DE3650507T2

DE3650507T2 - Schutz von Pflanzen gegen Virusinfektion

Info

Publication number: DE3650507T2
Application number: DE3650507T
Authority: DE
Inventors: Roger N Beachy; Robert T Fraley; Stephen G Rogers
Original assignee: University of Washington; Monsanto Co
Current assignee: University of Washington; Monsanto Co
Priority date: 1985-10-29
Filing date: 1986-10-29
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2006-10-30
Also published as: IL80433A; DE3650507D1; DK515186D0; IE81098B1; US6608241B1; ES2087055T3; JPH0851986A; JP3281512B2; DK515186A; IE862828L; BG49720A3; ATE136330T1; CA1341565C; EP0223452A2; JPH06339379A; AU6452886A; JP2000041512A; JP2000157288A; GR3020438T3; EP0223452A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die gegenüber Viruserkrankung resistent sind, genetisches Material, das verwendet wird, um solche Virusresistenz zu verleihen, und Produkte des Verfahrens. Entsprechend beinhaltet die vorliegende Erfindung Anwendungen aus den Gebieten der Pflanzenmolekularbiologie, der Pflanzenvirologie und dem Genetic Engineering von Pflanzen.
Virusinfektionen in Pflanzen verursachen eine Vielzahl von nachteiligen Wirkungen, einschließlich verkämmertes Wachstum, veränderte Morphologie und verminderte Erträge. Zusätzlich führen Virusinfektionen oft dazu, daß Pflanzen gegenüber Schädigung durch andere Erkrankungen und Pathogene empfänglicher sind. Bezüglich allgemeiner Information über Pflanzenviren siehe z.B. Matthews (1981), Lauffer (1981) und Kado & Agrawal (1972).
Pflanzen haben nicht wie Tiere Immunsysteme, die Antikörper beinhalten. Pflanzen haben jedoch mehrere Methoden entwickelt, Infektionen durch Pathogene zu widerstehen. Beispielsweise bilden einige Arten von Pflanzen Lectine, die an Zuckerreste auf den Oberflächen eindringender Pilze binden und die Pilze immobilisieren. Zusätzlich bilden einige Arten von Pflanzen offenbar verschiedene Moleküle, die in der Pflanze in Reaktion auf Attacken durch Bakterien, Insekten und möglicherweise Viren zirkulieren.
Es ist möglich, einen gewissen Grad von Virusresistenz in einigen Arten von Pflanzen zu induzieren, indem man junge Pflanzen mit einem "attenuierten" Stamm eines Virus infiziert, d.h. einem Stamm des Virus, der keine schweren Symptome verursacht; siehe z.B. Rast (1972) und Costa (1980). Dieser Ansatz beinhaltet mehrere Einschränkungen, einschließlich: (1) Er kann nur bei bestimmten Arten von Feldfrüchten ohne weiteres angewandt werden; (2) er kann nur bei bestimmten Arten von Viren angewandt werden; (3) er kann nur angewandt werden, wenn ein in geeigneter Weise attenuierter Stamm des infizierenden Virus identifiziert und isoliert worden ist; (4) der durch dieses Verfahren bereitgestellte Schutz kann nur gegenüber einer begrenzten Zahl verschiedener Viren wirksam sein; und (5) eine attenuierte Infektion kann eine Infektion, die durch einen zweiten, nicht verwandten Virus hervorgerufen wurde, in einer synergistischen Wechselwirkung ernsthaft verschärfen.
Bevan et al. (EMBO J. (1985), Band 4, Nr. 8, Seiten 1921-1926) exprimierten Hüllprotein von Tabakmosaik-Virus in Pflanzen, um die Analyse der Funktionen von Tabakmosaik-Virus-Proteinen zu erleichtern und ein Verfahren zum Testen der Wirkungen mutierter Tabakmosaik-Virus- Proteine bereitzustellen. Es wurden nur geringe Mengen an Hüllprotein exprimiert, da in dem hergestellten Genkonstrukt die Struktursequenz des Hüllproteins nicht unter wirksame transkriptionelle Kontrolle des Promotors gestellt wurde.
Beachy et al. (Biotechnology in Plant Sciences, Academic Press, New York (1985), Seiten 265-275) exprimierten Hüllprotein von Tabakmosaik- Virus in Pflanzen, um Cross-Protection zu studieren.
Entsprechend besteht ein Bedarf für ein Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen Virusinfektion, das die vorstehend zusammengefaßten Probleme überwindet und das nicht die Identifizierung, Isolierung oder Verwendung eines attenuierten Virus erfordert. Es besteht auch ein Bedarf, Virusresistenz zu verleihen, wo natürliche genetische Resistenz oder Resistenz durch Cross-Protection nicht verfügbar ist.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung genetisch transformierter Pflanzen bereitgestellt, die gegenüber Infektion durch ein Pflanzenvirus resistent sind, umfassend die Schritte:
a) Insertion in das Genom einer Pflanzenzelle eines rekombinanten, doppelsträngigen DNA-Moleküls, umfassend:
i) einen Promotor; der in Pflanzenzellen wirkt, um die Produktion eines mRNA-Polynucleotids zu verursachen;
ii) ein DNA-Polynucleotid mit einer Sequenz, die dem mRNA- Polynucleotid entspricht, wobei das mRNA-Polynucleotid eine Sequenz aufweist, die für das Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, des Pflanzenvirus kodiert;
iii) eine 3'nichttranslatierte Region, die in Pflanzenzellen wirkt, um die Addition von Polyadenylat an das 3'Ende des mRNA-Polynucleotids zu verursachen;
b) Gewinnung transformierter Pflanzenzellen, die Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, exprimieren; und
c) Regeneration genetisch transformierter Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Infektion durch das Pflanzenvirus aufweisen, aus den transformierten Pflanzenzellen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird nunmehr ein rekombinantes, doppelsträngiges DNA-Molekül bereitgestellt, umfassend in der 5'nach-3'Richtung der Transkription:
i) einen Promotor, der in Pflanzenzellen wirkt, um die Produktion eines mRNA-Polynucleotids zu verursachen;
ii) ein DNA-Polynucleotid mit einer Sequenz, die dem mRNA-Polynucleotid entspricht, wobei das mRNA-Polynucleotid eine Sequenz aufweist, die für das Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, eines Pflanzenvirus, das nicht Tabakmosaik-Virus ist, kodiert;
iii) eine 3'nichttranslatierte Region, die in Pflanzenzellen wirkt, um die Addition von Polyadenylat an das 3'Ende des mRNA-Polynucleotids zu verursachen, wobei das DNA-Molekül in der Lage ist, eine ausreichende Expression des Hüllproteins zu verursachen, um eine virale Infektion zu inhibieren oder wesentlich zu reduzieren.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine differenzierte Pflanze bereitgestellt worden, die, wie vorstehend beschrieben, transformierte Pflanzenzellen umfaßt, die gegenüber dem Pflanzenvirus Resistenz zeigen. Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das die Kultivierung einer solchen Pflanze und zusätzlich Propagierung einer solchen Pflanze unter Verwendung von Vermehrungsmaterial (propagules) wie Explantate, Ableger und Samen mit sich bringt, oder das Kreuzen der Pflanze mit einer anderen, um Nachkommen herzustellen, die ebenfalls Resistenz gegenüber dem Pflanzenvirus zeigen.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung deutlich werden. Es sollte jedoch vermerkt werden, daß obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele nur zur Illustrierung gegeben werden, da der Fachmann aus der detaillierten Beschreibung verschiedene Veränderungen und Modifikationen der Erfindung entnehmen wird. Referenzen sind auf die Autorennamen verkürzt, wobei die vollständigen Referenzen nachstehend aufgelistet sind.

