JP2000041512A - ウイルス感染に対する植物保護 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ウイルス病に耐性である植物を生
産する方法と、そのようなウイルス耐性の付与に用いる
遺伝物質と、その方法の産物を提供する。 【解決手段】 工学的に処理した植物が植物ウイルスに
対して耐性を示すように、植物のゲノムに、植物ウイル
スのゲノムの小部分を他のものと共に含むＤＮＡ構成物
を挿入することにより、植物を遺伝子工学的に処理す
る。
産する方法と、そのようなウイルス耐性の付与に用いる
遺伝物質と、その方法の産物を提供する。 【解決手段】 工学的に処理した植物が植物ウイルスに
対して耐性を示すように、植物のゲノムに、植物ウイル
スのゲノムの小部分を他のものと共に含むＤＮＡ構成物
を挿入することにより、植物を遺伝子工学的に処理す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルス病に耐性
である植物を生産する方法と、そのようなウイルス耐性
の付与に用いる遺伝物質と、その方法の産物とに関す
る。従って、本発明は、植物分子生物学、植物ウイルス
学および植物遺伝子工学の分野の応用を含んでいる。
である植物を生産する方法と、そのようなウイルス耐性
の付与に用いる遺伝物質と、その方法の産物とに関す
る。従って、本発明は、植物分子生物学、植物ウイルス
学および植物遺伝子工学の分野の応用を含んでいる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】植物に
おいてウイルス感染は、成長阻害、形態変化および収穫
減少などの種々の不利な効果の原因となる。更に、ウイ
ルス感染はしばしば植物を他の害虫や病原菌による損傷
に対してより影響され易くする。植物ウイルスについて
の一般的な知見は、文献（例えば、Matthews（1981）、
Lauffer（1981）およびKado & Agrawal（1972））に記
述されている。
おいてウイルス感染は、成長阻害、形態変化および収穫
減少などの種々の不利な効果の原因となる。更に、ウイ
ルス感染はしばしば植物を他の害虫や病原菌による損傷
に対してより影響され易くする。植物ウイルスについて
の一般的な知見は、文献（例えば、Matthews（1981）、
Lauffer（1981）およびKado & Agrawal（1972））に記
述されている。
【０００３】植物は、動物のように抗体が関与する免疫
系を持たない。しかし、植物は病原菌による感染に抵抗
するために、幾つかの方法を発達させてきた。例えば、
ある型の植物は、侵入する真菌の表面の糖部分に結合し
て真菌を不動化するレクチンを産生する。更に、ある型
の植物は、明らかに、細菌、昆虫、それに多分ウイルス
による攻撃に応答して植物中を循環する種々の分子を産
生する。
系を持たない。しかし、植物は病原菌による感染に抵抗
するために、幾つかの方法を発達させてきた。例えば、
ある型の植物は、侵入する真菌の表面の糖部分に結合し
て真菌を不動化するレクチンを産生する。更に、ある型
の植物は、明らかに、細菌、昆虫、それに多分ウイルス
による攻撃に応答して植物中を循環する種々の分子を産
生する。
【０００４】ある型の植物では、幼若な植物に「減衰さ
せた（attenuated）」ウイルス株、つまり、重大な症状
を起こさないウイルス株を感染させることによって、あ
る程度のウイルス耐性を誘導することができる（例え
ば、Rast（1972）およびCosta（1980）を参照）。この
方法には次のような幾つかの限界がある。つまり、
（1）一定の型の農作物（crop）中でのみ都合良く行う
ことができる。（2）一定の型のウイルスに対してのみ
行うことができる。（3）感染ウイルスの適切な減衰株
が同定されているかまたは単離されている場合にのみ、
行うことができる。（4）この方法によって与えられる
保護は、限られた数の種々のウイルスに対してのみ効果
があり得る。（5）減衰感染は第２の関連の無いウイル
スによる感染を、相乗効果によって更に深刻に悪化する
可能性がある。
せた（attenuated）」ウイルス株、つまり、重大な症状
を起こさないウイルス株を感染させることによって、あ
る程度のウイルス耐性を誘導することができる（例え
ば、Rast（1972）およびCosta（1980）を参照）。この
方法には次のような幾つかの限界がある。つまり、
（1）一定の型の農作物（crop）中でのみ都合良く行う
ことができる。（2）一定の型のウイルスに対してのみ
行うことができる。（3）感染ウイルスの適切な減衰株
が同定されているかまたは単離されている場合にのみ、
行うことができる。（4）この方法によって与えられる
保護は、限られた数の種々のウイルスに対してのみ効果
があり得る。（5）減衰感染は第２の関連の無いウイル
スによる感染を、相乗効果によって更に深刻に悪化する
可能性がある。
【０００５】それで、上述した問題が解決されていて、
しかも、減衰ウイルスの同定、単離および使用を必要と
しないようなウイルス感染から植物を保護する方法が必
要とされている。また、天然の遺伝的耐性または交叉免
疫（cross−protection）耐性が利用できないときにウ
イルス耐性を与える必要がある。
しかも、減衰ウイルスの同定、単離および使用を必要と
しないようなウイルス感染から植物を保護する方法が必
要とされている。また、天然の遺伝的耐性または交叉免
疫（cross−protection）耐性が利用できないときにウ
イルス耐性を与える必要がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の目的
は、減衰ウイルスの使用、耐性を与える遺伝的決定基の
存在、または、交叉免疫の利用可能性のいずれにも依存
しないウイルス耐性植物を生産する方法を提供すること
である。
は、減衰ウイルスの使用、耐性を与える遺伝的決定基の
存在、または、交叉免疫の利用可能性のいずれにも依存
しないウイルス耐性植物を生産する方法を提供すること
である。
【０００７】また、本発明の目的は、工学的に処理した
植物が植物ウイルスに対して耐性を示すように、植物の
ゲノムに、植物ウイルスのゲノムの小部分を他のものと
共に含むＤＮＡ構成物（construct）を挿入することに
より、植物を遺伝子工学的に処理する方法を提供するこ
とである。
植物が植物ウイルスに対して耐性を示すように、植物の
ゲノムに、植物ウイルスのゲノムの小部分を他のものと
共に含むＤＮＡ構成物（construct）を挿入することに
より、植物を遺伝子工学的に処理する方法を提供するこ
とである。
【０００８】また、本発明の他の目的は、遺伝的に形質
転換されたウイルス耐性植物の生産に使用できる組換体
ＤＮＡ分子を提供することである。
転換されたウイルス耐性植物の生産に使用できる組換体
ＤＮＡ分子を提供することである。
【０００９】更に、本究明の他の目的は、植物ウイルス
のＲＮＡ配列の生産を起こすＤＮＡ配列の存在をそれぞ
れ特徴とする、遺伝的に形質転換された細胞および分化
植物を提供することである。
のＲＮＡ配列の生産を起こすＤＮＡ配列の存在をそれぞ
れ特徴とする、遺伝的に形質転換された細胞および分化
植物を提供することである。
【００１０】上述の目的を達成する中で、本発明の一つ
の観点として、植物ウイルスによる感染に耐性である遺
伝的に形質転換された植物を生産する方法が提供され
た。この方法は次の工程を包含する。 （a） 植物細胞のゲノムに、（ｉ） 植物細胞中で機
能して、植物ウイルスのＲＮＡ配列の生産を起こすプロ
モーターと、（ii） 植物ウイルスから誘導したＤＮＡ
配列であって、植物ウイルスのＲＮＡ配列の生産を起こ
すＤＮＡ配列と、（iii） 植物細胞中で機能して、Ｒ
ＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの
付加を起こす３′非翻訳（non−translated）ＤＮＡ配
列とを包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子を、挿入する工
程。 （b） 形質転換された植物細胞を得る工程。 （c） 形質転換された植物細胞から、植物ウイルスに
よる感染に対する耐性が増した遺伝的に形質転換した植
物を再生する工程。一つの好ましい具体例では、植物ウ
イルスのＲＮＡ配列はそのウイルスのコートたんぱく質
をコードする。
の観点として、植物ウイルスによる感染に耐性である遺
伝的に形質転換された植物を生産する方法が提供され
た。この方法は次の工程を包含する。 （a） 植物細胞のゲノムに、（ｉ） 植物細胞中で機
能して、植物ウイルスのＲＮＡ配列の生産を起こすプロ
モーターと、（ii） 植物ウイルスから誘導したＤＮＡ
配列であって、植物ウイルスのＲＮＡ配列の生産を起こ
すＤＮＡ配列と、（iii） 植物細胞中で機能して、Ｒ
ＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの
付加を起こす３′非翻訳（non−translated）ＤＮＡ配
列とを包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子を、挿入する工
程。 （b） 形質転換された植物細胞を得る工程。 （c） 形質転換された植物細胞から、植物ウイルスに
よる感染に対する耐性が増した遺伝的に形質転換した植
物を再生する工程。一つの好ましい具体例では、植物ウ
イルスのＲＮＡ配列はそのウイルスのコートたんぱく質
をコードする。
【００１１】本発明の他の観点として、配列中に次のも
のを包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子が提供された。 （a） 植物細胞中で機能して、植物ウイルスのＲＮＡ
配列の生産を起こすプロモーター、（b） 植物ウイル
スから誘導されたＤＮＡ配列であって、植物ウイルスの
コートたんぱく質をコードするＲＮＡ配列の生産を起こ
すＤＮＡ配列、および、（c） 植物細胞中で機能し
て、ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオ
チドの付加を起こす３′非翻訳領域。
のを包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子が提供された。 （a） 植物細胞中で機能して、植物ウイルスのＲＮＡ
配列の生産を起こすプロモーター、（b） 植物ウイル
スから誘導されたＤＮＡ配列であって、植物ウイルスの
コートたんぱく質をコードするＲＮＡ配列の生産を起こ
すＤＮＡ配列、および、（c） 植物細胞中で機能し
て、ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオ
チドの付加を起こす３′非翻訳領域。
【００１２】また、本発明の他の観点として、上述の
（a）、（b）および（c）の要素を包含するＤＮＡを、
それぞれ含む細菌細胞および形質転換された植物細胞が
提供された。
（a）、（b）および（c）の要素を包含するＤＮＡを、
それぞれ含む細菌細胞および形質転換された植物細胞が
提供された。
【００１３】更に、本発明の他の観点として、上述のよ
うに形質転換された植物細胞を包含し、植物ウイルスに
対して耐性を示す分化した植物が提供された。また、本
発明の他の観点として、そのような植物を栽培するこ
と、外植片（explants）、挿木およびサッド（suds）な
どの胎芽（むかご、propagules）を用いてそのような植
物を繁殖させること、または、この植物を他の植物と交
雑（cross）させて同じくこの植物ウイルスに対して耐
性を示す後代（progeny）を生産することを伴う方法を
提供する。
うに形質転換された植物細胞を包含し、植物ウイルスに
対して耐性を示す分化した植物が提供された。また、本
発明の他の観点として、そのような植物を栽培するこ
と、外植片（explants）、挿木およびサッド（suds）な
どの胎芽（むかご、propagules）を用いてそのような植
物を繁殖させること、または、この植物を他の植物と交
雑（cross）させて同じくこの植物ウイルスに対して耐
性を示す後代（progeny）を生産することを伴う方法を
提供する。
【００１４】本発明の他の目的、特質および利点は、本
明細書の以下の説明から明らかとなるだろう。しかし、
本明細書中の詳しい説明および特定の具体例は、本発明
の好ましい具体例を示してはいるが、説明のためだけの
ものであり、本発明の技術的範囲を定めるものではな
い。本発明の技術的範囲内で成される種々の変形および
修正は、この詳細な説明から当業者には明らかであろ
う。
明細書の以下の説明から明らかとなるだろう。しかし、
本明細書中の詳しい説明および特定の具体例は、本発明
の好ましい具体例を示してはいるが、説明のためだけの
ものであり、本発明の技術的範囲を定めるものではな
い。本発明の技術的範囲内で成される種々の変形および
修正は、この詳細な説明から当業者には明らかであろ
う。
【００１５】図面の説明 図１はトランスジェニック植物におけるウイルス病耐性
の生物試験の概略を示す。
の生物試験の概略を示す。
【００１６】図２はダイス モザイク ウイルス コー
トたんぱく質（ＳＭＶ ＣＰ）の部分アミノ酸配列を示
す。
トたんぱく質（ＳＭＶ ＣＰ）の部分アミノ酸配列を示
す。
【００１７】図３は、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／
ＮＯＳ構成物を含む植物形質転換ベクター、ｐＭＯＮ３
１９を示す。このベクターは植物細胞に構成物を挿入す
るために使用した。
ＮＯＳ構成物を含む植物形質転換ベクター、ｐＭＯＮ３
１９を示す。このベクターは植物細胞に構成物を挿入す
るために使用した。
【００１８】図４は、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ I
IとＥｃｏ ＲＩに対する唯一の（unique）開裂部位を有
する合成マルチリンカーに隣接してＣａＭＶ３５Ｓ プ
ロモーターを含む発現ベクター、ｐＭＯＮ３１６を示
す。このマルチリンカーの後には、ノパリン シンター
ゼ遺伝子アデニル化シグナルをコードする260塩基対の
断片が続いている。
IとＥｃｏ ＲＩに対する唯一の（unique）開裂部位を有
する合成マルチリンカーに隣接してＣａＭＶ３５Ｓ プ
ロモーターを含む発現ベクター、ｐＭＯＮ３１６を示
す。このマルチリンカーの後には、ノパリン シンター
ゼ遺伝子アデニル化シグナルをコードする260塩基対の
断片が続いている。
【００１９】図５は、図４に示したＣａＭＶ３５Ｓ プ
ロモーター、マルチリンカーおよびノパリン シンター
ゼ断片の完全配列を示している。
ロモーター、マルチリンカーおよびノパリン シンター
ゼ断片の完全配列を示している。
【００２０】図６および図７は、本発明によってそれぞ
れ生産したトランスジェニックなタバコ植物とトマト植
物に対する異なる水準のウイルス接触（exposure）の効
果を含む例３（Ａ）と３（Ｂ）に記述した実験からのデ
ータを、それぞれ示している。
れ生産したトランスジェニックなタバコ植物とトマト植
物に対する異なる水準のウイルス接触（exposure）の効
果を含む例３（Ａ）と３（Ｂ）に記述した実験からのデ
ータを、それぞれ示している。
【００２１】図８は、遺伝的に耐性な系のトマト植物
と、本発明によって生産したトランスジェニック植物の
間のウイルス耐性の比較を含む例３（Ｃ）に記述した実
験からのデータを示している。 図９は、タバコ モザ
イク ウイルスの種々の株に対して効果的である、本発
明に従ったトマト植物中への交叉免疫の導入を含む例４
に記述した実験からのデータを示す。
と、本発明によって生産したトランスジェニック植物の
間のウイルス耐性の比較を含む例３（Ｃ）に記述した実
験からのデータを示している。 図９は、タバコ モザ
イク ウイルスの種々の株に対して効果的である、本発
明に従ったトマト植物中への交叉免疫の導入を含む例４
に記述した実験からのデータを示す。
【００２２】図１０は、例５で使用したペチュニア由来
のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの最初の単離と中
間体ベクターヘの導入を示している。
のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの最初の単離と中
間体ベクターヘの導入を示している。
【００２３】図１１は、例５で使用したペチュニア由来
のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの部分ヌクレオチ
ド配列を示している。
のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの部分ヌクレオチ
ド配列を示している。
【００２４】図１２は、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター
をペチュニアのｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーターに置換
したＤＮＡ構成物の生産の概略を示す。
をペチュニアのｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーターに置換
したＤＮＡ構成物の生産の概略を示す。
【００２５】図１３は、アルファルファ モザイク ウ
イルスのコートたんぱく質（ＡＭＶＣＰ）をコードする
ｃＤＮＡを製造するために使用した方法を示す。
イルスのコートたんぱく質（ＡＭＶＣＰ）をコードする
ｃＤＮＡを製造するために使用した方法を示す。
【００２６】図１４は、ポテト ウイルス Ｘのコート
たんぱく質遺伝子（ＰＶＸ ＣＰ）を含む植物ベクター
を製造するために使用した方法を示す。
たんぱく質遺伝子（ＰＶＸ ＣＰ）を含む植物ベクター
を製造するために使用した方法を示す。
【００２７】図１５は、ＰＶＸ ＣＰ遺伝子のヌクレオ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【００２８】図１６は、トマト ゴールデン モザイク
ウイルス コートたんぱく質（TGMV ＣＰ）をコード
するヌクレオチド断片を単離するための工程を示す。
ウイルス コートたんぱく質（TGMV ＣＰ）をコード
するヌクレオチド断片を単離するための工程を示す。
【００２９】図１７は、ＴＭＶ ＲＮＡに対するアンチ
センス相補体をコードするＤＮＡを含む植物ベクターを
生産するために例９で使用した工程の概略を示す。
センス相補体をコードするＤＮＡを含む植物ベクターを
生産するために例９で使用した工程の概略を示す。
【００３０】
【発明の実施の形態】本発明は、植物細胞中で機能し、
ウイルス耐性を生じるＤＮＡ構成物の製造を含む。以下
に詳細に説明するように、「ウイルス耐性」という語
は、ここでは、一つまたはそれ以上の型の植物ウイルス
に抵抗する植物の能力を意味している。
ウイルス耐性を生じるＤＮＡ構成物の製造を含む。以下
に詳細に説明するように、「ウイルス耐性」という語
は、ここでは、一つまたはそれ以上の型の植物ウイルス
に抵抗する植物の能力を意味している。
【００３１】多数の植物ウイルスが世界的に重大な農作
物の損失を引起こしている。本発明は、植物ウイルスに
感染され易い植物を保護する方法を提供する。そのよう
なウイルスには、例えば、ダイス モザイク ウイル
ス、ビーン ポッド モトル（bean pod mottle） ウ
イルス、タバコ リング スポット ウイルス、バーレ
イ イエロー ドゥワーフ（barley yellow dwarf）
ウイルス、コムギ スピンドル ストリーク（spindle
streak） ウイルス、ソイル ボーン（soil born）
モザイク ウイルス、コムギ ストリーク ウイルス
イン メイズ（inmaize）、メイズ ドゥワーフ モザ
イク ウイルス、メイズ クロロティック（chloroti
c） ドゥワーフ ウイルス、キューリ（cucumber）
モザイク ウイルス、タバコ モザイク ウイルス、ア
ルファルファ モザイク ウイルス、ポテト ウイルス
Ｘ、ポテト ウイルス Ｙ、ポテト リーフロール
（leafroll） ウイルス、トマト ゴールデン モザイ
ク ウイルスがある。これらの中で、メイズ ドゥワー
フ モザイク ウイルス、バーレイ イエロー ドゥワ
ーフ ウイルス、コムギ ストリーク モザイク ウイ
ルス、ソイル ボーン モザイク ウイルス、ポテト
リーフロール ウイルスおよびキューリ モザイクウイ
ルスに対する保護が特に重要である。 本発明の実施に
よりウイルス耐性となる植物には、ジャガイモ、トマ
ト、コショウ、タバコ、ダイズ、コムギ、コーン、シト
ラス（citrus）、スカッシュ（squash）、キューリおよ
びビート（beet）などがある。しかし、これらに限られ
るわけではない。
物の損失を引起こしている。本発明は、植物ウイルスに
感染され易い植物を保護する方法を提供する。そのよう
なウイルスには、例えば、ダイス モザイク ウイル
ス、ビーン ポッド モトル（bean pod mottle） ウ
イルス、タバコ リング スポット ウイルス、バーレ
イ イエロー ドゥワーフ（barley yellow dwarf）
ウイルス、コムギ スピンドル ストリーク（spindle
streak） ウイルス、ソイル ボーン（soil born）
モザイク ウイルス、コムギ ストリーク ウイルス
イン メイズ（inmaize）、メイズ ドゥワーフ モザ
イク ウイルス、メイズ クロロティック（chloroti
c） ドゥワーフ ウイルス、キューリ（cucumber）
モザイク ウイルス、タバコ モザイク ウイルス、ア
ルファルファ モザイク ウイルス、ポテト ウイルス
Ｘ、ポテト ウイルス Ｙ、ポテト リーフロール
（leafroll） ウイルス、トマト ゴールデン モザイ
ク ウイルスがある。これらの中で、メイズ ドゥワー
フ モザイク ウイルス、バーレイ イエロー ドゥワ
ーフ ウイルス、コムギ ストリーク モザイク ウイ
ルス、ソイル ボーン モザイク ウイルス、ポテト
リーフロール ウイルスおよびキューリ モザイクウイ
ルスに対する保護が特に重要である。 本発明の実施に
よりウイルス耐性となる植物には、ジャガイモ、トマ
ト、コショウ、タバコ、ダイズ、コムギ、コーン、シト
ラス（citrus）、スカッシュ（squash）、キューリおよ
びビート（beet）などがある。しかし、これらに限られ
るわけではない。
【００３２】２本鎖ＤＮＡ中に存在する植物遺伝子の発
現（expression）は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤ
ＮＡの一つの鎖からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）の転写と、核の中でのｍＲＮＡ一次転写体のその後
のプロセッシングを含んでいる。このプロセッシング
は、ウイルスＲＮＡの３′末端にポリアデニル化 ヌク
レオチドを付加する３′非翻訳領域を含んでいる。
現（expression）は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤ
ＮＡの一つの鎖からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）の転写と、核の中でのｍＲＮＡ一次転写体のその後
のプロセッシングを含んでいる。このプロセッシング
は、ウイルスＲＮＡの３′末端にポリアデニル化 ヌク
レオチドを付加する３′非翻訳領域を含んでいる。
【００３３】ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、普通「プロ
モーター」と称されるＤＮＡ領域によって制御されてい
る。プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼに対してＤ
ＮＡと会合し、更に、ＤＮＡ鎖の一つを鋳型（templet
e）として使用してｍＲＮＡの転写を始め、対応するＲ
ＮＡ鎖をつくように合図する配列を含む。 植物細胞中
で活性な多数のプロモーターが文献に記載されてきた。
これらには、例えば、ノパリン シンターゼ（nopalin
synthase）（ＮＯＳ）とオクトピン（octopine）シンタ
ーゼ（ＯＣＳ） プロモーター（これらは、アグロバク
テリウム タメファシエンス（Agrobacterium tumefaci
ens）の腫瘍誘導プラスミドに保有されている）、カリ
フラワー モザイク ウイルス（ＣａＭＶ） １９Ｓお
よび３５Ｓ プロモーター、リブロース２リン酸 カル
ボキシル化酵素の小サブユニット(ｓｓＲＵＢＩＳＣ
Ｏ、非常に豊富な植物ポリペプチド）からの光誘導プロ
モーター、および、ヒドロキシプロリンに富む糖たんぱ
く質をコードする遺伝子のプロモーターなどがある。こ
れらのプロモーターの全てが、植物中で発現される種々
の型のＤＮＡ構成物をつくるために使用された（ＰＣＴ
公報 ＷＯ 84／02913（Rogers et al., Monsanto）を
参照）。
モーター」と称されるＤＮＡ領域によって制御されてい
る。プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼに対してＤ
ＮＡと会合し、更に、ＤＮＡ鎖の一つを鋳型（templet
e）として使用してｍＲＮＡの転写を始め、対応するＲ
ＮＡ鎖をつくように合図する配列を含む。 植物細胞中
で活性な多数のプロモーターが文献に記載されてきた。
これらには、例えば、ノパリン シンターゼ（nopalin
synthase）（ＮＯＳ）とオクトピン（octopine）シンタ
ーゼ（ＯＣＳ） プロモーター（これらは、アグロバク
テリウム タメファシエンス（Agrobacterium tumefaci
ens）の腫瘍誘導プラスミドに保有されている）、カリ
フラワー モザイク ウイルス（ＣａＭＶ） １９Ｓお
よび３５Ｓ プロモーター、リブロース２リン酸 カル
ボキシル化酵素の小サブユニット(ｓｓＲＵＢＩＳＣ
Ｏ、非常に豊富な植物ポリペプチド）からの光誘導プロ
モーター、および、ヒドロキシプロリンに富む糖たんぱ
く質をコードする遺伝子のプロモーターなどがある。こ
れらのプロモーターの全てが、植物中で発現される種々
の型のＤＮＡ構成物をつくるために使用された（ＰＣＴ
公報 ＷＯ 84／02913（Rogers et al., Monsanto）を
参照）。
