぱく質の典型的な単離 ボティウイルスは、最も広範で経済的に重要な既知の植
物ウィルスの群を包含する。それで、一つのボティウイ
ルス、ダイス　モザイク　ウィルス（ＳＭＶ）を選び、
本発明に従ってウィルス病耐性（「交叉免疫」）を与え
るために使用することができるウィルス　ゲノムの小部
分、コートたんぱく質をコードする配列を単離する一般
的な方法を説明した（第１図参照）。

ＳＭＶを、ＳＭＶのＮ鎖を用いて感染されたダイズ菓か
ら精製した。文献　（Ｖ　ａｎＣｅ　　＆Ｂｅａｃｈｙ
　　（１９８４）　）に開示されている方法に従って、
ウィルスを単離し、ウィルスＲＮＡＩＩ製した。ＳＭＶ
に対する抗体は定法によりウサギ中で産生させた。これ
は、１１ｇのｖＩ製ＳＭＶをウサギに注射し、４週後に
５０μＱのＳＭＶの第２の注射を行い、更に２週後にＳ
ＭＶ　（５０μｑ）を注射する工程を含んでいた。最後
の追加抗原注射の後、２週間隔でこの例で使用するため
に血清を集めた。

ウィルス　コートたんぱく質遺伝子のＣＤＮＡクローニ
ングは、当業者によく知られている方法を用いて行った
。ＣＤＮＡは、まず、オリゴ（ｊＴを用いてポリアデニ
ル化されたＳＭＶ　　ＲＮＡをブライミングし、それか
ら、逆転写酵素を用いてＣＤＮＡを生産することにより
、ウィルスＲＮＡから生産した。２本ｔｌｌｃＤＮＡを
生産するために、第１のｆｌｉｃＤＮＡ　：　ＲＮＡハ
イブリッド分子をＲＮＳａｅ　　ＨとＤＮＡポリメラー
ゼエを用いて処理した。それから、この分子をＴ４　　
ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理し、その後、ＥＣ０Ｒ
Ｉメチラーゼにより処理した。この分子を、ＥＣｏＲＩ
部位を含む合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在下で
Ｔ４　　ＤＮＡ　　リガーゼと反応させた。その後、こ
の分子をＥＣＯＲＩを用いて消化し、プラスミドｌ）Ｅ
ＭＢ１１８に連結した。

このプラスミドは、ヨーロッパ分子生物学研究所（Ｐ、
　Ｏ，Ｂｏｘ　　１０−２２０９．６９００　　Ｈｅ１
ｄｅｌｂｅｒａ。

Ｆｅｄｅｒａｌ　　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ　　ｏｆ　　Ｇｅ
ｒｎ＋ａｎｙ）で構築された広く利用されているクロー
ニングベクターのクラスの一つである。ｐＥＭＢＬ１８
　　ＤＮＡに予め酵素ＥＣＯＲＩを用いて制限を行い、
プラスミドの再アニーリングを防ぐためにリン駿アルカ
リを用いて処理した。露出したＥＣＯＲ１部位を持つ２
本鎖ＣＤＮＡを開いたプラスミドに連結した。これらの
連結されたＣＤＮＡを大腸菌（０ｌｉ）ＤＨ５ａ株を形
質転換するために使用した。

形質転換した細菌のコロニーを３２ｐＨ識したＣＤＮＡ
を用いてスクリーニングし、３２ｐ標識分子と反応した
コロニーを選んだ。抗原産生に対するスクリーニングの
ために、ＩＰＴＧを使用してポジティブな形質転換体を
誘導し、予め産生させたウサギ　抗コートたんぱく質　
抗体を用い、抗体プロット法を介して成長するコロニー
をスクリーニングした。（一定の適当な抗ＣＰ抗体は市
販もされている。例えば、　Ａ　ｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔ
　ｙＤｅＣｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　
ｉｎ　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙ＋ａｎｄ、　）　　抗体と反応したそれらのコ
ロニーを更にスクリーニングして選汰し、それらが実際
にコートたんば（質：ＩａｃＺ融合たんぱく質を生産す
ることを確めた。融合たんぱく貿を生産するコロニーか
ら単離したプラスミドＤＮＡをプローブとして使用し、
ＣＤＮＡを含む他のコロニーを同定した。この方法は標
準的なハイブリダイゼーション法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　
　ｅｔ　　ａｌ、（１９８２）　）と一部！複している
。

クローンしたＣＤＮＡのＤＮＡ配列は標準法によって決
定した（第２図参照）。ウィルス　コートたんぱく質の
アミノ酸シークエンシングを完成して、ＮＨ２末端アミ
ノ酸配列を決定することができる。ある場合にはアミン
末端断片がブロックされている可能性があるので、ウィ
ルス　コートたんぱく質は、当業者に既知の方法を応用
し、ファースト　アトム　ボンバードメント（ｒａｓｔ
ａｔｏｍ　　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　）　　（ＦＡＢ
）と質量分析計によりシーフェンシングすることができ
る。それから、たんぱく質のアミノ酸配列をクローン化
ｃＤＮＡのシーフェンシングにより誘導した配列と比較
できる。これによってウィルス　コートたんぱく質をコ
ードすると同定されたｃＤＮＡ断片を、新たな制限部位
とＡＴＧ翻訳開始コドンを成熟コートたんぱく質のＮＨ
２末端アミノ酸のコドンの、５′末端に関して、すぐ隣
に導入することにより得ることができる。これはシラー
とスミスの方法（Ｚｏｌｌｅｒ＆　　Ｓｍ１ｔｈ（１９
８２））によって行うことができる。コートたんぱく質
コード配列を切取るための制限酵素消化の後、単離した
ＣＰコード配列を上に述べたように、適用なプロモータ
“−に連結し、本発明によってウィルス耐性を与えるた
めに植物中に置いた。

例２　ウィルス　コートたんぱく質遺伝子（タバコ　モ
ザイク　ウィルス）を含むトランスジェニック植物にお
けるウィルス病耐性 この例では、ウィルス　コートたんぱく質のヌクレオチ
ド配列が利用できる場合に本発明を実施する方法を説明
する。

Ａ、シラスミ゛　ｐＭＯＮ３１９の製造文献（Ｂｒｕｅ
ｎｉｎｏ　　（１９８２）　）に記述されるように、フ
ェノール抽出によってタバコ　モザイクウィルス（ＴＭ
Ｖ、普通のＵｌ　バルガー（ｖｕｌｇａｒｅ　）　　株
、配列は公表されている（Ｇｏｅｌｅｔ　　ｅｔ　　ａ
ｔ、　（１９８２）　）　）からＲＮＡを除いた。ウィ
ルスＲＮＡの３′末端に相補的であり、しかも、Ｎｄｅ
ｌとＢａｍＨＩ開裂部位を有する３５−ｍａｒ　　オリ
ゴヌクレオチド　ブライマーを合成した。オリゴヌクレ
オチドをウィルスＲＮＡに対してアニーリングし、マニ
アチスの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　（１９８２）　）に
従って、ＣＤＮＡの合成（逆転写酵素を用いる）のため
のブライマーとして用いた。１本ｌＤＮＡをマニアチス
の方法（ＭａｎｉａｔｉＳ　　（１９８２）　）により
２本ｍ（ｄｓ）ＤＮＡに変換した。

ｄｓ−ｃＤＮＡを、ブライマー上の部位で開裂するＢａ
ｍＨｌｌおよび、ＴＭＶ配列の５０８０の塩基で開裂す
るＨ　ｉ　ｎｄｌ［［により開裂した。生成した１、３
ｋｂの断片を、同じ＜Ｈｉ　ｎｄＩ［［と３ａｍＨＩを
用いて開裂したプラスミド　ｐＵＣ９ＤＮＡと混合した
。生成のアンピシリン耐性プラスミド　ｐＴＭ３７をそ
の後の操作に使用するコートたんぱく質コード配列ＤＮ
Ａの源とした。

これは３ａｍＨ１部位に隣接してＥｃｏＲＩ部位を有し
ている。

コートたんぱく質コード配列を有するより小さいＤＮＡ
断片を得るために、プラスミド　ｐＴＭ３７を、ＴＭＶ
配列の５７０７の塩基〈コートたんぱく質ｍＲＮＡに対
するＡＴＧ翻訳開始コドンから５塩基対）で開裂するＡ
ｈａＩＩＩ、および、ｐＴＭ３７中のＴＭＶ配列の末端
をちょうど越えて開裂するＥｃｏＲＩを用いて消化した
。それから、生成した長さ約７００塩基対（ｂｐ）の断
片を、コートたんぱく質コード断片の５′および３′末
端に対する制限部位を付加するために、他の二つのプラ
スミドに移してクローンした。これらの制限部位の付加
はその後のプラスミドの構築を容易にした。その代わり
に、制限部位を付加するために、サイト　ダイレクチイ
ツト（ｓ　ｉ　ｔｅ　−ｄ　ｉ　ｒｅｃｔｅｄ　）突然
変異生成、または、合成りＮＡリンカ−の連結などの他
の方法を選択することもできる。これらの技術は全て従
来技術の範囲内にある。

ＢｇＩＩＩ部位で５′末端に接し、ＥＣＯＲ１部位で３
′末端に接する７００ｂｐのコートたんぱく質コード配
列断片を、ＢｏｌｌＩとＥｃｏＲＩを用いる消化によっ
て中間体プラスミドから切取った。

この７００ｂｐの断片を精製し、同じ＜Ｆ３ａ　Ｉ　Ｉ
ＩとＥＣＯＲＩを用いて消化した　プラスミドｐＭＯＮ
３１６のＤＮＡと混合した。プラスミドｐＭｏＮ３１６
は、３５Ｓ転写体の生産ヲ指示する　カリフラワー　モ
ザイク　ウィルス（ｃａＭＶ）の３３０ｂｐ断片を保有
するＤＭＯＮ２００　（Ｆｒａｌｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ
　　（１９８５）　、Ｒｏｃｋｅｒｓｅｔ　　ａｌ　　
（１９８５）　）の誘導体である。

ＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーター断片を、５ａｌＩ挿入
物としてＣａＭＶ　　０Ｍ４−１８４株（Ｈｏｗａｒｔ
ｈ　　ｅｔ　　ａｔ（１９８１）　）の完全なゲノムを
保有するｐＢＲ３２２ＴＭ導体であるプラスミドｐＯ３
−１から単離した。０Ｍ４−１８４株は０Ｍ１８４１株
の天然に存在する欠失突然変異体である。ＣａＭＶの０
Ｍ１８４１株（Ｇ　ａｒｄｎｅｒｅｔ　　ａｔ　（１９
８１）　）とＣａｂｂ−８株（Ｆ　ｒａｎｃｋｅｔ　　
ａｌ　　（１９８０）　）のヌクレオチド配列は公表さ
れており、異なる０Ｍ４−１８４　　クローン（Ｄｕｄ
ｌ１３Ｖ　　ｅｔ　　ａｌ　　（１９８２）　）に対す
るある部分的な配列を有している。これらの全ての株の
３５８　プロモーターのヌクレオチド配列は非常に類似
している。以下の説明中に参照するヌクレオチド番号（
ｒｎ　　、、、Ｊ）は、ガードナーら（Ｇａｒｄｎｅｒ
　　ｅｔ　　ａｔ（１９８１）　）により開示されてい
る０Ｍ１８４１の配列に対するものである。

まず１３ａｍＨＩを用いて開裂された　ｐＢＲ３２２に
挿入し、その後ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（Ｋ　
ｌｅｎｏｗ　）断片を用いて処理し、最後にＥｃｏＲＩ
を用いて開裂したＡｌｕｌ　　（ｎ７１４３）−Ｅｃｏ
ＲＩ’　　（ｎ　　７５１７）断片として、３５Ｓ　　
プロモーターを０Ｍ４−１８４のｐＯ８−１クローンか
ら単離した。それから、プロモーター断片を３ａｍＨＩ
とＥＣＯＲＩを用いてｐＢＲ３２２から切取り、タレノ
ー　ポリメラーゼを用いて処理し、ｍｐ８マルチリンカ
−のＥｃｏＲ１部位がプロモーター断片の５′末端にく
るようにＭｌ　３　　ｍｐ８　　（ＭｅＳＳｉｎ（１＆
Ｖｉｅｉｒａ　　（１９８２）　）のＳｍａ　１部位に
挿入した。

その後、サイト　ダイレクチイツト　突然変異生成（Ｚ
　ｏｆｆｅｒ　　＆　　Ｓ　ｎ＋ｉｔｈ　（１９８２）
　）を使用して、ヌクレオチド　７４６４にグアニジン
残基を導入し、ＢｑｌｌＩ部位を形成した。

それから、３５Ｓ　　プロモーター断片を、Ｍｌ３から
、３３０　ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢＱ　Ｉ　Ｉ［断片とし
て切取った。これは、３５Ｓ　　プロモーター、転写開
始部位、および、５′非翻訳リーダーの３０個のヌクレ
オチドを含むが、ＣａＭＶ翻訳イニシエーター、また、
転写の開始点から１８０ヌクレオチド下に位置する３５
８転写ポリアデニル化シグナル　（ｃｏｖｅｙ　　ｅｔ
　　ａｌ（１９８１）、Ｇｕｉｌｌｅｙ　　ｅｔ　　ａ
ｔ（１９８２）　）は含まない。３５８プロモ一ター断
片を、合成マルチリンカ−と、ＮＯ８３’非翻訳領域か
らのｐＴｉ　７３７　　ツバリン　シンターゼ遺伝子＜
Ｂｅｖａｎ　　ｅｔ　　ａｔ（１９８３））（７）２６
０ｂｐ　　５ａｕ３Ａ断片（ヌクレオチド　６６５〜４
１７）とに結合させた。このようにして製造した断片を
ｐＭＯＮ２００に挿入し、ｌ）ＭＯＮ３１６を得た（第
３図）。３５８プロモーター、マルチリンカ−およびＮ
０８３′断片の完全な配列を第４図に示す。この配列は
、３５Ｓ　　プロモーター断片の５′末端に位置するＥ
ｃｏＲ１部位を除くためのクレノー　ポリメラーゼ処理
によって形成されたｘｍｎ１部位で始まっている。

プラスミド　ρＭＯＮ３１６は、５′　リーダーとＮＯ
Ｓポリアデニル化シグナルの間に、制限エンドヌクレア
ーゼ　Ｂａ１ＩＩ、　Ｃ１ａｌ。

Ｋｐｎｉ、ｘｈｏｌおよびＥｃｏＲＩに対する唯一の（
ｕｎｉｑｕｅ）開裂部位を有するコインテグレート型の
中間体ベクターである。この開裂部位のために、３５８
転写リ一ダー配列のすぐ隣に、それ自身の翻訳開始シグ
ナルを保有するコード配列を挿入することができる。ｌ
）ＭＯＮ３１６　　プラスミドは、大腸菌およびＡ、タ
メファシエンスにおける選抜のためのスベクチノマイシ
ン耐性を含むｐＭＯＮ２００の全ての性質、並びに、形
質転換された植物組織の選抜のためのキメラ　カナマイ
シン遺伝子（ＮＯ８−ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ’−ＮＯ３）、お
よび、後代中での形質転換体と遺伝形質の容易なスコア
リングのためのツバリン　シンターゼ遺伝子を保持して
いる。Ｉ）ＭＯＮ３１６　　プラスミドは上述のＣａＭ
Ｖ３５８−ＮＯ８カセットを含む。これはＤＭＯＮ２０
０には欠けていたものである。しかし、実質的にはｐＭ
ＯＮ２００と同様に使用することができる（　Ｆ　ｒａ
ｌｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ（１９８５）　、Ｒｏｇｅｒｓ
　　ｅｔ　　ａｌ　　（１９８６）を参照）。