Abbildung 1

liefert einen graphischen Überblick bezüglich eines biologischen Tests auf Resistenz gegenüber Viruserkrankung in transgenen Pflanzen.

Abbildung 2

zeigt eine partielle Aminosäuresequenz des Sojabohnenmosaik-Virus-Hüllproteins (soybean mosaic virus coat protein; SMV CP).

Abbildung 3

zeigt den Expressionsvektor pMON316, der benachbart zu einem synthetischen Multilinker den CaMV35S-Promotor enthält, der einmalig vorkommende Schnittstellen für die Restriktionsendonucleasen BGlII und EcoRI aufweist. Der Multilinker wird von einem 260-Basenpaar- Fragment gefolgt, das für die Polyadenylierungssignale des Nopalin-Synthasegens kodiert.

Abbildung 4

zeigt die vollständige Sequenz von CaMV35S-Promotor, Multilinker und Nopalin-Synthasesegment, die in Abbildung 3 dargestellt sind.

Abbildung 5

zeigt die Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pMON319, der ein CaMV35S/TMV-CP/NOS-Konstrukt enthält. Dieser Vektor wurde verwendet, um das Konstrukt in Pflanzenzellen zu inserieren.

Abbildungen 6 und 7

zeigen Daten von in Beispiel 3(A) bzw. 3(B) beschriebenen Experimenten, bei denen es um die Wirkung verschiedener Grade von Virusexposition auf transgene Tabak- bzw. Tomatenpflanzen geht, die erfindungsgemäß hergestellt wurden.

Abbildung 8

zeigt die Daten eines in Beispiel 3(C) beschriebenen Experiments, bei dem es um Vergleiche bezüglich der Virusresistenz zwischen Tomatenpflanzen von genetisch resistenten Linien und transgenen Pflanzen, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, geht.

Abbildung 9

zeigt die Daten eines in Beispiel 4 beschriebenen Experiments, bei dem es um die erfindungsgemäße Induktion von Cross-Protection in Tomatenpflanzen geht, die gegenüber verschiedenen Stämmen von Tabakmosaik- Virus wirksam war.

Abbildung 10

zeigt die anfängliche Isolierung und Inkorporierung des ssRUBISCO-Promotors aus Petunien in einen intermediären Vektor, der in Beispiel 5 verwendet wurde.

Abbildung 11

zeigt eine partielle Nucleotidsequenz des ssRUBISCO- Promotors von Petunien, der in Beispiel 5 verwendet wurde.