【００３４】植物細胞中でウイルスＲＮＡの転写を起こ
すことが知られているあるいは見出されているプロモー
ターを、本発明で使用することができる。そのようなプ
ロモーターは植物またはウイルスから得ることができ、
例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＳＳＲＵＢＩＳ
ＣＯ遺伝子などの植物遺伝子から単離されたプロモータ
ーがある。しかし、これらに限定されるわけではない。
後述するように、好ましくは、選んだ特定のプロモータ
ーは、植物を実質的にウイルス感染に対して耐性にする
有効量のコートたんぱく質の生産をもたらすための十分
な発現を引起こすことができなければならない。耐性を
誘導するために必要なコートたんぱく質の量は、植物お
よび／または保護の目標となるウイルスの型に応じて変
化する。従って、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターが好ま
しい。しかし、このプロモーターが本発明の全ての具体
例で最適なプロモーターであるとは限らない。
すことが知られているあるいは見出されているプロモー
ターを、本発明で使用することができる。そのようなプ
ロモーターは植物またはウイルスから得ることができ、
例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＳＳＲＵＢＩＳ
ＣＯ遺伝子などの植物遺伝子から単離されたプロモータ
ーがある。しかし、これらに限定されるわけではない。
後述するように、好ましくは、選んだ特定のプロモータ
ーは、植物を実質的にウイルス感染に対して耐性にする
有効量のコートたんぱく質の生産をもたらすための十分
な発現を引起こすことができなければならない。耐性を
誘導するために必要なコートたんぱく質の量は、植物お
よび／または保護の目標となるウイルスの型に応じて変
化する。従って、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターが好ま
しい。しかし、このプロモーターが本発明の全ての具体
例で最適なプロモーターであるとは限らない。
【００３５】本発明のＤＮＡ構成物中で用いられるプロ
モーターは、必要ならば、修飾してその制御特性を変化
させることができる。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモ
ーターを、光のないところでｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発現
を抑制するＳＳＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の一部分に連結さ
せ、葉では活性であるが根では活性でないプロモーター
をつくることができる。生成のキメラ プロモーターを
ここに示すように使用することができる。ここでの説明
では、「ＣａＭＶ３５Ｓ」の語は、例えば、オペレータ
ー領域との連結、無作為のまたは制御を伴った突然変異
生成（mutagenesis）によって誘導されたプロモーター
などの、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターの変形も含む。
モーターは、必要ならば、修飾してその制御特性を変化
させることができる。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモ
ーターを、光のないところでｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発現
を抑制するＳＳＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の一部分に連結さ
せ、葉では活性であるが根では活性でないプロモーター
をつくることができる。生成のキメラ プロモーターを
ここに示すように使用することができる。ここでの説明
では、「ＣａＭＶ３５Ｓ」の語は、例えば、オペレータ
ー領域との連結、無作為のまたは制御を伴った突然変異
生成（mutagenesis）によって誘導されたプロモーター
などの、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターの変形も含む。
【００３６】本発明のＤＮＡ構成物は、２本鎖ＤＮＡ形
の中にウイルスのコートたんぱく質をコードするウイル
ス ゲノムの一部分を含むことが好ましい。多くの型の
植物ウイルスはＤＮＡではなくＲＮＡを含んでいるが、
１本鎖または２本鎖のＤＮＡを含むものもある。ＲＮＡ
を含むウイルスは、標準の転写プロモーターおよび／ま
たは３′制御配列を含まない。この場合には、ポリペプ
チドまたはたんぱく質は、ウイルスに保有されるＲＮＡ
鎖またはその相補体（complement）から直接翻訳され
る。コートたんぱく質をコードしているウイルス ゲノ
ムの部分は、当業者によく知られている幾つかの方法の
いずれかによって決定できる（後述の例１を参照）。
の中にウイルスのコートたんぱく質をコードするウイル
ス ゲノムの一部分を含むことが好ましい。多くの型の
植物ウイルスはＤＮＡではなくＲＮＡを含んでいるが、
１本鎖または２本鎖のＤＮＡを含むものもある。ＲＮＡ
を含むウイルスは、標準の転写プロモーターおよび／ま
たは３′制御配列を含まない。この場合には、ポリペプ
チドまたはたんぱく質は、ウイルスに保有されるＲＮＡ
鎖またはその相補体（complement）から直接翻訳され
る。コートたんぱく質をコードしているウイルス ゲノ
ムの部分は、当業者によく知られている幾つかの方法の
いずれかによって決定できる（後述の例１を参照）。
【００３７】例えば、ある場合には、コートたんぱく質
をシークエンシング（sequencing）し、ウイルスのコー
トたんぱく質をコードするＤＮＡ配列の合成を選択する
ことができる。その代わりに、コートたんぱく質をコー
ドするウイルスからのＲＮＡを同定し、生成することも
できる。ＲＮＡを含む植物ウイルスの大部分では、コー
トたんぱく質遺伝子はウイルスＲＮＡの３′末端に位置
している。ある場合には、コートたんぱく質遺伝子は、
その配列がウイルスのコートたんぱく質のアミノ酸配列
を反映しているオリゴヌクレオチド プローブを用いて
位置を定めることができる。ウイルスがＲＮＡを保有し
ている場合には、ＤＮＡコード配列は逆転写酵素を用い
て相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成することによって得
られる。上述したように、多くの型の植物ウイルスはＲ
ＮＡを含んでいる。これらには、例えば、タバコ モザ
イク ウイルス、トマト スポッティド（spotted）
ウィルト（wilt） ウイルス、キューリ モザイク ウ
イルス、アルファルファモザイク ウイルス、ポテト
ウイルス Ｘなどのポテックスウイルス（potexviruse
s）、ポテト ウイルス Ｙなどのポティウイルス（pot
yviruses）、ポテト リーフロール ウイルスなどがあ
る。
をシークエンシング（sequencing）し、ウイルスのコー
トたんぱく質をコードするＤＮＡ配列の合成を選択する
ことができる。その代わりに、コートたんぱく質をコー
ドするウイルスからのＲＮＡを同定し、生成することも
できる。ＲＮＡを含む植物ウイルスの大部分では、コー
トたんぱく質遺伝子はウイルスＲＮＡの３′末端に位置
している。ある場合には、コートたんぱく質遺伝子は、
その配列がウイルスのコートたんぱく質のアミノ酸配列
を反映しているオリゴヌクレオチド プローブを用いて
位置を定めることができる。ウイルスがＲＮＡを保有し
ている場合には、ＤＮＡコード配列は逆転写酵素を用い
て相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成することによって得
られる。上述したように、多くの型の植物ウイルスはＲ
ＮＡを含んでいる。これらには、例えば、タバコ モザ
イク ウイルス、トマト スポッティド（spotted）
ウィルト（wilt） ウイルス、キューリ モザイク ウ
イルス、アルファルファモザイク ウイルス、ポテト
ウイルス Ｘなどのポテックスウイルス（potexviruse
s）、ポテト ウイルス Ｙなどのポティウイルス（pot
yviruses）、ポテト リーフロール ウイルスなどがあ
る。
【００３８】ポティウイルスなどの一定のウイルスの場
合には、コートたんぱく質は、プロセッシングを受けて
コートたんぱく質を放出するポリプロティンの一部であ
る。当業者は、次の例１に詳述するように、コートたん
ぱく質をコードするウイルスゲノムの領域を単離し、翻
訳開始シグナルを導入するためには、これらのことを考
慮しなければならない。
合には、コートたんぱく質は、プロセッシングを受けて
コートたんぱく質を放出するポリプロティンの一部であ
る。当業者は、次の例１に詳述するように、コートたん
ぱく質をコードするウイルスゲノムの領域を単離し、翻
訳開始シグナルを導入するためには、これらのことを考
慮しなければならない。
【００３９】それほど好ましくはないが、ウイルスＲＮ
Ａ配列の生産を起こす本発明のＤＮＡ構成物で用いられ
る配列はアンチセンス（anti−sense）の配置をとるこ
とができる。例えば、ＤＮＡの転写によって生産される
ＲＮＡは、最終的には、天然のウイルス コートたんぱ
く質ｍＲＮＡの柏補的配列を持つＲＮＡ分子を生産する
ことができる。（アンチセンス配置が使用される場合
は、ＤＮＡ配列は、コートたんぱく質ｍＲＮＡの５′領
域に相補的なアンチセンスＲＮＡをつくるために短くな
ると、信じられている。）その代わりに、アンチセンス
ＤＮＡはウイルスゲノムの他の断片から誘導できる。好
ましい領域には、試験管中でウイルスＲＮＡの翻訳を阻
害することが示されている（Beachy et al. (1985)）ウ
イルスＲＮＡの５′末端などがある。いずれの場合も、
アンチセンス転写体は安定性が低く、あるいは、宿主植
物中でのより高い水準での発現を必要とすると信じられ
ているので、この配置はあまり好ましくない。
Ａ配列の生産を起こす本発明のＤＮＡ構成物で用いられ
る配列はアンチセンス（anti−sense）の配置をとるこ
とができる。例えば、ＤＮＡの転写によって生産される
ＲＮＡは、最終的には、天然のウイルス コートたんぱ
く質ｍＲＮＡの柏補的配列を持つＲＮＡ分子を生産する
ことができる。（アンチセンス配置が使用される場合
は、ＤＮＡ配列は、コートたんぱく質ｍＲＮＡの５′領
域に相補的なアンチセンスＲＮＡをつくるために短くな
ると、信じられている。）その代わりに、アンチセンス
ＤＮＡはウイルスゲノムの他の断片から誘導できる。好
ましい領域には、試験管中でウイルスＲＮＡの翻訳を阻
害することが示されている（Beachy et al. (1985)）ウ
イルスＲＮＡの５′末端などがある。いずれの場合も、
アンチセンス転写体は安定性が低く、あるいは、宿主植
物中でのより高い水準での発現を必要とすると信じられ
ているので、この配置はあまり好ましくない。
【００４０】本発明のＤＮＡ構成物中で用いられるコー
ド配列は、必要ならば、当業者に既知の方法を使用し
て、無作為のまたは制御を伴った突然変異生成のいずれ
かにより修飾して突然変異体をつくることができる。そ
れで、そのような突然変異体（mutants）と変異体（var
ients）は本発明の範囲に含まれる。従って、「コート
たんぱく質」の語は、ここでは、トランケートされたた
んぱく質融合（fusion）たんぱく質、並びに、無修飾の
コートたんぱく質を含んでいる。
ド配列は、必要ならば、当業者に既知の方法を使用し
て、無作為のまたは制御を伴った突然変異生成のいずれ
かにより修飾して突然変異体をつくることができる。そ
れで、そのような突然変異体（mutants）と変異体（var
ients）は本発明の範囲に含まれる。従って、「コート
たんぱく質」の語は、ここでは、トランケートされたた
んぱく質融合（fusion）たんぱく質、並びに、無修飾の
コートたんぱく質を含んでいる。
【００４１】３′非翻訳領域は、植物中で機能してウイ
ルスＲＮＡの３′末端へのポリアデニル化 ヌクレオチ
ドの付加を起こすポリアデニル化シグナルを含む。適切
な３′領域は、例えば、（1）アグロバクテリウム（Agr
obacteriumu）のノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子
などの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子の、ポリアデ
ニル化シグナルを含む３′転写非翻訳領域、および、
（2）ダイズ貯蔵たんぱく質遺伝子およびＲｕＢＰカル
ボキシル化酵素遺伝子の小サブユニットなどの植物遺伝
子である。好ましい３′領域は、例えば、ＮＯＳ遺伝子
のものである。これについては後述の例に詳しく述べ
る。
ルスＲＮＡの３′末端へのポリアデニル化 ヌクレオチ
ドの付加を起こすポリアデニル化シグナルを含む。適切
な３′領域は、例えば、（1）アグロバクテリウム（Agr
obacteriumu）のノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子
などの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子の、ポリアデ
ニル化シグナルを含む３′転写非翻訳領域、および、
（2）ダイズ貯蔵たんぱく質遺伝子およびＲｕＢＰカル
ボキシル化酵素遺伝子の小サブユニットなどの植物遺伝
子である。好ましい３′領域は、例えば、ＮＯＳ遺伝子
のものである。これについては後述の例に詳しく述べ
る。
【００４２】本発明のＤＮＡ構成物によって生産される
ＲＮＡは、また、５′非翻訳のリーダー（leader）配列
を含む。この配列は、遺伝子を発現するために選んだプ
ロモーターから誘導できるし、また、ｍＲＮＡの翻訳を
増加させるために特別に修飾することができる。また、
５′非翻訳領域は、ウイルスＲＮＡから、適当な真核細
胞の遺伝子から、または、合成遺伝子配列から得ること
ができる。本発明は、後述の例に示すように、非翻訳領
域がプロモーター配列に伴う５′非翻訳配列、およびウ
イルス コートたんぱく質遺伝子の５′非翻訳領域の部
分の両者から誘導される構成物には限定されない。そう
ではなくて、非翻訳リーダー配列は、ウイルス コート
たんぱく質に対するコード配列の非翻訳領域の５′末端
の部分、または、プロモーター配列の部分であってよ
く、あるいは、関連のないプロモーター配列または上述
のようなコード配列から誘導できる。 本発明のＤＮＡ
構成物は任意の適当な方法によって植物のゲノムに挿入
できる。適当な植物形質転換ベクターには、例えば、ア
グロバクテリウム タメファシエンスのＴｉプラスミド
から誘導したもの、並びに、文献に開示されたものがあ
る（例えばHerrera−Estrella（1983）、Bevan（198
3）、Klee（1985）およびＥＰＯ公報第１２０５１６号
(Schilperoort et al.)）。アグロバクテリウムのＴｉ
または根誘導（Ｒｉ）プラスミドから誘導した植物形質
転換ベクターに加えて、本発明のＤＮＡ構成物を植物細
胞へ挿入する他の方法を用いることができる。そのよう
な方法には、例えば、リボゾームの使用、エレクトロポ
ーレーション（electroporation）、遊離ＤＮＡ取込み
を増加させる化学物質、および、ウイルスまたは花粉を
使用する形質転換などがある。
ＲＮＡは、また、５′非翻訳のリーダー（leader）配列
を含む。この配列は、遺伝子を発現するために選んだプ
ロモーターから誘導できるし、また、ｍＲＮＡの翻訳を
増加させるために特別に修飾することができる。また、
５′非翻訳領域は、ウイルスＲＮＡから、適当な真核細
胞の遺伝子から、または、合成遺伝子配列から得ること
ができる。本発明は、後述の例に示すように、非翻訳領
域がプロモーター配列に伴う５′非翻訳配列、およびウ
イルス コートたんぱく質遺伝子の５′非翻訳領域の部
分の両者から誘導される構成物には限定されない。そう
ではなくて、非翻訳リーダー配列は、ウイルス コート
たんぱく質に対するコード配列の非翻訳領域の５′末端
の部分、または、プロモーター配列の部分であってよ
く、あるいは、関連のないプロモーター配列または上述
のようなコード配列から誘導できる。 本発明のＤＮＡ
構成物は任意の適当な方法によって植物のゲノムに挿入
できる。適当な植物形質転換ベクターには、例えば、ア
グロバクテリウム タメファシエンスのＴｉプラスミド
から誘導したもの、並びに、文献に開示されたものがあ
る（例えばHerrera−Estrella（1983）、Bevan（198
3）、Klee（1985）およびＥＰＯ公報第１２０５１６号
(Schilperoort et al.)）。アグロバクテリウムのＴｉ
または根誘導（Ｒｉ）プラスミドから誘導した植物形質
転換ベクターに加えて、本発明のＤＮＡ構成物を植物細
胞へ挿入する他の方法を用いることができる。そのよう
な方法には、例えば、リボゾームの使用、エレクトロポ
ーレーション（electroporation）、遊離ＤＮＡ取込み
を増加させる化学物質、および、ウイルスまたは花粉を
使用する形質転換などがある。
【００４３】本発明の一つの具体例では、２本鎖ｃＤＮ
Ａはタバコ モザイク ウイルス（ＴＭＶ）のコートた
んぱく質をコードするＲＮＡ断片（ＣＰ−ｍＲＮＡ）か
ら製造される。このコード配列をＣａＭＶ３５Ｓ プロ
モーターおよびＮＯＳ ３′非翻訳領域に連結して、本
発明のＤＮＡ構成物を形成することができる。ＤＮＡ構
成物を、部分的にアグロバクテリウム タメファシエン
スのＴｉプラスミドから誘導した中間体プラスミドに挿
入して、プラスミドｐＭＯＮ３１９をつくる。それか
ら、ベクターを、弱めた（disarmed）Ｔｉプラスミドを
含む培養Ａ．タメファシエンスに挿入する。二つのプラ
スミドは、交叉（crossover event）によりコインテグ
レート（cointegrate） プラスミドを形成する。
Ａはタバコ モザイク ウイルス（ＴＭＶ）のコートた
んぱく質をコードするＲＮＡ断片（ＣＰ−ｍＲＮＡ）か
ら製造される。このコード配列をＣａＭＶ３５Ｓ プロ
モーターおよびＮＯＳ ３′非翻訳領域に連結して、本
発明のＤＮＡ構成物を形成することができる。ＤＮＡ構
成物を、部分的にアグロバクテリウム タメファシエン
スのＴｉプラスミドから誘導した中間体プラスミドに挿
入して、プラスミドｐＭＯＮ３１９をつくる。それか
ら、ベクターを、弱めた（disarmed）Ｔｉプラスミドを
含む培養Ａ．タメファシエンスに挿入する。二つのプラ
スミドは、交叉（crossover event）によりコインテグ
レート（cointegrate） プラスミドを形成する。
【００４４】コインテグレート プラスミドを含む細菌
細胞を、タバコ植物から誘導した細胞と共に培養し、形
質転換した植物細胞をカナマイシンを含む栄養培地を用
いて選抜する。それから、その細胞をカルス組織に培養
し、分化した植物に再生する。生成した本発明の植物
は、ウイルス耐性を与えるＤＮＡ構成物を含む。
細胞を、タバコ植物から誘導した細胞と共に培養し、形
質転換した植物細胞をカナマイシンを含む栄養培地を用
いて選抜する。それから、その細胞をカルス組織に培養
し、分化した植物に再生する。生成した本発明の植物
は、ウイルス耐性を与えるＤＮＡ構成物を含む。
【００４５】本発明の実施においては、特定のウイルス
に由来するＣＰコード配列を含むＤＮＡ構成物が持つ耐
性付与能力を、第１の例としてそのウイルスに対する全
身性の（systemic）宿主を用いて利用することが好まし
い。「全身性の」宿主植物中では、ウイルスは、複製
し、依然として非特定的な方法で接種部位（典型的に
は、葉上）から植物中を移動して、局部的でない全身的
な感染の症状を起こすことができる。（逆に、「非全身
的な」宿主は、壊疽性斑点の発達のような、接種部位の
周辺領域に制限された症状を示す。）特定のウイルスと
それに対して全身性である宿主とのペアリングは、植物
病理学ではよく認められている。例えば、多くのトマト
およびタバコの変種並びにアルファルファは、アルファ
ルファ モザイク ウイルス（ＡＭＶ）に対して全身性
である。また、キューリ モザイクウイルス（ＣｕＭ
Ｖ）は、トマト、タバコ、キューリおよび他のメロン作
物に全身性の感染を起こし、タバコ、トマトおよび多数
のランの変種は、ＴＭＶに対する全身性の宿主である。
一般的には文献を参照（ＩＮＤＥＸ ＯＦ ＰＬＡＮＴ
ＶＩＲＵＳ ＤＩＳＥＡＳＥＳ，Agriculture Handbook
No.307（ＡＲＳ−ＵＳＤＡ 1966）。 特に、本発明
によって製造されたＤＮＡ構成物は、ＲＮＡ配列の生産
を起こす構成物中のＤＮＡ配列を与える源として使用す
るウイルスに対して、全身性であるような植物から誘導
した植物細胞またはプロトプラストに、上に述べた適当
なベクターを介して導入される。ＤＮＡ配列がウイルス
のコートたんぱく質をコードしている場合には、このよ
うに修飾された植物物質は、例えば、ノーザン ブロッ
ティング（Northern blotting）によりＣＰ−ｍＲＮＡ
の存在を試験される。ＣＰ−ｍＲＮＡが検出されない
（または力価が低すぎる）場合には、ＣＰをコードする
断片を制御するために構成物中で使用されているプロモ
ーターを、より強力な可能性のある他のプロモーターと
置換えて、この変化した構成物を再び試験することがで
きる。
に由来するＣＰコード配列を含むＤＮＡ構成物が持つ耐
性付与能力を、第１の例としてそのウイルスに対する全
身性の（systemic）宿主を用いて利用することが好まし
い。「全身性の」宿主植物中では、ウイルスは、複製
し、依然として非特定的な方法で接種部位（典型的に
は、葉上）から植物中を移動して、局部的でない全身的
な感染の症状を起こすことができる。（逆に、「非全身
的な」宿主は、壊疽性斑点の発達のような、接種部位の
周辺領域に制限された症状を示す。）特定のウイルスと
それに対して全身性である宿主とのペアリングは、植物
病理学ではよく認められている。例えば、多くのトマト
およびタバコの変種並びにアルファルファは、アルファ
ルファ モザイク ウイルス（ＡＭＶ）に対して全身性
である。また、キューリ モザイクウイルス（ＣｕＭ
Ｖ）は、トマト、タバコ、キューリおよび他のメロン作
物に全身性の感染を起こし、タバコ、トマトおよび多数
のランの変種は、ＴＭＶに対する全身性の宿主である。
一般的には文献を参照（ＩＮＤＥＸ ＯＦ ＰＬＡＮＴ
ＶＩＲＵＳ ＤＩＳＥＡＳＥＳ，Agriculture Handbook
No.307（ＡＲＳ−ＵＳＤＡ 1966）。 特に、本発明
によって製造されたＤＮＡ構成物は、ＲＮＡ配列の生産
を起こす構成物中のＤＮＡ配列を与える源として使用す
るウイルスに対して、全身性であるような植物から誘導
した植物細胞またはプロトプラストに、上に述べた適当
なベクターを介して導入される。ＤＮＡ配列がウイルス
のコートたんぱく質をコードしている場合には、このよ
うに修飾された植物物質は、例えば、ノーザン ブロッ
ティング（Northern blotting）によりＣＰ−ｍＲＮＡ
の存在を試験される。ＣＰ−ｍＲＮＡが検出されない
（または力価が低すぎる）場合には、ＣＰをコードする
断片を制御するために構成物中で使用されているプロモ
ーターを、より強力な可能性のある他のプロモーターと
置換えて、この変化した構成物を再び試験することがで
きる。
【００４６】その代わりに、この監視を全体（whole）
の再生した植物に行うことができる。いずれの場合も、
ウイルスｍＲＮＡの適切な生産が行われたときには、形
質転換細胞（またはプロトプラスト）は全植物に再生さ
れ、後者（植物）をウイルスに対する耐性に関してスク
リーニングする。再生工程のための方法論の選択は重要
ではなく、マメ科（アルファルファ、ダイズ、クローバ
ーなど）、セリ科（ニンジン、セロリー、アメリカボウ
フウ）、アブラナ科（キャベツ、ハツカダイコン、ナタ
ネなど）、ウリ科（メロンとキューリ）、イネ科（コム
ギ、イネ、コーンなど）、ナス科（ジャガイモ、タバ
コ、トマト、コショウ）および種々の植物作物の宿主に
対する適当なプロトコルが利用できる。文献（例えば、
Ammirato et a1．（1984））を参照。上記の科のそれぞ
れの植物に、本発明によってウイルス耐性を与えること
ができる。
の再生した植物に行うことができる。いずれの場合も、
ウイルスｍＲＮＡの適切な生産が行われたときには、形
質転換細胞（またはプロトプラスト）は全植物に再生さ
れ、後者（植物）をウイルスに対する耐性に関してスク
リーニングする。再生工程のための方法論の選択は重要
ではなく、マメ科（アルファルファ、ダイズ、クローバ
ーなど）、セリ科（ニンジン、セロリー、アメリカボウ
フウ）、アブラナ科（キャベツ、ハツカダイコン、ナタ
ネなど）、ウリ科（メロンとキューリ）、イネ科（コム
ギ、イネ、コーンなど）、ナス科（ジャガイモ、タバ
コ、トマト、コショウ）および種々の植物作物の宿主に
対する適当なプロトコルが利用できる。文献（例えば、
Ammirato et a1．（1984））を参照。上記の科のそれぞ
れの植物に、本発明によってウイルス耐性を与えること
ができる。
【００４７】ウイルス耐性を試験される再生植物は、病
気の発達の速度が接種物中のウイルス濃度と線形に相関
する範囲の濃度で、ウイルスに接させることが好まし
い。この線形の範囲は、一定のウイルスと宿主種のベア
リングに関して、形質転換していない植物を用いて経験
的に決定することができる。 ウイルス接種の方法は当
業者にはよく知られており、文献（Kado & Agrawal (19
72)）にまとめられている。一つの方法は、カルボラン
ダム（carborundum）またはケイソウ土などの研磨剤と
ウイルスとを含む水性懸濁液（典型的にはpH 7〜8に緩
衝化する）を用いて、葉表面を研磨する工程を含む。こ
の方法での接種はその簡便さのために−般に好まれてい
るが、−定の植物ウイルスに対しては他の方法が好まし
い可能性があることは当業者には認められるだろう。例
えば、アフィドボーン（aphid−born） ポテト リー
フロール ウイルスは機械的な研磨によっては容易に接
種されないことが知られている。これは適当な昆虫ベク
ターを用いて移入される。一般的には文献（Thomas (19
83)）を参黙。
気の発達の速度が接種物中のウイルス濃度と線形に相関
する範囲の濃度で、ウイルスに接させることが好まし
い。この線形の範囲は、一定のウイルスと宿主種のベア