７００ｂｐのＴＭＶコートたんぱく質コード断片を挿入
することにより、形質転換植物細胞中でのこのたんぱく
質の合成の適切なシグナルが提供される。生成のプラス
ミドを第５図に示す。このプラスミドをｒｐＭＯＮ３１
９Ｊと称する。

プラスミド　Ｉ）ＭＯＮ３１９を、フレーリーら（Ｆｒ
ａｌｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ　　（１９８５）　）に従い
、ｒｐＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥＪと称する弱めた７ｉ　　プ
ラスミドを含むＡ、タメファシエンスＩｌＩ胞に挿入し
た。

このプラスミドは、完全に機能的なＴ−ＤＮＡｆｉ域を
含まず、左のＴ−ＤＮＡ境界を含む。

ｐＭＯＮ３１９　　プラスミドは、細菌中のスペクチノ
マイシン（Ｓｔ）Ｃ）とストレプトマイシン（Ｓｔｒ）
に対する選択可能な耐性を伝達する標識遺伝子を保有し
ている。更に、ｐＭＯＮ３１９をｐＴ　ｉ　Ｂ６Ｓ３−
ＳＥと組合わせて、それにより、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭ
Ｖ−ＣＰ／ＮＯ８構成物を含む再構成されたＴ−ＤＮＡ
領域を有するコインテグレート　Ｔｉ　プラスミドをつ
くる交叉を起こすことができる相同性の領域を保有して
いる。しかし、ｐＭＯＮ３１９はＡ、ウメファシェンス
細胞中で独立して複製することができない。

それで、ＳｐＣおよび３ｔｒ存在下では、コインテグレ
ート　プラスミドを有するＡ、タメファシエンス細胞の
みが生存できる。

コインテグレート　Ｔｉ　　プラスミドを含むＡ、タメ
ファシエンスの培養を、ホーシュら（Ｈｏｒｓｃｈ　　
ｅｔ　　ａｌ　　（１９８５）　）に記述されるように
、タバコ植物（Ｎ　１ｃｉｔｔａｎａ　　ｔｏｂａｃｕ
ｉ　　ｃｖ。

５ａｌｌｌｓＬｌｎ　”　）から採取した葉のディスク
と接触させた。アグロバクテリウム細胞は、ＤＮＡ構成
物を植物細胞の染色体に挿入した。カナマイシンに耐性
の植物細胞を選抜し、ホーシュら（）−１ｏｒｓｃｈ　
　ｅｔ　　ａｌ　　（１９８５）　）が記述する方法に
より分化植物に再生した。

実験で対照とした植物は、（１）外来性の遺伝子を全く
含んでいないか、または、（２）１）ＭＯＮ２００　　
プラスミドのみを含むかのどららかであった。

ｐＭＯＮ３１９　：　：ρＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥコインテ
グレート　プラスミドを含むＡ、タメファシエンスａｍ
の培養を、ブタベスト条約に従いＡＴＣＣに寄託した。

受託番号は第５３２９４号であった。

Ｃ０・ 文献（Ｌ　ａｎｅ　　＆　　Ｔ　ｒｅｍｉａｔｅｓ　−
Ｋ　ｅｎｎｅｄｙ（１９８１）　）に記載される方法に
より、再生した植物の葉からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ
は、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ
　　（１９８２）　）　）が記述するように、ホルムア
ルデヒドを含むアガロースゲル中での電気泳動により大
きさに従って分離し、ニトロセルロースに対してブロッ
ティングした。

ウィルスＲＮＡは、マニアチスら　（Ｍ　ａｎｉａｔｉ
ｓｅｔ　　ａｌ　　（１９８２）　）　’）の方法を使
用して、３２ｐｔｌｌＤＮＡクローンに対してハイブリ
ダイゼーションさせることによって、ニトロセルロース
上に検出した。

このＲＮＡハイブリダイゼーション分析に基づいて、形
質転換した植物ＩＭＯＮ３１９を保有する植物）はウィ
ルスＲＮＡを保有するが、　　−ｐＭＯＮ２００のみを
含む植物はウィルスＲＮＡを含まないことが決定された
。ＴＭＶ　　コートたんぱく質の存在は、ｐＭＯＮ３１
９を含むが、ｐＭＯＮ２００は含まない植物中に検出さ
れた。

リームリ（Ｌ　ａｅｎ＋ｍｌｉ　（１９７０）　）に従
い、試料緩衝液中で粉砕することにより葉からたんぱく
質を抽出した。リームリ（Ｌ　ａｅｍｍｌ　ｉ　（１９
７０）　）が開示するように、たんぱく質の５０μＱの
部分に、ＳＤＳを含む１２％ポリアクリルアミドゲル中
での電気泳動を行った。たんぱく質は、トービンら（Ｔ
ｏｗｂｉｎ　　ｅｔ　　ａｔ　　（１９８１）　）の開
示するように、電気泳動的にニトロセル０−スヘ移され
た。

ブロッティングしたたんぱく質を、シミングトンら（Ｓ
Ｖｌｉｎｇｔｏｎ　　ａｔ　　ａｌ（１９８１）　）の
開示に従い、精製したＴＭＶに対してウサギ中で産生さ
せた抗血清と反応させた。ニトロセルロース上でＴＭＶ
と結合したウサギ抗体は、１２５１標識したロバ　抗ウ
サギ　抗血清（Ａ　Ｈｒｓｈａｍ　　Ｃｏ、　。

Ｃｈｉｃａｌ）Ｏ）との結合により検出した。

イムノプロット分析の結果に基づいて、形質転換した植
物（ｐＭＯＮ３１９を含む）はＴＭＶコートたんぱく質
を生産するが、ｐＭＯＮ２００のみを含む植物はＴＭＶ
　　コートたんぱく質を生産しないことが決定された。

これらの葉中で生産されるコートたんぱく質の量は、葉
の全たんぱく賃の５０μＱ中にコートたんぱく質が約５
０ナノグラム、つまり０．１％であった。

Ｄ、タバコ貞　のＴＭＶに・する・ 形質転換した植物と対照の植物とを約２フイートの高さ
に成長させ、それから、幹部を腋芽を伴った挿木に分割
し、これを根付かせ個々の植物に再生させた。これらの
植物にＴＭＶを接種した。

これは、研磨粒子をウィルス粒子の水性懸濁液に加え、
研磨溶液を葉上でこすることによって行った。特に、Ｔ
ＭＶは０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）（７
，２）に懸濁した。約５０μ℃の溶液を、カルボランダ
ム（３２０グリツド、Ｆｉｓｈｅｒ　　５ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ　　Ｃｏ、製造）を撒いたタバコ葉に、こするこ
とによって適用した。葉の表面が乾燥した侵、葉を水で
すすぎ、植物を温室または生育室に置いた。

対照植物は接種後約３〜５日以内に感染の症状を示した
。それに対して、本発明のＤＮＡ構成物を含む植物は、
接種後８〜１０日まで症状を生じなかった。この結果は
独立した３組の実験で確められた。

他の実験では、ｐＭＯＮ３１９を含む二つの異なる形質
転換植物により生産された種子を発芽させ、実生（Ｓｅ
ｅｄｌｉｎｇ）を土壌で成長させた。それぞれの実生に
、上述のイムノブロッティング法によってＴＭＶ　　コ
ートたんぱく質が存在するか否かを試験した。全部で３
９の実生に、上に述べたＴＭＶを含む懸濁液（０，２５
μにＪ／ｒｄ）を用いて、実生がＴＭＶ　　コートたん
ぱく質を含むか否かを前もって知らない盲検法で接種を
行った。実験の結果、１１／３９の植物がコートたんぱ
く質を含んでいた。残りはコートたんぱく質を含んでい
す、この実験の対照とした。

接種後５日に、３／１１（２７％）の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶコートたんぱく質
を含む植物はいずれもそのような症状を示さなかった。

接種後６日に、４５％の対照植物がＴＭＶ感染の典型的
な症状を生じた。一方、ＴＭＶ　　コートたんぱく質を
含む植物では１８％のみがそのような症状を示した。

接種′４！ｉ７日に、８２％の対照植物がＴＭＶ感染の
典型的な症状を生じた。ＴＭＶ　　コートたんぱく質を
含む植物では５７％がそのような症状を示した。

接種後８日に、８２％の対照植物がＴＭＶ感染の典型的
な症状を生じた。ＴＭＶ　　コートたんぱく質を含む植
物では６４％がそのような症状を示した。

ライ／ｌ／　スニよる重大な攻撃（ｍａｓｓｉｖｅ　　
ａｓｓａｕｌｔ）にもかかわらず症状の発生が相当に遅
れたという結果は、形質転換された植物が、形質転換さ
れな・い植物よりもウィルスに対して相当に耐性が大き
いことの証明である。この実験で観測された耐性の増加
の程度は、形質転換された植物が、開放田畑または濡至
で起こる可能性がある感染接触の型に耐えることができ
ることを示している。

例３．トランスジニック植物におけるウィルス病耐性の
確Ｈ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）Ａ、タバコ
における゛用量応答（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ）例
２に説明した形質転換したタバコ植物の実生をこの実験
に使用した。上に述べたイムノブロッティング法により
、ＣＰコード配列を発現するか、または、ＣＰコード配
列を発現しないかを決定された植物を、３群に分け、上
記のＴＭＶ（Ｕ１バルガー株）を含む懸濁液を用いて接
種した。この３群はそれぞれ、０．４μＱ／ｄ、０．８
μｑ／ｄおよび２，０μＱ／ｒｔｄｌの濃度でＴＭＶを
含む懸濁液を用いて接種を行った。接種した植物を温室
に入れ、ウィルス感染の症状をＩ！察した。第６図の棒
グラフはこの実験の結果を示している。データは、明ら
かに、コートたんぱく質を発現する植物が、〜０．４μ
ｇ／−またはそ、れ以下でウィルスに対して全く耐性で
あったことを示している。

Ｂ、トマトにおける゛用吊応 コインテグレート　プラスミド　ＤＭＯＮ３１９　：　
：　ｐＴｉ　Ｂ６Ｓ３−ＳＥを含むＡ、タメファシエン
ス細胞の培養を、再び例２に説明した方法を使用して、
トマト植物から採取した葉のディスクと接触させた。Ｃ
ａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯ８構成物を含むカナ
マイシン耐性組織を選抜し、植物に再生した。自家受精
したトランスジェニックなトマト植物の実生後代を、試
験植物とした。この実験に対する対照植物は、形質転換
されていない親植物および非発現の実生後代であった。

試験植物と対照植物とに例２の接種方法に従い、０．５
μＱ／ｄと２０μＱ／ｄの間の濃度でＴＭＶを含む懸濁
液を用いて接種を行った。この実験の結果を第７図に示
す。第７図に示すように、全ての対照植物が３０日以内
にウィルス感染の症状を示した。更に、対照植物はウィ
ルス接種物の増加に伴ってより速やかに症状を示した。

これと対照的に、ＴＭＶコートたんぱく質を発現する実
生はＴＭＶ感染に対して実質的に耐性であり、感染の症
状を示す場合でも接種後３０日までは症状を発達させな
かった。

Ｃ９−との 本発明によって上記の実生後代に付与された耐性を更に
確認するために、ＴｏＭＶ耐性のための遺伝的決定基を
含むことが知られているトマト植物のＴｏＭＶ接種に対
する応答を、例２の方法を用いてｍ製したトランスジェ
ニック植物の対応する応答と比較した。特に、通常の育
種方法によってそれぞれ耐性決定基二二二二または二二
二ＩＬを導入された「フライゲラ（ｃｒａｉｇｅｌｌａ
）　Ｊ変種植物に、ｒＴＯＭＶ２ＪまたはｒＴｏＭＶ２
ａＪと称するＴｏＭＶ株を用いて接種を行った。（種々
の株による丁ＯＭＶ感染に対する異なる耐性決定基を保
有する植物の相対感受性のデータを、次の表に示す。）
　形質転換されＴＭＶ　　コートたんぱく質を発現した
ほかはＴｏＭＶ２感受性である変種のトランスジェニッ
ク植物を含む試験群（ｒＶＦ３６Ｊ　）に、形質転換さ
れないＶＦ３６植物の対照群と同様に、同じウィルス株
を用いて接種を行った。

Ｌ旦］巳１− ＶＦ３６　　　　　５１５　　　５１５　　　５１５Ｔ
ｍ−１０１５０１５０１５ Ｔｍ−２０１５５１５０１５ Ｔｍ−２ａ　　　　Ｃ１５０１５３１５トランス− ジェニック　　１１５　　３１５　　１１５＊　−ＴＭ
Ｖ株　ＰＶ２３０ 十−゛　感染性 −−耐性 それぞれの群の５つの植物が、接種後１４日に病気の症
状を記録された。接種後１４日以内に対照植物およびＴ
ｍ−２決定基を含む植物の両方が全てＴｏＭＶ感染の症
状を発達させた。５つのトランスジェニック植物のうち
３つが同じＷ４間にわたって症状を示した（第８図参照
）。前記の表中のデータは、トランスジェニックな植物
が、形質転換されていない対照よりも相当に良く、しか
も、ＴｏＭＶの多くの株に対して非選択性の耐性の水準
を示すことを証明している（第８図参照）。これと対照
的に、遺伝的耐性はかなり範囲が狭い。

試論植物中、恐終的には６０％が感染の徴候を示したが
、症状はＴｍ−２植物のものよりも重大でなかった。こ
の結果は、試験植物中でのＣＰ発現により付与されたＴ
ＯＭＶ２に対する耐性は、Ｔｍ−２によりコードされる
遺伝的耐性より、優れてはいないとしてもそれと比較で
きるものであったことを示している。

ｆＭ４　　タバコ　モザイク　ウィルスの種々の株に対
する交叉免疫 ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯ８構成物を保有す
る形質転換したトマト植物を例３に記述した方法で製造
した。自家受精トラスジェニック　トマト植物の実生後
代をこの実験の試験植物とした。対照植物は、ＴＭＶ　
　コートたんぱく質を発現しない実生後代、および、組
型の正常の形質転換していない植物であった。

試験植物と対照植物に次の二つの異なるＴＭＶ株を用い
て接種を行った。

ＰＶ−２３０−ＡＴＣＣから得たＴＭＶのヴイルレント
株 （受託番号ＰＶ−２３０＞ Ｌ−ＴＭＶ　　−トマト植物に感染することが知られて
いる株 試験植物と対照植物に、例２に記述した方法に従い、そ
れぞれ２μＱ／ｄと２０μＱ／−のｔ１度で前記のそれ
ぞれのＴＭＶ株を接種した。この実験の結果を第９図に
示す。このデータは、ＴＭＶコートたんぱく質を発現す
るトランスジェニックなトマト植物がＴＭＶ感染に耐性
であったことを明らかに示している。試験したＴＭＶの
両方の株に対して耐性が示された。更に、２０μｇＺＩ
ｄもの高濃度でヴイルレント株ＰＶ−２３０を使用した
にもかかわらず、高い割合のトマト植物（４０％から１
００％）が接種後２９日内に症状を発達させなかった。

１１　種々のプロモーターによるウィルス　コートたん
ぱく質の制御 本発明の他のプロモーターの使用を示すため、および、
コートたんぱく質の発現の水準とウィルス耐性の間の相
関を示すために、一つの実験を行った。

第１群の植物は、例２に記述したように形質転換されて
ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯ８構成物を保有す
るトランスジェニックなタバコ植物の実生後代であった
。