Abbildung 12

gibt einen Überblick über die Herstellung eines DNA- Konstrukts, in dem der CaMV35S-Promotor durch den ssRUBISCO-Promotor von Petunien ersetzt wird. Abbildung 13 zeigt ein Verfahren, das zur Herstellung von cDNA, die für das Hüllprotein von Luzernemosaik-Virus (alfalfa mosaic virus coat protein; AMV CP) kodiert, verwendet wurde.

Abbildung 14

zeigt ein Verfahren, das zur Herstellung eines Pflanzenvektors verwendet wurde, der das Gen für das Hüllprotein von Kartoffel-X-Virus (potato virus X coat protein; PVX CP) enthält.

Abbildung 15

zeigt die Nucleotidsequenz des PVX CP-Gens.

Abbildung 16

zeigt die Schritte, die zur Isolierung eines Nucleotidfragments unternommen wurden, das für das Hüllprotein von Tomato-golden-mosaic-Virus (tomato golden mosaic virus coat protein; TGMV CP) kodiert.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Herstellung von DNA-Konstrukten, die in Pflanzenzellen wirken und Virusresistenz erzeugen. Wie nachstehend näher erläutert, wird der Ausdruck "Virusresistenz" hier im Hinblick auf die Fähigkeit einer Pflanze verwendet, einer oder mehreren Arten von Pflanzenviren zu widerstehen.
Verschiedene Pflanzenviren verursachen weltweit bedeutende Verluste bei Feldfrüchten. Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Schutz von Pflanzen bereit, die gegenüber Infektion durch Pflanzenviren empfänglich sind. Beispiele solcher Pflanzenviren sind Sojabohnenmosaik-Virus, Bean-podmottle-Virus, Tabakringflecken-Virus, Gerstengelbverzwergungs-Virus, Weizenspindelstrichel-Virus, Soil-born-mosaic-Virus, Weizenstrichel-Virus in Mais, Maize-dwarf-mosaic-Virus, Maize-chlorotic-dwarf-Virus, Gurkenmosaik-Virus, Tabakmosaik-Virus, Luzememosaik-Virus, Kartoffel-X-Virus, Kartoffel-Y-Virus, Kartoffelblattroll-Virus und Tomato-golden-mosaic-Virus. Innerhalb dieser Viren ist Schutz gegenüber Maize-dwarf-mosaic-Virus, Gerstengelbverzwergungs-Virus, Weizenstrichelmosaik-Virus, Soil-bornmosaic-Virus, Kartoffelblattroll-Virus und Gurkenmosaik-Virus von besonderer Wichtigkeit.
Pflanzen, die durch Anwendung der vorliegenden Erfindung virusresistent gemacht werden können, schließen Kartoffel, Tomate, Paprika, Tabak, Sojabohne, Weizen, Mais, Zitruspflanze, Kürbis, Gurke und Rote Bete ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Expression eines Pflanzengens, das in doppelsträngiger DNA vorliegt, beinhaltet Transkription von Messenger-RNA (mRNA) von einem Strang der DNA durch das Enzym RNA-Polymerase und das anschließende Prozessieren des primären mRNA-Transkripts innerhalb des Kerns. Dieses Prozessieren involviert eine 3'nichttranslatierte Region, die Polyadenylatnudeotide zum 3'Ende der viralen RNA hinzufügt.
Die Transkription von DNA zu mRNA wird durch eine DNA-Region reguliert, die üblicherweise der "Promotor" genannt wird. Die Promotorregion enthält eine Basensequenz, die der RNA-Polymerase signalisiert, mit der DNA zu assozueren und unter Verwendung eines der DNA- Stränge als Matrize die Transkription zu initiieren, um einen korrespondierenden RNA-Strang herzustellen.
Es sind eine Reihe von Promotoren in der Literatur beschrieben worden, die in Pflanzenzellen aktiv sind. Diese schließen den Nopalin-Synthase(NOS)- und den Octopin-Synthase(OCS)-Promotor ein (die sich auf den Tumor-induzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens befinden), die Blumenkohlmosaik-Virus(cauliflower mosaic Virus; CaMV)-19S- und -35S-Promotoren, den lichtinduzierbaren Promotor der kleinen Untereinheit von Ribulose-bis-phosphat-Carboxylase (ssRUBISCO, ein sehr häufig vorkommendes Pflanzenpolypeptid), den Mannopin-Synthase-Promotor (Velten et al. (1984) und Velten & Schell (1985)) und Promotoren von Genen, die für Hydroxyprolin-reiche Glykoproteine kodieren. Alle diese Promotoren sind verwendet worden, um verschiedene Arten von DNA-Konstrukten herzustellen, die in Pflanzen exprimiert worden sind; siehe z.B. die PCT-Veröffentlichung WO 84/02913 (Rogers et al., Monsanto).
In der vorliegenden Erfindung können Promotoren verwendet werden, die bekannt dafür sind oder für die gefünden wird, daß sie Transkription viraler RNA in Pflanzenzellen verursachen. Solche Promotoren können von Pflanzen oder Viren erhalten werden und schließen den CaMV35S- Promotor ein sowie Promotoren, die von Pflanzengenen isoliert wurden, wie die ssRUBISCO-Gene, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Wie nachstehend beschrieben, sollte der spezielle ausgewählte Promotor in der Lage sein, eine ausreichende Expression zu verursachen, damit die Produktion einer ausreichenden Menge an Hüllprotein erhalten wird, um die Pflanze im wesentlichen resistent gegenüber Virusinfektion zu machen. Die Menge an Hüllprotein, die zur Induktion der Resistenz benötigt wird, kann entsprechend der Art der Pflanze und/oder des Virus, gegen das geschützt werden soll, variieren. Obwohl der CaMV35S-Promotor bevorzugt ist, sollte demnach vermerkt werden, daß dieser Promotor nicht für alle erfindungsgemäßen Ausführungsformen der optimale sein mag.