リングに関して、形質転換していない植物を用いて経験
的に決定することができる。 ウイルス接種の方法は当
業者にはよく知られており、文献（Kado & Agrawal (19
72)）にまとめられている。一つの方法は、カルボラン
ダム（carborundum）またはケイソウ土などの研磨剤と
ウイルスとを含む水性懸濁液（典型的にはpH 7〜8に緩
衝化する）を用いて、葉表面を研磨する工程を含む。こ
の方法での接種はその簡便さのために−般に好まれてい
るが、−定の植物ウイルスに対しては他の方法が好まし
い可能性があることは当業者には認められるだろう。例
えば、アフィドボーン（aphid−born） ポテト リー
フロール ウイルスは機械的な研磨によっては容易に接
種されないことが知られている。これは適当な昆虫ベク
ターを用いて移入される。一般的には文献（Thomas (19
83)）を参黙。
【００４８】再生物の後代に接種を行い、形質転換され
ていない植物、および／または、ウイルスＲＮＡ配列の
生産を起こすＤＮＡ配列を欠いている構成物を用いて形
質転換された植物である、同様に処理した対照と共に観
測し、例えば、症状の発生の時期について群の間の相違
に反映される比較耐性を測定する（図１参照）。例え
ば、本発明によるウイルス コートたんぱく質をコード
する配列を含む植物は、ウイルス感染の症状を示すとし
ても、対照の植物に比較して相当に長い期間の後にのみ
症状を示すことが見出された。トランスジェニック（tr
ansgenic）植物の間で観測された耐性は、ウイルスｍＲ
ＮＡまたはコートたんぱく質の測定された水準と相関し
ている。このように、ウイルス ゲノムの小部分の発現
は、ウイルス感染に対する耐性を与えることができるこ
とが見出された。
ていない植物、および／または、ウイルスＲＮＡ配列の
生産を起こすＤＮＡ配列を欠いている構成物を用いて形
質転換された植物である、同様に処理した対照と共に観
測し、例えば、症状の発生の時期について群の間の相違
に反映される比較耐性を測定する（図１参照）。例え
ば、本発明によるウイルス コートたんぱく質をコード
する配列を含む植物は、ウイルス感染の症状を示すとし
ても、対照の植物に比較して相当に長い期間の後にのみ
症状を示すことが見出された。トランスジェニック（tr
ansgenic）植物の間で観測された耐性は、ウイルスｍＲ
ＮＡまたはコートたんぱく質の測定された水準と相関し
ている。このように、ウイルス ゲノムの小部分の発現
は、ウイルス感染に対する耐性を与えることができるこ
とが見出された。
【００４９】ある場合には、ウイルスｍＲＮＡまたはコ
ートたんぱく質の発現は検出することができない。これ
は多分ｍＲＮＡまたはたんぱく質の不安定性のためと思
われる。しかし、ｍＲＮＡまたはたんぱく質を安定化す
る方法が当業者には知られている。例えば、安定なｍＲ
ＮＡの形成には、イントロンのスプライジングが重要な
役割を果たすことが知られている（Hamer & Leder (197
9)）。ウイルス コートたんぱく質遺伝子の発現は、イ
ントロンをコード配列または非コード配列に挿入するこ
とにより十分に高められる。更に、ｍＲＮＡの３′非翻
訳配列が、対応するｍＲＮＡの安定性を決定することが
知られている（Shaw & Kamen (1986)）。工学的に処理
したコートたんぱく質ｍＲＮＡの安定性は、その３′非
翻訳領域の交替によって十分に増加させることができ
る。最後に、幾つかのたんぱく質はたんぱく質分解の際
にその機能活性を保持することが知られている（Moore
(1981)、Sandmeier (1980)、Zurini (1984)）。
ートたんぱく質の発現は検出することができない。これ
は多分ｍＲＮＡまたはたんぱく質の不安定性のためと思
われる。しかし、ｍＲＮＡまたはたんぱく質を安定化す
る方法が当業者には知られている。例えば、安定なｍＲ
ＮＡの形成には、イントロンのスプライジングが重要な
役割を果たすことが知られている（Hamer & Leder (197
9)）。ウイルス コートたんぱく質遺伝子の発現は、イ
ントロンをコード配列または非コード配列に挿入するこ
とにより十分に高められる。更に、ｍＲＮＡの３′非翻
訳配列が、対応するｍＲＮＡの安定性を決定することが
知られている（Shaw & Kamen (1986)）。工学的に処理
したコートたんぱく質ｍＲＮＡの安定性は、その３′非
翻訳領域の交替によって十分に増加させることができ
る。最後に、幾つかのたんぱく質はたんぱく質分解の際
にその機能活性を保持することが知られている（Moore
(1981)、Sandmeier (1980)、Zurini (1984)）。
【００５０】本発明によって生産されたトランケートさ
れたコートたんぱく質は、トランスジェニック植物中に
高水準で発現されたときに、その生物活性を保持しウイ
ルス耐性を与えることができた。
れたコートたんぱく質は、トランスジェニック植物中に
高水準で発現されたときに、その生物活性を保持しウイ
ルス耐性を与えることができた。
【００５１】
【実施例】例１ 交叉免疫で使用するためのウイルス
コー卜たんぱく質の典型的な単離 ポティウイルスは、最も広範で経済的に重要な既知の植
物ウイルスの群を包含する。それで、一つのポティウイ
ルス、ダイス モザイク ウイルス（ＳＭＶ）を選び、
本発明に従ってウイルス病耐性（「交叉免疫」）を与え
るために使用することができるウイルス ゲノムの小部
分、コートたんぱく質をコードする配列を単離する一般
的な方法を説明した（図１参照）。
コー卜たんぱく質の典型的な単離 ポティウイルスは、最も広範で経済的に重要な既知の植
物ウイルスの群を包含する。それで、一つのポティウイ
ルス、ダイス モザイク ウイルス（ＳＭＶ）を選び、
本発明に従ってウイルス病耐性（「交叉免疫」）を与え
るために使用することができるウイルス ゲノムの小部
分、コートたんぱく質をコードする配列を単離する一般
的な方法を説明した（図１参照）。
【００５２】ＳＭＶを、ＳＭＶのＮ鎖を用いて感染され
たダイズ葉から精製した。文献（Vance & Beachy (198
4)）に開示されている方法に従って、ウイルスを単離
し、ウイルスＲＮＡを調製した。ＳＭＶに対する抗体は
定法によりウサギ中で産生させた。これは、１mgの精製
ＳＭＶをウサギに注射し、４週後に５０μｇのＳＭＶの
第２の注射を行い、更に２週後にＳＭＶ（５０μｇ）を
注射する工程を含んでいた。最後の追加抗原注射の後、
２週間隔でこの例で使用するために血清を集めた。
たダイズ葉から精製した。文献（Vance & Beachy (198
4)）に開示されている方法に従って、ウイルスを単離
し、ウイルスＲＮＡを調製した。ＳＭＶに対する抗体は
定法によりウサギ中で産生させた。これは、１mgの精製
ＳＭＶをウサギに注射し、４週後に５０μｇのＳＭＶの
第２の注射を行い、更に２週後にＳＭＶ（５０μｇ）を
注射する工程を含んでいた。最後の追加抗原注射の後、
２週間隔でこの例で使用するために血清を集めた。
【００５３】ウイルス コートたんぱく質遺伝子のｃＤ
ＮＡクローニングは、当業者によく知られている方法を
用いて行った。ｃＤＮＡは、まず、オリゴｄＴを用いて
ポリアデニル化されたＳＭＶ ＲＮＡをプライミング
し、それから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを生産する
ことにより、ウイルスＲＮＡから生産した。２本鎖ｃＤ
ＮＡを生産するために、第１の鎖ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイ
ブリッド分子をＲＮｓａｅ ＨとＤＮＡポリメラーゼＩ
を用いて処理した。それから、この分子をＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて処理し、その後、Ｅｃｏ ＲＩメチ
ラーゼにより処理した。この分子を、Ｅｃｏ ＲＩ部位
を含む合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在下でＴ４
ＤＮＡ リガーゼと反応させた。その後、この分子を
ＥｃｏＲＩを用いて消化し、プラスミドｐＥＭＢＬ 18
に連結した。このプラスミドは、ヨーロッパ分子生物学
研究所（P. O. Box 10−2209，6900 Heidelberg. Fede
ral Republic of Germany）で構築された広く利用され
ているクローニングベクターのクラスの一つである。ｐ
ＥＭＢＬ18 ＤＮＡに予め酵素Ｅｃｏ ＲＩを用いて制
限を行い、プラスミドの再アニーリングを防ぐためにリ
ン酸アルカリを用いて処理した。露出したＥｃｏ ＲＩ
部位を持つ２本鎖ｃＤＮＡを開いたプラスミドに連結し
た。これらの連結されたｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）ＤＨ５α株を形質転換するために使用した。
ＮＡクローニングは、当業者によく知られている方法を
用いて行った。ｃＤＮＡは、まず、オリゴｄＴを用いて
ポリアデニル化されたＳＭＶ ＲＮＡをプライミング
し、それから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを生産する
ことにより、ウイルスＲＮＡから生産した。２本鎖ｃＤ
ＮＡを生産するために、第１の鎖ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイ
ブリッド分子をＲＮｓａｅ ＨとＤＮＡポリメラーゼＩ
を用いて処理した。それから、この分子をＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて処理し、その後、Ｅｃｏ ＲＩメチ
ラーゼにより処理した。この分子を、Ｅｃｏ ＲＩ部位
を含む合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在下でＴ４
ＤＮＡ リガーゼと反応させた。その後、この分子を
ＥｃｏＲＩを用いて消化し、プラスミドｐＥＭＢＬ 18
に連結した。このプラスミドは、ヨーロッパ分子生物学
研究所（P. O. Box 10−2209，6900 Heidelberg. Fede
ral Republic of Germany）で構築された広く利用され
ているクローニングベクターのクラスの一つである。ｐ
ＥＭＢＬ18 ＤＮＡに予め酵素Ｅｃｏ ＲＩを用いて制
限を行い、プラスミドの再アニーリングを防ぐためにリ
ン酸アルカリを用いて処理した。露出したＥｃｏ ＲＩ
部位を持つ２本鎖ｃＤＮＡを開いたプラスミドに連結し
た。これらの連結されたｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）ＤＨ５α株を形質転換するために使用した。
【００５４】形質転換した細菌のコロニーを３２Ｐ標識
したｃＤＮＡを用いてスクリーニングし、３２Ｐ標識分
子と反応したコロニーを選んだ。抗原産生に対するスク
リーニングのために、ＩＰＴＧを使用してポジティブな
形質転換体を誘導し、予め産生させたウサギ抗コートた
んぱく質抗体を用い、抗体ブロット法を介して成長する
コロニーをスクリーニングした。（一定の適当な抗ＣＰ
抗体は市販もされている。例えば、American Type Cult
ure Collection in Rockville, Maryland。）抗体と反
応したそれらのコロニーを更にスクリーニングして選抜
し、それらが実際にコートたんぱく質：ｌａｃＺ融合た
んぱく質を生産することを確かめた。融合たんぱく質を
生成するコロニーから単離したプラスミドＤＮＡをプロ
ーブとして使用し、ｃＤＮＡを含む他のコロニーを同定
した。この方法は標準的なハイブリダイゼーション法
（Maniatis et al. (1982)）と一部重複している。
したｃＤＮＡを用いてスクリーニングし、３２Ｐ標識分
子と反応したコロニーを選んだ。抗原産生に対するスク
リーニングのために、ＩＰＴＧを使用してポジティブな
形質転換体を誘導し、予め産生させたウサギ抗コートた
んぱく質抗体を用い、抗体ブロット法を介して成長する
コロニーをスクリーニングした。（一定の適当な抗ＣＰ
抗体は市販もされている。例えば、American Type Cult
ure Collection in Rockville, Maryland。）抗体と反
応したそれらのコロニーを更にスクリーニングして選抜
し、それらが実際にコートたんぱく質：ｌａｃＺ融合た
んぱく質を生産することを確かめた。融合たんぱく質を
生成するコロニーから単離したプラスミドＤＮＡをプロ
ーブとして使用し、ｃＤＮＡを含む他のコロニーを同定
した。この方法は標準的なハイブリダイゼーション法
（Maniatis et al. (1982)）と一部重複している。
【００５５】クローンしたｃＤＮＡのＤＮＡ配列は標準
法によって決定した（図２参照）。ウイルスコートたん
ぱく質のアミノ酸シークエンシングを完成して、ＮＨ２
末端アミノ酸配列を決定することができる。ある場合に
はアミノ末端断片がブロックされている可能性があるの
で、ウイルス コートたんぱく質は、当業者に既知の方
法を応用し、ファースト アトム ボンバードメント
（fast atom bombardment）（ＦＡＢ）と質量分析計に
よりシークエンシングすることができる。それから、た
んぱく質のアミノ酸配列をクローン化ｃＤＮＡのシーク
エンシングにより誘導した配列と比較できる。これによ
ってウイルス コートたんぱく質をコードすると同定さ
れたｃＤＮＡ断片を、新たな制限部位とＡＴＧ翻訳開始
コドンを成熟コートたんぱく質のＮＨ２末端アミノ酸の
コドンの、５′末端に関して、すぐ隣に導入することに
より得ることができる。これはゾラーとスミスの方法
（Zoller & Smith (1982)）によって行うことができ
る。コートたんぱく質コード配列を切取るための制限酵
素消化の後、単離したＣＰコード配列を上に述べたよう
に、適用なプロモーターに連結し、本発明によってウイ
ルス耐性を与えるために植物中に置いた。
法によって決定した（図２参照）。ウイルスコートたん
ぱく質のアミノ酸シークエンシングを完成して、ＮＨ２
末端アミノ酸配列を決定することができる。ある場合に
はアミノ末端断片がブロックされている可能性があるの
で、ウイルス コートたんぱく質は、当業者に既知の方
法を応用し、ファースト アトム ボンバードメント
（fast atom bombardment）（ＦＡＢ）と質量分析計に
よりシークエンシングすることができる。それから、た
んぱく質のアミノ酸配列をクローン化ｃＤＮＡのシーク
エンシングにより誘導した配列と比較できる。これによ
ってウイルス コートたんぱく質をコードすると同定さ
れたｃＤＮＡ断片を、新たな制限部位とＡＴＧ翻訳開始
コドンを成熟コートたんぱく質のＮＨ２末端アミノ酸の
コドンの、５′末端に関して、すぐ隣に導入することに
より得ることができる。これはゾラーとスミスの方法
（Zoller & Smith (1982)）によって行うことができ
る。コートたんぱく質コード配列を切取るための制限酵
素消化の後、単離したＣＰコード配列を上に述べたよう
に、適用なプロモーターに連結し、本発明によってウイ
ルス耐性を与えるために植物中に置いた。
【００５６】例２ ウイルス コートたんぱく質遺伝子
（タバコ モザイク ウイルス）を含むトランスジェニ
ック植物におけるウイルス病耐性 この例では、ウイルス コートたんぱく質のヌクレオチ
ド配列が利用できる場合に本発明を実施する方法を説明
する。
（タバコ モザイク ウイルス）を含むトランスジェニ
ック植物におけるウイルス病耐性 この例では、ウイルス コートたんぱく質のヌクレオチ
ド配列が利用できる場合に本発明を実施する方法を説明
する。
【００５７】Ａ．プラスミド ｐＭＯＮ３１９の製造 文献（Bruening (1982)）に記述されるように、フェノ
ール抽出によってタバコ モザイク ウイルス（ＴＭ
Ｖ、普通のＵ１ バルガー（vulgare）株、配列は公表
されている（Goelet et al. (1982)））からＲＮＡを除
いた。ウイルスＲＮＡの３′末端に相補的であり、しか
も、Ｎｄｅ ＩとＢａｍ ＨＩ開裂部位を有する３５−ｍ
ｅｒ オリゴヌクレオチド プライマーを合成した。オ
リゴヌクレオチドをウイルス ＲＮＡに対してアニーリ
ングし、マニアチスの方法（Maniatis (1982)）に従っ
て、ｃＤＮＡの合成（逆転写酵素を用いる）のためのプ
ライマーとして用いた。１本鎖ＤＮＡをマニアチスの方
法（Maniatis (1982)）により２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに
変換した。
ール抽出によってタバコ モザイク ウイルス（ＴＭ
Ｖ、普通のＵ１ バルガー（vulgare）株、配列は公表
されている（Goelet et al. (1982)））からＲＮＡを除
いた。ウイルスＲＮＡの３′末端に相補的であり、しか
も、Ｎｄｅ ＩとＢａｍ ＨＩ開裂部位を有する３５−ｍ
ｅｒ オリゴヌクレオチド プライマーを合成した。オ
リゴヌクレオチドをウイルス ＲＮＡに対してアニーリ
ングし、マニアチスの方法（Maniatis (1982)）に従っ
て、ｃＤＮＡの合成（逆転写酵素を用いる）のためのプ
ライマーとして用いた。１本鎖ＤＮＡをマニアチスの方
法（Maniatis (1982)）により２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに
変換した。
【００５８】ｄｓ−ｃＤＮＡを、プライマー上の部位で
開裂するＢａｍ ＨＩ、および、ＴＭＶ配列の5080の塩
基で開裂するＨｉｎｄ IIIにより開裂した。生成した1.
3 kbの断片を、同じくＨｉｎｄ IIIとＢａｍ ＨＩを用
いて開裂したプラスミドｐＵＣ９ ＤＮＡと混合した。
生成のアンピシリン耐性プラスミドｐＴＭ ３７をその
後の操作に使用するコートたんぱく質コード配列ＤＮＡ
の源としたこれはＢａｍ ＨＩ部位に隣接してＥｃｏ Ｒ
Ｉ部位を有している。
開裂するＢａｍ ＨＩ、および、ＴＭＶ配列の5080の塩
基で開裂するＨｉｎｄ IIIにより開裂した。生成した1.
3 kbの断片を、同じくＨｉｎｄ IIIとＢａｍ ＨＩを用
いて開裂したプラスミドｐＵＣ９ ＤＮＡと混合した。
生成のアンピシリン耐性プラスミドｐＴＭ ３７をその
後の操作に使用するコートたんぱく質コード配列ＤＮＡ
の源としたこれはＢａｍ ＨＩ部位に隣接してＥｃｏ Ｒ
Ｉ部位を有している。
【００５９】コートたんぱく質コード配列を有するより
小さいＤＮＡ断片を得るために、プラスミド ｐＴＭ
３７を、ＴＭＶ配列の5707の塩基（コートたんぱく質ｍ
ＲＮＡに対するＡＴＧ翻訳開始コドンから５塩基対）で
開裂するＡｈａ III、および、pＴＭ ３７中のＴＭＶ配
列の末端をちょうど越えて開裂するＥｃｏ ＲＩを用い
て消化した。それから、生成した長さ約７００塩基対
（ｂｐ）の断片を、コートたんぱく質コード断片の５′
および３′末端に対する制限部位を付加するために、他
の二つのプラスミドに移してクローンした。これらの制
限部位の付加はその後のプラスミドの構築を容易にし
た。その代わりに、制限部位を付加するために、サイト
ダイレクティッド（site−directed）突然変異生成、
または、合成ＤＮＡリンカーの連結などの他の方法を選
択することもできる。これらの技術は全て従来技術の範
囲内にある。
小さいＤＮＡ断片を得るために、プラスミド ｐＴＭ
３７を、ＴＭＶ配列の5707の塩基（コートたんぱく質ｍ
ＲＮＡに対するＡＴＧ翻訳開始コドンから５塩基対）で
開裂するＡｈａ III、および、pＴＭ ３７中のＴＭＶ配
列の末端をちょうど越えて開裂するＥｃｏ ＲＩを用い
て消化した。それから、生成した長さ約７００塩基対
（ｂｐ）の断片を、コートたんぱく質コード断片の５′
および３′末端に対する制限部位を付加するために、他
の二つのプラスミドに移してクローンした。これらの制
限部位の付加はその後のプラスミドの構築を容易にし
た。その代わりに、制限部位を付加するために、サイト
ダイレクティッド（site−directed）突然変異生成、
または、合成ＤＮＡリンカーの連結などの他の方法を選
択することもできる。これらの技術は全て従来技術の範
囲内にある。
【００６０】Ｂｇｌ II部位で５′末端に接し、Ｅｃｏ
ＲＩ部位で３′末端に接する７００bpのコートたんぱく
質コード配列断片を、Ｂｇｌ IIとＥｃｏ ＲＩを用いる
消化によって中間体プラスミドから切取った。この７０
０bpの断片を精製し、同じくＢｇｌ IIとＥｃｏ ＲＩを
用いて消化したプラスミドｐＭＯＮ ３１６のＤＮＡと
混合した。プラスミドｐＭＯＮ ３１６は、３５Ｓ転写
体の生産を指示するカリフラワー モザイク ウイルス
（ＣａＭＶ）の３３０bp断片を保有するｐＭＯＮ２００
（Fraley et al (1985)）、Rogers et al (1985)）の誘
導体である。
ＲＩ部位で３′末端に接する７００bpのコートたんぱく
質コード配列断片を、Ｂｇｌ IIとＥｃｏ ＲＩを用いる
消化によって中間体プラスミドから切取った。この７０
０bpの断片を精製し、同じくＢｇｌ IIとＥｃｏ ＲＩを
用いて消化したプラスミドｐＭＯＮ ３１６のＤＮＡと
混合した。プラスミドｐＭＯＮ ３１６は、３５Ｓ転写
体の生産を指示するカリフラワー モザイク ウイルス
（ＣａＭＶ）の３３０bp断片を保有するｐＭＯＮ２００
（Fraley et al (1985)）、Rogers et al (1985)）の誘
導体である。
【００６１】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター断片を、Ｓ
ａｌＩ挿入物としてＣａＭＶ ＣＭ４−１８４株（Howa
rth et al (1981)）の完全なゲノムを保有するｐＢＲ
３２２誘導体であるプラスミド ｐＯＳ−１から単離し
た。ＣＭ４−１８４株はＣＭ１８４１株の天然に存在す
る欠失突然変異体である。ＣａＭＶのＣＭ１８４１株
（Gardner et al (1981)）とＣａｂｂ−Ｓ株（Franck e
t al (1980)）のヌクレオチド配列は公表されており、
異なるＣＭ４−１８４ クローン（Dudley et al(198
2)）に対するある部分的な配列を有している。これらの
全ての株の３５Ｓプロモーターのヌケレオチド配列は非
常に類似している。以下の説明中に参照するヌクレオチ
ド番号（「ｎ ．．．」）は、ガードナーら（Gardner e
t al (1981)）により開示されているＣＭ１８４１の配
列に対するものである。
ａｌＩ挿入物としてＣａＭＶ ＣＭ４−１８４株（Howa
rth et al (1981)）の完全なゲノムを保有するｐＢＲ
３２２誘導体であるプラスミド ｐＯＳ−１から単離し
た。ＣＭ４−１８４株はＣＭ１８４１株の天然に存在す
る欠失突然変異体である。ＣａＭＶのＣＭ１８４１株
（Gardner et al (1981)）とＣａｂｂ−Ｓ株（Franck e
t al (1980)）のヌクレオチド配列は公表されており、
異なるＣＭ４−１８４ クローン（Dudley et al(198
2)）に対するある部分的な配列を有している。これらの
全ての株の３５Ｓプロモーターのヌケレオチド配列は非
常に類似している。以下の説明中に参照するヌクレオチ
ド番号（「ｎ ．．．」）は、ガードナーら（Gardner e
t al (1981)）により開示されているＣＭ１８４１の配
列に対するものである。
【００６２】まずＢａｍ ＨＩを用いて開裂されたｐＢ
Ｒ ３２２に挿入し、その後ＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノー（Klenow）断片を用いて処理し、最後にＥｃｏ
ＲＩを用いて開裂したＡｌｕ Ｉ（ｎ ７１４３）−Ｅ
ｃｏ ＲＩ＊（ｎ ７５１７）断片として、３５Ｓ プ
ロモーターをＣＭ４−１８４のｐＯＳ−１クローンから
単離した。それから、プロモーター断片をＢａｍ ＨＩ
とＥｃｏ ＲＩを用いてｐＢＲ ３２２から切取り、クレ
ノー ポリメラーゼを用いて処理し、ｍｐ８マルチリン
カーのＥｃｏ ＲＩ部位がプロモーター断片の５′末端
にくるようにＭ１３ｍｐ８（Messing & Vieira (198
2)）のＳｍａ I部位に挿入した。その後、サイト ダイ
レクティッド 突然変異生成（Zoller & Smith (198
2)）を使用して、ヌクレオチド ７４６４にグアニジン
残基を導入し、Ｂｇｌ II部位を形成した。
Ｒ ３２２に挿入し、その後ＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノー（Klenow）断片を用いて処理し、最後にＥｃｏ
ＲＩを用いて開裂したＡｌｕ Ｉ（ｎ ７１４３）−Ｅ
ｃｏ ＲＩ＊（ｎ ７５１７）断片として、３５Ｓ プ
ロモーターをＣＭ４−１８４のｐＯＳ−１クローンから
単離した。それから、プロモーター断片をＢａｍ ＨＩ
とＥｃｏ ＲＩを用いてｐＢＲ ３２２から切取り、クレ
ノー ポリメラーゼを用いて処理し、ｍｐ８マルチリン
カーのＥｃｏ ＲＩ部位がプロモーター断片の５′末端
にくるようにＭ１３ｍｐ８（Messing & Vieira (198
2)）のＳｍａ I部位に挿入した。その後、サイト ダイ
レクティッド 突然変異生成（Zoller & Smith (198
2)）を使用して、ヌクレオチド ７４６４にグアニジン
残基を導入し、Ｂｇｌ II部位を形成した。
【００６３】それから、３５Ｓ プロモーター断片を、
Ｍ１３から、３３０bpのＥｃｏ ＲＩ−Ｂｇｌ II断片と
して切取った。これは、３５Ｓ プロモーター、転写開
始部位、および、５′非翻訳リーダーの３０個のヌクレ
オチドを含むが、ＣａＭＶ翻訳イニシエーター、また、
転写の開始点から１８０ヌクレオチド下に位置する３５
Ｓ転写ポリアデニル化シグナル（Covey et al (1981)、
Guilley et al (1982)）は含まない。３５Ｓ プロモー
ター断片を、合成マルチリンカーと、ＮＯＳ３′非翻訳
領域からのｐＴｉＴ３７ ノパリン シンターゼ遺伝子
（Bevan etal (1983)）の２６０bp Ｓａｕ ３Ａ断片
（ヌクレオチド ６６５〜４１７）とに結合させた。こ
のようにして製造した断片をｐＭＯＮ２００に挿入し、
ｐＭＯＮ３１６を得た（図３）。３５Ｓ プロモータ
ー、マルチリンカーおよびＮＯＳ ３′断片の完全な配
列を図４に示す。この配列は、３５Ｓ プロモーター断
片の５′末端に位置するＥｃｏ ＲＩ部位を除くための
クレノー ポリメラーゼ処理によって形成されたＸｍｎ
Ｉ部位で始まっている。