第２群と第３群の植物は、第１群の植物と同様に、ＴＭ
Ｖ　　コートたんぱく質遺伝子を発現するように形質転
換されたトランスジェニックなタバコ植物の実生後代で
あるが、ただ、ＣａＭＶ３５Ｓ　プロモーターを次の方
法によって、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ　）由来の５
ｓＲＵＢ　ｌ５ＣＯプロモーター（Ｔｕｎｅｒ　　ｅｔ
　　ａｔ　　（１９８Ｇ＞　）に置換した。

ペチュニア　１１Ａ　　小サブユニット（ＳＳ）プロモ
ーター断片を、バクチリオフ？−ジ　λに保有されるゲ
ノム　クローン（Ｔｕｎｅｒ　　ｅｔ　　ａｔ（１９８
６）　）から、ＥＣＯＲＩを用いる開裂を経て単離した
。このプロモーターを保有する生成した１、３ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ断片を更にｐｓｔｔを用いて消化し、ファージ
　Ｍ１３ｍｐ８のｐｓｔ１部位とＥｃｏＲ１部位との間
に挿入して、サイトダイレクチイド　突然変異生成のた
めに、小サブユニット転写体の５′非翻訳配列にＢＩＩ
［を導入した（第１０図）。ペチュニア　１１Ａ　　ｓ
ｓプロモーターと突然変異生成プライマーの部分配列を
第１１図に示す。ＥＣＯＲＩとＢｑ　ｌ　ＩＩを用いて
開裂した後、生成の８００ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩとＢ
ａ１ｌＩを用いて開裂したｐＭＯＮ２００に挿入した。

生成のプラスミド　ｐＭＯＮ８０４６をＥＣ０ＲＩを用
いて消化し、ＤＮＡポリメラーゼの大クレノー断片およ
びＤＮＡリガーゼを用いて処理した。ＥＣＯＲ１部位を
失ったプラスミドを単離し、ｐＭＯＮ８０４８と命名し
た　（第１０図）。

ペチュニア　５Ｓ−ＮＯ８３’　カセット、プラスミド
　ｐＭＯＮ３１１を構築するために、３ｍａ　１部位を
１３８ｍＨＩリンカーで置換え、その後クレノー　ポリ
メラーゼとりガーゼを用いて処理することによりＢａｍ
８１部位を除いたｐＭＯＮ２００１導体を、Ｓｔｕ　Ｉ
とＨｉｎｄｕを用いて消化した。生成の８ｋｂ断片を、
ｐＭＯＮ３１６から精製した３　００　ｂｐのＢＱＩＩ
Ｉ−ｔｏ−Ｈｉｎｄｎｌ断片、および、ｐＭＯＮ８０４
８の２．６ｋｂのＳｔｕ　Ｉ−ｔｏ−ＢＱ　Ｉ　ＩＩ断
片と混合した。生成のプラスミド　ｐＭＯＮ８０４９は
、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターがペチュニア　ＳＳプロ
モーターと置換えられている以外は１）ＭＯＮ３１６．
！：同様テアル（第１２図）　、　５’　末端に５ｏｏ
ｎ部位を３′末端にＥＣｏＲｌ部位を含む上記の７００
ｂｌ）のＴＭＶ−ＣＰコード断片を、８ｃｌｌＩとＥｃ
ｏＲＩを用いて開裂したｐＭＯＮ８０４９に挿入し、ペ
チュニア　ＳＳ　プロモーター／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯ８
ｅｌ構成物保有するρＭＯＮ８０５９を得たく第１２図
）。

第４群の植物はプラスミド　ｐＭＯＮ２００のみを含む
ように形質転換し、対照植物とした。

それぞれの群は、例２（Ｄ）に概説した方法に従ってＴ
ＭＶを接種した３０の植物を含んでいた。

接種後、これらの植物を渦空に置き、ウィルス感染の症
状を観察した。

ＴＭＶ　　コートたんぱく質の相対的な水準は、ウェス
タン（Ｗ　ｅｓｔｅｒｎ　）　　プロット分析により評
価した。第１群の植物におけるコートたんぱく質遺伝子
発現の程度に対する平均値を１００％とし、次のように
決定した。

以旦１ｊ１」ヨ旧り 第１群　−１００ 第２群　−１４ 第３群　−３ 第４群　−〇 症状を示す植物の割合（％） Ｌ　　　　　　　工１１１ＬＬＬＬ Ｌ４　　５　　　６　　　７　　８　　１！２岡 １　　０　　３　　７　　２３４０４７ｙ。

１噂 ２　　０　　３　１３　　６３　　８３９７　　　Ｏ７
上に示したデータは次の結論を支持している。

（１）　リブロース２リン酸　カルボキシル化酵素　小
サブユニット　プロモーターは、本発明での使用に対し
て有用なプロモーターである。しかし、一定の植物では
ＣａＭＶ２５Ｓ　　プロモーターのように強力なプロモ
ーターではない可能性がある。

〈２）　コートたんぱく質の発現の水準とウィルス耐性
との間には正の相関がある。

ＬＬ　　ウィルス　コートたんはり質遺伝子（アルファ
ルファ　モザイク　ウィルス）を含むトランスジェニッ
クな植物におけるウィルス病耐性アルファルファ　モザ
イク　ウィルスのコートたんぱく質コード配列（ＡＭＶ
　　ＣＰ）を含むＤＮＡ構成物を、ＴＭＶ耐性を工学的
に処理するために用いた戦略と同様の戦略を使用して製
造した。ＡＭＶのコートたんぱく質をコードする全長さ
の（ｆｕｌｌ　−ｌｅｎｇｔｈ）　ＣＤ　Ｎ　Ａクロー
ンを次に記述し、第１３図に概略的に示すようにして得
た。

ＡＭＶ　　コートたんぱく質ｃＤＮＡを、ＣａＭＶ３５
Ｓ　　プロモーターとＮＯ８３’末端に、既に述べたよ
うにして融合させた。それか毛、この構成物をアグロバ
クテリウム介在形質転換系を用いて植物に移入すること
ができる。

ＡＭＶの３分節系（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）　ＲＮ　Ａ
ゲノムの完全なヌクレオチド配列は既に知られている。

このデータは、ＡＭＶゲノムが４つの主要な遺伝子生成
物をコードしていることを示している。これらは、ＲＮ
Ａ　　１によってコードされている１２６キロダルトン
（ｋｄ）のたんぱく質、ＲＮＡ２によってコードされて
いる９０ｋｄのたんぱく質、および、ＲＮＡ　　３によ
ってコードされている３２ｋｄのたんぱく質である。コ
ートたんぱく質は、ＲＮＡ　　３の３′末端　８８１ヌ
クレオチドと相同するｒＲＮＡ　　４Ｊと称されるサブ
ゲノムメッセンジｔ　−（Ｂａｒｋｅｒ　　ｅｔ　　ａ
ｌ　　（１９８３ｋ））　）から翻訳される。

ＡＭＶのコートたんぱく質をコードする全長さのＣＤＮ
Ａを合成するために、第１１１および第２鎖の両方のＤ
ＮＡ合成に対する合成オリゴヌクレオチド　ブライマー
を使用した。第１３図に参照されるように、使用したブ
ライマーは、ＡＭＶ　　コートたんぱく質コード配列の
それぞれの末端に唯−ｆ７）　（ｕｎｉＱｕｅ）　Ｅ　
ＣＯＲ１部位を含んでいた。第１鎖のＣＤＮＡは、１０
０ａｅの反応中５μＱのＡＭＶ全ＲＮＡと５５ｒ＋ｇの
ブライマーから、４ｍＭのビロリン酸ナトリウムと逆転
写酵素を用いて合成した。この方法によって、分子ｍが
１．０４ｘ１０’ダルトン（ＲＮＡ　　１）、０．７３
ｘ１０’ダルトン（ＲＮＡ　　２）および０．６８ｘ１
０６ダルトン（ＲＮＡ　　３）のｃＤＮＡが合成された
。ＲＮＡ鋳型を加水分解した後、ｃＤＮＡ生成物をＰ−
６０カラムで分別した。１本ＩｃＤＮＡをアニーリング
して２本鎖ブライマーとして、逆転写酵素と共にインキ
ュベーションした。ＡＭＶ　　コートたんぱく質配列を
含む生成した２重鎮ｃＤＮＡは、それぞれの末端でＥＣ
ｏＲＩ部位に接していた。ＥＣ０ＲＩを用いて消化した
後、ｃＤＮＡをｐｔＪｃ９のＥｃｏＲ１部位に挿入し、
大腸菌ＪＭ１０１細胞を形質転換し、それから、アンピ
シリン、Ｉ　ＰＴＧおよびＸ−Ｇａ　Ｉを含む培地上で
選抜した。約１０００の形質転換体を得た。２５％の形
質転換体に５′および３′特異プライマーの両方に対し
てハイブリダイゼーションを行った。ＤＮＡを３つのポ
ジティブからｖ４＄１シた。ＥｃｏＲｌ消化物は予期し
た大きさく８８１ｂｐ）の挿入物の存在を明らかにした
。ヌクレオチド　シーフェンシング（それぞれの末端に
〜１００ｂｐ）により、これらのクローンが実際に全長
さのＡＭＶ　　コートたんぱく質挿入物を含むことが確
認された。

ＡＭＶ　　コートたんぱく質をコードする８８１ｂｐの
ＥＣ０ＲＩ断片を、意味を持つ配向および意味を持たな
い配向　（５ＩＳｌｌｉ　　ａｎｄ　　ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅＯｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）とで（それぞれ、ｐＭＯ
Ｎ’９８００とｐＭＯＮ９８０１　）　、植物発現ベク
ター１）ＭＯＮ３１６１．：結合させた。ｐＭＯＮ９８
００の構造を第１３図に示す。それから、これらのベク
ターを例２に記述したアグロバクテリウム介在形質転換
系を使用して、タバコ、トマトおよびベチュニアに移入
した。

ＡＭＶ　　コートたんぱく質ｍＲＮＡの発現を更に調べ
るために、ＡＭＶ　　コートたんぱく質遺伝子を意味の
ある配向（１）ＭＯＮ９８００）で含むトランスジェニ
ックなタバコ植物（ｃｖ、”　３ａｍｓｕｎ″）由来の
カルス組織に、ノーザン（Ｎ　０ｒｔｈｅｒｎ）　プロ
ット分析を行った。ｐＭＯＮ９８００からと、ＡＭＶ　
　ＣＰコード配列を欠＜ｐＭＯＮ２００から誘導した対
照ベクターであるｐＭＯＮ２７３からの全ＲＮＡ　（４
０μＱ）をアガロース■ ゲル上に仕込み、膜（Ｇｅｎｅ　　５ｃｒｅｅｎ　　、
　ＮｅｗＥ　ｎｇｌＡｎｄ　　Ｎ　ｕｃｌｅａｒ　　製
造）に移し、それから、ＡＭＶ　　コートたんぱく質を
コードする８　８１　ｂｐのｃＤＮＡ挿入物をプローブ
として調べた。予期した大ぎさの転写体（１，２ｋｂ）
に対応するバンドの群は非常に強いハイブリダイゼーシ
ョンを示した。プローブとハイブリダイゼーションする
、より小さい大きさの転写体も存在した。ｐＭＯＮ２７
３を用いて形質転換した対照カルスに対してはハイブリ
ダイゼーションは検出されなかった。

同じく、ＡＭＶ　　コートたんぱく質検出のためのウェ
スタン　プロット　プロトコルを、トランスジェニック
な植物と感染植物とに発達させた。

市販の抗ＡＭＶ　　ｒｇＧ分画（ＡＯｄｉａ　　Ｉｎｃ
、。

Ｍ　ｉｓｈａｗａｋａ、　　Ｉ　Ｎ　）を、トランスシ
エニツクナタバコ　カルスおよび葉中、および、トラン
スジェニックなトマト葉中でのコートたんぱく質の検出
にうまく使用することができた。特に、対照およびトラ
ンスジェニックなタバコ　カルスからの３０μＱのたん
ぱく質、および、対照およびトランスジェニックなトマ
ト材料からの４０μｑのたんぱく質をウェスタン　プロ
ットに適用し、精製ＡＭＶ　　コートたんぱく質標品と
共に移動する分子量２８〜２Ｑｋｄ付近の免疫反応性の
バンドが得られた。

ＡＭＶ　　コートたんぱく質を発現すると同定されたト
ランスジェニックなタバコ植物に、ＡＭＶの接種を行っ
た。また、形質転換されていないか、または、ベクター
　ｐＭＯＮ３１６を用いて形質転換されたかのいずれか
の対照植物に、接種を行った。症状の発達を生育室内で
毎日監視した。用いた対照植物とトランスジェニック植
物とは、大きさ、外観および発達段階（全て開花を始め
ていた）が類似していた。対照植物とトランスジェニッ
ク植物からの３枚の葉に、それぞれ、ＡＭＶ感染植物の
抽出物を接種した。その後の滴定分析から、この接種に
用いたＡＭＶの濃度は約５０μＱ／ｄであったことが示
された。

対照のトランスジェニックなタバコ植物および形質転換
されていないタバコ植物の接種を施された葉は、ＡＭＶ
の感染後１週以内に症状を示した。

これと対照的に、ＣＰを発現するトランスジェニック植
物はいずれも感染後１週以内に症状を示さなかった。１
０日後、後者の植物の一つは、３枚の接種した葉の１枚
に１または２の病害を示した。

感染ｖｉ２週には、対照植物の接種を施され葉の多数の
病害は同様のままだったが、接種しなかった上側の葉は
葉の表面に均一に広がった症状（緑退環）を示した。Ａ
ＭＶ　　コートたんぱく質を生産するトランスジェニッ
ク試験植物は、接種した菓または全体の（接種していな
い）葉のいずれにも症状を示さなかった（または、追加
の症状を示さなかった）。

トランスジェニック植物および対照植物中のＡＭＶの複
製は、ウェスタンおよびドツト（ｄｏｔ　）プロット分
析を介してコートたんぱく質の水準を監視することによ
って測定した。感染１１１週に、トランスジェニック植
物ではウェスタン　ブロッティングによって背景の水準
の発現のみが検出された。つまり、検出された発現の水
準は、導入されたコートたんぱく質コード配列の固有の
水準と比較できるものであった。一方、対照植物は相当
に高い水準のＡＭＶ　　コートたんぱく質を含んでいた
。デンシトメーター　スキャンニングによるハイブリダ
イゼーションのシグナルの量化から、トランスジェニッ
クと形質転換されていない対照のタバコ植物との間には
２１１倍の差が示された。

トランスジェニックなタバコ対照植物は、ＡＭＶ形質転
換体の水準より１１０ないし８１５倍高いＡＭＶ　　コ
ートたんぱく質の水準によって確認された。この結果は
、上記のたんぱく質をつくるトランスジェニックな植物
ではＡＭＶ複製は相当に低いことを示している。

ＬＬ　ポテト　ウィルス　Ｘ　コートたんぱく質コード
配列を含むＤＮ’Ａ構成物 ポテト　ウィルス　Ｘのコートたんぱく質コード配列（
ＰＶＸ　　ＣＰ）を包含する構成物を、ＴＭＶおよびＡ
ＭＶ構成物の工学的処理に用いた同様の方法を使用して
製造した。ボテックスウィルス群に属するポテト　ウィ
ルス　Ｘ　（ＰＶＸ）は、２ｘ１０６ダルトンの１本の
感染性のゲノムＲＮＡを含ンテイル。ＰＶＸ　　ＲＮＡ
（７）３’末端領域をクローニングし、シーフェンシン
グを行った。この領域は、長さが２３７アミノ酸残基の
たんぱく質をコードするコートたんぱく質遺伝子を含む
（Ｚａｋｌ＋ａｒｙｅｖ　　ｅｔ　　ａｌ（１９８４）
　）。