Die Promotoren, die für die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte verwendet werden, können, falls gewunscht, modifiziert werden, um ihre Kontrollcharakteristika zu beeinflussen. Beispielsweise kann der CaMV35S-Promotor an den Teil des ssRUBISCO-Gens ligiert werden, der die Expression von ssRUBISCO in Abwesenheit von Licht reprimiert, um einen Promotor herzustellen, der in Blättern, jedoch nicht in Wurzeln aktiv ist. Der resultierende chimäre Promotor kann verwendet werden, wie hier beschrieben. Für die Zwecke dieser Beschreibung schließt der Ausdruck "CAMV35S"-Promotor entsprechend Variationen des CaMV35S- Promotors ein, z.B. Promotoren, die im Wege der Ligation mit Operatorregionen, durch zufällige oder kontrollierte Mutagenese, etc. abgeleitet wurden.
Die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte enthalten, in doppelsträngiger DNA-Form, einen Teil des Virusgenoms, das für das Hüllprotein eines Virus kodiert. Obwohl die meisten Arten von Pflanzenviren RNA anstatt DNA enthalten, enthalten andere einzel- oder doppelsträngige DNA. Viren, die RNA enthalten, enthalten keine Gene mit üblichen transkriptionellen Promotoren und/oder 3'regulatorischen Sequenzen. In diesen Fällen werden die Polypeptide oder Proteine direkt vom RNA- Strang translatiert, der in dem Virus oder seinem Komplement enthalten ist. Der Teil des Virusgenoms, der für das Hüllprotein kodiert, kann mittels eines von verschiedenen bekannten Verfahren, die im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns liegen, bestimmt werden; siehe nachstehend Beispiel 1.
Beispielsweise kann man in manchen Fällen beschließen, das Hüllprotein des Virus zu sequenzieren und eine DNA-Sequenz zu synthetisieren, die für das Hüllprotein kodiert. Alternativ kann man RNA des Virus identifizieren und reinigen, die für das Hüllprotein kodiert. Bei den allermeisten RNA-enthaltenden Pflanzenviren ist das Hüllproteingen am 3'Ende der viralen RNA lokalisiert. In einigen Fällen könnte das Hüllproteingen durch Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde lokalisiert werden, deren Sequenz die Aminosäuresequenz des viralen Hüllproteins reflektiert. Wenn das Virus RNA enthält, kann die kodierende DNA-Sequenz unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase erhalten werden, um komplementäre DNA (cDNA) zu bilden. Wie vorstehend angegeben, enthalten die meisten Arten von Pflanzenviren RNA, einschließlich Tabakmosaik-Virus, Tomato-spotted-wilt-Virus, Gurkenmosaik-Virus, Luzernemosaik-Virus, Potexviren wie Kartoffel-X-Virus, Potyviren wie Kartoffel- Y-Virus und Kartoffelblattroll-Virus.
Im Falle einiger Viren, z.B. Potyviren, ist das Hüllprotein Teil eines Polyproteins, das zur Freisetzung des Hüllproteins prozessiert wird. Der Fachmann sollte dies berücksichtigen, um die Region des Virusgenoms zu isolieren, die für das Hüllprotein kodiert, und um, wie nachstehend in Beispiel 1 ausgeführt, Translationsinitiationssignale einzuführen.
Eine kodierende Sequenz, die in einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt verwendet wird, kann, falls gewünscht, modifiziert werden, um entweder durch zufällige oder kontrollierte Mutagenese unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren Mutanten herzustellen. Solche Mutanten und Varianten liegen daher innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung. Entsprechend schließt der Ausdruck "Hüllprotein", wie er hier verwendet wird, verkürzte Proteine und Fusionsproteine sowie nichtmodifiziertes Hüllprotein ein.
Die 3'nichttranslatierte Region enthält ein Polyadenylierungssignal, das in Pflanzen wirkt, um die Addition von Polyadenylatnucleotiden an das 3' Ende der viralen RNA zu verursachen. Beispiele geeigneter 3'Regionen sind (1) die 3'transkribierten, nichttranslatierten Regionen mit dem Polyadenylierungssignal von Agrobacterium den Tumor-induzierenden (Ti) Plasmidgenen, z.B. das Nopalin-Synthase(NOS)-Gen, und (2) Pflanzengene, wie die Sojabohnen-Speicherproteingene und die kleine Untereinheit des RuBP-Carboxylasegens. Ein Beispiel für eine bevorzugte 3'Region ist die des NOS-Gens, die in den nachstehenden Beispielen genauer beschrieben wird.