Ｍ１３から、３３０bpのＥｃｏ ＲＩ−Ｂｇｌ II断片と
して切取った。これは、３５Ｓ プロモーター、転写開
始部位、および、５′非翻訳リーダーの３０個のヌクレ
オチドを含むが、ＣａＭＶ翻訳イニシエーター、また、
転写の開始点から１８０ヌクレオチド下に位置する３５
Ｓ転写ポリアデニル化シグナル（Covey et al (1981)、
Guilley et al (1982)）は含まない。３５Ｓ プロモー
ター断片を、合成マルチリンカーと、ＮＯＳ３′非翻訳
領域からのｐＴｉＴ３７ ノパリン シンターゼ遺伝子
（Bevan etal (1983)）の２６０bp Ｓａｕ ３Ａ断片
（ヌクレオチド ６６５〜４１７）とに結合させた。こ
のようにして製造した断片をｐＭＯＮ２００に挿入し、
ｐＭＯＮ３１６を得た（図３）。３５Ｓ プロモータ
ー、マルチリンカーおよびＮＯＳ ３′断片の完全な配
列を図４に示す。この配列は、３５Ｓ プロモーター断
片の５′末端に位置するＥｃｏ ＲＩ部位を除くための
クレノー ポリメラーゼ処理によって形成されたＸｍｎ
Ｉ部位で始まっている。
【００６４】プラスミドｐＭＯＮ３１６は、５′リーダ
ーとＮＯＳポリアデニル化シグナルの間に、制限エンド
ヌクレアーゼＢｇｌ II、Ｃｌａ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｈ
ｏ ＩおよびＥｃｏ ＲＩに対する唯一の（unique）開裂
部位を有するコインテグレート型の中間体ベクターであ
る。この開裂部位のために、３５Ｓ転写リーダー配列の
すぐ隣に、それ自身の翻訳開始シグナルを保有するコー
ド配列を挿入することができる。ｐＭＯＮ３１６プラス
ミドは、大腸菌およびＡ．タメファシエンスにおける選
抜のためのスペクチノマイシン耐性を含むｐＭＯＮ２０
０の全ての性質、並びに、形質転換された植物組織の選
抜のためのキメラ カナマイシン遺伝子（ＮＯＳ−ＮＰ
Ｔ II′−ＮＯＳ）、および、後代中での形質転換体と
遺伝形質の容易なスコアリングのためのノパリン シン
ターゼ遺伝子を保持している。ｐＭＯＮ３１６ プラス
ミドは上述のＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ カセットを含
む。これはｐＭＯＮ２００には欠けていたものである。
しかし、実質的にはｐＭＯＮ２００と同様に使用するこ
とができる（Fraley et al (1985)、Rogers et al (198
6)を参照）。
ーとＮＯＳポリアデニル化シグナルの間に、制限エンド
ヌクレアーゼＢｇｌ II、Ｃｌａ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｈ
ｏ ＩおよびＥｃｏ ＲＩに対する唯一の（unique）開裂
部位を有するコインテグレート型の中間体ベクターであ
る。この開裂部位のために、３５Ｓ転写リーダー配列の
すぐ隣に、それ自身の翻訳開始シグナルを保有するコー
ド配列を挿入することができる。ｐＭＯＮ３１６プラス
ミドは、大腸菌およびＡ．タメファシエンスにおける選
抜のためのスペクチノマイシン耐性を含むｐＭＯＮ２０
０の全ての性質、並びに、形質転換された植物組織の選
抜のためのキメラ カナマイシン遺伝子（ＮＯＳ−ＮＰ
Ｔ II′−ＮＯＳ）、および、後代中での形質転換体と
遺伝形質の容易なスコアリングのためのノパリン シン
ターゼ遺伝子を保持している。ｐＭＯＮ３１６ プラス
ミドは上述のＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ カセットを含
む。これはｐＭＯＮ２００には欠けていたものである。
しかし、実質的にはｐＭＯＮ２００と同様に使用するこ
とができる（Fraley et al (1985)、Rogers et al (198
6)を参照）。
【００６５】７００bpのＴＭＶコートたんぱく質コード
断片を挿入することにより、形質転換植物細胞中でのこ
のたんぱく質の合成の適切なシグナルが提供される。生
成のプラスミドを図５に示す。このプラスミドを「ｐＭ
ＯＮ３１９」と称する。
断片を挿入することにより、形質転換植物細胞中でのこ
のたんぱく質の合成の適切なシグナルが提供される。生
成のプラスミドを図５に示す。このプラスミドを「ｐＭ
ＯＮ３１９」と称する。
【００６６】Ｂ．ＣＰ遺伝子を含むＤＮＡ構成物の植物
細胞への挿入 プラスミド ｐＭＯＮ３１９を、フレーリーら（Fraley
et al (1985)）に従い、「ＰＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥ」と
称する弱めたＴｉ プラスミドを含むＡ．タメファシエ
ンス細胞に挿入した。このプラスミドは、完全に機能的
なＴ−ＤＮＡ領域を含まず、左のＴ−ＤＮＡ境界を含
む。
細胞への挿入 プラスミド ｐＭＯＮ３１９を、フレーリーら（Fraley
et al (1985)）に従い、「ＰＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥ」と
称する弱めたＴｉ プラスミドを含むＡ．タメファシエ
ンス細胞に挿入した。このプラスミドは、完全に機能的
なＴ−ＤＮＡ領域を含まず、左のＴ−ＤＮＡ境界を含
む。
【００６７】ＰＭＯＮ３１９ プラスミドは、細菌中の
スペクチノマイシン（Ｓｐｃ）とストレプトマイシン
（Ｓｔｒ）に対する選択可能な耐性を伝達する標識遺伝
子を保有している。更に、ｐＭＯＮ３１９をｐＴｉＢ６
Ｓ３−ＳＥと組合わせて、それにより、ＣａＭＶ３５Ｓ
／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を含む再構成されたＴ
−ＤＮＡ領域を有するコインテグレート Ｔｉ プラス
ミドをつくる交叉を起こすことができる相同性の領域を
保有している。しかし、ｐＭＯＮ３１９はＡ．タメファ
シエンス細胞中で独立して複製することができない。そ
れで、ＳｐｃおよびＳｔｒ存在下では、コインテグレー
ト プラスミドを有するＡ．タメファシエンス細胞のみ
が生存できる。
スペクチノマイシン（Ｓｐｃ）とストレプトマイシン
（Ｓｔｒ）に対する選択可能な耐性を伝達する標識遺伝
子を保有している。更に、ｐＭＯＮ３１９をｐＴｉＢ６
Ｓ３−ＳＥと組合わせて、それにより、ＣａＭＶ３５Ｓ
／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を含む再構成されたＴ
−ＤＮＡ領域を有するコインテグレート Ｔｉ プラス
ミドをつくる交叉を起こすことができる相同性の領域を
保有している。しかし、ｐＭＯＮ３１９はＡ．タメファ
シエンス細胞中で独立して複製することができない。そ
れで、ＳｐｃおよびＳｔｒ存在下では、コインテグレー
ト プラスミドを有するＡ．タメファシエンス細胞のみ
が生存できる。
【００６８】コインテグレート Ｔｉ プラスミドを含
むＡ．タメファシエンスの培養を、ホーシュら（Horsch
et al (1985)）に記述されるように、タバコ植物（Nic
itiana tobacum cv. “Samsun”）から採取した葉のデ
ィスクと接触させた。アグロバクテリウム細胞は、ＤＮ
Ａ構成物を植物細胞の染色体に挿入した。カナマイシン
に耐性の植物細胞を選抜し、ホーシュら（Horsch et al
(1985)）が記述する方法により分化植物に再生した。
むＡ．タメファシエンスの培養を、ホーシュら（Horsch
et al (1985)）に記述されるように、タバコ植物（Nic
itiana tobacum cv. “Samsun”）から採取した葉のデ
ィスクと接触させた。アグロバクテリウム細胞は、ＤＮ
Ａ構成物を植物細胞の染色体に挿入した。カナマイシン
に耐性の植物細胞を選抜し、ホーシュら（Horsch et al
(1985)）が記述する方法により分化植物に再生した。
【００６９】実験で対照とした植物は、（１）外来性の
遺伝子を全く含んでいないか、または、（２）ｐＭＯＮ
２００ プラスミドのみを含むかのどちらかであった。
ｐＭＯＮ３１９：ｐＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥ コインテグレ
ート プラスミドを含むＡ．タメファシエンス細胞の培
養を、ブタペスト条約に従いＡＴＣＣに寄託した。受託
番号は第５３２９４号であった。
遺伝子を全く含んでいないか、または、（２）ｐＭＯＮ
２００ プラスミドのみを含むかのどちらかであった。
ｐＭＯＮ３１９：ｐＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥ コインテグレ
ート プラスミドを含むＡ．タメファシエンス細胞の培
養を、ブタペスト条約に従いＡＴＣＣに寄託した。受託
番号は第５３２９４号であった。
【００７０】Ｃ．植物細胞中でのウイルスＲＮＡの発現 文献（Lane & Tremiates−Kennedy (1981)）に記載され
る方法により、再生した植物の葉からＲＮＡを抽出し
た。ＲＮＡは、マニアチスら（Maniatis et al (198
2)）が記述するように、ホルムアルデヒドを含むアガロ
ースゲル中での電気泳動により大きさに従って分離し、
ニトロセルロースに対してブロッティングした。ウイル
スＲＮＡは、マニアチスら（Maniatis et al (1982)）
の方法を使用して、３２Ｐ標識ＤＮＡクローンに対して
ハイブリダイゼーションさせることによって、ニトロセ
ルロース上に検出した。
る方法により、再生した植物の葉からＲＮＡを抽出し
た。ＲＮＡは、マニアチスら（Maniatis et al (198
2)）が記述するように、ホルムアルデヒドを含むアガロ
ースゲル中での電気泳動により大きさに従って分離し、
ニトロセルロースに対してブロッティングした。ウイル
スＲＮＡは、マニアチスら（Maniatis et al (1982)）
の方法を使用して、３２Ｐ標識ＤＮＡクローンに対して
ハイブリダイゼーションさせることによって、ニトロセ
ルロース上に検出した。
【００７１】このＲＮＡハイブリダイゼーション分析に
基づいて、形質転換した植物（ｐＭＯＮ３１９を保有す
る植物）はウイルスＲＮＡを保有するが、ｐＭＯＮ２０
０のみを含む植物はウイルスＲＮＡを含まないことが決
定された。ＴＭＶ コートたんぱく質の存在は、ｐＭＯ
Ｎ３１９を含むが、ｐＭＯＮ２００は含まない植物中に
検出された。リームリ（Laemmli (1970)）に従い、試料
緩衝液中で粉砕することにより葉からたんぱく質を抽出
した。リームリ（Laemmli (1970)）が開示するように、
たんぱく質の５０μｇの部分に、ＳＤＳを含む１２％ポ
リアクリルアミドゲル中での電気泳動を行った。たんぱ
く質は、トービンら（Towbin et al (1981)）の開示す
るように、電気泳動的にニトロセルロースヘ移された。
基づいて、形質転換した植物（ｐＭＯＮ３１９を保有す
る植物）はウイルスＲＮＡを保有するが、ｐＭＯＮ２０
０のみを含む植物はウイルスＲＮＡを含まないことが決
定された。ＴＭＶ コートたんぱく質の存在は、ｐＭＯ
Ｎ３１９を含むが、ｐＭＯＮ２００は含まない植物中に
検出された。リームリ（Laemmli (1970)）に従い、試料
緩衝液中で粉砕することにより葉からたんぱく質を抽出
した。リームリ（Laemmli (1970)）が開示するように、
たんぱく質の５０μｇの部分に、ＳＤＳを含む１２％ポ
リアクリルアミドゲル中での電気泳動を行った。たんぱ
く質は、トービンら（Towbin et al (1981)）の開示す
るように、電気泳動的にニトロセルロースヘ移された。
【００７２】ブロッティングしたたんぱく質を、シミン
グトンら（Symington et al (1981)）の開示に従い、精
製したＴＭＶに対してウサギ中で産生させた抗血清と反
応させた。ニトロセルロース上でＴＭＶと結合したウサ
ギ抗体は、１２５Ｉ標識したロバ 抗ウサギ 抗血清
（Amersham Co., Chicago）との結合により検出した。
グトンら（Symington et al (1981)）の開示に従い、精
製したＴＭＶに対してウサギ中で産生させた抗血清と反
応させた。ニトロセルロース上でＴＭＶと結合したウサ
ギ抗体は、１２５Ｉ標識したロバ 抗ウサギ 抗血清
（Amersham Co., Chicago）との結合により検出した。
【００７３】イムノブロット分析の結果に基づいて、形
質転換した植物（ｐＭＯＮ３１９を含む）はＴＭＶコー
トたんぱく質を生産するが、ｐＭＯＮ２００のみを含む
植物はＴＭＶコートたんぱく質を生産しないことが決定
された。これらの葉中で生産されるコートたんぱく質の
量は、葉の全たんぱく質の５０μｇ中にコートたんぱく
質が約５０ナノグラム、つまり０．１％であった。
質転換した植物（ｐＭＯＮ３１９を含む）はＴＭＶコー
トたんぱく質を生産するが、ｐＭＯＮ２００のみを含む
植物はＴＭＶコートたんぱく質を生産しないことが決定
された。これらの葉中で生産されるコートたんぱく質の
量は、葉の全たんぱく質の５０μｇ中にコートたんぱく
質が約５０ナノグラム、つまり０．１％であった。
【００７４】Ｄ．タバコ植物のＴＭＶに対する耐性 形質転換した植物と対照の植物とを約２フィートの高さ
に成長させ、それから、幹部を腋芽を伴った挿木に分割
し、これを根付かせ個々の植物に再生させた。これらの
植物にＴＭＶを接種した。これは、研磨粒子をウイルス
粒子の水性懸濁液に加え、研磨溶液を葉上でこすること
によって行った。特に、ＴＭＶは０．０５Ｍのリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH 7.2）に懸濁した。約５０μｌの溶
液を、カルボランダム（３２０グリット、Fisher Scien
tific Co. 製造）を撒いたタバコ葉に、こすることによ
って適用した。葉の表面が乾燥した後、葉を水ですす
ぎ、植物を温室または生育室に置いた。
に成長させ、それから、幹部を腋芽を伴った挿木に分割
し、これを根付かせ個々の植物に再生させた。これらの
植物にＴＭＶを接種した。これは、研磨粒子をウイルス
粒子の水性懸濁液に加え、研磨溶液を葉上でこすること
によって行った。特に、ＴＭＶは０．０５Ｍのリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH 7.2）に懸濁した。約５０μｌの溶
液を、カルボランダム（３２０グリット、Fisher Scien
tific Co. 製造）を撒いたタバコ葉に、こすることによ
って適用した。葉の表面が乾燥した後、葉を水ですす
ぎ、植物を温室または生育室に置いた。
【００７５】対照植物は接種後約３〜５日以内に感染の
症状を示した。それに対して、本発明のＤＮＡ構成物を
含む植物は、接種後８〜１０日まで症状を生じなかっ
た。この結果は独立した３組の実験で確かめられた。
症状を示した。それに対して、本発明のＤＮＡ構成物を
含む植物は、接種後８〜１０日まで症状を生じなかっ
た。この結果は独立した３組の実験で確かめられた。
【００７６】他の実験では、ｐＭＯＮ３１９を含む二つ
の異なる形質転換植物により生産された種子を発芽さ
せ、実生（seedling）を土壌で成長させた。それぞれの
実生に、上述のイムノブロッティング法によってＴＭＶ
コートたんぱく質が存在するか否かを試験した。全部で
３９の実生に、上に述べたＴＭＶを含む懸濁液（０．２
５μｇ／ml）を用いて、実生がＴＭＶ コートたんぱく
質を含むか否かを前もって知らない盲検法で接種を行っ
た。実験の結果、１１／３９の植物がコートたんぱく質
を含んでいた。残りはコートたんぱく質を含んでいず、
この実験の対照とした。
の異なる形質転換植物により生産された種子を発芽さ
せ、実生（seedling）を土壌で成長させた。それぞれの
実生に、上述のイムノブロッティング法によってＴＭＶ
コートたんぱく質が存在するか否かを試験した。全部で
３９の実生に、上に述べたＴＭＶを含む懸濁液（０．２
５μｇ／ml）を用いて、実生がＴＭＶ コートたんぱく
質を含むか否かを前もって知らない盲検法で接種を行っ
た。実験の結果、１１／３９の植物がコートたんぱく質
を含んでいた。残りはコートたんぱく質を含んでいず、
この実験の対照とした。
【００７７】接種後５日に、３／１１（２７％）の対照
植物がＴＭＶ感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コ
ートたんぱく質を含む植物はいずれもそのような症状を
示さなかった。
植物がＴＭＶ感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コ
ートたんぱく質を含む植物はいずれもそのような症状を
示さなかった。
【００７８】接種後６日に、４５％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。一方、ＴＭＶ コートた
んぱく質を含む植物では１８％のみがそのような症状を
示した。
感染の典型的な症状を生じた。一方、ＴＭＶ コートた
んぱく質を含む植物では１８％のみがそのような症状を
示した。
【００７９】接種後７日に、８２％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コートたんぱく
質を含む植物では５７％がそのような症状を示した。
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コートたんぱく
質を含む植物では５７％がそのような症状を示した。
【００８０】接種後８日に、８２％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コートたんぱく
質を含む植物では６４％がそのような症状を示した。
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コートたんぱく
質を含む植物では６４％がそのような症状を示した。
【００８１】ウイルスによる重大な攻撃（massive assa
ult）にもかかわらず症状の発生が相当に遅れたという
結果は、形質転換された植物が、形質転換されない植物
よりもウイルイに対して相当に耐性が大きいことの証明
である。この実験で観測された耐性の増加の程度は、形
質転換された植物が、開放田畑または温室で起る可能性
がある感染接触の型に耐えることができることを示して
いる。
ult）にもかかわらず症状の発生が相当に遅れたという
結果は、形質転換された植物が、形質転換されない植物
よりもウイルイに対して相当に耐性が大きいことの証明
である。この実験で観測された耐性の増加の程度は、形
質転換された植物が、開放田畑または温室で起る可能性
がある感染接触の型に耐えることができることを示して
いる。
【００８２】例３．トランスジェニック植物におけるウ
イルス病耐性の確認（characterization） Ａ．タバコにおける適用量応答（dose−response） 例２に説明した形質転換したタバコ植物の実生をこの実
験に使用した。上に述べたイムノブロッティング法によ
り、ＣＰコード配列を発現するか、または、ＣＰコード
配列を発現しないかを決定された植物を、３群に分け、
上記のＴＭＶ（Ｕ１バルガー族）を含む懸濁液を用いて
接種した。この３群はそれぞれ、０．４μｇ／ml、０．
８μｇ／mlおよび２．０μｇ／mlの濃度でＴＭＶを含む
懸濁液を用いて接種を行った。接種した植物を温室に入
れ、ウイルス感染の症状を観察した。図６の棒グラフは
この実験の結果を示している。データは、明らかに、コ
ートたんぱく質を発現する植物が、〜０．４μｇ／mlま
たはそれ以下でウイルスに対して全く耐性であったこと
を示している。
イルス病耐性の確認（characterization） Ａ．タバコにおける適用量応答（dose−response） 例２に説明した形質転換したタバコ植物の実生をこの実
験に使用した。上に述べたイムノブロッティング法によ
り、ＣＰコード配列を発現するか、または、ＣＰコード
配列を発現しないかを決定された植物を、３群に分け、
上記のＴＭＶ（Ｕ１バルガー族）を含む懸濁液を用いて
接種した。この３群はそれぞれ、０．４μｇ／ml、０．
８μｇ／mlおよび２．０μｇ／mlの濃度でＴＭＶを含む
懸濁液を用いて接種を行った。接種した植物を温室に入
れ、ウイルス感染の症状を観察した。図６の棒グラフは
この実験の結果を示している。データは、明らかに、コ
ートたんぱく質を発現する植物が、〜０．４μｇ／mlま
たはそれ以下でウイルスに対して全く耐性であったこと
を示している。
【００８３】Ｂ．トマトにおける適用量応答 コインテグレート プラスミド ｐＭＯＮ３１９：ｐＴ
ｉＢ６Ｓ３−ＳＥを含むＡ．タメファシエンス細胞の培
養を、再び例２に説明した方法を使用して、トマト植物
から採取した葉のディスクと接触させた。ＣａＭＶ３５
Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を含むカナマイシン
耐性組織を選抜し、植物に再生した。自家受精したトラ
ンスジェニックなトマト植物の実生後代を、試験植物と
した。この実験に対する対照植物は、形質転換されてい
ない親植物および非発現の実生後代であった。
ｉＢ６Ｓ３−ＳＥを含むＡ．タメファシエンス細胞の培
養を、再び例２に説明した方法を使用して、トマト植物
から採取した葉のディスクと接触させた。ＣａＭＶ３５
Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を含むカナマイシン
耐性組織を選抜し、植物に再生した。自家受精したトラ
ンスジェニックなトマト植物の実生後代を、試験植物と
した。この実験に対する対照植物は、形質転換されてい
ない親植物および非発現の実生後代であった。
【００８４】試験植物と対照植物とに例２の接種方法に
従い、０．５μｇ／mlと２０μｇ／mlの間の濃度で、Ｔ
ＭＶを含む懸濁液を用いて接種を行った。この実験の結
果を図７に示す。図７に示すように、全ての対照植物が
３０日以内にウイルス感染の症状を示した。更に、対照
植物はウイルス接種物の増加に伴ってより速やかに症状
を示した。これと対照的に、ＴＭＶコートたんぱく質を
発現する実生はＴＭＶ感染に対して実質的に耐性であ
り、感染の症状を示す場合でも接種後３０日までは症状
を発達させなかった。
従い、０．５μｇ／mlと２０μｇ／mlの間の濃度で、Ｔ
ＭＶを含む懸濁液を用いて接種を行った。この実験の結
果を図７に示す。図７に示すように、全ての対照植物が
３０日以内にウイルス感染の症状を示した。更に、対照
植物はウイルス接種物の増加に伴ってより速やかに症状
を示した。これと対照的に、ＴＭＶコートたんぱく質を
発現する実生はＴＭＶ感染に対して実質的に耐性であ
り、感染の症状を示す場合でも接種後３０日までは症状
を発達させなかった。
【００８５】Ｃ．遺伝的耐性との比較 本発明によって上記の実生後代に付与された耐性を更に
確認するために、ＴｏＭＶ耐性のための遺伝的決定基を
含むことが知られているトマト植物のＴｏＭＶ接種に対
する応答を、例２の方法を用いて調製したトランスジェ
ニック植物の対応する応答と比較した。特に、通常の育
種方法によってそれぞれ耐性決定基Ｔｍ−２またはＴｍ
−２ａを導入された「クライゲラ（Craigella）」変種
植物に、「ＴｏＭＶ２」または「ＴｏＭＶ２ａ」と称す
るＴｏＭＶ株を用いて接種を行った。（種々の株による
ＴｏＭＶ感染に対する異なる耐性決定基を保有する植物
の相対感受性のデータを、次の表に示す。）形質転換さ
れたＴＭＶ コートたんぱく質を発現したほかはＴｏＭ
Ｖ２感受性である変種のトランスジェニック植物を含む
試験群（「ＶＦ３６」）に、形質転換されないＶＦ３６
植物の対照群と同様に、同じウイルス株を用いて接種を
行った。
確認するために、ＴｏＭＶ耐性のための遺伝的決定基を
含むことが知られているトマト植物のＴｏＭＶ接種に対
する応答を、例２の方法を用いて調製したトランスジェ
ニック植物の対応する応答と比較した。特に、通常の育
種方法によってそれぞれ耐性決定基Ｔｍ−２またはＴｍ
−２ａを導入された「クライゲラ（Craigella）」変種
植物に、「ＴｏＭＶ２」または「ＴｏＭＶ２ａ」と称す
るＴｏＭＶ株を用いて接種を行った。（種々の株による
ＴｏＭＶ感染に対する異なる耐性決定基を保有する植物
の相対感受性のデータを、次の表に示す。）形質転換さ
れたＴＭＶ コートたんぱく質を発現したほかはＴｏＭ
Ｖ２感受性である変種のトランスジェニック植物を含む
試験群（「ＶＦ３６」）に、形質転換されないＶＦ３６
植物の対照群と同様に、同じウイルス株を用いて接種を
行った。
【００８６】 ＴＯＭＶ株 植物群 ＴＭＶ＊ ２ ２ａ ＶＦ３６ ５／５ ５／５ ５／５ Ｔｍ−１ ０／５ ０／５ ０／５ Ｔｍ−２ ０／５ ５／５ ０／５ Ｔｍ−２ａ ０／５ ０／５ ３／５ トランスジェニック １／５ ３／５ １／５ ＊ ＝ ＴＭＶ株 ＰＶ２３０ ＋ ＝ 感受性 − ＝ 耐性 それぞれの群の５つの植物が、接種後１４日に病気の症
状を記録された。接種後１４日以内に対照植物Ｔｍ−２
決定基を含む植物の両方が全てＴｏＭＶ感染の症状を発
達させた。５つのトランスジェニック植物のうち３つが
同じ期間にわたって症状を示した（図８参照）。前記の
表中のデータは、トランスジェニックな植物が、形質転
換されていない対照よりも相当に良く、しかも、ＴｏＭ
Ｖの多くの株に対して非選択性の耐性の水準を示すこと
を証明している（図８参照）。これと対照的に、遺伝的
耐性はかなり範囲が狭い。試験植物中、最終的には６０
％が感染の徴候を示したが、症状はＴｍ−２植物のもの
よりも重大でなかった。この結果は、試験食物中でのＣ
Ｐ発現により付与されたＴｏＭＶ２に対する耐性は、Ｔ
ｍ−２によりコードされる遺伝的耐性より、優れてはな
いとしてもそれと比較できるものであったことを示して
いる。
状を記録された。接種後１４日以内に対照植物Ｔｍ−２
決定基を含む植物の両方が全てＴｏＭＶ感染の症状を発
達させた。５つのトランスジェニック植物のうち３つが
同じ期間にわたって症状を示した（図８参照）。前記の
表中のデータは、トランスジェニックな植物が、形質転
換されていない対照よりも相当に良く、しかも、ＴｏＭ
Ｖの多くの株に対して非選択性の耐性の水準を示すこと
を証明している（図８参照）。これと対照的に、遺伝的
耐性はかなり範囲が狭い。試験植物中、最終的には６０
％が感染の徴候を示したが、症状はＴｍ−２植物のもの
よりも重大でなかった。この結果は、試験食物中でのＣ
Ｐ発現により付与されたＴｏＭＶ２に対する耐性は、Ｔ
ｍ−２によりコードされる遺伝的耐性より、優れてはな
いとしてもそれと比較できるものであったことを示して
いる。