５′末端から最初の１０ｇのコドンを除いて、ＰＶＸ　
コートたんば＜質遺伝子を含むＣＤＮＡ複製物を、ポリ
アデニル化したＰＶＸ　　ウィルスＲＮＡから合成した
。「クローン　ｐ３ａＪと称するｃＤＮＡ複製物を、文
献（Ｚａｋｈａｒｙｅｖｅｔ　　ａｔ　（１９８４）　
）記載のｄＧ、ｄＣティリング（ｔａｉｌｉｎｇ　）法
を介して１）ＢＲ３２２のＰｓｔ１部位へクローニング
した。遺伝子の５′末端を修復するために、開始コドン
　ＡＴＧの直前、および２２コドン後に１８塩基の真正
（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ　）５′非コ一ド配列を含む合成
のＢａｍＨＩ−ｐｓｔｌ　　断片を用いて、ｄＧ、ｄＣ
ティル（ｔａｉｌ）および１１番目から２１番目までの
コドンを含むより小さいＰｓｔＩ−Ｐｓｔｌ断片を置換
えた。

この遺伝子のｄＧ、ＱＣティルと３′末端のｄＡ、ｄＴ
　　伸長の部分を、１）ＵＣｌ　８中でサブクローニン
グしたより大きいＨｐａＩＩ−Ｐｓｔ　ｌ断片のＢａ１
３１消化によって除去し、それから、Ｃｌａｌ部位をリ
ンカ−付加によって形成した。

ＸｈｏＩ−Ｃｌａｌ断片（約　１７０ｂｐ）を使用して
、それぞれ、ｐ３ａ由来の本来の３′末端配列、および
、ｐＢＲ３２２由来の　Ｐｓｔｌ−Ｃｌａｌ配列を含む
Ｘｈｏ　Ｉ−ＣＩ　ａ　ｌ断片を置換えた。

最終構成物は、１８ｂｐの５′非コ“−ド領域のＣＤＮ
Ａ、６５７ｂｌ）のコートたんぱく質配列コード領域（
翻訳終結コドンであるＴＡＡを含む）、７２ｂｐの３′
非コード領域、および、４０ｂｐのｐＥＭＢＬｌ　２　
（＋）中のｄＡ、ｄＴ　　伸長を含んでいた（第１４図
参照）。ＰｖＸ　コートたんぱく質遺伝子の配列を第１
５図に示す。水平の矢印はｐ３ａ中のＰＶＸ配列の５′
境界を示す。合成りＮＡから誘導した領域は配列上部の
波線で示した。構築に用いた制限部位には下線を施した
。このシーフェンシングデータと文献（Ｚ　ａｋｈａｒ
ｙｅｖｅｔ　　ａｔ　（ｔ９８４）　）に発表されてい
るデータとの相違を、配列の下に示す。コードされてい
る新たなアミノ酸を本来のものの上に示す。

ＰＶＸ　コートたんぱく質の全長さのＣＤＮＡを、Ｃａ
　ｌｖｌ　Ｖ　３５　Ｓ　　プロモーター（ｐＭＯＮ９
８１８）または５ｓＲＵＢＩｓｃｏ　　プロモーター　
（ｐＭＯＮ９８１８）のいずれかとｒｂｃＳ−２９３’
末端（Ｏｄｅｌｌ　　ｅｔ　　ａｌ（１９８５）　）を
用いて、両方の配向で、ｐＭＯＮ５０５から誘導した発
現ベクターに挿入した。ＰＶＸ　コートたんぱく質遺伝
子を発現させるために次に示すベクターを作成し、例２
に記述したアグロバクテリウム介在の形質転換系を使用
して、タバコ植物へ移入した。

（ａ）　　ｐＭＯＮ９８０９　−　　ＰＶＸＩ−トたん
ぱく質コード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯＮ９８
１８のＣａＭＶ３５Ｓプ０モーターとｒｂｃＳ−Ｅ９　
３’末端の間に挿入した。

（ｂ）　　ｐＭＯＮ９８１０　−　　ＰＶＸ：＋−トた
んぱく質ｃＤＮＡを、意味のない（アンチセンス）配向
で、ｐＭＯＮ９８１８のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと
ｒｂｃＳ−Ｅ９　３’末端の間に挿入した。

（ｃ）　　ｐＭＯＮ９８１１　−　　ＰＶＸコートたん
ぱく質コード配列の５′断片を、意味のある配向で、ｐ
ＭｏＮ９８１８に挿入した。

（ｄ）　　ｐＭＯＮ９８１２　−　　ＰＶＸ：］−また
んぱく質コード配列の５′断片を、意味のない配向で、
ｐＭＯＮ９８１８に挿入した。

（ｅ）　　ｐＭＯＮ９８１３　−　　ＰＶＸ：ｌ−トた
んぱく質コード配列を、意味のある配向で、１）ＭＯＮ
９８１９のｒｂｃｓ８ＢプロモーターとＥ９３′末端の
間に挿入した。

上記に従い、植物にＰｖＸを用いて接種を行い、ウィル
ス耐性の水準を測定した。

Ａ’ＭＶのｍＲＮＡと異なり、ポックスウィルスのＲＮ
Ａはポリアデニル化されており、このために、オリゴ（
ｊＴを第１１１１合成のブライマーとして使用し、ＤＮ
Ａポリメラーゼまたは鳥骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素
を第２鎖合成に使用することが可能になる。この例の始
めに詳細に記述したように、２本！ｌｌＤＮＡの単離と
、植物中でコートたんぱく質配列の発現との操作を行う
ことができる。

ｌ　　トマト　ゴールデン　モザイク　ウィルスコート
たんぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成物 トマト　ゴールデン　モザイク　ウィルス（ＴＧＭＶ）
　　コートたんぱく質に対するｍＲＮＡの生産を起こす
ことができるコード配列を含むＤＮＡ構成物を包含する
プラスミドを、以下のようにして構築した。プラスミド
　ｐＢＨ４０４（Ｂｉｓａｒｏ　　ｅｔ　　ａｌ　　＜
１９８２）　）をＸｈｏＩＩを用いて消化し、ＴＧＭＶ
　　コートたんぱく質（ＴＧＭＶ　　ＯＰ）のコード配
列を保有するヌクレオチド３１２から１２８５におよぶ
約１ｋｂの断片（Ｈａｍｉｌｔｏｎ　　ｅｔ　　ａｔ　
　（１９８４）　）を単離した（第１６図参照）。この
断片を、ｐＭＯＮ２００をＮｄｅｌを用いて開裂し９０
０　ｂｐのＮｄｅｌ断片を除くことにより構築したプラ
スミドであるｐＭＯＮ５３０に挿入した。このようにし
てｐＭＯＮ５０３を得た。これをＨｉ　ｎｄｌ［［とＳ
ｍａ　Ｉを用いて開裂し、同じ＜Ｈｉ　ｎｄＩ［［と３
ｍａ　１を用いて開裂したｌ）　Ｔ　Ｊ　Ｓ　７５　（
Ｓ　ｃｈＮｄｈａｕｓｅｒ　　＆Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ　　
（１９８５）　）と混合した。ＤＴＪＳ７５の３．８ｋ
ｂ（７）Ｈｉ’ｎｄ　ＩＩＩ−Ｓｍａ　Ｉ断片を含む生
成したプラスミドを、８ｋｂのｐＭＯＮ５０３断片と結
合させ、これをとり、ｐＭＯＮ５０５と命名した。ｐＭ
ＯＮ３１６由来のＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯ８発現カセット
（第３図参照）を、２．４ｋｂのＳｔｕ　Ｉ　−Ｈｉ　
ｎｄＩＩ［断片上に単離し、Ｓｔｕ　Ｉと＠　ｉ　ｎｄ
ｌＩ［を用いて開裂したｐＭＯＮ５０５ＤＮＡと混合し
た。

生成のプラスミド　ｐＭＯＮ５３０　（第１６図参照）
　ヲＢＱ　Ｉ　ＩＩヲ用イＴ消化し、ＴＧＭＶ　　’：
ｌ−トたんぱく質コード配列を保有する１ｋｂの）（ｈ
。

■断片を挿入した。プラスミドはｌｋｂ断片を意味のあ
る配向で含んでいることを同定された。

ｒｐＭＯＮ４０１Ｊと称するこのプラスミドは、ＣａＭ
Ｖ３５Ｓ／ＴＧＭＶ−ＣＰ／ＮＯ８構成物を保有してい
た（第１６図参照）。例２に記述される方法と実質的に
同じ方法により、タバコ植物をｐＭＯＮ４０１を用いて
形質転換した。カナマイシンに耐性であるこれらの植物
の自家受精により、上に詳’＞ｆＬした方法に従ってウ
ィルス耐性を試験できる実生後代を得た。

１ＰＪ９　　ＴＭＶ　　ＲＮＡに相補的なアンチセンス
ＲＮＡの発現ベクター コートたんぱく質に関するｍＲＮＡに対して相対的にア
ンチセンスの極性を有するＲＮＡを生産するように、Ｔ
ＭＶ−ＣＰ　　遺伝子を中間体プラスミド（ｐＭＯＮ３
１６）に挿入する実験を行った。

第１７図に参照されるように、ＴＭＶ　　コートたんぱ
く質遺伝子を、酵素ＡｈａｌＩＩおよびＢａｍＨｌを用
いて中間体プラスミド（ｐＴＭ３７）から切取った。こ
の配向においては、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の５′
末端はＡｈａｌ［［部位の近くに位１ｔ８゜ＡｈａＩＩ
Ｉ：ＢａｍＨＩ　　断片を。

ＢａｍＨＩとＳｍａ　Ｉを用いて既に消化したプラスミ
ド　ｐＵｃｌ　３に導入した。

コートたんぱく質遺伝子を、ＥＣ０ＲＩと３ａｍＨＩを
用いる消化によってｐＵｃｌ　３から切取った。このＤ
ＮＡ断片を、酵素ＢＱ　Ｉ　ＩとＥＣＯＲＩを用いて制
限したｐＭＯＮ３１６　（第３図参照）に連結した。

この配置においては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、
ＴＭＶ　　コートたんぱく質　ｍＲＮＡに相補的なＲＮ
Ａを生産する。このＲＮＡは次のものを包含する（転写
体の５′末端から）。

（１）　　ＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーターから誘導し
た約３０のヌクレオチド （２）　　ｃＤＮＡの第１ｔＡのＵＡ製に使用したヌク
レオチド　ブライマーから誘導した約８のヌクレオチド （３）　　ＴＭＶ　　ＲＮＡ（７）ヌクＬ／ｌチｔ’　
　（−）６３９５　　ｋ＞　　５７０７ （４）　　ＮＯ８３’　末端によって付与された約１５
０のヌクレオチド この構成物を植物に導入し、それらの植物に例２の記述
に従ってウィルス耐性の試験を行うことができる。

例１０　　キューリ　モザイク　ウィルス（ｃｕＭＶ）
コートたんぱく質遺伝子のクローニングＲＮＡ　　４が
豊富であるＣｕＭＶ−Ｄ株（Ｊ。

Ｍ、　Ｋａｐｅｒ、　ＵＳＤＡ　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３ｅｒｖｉｃｅ、　３ｅ
ｌｔＳＶｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄより入手可能）
の大きさに従って分別したゲノムＲＮＡを、ＣｕＭＶ　
　ＲＮＡ分子当りのＡＭＰ残基の概算ｆｉｌｌ　（ｅｓ
ｔｉｍａｔｅｄ　　ｎｕｍｂｅｒ　）が約３０になるよ
うにポリアデニル化した。２本１１ｃＤＮＡを合成する
ために、ウイッケンズら（Ｗ　１ｃｋｅｎｓ　　ｅｔａ
ｌ　（１９７８）　）の方法論を第１鎖ｃＤＮＡの製造
に適用した。更に詳しくは、３μＱのポリアデニル化Ｃ
ｕＭＶ−ＲＮＡ４．１００ｍＭトリス−１−１０℃（ｐ
Ｈ８，３）、１４０ｍＭ　　Ｋ（１，１０ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｌ２２．１９ｍＭ　　β−メルカプトエタノール、１
．５μＱ　（ｄＴ）ｘ　ｓ　、０．５ｍＭ　　ｄＮＴＰ
’　ｓ、２０μｃｉ　［（２−３２Ｐ］ｄＣＴＰ　　（
３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ　、　　ＮｅｗＥ　ｎｇｌａ
ｎｄ　　Ｎ　ｕｃｌｅａｒ）　、および、４８単位のＡ
ＭＶ逆転写酵素（Ｌ　ｉｒｅ　　５ＣｉｅｎＳｅ！、　
　Ｉ　ｎＣ，）を含む８０μｅの反応混合物を、４２℃
で９０分間インキュベートした。それ、から、４μ２の
０．５ＭＥＤＴＡを反応混合物に加え、続いてこれをフ
ェノール／クロロホルムで抽出し、その後、２０μ℃の
０．５トリス−ＨＣり（ｐＨ７，５）で逆抽出した。１
／３容の８Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容のエタノール
を用いて連続して２回沈澱させることにより、生成物を
遊離のヌクレオチドとして回収した。

上記の反応から得たＣＤＮＡを乾燥させ、４０μ２の水
に再懸濁した。第１１合成にはガブラーとホフマンの方
法（Ｇ　ｕｂｌｅｒ　　＆　　Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８
３）　）を適用した。２０ｍＭトリス−Ｈ（１（ｐＨ７
，５）　、１０ｍＭ　（ＮＨ４）２　ＳＯ４，５ｍＭ　
　Ｍｏ（１２，１００ｍＭ　　ＫＣＭ、０．２［１／Ｉ
ｄｌ　ＢＳＡ、０．１ｍＭ　　ｄＮＴＰ’Ｓ、３０単位
のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｎｅｗｌ：ｎｇｌａｎｄ　　
Ｂｉｏｌａｂｓ）　、２０ｕＣｉ　［Ｃｒ−３２Ｐ］ｄ
ＣＴＰ、および、２ｗＬ位の　ＲＮＡ５ｅ　　Ｈ（ＢＲ
Ｌ）を、０．１−の容積中に含む反応混合物に、４０μ
２の水中のｃＤＮＡを加えた。まず、この反応混合物を
１１℃で１時間インキュベートし、その後２２℃で１時
間インキュベートした。

第１鎖ＣＤＮＡの合成について記述した同じ方法で、生
成物を回収した。

文献（Ｈｕｙｎｈ　　ｅｔ　　ａｔ（１９８５’）　）
に開示された方法に従って、２重鎖ｃＤＮＡをＥＣＯＲ
［メチラーゼを用いてメチル化し、リン酸化したＥＣＯ
ＲＩリンカ−（Ｎ　ｅ’Ｎ　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　３
１ｏｌａｂｓ）に連結し、ＥｃｏＲＩ酵素で消化し、そ
れから、過剰のリンカ−から分離した。その後、ｃＤＮ
Ａを、試料レーンと接したレーン中に適用した標識ＤＮ
Ａと共に、１％アガロースゲル上で電気泳動した。標識
をエチジウム　プロミド染色によって可視化し、約９０
０〜１３００ｂｐの大きさのＣＤＮＡを含むゲル薄片を
切取った。ＣＤＮＡを電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕ
口Ｏｎ）シ、５μａのグリコーゲン担体　（Ｂ　ｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　　Ｍ　ａｎｎｈｅｉｎ＋Ｂ　ｊＯｃｈｅ
ｌｉｃａ１３　）の存在下で沈澱させ、１０μ℃の連結
反応容積と相溶性である容積の水中に再懸濁した。それ
から、ｃＤＮＡを空温で４時間、２０ｎｏのＥｃｏＲＩ
消化リン酸化ｐＥＭＢＬ１２（＋）　　ＤＮＡに連結さ
せた。その後、生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ１０１株
中に形質転換させた。コロニーを、アンピシリン耐性、
並びに、０、６ＩｕＸ−Ｇａ　ＩとＩ　ＰＴＧを用いて
広げたプレート上の白色により選抜した。挿入物の大き
さを、ミニブレツブ　（ｎ＋１ｎｉｐｒｅｐ）　　Ｄ　
Ｎ　Ａ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ　　（１９
８２）　）のＥＣＯＲＩ消化によって決定した。