Die RNA, die von einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt produziert wird, enthält auch eine 5'nichttranslatierte Leadersequenz. Diese Sequenz kann von dem Promotor abgeleitet werden, der zur Expression des Gens ausgewählt wurde, und kann spezifisch modifiziert werden, um die Translation der mRNA zu erhöhen. Die 5'nichttranslatierten Regionen können auch von viralen RNAs erhalten werden, von geeigneten eukaryontischen Genen oder von synthetischen Gensequenzen. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Konstrukte beschränkt, wie sie in den folgenden Beispielen präsentiert werden, in denen die nichttranslatierte Region sowohl von der 5'nichttranslatierten Sequenz abgeleitet ist, die die Promotorsequenz begleitet, als auch von einem Teil der 5'nichttranslatierten Region des Hüllproteingens des Virus. Vielmehr kann die nichttranslatierte Leadersequenz Teil des 5'Endes der nichttranslatierten Region der für das Virus- Hüllprotein kodierenden Sequenz sein, oder Teil der Promotorsequenz, oder sie kann, wie vorstehend diskutiert, von einem nicht verwandten Promotor oder einer kodierenden Sequenz abgeleitet sein.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt kann in das Genom einer Pflanze durch irgendein geeignetes Verfahren inseriert werden. Geeignete Pflanzentransformationsvektoren schließen jene ein, die von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind, sowie die z.B. von Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) und in EP-A-120 516 (Schilperoort et al.) offenbarten. Zusätzlich zu Pflanzentransformationsvektoren, die von den Ti- oder Wurzel-induzierenden(root inducing; Ri)Plasmiden von Agrobacterium abgeleitet sind, können alternative Verfahren verwendet werden, um die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte in Pflanzenzellen zu inserieren. Solche Verfahren können z.B. die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, die die Aufnahme von freier DNA erhöhen, und Transformation mittels Viren oder Pollen beinhalten.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine doppelsträngige cDNA-Sequenz von einem RNA-Segment (CP-mRNA) hergestellt, das für das Hüllprotein von Tabakmosaik-Virus (tobacco mosaic virus; TMV) kodiert. Diese kodierende Sequenz kann an einen CaMV35S-Promotor und eine NOS-3'nichttranslatierte Region zur Bildung eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts ligiert werden. Das DNA-Konstrukt wird in ein intermediäres Plasmid inseriert, das teilweise von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens erhalten wird, um das Plasmid pMON319 zu erhalten. Der Vektor wird dann in kultivierte A. tumefaciens-Zellen eingeführt, die ein entschärftes Ti-Plasmid enthalten. Die zwei Plasmide bilden ein Cointegratplasmid mittels eines Crossover-Ereignisses.
Bakterienzellen mit dem Cointegratplasmid wurden zusammen mit Zellen, die von Tabakpflanzen erhalten wurden, kultiviert, und transformierte Pflanzenzellen wurden mittels Nährmedien mit Kanamycin selektiert. Die Zellen wurden dann zu Kallusgewebe kultiviert und zu differenzierten Pflanzen regeneriert. Die resultierenden erfindungsgemäßen Pflanzen enthalten das DNA-Konstrukt, das Virusresistenz verleiht.
Bei Ausführung der vorliegenden Erfindung werden die Resistenz-verleihenden Fähigkeiten eines DNA-Konstrukts, das eine CP-kodierende Sequenz eines bestimmten Virus enthalten kann, zunächst vorzugsweise unter Verwendung eines für dieses Virus systemischen Wirts untersucht. In einer "systemischen" Wirtspflanze hat das Virus die Fähigkeit zu replizieren und sich mittels eines bisher nicht spezifizierten Vorganges von der Inokulationsstelle (typischerweise auf einem Blatt) durch die Pflanze zu bewegen, wobei Infektionssymptome hervorgerufen werden, die eher systemisch als lokalisiert sind. (Umgekehrt zeigt ein "nicht systemischer" Wirt Symptome, wie die Entwicklung nekrotischer Flecken, die auf die Region um die Inokulationsstelle herum beschränkt sind.) Die Paarbildung von spezifischen Viren mit Wirten, die gegenüber diesen Viren systemisch sind, ist in der Pflanzenpathologie gut bekannt. Beispielsweise ist bekannt, daß die meisten Tomaten- und Tabaksorten wie auch die Luzerne systemische Wirte für Luzernemosaik-Virus (alfalfa mosaic virus; AMV) sind; daß das Gurkenmosaik-Virus (cucumber mosaic virus; CuMV) systemisch Tomate, Tabak, Gurke und andere Melonenfrüchte infiziert, und daß Tabak-, Tomaten- und eine Vielzahl von Orchideensorten systemische Wirte für TMV sind. Siehe allgemein INDEX OF PLANT VIRUS DISEASES, Agriculture Handbook Nr.307 (ARS-USDA 1966).
Genauer gesagt wird ein erfindungsgemäß hergestelltes DNA-Konstrukt mittels eines geeigneten Vektors, wie vorstehend beschrieben, vorzugsweise in Zellen einer Pflanze oder Protoplasten einer Pflanze eingeführt, die ein systemischer Wirt für das Virus ist, das als Quelle für eine DNA-Sequenz in dem Konstrukt dient, das die Produktion einer RNA- Sequenz verursacht. Das so modifizierte Pflanzenmaterial kann z.B. durch Northern Blotting bezüglich der Anwesenheit von CP-mRNA getestet werden; falls keine CP-mRNA (oder ein zu niedriger Titer) nachgewiesen wird, kann der Promotor; der in dem Konstrukt zur Kontrolle des CP- kodierenden Segments verwendet wurde, durch einen anderen, potentiell stärkeren Promotor ersetzt und das veränderte Konstrukt erneut getestet werden.