【００８７】例４ タバコ モザイク ウイルスの種々
の株に対する交叉免疫 ＣａＭＶ３５／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を保有す
る形質転換したトマト植物を例３に記述した方法で製造
した。自家受精トラスジェニック トマト植物の実生後
代をこの実験の試験植物とした。対照植物は、ＴＭＶ
コートたんぱく質を発現しない実生後代、および、親型
の正常の形質転換していない植物であった。
の株に対する交叉免疫 ＣａＭＶ３５／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を保有す
る形質転換したトマト植物を例３に記述した方法で製造
した。自家受精トラスジェニック トマト植物の実生後
代をこの実験の試験植物とした。対照植物は、ＴＭＶ
コートたんぱく質を発現しない実生後代、および、親型
の正常の形質転換していない植物であった。
【００８８】試験植物と対照植物に次の二つの異なるＴ
ＭＶ株を用いて接種を行った。
ＭＶ株を用いて接種を行った。
【００８９】ＰＶ−２３０−ＡＴＣＣから得たＴＭＶの
ヴィルレント株（受託番号ＰＶ−２３０） Ｌ−ＴＭＶ−トマト植物に感染することが知られている
株 試験植物と対照植物に、例２に記述した方法に従い、そ
れぞれ２μｇ／mlとと２０μｇ／mlの濃度で前記のそれ
ぞれのＴＭＶ株を接種した。この実験の結果を図９に示
す。このデータは、ＴＭＶコートたんぱく質を発現する
トランスジェニックなトマト植物がＴＭＶ感染に耐性で
あったことを明らかに示している。試験したＴＭＶの両
方の株に対して耐性が示された。更に、２０μｇ／mlも
の高濃度でヴィルレント株ＰＶ−２３０を使用したにも
かかわらず、高い割合のトマト植物（４０％から１００
％）が接種後２９日内に症状を発達させなかった。
ヴィルレント株（受託番号ＰＶ−２３０） Ｌ−ＴＭＶ−トマト植物に感染することが知られている
株 試験植物と対照植物に、例２に記述した方法に従い、そ
れぞれ２μｇ／mlとと２０μｇ／mlの濃度で前記のそれ
ぞれのＴＭＶ株を接種した。この実験の結果を図９に示
す。このデータは、ＴＭＶコートたんぱく質を発現する
トランスジェニックなトマト植物がＴＭＶ感染に耐性で
あったことを明らかに示している。試験したＴＭＶの両
方の株に対して耐性が示された。更に、２０μｇ／mlも
の高濃度でヴィルレント株ＰＶ−２３０を使用したにも
かかわらず、高い割合のトマト植物（４０％から１００
％）が接種後２９日内に症状を発達させなかった。
【００９０】例５ 種々のプロモーターによるウイルス
コートたんぱく質の制御 本発明の他のプロモーターの使用を示すため、および、
コートたんぱく質の発現の水準とウイル耐性の間の相関
を示すために、一つの実験を行った。
コートたんぱく質の制御 本発明の他のプロモーターの使用を示すため、および、
コートたんぱく質の発現の水準とウイル耐性の間の相関
を示すために、一つの実験を行った。
【００９１】第１群の植物は、例２に記述したように形
質転換されてＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ
構成物を保有するトランスジェニックなタバコ植物の実
生後代であった。
質転換されてＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ
構成物を保有するトランスジェニックなタバコ植物の実
生後代であった。
【００９２】第２群と第３群の植物は、第１群の植物と
同様に、ＴＭＶコートたんぱく質遺伝子を発現するよう
に形質転換されたトランスジェニックなタバコ植物の実
生後代であるが、ただ、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター
を次の方法によって、ぺチュニア（petunia）由来のｓ
ｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーター（Tuner et al （198
6））に置換した。
同様に、ＴＭＶコートたんぱく質遺伝子を発現するよう
に形質転換されたトランスジェニックなタバコ植物の実
生後代であるが、ただ、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター
を次の方法によって、ぺチュニア（petunia）由来のｓ
ｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーター（Tuner et al （198
6））に置換した。
【００９３】ペチュニア １１Ａ 小サブユニット（ｓ
ｓ）プロモーター断片を、バクテリオファージλに保有
されるゲノム クローン（Tuner et al （1986））か
ら、Ｅｃｏ ＲＩを用いる開裂を経て単離した。このプ
ロモーターを保有する生成した１．３kbのＥｃｏ ＲＩ
断片を更にＰｓｔ Ｉを用いて消化し、ファージ Ｍ１
３ｍｐ８のＰｓｔ Ｉ部位とＥｃｏ ＲＩ部位との間に挿
入して、サイト ダイレクティド 突然変異生成のため
に、小サブユニット転写体の５′非翻訳配列にＢｇｌ I
Iを導入した（図１０）。ペチュニア １１Ａ ｓｓ
プロモーターと突然変異生成プライマーの部分配列を図
１１に示す。Ｅｃｏ ＲＩとＢｇｌ IIを用いて開裂した
後、生成の８００bp断片を、Ｅｃｏ ＲＩとＢｇｌ IIを
用いて開裂したｐＭＯＮ２００に挿入した。生成のプラ
スミド ｐＭＯＮ８０４６をＥｃｏＲＩを用いて消化
し、ＤＮＡポリメラーゼの大クレノー断片およびＤＮＡ
リガーゼを用いて処理した。Ｅｃｏ ＲＩ部位を失った
プラスミドを単離し、ｐＭＯＮ８０４８と命名した（図
１０）。
ｓ）プロモーター断片を、バクテリオファージλに保有
されるゲノム クローン（Tuner et al （1986））か
ら、Ｅｃｏ ＲＩを用いる開裂を経て単離した。このプ
ロモーターを保有する生成した１．３kbのＥｃｏ ＲＩ
断片を更にＰｓｔ Ｉを用いて消化し、ファージ Ｍ１
３ｍｐ８のＰｓｔ Ｉ部位とＥｃｏ ＲＩ部位との間に挿
入して、サイト ダイレクティド 突然変異生成のため
に、小サブユニット転写体の５′非翻訳配列にＢｇｌ I
Iを導入した（図１０）。ペチュニア １１Ａ ｓｓ
プロモーターと突然変異生成プライマーの部分配列を図
１１に示す。Ｅｃｏ ＲＩとＢｇｌ IIを用いて開裂した
後、生成の８００bp断片を、Ｅｃｏ ＲＩとＢｇｌ IIを
用いて開裂したｐＭＯＮ２００に挿入した。生成のプラ
スミド ｐＭＯＮ８０４６をＥｃｏＲＩを用いて消化
し、ＤＮＡポリメラーゼの大クレノー断片およびＤＮＡ
リガーゼを用いて処理した。Ｅｃｏ ＲＩ部位を失った
プラスミドを単離し、ｐＭＯＮ８０４８と命名した（図
１０）。
【００９４】ペチュニア ｓｓ−ＮＯＳ ３′カセッ
ト、プラスミド ｐＭＯＮ３１１を構築するために、Ｓ
ｍａ Ｉ部位をＢａｍＨＩリンカーで置換え、その後ク
レノーポリメラーゼとリガーゼを用いて処理することに
よりＢａｍＨＩ部位を除いたｐＭＯＮ２００誘導体を、
Ｓｔｕ ＩとＨｉｎｄ IIIを用いて消化した。生成の８k
b断片を、ｐＭＯＮ３１６から精製した３００bpのＢｇ
ｌ II−ｔｏ−Ｈｉｎｄ III断片、および、ｐＭＯＮ８
０４８の２．６kbのＳｔｕ Ｉ−ｔｏ−ＢｇｌII断片と
混合した。生成のプラスミド ｐＭＯＮ８０４９は、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターがペチュニア ｓｓ プロモ
ーターと置換えられている以外はｐＭＯＮ３１６と同様
である（図１２）。５′末端にＢｇｌ II部位を３′末
端にＥｃｏ ＲＩ部位を含む上記の700bpのＴＭＶ−ＣＰ
コード断片を、Ｂｇｌ IIとＥｃｏ ＲＩを用いて開裂し
たpＭＯＮ８０４９に挿入し、ペチュニア ｓｓ プロ
モーター／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ構成物を保有するｐＭ
ＯＮ８０５９を得た（図１２）。
ト、プラスミド ｐＭＯＮ３１１を構築するために、Ｓ
ｍａ Ｉ部位をＢａｍＨＩリンカーで置換え、その後ク
レノーポリメラーゼとリガーゼを用いて処理することに
よりＢａｍＨＩ部位を除いたｐＭＯＮ２００誘導体を、
Ｓｔｕ ＩとＨｉｎｄ IIIを用いて消化した。生成の８k
b断片を、ｐＭＯＮ３１６から精製した３００bpのＢｇ
ｌ II−ｔｏ−Ｈｉｎｄ III断片、および、ｐＭＯＮ８
０４８の２．６kbのＳｔｕ Ｉ−ｔｏ−ＢｇｌII断片と
混合した。生成のプラスミド ｐＭＯＮ８０４９は、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターがペチュニア ｓｓ プロモ
ーターと置換えられている以外はｐＭＯＮ３１６と同様
である（図１２）。５′末端にＢｇｌ II部位を３′末
端にＥｃｏ ＲＩ部位を含む上記の700bpのＴＭＶ−ＣＰ
コード断片を、Ｂｇｌ IIとＥｃｏ ＲＩを用いて開裂し
たpＭＯＮ８０４９に挿入し、ペチュニア ｓｓ プロ
モーター／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ構成物を保有するｐＭ
ＯＮ８０５９を得た（図１２）。
【００９５】第４群の植物はプラスミド ｐＭＯＮ２０
０のみを含むように形質転換し、対照植物とした。
０のみを含むように形質転換し、対照植物とした。
【００９６】それぞれの群は、例２（Ｄ）に概説した方
法に従ってＴＭＶを接種した３０の植物を含んでいた。
接種後、これらの植物を温室に置き、ウイルス感染の症
状を観察した。
法に従ってＴＭＶを接種した３０の植物を含んでいた。
接種後、これらの植物を温室に置き、ウイルス感染の症
状を観察した。
【００９７】ＴＭＶ コートたんぱく質の相対的な水準
は、ウエスタン（Western） ブロット分析により評価
した。第1群の植物におけるコートたんぱく質遺伝子発
現の程度に対する平均値を１００％とし、次のように決
定した。
は、ウエスタン（Western） ブロット分析により評価
した。第1群の植物におけるコートたんぱく質遺伝子発
現の程度に対する平均値を１００％とし、次のように決
定した。
【００９８】ＣＰ発現の平均値 第１群 − １００ 第２群 − １４ 第３群 − ３ 第４群 − ０ 症状を示す植物の割合（％）群 （接種後の日数） ３ ４ ５ ６ ７ ８ １０ １ ０ ３ ７ ２３ ４０ ４７ ５０ ２ ０ ３ １３ ６３ ８３ ９７ ９７ ３ ０ ０ １５ ８８ １００ ４ ０ １３ ７０ １００ 上に示したデータは次の結論を支持している。 （１） リブロース２リン酸 カルボキシル化酵素 小
サブユニット プロモーターは、本発明での使用に対し
て有用なプロモーターである。しかし、一定の植物では
ＣａＭＶ２５Ｓ プロモーターのように強力なプロモー
ターではない可能性がある。（２） コートたんぱく質
の発現の水準とウイルス耐性との間には正の相開があ
る。
サブユニット プロモーターは、本発明での使用に対し
て有用なプロモーターである。しかし、一定の植物では
ＣａＭＶ２５Ｓ プロモーターのように強力なプロモー
ターではない可能性がある。（２） コートたんぱく質
の発現の水準とウイルス耐性との間には正の相開があ
る。
【００９９】例６ ウイルス コートたんぱく質遺伝子
（アルファルファ モザイク ウイルス）を含むトラン
スジェニックな植物におけるウイルス病耐性 アルファ
ルファ モザイク ウイルスのコートたんぱく質コード
配列（ＡＭＶ ＣＰ）を含むＤＮＡ構成物を、ＴＭＶ耐
性を工学的に処理するために用いた戦略と同様の戦略を
使用して製造した。ＡＭＶのコートたんぱく質をコード
する全長さの（full−length）ｃＤＮＡクローンを次に
記述し、図１３に概略的に示すようにして得た。ＡＭＶ
コートたんぱく質ｃＤＮＡを、ＣａＭＶ３５Ｓ プロ
モーターとＮＯＳ ３′末端に、既に述べたようにして
融合させた。それから、この構成物をアグロバクテリウ
ム介在形質転換系を用いて植物に移入することができ
る。
（アルファルファ モザイク ウイルス）を含むトラン
スジェニックな植物におけるウイルス病耐性 アルファ
ルファ モザイク ウイルスのコートたんぱく質コード
配列（ＡＭＶ ＣＰ）を含むＤＮＡ構成物を、ＴＭＶ耐
性を工学的に処理するために用いた戦略と同様の戦略を
使用して製造した。ＡＭＶのコートたんぱく質をコード
する全長さの（full−length）ｃＤＮＡクローンを次に
記述し、図１３に概略的に示すようにして得た。ＡＭＶ
コートたんぱく質ｃＤＮＡを、ＣａＭＶ３５Ｓ プロ
モーターとＮＯＳ ３′末端に、既に述べたようにして
融合させた。それから、この構成物をアグロバクテリウ
ム介在形質転換系を用いて植物に移入することができ
る。
【０１００】ＡＭＶの３分節系（tripartite）ＲＮＡゲ
ノムの完全なヌクレオチド配列は既に知られている。こ
のデータは、ＡＭＶゲノムが４つの主要な遺伝子生成物
をコードしていることを示している。これらは、ＲＮＡ
１によってコードされている１２６キロダルトン（k
d）のたんぱく質、ＲＮＡ ２によってコードされている
９０kdのたんぱく質、および、ＲＮＡ ３によってコー
ドされている３２kdのたんぱく質である。コートたんぱ
く質は、ＲＮＡ ３の３′末端 ８８１ヌクレオチドと
相同する「ＲＮＡ ４」と称されるサブゲノム メッセ
ンジャー（Barker et al （1983ｂ））から翻訳され
る。
ノムの完全なヌクレオチド配列は既に知られている。こ
のデータは、ＡＭＶゲノムが４つの主要な遺伝子生成物
をコードしていることを示している。これらは、ＲＮＡ
１によってコードされている１２６キロダルトン（k
d）のたんぱく質、ＲＮＡ ２によってコードされている
９０kdのたんぱく質、および、ＲＮＡ ３によってコー
ドされている３２kdのたんぱく質である。コートたんぱ
く質は、ＲＮＡ ３の３′末端 ８８１ヌクレオチドと
相同する「ＲＮＡ ４」と称されるサブゲノム メッセ
ンジャー（Barker et al （1983ｂ））から翻訳され
る。
【０１０１】ＡＭＶのコートたんぱく質をコードする全
長さのｃＤＮＡを合成するために、第１鎖および第２鎖
の両方のＤＮＡ合成に対する合成オリゴヌクレオチド
プライマーを使用した。図１３に参照されるように、使
用したプライマーは、ＡＭＶコートたんぱく質コード配
列のそれぞれの末端に唯一の（unique）Ｅｃｏ ＲＩ部
位を含んでいた。第１鎖のｃＤＮＡは、１００mlの反応
中５μｇのＡＭＶ全ＲＮＡと５５ngのプライマーから、
４ｍＭのピロリン酸ナトリウムと逆転写酵素を用いて合
成した。この方法によって、分子量が０４×１０６ダル
トン（ＲＮＡ１）、０．７３×１０６ダルトン（ＲＮＡ
２）および０．６８×１０６ダルトン（ＲＮＡ ３）の
ｃＤＮＡが合成された。ＲＮＡ鋳型を加水分解した後、
ｃＤＮＡ生成物をＰ−６０カラムで分別した。１本鎖ｃ
ＤＮＡをアニーリングして２本鎖プライマーとして、逆
転写酵素と共にインキュベーションした。ＡＭＶ コー
トたんぱく質配列を含む生成した２本鎖ｃＤＮＡは、そ
れぞれの末端でＥｃｏＲＩ部位に接していた。Ｅｃｏ
ＲＩを用いて消化した後、ｃＤＮＡをｐＵＣ９のＥｃｏ
ＲＩ部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０１細胞を形質転換
し、それから、アンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａ
ｌを含む培地上で選抜した。約１０００の形質転換体を
得た。２５％の形質転換体に５′および３′特異プライ
マーの両方に対してハイブリダイゼーションを行った。
ＤＮＡを３つのポジティブから調製した。Ｅｃｏ ＲＩ
消化物は予期した大きさ（８８１bp）の挿入物の存在を
明らかにした。ヌクレオチド シークエンシング（それ
ぞれの末端に〜１００bp）により、これらのクローンが
実際に全長さのＡＭＶ コートたんぱく質挿入物を含む
ことが確認された。
長さのｃＤＮＡを合成するために、第１鎖および第２鎖
の両方のＤＮＡ合成に対する合成オリゴヌクレオチド
プライマーを使用した。図１３に参照されるように、使
用したプライマーは、ＡＭＶコートたんぱく質コード配
列のそれぞれの末端に唯一の（unique）Ｅｃｏ ＲＩ部
位を含んでいた。第１鎖のｃＤＮＡは、１００mlの反応
中５μｇのＡＭＶ全ＲＮＡと５５ngのプライマーから、
４ｍＭのピロリン酸ナトリウムと逆転写酵素を用いて合
成した。この方法によって、分子量が０４×１０６ダル
トン（ＲＮＡ１）、０．７３×１０６ダルトン（ＲＮＡ
２）および０．６８×１０６ダルトン（ＲＮＡ ３）の
ｃＤＮＡが合成された。ＲＮＡ鋳型を加水分解した後、
ｃＤＮＡ生成物をＰ−６０カラムで分別した。１本鎖ｃ
ＤＮＡをアニーリングして２本鎖プライマーとして、逆
転写酵素と共にインキュベーションした。ＡＭＶ コー
トたんぱく質配列を含む生成した２本鎖ｃＤＮＡは、そ
れぞれの末端でＥｃｏＲＩ部位に接していた。Ｅｃｏ
ＲＩを用いて消化した後、ｃＤＮＡをｐＵＣ９のＥｃｏ
ＲＩ部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０１細胞を形質転換
し、それから、アンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａ
ｌを含む培地上で選抜した。約１０００の形質転換体を
得た。２５％の形質転換体に５′および３′特異プライ
マーの両方に対してハイブリダイゼーションを行った。
ＤＮＡを３つのポジティブから調製した。Ｅｃｏ ＲＩ
消化物は予期した大きさ（８８１bp）の挿入物の存在を
明らかにした。ヌクレオチド シークエンシング（それ
ぞれの末端に〜１００bp）により、これらのクローンが
実際に全長さのＡＭＶ コートたんぱく質挿入物を含む
ことが確認された。
【０１０２】ＡＭＶ コートたんぱく質をコードする８
８１bpのＥｃｏ ＲＩ断片を、意味を持つ配向および意
味を持たない配向 （sense and antisense orientatio
n）とで（それぞれ、ｐＭＯＮ９８００とｐＭＯＮ９８
０１）、植物発現ベクターｐＭＯＮ３１６に結合させ
た。ｐＭＯＮ９８００の構造を図１３に示す。それか
ら、これらのベクターを例２に記述したアグロバクテリ
ウム介在形質転換系を使用して、タバコ、トマトおよび
ペチュニアに移入した。
８１bpのＥｃｏ ＲＩ断片を、意味を持つ配向および意
味を持たない配向 （sense and antisense orientatio
n）とで（それぞれ、ｐＭＯＮ９８００とｐＭＯＮ９８
０１）、植物発現ベクターｐＭＯＮ３１６に結合させ
た。ｐＭＯＮ９８００の構造を図１３に示す。それか
ら、これらのベクターを例２に記述したアグロバクテリ
ウム介在形質転換系を使用して、タバコ、トマトおよび
ペチュニアに移入した。
【０１０３】ＡＭＶ コートたんぱく質ｍＲＮＡの発現
を更に調べるために、ＡＭＶ コートたんぱく質遺伝子
を意味のある配向（ｐＭＯＮ９８００）で含むトランス
ジェニツッなタバコ植物（cv．“Samsun”）由来のカル
ス組織に、ノーザン（Northern） ブロット分析を行っ
た。ｐＭＯＮ９８００からと、ＡＭＶ ＣＰコード配列
を欠くｐＭＯＮ２００から誘導した対照ベクターである
ｐＭＯＮ２７３からの全ＲＮＡ（４０μｇ）をアガロー
スゲル上に仕込み、膜（Gene Screen（登録商標）、New
England Nuclear 製造）に移し、それからＡＭＶ コ
ートたんぱく質をコードする８８１bpのｃＤＮＡ挿入物
をプローブとして調べた。予期した大きさの転写体
（１．２kb）に対応するバンドの群は非常に強いハイブ
リダイゼーションを示した。プローブとハイブリダイゼ
ーションする、より小さい大きさの転写体も存在した。
ｐＭＯＮ２７３を用いて形質転換した対照カルスに対し
てはハイブリダイゼーションは検出されなかった。
を更に調べるために、ＡＭＶ コートたんぱく質遺伝子
を意味のある配向（ｐＭＯＮ９８００）で含むトランス
ジェニツッなタバコ植物（cv．“Samsun”）由来のカル
ス組織に、ノーザン（Northern） ブロット分析を行っ
た。ｐＭＯＮ９８００からと、ＡＭＶ ＣＰコード配列
を欠くｐＭＯＮ２００から誘導した対照ベクターである
ｐＭＯＮ２７３からの全ＲＮＡ（４０μｇ）をアガロー
スゲル上に仕込み、膜（Gene Screen（登録商標）、New
England Nuclear 製造）に移し、それからＡＭＶ コ
ートたんぱく質をコードする８８１bpのｃＤＮＡ挿入物
をプローブとして調べた。予期した大きさの転写体
（１．２kb）に対応するバンドの群は非常に強いハイブ
リダイゼーションを示した。プローブとハイブリダイゼ
ーションする、より小さい大きさの転写体も存在した。
ｐＭＯＮ２７３を用いて形質転換した対照カルスに対し
てはハイブリダイゼーションは検出されなかった。
【０１０４】同じく、ＡＭＶ コートたんぱく質検出の
ためのウエスタン ブロット プロトコルを、トランス
ジェニックな植物と感染植物とに発達させた。市販の抗
ＡＭＶ ＩｇＧ分画（Agdia Inc., Mishawaka, IN）を、
トランスジェニックなタバコカルスおよび葉中、およ
び、トランスジェニックなトマト葉中でのコートたんぱ
く質の検出にうまく使用することができた。特に、対照
およびトランスジェニックなタバコ カルスからの３０
μｇのたんぱく質、および、対照およびトランスジェニ
ックなトマト材料からの４０μｇのたんぱく質をウエス
タン ブロットに適用し、精製ＡＭＶ コートたんぱく
質標品と共に移動する分子量２８〜２９kd付近の免疫反
応性のバンドが得られた。
ためのウエスタン ブロット プロトコルを、トランス
ジェニックな植物と感染植物とに発達させた。市販の抗
ＡＭＶ ＩｇＧ分画（Agdia Inc., Mishawaka, IN）を、
トランスジェニックなタバコカルスおよび葉中、およ
び、トランスジェニックなトマト葉中でのコートたんぱ
く質の検出にうまく使用することができた。特に、対照
およびトランスジェニックなタバコ カルスからの３０
μｇのたんぱく質、および、対照およびトランスジェニ
ックなトマト材料からの４０μｇのたんぱく質をウエス
タン ブロットに適用し、精製ＡＭＶ コートたんぱく
質標品と共に移動する分子量２８〜２９kd付近の免疫反
応性のバンドが得られた。
【０１０５】ＡＭＶ コートたんぱく質を発現すると同
定されたトランスジェニックなタバコ植物に、ＡＭＶの
接種を行った。また、形質転換されていないか、また
は、ベクター ＰＭＯＮ３１６を用いて形質転換された
かのいずれかの対照植物に、接種を行った。症状の発達
を生育室内で毎日監視した。用いた対照植物とトランス
ジェニック植物とは、大きさ、外観および発達段膳（全
て開花を始めていた）が類似していた。対照植物とトラ
ンスジェニック植物からの３枚の葉に、それぞれ、ＡＭ
Ｖ感染植物の抽出物を接種した。その後の滴定分析か
ら、この接種に用いたＡＭＶの濃度は約５０μｇ／mlで
あったことが示された。
定されたトランスジェニックなタバコ植物に、ＡＭＶの
接種を行った。また、形質転換されていないか、また
は、ベクター ＰＭＯＮ３１６を用いて形質転換された
かのいずれかの対照植物に、接種を行った。症状の発達
を生育室内で毎日監視した。用いた対照植物とトランス
ジェニック植物とは、大きさ、外観および発達段膳（全
て開花を始めていた）が類似していた。対照植物とトラ
ンスジェニック植物からの３枚の葉に、それぞれ、ＡＭ
Ｖ感染植物の抽出物を接種した。その後の滴定分析か
ら、この接種に用いたＡＭＶの濃度は約５０μｇ／mlで
あったことが示された。
【０１０６】対照のトランスジェニックなタバコ植物お
よび形質転換されていないタバコ植物の接種を施された
葉は、ＡＭＶの感染後１週以内に症状を示した。これと
対照的に、ＣＰを発現するトランスジェニック植物はい
ずれも感染後１週以内に症状を示さなかった。１０日
後、後者の植物の一つは、３枚の接種した葉の１枚に１
または２の病害を示した。感染後２週には、対照植物の
接種を施され葉の多数の病害は同様のままだったが、接
種しなかった上側の葉は葉の表面に均一に広がった症状
（緑退環）を示した。ＡＭＶ コートたんぱく質を生産
するトランスジェニック試験植物は、接種した葉または
全体の（接種していない）葉のいずれにも症状を示さな
かった（または、追加の症状を示さなかった）。 トラ
ンスジェニック植物および対照植物中のＡＭＶの複製
は、ウエスタンおよびドット（dot）ブロット分析を介
してコートたんぱく質の水準を監視することによって測
定した。感染後１週に、トランスジェニック植物ではウ
エスタン ブロッティングによって背景の水準の発現の
みが検出された。つまり、検出された発現の水準は、導
入されたコートたんぱく質コード配列の固有の水準と比
較できるものであった。一方、対照植物は相当に高い水
準のＡＭＶ コートたんぱく質を含んでいた。デンシト
メーター スキャンニングによるハイブリダイゼーショ
ンのシグナルの量化から、トランスジェニックと形質転
換されていない対照のタバコ植物との間には２１１倍の
差が示された。トランスジェニックなタバコ対照植物
は、ＡＭＶ形質転換体の水準より１１０ないし８１５倍
高いＡＭＶ コートたんぱく質の水準によって確認され
た。この結果は、上記のたんぱく質をつくるトランスジ
ェニックな植物ではＡＭＶ複製は相当に低いことを示し
ている。
よび形質転換されていないタバコ植物の接種を施された
葉は、ＡＭＶの感染後１週以内に症状を示した。これと
対照的に、ＣＰを発現するトランスジェニック植物はい
ずれも感染後１週以内に症状を示さなかった。１０日
後、後者の植物の一つは、３枚の接種した葉の１枚に１
または２の病害を示した。感染後２週には、対照植物の
接種を施され葉の多数の病害は同様のままだったが、接
種しなかった上側の葉は葉の表面に均一に広がった症状
（緑退環）を示した。ＡＭＶ コートたんぱく質を生産
するトランスジェニック試験植物は、接種した葉または
全体の（接種していない）葉のいずれにも症状を示さな
かった（または、追加の症状を示さなかった）。 トラ
ンスジェニック植物および対照植物中のＡＭＶの複製
は、ウエスタンおよびドット（dot）ブロット分析を介
してコートたんぱく質の水準を監視することによって測
定した。感染後１週に、トランスジェニック植物ではウ
エスタン ブロッティングによって背景の水準の発現の
みが検出された。つまり、検出された発現の水準は、導
入されたコートたんぱく質コード配列の固有の水準と比
較できるものであった。一方、対照植物は相当に高い水
準のＡＭＶ コートたんぱく質を含んでいた。デンシト