６００ｂｐから１３００ｂｐの範囲にわたる挿入物を有
する１６のコロニーに、ジデオキシシーフェンシングに
よって更にスクリーニングを行い、文献（Ｇｏｕｌｄ　
　＆　　Ｓｙｎ＋ｏｎｓ　（１９８２）　）に報告され
ているように、Ｘ株のＣＭＶ　　コートたんぱく質に対
する配列相同性の存在を決定した。最長のクローンを完
全にシーフェンシングし、ＣｕＭＶＣＰに対する全長さ
のＣＤＮＡを得たことを確認した。ＣｕＭＶ　　コート
たんぱく質コード配列を、発現ベクター　ｐＭＯＮ９８
１８とｐＭＯＮ９８１９（前記の例７を参照）中にクロ
ーニングすることができる。その後、これらのベクター
を使用して、ＣｕＭＶ　　コートたんぱく質コード配列
からの意味のある配列と意味のない（アンチセンス）配
列を生産することができる。

次のベクターを構築し、植物に移入させた。

ｐＭＯＮ９８１６　−　　ｐＭＯＮ９８１８中の意味の
ある配向のＣｕＭＶ　　コートたんぱく質コード配列 ｐＭＯＮ９８１７　−　１）ＭＯＮ９８１８中（７）ｊ
ｔ味のない配向のＣｕＭＶ　　コートたんぱく質コード
配列 これらのベクターを例２に従って、アグロバタテリウム
細胞に導入し、生産したトマトおよびタバコ植物に形質
転換させた。上記に従って、これらの植物にＣｕＭＶを
接種し、ウィルス耐性の水準を決定することができる。

１旦　ポテト　リーフロール　ウィルス由来のＲＮＡの
操作 精製したポテト　リーフロール　ウィルス（Ｐ　Ｌ　Ｒ
Ｖ　）　　（Ｄ　ｒ、　　Ｐ　ｅｔａ　　Ｔ　ｈｏｍａ
ｓ、　　Ｕ　Ｓ　ＤＡ　　Ａｇｒｉｃｕ１℃ｕｒａｌ　
　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｓ　ｔａｔｉｏｎ。

ｐ　ｒｏｓｓｅｒ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　　から入
手）から、太きさが約６ｋｂの完°全なウィルスＲＮＡ
を単離した。

このＲＮＡを、大腸菌　ポリ（Ａ）　　ポリメラーゼを
用いてポリアデニル化することができる。更に、上記に
従って、ｃＤＮＡの第１鎖をオリゴｄＴ　　ブライミン
グにより合成できる。その後、ガブラーとホフマン（Ｇ
　ｕｂｌｅｒ　　＆　　ＨｏＨｍａｎ（１９８３）　）
　ニ従い、ＲＮＡＳｅ　Ｈの存在下でＤＮＡ　　ポリメ
ラーゼＩを使用することによって、第２のｃＤＮＡ鎖を
合成できる。

上記の例１０に従って、このようにして生産した２本！
１ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ　　メチラーゼでメチル化し、
ＥｃｏＲＩ　　リンカ−に連結し、それから、ＥｃｏＲ
Ｉで消化したｐＥＭＢＬｌ　２　（＋）に連結すること
ができる。生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ　１０１（Ｍ
ｅｌｏｌ（＋ｇ　　＆　　Ｖｉｅｉｒａ　　（１９８２
）　）に形質転換させ、それによって得た組換体クロー
ンを、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ　　（１９８３）　）の
記述に従い、ＰＬＲＶに対する抗体を使用してスクリー
ニングすることができる。ウィルス　コートたんぱく質
をコードしていることが同定されたｃＤＮＡ断片は、成
熟コートたんぱく質のＮ８２末端アミノ酸に対するコド
ンのすぐ隣（ｖｒｓ−ａ−ｖｒｓ　　５’末端）に、新
たな制限部位およびＡＴＧ翻訳開始コドンを導入するこ
とによって得られる。

これはシラーとスミスの方法（Ｚｏｌｌｅｒ　　＆　　
５Ｉｌｉｔｈ　（１９８２）　）によって行うことがで
きる。

し　カリフラワー　モザイク　ウィルス由来ＤＮＡの操
作 カリフラワー　モザイク　ウィルス（ｃａＭＶ）のコー
トたんぱく質コード配列は、プラスミドｐＯ８１（Ｈｏ
ｗａｒｔｈ　　ｅｔ　　ａｌ（１９８１）　）をＡＣＣ
Ｉを用いて開裂し、ＤＮＡ　　ポリメラーゼのクレノー
断片で処理し、ＢａｍＨＩで開裂することによって、１
，６ｋｂの断片上に単離することができる。プラスミド
そのものはＱｒ、　　ロバート　シェフ？−ド（Ｄ　ｒ
、　　Ｒｏｂｅｒｔ　　Ｓ　ｈｅＦ）ｈｅｒｄ、　　Ｕ
　ｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　　ｏｆ　　１（ｅｎｔｕｃｋｙ
　、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ）から入手できる。１，６ｋ
ｂの断片にゲル上で電気泳動による分離を行った後、Ｎ
　Ａ　−４５ＩＩ　（Ｓ　ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆　　５
ｃｈｅｕｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）を用いてそれを
精製し、ＥＣＯＲＩで消化したｐＭＯＮ３１６ＤＮＡと
混合し、クレノー断片を用いて処理し、ＢＱＩＩＩを用
いて消化することができる。

リガーゼで処理することによりＣａＭＶ　　コートたん
ぱく質フード配列を含む組換体プラスミドを１ワる。こ
のプラスミドを上記に従って使用し、細胞を形質転換さ
せることができる。意味のある配向のコード配列を有す
るプラスミドを保有するそれらの細胞は、Ｈｉ　ｎｄｌ
［Ｉを用いるプラスミドＤＮＡの消化により、同定する
ことができる。つまり、そのようなりＮＡは、１．１ｋ
ｂおよび０、７ｋｂ（７）ｔ−１ｉ　ｎｄ　ｍ１ｇ１片
、並びに、プラスミドの残りに由来するより大きな断片
を示す。それから、正しく配向したＣａＭＶコートたん
ぱく質コード配列を含むプラスミドＤＮＡをクローニン
グし、植物細胞に導入し、それを今度は全植物へ再生す
ることができる。これらの形質転換植物のウィルス耐性
は、その後、既に記述した基本的な方法に従って決定す
ることができる。例えば、形質転換したタバコ植物の耐
性は、タバコに感染するＣａＭＶ　　Ｗ２６０株、Ｗ２
Ｏ３株および　Ｗ２Ｂ５株（Ｇ　ｒａｃｉａ　　＆　　
Ｓ　ｈｅｐｈｅｒｄ　（１９８５）　）を用いる接種に
よって試験することができる。

Ｌｕ　ＭＡＳ（２′）プロモーターによッテ制御された
ＴＭＶコートたんぱく質コード配列を有するＤＮＡ構成
物 ＥｃｏＲＩ　（２１，６３１）とＣ１ａｌ（２０゜１３
８）によるオクトビン型ｐＴ　ｉ　Ａ６ブラスミド　Ｂ
ａｍＨ１２Ｉｌｉ片を保有するプラスミドｐＮＷ３４Ｇ
−２−１（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ（１９
８１）　）から、ＭＡＳ　　プロモーターを保有するＤ
ＮＡ断片を切取った。（括弧内の数値は、オクトビン型
Ｔｉプラスミド　Ｔ−ＤＮＡ配列のべ一力一ら（Ｂａｒ
ｋｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ　　（１９８３ａ）　）の発表
配列から取った開裂部位の座標である。）　生成した１
５０３ｂｐの断片を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＣ１ａｌ
開裂ｐＭＯＮ　５０５　（Ｈｏｒｓｃｈ　　＆Ｋｌｅｅ
　　（１９８６）　）に挿入して、ｐＭＯＮ７０６を生
産した。Ｎ０８３’末端を、ＢｕｆｆおよびＢａｍＨＩ
を用いてｐＭＯ５３０から切取った。

２９８　ｂｐのＮ０８３’断片を、ｐＭＯＮ７０６のＭ
ＡＳ　　プロモーターの３′末端に隣接するＢｑ１■部
位に導入し、ｐＭＯＮ７０７を得た。

生成したｐＭＯＮ７０７中（７）ＭＡＳ　　プロモータ
ー　−Ｎ０８３′　カセットを、５ｔｕｌと旧ｉｎｄ［
［を用いてＩ）ＭＯＮ７０７を開裂し、それから、Ｎ０
８−ＮＰＴＩ　［’　−ＮＯ８’Ｆメ７カナマイシン耐
性遺伝子およびＭＡＳ　　プロモーター　−Ｎ０８３’
　　カセットを保有する３、２ｋｂの断片を単離するこ
とにより、コインテグレート型ベクターに移入した。こ
の断片を、ｐＭＯＮ２００の７，７ｋｂのＳｔｕ　Ｉ−
ｔｏ　−ＨｌｎｄｌＩ［断片に付加した。生成のプラス
ミド、ｐＭＯＮ９７４１はｌ）ＭＯＮ３１１類似物であ
るが、ＭＡＳ　　プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーターと置換わっだ発現カセットを含んでいる。

ＴＭＶ−ＣＰコード配列は、例２の記述に従つて、また
は、アベルら（Ａｂｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ　　（１９８
６）　）が開示するようにＢＩＩＩと１３ａｍＨＩを用
いてｐＴＭ３１９　　ＤＮＡを消化することによって、
得ることができる。それから、７００　ｂｐのＣＰコー
ド断片を８に）ＩＩＩを用いて開裂したｐＭＯＮ９７４
１に挿入できる。プロモーターおよびＮ０８３’　に関
して意味のある配向でＣＰ挿入物を有するプラスミドは
、ＢＱＩＩＩとＥＣＯＲＩを用いてプラスミド　ＤＮＡ
を消化し、ＭＡＳプロモーターを１，５ｋｂの断片上に
、更に、ＣＰコード配列を７００　ｂｌｌの断片上に放
出させることにより、同定できる。生成のプラスミドを
Ａ、タメファシエンスニ交配すｔｔ、ＭＡＳ／ＴＭＶ−
ＣＰ／ＮＯ３３’　　構成物を保有するＡ、タメフ７シ
エンス細胞を、上記に従って、形質転換したタバコ植物
およびトマト植物を得るために使用できる。

既に記述した方法で、形質転換した植物のウィルス耐性
を試験することができる。

１旦　エレクトロボーレーション技術を使用する遊離Ｄ
ＮＡベクターによる植物細胞の形質転換以下の説明によ
り、ウィルス病耐性を得るために、プラスミドＤＮＡを
外膜を除去した種々の植物細胞（プロトプラスト）に効
果的に導入するアグロバクテリウムに基づかない遊離の
ＤＮＡ受渡しく　ｄｅｌｉｖｅｒｙ）法を概説する。

ダイズ［１江蛙坦ａ＋ａｘ　　（ＧＭ）　］　、ペチュ
ニア　［Ｐｅｔｕｎｉａ　　　１Ｌ仄ＬＬ史Ｌ−Ｍｉｔ
ｃｈｅｌｌ　　　（ＭＰ４）　　］およびニンジン［１
阻阻Ｌｃａｒｏｔａ　（Ｔ　Ｃ）　］由来の細胞培養を
ウィドホルム（Ｗ　１ｄｈｏｌｉ　（１９７７）　）に
従い、ＴＣおよびＧＭに対しては０．ｌａ／（１の２．
４−Ｄ、あるいは、ＭＰ４に対しては０．２＋ａＭλの
ρ−りＯロフエノキシ酢酸を含む５０ｄのＭＳ培養基（
Ｍ　ｕｒａｓｈｉｏｅ　　＆　　Ｓ　ｋｏｏｇ（１９６
２）　）中で、旋回撮とう器上の２５０ｍエルレンマイ
ヤー　フラス：］　（１３５ｒｌ）＋１１　、２７’　
〜２８℃）中に成長させた。

１０ｄパツク（ｐａｃｋｅｄ　）細胞容積の対ｍ成ｉ　
ｔ。

ている懸濁培養細胞を、１０％マンニトールと０．１％
ＣａＣｌ２・２Ｈ２０（＋）８５．７＞とに溶解した酵
素４ｏＩｄ中で１２時間インキュベートすることにより
、ＧＭおよびＴＣ由来のプロトプラストを、それぞれ生
産した。酵素混合物は、２％セルラーゼ　Ｒ−１０（Ｋ
ｉｎｋｉ　　Ｙａｋｕ目。

Ｎ　１ｓｈｉｎｏａ＋ｉｙａ、　Ｊａｐａｎ）　、０．
１％マセロザイム（Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ　）　Ｒ−１
０（Ｋ　１ｎｋｉ　　Ｙａｋｕｌｔ　）、および、０．
５％ベクトラヤーゼ（Ｐ　ｅｃｔｏｌａｙａｚｅ）Ｙ−
２３（Ｓｅｉｓｈｉｎ　　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ　　　Ｃｏ。

Ｌｔｄ、、Ｎｏｄａ、　　Ｃｈｉｂａ、　Ｊａｐａｎ）
を含んティた。

生成のプロトプラストは、ハウブトマンとウィンドホル
ム（Ｈａｕｐｔｍａｎ　　＆　　Ｗｉｎｄｈｏｌｍ　　
（１９８４）　）の開示に従って、単離、精製および培
養した。

ＭＰ４由来のメゾフィル（ｍｅｓｏｐｈｙｌ　Ｉ　）　
　プロトプラストを、使用した酵素混合物が懸濁培養に
用いたものと同一だった以外はフレーリーら（Ｆｒａｌ
ｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ　　（＋９８４）　）の開示に従
って、単離し培養した。