Alternativ kann diese Überprüfung in vollständigen regenerierten Pflanzen durchgeführt werden. Wenn adäquate Produktion von Virus-mRNA erhalten wird und die transformierten Zellen (oder Protoplasten) zu vollständigen Pflanzen regeneriert worden sind, werden letztere in jedem Fall hinsichtlich Resistenz gegenüber dem Virus einem Screening unterzogen. Die Wahl des Verfahrens für den Regenerationsschritt ist nicht kritisch, geeignete Protokolle sind verfügbar für Wirte ausgewählt aus Leguminosae (Luzerne, Sojabohne, Klee, etc.), Umbelliferae (Karotte, Sellerie, Pastinak), Cruciferae (Kohl, Rettich, Rübsamen, etc.), Cucurbitaceae (Melonen und Gurke), Gramineae (Weizen, Reis, Mais, etc.), Solanaceae (Kartoffel, Tabak, Tomate, Paprika) und verschiedenen Blumennutzpflanzen; siehe z.B. Ammirato et al. (1984). Pflanzen von jeder der vorstehend genannten Familien können erfindungsgemäß virusresistent gemacht werden.
Regenerierte Pflanzen, die bezüglich Virusresistenz getestet werden, werden dem Virus vorzugsweise bei einer Konzentration ausgesetzt, die in einem Bereich liegt, in dem die Rate der Krankheitsentwicklung linear mit der Viruskonzentration im Inokulum korreliert. Dieser lineare Bereich kann unter Verwendung nichttransformierter Pflanzen für ein bestimmtes Paar von Virus und Wirtsspezies empirisch ermittelt werden.
Verfahren zur Virusinokulation sind dem Fachmann ohne weiteres bekannt und werden in Kado & Agrawal (1972) gewürdigt. Bin Verfahren beinhaltet Abschleifen einer Blattoberfläche mit einer wäßrigen Suspension (üblicherweise bei pH 7 - 8 gepuffert), die ein Schleifmittel, z.B. Carborundum oder Diatomeenerde, und das Virus enthält. Obwohl Inokulation auf diese Weise im allgemeinen wegen ihrer Einfachheit bevorzugt ist, ist für den Fachmann klar, daß andere Ansätze für bestimmte Pflanzenviren bevorzugt sein können. Beispielsweise ist das über Blattläuse übertragene Kartoffelblattroll-Virus bekannt dafür, daß es mittels mechanischer Abschleifung nicht ohne weiteres inokuliert werden kann; vielmehr wird es mittels geeigneter Insektenvektoren transferiert; siehe allgemein Thomas (1983).
Nachkommen von regenerierten Pflanzen werden inokuliert und mit gleich behandelten Kontrollen beobachtet, bei denen es sich um nichttransformierte Pflanzen und/oder Pflanzen handeln kann, die mit einem Konstrukt ohne die DNA-Sequenz, die die Produktion einer Virus-RNA- Sequenz verursacht, transformiert wurden, um im Vergleich die Resistenz zu bestimmen, wie sie z.B. durch einen Unterschied zwischen den Gruppen in bezug auf den Zeitpunkt des Auftretens von Symptomen widergespiegelt wird (siehe Abb. 1). Beispielsweise ist gefunden worden, daß Pflanzen, die erfindungsgemäß die kodierende Sequenz für das Hüllprotein des Virus enthalten, im Vergleich zu Kontrollpflanzen die Symptome einer Virusinfektion, wenn überhaupt, nur nach einer wesentlich längeren Zeitdauer zeigen. Die beobachtete Resistenz innerhalb der transgenen Pflanzen kann mit den gemessenen Mengen an Virus-mRNA oder Hüllprotein korreliert werden. Entsprechend ist gefünden worden, daß die Expression eines kleinen Teils des viralen Genoms Resistenz gegenüber Virusinfektion vermitteln kann.
In einigen Fällen mag die Expression von viraler RNA oder von Hüllprotein nicht nachweisbar sein. Dies kann an einer Instabilität der mRNA oder des Proteins liegen. Dem Fachmann sind jedoch Verfahren zur Stabilisierung von mRNA und Proteinen bekannt. Beispielsweise ist bekannt, daß das Splicing von Introns eine wichtige Rolle für die Bildung stabiler mRNA spielt; Hamer & Leder (1979). Die Expression des Virus-Hüllproteingens kann durch Insertion von Introns entweder in die kodierenden oder die nichtkodierenden Sequenzen wesentlich verstärkt werden. Weiterhin ist bekannt, daß Sequenzen in den 3'nichttranslatierten Sequenzen der mRNAs die Stabilität der korrespondierenden mRNAs bestimmen; Shaw & Kamen (1986). Die Stabilität der durch Engineering erhaltenen Hüllprotein-mRNA kann durch Veränderung ihrer 3'nichttranslatierten Region wesentlich verstärkt werden. Schließlich ist bekannt, daß mehrere Proteine nach Proteolyse ihre fünktionelle Aktivität behalten; Moore (1981), Sandmeier (1980), Zurini (1984). Die erfindungsgemäß erhaltenen verkürzten Hüllproteinmoleküle könnten ihre biologische Aktivität behalten und bei Expression in großen Mengen in transgenen Pflanzen Virusresistenz vermitteln.