メーター スキャンニングによるハイブリダイゼーショ
ンのシグナルの量化から、トランスジェニックと形質転
換されていない対照のタバコ植物との間には２１１倍の
差が示された。トランスジェニックなタバコ対照植物
は、ＡＭＶ形質転換体の水準より１１０ないし８１５倍
高いＡＭＶ コートたんぱく質の水準によって確認され
た。この結果は、上記のたんぱく質をつくるトランスジ
ェニックな植物ではＡＭＶ複製は相当に低いことを示し
ている。
【０１０７】例７ ポテト ウイルス Ｘ コートたん
ぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成物 ポテト ウイルス Ｘのコートたんぱく質コード配列
（ＰＶＸ ＣＰ）を包含する構成物を、ＴＭＶおよびＡ
ＭＶ構成物の工学的処理に用いた同様の方法を使用して
製造した。ポテックスウイルス群に属するポテト ウイ
ルス Ｘ （ＰＶＸ）は、２×１０６ダルトンの１本の
感染性のゲノムＲＮＡを含んでいる。ＰＶＸ ＲＮＡの
３′末端領域をクローニングし、シークエンシングを行
った。この領域は、長さが２３７アミノ酸残基のたんぱ
く質をコードするコートたんぱく質遺伝子を含む（Zakh
aryev et al（1984））。
ぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成物 ポテト ウイルス Ｘのコートたんぱく質コード配列
（ＰＶＸ ＣＰ）を包含する構成物を、ＴＭＶおよびＡ
ＭＶ構成物の工学的処理に用いた同様の方法を使用して
製造した。ポテックスウイルス群に属するポテト ウイ
ルス Ｘ （ＰＶＸ）は、２×１０６ダルトンの１本の
感染性のゲノムＲＮＡを含んでいる。ＰＶＸ ＲＮＡの
３′末端領域をクローニングし、シークエンシングを行
った。この領域は、長さが２３７アミノ酸残基のたんぱ
く質をコードするコートたんぱく質遺伝子を含む（Zakh
aryev et al（1984））。
【０１０８】５′末端から最初の１０個のコドンを除い
て、ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子を含むｃＤＮＡ複
製物を、ポリアデニル化したＰＶＸ ウイルス ＲＮＡ
から合成した。「クローン ｐ３ａ」と称するｃＤＮＡ
複製物を、文献（Zakharyevet al（1984））記載のｄ
Ｇ．ｄＣ ティリング（tailing）法を介してｐＢＲ３
２２のＰｓｔ Ｉ部位ヘクローニングした。遺伝子の
５′末端を修復するために、開始コドン ＡＴＧの直
前、および２２コドン後に１８塩基の真正（authenti
c）５′非コード配列を含む合成のＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ
Ｉ断片を用いて、ｄＧ．ｄＣ テイル（tail）および１
１番目から２１番目までのコドンを含むより小さいＰｓ
ｔ Ｉ−Ｐｓｔ Ｉ断片を置換えた。この遺伝子のｄＧ．
ｄＣ テイルと３′末端のｄＡ．ｄＴ 伸長の部分を、
ｐＵＣ１８中でサブクローニングしたより大きいＨｐａ
II−Ｐｓｔ Ｉ断片のＢａｌ ３１消化によって除去
し、それから、Ｃｌａ Ｉ部位をリンカー付加によって
形成した。Ｘｈｏ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ断片（約１７０bp）を
使用して、それぞれ、ｐ３ａ由来の本来の３′末端配
列、および、ｐＢＲ３２２由来のＰｓｔ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ
配列を含むＸｈｏ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ断片を置換えた。
て、ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子を含むｃＤＮＡ複
製物を、ポリアデニル化したＰＶＸ ウイルス ＲＮＡ
から合成した。「クローン ｐ３ａ」と称するｃＤＮＡ
複製物を、文献（Zakharyevet al（1984））記載のｄ
Ｇ．ｄＣ ティリング（tailing）法を介してｐＢＲ３
２２のＰｓｔ Ｉ部位ヘクローニングした。遺伝子の
５′末端を修復するために、開始コドン ＡＴＧの直
前、および２２コドン後に１８塩基の真正（authenti
c）５′非コード配列を含む合成のＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ
Ｉ断片を用いて、ｄＧ．ｄＣ テイル（tail）および１
１番目から２１番目までのコドンを含むより小さいＰｓ
ｔ Ｉ−Ｐｓｔ Ｉ断片を置換えた。この遺伝子のｄＧ．
ｄＣ テイルと３′末端のｄＡ．ｄＴ 伸長の部分を、
ｐＵＣ１８中でサブクローニングしたより大きいＨｐａ
II−Ｐｓｔ Ｉ断片のＢａｌ ３１消化によって除去
し、それから、Ｃｌａ Ｉ部位をリンカー付加によって
形成した。Ｘｈｏ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ断片（約１７０bp）を
使用して、それぞれ、ｐ３ａ由来の本来の３′末端配
列、および、ｐＢＲ３２２由来のＰｓｔ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ
配列を含むＸｈｏ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ断片を置換えた。
【０１０９】最終構成物は、１８bpの５′非コード領域
のｃＤＮＡ、６５７bpのコートたんぱく質配列コード領
域（翻訳終結コドンであるＴＡＡを含む）、７２bpの
３′非コード領域、および、４０bpのｐＥＭＢＬ１２
（＋）中のｄＡ．ｄＴ 伸長を含んでいた（図１４参
照）。ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子の配列を図１５
に示す。水平の矢印はｐ３ａ中のＰＶＸ配列の５′境界
を示す。合成ＤＮＡから誘導した領域は配列上部の波線
で示した。構築に用いた制限部位には下線を施した。こ
のシークエンシングデータと文献（Zakharyev et al（1
984））に発表されているデータとの相違を、配列の下
に示す。コードされている新たなアミノ酸を本来のもの
の上に示す。
のｃＤＮＡ、６５７bpのコートたんぱく質配列コード領
域（翻訳終結コドンであるＴＡＡを含む）、７２bpの
３′非コード領域、および、４０bpのｐＥＭＢＬ１２
（＋）中のｄＡ．ｄＴ 伸長を含んでいた（図１４参
照）。ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子の配列を図１５
に示す。水平の矢印はｐ３ａ中のＰＶＸ配列の５′境界
を示す。合成ＤＮＡから誘導した領域は配列上部の波線
で示した。構築に用いた制限部位には下線を施した。こ
のシークエンシングデータと文献（Zakharyev et al（1
984））に発表されているデータとの相違を、配列の下
に示す。コードされている新たなアミノ酸を本来のもの
の上に示す。
【０１１０】ＰＶＸ コートたんばく賃の全長さのｃＤ
ＮＡを、CａＭＶ３５Ｓ プロモーター（ｐＭＯＮ９８
１８）またはｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーター（ｐＭ
ＯＮ９８１８）のいずれかとｒｂｃＳ−Ｅ９ ３′末端
（Odell et al（1985））を用いて、両方の配向で、ｐ
ＭＯＮ５０５から誘導した発現ベクターに挿入した。Ｐ
ＶＸ コートたんぱく質遺伝子を発現させるために次に
示すベクターを作成し、例２に記述したアグロバクテリ
ウム介在の形質転換系を使用して、タバコ植物へ移入し
た。 （ａ） ｐＭＯＮ９８０９−ＰＶＸコー卜たんぱく質コ
ード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯＮ９８１８のＣ
ａＭＶ３５ＳプロモーターとｒｂｃＳ−Ｅ９ ３′未瑞
の間に挿入した。 （ｂ） ｐＭＯＮ９８１０−ＰＶＸコートたんぱく質ｃ
ＤＮＡを、意味のない（アンチセンス）配向で、ｐＭＯ
Ｎ９８１８のＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｒｂｃＳ−
Ｅ９ ３′末端の間に挿入した。 （ｃ） ｐＭＯＮ９８１１−ＰＶＸコートたんぱく質コ
ード配列の５′断片を、意味のある配向で、ｐＭＯＮ９
８１８に挿入した。 （ｄ） ｐＭＯＮ９８１２−ＰＶＸコートたんぱく質コ
ード配列の５′断片を、意味のない配向で、ｐＭＯＮ９
８１８に挿入した。 （ｅ） ｐＭＯＮ９８１３−ＰＶＸコートたんぱく質コ
ード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯＮ９８１９のｒ
ｂｃＳ８ＢプロモーターとＥ９ ３′末端の間に挿入し
た。
ＮＡを、CａＭＶ３５Ｓ プロモーター（ｐＭＯＮ９８
１８）またはｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーター（ｐＭ
ＯＮ９８１８）のいずれかとｒｂｃＳ−Ｅ９ ３′末端
（Odell et al（1985））を用いて、両方の配向で、ｐ
ＭＯＮ５０５から誘導した発現ベクターに挿入した。Ｐ
ＶＸ コートたんぱく質遺伝子を発現させるために次に
示すベクターを作成し、例２に記述したアグロバクテリ
ウム介在の形質転換系を使用して、タバコ植物へ移入し
た。 （ａ） ｐＭＯＮ９８０９−ＰＶＸコー卜たんぱく質コ
ード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯＮ９８１８のＣ
ａＭＶ３５ＳプロモーターとｒｂｃＳ−Ｅ９ ３′未瑞
の間に挿入した。 （ｂ） ｐＭＯＮ９８１０−ＰＶＸコートたんぱく質ｃ
ＤＮＡを、意味のない（アンチセンス）配向で、ｐＭＯ
Ｎ９８１８のＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｒｂｃＳ−
Ｅ９ ３′末端の間に挿入した。 （ｃ） ｐＭＯＮ９８１１−ＰＶＸコートたんぱく質コ
ード配列の５′断片を、意味のある配向で、ｐＭＯＮ９
８１８に挿入した。 （ｄ） ｐＭＯＮ９８１２−ＰＶＸコートたんぱく質コ
ード配列の５′断片を、意味のない配向で、ｐＭＯＮ９
８１８に挿入した。 （ｅ） ｐＭＯＮ９８１３−ＰＶＸコートたんぱく質コ
ード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯＮ９８１９のｒ
ｂｃＳ８ＢプロモーターとＥ９ ３′末端の間に挿入し
た。
【０１１１】上記に従い、植物にＰＶＸを用いて接種を
行い、ウイルス耐性の水準を測定した。
行い、ウイルス耐性の水準を測定した。
【０１１２】ＡＭＶのｍＲＮＡと異なり、ポックスウイ
ルスのＲＮＡはポリアデニル化されており、このため
に、オリゴｄＴを第１鎖合成のプライマーとして使用
し、ＤＮＡポリメラーゼまたは鳥骨髄芽球症ウイルス逆
転写酵素を第２鎖合成に使用することが可能になる。こ
の例の始めに詳細に記述したように、２本鎖ＤＮＡの単
離と、植物中でコートたんぱく質配列の発現との操件を
行うことができる。
ルスのＲＮＡはポリアデニル化されており、このため
に、オリゴｄＴを第１鎖合成のプライマーとして使用
し、ＤＮＡポリメラーゼまたは鳥骨髄芽球症ウイルス逆
転写酵素を第２鎖合成に使用することが可能になる。こ
の例の始めに詳細に記述したように、２本鎖ＤＮＡの単
離と、植物中でコートたんぱく質配列の発現との操件を
行うことができる。
【０１１３】例８ トマト ゴールデン モザイク ウ
イルス コートたんぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成
物 トマト ゴールデン モザイク ウイルス（ＴＧＭＶ）
コートたんぱく質に対するｍＲＮＡの生産を起こすこ
とができるコード配列を含むＤＮＡ構成物を包含するプ
ラスミドを、以下のようにして構築した。プラスミド
ｐＢＨ４０４（Bisaro et al（1982））をＸｈｏ IIを
用いて消化し、ＴＧＭＶ コートたんぱく質（ＴＧＭＶ
ＣＰ）のコード配列を保有するヌクレオチド３１２か
ら１２８５におよぶ約１kbの断片（Hamilton et al（19
84））を単離した（図１６参照）。この断片を、ｐＭＯ
Ｎ２００をＮｄｅ Ｉを用いて開裂し９００bpのＮｄｅ
Ｉ断片を除くことにより構築したプラスミドであるｐＭ
ＯＮ５３０に挿入した。このようにしてｐＭＯＮ５０３
を得た。これをＨｉｎｄ IIIとＳｍａ Ｉを用いて開裂
し、同じくＨｉｎｄ IIIとＳｍａ Ｉを用いて開裂した
ｐＴＪＳ７５（Schmidhauser & Helinski（1985））と
混合した。ｐＴＪＳ７５の３．８kbのＨｉｎｄIIIとＳ
ｍａ Ｉ断片を含む生成したプラスミドを、８kbのｐＭ
ＯＮ５０３断片と結合させ、これをとり、ｐＭＯＮ５０
５と命名した。ｐＭＯＮ３１６由来のＣａＭＶ３５Ｓ−
ＮＯＳ 発現カセット（図３参照）を、２．４kbのＳｔ
ｕ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片上に単離し、Ｓｔｕ ＩとＨｉ
ｎｄ IIIを用いて開裂したｐＭＯＮ５０５ＤＮＡと混合
した。
イルス コートたんぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成
物 トマト ゴールデン モザイク ウイルス（ＴＧＭＶ）
コートたんぱく質に対するｍＲＮＡの生産を起こすこ
とができるコード配列を含むＤＮＡ構成物を包含するプ
ラスミドを、以下のようにして構築した。プラスミド
ｐＢＨ４０４（Bisaro et al（1982））をＸｈｏ IIを
用いて消化し、ＴＧＭＶ コートたんぱく質（ＴＧＭＶ
ＣＰ）のコード配列を保有するヌクレオチド３１２か
ら１２８５におよぶ約１kbの断片（Hamilton et al（19
84））を単離した（図１６参照）。この断片を、ｐＭＯ
Ｎ２００をＮｄｅ Ｉを用いて開裂し９００bpのＮｄｅ
Ｉ断片を除くことにより構築したプラスミドであるｐＭ
ＯＮ５３０に挿入した。このようにしてｐＭＯＮ５０３
を得た。これをＨｉｎｄ IIIとＳｍａ Ｉを用いて開裂
し、同じくＨｉｎｄ IIIとＳｍａ Ｉを用いて開裂した
ｐＴＪＳ７５（Schmidhauser & Helinski（1985））と
混合した。ｐＴＪＳ７５の３．８kbのＨｉｎｄIIIとＳ
ｍａ Ｉ断片を含む生成したプラスミドを、８kbのｐＭ
ＯＮ５０３断片と結合させ、これをとり、ｐＭＯＮ５０
５と命名した。ｐＭＯＮ３１６由来のＣａＭＶ３５Ｓ−
ＮＯＳ 発現カセット（図３参照）を、２．４kbのＳｔ
ｕ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片上に単離し、Ｓｔｕ ＩとＨｉ
ｎｄ IIIを用いて開裂したｐＭＯＮ５０５ＤＮＡと混合
した。
【０１１４】生成のプラスミド ｐＭＯＮ５３０（図１
６参照）Ｂｇｌ IIを用いて消化し、ＴＧＭＶ コート
たんぱく質コード配列を保有する１kbのＸｈｏ II断片
を挿入した。プラスミドは１kb断片を意味のある配向で
含んでいることを同定された。「ｐＭＯＮ４０１」と称
するこのプラスミドは、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＧＭＶ−Ｃ
Ｐ／ＮＯＳ 構成物を保有していた（図１６参照）。例
２に記述される方法と実質的に同じ方法により、タバコ
植物をｐＭＯＮ４０１を用いて形質転換した。カナマイ
シンに耐性であるこれらの植物の自家受精により、上に
詳述した方法に従ってウイルス耐性を試験できる実生後
代を得た。
６参照）Ｂｇｌ IIを用いて消化し、ＴＧＭＶ コート
たんぱく質コード配列を保有する１kbのＸｈｏ II断片
を挿入した。プラスミドは１kb断片を意味のある配向で
含んでいることを同定された。「ｐＭＯＮ４０１」と称
するこのプラスミドは、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＧＭＶ−Ｃ
Ｐ／ＮＯＳ 構成物を保有していた（図１６参照）。例
２に記述される方法と実質的に同じ方法により、タバコ
植物をｐＭＯＮ４０１を用いて形質転換した。カナマイ
シンに耐性であるこれらの植物の自家受精により、上に
詳述した方法に従ってウイルス耐性を試験できる実生後
代を得た。
【０１１５】例９ ＴＭＶ ＲＮＡに相補的なアンチセ
ンスＲＮＡの発現ベクター コートたんばく質に関するｍＲＮＡに対して相対的にア
ンチセンスの極性を有するＲＮＡを生産するように、Ｔ
ＭＶ−ＣＰ 遺伝子を中間体プラスミド（ｐＭＯＮ３１
６）に挿入する実験を行った。
ンスＲＮＡの発現ベクター コートたんばく質に関するｍＲＮＡに対して相対的にア
ンチセンスの極性を有するＲＮＡを生産するように、Ｔ
ＭＶ−ＣＰ 遺伝子を中間体プラスミド（ｐＭＯＮ３１
６）に挿入する実験を行った。
【０１１６】図１７に参照されるように、ＴＭＶ コー
トたんぱく質遺伝子を、酵素ＡｈａIIIおよびＢａｍＨ
Ｉを用いて中間体プラスミド（ｐＴＭ３７）から切取っ
た。この配向においては、ｍＲＮＡをコードする遺伝子
の５′末端はＡｈａ III部位の近くに位置する。Ａｈａ
III：ＢａｍＨＩ 断片を、ＢａｍＨＩとＳｍａ Ｉを用
いて既に消化したプラスミド ｐＵＣ１３に導入した。
トたんぱく質遺伝子を、酵素ＡｈａIIIおよびＢａｍＨ
Ｉを用いて中間体プラスミド（ｐＴＭ３７）から切取っ
た。この配向においては、ｍＲＮＡをコードする遺伝子
の５′末端はＡｈａ III部位の近くに位置する。Ａｈａ
III：ＢａｍＨＩ 断片を、ＢａｍＨＩとＳｍａ Ｉを用
いて既に消化したプラスミド ｐＵＣ１３に導入した。
【０１１７】コートたんぱく質遺伝子を、Ｅｃｏ ＲＩ
とＢａｍＨＩを用いる消化によってｐＵＣ１３から切取
った。このＤＮＡ断片を、酵素Ｂｇｌ IIとＥｃｏ ＲＩ
を用いて制限したｐＭＯＮ３１６（図３参照）に連結し
た。
とＢａｍＨＩを用いる消化によってｐＵＣ１３から切取
った。このＤＮＡ断片を、酵素Ｂｇｌ IIとＥｃｏ ＲＩ
を用いて制限したｐＭＯＮ３１６（図３参照）に連結し
た。
【０１１８】この配置においては、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターは、ＴＭＶ コートたんぱく質 ｍＲＮＡに相
補的なＲＮＡを生産する。このＲＮＡは次のものを包含
する（転写体５′末端から）。 （１） ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターから誘導した約
３０のヌクレオチド （２） ｃＤＮＡの第１鎖の調製に使用したヌククレオ
チド プライマーから誘導した約８のヌクレオチド （３） ＴＭＶ ＲＮＡのヌクレオチド （−）６３９５
（−） ５７０７ （４） ＮＯＳ ３′末端によって付与された約１５０
のヌクレオチド この構成物を植物に導入し、それらの植物に例２の記述
に従ってウイルス耐性の試験を行うことができる。
モーターは、ＴＭＶ コートたんぱく質 ｍＲＮＡに相
補的なＲＮＡを生産する。このＲＮＡは次のものを包含
する（転写体５′末端から）。 （１） ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターから誘導した約
３０のヌクレオチド （２） ｃＤＮＡの第１鎖の調製に使用したヌククレオ
チド プライマーから誘導した約８のヌクレオチド （３） ＴＭＶ ＲＮＡのヌクレオチド （−）６３９５
（−） ５７０７ （４） ＮＯＳ ３′末端によって付与された約１５０
のヌクレオチド この構成物を植物に導入し、それらの植物に例２の記述
に従ってウイルス耐性の試験を行うことができる。
【０１１９】例10 キューリ モザイク ウイルス（Ｃ
ｕＭＶ）コートたんぱく質遺伝子のクローニング ＲＮＡ ４が豊富であるＣｕＭＶ−Ｄ株（J．M．Kaper,
ＵＳＤＡ Agricultural Research Service, Beltsvill
e, Marylandより入手可能）の大きさに従って分別した
ゲノムＲＮＡを、ＣｕＭＶ ＲＮＡ分子当りのＡＭＰ残
基の概算値（estimated number）が約３０になるように
ポリアデニル化した。２本鎖ｃＤＮＡを合成するため
に、ウイッケンズら（Wickens et al（1978））の方法
論を第1鎖ｃＤＮＡの製造に適用した。更に詳しくは、
３μｇのポリアデニル化ＣｕＭＶ−ＲＮＡ４、１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１４０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１９ｍＭ β−メルカプト
エタノール、１．５μｇ（ｄＴ）１ ５、０．５ｍＭ ｄ
ＮＴＰ′ｓ、２０μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ （３
０００Ｃｉ／mmole、New England nuclear）、および、
４８単位のＡＭＶ逆転写酵素（life Sciense, Inc.）を
含む８０μｌの反応混合物を、４２℃で９０分間インキ
ュベートした。それから、４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ
を反応混合物に加え、続いてこれをフェノール／クロロ
ホルムで抽出し、その後、２０μｌの０．５トリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）で逆抽出した。１／３容の８Ｍ酢酸
アンモニウムおよび２容の工タノールを用いて連続して
２回沈澱させることにより、生成物を遊離のヌクレオチ
ドとして回収した。
ｕＭＶ）コートたんぱく質遺伝子のクローニング ＲＮＡ ４が豊富であるＣｕＭＶ−Ｄ株（J．M．Kaper,
ＵＳＤＡ Agricultural Research Service, Beltsvill
e, Marylandより入手可能）の大きさに従って分別した
ゲノムＲＮＡを、ＣｕＭＶ ＲＮＡ分子当りのＡＭＰ残
基の概算値（estimated number）が約３０になるように
ポリアデニル化した。２本鎖ｃＤＮＡを合成するため
に、ウイッケンズら（Wickens et al（1978））の方法
論を第1鎖ｃＤＮＡの製造に適用した。更に詳しくは、
３μｇのポリアデニル化ＣｕＭＶ−ＲＮＡ４、１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１４０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１９ｍＭ β−メルカプト
エタノール、１．５μｇ（ｄＴ）１ ５、０．５ｍＭ ｄ
ＮＴＰ′ｓ、２０μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ （３
０００Ｃｉ／mmole、New England nuclear）、および、
４８単位のＡＭＶ逆転写酵素（life Sciense, Inc.）を
含む８０μｌの反応混合物を、４２℃で９０分間インキ
ュベートした。それから、４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ
を反応混合物に加え、続いてこれをフェノール／クロロ
ホルムで抽出し、その後、２０μｌの０．５トリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）で逆抽出した。１／３容の８Ｍ酢酸
アンモニウムおよび２容の工タノールを用いて連続して
２回沈澱させることにより、生成物を遊離のヌクレオチ
ドとして回収した。
【０１２０】上記の反応から得たｃＤＮＡを乾燥させ、
４０μｌの水に再懸濁した。第２鎖合成にはガブラーと
ホフマンの方法（Gubler & Hoffman（1983））を適用し
た。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍＭ
ＫＣｌ、０．２mg／ml ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ′ｓ、３０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（New Eng1an
d Biolabs）、２０μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、お
よび、２単位のＲＮＡｓｅ Ｈ（ＢＲＬ）を、０．１ml
の容積中に含む反応混合物に、４０μｌの水中のｃＤＮ
Ａを加えた。まず、この反応混合物を１１℃で１時間イ
ンキュベートし、その後２２℃で１時間インキュベート
した。第1鎖ｃＤＮＡの合成について記述した同じ方法
で、生成物を回収した。
４０μｌの水に再懸濁した。第２鎖合成にはガブラーと
ホフマンの方法（Gubler & Hoffman（1983））を適用し
た。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍＭ
ＫＣｌ、０．２mg／ml ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ′ｓ、３０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（New Eng1an
d Biolabs）、２０μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、お
よび、２単位のＲＮＡｓｅ Ｈ（ＢＲＬ）を、０．１ml
の容積中に含む反応混合物に、４０μｌの水中のｃＤＮ
Ａを加えた。まず、この反応混合物を１１℃で１時間イ
ンキュベートし、その後２２℃で１時間インキュベート
した。第1鎖ｃＤＮＡの合成について記述した同じ方法
で、生成物を回収した。
【０１２１】文献（Huynh et al（1985））に開示され
た方法に従って、２本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏ ＲＩメチラ
ーゼを用いてメチル化し、リン酸化したＥｃｏ ＲＩリ
ンカー（New England Biolabs）に連結し、Ｅｃｏ ＲＩ
酵素で消化し、それから、過剰のリンカーから分離し
た。その後、ｃＤＮＡを、試料レーンと接したレーン中
に適用した標識ＤＮＡと共に、１％アガロースゲル上で
電気泳動した。標識をエチジウム ブロミド染色によっ
て可視化し、約９００〜１３００bpの大きさのｃＤＮＡ
を含むゲル薄片を切取った。ｃＤＮＡを電気溶出（elec