Ｂ、　　　　の　に゛け　　ロ　　−ス　のＵ１刃」口
Ｌ コムギ［ｒｉｔｉ（ｔｉｎ　　ｌｌｌ０ｎＯＣＯＣＣｕ
ｌｌｌ　（Ｔ　Ｍ　）およびＴ　ｒｉｔｉｃｕｍ　　ａ
ｅｔｉｕｕｍ　　（Ｔ　Ａ　）　、Ｍ　ａｄｄｏｃｋら
（１９８３）　　および　□　ｚｔａｓ　−Ａ　ｋｉｎ
ｓとＶａｓｉｌ（１９８３）により開示］、エレフ７＞
ト　グラス［ｅｎｎｉｓｅｔｕｍ　　　ｕｒ　ｕｒｅｕ
ｍ　　（Ｐ　Ｐ　）　、Ｖａｓｉｌら（１９８３）　　
および　Ｋ　ａｒｌｓｓｏｎとＶ　ａｓｉｌ　（１９８
６）により開示］、ギニア　グラス　［ｐ　ａｎｉｃｕ
ｍ＋１ａＸｉ＋１ＵＩＩ　　（ＰＭ）　、ｌｕとＶ　ａ
ｓｉ　ｌ　（１９８１）　　および　Ｋａｒｌｓｓｏｎ
とＶ　ａｓｉｌ　（ｔ９８６）により開示］、イネ［止
江組５ａｔｉＶａ　（ＯＳ　）　、ＨｅＶｓｌｌ！ｒら
（１９８３）　　および　Ｙａｌａｄａら（１９８６）
により開示］、コーン［Ｚ　ｅａ　　シＤ」−（Ｚ　Ｍ
　）　、Ｍ　ｅａｄｏｗｓ（１９８２）により開示］、
サトウキビ［７姐ｏＨｉｃｉｎａｒｕｍ　　（Ｓ　Ｃ）
　、ＨｏとＶ　ａｓｉｌ　（１９８３）および　Ｓ　ｒ
ｉｎｉｖａｓｉｎとＶ　ａＳｉ　ｌ　（１９８５）によ
り開示］、および、ベニセタム　アメリカナム（ｅｎｎ
ｉｓｅｔｕｎ　　ａｍｅｒ＋ｃａｎｕｍ＞とＰ、プルブ
レラム（Ｐ　、　ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ　）およびＰ、ス
ク７？ラタム（ｐ　、　５ｑｕａｌｕｌａｔｕｉ　）の
間の複文９１１（ｄｏｕｂｌｅＣｒＯ８Ｓ）トリスペシ
フィック（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　）ハイブリッド（
ＰＡＰＳ）　　［ＤｕｊａｒｄｉｎとＨａｎｎａ（１９
８４）により開示］から単子葉類の細胞を採取した。Ｐ
ＭおよびＰＡＰＳの懸濁培養を、５％ココナツト　ミル
クおよび２Ｈ１ｇ／（１２，４−Ｄを含む変形ＭＳ培地
（Ｖａｓｉｌ　　＆　　Ｖａｓｉｌ　（１９８１）　）
中で成長させた。一方、ＳＣ培養に対して使用したＭＳ
培地は、更に５００１１１！；Ｉ／βのカゼイン加水分
解物を含んでいた。ＴＭ懸濁培養は、ダディッツら（Ｄ
ｕｄｉｔｓ　　ｅｔ　　ａｌ　　（１９７７）　）に従
ッテ、脂質培地中で成長させた。他の単子葉類の細胞培
養は、それぞれ上に引用した文献に従って成長させた。

週に２度継代培＊　（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）　Ｌ／た
ＴＭとＰＡＰＳを除き、全ての懸濁培養は、３５−の培
地中に２〜８ＩＩｒ１の接種物を用いて、７日の継代培
養で成長させた。プロトプラスト単離に先だって、４〜
５日目に、懸濁を２５〜３５Ｍ１の培地中に５〜８ｍの
接種物を用いて継代培養した。

それぞれの単子葉類ｌ１ｌＩｔｌ型に関するプロトプラ
ストを、バジルら（Ｖａｓｉｌ　　ｅｔ　　ａｌ（１９
８３）　）の開示に従い、３ｍＭ　　ＭＥＳ、０．４５
Ｍ？ンニトール、７ｍＭ　　ＣａＣｆｆ１２　＠　２Ｈ
２ｏ、および、０．７ｍＭ　　ＮａＨ２ＰＯ４０Ｈ（＋
）８５．６）に溶解した種々の酵素混合物を使用して、
単離した。酵素混合物は、ＴＭおよびＰＭに対しては、
１．０％セルラーゼ　Ｒ８（Ｋｉｎｋｉ　　Ｙａｋｕｌ
ｔ　＞と０．８％ペクチナーゼ（Ｓ　ｉｏｍａ）を；Ｓ
Ｃに対しては、２％セルラーゼ　Ｒ８と０．７％ペクチ
ナーゼを；ＰＰに対しては、３％セルラーゼ　Ｒ−１０
と０．７％ペクチナーゼを：ＰＡＰＳに対しては、２．
５％セルラーゼ　Ｒ−１０とｏ、７５％ペクチナーゼを
含んでいた。

それから、単離した単子葉類プロトプラストを、カオと
ミカイルク　（Ｋ　ａｏ　　＆　　Ｍ　１ｃｈａｙｌｕ
ｋ（１９７５）　）により変形された８ｐ培地（Ｖａｓ
ｉｌ＆　　Ｖａｓｉｌ　（１９８０）　）中で培養した
。この培養基は、０．４〜０．５Ｍグルコース、０．５
〜１．０ｍＭり　２．４−Ｄおよび０．２ｍｇ／ｆｆｉ
ゼアチンを含んでいた。これを１週間後にプロトプラス
ト培養基を用いて１：２．３に希釈した。

ＰＡＰＳおよびＴＭのコロニー形成率（ｐｌａｔｉｎ（
７ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　）を測定するために、２〜３
週間後に、２ｍの元のプロトプラスト培養と等価な山を
、０．４％のジ−プラーク（Ｓ　ｅａｐｌａｑｕｅ）　
　アガロース（ＦＭＣ）を用いて３６ｄに希釈した。そ
れから、希釈した培養の３戒を、ｉＱｃ＋ａベトリ皿の
０．６％アガロースを含む同じ培地の層上にプレートし
た。

カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの存在
下で、ジンマーマン（Ｚ　ｉｍｍｅｒｍａｎ）細胞融合
系（Ｑ　ＣＡ　　ｐ　ｒｅｃｉｓｉｏｎ）　、または、
キャパシター　ディスチャージ　バンク（Ｆ　ｒｏｍｍ
ｅｔ　　ａｌ　（１９８５）　）を用いて、プロトプラ
ストにエレクトロボーレーションを行った。ジンマーマ
ン細胞融合系を用いるエレクトロボーレーションは、ジ
ンマーマン　へリカル　フュージョン　チャンバー中で
、または、ボッターら（Ｐ　ｏｔｔｅｒ　　ｅｔａｌ　
　（１９８４）　）の方法に従ってキュベツトと白金ま
たはアルミニウム箔から構成されたエレクトロボーレー
ション室中で行った。パルス　（直流２４０Ｖ）を、そ
れぞれ９のパルスからなるパルス列として９９９．９μ
ｓｅｃで与えた。それぞれのパルス列を、プロトプラス
ト洗浄溶液中、５０μΩの子ウシ胸線ＤＮＡを伴ってま
たはそれを伴わずに１４μＱのプラスミド　ＤＮＡの存
在下で、１回、１０回、５０回および１００回与えた。

キャパシター　バンクは、１個の１００μＦキヤパシタ
ーと１個の２４００μＦキヤパシター（Ｍａｌｌｏｒｙ
）と共に、それぞれ４０．１１０．２４０．３４０μＦ
のキャパシターの４個を含むように構成した。キャパシ
ターは個々にまたは平行に充電と放電を行うことができ
た。パルス放電は、２重チャンネル記録オシロスコープ
（Ｔ　ｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　　モデル　５８４Ａ＞を使
用して監視した。アンペア数はエレクトロボーレーショ
ンの間に１個の１オーム抵抗にかかる放電を測定するこ
とによって決定した。

エレクトロボーレーションに先だって、プロトプラスト
を、１０ｍＭ　　Ｈｅｐｅｓ、　１５０ｍＭＮａＣｊ２
．５ｍＭ　　ＣａＣＪ２２、および、０．２Ｍマンニト
ール（ｐＨ７，２）中で１度洗浄し、それから、同じ緩
衝液（Ｆｒｏｍｍ　　ｅｔ　　ａｔ（１９８５）　）を
用いて約３Ｘ１０８ブＯドブラスト／ｄの密度にした。

１ｍの再懸濁プロトプラストに２０ｍのプラスミド　Ｄ
ＮＡを加え、混合した。このプロトプラストに種々の電
圧と容量でエレクトロボーレーションを行った。プロト
プラストは氷上に約１０分間保ち、その後、液体培養基
中でのブレーティングを行った。

種々のエレクトロボーレーション処理によって細胞溶解
された双子葉類プロトプラストの数を評価するために、
パルス放電を与える前および直後にＴＣプロトプラスト
の密度を測定した。測定値は残存割合で表わした。生存
率測定は、エレクトロボーレーションの２日後のフェノ
サフラニン（ｐｈｅｎｏｓａｒｒａｎ＋ｎ　）染料排除
（Ｗ　ｔｄｈｏｌｍ　（１９７２）　）を基礎にした。

結果はエレクトロボーレーションを行っていない対照と
比較したパーセント生存率で表わした。エレクトロボー
レーションを行った双子葉類プロトプラストのコロニー
形成率評価は、培養の３〜４週後に形成されたコロニー
数を数えることによって得た。これを、エレクトロボー
レーションを行っていない対照の割合として表わした。

形質転換したコロニーは、フロムら（Ｆ　ｒｏｍｍｅｔ
　　ａｌ　（１９８６）　）の開示に従い、カナマイシ
ンを含む培地に移した後に選抜した。同様にして、工学
的に処理したウィルス　コートたんぱく質とカナマイシ
ン選抜可能標識とを含むｐＭＯＮ３１９、ｐＭＯＮ４０
１、ｐＭＯＮ９８００．ｐＭＯＮ９８０９、および、ｐ
ＭＯＮ９８１６などのプラスミドを遊離ＤＮＡ形質転換
に使用することができる。再生植物は、例２に記述した
方法を使用して、コートたんぱく質ｍＲＮＡとたんぱく
貿生産とを監視することができる。

λｂａｌ、　　Ｐ、ｌ　　ａｔ　　ａｌ、　　旦ζ１監
ｎΩ旦　２コ２：　７コ８　　（１９１１６）。

ｊｕｍｉｒａｔｏ、　　ｐ、ｖ、、　　ａｔ　ａｌ　（
ｅｄｓ、）、　　３１（ＪｔＪ（Ｄ３００Ｋ　ＯＦ　Ｐ
ＬＡｂ”ｆ’　ＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥ　−ＣＲＯＰ　
５ＰＥＣ？Ｅ５　（Ｍａｃｗｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ、　
Ｃｏ、　１９１＋４）。

５　　　　　Ｂａｒｋａｒ、　　Ｒ，Ｆ、、　　ａｔ　
　ａｌ、　　　　　　　　　　　　　　　　゛　　　　
２：３コ５　　（１９８コａｌ。

Ｂａｒｋａｒ、　　Ｒ，Ｆ、、　　ｅｔ　　ａｌ、　　
　　　　”ｄ　　　　　ａ　　　　　１１：２１１８１
−ｆ１９１　　（１９８コｂ）。

Ｂ＠ａｃｈｙ、　　Ｒ，Ｎ、、　　ｅｔ　　ａｌ、　　
１Ｂ　　Ｂ工０ＴＩＣ）ＩＩＮＯＬＯＧＹ　　ＩＮ　　
ＰＫ；すＴｓｃｘＥＮｃｚ　　−ＲＥＬＥＶ入ＮＩＪ　
　Ｔｏ　　入ＧＲ工ＣυＬτυＲΣ　ＸＮ　　Ｔｌ（！
　　Ｅ工ＧＯＴ工ＥＳ　　２６５−１０　　７５　　（
Ｍ、　　Ｚａｉｔｌｉｎ、　　ａｔ　　ａｌ　　ａｄｓ
、）　　（入ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　１９＋
１５）。

Ｂａｖａｎ、　　Ｍ、、　　ａｔ　　ａｌ、　　Ｅ息匁
猛ｘ息　３０４＋　　１１１４　　（１９ａコ）。

Ｂ１１ａｒｏ、Ｄ、Ｍ、、ａｔａｌ、１０＋４９１コー
９２２（１９８２）　。

Ｂｒｕａｎｉｎｇ、　Ｇ、、　ａｔ　ａｌ、　ム暉扛ｚ
ニア１：　４９Ｂ−５１７（１９７６）　。

１５　　　　Ｃｏ５ｔａ、　　入−３−１ａｔ　　ａｌ
＋　　！！ｌＡｎ監−ｎ１区但凰農塵　６４：　　５コ
Ｂ−４１（１９＋１０１゜Ｃｏｖ＠ｙ、　　Ｓ、、　　
ｅｔ　　ａＬ、　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　９：　　６フコ５　　（１９８１１゜Ｄｕｄｉｔ
ｉｓ、　　Ｄ、、　　ｅｔ　　ａｌ、　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−ｅ　　　　　　５１：　　１２
７−３２（１９フフ）。

Ｄｕｄｌａｙ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　對ヨ１２江１１
７：　１９　（１９ｆ１２１゜２０　　　　Ｄｕｊａｒ
ｄｉｎ、　　Ｍ、　　＆　　Ｗ、　　Ｈａｎｎａ、　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｓ　　　　　　６９
：　　９）−１ｏｏ　　（１９８４）。

Ｆｒａｌａｙ、　　Ｒ，？、、　　ｅｔ　　ａｌ、　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　コニ　コア１−
７８　　（１９８４）。

Ｆｒａｌ＠ｙ、　　Ｒ，？、、　　ｅｔ　　ａｌ、　　
３１工Ｑｌコシ（＝ｈｎｓ口ＪすＩＹ　コニ　６２９−
コ５　　（１９１１５）。

Ｆｒａｎｃｋ、　　入＋１ａセａｌ、　　；１１」１２
Ｌ＋　　２８５　　（１９８０１゜２５　　Ｆｒｏｍａ
、　Ｍ６．　ａｔ　ａｌ、　　　　　　　　　　　　　
　’　　　　　８’２＋　８２４−２８（１９８５）。

”””ｒ　　”ｒ　　”−ａＬ　　匠龜監ｕ二立　コ１
９＋　　７９１−９３　（１９１１６１。

ｃａｒｄｎ＠ｒ、　Ｒ，Ｃ，、ａｔ　ａｌ、　　　　　
　　　　ｄ　　　　　９：　　２８７１　　（１９８１
１゜Ｇａｒｆｉｎｋ＠ｌ、　　Ｄ、、　　ａｔ　　ａｌ
、　　（Ｊユ、ｌ　　２７：　　１４：ｌ−５コ　（１
９８１）。

３０　　　Ｇｏｅｌａｔ、　　Ｐ、、　　ａｔ　ａｌ、
　　　　　　　　　　　　ｄ　　　ｃ’　　　　　７９
：　　５８１８（１９Ｂ２）。

Ｇｏｕｌｄ、　　入、Ｒ，＆　　Ｒ，Ｈ，Ｓｙｍｏｎｓ
、　　　　　　Ｊ　　　’ｏ　　ｅ、、　　１２６：　
　２１７−２６　　（１９８２１゜ Ｇｒａｃｉａ、　　Ｏ，＆　　Ｒ，５ｈａｐｈａｒｄ、
　　ＭユＪゴＥロンＩｙ　Ｌ４６：　　１４１−４５　
　ＩＬり８５）・３５　　　　ａｕｂｌａｒ、　　υ、
　　＆　　Ｂ、Ｊ、　　Ｈｏｆｆｍａｎ、　　ｊ、ｇ４
＠　　２５：　　２６コー６９　　（１９８コ）。

Ｇｕｉｌｌｅｙ、　　Ｈ，、ａｔ　　ａｌ、　　（，１
よ１　コ０：　）６コ　（１９８２１。

）！ａａａｒ、　　ｏ、　　＆　　Ｐ、Ｌａｄ＠ｒ、　
　（、ｇ４工　１８；　　１２９９−Ｌコ０２　　（１
９〕９）。

）ｉａｍｉｌｔｏｎ、　　ＩＪ、（ＬＯ，、ａ：　　Ｉ
ｌｌ、　　：区：Ｑ−シ、コニ　２１タフ−２０５（１
９１４１゜）１ａｕｐｔ；ａｎ、Ｒ，Ｍ、＆Ｊ、Ｍ、Ｉ
ＪＲＬｈｏｌｐ、Ｅ五１」８−−Ｚｈヱ」ｄムＬＬ４７
０＋コ０−コ４（１９８２）　。