Beispiel 1: Typische Isolierung eines Virus-Hüllproteingens zur Verwendung für Cross-Protection

Die Potyviren umfassen die am meisten verbreitete und ökonomisch wichtigste Gruppe bekannter Pflanzenviren. Ein Potyvirus, das Sojabohnenmosaik-Virus (soybean mosaic virus; SMV), wurde daher ausgewählt, um einen allgemeinen Ansatz zur Isolierung eines kleinen Teils des Virusgenoms zu illustrieren, nämlich der Sequenz, die für das Hüllprotein kodiert, die verwendet werden kann, um Resistenz gegenüber Virusinfektion ("Cross-Protection") gemäß der vorliegenden Erfindung zu verleihen (siehe Abb. 1).
SMV wurde aus Sojabohnenblättern gereinigt, die mit dem N-Stamm von SMV infiziert worden waren. Virus wurde isoliert und virale RNA präpariert gemäß den von Vance & Beachy (1984) offenbarten Verfahren. Antikörper gegen SMV wurden mittels herkömmlicher Verfahren in Kaninchen erzeugt, die die Injektion von 1 mg von gereinigtem SMV in Kaninchen einschlossen, gefolgt von einer zweiten Injektion vier Wochen später von 50 µg SMV und zwei Wochen danach von einer zusätzlichen SMV-Injektion (50 µg). Serum zur Verwendung in diesem Beispiel wurde in zweiwöchigen Intervallen nach der letzten Booster- Injektion gesammelt.
Die cDNA-Klonierung des Hüllproteingens des Virus wurde unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erreicht. cDNA wurde von viraler RNA hergestellt, indem zunächst die polyadenylierte SMV-RNA einem Priming mit Oligo-dT unterzogen wurde und dann cDNA mittels Reverser Transkriptase hergestellt wurde. Zur Herstellung doppelsträngiger cDNA wurde das cDNA:RNA-Hybridmolekül, das den ersten Strang enthielt, mit RNase H und DNA-Polymerase I behandelt. Die Moleküle wurden dann mit T4-DNA-Polymerase behandelt, gefolgt von EcoRI-Methylase. Die Moleküle wurden dann mit T4- DNA-Ligase in Anwesenheit synthetischer Oligonucleotidlinker umgesetzt, die die EcoRI-Schnittstelle enthielten. Anschließend wurden die Moleküle mit EcoRI verdaut und mit dem Plasmid pEMBL18 ligiert, einem aus der Klasse von vielerorts erhältlichen Klonierungsvektoren, die im European Molecular Biology Laboratory, Postfach 10-2209, 6900 Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland, hergestellt wurden. Die pEMBL18-DNA war zuvor mit dem Enzym EcoRI gespalten und zur Verhinderung des erneuten Zusammenfügens des Plasmids mit Alkalischer Phosphatase behandelt worden. Doppelsträngige cDNAs mit exponierten EcoRI-Schnittstellen wurden dann mit dem geöffneten Plasmid ligiert. Diese ligierten cDNAs wurden dann verwendet, um E. coli vom Stamm DH5α zu transformieren.
Kolonien der transformierten Bakterien wurden einem Screening mit ³²P- markierter cDNA unterzogen. Diejenigen, die mit den ³²P-markierten Molekülen reagierten, wurden ausgewählt. Zum Screening auf Antigenproduktion wurde IPTG verwendet, um positive Transformanten zu induzieren, und die wachsenden Kolonien wurden mittels eines Antikörper-Blot-Verfahrens mit den zuvor erzeugten Kaninchen-Anti-Hüllprotein- Antikörpern einem Screening unterzogen. (Bestimmte geeignete Anti-CP- Antikörper können auch kommerziell erhalten werden, z.B. von der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland.) Die Kolonien, die mit dem Antikörper reagierten, wurden für ein weiteres Screening selektiert, um zu bestätigen, daß sie tatsächlich ein Hüllprotein:lacZ- Fusionsprotein produzierten. Plasmid-DNA, die von Kolonien isoliert worden war, die ein Fusionsprotein produzierten, wurde als Sonde zur Identifizierung anderer Kolonien mit überlappenden cDNAs mittels Standard-Hybridisierungstechniken verwendet; Maniatis et al. (1982).
Die DNA-Sequenz der Monierten cDNAs wurde mittels Standard-Verfahren bestimmt; siehe Abb. 2. Aminosäuresequenzierung des viralen Hüllproteins kann durchgeführt werden, um seine NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz zu bestimmen. Da das Amino-terminale Fragment in einigen Fällen blockiert sein kann, kann ein virales Hüllprotein durch Beschuß mit schnellen Atomen (fast atom bombardment; FAB) und Massenspektrometeranalysen unter Anwendung dem Fachmann bekannter Verfahren sequenziert werden. Die Aminosäuresequenz des Proteins kann dann mit der durch Sequenzierung der Monierten cDNA erhaltenen Sequenz verglichen werden. Ein cDNA-Segment, das auf diese Weise als für das virale Hüllprotein kodierend identifiziert wurde, kann durch Einführen einer neuen Restriktionsschnittstelle und eines ATG-Translationsinitiationskodons vis- -vis dem 5'Ende unmittelbar neben dem Kodon für die NH&sub2;-terminale Aminosäure des reifen Hüllproteins erhalten werden. Dies kann nach dem Verfahren von Zoller & Smith (1982) erfolgen. Nach Verdauung mit Restriktionsenzym zum Ausschneiden der für das Hüllprotein kodierenden Sequenz kann die isolierte CP-kodierende Sequenz, wie vorstehend beschrieben, mit einem geeigneten Promotor ligiert und erfindungsgemäß in Pflanzen eingeführt werden, um Virusresistenz zu verleihen.