troelution）し、５μｇのグリコーゲン担体（Boehring
er Mannheim Biochemicals）の存在下で沈澱させ、１０
μｌの連結反応容積と相溶性である容積の水中に再懸濁
した。それから、ｃＤＮＡを室温で４時間、２０ngのＥ
ｃｏ ＲＩ消化リン酸化ｐＥＭＢＬ １２（＋）ＤＮＡに
連結させた。その後、生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ１
０１株中に形質転換させた。コロニーを、アンピシリン
耐性、並びに、０．６mgＸ−ＧａｌとＩＰＴＧを用いて
広げたプレート上の白色により選抜した。挿入物の大き
さを、ミニプレップ（miniprep）ＤＮＡ（Maniatis et
al（1982））のＥｃｏＲＩ消化によって決定した。
た方法に従って、２本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏ ＲＩメチラ
ーゼを用いてメチル化し、リン酸化したＥｃｏ ＲＩリ
ンカー（New England Biolabs）に連結し、Ｅｃｏ ＲＩ
酵素で消化し、それから、過剰のリンカーから分離し
た。その後、ｃＤＮＡを、試料レーンと接したレーン中
に適用した標識ＤＮＡと共に、１％アガロースゲル上で
電気泳動した。標識をエチジウム ブロミド染色によっ
て可視化し、約９００〜１３００bpの大きさのｃＤＮＡ
を含むゲル薄片を切取った。ｃＤＮＡを電気溶出（elec
troelution）し、５μｇのグリコーゲン担体（Boehring
er Mannheim Biochemicals）の存在下で沈澱させ、１０
μｌの連結反応容積と相溶性である容積の水中に再懸濁
した。それから、ｃＤＮＡを室温で４時間、２０ngのＥ
ｃｏ ＲＩ消化リン酸化ｐＥＭＢＬ １２（＋）ＤＮＡに
連結させた。その後、生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ１
０１株中に形質転換させた。コロニーを、アンピシリン
耐性、並びに、０．６mgＸ−ＧａｌとＩＰＴＧを用いて
広げたプレート上の白色により選抜した。挿入物の大き
さを、ミニプレップ（miniprep）ＤＮＡ（Maniatis et
al（1982））のＥｃｏＲＩ消化によって決定した。
【０１２２】６００bpから１３００bpの範囲にわたる挿
入物を有する１６のコロニーに、ジデオキシシークエン
シングによって更にスクリーニングを行い、文献（Goul
d &Symons（1982））に報告されているように、Ｘ株の
ＣＭＶコートたんぱく質に対する配列相同性の存在を決
定した。最良のクローンを完全にシークエンシングし、
ＣｕＭＶ ＣＰに対する全長さのｃＤＮＡを得たことを
確認した。ＣｕＭＶコートたんぱく質コード配列を、発
現ベクターｐＭＯＮ９８１８とｐＭＯＮ９８１９（前記
の例７を参照）中にクローニングすることができる。そ
の後、これらのベクターを使用して、ＣｕＭＶ コート
たんぱく質コード配列からの意味のある配列と意味のな
い（アンチセンス）配列を生産することができる。
入物を有する１６のコロニーに、ジデオキシシークエン
シングによって更にスクリーニングを行い、文献（Goul
d &Symons（1982））に報告されているように、Ｘ株の
ＣＭＶコートたんぱく質に対する配列相同性の存在を決
定した。最良のクローンを完全にシークエンシングし、
ＣｕＭＶ ＣＰに対する全長さのｃＤＮＡを得たことを
確認した。ＣｕＭＶコートたんぱく質コード配列を、発
現ベクターｐＭＯＮ９８１８とｐＭＯＮ９８１９（前記
の例７を参照）中にクローニングすることができる。そ
の後、これらのベクターを使用して、ＣｕＭＶ コート
たんぱく質コード配列からの意味のある配列と意味のな
い（アンチセンス）配列を生産することができる。
【０１２３】次のベクターを構築し、植物に移入させ
た。ｐＭＯＮ９８１６−ｐＭＯＮ９８１８中の意味のあ
る配向のＣｕＭＶ コートたんぱく質コード配列 ｐＭＯＮ９８１７−ｐＭＯＮ９８１８中の意味のない配
向のＣｕＭＶ コートたんぱく質コード配列 これらのベクターを例２に従って、アグロバクテリウム
細胞に導入し、生産したトマトおよびタバコ植物に形質
転換させた。上記に従って、これらの植物にＣｕＭＶを
接種し、ウイルス耐性の水準を決定することができる。
た。ｐＭＯＮ９８１６−ｐＭＯＮ９８１８中の意味のあ
る配向のＣｕＭＶ コートたんぱく質コード配列 ｐＭＯＮ９８１７−ｐＭＯＮ９８１８中の意味のない配
向のＣｕＭＶ コートたんぱく質コード配列 これらのベクターを例２に従って、アグロバクテリウム
細胞に導入し、生産したトマトおよびタバコ植物に形質
転換させた。上記に従って、これらの植物にＣｕＭＶを
接種し、ウイルス耐性の水準を決定することができる。
【０１２４】例11 ポテト リーフロール ウイルス由
来のＲＮＡの操作 精製したポテト リーフロール ウイルス （ＰＬＲ
Ｖ）（Dr. Peta Thomas,USDA Agricultural Research S
tation, prosser, Washingtonから入手）から、大きさ
が約６kbの完全なウイルスＲＮＡを単離した。このＲＮ
Ａを、大腸菌 ポリ（Ａ） ポリメラーゼを用いてポリ
アデニル化することができる。更に、上記に従って、ｃ
ＤＮＡの第1鎖をオリゴｄＴ プライミングにより合成
できる。その後、ガブラーとホフマン（Gubler & Hoffm
an（1983））に従い、ＲＮＡｓｅＨの存在下でＤＮＡ
ポリメラーゼＩを使用することによって第２のｃＤＮＡ
鎖を合成できる。
来のＲＮＡの操作 精製したポテト リーフロール ウイルス （ＰＬＲ
Ｖ）（Dr. Peta Thomas,USDA Agricultural Research S
tation, prosser, Washingtonから入手）から、大きさ
が約６kbの完全なウイルスＲＮＡを単離した。このＲＮ
Ａを、大腸菌 ポリ（Ａ） ポリメラーゼを用いてポリ
アデニル化することができる。更に、上記に従って、ｃ
ＤＮＡの第1鎖をオリゴｄＴ プライミングにより合成
できる。その後、ガブラーとホフマン（Gubler & Hoffm
an（1983））に従い、ＲＮＡｓｅＨの存在下でＤＮＡ
ポリメラーゼＩを使用することによって第２のｃＤＮＡ
鎖を合成できる。
【０１２５】上記の例10に従って、このようにして生産
した２本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏ ＲＩメチラーゼでメチル
化し、Ｅｃｏ ＲＩリンカーに連結し、それから、Ｅｃ
ｏ ＲＩで消化したｐＥＭＢＬ １２（＋）に連結するこ
とができる。生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ １０１（M
essing & Vieira（1982））に形質転換させ、それによ
って得た組換体クローンを、トーマス（Thomas（198
3））の記述に従い、ＰＬＲＶに対する抗体を使用して
スクリーニングすることができる。ウイルス コートた
んぱく質をコードしていることが同定されたｃＤＮＡ断
片は、成熟コートたんぱく質のＮＨ２末端アミノ酸に対
するコドンのすぐ隣（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ５′末端）
に、新たな制限部位およびＡＴＧ翻訳開始コドンを導入
することによって得られる。これはゾラーとスミスの方
法（Zoller & Smith（1982））によって行うことができ
る。
した２本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏ ＲＩメチラーゼでメチル
化し、Ｅｃｏ ＲＩリンカーに連結し、それから、Ｅｃ
ｏ ＲＩで消化したｐＥＭＢＬ １２（＋）に連結するこ
とができる。生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ １０１（M
essing & Vieira（1982））に形質転換させ、それによ
って得た組換体クローンを、トーマス（Thomas（198
3））の記述に従い、ＰＬＲＶに対する抗体を使用して
スクリーニングすることができる。ウイルス コートた
んぱく質をコードしていることが同定されたｃＤＮＡ断
片は、成熟コートたんぱく質のＮＨ２末端アミノ酸に対
するコドンのすぐ隣（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ５′末端）
に、新たな制限部位およびＡＴＧ翻訳開始コドンを導入
することによって得られる。これはゾラーとスミスの方
法（Zoller & Smith（1982））によって行うことができ
る。
【０１２６】例12 カリフラワー モザイク ウイルス
由来ＤＮＡの操作 カリフラワー モザイク ウイルス（ＣａＭＶ）のコー
トたんぱく質コード配列は、プラスミドｐＯＳ１（Hhow
arth et al（1981））をＡｃｃ Ｉを用いて開裂し、Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼのクレノー断片で処理し、ＢａｍＨ
Ｉで開裂することによって、１．６kbの断片上に単離す
ることができる。プラスミドそのものはDr．ロバート
シェファード（Dr. Robert Shepherd, University of K
entucky,Lexington）から入手できる。１．６kbの断片
にゲル上で電気泳動による分離を行った後、ＮＡ−４５
膜（Schleicher & Scheull. Keene, NH）を用いてそれ
を精製し、Ｅｃｏ ＲＩで消化したｐＭＯＮ３１６ ＤＮ
Ａと混合し、クレノー断片を用いて処理し、Ｂｇｌ II
を用いて消化することができる。
由来ＤＮＡの操作 カリフラワー モザイク ウイルス（ＣａＭＶ）のコー
トたんぱく質コード配列は、プラスミドｐＯＳ１（Hhow
arth et al（1981））をＡｃｃ Ｉを用いて開裂し、Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼのクレノー断片で処理し、ＢａｍＨ
Ｉで開裂することによって、１．６kbの断片上に単離す
ることができる。プラスミドそのものはDr．ロバート
シェファード（Dr. Robert Shepherd, University of K
entucky,Lexington）から入手できる。１．６kbの断片
にゲル上で電気泳動による分離を行った後、ＮＡ−４５
膜（Schleicher & Scheull. Keene, NH）を用いてそれ
を精製し、Ｅｃｏ ＲＩで消化したｐＭＯＮ３１６ ＤＮ
Ａと混合し、クレノー断片を用いて処理し、Ｂｇｌ II
を用いて消化することができる。
【０１２７】リガーゼで処理することによりＣａＭＶ
コートたんぱく質コード配列を含む組換体プラスミドを
得る。このプラスミドを上記に従って使用し、細胞を形
質転換させることができる。意味のある配向のコード配
列を有するプラスミドを保有するそれらの細胞は、Ｈｉ
ｎｄ IIIを用いるプラスミドＤＮＡの消化により、同定
することができる。つまり、そのようなＤＮＡは、１．
１kbおよび０．７kbのｈｉｎｄ III断片、並びに、プラ
スミドの残りに由来するより大きな断片を示す。それか
ら、正しく配向したＣａＭＶコートたんぱく質コード配
列を含むプラスミドＤＮＡをクローニングし、植物細胞
に導入し、それを今度は全植物へ再生することができ
る。これらの形質転換植物のウイルス耐性は、その後、
既に記述した基本的な方法に従って決定することができ
る。例えば、形質転換したタバコ植物の耐性は、タバコ
に感染するＣａＭＶ Ｗ２６０株、Ｗ２６２株およびＷ
２８３株（Gracia & Shepherd（1985））を用いる接種
によって試験することができる。
コートたんぱく質コード配列を含む組換体プラスミドを
得る。このプラスミドを上記に従って使用し、細胞を形
質転換させることができる。意味のある配向のコード配
列を有するプラスミドを保有するそれらの細胞は、Ｈｉ
ｎｄ IIIを用いるプラスミドＤＮＡの消化により、同定
することができる。つまり、そのようなＤＮＡは、１．
１kbおよび０．７kbのｈｉｎｄ III断片、並びに、プラ
スミドの残りに由来するより大きな断片を示す。それか
ら、正しく配向したＣａＭＶコートたんぱく質コード配
列を含むプラスミドＤＮＡをクローニングし、植物細胞
に導入し、それを今度は全植物へ再生することができ
る。これらの形質転換植物のウイルス耐性は、その後、
既に記述した基本的な方法に従って決定することができ
る。例えば、形質転換したタバコ植物の耐性は、タバコ
に感染するＣａＭＶ Ｗ２６０株、Ｗ２６２株およびＷ
２８３株（Gracia & Shepherd（1985））を用いる接種
によって試験することができる。
【０１２８】例13 ＭＡＳ（２′）プロモーターによっ
て制御されたＴＭＶコートたんぱく質コード配列を有す
るＤＮＡ構成物 Ｅｃｏ ＲＩ（２１，６３１）とＣｌａ Ｉ（２０，１３
８）によるオクトピン型ｐＴｉＡ６プラスミド Ｂａｍ
ＨＩ２断片を保有するプラスミドｐＮＷ３４Ｃ−２−１
（garfinkel et al（1981））から、ＭＡＳプロモータ
ーを保有すＤＮＡ断片を切取った。（括弧内の数値は、
オクトピン型Ｔｉプラスミド Ｔ−ＤＮＡ配列のベーカ
ーら（Barker et al（1983a））の発表配列から取った
開裂部位の座標である。）生成した１５０３bpの断片を
精製し、Ｅｃｏ ＲＩおよびＣｌａ Ｉ開裂ｐＭＯＮ５０
５（Horsch & Klee（1986））に挿入して、ＰＭＯＮ７
０６を生産した。ＮＯＳ３′末端を、Ｂｇｌ IIおよび
ＢａｍＨＩを用いてｐＭＯ５３０から切取った。２９８
bpのＮＯＳ３′断片を、ｐＭＯＮ７０６のＭＡＳプロモ
ーターの３′末端に隣接するＢｇｌ II部位に導入し、
ｐＭＯＮ７０７を得た。
て制御されたＴＭＶコートたんぱく質コード配列を有す
るＤＮＡ構成物 Ｅｃｏ ＲＩ（２１，６３１）とＣｌａ Ｉ（２０，１３
８）によるオクトピン型ｐＴｉＡ６プラスミド Ｂａｍ
ＨＩ２断片を保有するプラスミドｐＮＷ３４Ｃ−２−１
（garfinkel et al（1981））から、ＭＡＳプロモータ
ーを保有すＤＮＡ断片を切取った。（括弧内の数値は、
オクトピン型Ｔｉプラスミド Ｔ−ＤＮＡ配列のベーカ
ーら（Barker et al（1983a））の発表配列から取った
開裂部位の座標である。）生成した１５０３bpの断片を
精製し、Ｅｃｏ ＲＩおよびＣｌａ Ｉ開裂ｐＭＯＮ５０
５（Horsch & Klee（1986））に挿入して、ＰＭＯＮ７
０６を生産した。ＮＯＳ３′末端を、Ｂｇｌ IIおよび
ＢａｍＨＩを用いてｐＭＯ５３０から切取った。２９８
bpのＮＯＳ３′断片を、ｐＭＯＮ７０６のＭＡＳプロモ
ーターの３′末端に隣接するＢｇｌ II部位に導入し、
ｐＭＯＮ７０７を得た。
【０１２９】生成したｐＭＯＮ７０７中のＭＡＳ プロ
モーターＮＯＳ３′カセットを、Ｓｔｕ ＩとＨｉｎｄ
IIIを用いてｐＭＯＮ７０７を開裂し、それから、ＮＯ
Ｓ−ＮＰＴ II′−ＮＯＳ キメラ カナマイシン耐性
遺伝子およびＭＡＳ プロモーター ＮＯＳ３′カセッ
トを保有する３．２kbの断片を単離することにより、コ
インテグレート型ベクターに移入した。この断片を、ｐ
ＭＯＮ２００の７．７kbのＳｔｕ Ｉ−ｔｏ−Ｈｉｎｄ
III断片に付加した。生成のプラスミド、ｐＭＯＮ９７
４１はｐＭＯＮ３１６の類似物であるが、ＭＡＳプロモ
ーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと置換わった発現
カセットを含んでいる。
モーターＮＯＳ３′カセットを、Ｓｔｕ ＩとＨｉｎｄ
IIIを用いてｐＭＯＮ７０７を開裂し、それから、ＮＯ
Ｓ−ＮＰＴ II′−ＮＯＳ キメラ カナマイシン耐性
遺伝子およびＭＡＳ プロモーター ＮＯＳ３′カセッ
トを保有する３．２kbの断片を単離することにより、コ
インテグレート型ベクターに移入した。この断片を、ｐ
ＭＯＮ２００の７．７kbのＳｔｕ Ｉ−ｔｏ−Ｈｉｎｄ
III断片に付加した。生成のプラスミド、ｐＭＯＮ９７
４１はｐＭＯＮ３１６の類似物であるが、ＭＡＳプロモ
ーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと置換わった発現
カセットを含んでいる。
【０１３０】ＴＭＶ-ＣＰコード配列は、例２の記述に
従って、または、アベルら（Abel etal（1986））が開
示するようにＢｇｌ IIとＢａｍＨＩを用いてｐＴＭ３
１９ＤＮＡを消化することによって、得ることができ
る。それから、７００bpのＣＰコード断片をＢｇｌ II
を用いて開裂したｐＭＯＮ９７４１に挿入できる。プロ
モーターおよびＮＯＳ３′に関して意味のある配向でＣ
Ｐ挿入物を有するプラスミドは、Ｂｇｌ IIとＥｃｏ Ｒ
Ｉを用いてプラスミド ＤＮＡを消化し、ＭＡＳプロモ
ーターを１．５kbの断片上に、更に、ＣＰコード配列を
７００bpの断片上に放出させることにより、同定でき
る。生成のプラスミドをＡ．タメファシエンスに交配さ
せ、ＭＡＳ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ３′構成物を保有す
るＡ．タメファシエンス細胞を、上記に従って、形質転
換したタバコ植物およびトマト植物を得るために使用で
きる。既に記述した方法で、形質転換した植物のウイル
ス耐性を試験することができる。
従って、または、アベルら（Abel etal（1986））が開
示するようにＢｇｌ IIとＢａｍＨＩを用いてｐＴＭ３
１９ＤＮＡを消化することによって、得ることができ
る。それから、７００bpのＣＰコード断片をＢｇｌ II
を用いて開裂したｐＭＯＮ９７４１に挿入できる。プロ
モーターおよびＮＯＳ３′に関して意味のある配向でＣ
Ｐ挿入物を有するプラスミドは、Ｂｇｌ IIとＥｃｏ Ｒ
Ｉを用いてプラスミド ＤＮＡを消化し、ＭＡＳプロモ
ーターを１．５kbの断片上に、更に、ＣＰコード配列を
７００bpの断片上に放出させることにより、同定でき
る。生成のプラスミドをＡ．タメファシエンスに交配さ
せ、ＭＡＳ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ３′構成物を保有す
るＡ．タメファシエンス細胞を、上記に従って、形質転
換したタバコ植物およびトマト植物を得るために使用で
きる。既に記述した方法で、形質転換した植物のウイル
ス耐性を試験することができる。
【０１３１】例14 エレクトロポーレーション技術を使
用する遊離ＤＮＡベクターによる植物細胞の形質転換 以下の説明により、ウイルス病耐性を得るために、プラ
スミドＤＮＡを外膜を除去した種々の植物細胞（プロト
プラスト）に効果的に導入するアグロバクテリウムに基
づかない遊離のＤＮＡ受渡し（delivery）法を概説す
る。
用する遊離ＤＮＡベクターによる植物細胞の形質転換 以下の説明により、ウイルス病耐性を得るために、プラ
スミドＤＮＡを外膜を除去した種々の植物細胞（プロト
プラスト）に効果的に導入するアグロバクテリウムに基
づかない遊離のＤＮＡ受渡し（delivery）法を概説す
る。
【０１３２】Ａ．双子葉類の種におけるプロトプラスト
の単離および培養 ダイズ［Glycine max（ＧＭ）］、ペチュニア［Petunia
hybrida Mitchell（ＭＰ４）］およびニンジン［Daucu
s carota（ＴＣ）］由来の細胞培養をウィドホルム（Wi
dholm（1977））に従い、ＴＣおよびＧＭに対しては
０．４mg／ｌの２，４−Ｄ、あるいは、ＭＰ４に対して
は０．２mg／ｌのρ−クロロフェノキシ酢酸を含む５０
mlのＭＳ培養基（Murashige & Skoog（1962））中で、
旋回振とう器上の２５０mlエルレンマイヤー フラスコ
（１３５rpm、２７°〜２８℃）中に成長させた。
の単離および培養 ダイズ［Glycine max（ＧＭ）］、ペチュニア［Petunia
hybrida Mitchell（ＭＰ４）］およびニンジン［Daucu
s carota（ＴＣ）］由来の細胞培養をウィドホルム（Wi
dholm（1977））に従い、ＴＣおよびＧＭに対しては
０．４mg／ｌの２，４−Ｄ、あるいは、ＭＰ４に対して
は０．２mg／ｌのρ−クロロフェノキシ酢酸を含む５０
mlのＭＳ培養基（Murashige & Skoog（1962））中で、
旋回振とう器上の２５０mlエルレンマイヤー フラスコ
（１３５rpm、２７°〜２８℃）中に成長させた。
【０１３３】１０mlパック（packed）細胞容積の対数成
長している懸濁培養細胞を、１０％マンニトールと０．
１％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ｐＨ５．７）とに溶解した
酵素４０ml中で１２時間インキュベートすることによ
り、ＧＭおよびＴＣ由来のプロトプラストを、それぞれ
生産した。酵素混合物は、２％セルラーゼＲ−１０（Ki
nki Yakult，Nishinomiya，Japan）、０．１％マセロザ
イム（Macerozyme）Ｒ−１０（Kinki Yakult）、およ
び、０．５％ペクトラヤーゼ（Pectolayaze） Ｙ−２
３（Seishin Pharmaceutical Co． Ltd., Noda, Chiba,
Japan）を含んでいた。生成のプロトプラストは、ハウ
プトマンとウィンドホルム（Hauptman & Windholm（198
4））の開示に従って、単離、精製および培養した。
長している懸濁培養細胞を、１０％マンニトールと０．
１％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ｐＨ５．７）とに溶解した
酵素４０ml中で１２時間インキュベートすることによ
り、ＧＭおよびＴＣ由来のプロトプラストを、それぞれ
生産した。酵素混合物は、２％セルラーゼＲ−１０（Ki
nki Yakult，Nishinomiya，Japan）、０．１％マセロザ
イム（Macerozyme）Ｒ−１０（Kinki Yakult）、およ
び、０．５％ペクトラヤーゼ（Pectolayaze） Ｙ−２
３（Seishin Pharmaceutical Co． Ltd., Noda, Chiba,
Japan）を含んでいた。生成のプロトプラストは、ハウ
プトマンとウィンドホルム（Hauptman & Windholm（198
4））の開示に従って、単離、精製および培養した。
【０１３４】ＭＰ４由来のメゾフィル（mesophyll））
プロトプラストを、使用した酵素混合物が懸濁培養に用
いたものと同一だった以外はフレーリーら（Fraley et
al（1984））の開示に従って、単離し培養した。
プロトプラストを、使用した酵素混合物が懸濁培養に用
いたものと同一だった以外はフレーリーら（Fraley et
al（1984））の開示に従って、単離し培養した。
【０１３５】Ｂ．単子葉類の種におけるプロトプラスト
の単離および培養 コムギ［Triticum monococcum（ＴＭ）およびTriticum
aetiuum（ＴＡ）、Maddockら（1983）およびOzias−Aki
nsとVasil（1983）により開示］、エレファント グラ
ス［Pennisetum purpureum（ＰＰ）、Vasilら（1983）
およびKarlssonとVasil（1986）により開示］、ギニア
グラス［Panicum maximum（ＰＭ）、LuとVasil（198
1）およびKarlssonとVasil（1986）により開示］、イネ
［Oryza sativa（ＯＳ）、Heyserら（1983）およびYama
daら（1986）により開示］、コーン［Zea mays（Ｚ
Ｍ）、Meadows（1982）により開示］、サトウキビ［Sac
charum officinarum（ＳＣ）、HoとVasil（1983）およ
びSrinivasinとVasil（1985）により開示］、および、
ペニセタム アメリカナム（Pennisetum americanum）
とＰ．プルプレウム（P. purpureum）およびＰ．スクア
マラタム（P. squamulatum）の間の複交雑（double cro
ss）トリスペシフィック（trispecific）ハイブリッド
（ＰＡＰＳ）［DujardidnとHanna（1984）により開示］
から単子葉類の細胞を採取した。ＰＭおよびＰＡＰＳの
懸濁培養を、５％ココナット ミルクおよび２mg／ｌ
２，４−Ｄを含む変形ＭＳ培地（Vasil & Vasil（198
1））中で成長させた。一方、ＳＣ培養に対して使用し
たＭＳ培地は、更に５００mg／ｌのカゼイン加水分解物
を含んでいた。ＴＭ懸濁培養は、ダディッツら（Dudits
et al（1977））に従って、脂質培地中で成長させた。
他の単子葉類の細胞培養は、それぞれ上に引用した文献
に従って成長させた。週に２度継代培養（subculture）
したＴＭとＰＡＰＳを除き、全ての懸濁培養は、３５ml
の培地中に２〜８mlの接種物を用いて、７日の継代培養
で成長させた。プロトプラスト単離に先だって、４〜５
日目に、懸濁を２５〜３５mlの培地中に５〜８mlの接種
物を用いて継代培養した。
の単離および培養 コムギ［Triticum monococcum（ＴＭ）およびTriticum
aetiuum（ＴＡ）、Maddockら（1983）およびOzias−Aki
nsとVasil（1983）により開示］、エレファント グラ
ス［Pennisetum purpureum（ＰＰ）、Vasilら（1983）
およびKarlssonとVasil（1986）により開示］、ギニア
グラス［Panicum maximum（ＰＭ）、LuとVasil（198
1）およびKarlssonとVasil（1986）により開示］、イネ
［Oryza sativa（ＯＳ）、Heyserら（1983）およびYama
daら（1986）により開示］、コーン［Zea mays（Ｚ
Ｍ）、Meadows（1982）により開示］、サトウキビ［Sac
charum officinarum（ＳＣ）、HoとVasil（1983）およ
びSrinivasinとVasil（1985）により開示］、および、
ペニセタム アメリカナム（Pennisetum americanum）
とＰ．プルプレウム（P. purpureum）およびＰ．スクア
マラタム（P. squamulatum）の間の複交雑（double cro
ss）トリスペシフィック（trispecific）ハイブリッド
（ＰＡＰＳ）［DujardidnとHanna（1984）により開示］