Ｈ＠ｒｒ＠ｒａ−Ｅｓｔｒ＠ｌｌａ、　　！１．．　　
ｍｅ　　ａｌ、　　区九二鼠：：　コロコニ　　２０９
　　（１９８コ）。

ＨｅＹＳ＠ｒ＊Ｊ−ｒａｔａｌ＊’−２り：１７５−８
２（１９８コ）。

Ｈｉｒｔｈ、　Ｌ、　＆　Ｋ、Ｚ、　Ｒｌｃｈａｒｄｓ
、　ｍ　ｕｕｆｆｅｒ、　ａｔ　ａｌ　（１９８１１゜
Ｈｏ、　　Ｗ、　　＆　　工、ＩＣ，Ｖａｓｉｌ、　　
６ｍ１−」お≧（１Ｓｌ：　７１９−２６　　（１９８
コ）。

’　　　””Ｃｈｔ、”’ｒ　　＠”−ａｌ、　　旦ζ
１Ｌｎｑ監　２２フ：　　１２２９　　（１９１１５１
゜Ｈｏｒｓｃｈ、Ｒ，Ｂ、＆　Ｈ，Ｘｌａｍ。

Ｂコ＋　　４４２８−コ２　（１りＢ６）。

Ｈｏｗａｍ、　　入、、　　＠ｔ＆工、　！工＝２１Ω
ｇ！　１λ２：　６フ！ｌ　　（Ｘ９ａｉｌ。

Ｈｕｙｎｈ　　　　　　　　　　　ａｔ　　ａｌ、　　
１ｎ　Ｌ　　ＤＮＡ　　ＣＬＯＮ工ＮＧ　　（Ｄ、　　
Ｇｌｏｖｅｒ　　ａｄ、）旦シｃ上ミ　ｌｌｂ、ｎｒ−
目０９ （１９６２１゜ ０ｄａｌｌ、Ｊｏ、＠セａｉ、ド１」−ゎにユコ１コニ
８ＬＯ（１９８５１゜０ｚｉａｓ−λｋｉｎｓ、　Ｐ、
　＆　Ｘ、に、　Ｖａｓｉｌ、　トＩＬ」二」丈Ｌ７０
：　１０９２−９７（１９８コ）。

Ｐｏｔｔａｒ、　　　Ｌ、　　　ｅセ　　ａｌ、　　　
Ｅ：５　　８１：　７１６１（６５（１９８４）。

Ｒａ５ｔ、　　入１．　ａｔ　ａｌ、　　ｌｅ　１′Ｉ
　　　　　　　　　　６　　　ｏ　　　　　　　　７８
：１１０−１２　　（１９７２Ｊ。

Ｒｏｇ＠ｒｓ、　　Ｓ、Ｇ、、　　　　ａ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　コニ　　１１
１−１６（１り８５）。

１０　　Ｒｏｇｅｒｓ、　５．、　　ｅセミｌ、　１ｊ
１１１８　ＫＥＴＨＯＤＳ工Ｎ　ＥＮＺＹＭ。ＬＯＧＹ
　６２７（Ｈ，Ｗａｉｇｓｂａｃｈ　　＆　　入、　　
Ｗａｉｇｓｂａｃｈ、　　ａｄｓ、）　　（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ１９１１６）。

Ｒｏｇａｒｓ、　　Ｓ、Ｇ、、　　ａｔ　　ａｌ、　　
ｊＢ　　ＢＩＯＴＥＯＩＮＯＬＯＧＹ　　工Ｎ　　ＰＬ
ＡＪＪＴ　　５ＣＩＥＮＣＥ　　’−１１（Ｐ、　Ｄａ
ｙ、　ａｔ　ａｌ　ａｄｓ、）　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒａｓ＋ｓ　１９１！５）。

１５　　　　Ｓａｎｄｍ＠ｒａｒ、　　１：、　　＆　
　Ｐ、　　Ｃｈｒｉｓｔｅｎ、　　シ、−Ｊｌ≦ａ１−
」コ１ａｍ４２５５：　　６１５コー５９　　（１９８
０１゜ ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓａｒ、　Ｔ、Ｊ、　＆　Ｄ、Ｒ，
Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、　、］　％Ｚ　１６４−１５５　　
（Ｌ９８５）。

（１９８５）。

Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ、　　ｙ、、　　ａｔ　ａｌ、　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　７８＋１フフー１８１　　（１９８１）。

ＴｈＱＩ！Ｉ”＋　　Ｐ、”ｒ　　！１】Ｄよニュ日−
社■■ジー”’　　”’−４７（１９８コ］。

２５　　Ｔｏｗｂｉｎ、　ａｔ　ａｌ、　　　　　　　
　　　　　　　　　　　７６：　４３５０（１９７９）
。

で−ｍａｒ、　　Ｎ、、　　ｅｔ　　ａｌ、　　　　　
　　　　　’　　　　　　　　　１４：　　ココ２５　
　（１９１１６）。

Ｖａｎｃａ、　　Ｖ、Ｂ、　　＆　　Ｒ，Ｎ、　　Ｂｅ
ａｃｈｙ、　　３！ユＪｘとし≧Ｉ！　１：１２：　　
２７１−Ｉｌｌ　　（１９＋１４１゜ＶａｓｉＬ　ｖ、
　　ｂ　工、に、　Ｖａｓｉｌ、　　　　　　　　　　
　　　　　５６：　９７−９９３０　　　（１９８ｏ）
。

Ｖａｓｉｌ、　Ｖ、　＆　Ｘ、に、　Ｖａｓｉｌ、　仙
り加ム４７：　６６９−７１１　（１９８１１゜Ｖａｓ
ｉｌ、　　　Ｖ、、　　　ａｔ　　ａｌ、　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１１：　　
　２コニ−２３９（１９８コ〕。

１Ｊｉｃｋａｎｓ、　　　Ｍ、Ｐ、、　　　ａｔ　　ａ
ｌ、　　　シュー一一工９１よ−−ｇｈ二コ、　２５コ
ニ　　２４８コー４９５コ５　　　　Ｑ９７ａｌ。

Ｗｉｄｈｏｌｍ、　　Ｊ、Ｍ、、　　＄工ｎ−ＩユΩｈ
ｎΩ１エ　４７：　　１１１９−９４　　（１９）２）
。

％Ｊｉｄｈｏ１ｍ、　　Ｊ、Ｍ、、　　！！ユＪ■１１
ａ　１コ４：　ｌＯコーＢ　（１９７７）。

Ｙａｍａｄａ、　Ｙ、、　ａｔ　ａｌ、　　　　　　ｐ
　　　ｓ　　　　５：　８５−８８　（１９１＋６１゜
Ｚａｋ、’＋ａ５１ａｖ、　ｖ、Ｍ、、ａｔ　ａｌ、　
　　ｗｗ　　　　　　　　ｔ＊　　　　　　１２：　　
６１−７０　　（１９１１４）。

Ｚｏｌｌａｒ、　　Ｍ、　　＆　　Ｍ、　　Ｓ＋ｐｉｔ
ｈ、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
：　　６４８１（１９１１２）　。

５　　Ｚｕｒｉｎｉ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、こ」シＬ
≦ムＬ２５９：　６１ｇ−２７（１！１４１゜

【図面の簡単な説明】

第１図はウィルス病耐性生物試験の概略図である。 第２図はダイス　モザイク　ウィルス　コートたんぱく
質（Ｓ　Ｍ　Ｖ　　ＣＰ　）の部分アミノ酸配列図であ
る。 第３図は　ＣａＭＶ３５８／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯ８Ｒ４
成物を含む植物形質転換ベクター図である。 第４図はＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーターを含む発現ベ
クター図である。 第５図はＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーター、マルチリン
カ−およびツバリン　シンターゼ断片の完゛　全配列図
である。 第６図および第７図は、それぞれ、トランスジェニック
なタバコ植物およびトマト植物に対する異なる水準のウ
ィルス接触の効果のデータ図である。 第８図はウィルス耐性の比較のデータ図である。 第９図は交叉免疫の導入のデータ図である。 第１０図は５ｓＲＵＢ　ｌ５ＣＯプロモーターの最初の
単離と中間体ベクターへの導入を示す系統図である。 第１１図は５ｓＲＵＢ　ＩＳＣ○　プロモーターの部分
ヌクレオチド配列図である。 第１２図はＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーターを５ｓＲＬ
ＩＢ　ｌ５ＣＯプロモーターに置換した０ＮＡＩ！成物
の製造の系統図である。 第１３図はアルファルファ　モザイク　ウィルスのコー
トたんぱく質（ＡＭＶ　　ＣＰ）をコードするＣＤＮＡ
の製造の系統図である。 第１４図はポテト　ウィルス　Ｘ　のコートたんぱく質
遺伝子（ＰＶＸ　　ＣＰ）を含む植物ベクターの製造の
系統図である。 第１５図はｐｖｘ　　ｃｐ遺伝子のヌクレオチド配列図
である。 第１６図はトマト　ゴールデン　モザイク　ウィルス　
コートたんぱく質（ＴＧＭＶ　　ＣＰ）をコードするヌ
クレオチド断片の単離の系統図である。 第１７図はＴＭＶ　　ＲＮＡに対するアンチセンス相補
体をコードするＤＮＡを含む植物ベクターの製造の系統
図である。 出願人代理人　弁理士　鈴江武彦 図面の浄書（内容に変更なし） ヤ７゛含Ｂ＼−＋＝ｊオＬＬ還王々−（Ｊｉ烙１道鞠（
保ヒ牛田ｇｅシＦｉｇ　　　　１ ＮＴ＋堝　□　ｈ　　８０−　＋ＯＯｂｏ□Ｃ（ＡＡａ
１３ＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧｔＡＧＴＡＧＴ１１ｊＶＧ
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ＣＴＴＣＡＴＯＱＴＡＴＧＧＴＧＣＩＯＮＧＴＳＰＤＡ
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ＣＴＭＴＧＧＣＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＭＤＧＥＥＯ
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　　　　　、　　　　　　　＋４０ｃｃＡｔｃａｖｔＧ
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ａＧａＴＧｃｒＬｒｃ丁ＧＣＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣ
ＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＣ（ｃＴＭＶ　　　　　　　５ａ
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　　　　　　　　　　　　　　　　　３ＩＯＲＦＩ　　
　　　　　　０ＲＦ２　　　　　　ＣＰ　　　　　　Ｓ
　Ｎ０ＲＦ　　　　　　７°ライマー Ｆｉｇ　　　５ ５　　６　　７　　　Ｇ　　　＋５　　１’）詩イ走９
日数（ｒ３） Ｆｉｇ　　　６ ＴｏＭＶ　２　　ｔｔ　ｔｔ　　＋２　ν９／ＩＴＩＩ
＋４　　　　５　　　　５　　　　７　　　　８　　　
　１＋　　　　　１４１１豐１にりシベ Ｆｉｇ、８ Ｆｉｇ　　　１０ ＜＋ｚ二　１１４　　　　　　　５ｓＲｕＢｌｓｃｏ　
　　１０％−９−ＥｃｏＲＸ ］ ＧＡＡＴＴＣ・・・・５００ｂｐｔ）Ｌ・ｐｚｓｇｒｌ
”１ｙ１”６・ＱＮＡ・・・竜串択９間り元、 Ｆｉｇ　　　１１ Ｆｉｇ　　　１２ ＡＭＶコ−ｃｘｃ＋ｒ＜’ｉ　　ＣＤＮＡ＃）合気４＃
ａ”ライ”−’）ＲＮＡ４ＡＱ”イゲソグイｗニー”−
ａ＆＊　１１４−写一一一・　・・＋７・ シｏＲＸ　瑞４し Ｆｉｇ　　　１３ Ｆｉｇ　　　１４ ：＝ｚｇ：：ａｉ：　　書　＝　鑓 Ｆｉｇ　　　１６ −Ｌ　おＣ負ｎ　　’＋Ｅ　　、椋　（方式）昭和６１
年　１月２９［１ 特許庁反官　１．１．％　　口］　明　雄　殿２、発明
の名称 ウィルス感染に対する植物保護 ３、補正をする者 ・１１件との関係　　特許出願人 名称　　モンサンド・カンパニー　（ほか１名）４６代
理人 住所　東京都千代川区霞が関３丁ロア番２号　ｔＪＢＥ
ビル昭和６２年１月２７０ ６、補正の灯象 適正な願１λＳ（代表者の氏名）、委任状およびその訳
文、明細１す（第１０６頁ないし第ｔＯＳ頁及び図面の
簡単な説明の欄）、図面 □゛、−１，−・ ゴ　　　・　１ 、？、補正の内容 （１）適正な願；ｌびに委任状およびその訳文は別紙の
通り（２）明細書第１０６頁ないし第１０９頁を別紙の
通り訂ｉＥする。 ＃−≠に変撲々を− （３）明細書第１０６第７行目ないし同頁第１３行口に
於いて［第３図はｅ・である、」とあるを「第３図はＣ
ａＭＶ３５Ｓ　　プロモーターを含む発現ベクター図で
ある。第４図はＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモーター。 マルチリンカ−およびツバリン　シンターゼ断片の完全
配列図である。第５図はＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ
／ＮＯ３構成物を含む植物形質転換ベクター図である。 」と訂正する。 （′ト）　　ロＰカーＳ７番　（丙汀・２椹し史〕トシ
ノ１三じＬＩＬ ・アベルら、サイエンス、１９８６年２３２巻７３８頁
［Ａｂｅｌ、Ｐ、、ｅｔ　　ａｔ、５ｃｉｅｎｃｅ　　
２３２ニア３８（１９８Ｇ＞　］ ・アミラードら編集、［植物細胞培養ハンドブック−農
作動程」、マクミラン出版社、１９８４年［△ｎｍ１ｒ
ａｃｏ、　　ｐ、　■、、ｅｔ　　ａｌ（ｅｄｓ、）　
、　３ＨＡＮＤＢＯＯＫ　　ＯＦ　　ＰＬＡＮＴ　　Ｃ
ＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥ−ＣＲＯＰ　　ＳＰＥＣＩＥＳ（
Ｍａｃｍｔｌｌａｎ　　Ｐｕｂｌ、Ｇｏ、１９８４）コ
・バーカーら、プラント　モレキュラー　バイオロジー
、１９８３年ａ　２巻　３３５頁［３ａｒｋｅｒ、　　
Ｒ。 Ｆ、、ｅｔ　　ａｔ、　　１ａｎｔ　　Ｍｏ１ｅｃ　　
　ｉｏｌ、２：　　３３５（１９８３ａ　）　］ ・バーカーら、ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ、１
９８３年ｂ１１巻２８８１〜８９１頁［Ｂａｒｋｅｒ、
　　Ｒ。 Ｆ　、、ｅｔ　　ａｔ、　Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　　ｃｉ
ｄｓ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　１１　：２８８１−８９
１　　（＋９８３ｂ　）　］・ビーチら、「植物科学に
おけるバイオテクノロジー　−８０年代の農業に関連し
て」　（ザイトリンら編集）の２６５〜７５頁、アカデ
ミツクプレス、１９８５年［３ｅａｃｈｙ、　　Ｒ，Ｎ
、、ｅｔ　　ａｔ、　　１ｎＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
Ｙ　　ＩＮ　　ＰＬＡＮＴＳＣＩＥＮＣＥ−ＲＥＬＥＶ
ＡＮＣＥ　　ＴＯＡＧＲＩＣＵＬＴｔＪＲＥ　　ＩＮ　
　ＴＨＥＥ　ＩＧＨＴ　Ｉ　ＥＳ　　２６５　７５（Ｍ
、　Ｚａｉ口ｉｎ、　ｅｔａｔ　　ｅｄｓ、＞　　（Ａ
ｃａｄｅＩｌｌｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　１９８５）　］
・ビビーンら、ネイチャー、１９８３年３０４巻１８４
頁［Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、、ｅｔ　　ａｌ、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　　３０４：　　１８４＜１９８３）　］ ・ピサロら、ヌクレイツク　アシツズ　リサーチ、１９
８２年１０巻４９１３〜９２２頁［Ｂ　１ｓａｒｏ、　
　Ｄ　、　　Ｍ　、、ｅｔａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　
Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、１０：４９１３−９２２（１９
８２）　］ ・ブリューニングら、パイフロシー、１９７６年７１巻
４９８〜５１７頁［３ｒｕｅｎｉｎｇ、　　Ｇ　、、ｅ
ｔ　　ａｔ。 Ｌ匹蛙坦Ｌ７１　：　　４９８−５１７　　（１９７ｆ
３）　］・コスタら、プラント　ディシース、１９８０
年６４巻５３８〜４１頁［Ｃｏ５ｔａ、　Ａ、　Ｓ、、
ｅｔ　　ａｔ、　　ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ　　Ｇ４
：　　５３８−４１（１９８０）　］・コーベイら、ヌ
クレイツク　アシツズ　リサーチ、１９８１年９巻６７
３５頁［Ｃｏｖｅｙ、　３　、、ｅｔ　　ａｌ。 Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａ　ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、　　９
　：　６７３５　（１９８１）　］・ダジティスら、セ
オレテイカル　アプリケーションズ　イン　ジエネテイ
クス、１９７７年５１巻１２７〜３２頁［［）ｔｌｄｉ
ｔｉｓ、　　［）、、ｅｔ　　ａｔ、工ｈｅｏｒｅｔ−
り圧ニー主並虹、　５１：　　１２７−３２＜１９７７
＞　トダドレーら、パイフロジー、１９８２年１１７巻
１９頁［Ｄｕｄｌｅｙ、　　Ｒ，、ｅｔ　　ａｌ、　Ｖ
ユニ旦ｙｕ−１１７：　１９（１９８２）　］ ・ダジャルディンおよびハナ、セオレテイカルアプリケ
ーションズ　イン　ジエネテイクス、１９８４年６９巻
９７〜１００頁［Ｄｕｊａｒｄｉｎ、　　Ｍ、　　＆　
　Ｗ。 １−１ａｎｎａ、　７　ｈｅｏｒｅｔ、　Ａｐ　ｌ、　
　Ｑｅｎｅｔ、　６９：　９７−１００　（１９８４）
　］ ・フレーリーら、プラント　モレキュラー　バイオロジ
ー、１９８４年　３巻　３７１〜７８頁［Ｆ　ｒａｌｅ
ｙ、　　Ｒ。 Ｔ、、ｅｔ　　ａｔ、　Ｐｌａｎｔ　　Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏｌ、　３：　　３７１−７８（４９８４）］ ・フレーリーら、バイオ／テクノロジー、１９８５年３
巻　Ｂ２９−３５頁［Ｆ　ｒａｌｅｙ、　　Ｒ、Ｔ　、
、ｅｔ　　ａｌ。 ｉｏ／　　ｅｃｈｎｏｌｏ　　　３　：　　６２９−３
５　（１９８５）　　］・フランクら、セル、１９８０
年２１巻２８５頁［Ｆｒａｎｃｋ、　　Ａ、、ｅｔ　　
ａｌ、　、！１．ＬＬＬ　　２１：　　２８５（１９８
０）］ ・フロムら、プロシーディンゲス　オブ　ナショナル　
アカデミ−オブ　サイエンス　インＵＳＡ、１９８５年
８２巻　８２４〜２８頁［Ｆｒｏｍｍ、　Ｍ　、、ｅｔ
ａｌ、　ｐｒｏｃ、　　Ｎａ口、　　　ｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ８２：　　８２４−２８（１９８５）　
］・フロムら、ネイチャ＝、１９８６年３１９巻７９１
〜９３頁［Ｆｒｏａ＋ｍ、　Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　３１９：　７９１−９３（１９８６）　］ ・ガードナーら、ヌクレイツク　アシツズ　リサーチ、
１９８１年９巻２８７１頁［Ｇａｒｄｎｅｒ、　Ｒ，Ｃ
，、ｅｔａｔ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　、Ａ、ｃｉｄｓ　
　Ｒｅｓ、　　９：２８７１＜１９８１）　］ ・ガーフィンケルら、セル、１９８１年２７巻１４３〜
５３頁［Ｇａｒｒｉｎｋｅｌ、　Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、　
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ル　アカデミ−オブ　サイエンス　インＵＳＡ、１９８
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ｒｉｎｉ、　　Ｍ、ｅｔ　　ａｌ、　　　、　　　ｉｏ
ｌ　　　Ｃｈｅｍ。 ２５９：　　１３１８−２７（１９８４）　］−〔続　
ネ山　　−ｒ−Ｅ　　書−り 昭和６１年　１月２９０ ’ＪＳ　＋ｔ’Ｙ　Ｉｆ’　ｋ　官　　黒　Ｌ１２　１
ＪＩ　　！　　殿１、・バ件の表示 特願昭６１−２５８０６３号 ２、発明の名称 ウィルス感染に対する植物保護 ３６補１Ｅをする者 １Ｇ件との関係　　特許出願人 名称　モンサント・カンパニー　（ほか１名）４、代理
人 住所　東京都千代田区霞が関３丁目７＃２号　ＵＢＥビ
ル５、自発補正 ６、補正の対象 ／ゝ゛　　　　　　　　　　　Ｉえ字ロア、補正の内容 ≠け　明ｍ書第１７頁第１７行ないし第１８頁第１１行
に於て［第３図は・・・示している。」とあるを「第３
図は、制限エンドヌクレアーゼＢａｌ■とＥＣＯＲＩに
対する唯一の（ｕｎｉＱｕｅ）開Ｈ１１１位を有する合
成マルチリンカ−に隣接してＣａＭＶ３５Ｓ　　プロモ
ーターを含む発現ベクター、ｐＭＯＮ３１６を示す。こ
のマルチリンカ−の後には、ツバリン　シンターゼ遺伝
子アデニル化シグナルをコードする２６０［３対の断片
が続いている。第４図は、第３図に示したＣａＭＶ３５
８　　プロモーター、マルチリンカ−およびツバリン　
シンターゼ断片の完全配列を示している。 第５図は、ＣａＭＶ３５８／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯ８構成
物を含む植１カ形質転換ベクター、１）ｌｖ１ＯＮ３１
９を示す。このベクターは植物８Ｉ［ｌｌ！ｉｔに構成
物を挿入するために使用した。」と訂正する。

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物ウィルスによる感染に対して耐性である遺伝
   的に形質転換した植物を生産する方法であって、 （ａ）植物細胞のゲノムに、 （ｉ）植物細胞中で機能して、上記の植物ウィルスのＲ
   ＮＡ配列の生産を起こすプロモーターと、 （ｉｉ）上記の植物ウィルスのコートたんぱく質をコー
   ドするＲＮＡ配列の生産を起こす上記の植物ウィルスか
   ら誘導したＤＮＡ配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して、上記の ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチド
   の付加を起こす３′非翻訳領域と を包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子を挿入する工程と、 （ｂ）形質転換された植物細胞を得る工程と、（ｃ）上
   記の形質転換植物細胞から、上記の植物ウィルスによる
   感染に対する耐性が増した遺伝的に形質転換された植物
   を再生する工程と を包含する形質転換植物の生産方法。
2. （２）上記のプロモーターが植物ＤＮＡウィルスプロモ
   ーターである特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）上記のプロモーターがカリフラワーモザイクウィ
   ルスの３５Ｓプロモーターである特許請求の範囲第２項
   記載の方法。
4. （４）上記のプロモーターがノパリンシンターゼまたは
   オクトピンシンターゼプロモーターである特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
5. （５）上記のプロモーターが植物遺伝子プロモーターで
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）上記のプロモーターがリブロース２リン酸カルボ
   キシル化酵素小サブユニットプロ モーターである特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）上記のプロモーターがヒドロキシプロリンに富む
   糖たんぱく質をコードする遺伝子のプロモーターである
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）上記のＤＮＡ配列が、２本鎖ウィルスＤＮＡ、ま
   たは、ＤＮＡまたはＲＮＡウィルスから合成した２本鎖
   ＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載の方法。
9. （９）上記の植物ウィルスが、タバコモザイクウィルス
   、ダイズモザイクウィルス、ビ ーンポッドモトルウィルス、タバコリン グスポットウィルス、バーレイイエロー ドゥワーフウィルス、コムギストリークウ ィルス、コムギスピンドルストリークウィ ルス、ソイルホーンモザイクウィルス、メ イズドゥワーフモザイクウィルス、メイズ クロロティックドゥワーフウィルス、アル ファルファモザイクウィルス、ポテトウィ ルスＸ、ポテトウィルスＹ、ポテトリー フロールウィルス、トマトゴールデンモザ イクウィルスおよびキューリモザイクウィ ルスからなる群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載
   の方法。
10. （１０）上記の植物ウィルスがタバコモザイクウィルス
    である特許請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）上記のＤＮＡ配列が、上記のコートたんぱく質
    が上記の形質転換植物中で存在するように上記の形質転
    換植物中で発現する特許請求の範囲第１項記載の方法。
12. （１２）配列中に、 （ａ）植物細胞中で機能して、植物ウィルスのＲＮＡ配
    列の生産を起こすプロモーターと、（ｂ）上記の植物ウ
    ィルスのコートたんぱく質をコードするＲＮＡ配列の生
    産を起こす上記の植物ウィルスから誘導したＤＮＡ配列
    と、 （ｃ）植物細胞中で機能して、上記のＲＮＡ配列の３′
    末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を起こす３
    ′非翻訳領域と を包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子。
13. （１３）上記のプロモーターが植物ＤＮＡウィルスプロ
    モーターである特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分
    子。
14. （１４）上記のプロモーターがカリフラワーモザイクウ
    ィルスの３５Ｓプロモーターである特許請求の範囲第１
    ３項記載のＤＮＡ分子。
15. （１５）上記のプロモーターがノパリンシンターゼまた
    はオクトピンシンターゼである特許請求の範囲第１２項
    記載のＤＮＡ分子。
16. （１６）上記のプロモーターが植物遺伝子プロモーター
    である特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。
17. （１７）上記のプロモーターがリブロース２リン酸カル
    ボキシル化酵素小サブユニットプロ モーターである特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ分
    子。
18. （１８）上記のプロモーターがヒドロキシプロリンに富
    む糖たんぱく質をコードする遺伝子のプロモーターであ
    る特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。
19. （１９）上記のＤＮＡ配列が上記のコートたんぱく質の
    生産を起こす特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子
    。
20. （２０）上記の植物ウィルスが、タバコモザイクウィル
    ス、ダイズモザイクウィルス、ビ ーンポッドモトルウィルス、タバコリン グスポットウィルス、バーレイイエロー ドゥワーフウィルス、コムギストリークウ ィルス、コムギスピンドルストリークウィ ルス、ソイルホーンモザイクウィルス、メ イズドゥワーフモザイクウィルス、メイズ クロロティックドゥワーフウィルス、アル ファルファモザイクウィルス、ポテトウィ ルスＸ、ポテトウィルスＹ、ポテトリー フロールウィルス、トマトゴールデンモザ イクウィルスおよびキューリモザイクウィ ルスからなる群から選ばれる特許請求の範囲第１２項記
    載のＤＮＡ分子。
21. （２１）特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子を包
    含する植物形質転換ベクター。
22. （２２）特許請求の範囲第２１項記載の植物形質転換ベ
    クターを含有する細菌細胞。
23. （２３）上記の形質転換ベクターがｐＭＯＮ３１９：：
    ｐＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥコインテグレートプラスミドであ
    る特許請求の範囲第２２項記載の細菌細胞。
24. （２４）上記の細菌細胞がアグロバクテリウムタメファ
    シエンス細胞である特許請求の範囲第２２項記載の細菌
    細胞。
25. （２５）上記の細菌細胞が受託番号第５３９２４号のＡ
    ＴＣＣ寄託物を包含する細菌細胞の特性を有する特許請
    求の範囲第２４項記載の細菌細胞。
26. （２６）（ａ）植物細胞中で機能して、植物ウィルスの
    ＲＮＡ配列の生産を起こすプロモーターと、 （ｂ）上記の植物ウィルスのコートた んぱく質をコードするＲＮＡ配列の生産を起こすＤＮＡ
    配列と、 （ｃ）植物細胞中で機能して、上記の ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチド
    の付加を起こす３′非翻訳領域と を包含するＤＮＡを含有する形質転換植物細胞。
27. （２７）上記の植物ウィルスに対する耐性を示す特許請
    求の範囲第２６項記載の形質転換植物細胞を包含する分
    化植物。
28. （２８）上記のＤＮＡ配列が、上記のコートたんぱく質
    が上記の植物中で存在するように発現する特許請求の範
    囲第２７項記載の方法。
29. （２９）上記の植物が、マメ科、セリ科、アブラナ科、
    ウリ科、イネ科およびナス科から選んだ科に属する特許
    請求の範囲第２７項記載の植物。
30. （３０）上記の植物ウィルスがタバコモザイクウィルス
    またはアルファルファモザイクウ ィルスである特許請求の範囲第２７項記載の植物。
31. （３１）上記の植物がタバコ植物である特許請求の範囲
    第３０項記載の植物。
32. （３２）上記の植物がトマト植物である特許請求の範囲
    第３０項記載の植物。
33. （３３）植物ウィルスによる感染に対して耐性である工
    学的に処理した形質転換植物を生産する方法であって、 （ａ）植物細胞のゲノムに、 （ｉ）植物細胞中で機能して、上記の植物ウィルスのＲ
    ＮＡ配列の生産を起こすプロモーターと、 （ｉｉ）上記の植物ウィルスのＲＮＡ配列の生産を起こ
    すＤＮＡ配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して、上記の ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチド
    の付加を起こす３′非翻訳ＤＮＡ配列とを包含する組換
    体２本鎖ＤＮＡ分子を挿入する工程と、 （ｂ）形質転換された植物細胞を得る工程と、（ｃ）上
    記の形質転換植物細胞から、上記の植物ウィルスによる
    感染に対する耐性が増した遺伝的に形質転換された植物
    を再生する工程と を包含する形質転換植物の生産方法。
34. （３４）上記のＲＮＡ配列が上記の植物ウィルスのアン
    チセンス配列である特許請求の範囲第３３項記載の方法
    。
35. （３５）ウィルス耐性植物の生産方法であって、（ａ）
    植物細胞中で機能して、植物ウィルスのＲＮＡ配列の生
    産を起こすプロモーターと、（ｂ）上記の植物ウィルス
    のコートたんぱく質をコードする上記の植物ウィルスの
    ＲＮＡ配列の生産を起こす上記の植物ウィルスから誘導
    したＤＮＡ配列と、 （ｃ）植物細胞中で機能して、上記のＲＮＡ配列の３′
    末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を起こす３
    ′非翻訳領域と を包含するＤＮＡを含有する植物の繁殖を包含するウィ
    ルス耐性植物の生産方法。
36. （３６）第１の植物と第２の植物との間に、少なくとも
    いくらかの交雑後代が上記の植物ウィルスに対する耐性
    を示すように交雑を行うことによってこの第１の植物が
    繁殖する特許請求の範囲第３５項記載の方法。
37. （３７）上記のＤＮＡ配列が、上記のコートたんぱく質
    をコードするｍＲＮＡが上記の植物中に存在するように
    発現される特許請求の範囲第２７項記載の植物。
38. （３８）上記のプロモーターがマンノピンシンターゼプ
    ロモーターである特許請求の範囲第１項記載の方法。
39. （３９）上記のプロモーターがマンノピンシンターゼプ
    ロモーターである特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ
    分子。
40. （４０）上記のＲＮＡ配列が上記の植物ウィルスのアン
    チセンスコートたんぱく質をコードする特許請求の範囲
    第１項記載の方法。