から単子葉類の細胞を採取した。ＰＭおよびＰＡＰＳの
懸濁培養を、５％ココナット ミルクおよび２mg／ｌ
２，４−Ｄを含む変形ＭＳ培地（Vasil & Vasil（198
1））中で成長させた。一方、ＳＣ培養に対して使用し
たＭＳ培地は、更に５００mg／ｌのカゼイン加水分解物
を含んでいた。ＴＭ懸濁培養は、ダディッツら（Dudits
et al（1977））に従って、脂質培地中で成長させた。
他の単子葉類の細胞培養は、それぞれ上に引用した文献
に従って成長させた。週に２度継代培養（subculture）
したＴＭとＰＡＰＳを除き、全ての懸濁培養は、３５ml
の培地中に２〜８mlの接種物を用いて、７日の継代培養
で成長させた。プロトプラスト単離に先だって、４〜５
日目に、懸濁を２５〜３５mlの培地中に５〜８mlの接種
物を用いて継代培養した。
【０１３６】それぞれの単子葉類細胞型に開するプロト
プラストを、バジルら（Vasil et al（1983））の開示
に従い、３ｍＭ ＭＥＳ、０．４５Ｍマンニトール、７
ｍＭＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および０．７ｍＭ ＮａＨ
２ＰＯ４ＯＨ（ｐＨ５．６）に溶解した種々の酵素混合
物を使用して、単離した。酵素混合物は、ＴＭおよびＰ
Ｍに対しては、１．０％セルラーゼ ＲＳ（Kinki Yaku
lt）と０．８％ペクチナーゼ（Sigma）を；ＳＣに対し
ては、２％セルラーゼ ＲＳと０．７％ペクチナーゼ
を；ＰＰに対しては、３％セルラーゼ Ｒ−１０と０．
７％ペクチナーゼを；ＰＡＰＳに対しては、２．５％セ
ルラーゼ Ｒ−１０と０．７５％ペクチナーゼを含んで
いた。
プラストを、バジルら（Vasil et al（1983））の開示
に従い、３ｍＭ ＭＥＳ、０．４５Ｍマンニトール、７
ｍＭＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および０．７ｍＭ ＮａＨ
２ＰＯ４ＯＨ（ｐＨ５．６）に溶解した種々の酵素混合
物を使用して、単離した。酵素混合物は、ＴＭおよびＰ
Ｍに対しては、１．０％セルラーゼ ＲＳ（Kinki Yaku
lt）と０．８％ペクチナーゼ（Sigma）を；ＳＣに対し
ては、２％セルラーゼ ＲＳと０．７％ペクチナーゼ
を；ＰＰに対しては、３％セルラーゼ Ｒ−１０と０．
７％ペクチナーゼを；ＰＡＰＳに対しては、２．５％セ
ルラーゼ Ｒ−１０と０．７５％ペクチナーゼを含んで
いた。
【０１３７】それから、単離した単子葉類プロトプラス
トをカオとミカイルク（Kao & Michayluk（1975））に
より変形された８ｐ培地（Vasil & Vasil（1980））中
で培養した。この培養基は、０．４〜０．５Ｍグルコー
ス、０．５〜１．０mg／ｌ ２，４−Ｄおよび０．２mg
／ｌゼアチンを含んでいた。これを1週間後にプロトプ
ラスト培養基を用いて１：２．３に希釈した。ＰＡＰＳ
およびＴＭのコロニー形成率（plating efficiency）を
測定するために、２〜３週間後に、２mlの元のプロトプ
ラスト培養と等価な量を、０．４％のシープラーク（Se
aplaque） アガロース（ＦＭＣ）を用いて３６mlに希
釈した。それから、希釈した培養の３mlを、１０cmペト
リ皿の０．６％アガロースを含む同じ培地の層上にプレ
ートした。
トをカオとミカイルク（Kao & Michayluk（1975））に
より変形された８ｐ培地（Vasil & Vasil（1980））中
で培養した。この培養基は、０．４〜０．５Ｍグルコー
ス、０．５〜１．０mg／ｌ ２，４−Ｄおよび０．２mg
／ｌゼアチンを含んでいた。これを1週間後にプロトプ
ラスト培養基を用いて１：２．３に希釈した。ＰＡＰＳ
およびＴＭのコロニー形成率（plating efficiency）を
測定するために、２〜３週間後に、２mlの元のプロトプ
ラスト培養と等価な量を、０．４％のシープラーク（Se
aplaque） アガロース（ＦＭＣ）を用いて３６mlに希
釈した。それから、希釈した培養の３mlを、１０cmペト
リ皿の０．６％アガロースを含む同じ培地の層上にプレ
ートした。
【０１３８】Ｃ．エレクトロポーレーションによる遊離
ＤＮＡ受渡し カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの存在
下で、ジンマーマン（Zimmerman）細胞融合系（ＧＣＡ
Precision）、または、キャパシター ディスチャー
ジ バンク（Fromm et al（1985））を用いて、プロト
プラストにエレクトロポーレーションを行った。ジンマ
ーマン細胞融合系を用いるエレクトロポーレーション
は、ジンマーマン ヘリカル フュージョン チャンバ
ー中で、または、ポッターら（Potter et al（1984））
の方法に従ってキュベットと白金またはアルミニウム箔
から構成されたエレクトロポーレーション室中で行っ
た。パルス（直流２４０Ｖ）を、それぞれ９のパルスか
らなるパルス列として９９９．９μsecで与えた。それ
ぞれのパルス列を、プロトプラスト洗浄溶液中、５０μ
ｇの子ウシ胸線ＤＮＡを伴ってまたはそれを伴わずに１
４μｇのプラスミド ＤＮＡの存在下で、１回、１０
回、５０回および１００回与えた。
ＤＮＡ受渡し カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの存在
下で、ジンマーマン（Zimmerman）細胞融合系（ＧＣＡ
Precision）、または、キャパシター ディスチャー
ジ バンク（Fromm et al（1985））を用いて、プロト
プラストにエレクトロポーレーションを行った。ジンマ
ーマン細胞融合系を用いるエレクトロポーレーション
は、ジンマーマン ヘリカル フュージョン チャンバ
ー中で、または、ポッターら（Potter et al（1984））
の方法に従ってキュベットと白金またはアルミニウム箔
から構成されたエレクトロポーレーション室中で行っ
た。パルス（直流２４０Ｖ）を、それぞれ９のパルスか
らなるパルス列として９９９．９μsecで与えた。それ
ぞれのパルス列を、プロトプラスト洗浄溶液中、５０μ
ｇの子ウシ胸線ＤＮＡを伴ってまたはそれを伴わずに１
４μｇのプラスミド ＤＮＡの存在下で、１回、１０
回、５０回および１００回与えた。
【０１３９】キャパシター バンクは、１個の１００μ
Ｆキャパシターと１個の２４００μＦキャパシター（Ma
llory）と共に、それぞれ４０、１１０、２４０、３４
０μＦのキャパシターの４個を含むように構成した。キ
ャパシターは個々にまたは平行に充電と放電を行うこと
ができた。パルス放電は、２重チャンネル記録オシロス
コープ（Tectronice モデル ５８４Ａ）を使用して監
視した。アンペア数はエレクトロポーレーションの間に
１個の１オーム抵抗にかかる放電を測定することによっ
て決定した。
Ｆキャパシターと１個の２４００μＦキャパシター（Ma
llory）と共に、それぞれ４０、１１０、２４０、３４
０μＦのキャパシターの４個を含むように構成した。キ
ャパシターは個々にまたは平行に充電と放電を行うこと
ができた。パルス放電は、２重チャンネル記録オシロス
コープ（Tectronice モデル ５８４Ａ）を使用して監
視した。アンペア数はエレクトロポーレーションの間に
１個の１オーム抵抗にかかる放電を測定することによっ
て決定した。
【０１４０】エレクトロポーレーションに先だって、プ
ロトプラストを、１０ｍＭ Hepes、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、および、０．２Ｍマンニトー
ル（ｐＨ７．２）中で１度洗浄し、それから、同じ緩衝
液（Fromm et al（1985））を用いて約３×１０６プロ
トプラスト／mlの密度にした。１mlの再懸濁プロトプラ
ストに２０mlのプラスミド ＤＮＡを加え、混合した。
このプロトプラストに種々の電圧と容量でエレクトロポ
ーレーションを行った。プロトプラストは氷上に約１０
分間保ち、その後、液体培養基中でのプレーティングを
行った。
ロトプラストを、１０ｍＭ Hepes、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、および、０．２Ｍマンニトー
ル（ｐＨ７．２）中で１度洗浄し、それから、同じ緩衝
液（Fromm et al（1985））を用いて約３×１０６プロ
トプラスト／mlの密度にした。１mlの再懸濁プロトプラ
ストに２０mlのプラスミド ＤＮＡを加え、混合した。
このプロトプラストに種々の電圧と容量でエレクトロポ
ーレーションを行った。プロトプラストは氷上に約１０
分間保ち、その後、液体培養基中でのプレーティングを
行った。
【０１４１】種々のエレクトロポーレーション処理によ
って細胞溶解された双子葉類プロトプラストの数を評価
するために、パルス放電を与える前および直後にＴＣプ
ロトプラストの密度を測定した。測定値は残存割合で表
わした。生存率測定は、エレクトロポーレーションの２
日後のフェノサフラニン（phenosafranin）染料排除（W
idholm（1972））を基礎にした。結果はエレクトロポー
レーションを行っていない対照と比較したパーセント生
存率で表わした。エレクトロポーレーションを行った双
子葉類プロトプラストのコロニー形成率評価は、培養の
３〜４週後に形成されたコロニー数を数えることによっ
て得た。これを、エレクトロポーレーションを行ってい
ない対照の割合として表わした。
って細胞溶解された双子葉類プロトプラストの数を評価
するために、パルス放電を与える前および直後にＴＣプ
ロトプラストの密度を測定した。測定値は残存割合で表
わした。生存率測定は、エレクトロポーレーションの２
日後のフェノサフラニン（phenosafranin）染料排除（W
idholm（1972））を基礎にした。結果はエレクトロポー
レーションを行っていない対照と比較したパーセント生
存率で表わした。エレクトロポーレーションを行った双
子葉類プロトプラストのコロニー形成率評価は、培養の
３〜４週後に形成されたコロニー数を数えることによっ
て得た。これを、エレクトロポーレーションを行ってい
ない対照の割合として表わした。
【０１４２】形質転換したコロニーは、フロムら（From
m et al（1986））の開示に従い、カナマイシンを含む
培地に移した後に選抜した。同様にして、工学的に処理
したウイルス コートたんぱく質とカナマイシン選抜可
能標識とを含むｐＭＯＮ３１９、ｐＭＯＮ４０１、ｐＭ
ＯＮ９８００、ｐＭＯＮ９８０９、および、ｐＭＯＮ９
８１６などのプラスミドを遊離ＤＮＡ形質転換に使用す
ることができる。再生植物は、例２に記述した方法を使
用して、コートたんぱく質ｍＲＮＡとたんぱく質生産と
を監視することができる。
m et al（1986））の開示に従い、カナマイシンを含む
培地に移した後に選抜した。同様にして、工学的に処理
したウイルス コートたんぱく質とカナマイシン選抜可
能標識とを含むｐＭＯＮ３１９、ｐＭＯＮ４０１、ｐＭ
ＯＮ９８００、ｐＭＯＮ９８０９、および、ｐＭＯＮ９
８１６などのプラスミドを遊離ＤＮＡ形質転換に使用す
ることができる。再生植物は、例２に記述した方法を使
用して、コートたんぱく質ｍＲＮＡとたんぱく質生産と
を監視することができる。
【図１】ウイルス病耐性生物試験の概略図である。
【図２】ダイズ モザイク ウイルス コートたんぱく
質（ＳＭＶ ＣＰ）の部分アミノ酸配列図である。
質（ＳＭＶ ＣＰ）の部分アミノ酸配列図である。
【図３】ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成
物を含む植物形質転換ベクター図である。
物を含む植物形質転換ベクター図である。
【図４】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターを含む発現ベク
ター図である。
ター図である。
【図５】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター、マルチリンカ
ーおよびノパリン シンターゼ断片の完全配列図であ
る。
ーおよびノパリン シンターゼ断片の完全配列図であ
る。
【図６】トランスジェニックなタバコ植物に対する異な
る水準のウイルス接触の効果のデータ図である。
る水準のウイルス接触の効果のデータ図である。
【図７】トランスジェニックなトマト植物に対する異な
る水準のウイルス接触の効果のデータ図である。
る水準のウイルス接触の効果のデータ図である。
【図８】ウイルス耐性の比較のデータ図である。
【図９】交叉免疫の導入のデータ図である。
【図１０】ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの最初の
単離と中間体ベクターへの導入を示す系統図である。
単離と中間体ベクターへの導入を示す系統図である。
【図１１】ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの部分ヌ
クレオチド配列図である。
クレオチド配列図である。
【図１２】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターをｓｓＲＵＢ
ＩＳＣＯ プロモーターに置換したＤＮＡ構成物の製造
の系統図である。
ＩＳＣＯ プロモーターに置換したＤＮＡ構成物の製造
の系統図である。
【図１３】アルファルファ モザイク ウイルスのコー
トたんぱく質（ＡＭＶ ＣＰ）をコードするｃＤＮＡの
製造の系統図である。
トたんぱく質（ＡＭＶ ＣＰ）をコードするｃＤＮＡの
製造の系統図である。
【図１４】ポテト ウイルス Ｘのコートたんぱく質遺
伝子（ＰＶＸ ＣＰ）を含む植物ベクターの製造の系統
図である。
伝子（ＰＶＸ ＣＰ）を含む植物ベクターの製造の系統
図である。
【図１５】ＰＶＸ ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列図で
ある。
ある。
【図１６】トマト ゴールデン モザイク ウイルス
コー卜たんぱく質（ＴＧＭＶ ＣＰ）コードするヌクレ
オチド断片の単離の系統図である。
コー卜たんぱく質（ＴＧＭＶ ＣＰ）コードするヌクレ
オチド断片の単離の系統図である。
【図１７】ＴＭＶ ＲＮＡに対するアンチセンス相補体
をコードするＤＮＡを含む植物ベクターの製造の系統図
である。
をコードするＤＮＡを含む植物ベクターの製造の系統図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 594024752 ワシントン・ユニバーシテイー ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩ ＴＹ アメリカ合衆国、ミズーリ州 63130、セ ント・ルイス、キャンパス・ボックス 1137 (72)発明者 ロジャー・エヌ・ビーチイ アメリカ合衆国、ミズーリ州 63124，ラ デユー、ゴッドウイン・レーン 17 (72)発明者 ロバート・テイー・フラレイ アメリカ合衆国、ミズーリ州 63131，セ ント・ルイス、トッピング・エステーツ 12917 (72)発明者 ステイーブン・ジー・ロジャース アメリカ合衆国、ミズーリ州 63017，チ ェスターフィールド、テインバーブルッ フ・ドライブ 14788
Claims (14)
- 【請求項１】 植物ウイルスによる感染に対して耐性で
ある遺伝的に形質転換した単子葉植物を生産する方法で
あって、（a）植物細胞のゲノムに、 （ｉ）植物細胞中で機能してｍＲＮＡポリヌクレオチド
の生産を起こすプロモーターと、 （ii）コートたんぱく質をコードする配列を有するＤＮ
Ａポリヌクレオチドと、 （iii）植物細胞中で機能して該ｍＲＮＡポリヌクレオ
チドの３′末端へのポリアデニレートの付加を起こす
３′非翻訳領域とを包含し、 該植物ウイルスが、バーレイ イエロー ドゥワーフ、
コムギ ストリーク、コムギ スピンドル ストリー
ク、メイズ ドゥワーフ モザイク及びメイズクロロテ
ィック ドゥワーフからなる群から選ばれるものであ
り、かつ、該植物細胞が該ＤＮＡ分子で形質転換され得
るものである、組換体２本鎖ＤＮＡ分子を挿入する工
程、（b）コートたんぱく質を発現する形質転換された
植物細胞を得る工程、及び（c）形質転換植物細胞から
該植物ウイルスによる感染に対する耐性が増した遺伝的
に形質転換された植物を再生する工程を包含する形質転
換植物の生産方法。 - 【請求項２】 該コートたんぱく質が、その突然変異
体、トランケート体、融合体、その他の変異体である特
許請求の範囲第1項記載の方法。 - 【請求項３】 プロモーターが植物ＤＮＡウイルス プ
ロモーターである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】 プロモーターが植物遺伝子プロモーター
である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】 プロモーターがリブロース ビスホスフ
ェート カルボキシラーゼ 小サブユニット プロモー
ターである特許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】 ＤＮＡ配列が、２本鎖ウイルス ＤＮ
Ａ、又は、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスから合成した２本
鎖ＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】 ＤＮＡ配列が、コートたんぱく質が形質
転換植物中に存在するように形質転換植物中で発現され
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項８】 プロモーターがマンノピン シンターゼ
プロモーターである特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項９】（a）植物細胞中で機能してｍＲＮＡポリ
ヌクレオチドの生産を起こすプロモーターと、（b）コ
ートたんぱく質をコードする配列を有するＤＮＡポリヌ
クレオチドと、（c）植物細胞中で機能して該ＲＮＡ配
列の３′末端へのポリアデニレートの付加を起こす３′
非翻訳領域とを包含し、 該植物ウイルスが、バーレイ イエロー ドゥワーフ、
コムギ ストリーク、コムギ スピンドル ストリー
ク、メイズ ドゥワーフ モザイク及びメイズクロロテ
ィック ドゥワーフからなる群から選ばれるものであ
り、かつ、該植物細胞が該ＤＮＡ分子で形質転換され得
るものである、ＤＮＡ分子を含有する形質転換植物細胞
を包含する植物ウイルスによる感染に対して耐性である
分化単子葉植物。 - 【請求項１０】 該コートたんぱく質が、その突然変異
体、トランケート体、融合体、その他の変異体である特
許請求の範囲第９項記載の植物。 - 【請求項１１】 ＤＮＡ配列が、コートたんぱく質が植
物中に存在するように発現される特許請求の範囲第９項
記載の植物。 - 【請求項１２】 植物が、イネ科に属する特許請求の範
囲第９項記載の植物。 - 【請求項１３】 ＤＮＡ配列が、コートたんぱく質ポリ
ヌクレオチド配列のｍＲＮＡが上記植物中に存在するよ
うに発現される特許請求の範囲第９項記載の植物。 - 【請求項１４】 ウイルス耐性を付与し得るＤＮＡ構成
物であって作動可能な配列中に、 植物中で機能し得るプロモーター、 植物ウイルスのコートたんぱく質をコードする配列、及
び終結配列を含むＤＮＡ構築物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US79238985A | 1985-10-29 | 1985-10-29 | |
| US792389 | 1985-10-29 | ||
| US84491886A | 1986-03-27 | 1986-03-27 | |
| US844918 | 1986-03-27 | ||
| US06/917,027 US6608241B1 (en) | 1985-10-29 | 1986-10-09 | Protection of plants against viral infection |
| US917027 | 1986-10-09 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61258063A Division JPS62201527A (ja) | 1985-10-29 | 1986-10-29 | ウイルス感染に対する植物保護 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6007601A Pending JPH06339379A (ja) | 1985-10-29 | 1994-01-27 | ウイルス感染に対する植物保護 |
| JP17377495A Expired - Fee Related JP3281512B2 (ja) | 1985-10-29 | 1995-07-10 | ウイルス耐性の植物の生産方法 |
| JP11214304A Pending JP2000041512A (ja) | 1985-10-29 | 1999-07-28 | ウイルス感染に対する植物保護 |
| JP11330565A Pending JP2000157288A (ja) | 1985-10-29 | 1999-11-19 | ウイルス感染に対して耐性であるトランスジェニック植物 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6007601A Pending JPH06339379A (ja) | 1985-10-29 | 1994-01-27 | ウイルス感染に対する植物保護 |
| JP17377495A Expired - Fee Related JP3281512B2 (ja) | 1985-10-29 | 1995-07-10 | ウイルス耐性の植物の生産方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11330565A Pending JP2000157288A (ja) | 1985-10-29 | 1999-11-19 | ウイルス感染に対して耐性であるトランスジェニック植物 |
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| US5107065A (en) * | 1986-03-28 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells |
| US5453566A (en) * | 1986-03-28 | 1995-09-26 | Calgene, Inc. | Antisense regulation of gene expression in plant/cells |
| IL81737A (en) * | 1986-03-28 | 1992-11-15 | Calgene Inc | Regulation of gene expression in plant cells |
| EP0240331B2 (en) * | 1986-04-02 | 2001-04-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Virus resistant plants having a viral coat protein |
| EP0240332B1 (en) * | 1986-04-02 | 1995-07-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Virus resistant plants having antisense RNA |
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| EP0298918B1 (de) * | 1987-07-10 | 2001-09-05 | Syngenta Participations AG | Induzierbare Virusresistenz bei Pflanzen |
| WO1989005858A1 (en) * | 1987-12-21 | 1989-06-29 | The Upjohn Company | Cucumber mosaic virus coat protein gene |
| US5623066A (en) * | 1987-12-21 | 1997-04-22 | Asgrow Seed Company | Cucumber mosaic virus coat protein gene |
| FR2631973B1 (fr) * | 1988-05-30 | 1992-12-11 | Agronomique Inst Nat Rech | Sequence nucleotidique complete de l'adn complementaire de l'arn genomique de potyvirus, genes codant pour la proteine de capside de potyvirus et applications de ces genes a la creation de plantes transgeniques resistantes aux potyvirus |
| WO1990002185A1 (en) * | 1988-08-19 | 1990-03-08 | The Upjohn Company | Cocumber mosaic virus coat protein gene |
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| GB8827094D0 (en) * | 1988-11-19 | 1988-12-21 | Scottish Crop Research Inst | Dna sequence encoding coat protein gene of potato leafroll virus |
| EP0413019B1 (en) * | 1989-02-24 | 2001-10-04 | Monsanto Technology LLC | Synthetic plant genes and method for preparation |
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