Beispiel 2: Resistenz gegenüber Viruserkrankung in transgenen Pflanzen, die ein Virus-Hüllproteingen (Tabakmosaik-Virus) enthalten

Dieses Beispiel illustriert, wie die vorliegende Erfindung ausgeführt wird, wenn die Nucleotidsequenz eines Virus-Hüllproteingens verfügbar ist.

A. Herstellung des Plasmids pMON319

RNA wurde von Tabakmosaik-Virus (TMV; der übliche gemeine Stamm U1; Sequenz publiziert von Goelet et al. (1982)) durch Phenolextraktion, wie in Bruening (1976) beschrieben, entfernt. Es wurde ein 35mer Oligonucleotidprimer synthetisiert, der zum 3'Ende der viralen RNA komplementär war und zusätzlich NdeI- und BamHI-Restriktionsschnittstellen besaß. Das Oligonucleotid wurde an die virale RNA hybridisiert und diente als Primer für die Synthese (mittels Reverser Transkriptase) von cDNA gemäß dem Verfahren von Maniatis (1982). Die einzelsträngige DNA wurde gemäß dem Verfahren von Maniatis (1982) zu doppelsträngiger (ds) DNA konvertiert.
Die ds cDNA wurde mittels BamHI geschnitten, das an einer Schnittstelle auf dem Primer schneidet, und mittels HindIII, das an der Base 5080 der TMV-Sequenz schneidet. Das resultierende 1,3 kb-Fragment wurde mit pUC9-Plasmid-DNA gemischt, die ebenfalls mit HindIII und BamHI geschnitten worden war. Das resultierende Ampicillin-Resistenz- Plasmid, pTM37, war die Quelle für DNA für die Hüllprotein-kodierende Sequenz, die für weitere Manipulationen verwendet wurde, und besitzt eine EcoRI-Schnittstelle neben der BamHI-Schnittstelle.
Um ein kleineres DNA-Fragment mit der Hüllprotein-kodierenden Sequenz zu erhalten, wurde Plasmid pTM37 mit AhaIII verdaut, das bei der Base 5707 der TMV-Sequenz schneidet (fünf Basenpaare von dem ATG-Translationsinitiationskodon für die Hüllprotein-mRNA entfernt), und mit EcoRI, das gerade nach dem Ende der TMV-Sequenzen in pTM37 schneidet. Das resultierende Fragment mit einer Länge von ungefähr 700 Basenpaaren (bp) wurde dann in zwei andere Plasmide transferiert und kloniert, um Restriktionsschnittstellen zu den 5' und 3' Enden des Hüllprotein-kodierenden Fragments hinzuzufügen. Diese Hinzufügungen von Restriktionsschnittstellen erleichterten die Konstruktion weiterer Plasmide. Alternativ kann man die Möglichkeit wählen, die Restriktionsschnittstellen auf andere Weisen hinzuzufügen, z.B. durch ortsspezifische Mutagenese oder durch Ligation synthetischer DNA-Linker. Diese Techniken liegen alle innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns.
Das 700 bp-Fragment mit der Hüllprotein-kodierenden Sequenz, die am 5'Ende durch eine BglII-Schnittstelle und am 3'Ende durch eine EcoRI- Schnittstelle flankiert wird, wurde aus dem intermediären Plasmid durch Verdauung mit BglII und EcoRI ausgeschnitten. Dieses 700 bp-Fragment wurde gereinigt und mit DNA des Plasmids pMON316 gemischt, die ebenfalls mit BglII und EcoRI verdaut worden war. Plasmid pMON316 ist ein Derivat von pMON200 (Fraley et al. (1985); Rogers et al. (1985)), das ein 330 bp-Segment des Blumenkohlmosaik-Virus (cauliflower mosaic virus; CaMV) trägt, das die Produktion eines 35S-Transkripts bewirkt.
Das CaMV35S-Promotorfragment wurde aus dem Plasmid pOS-1 isoliert, einem Derivat von pBR322, das das gesamte Genom des CaMV-Stammes CM4-184 (Howarth et al. (1981)) als ein SalI-Insert trägt. Der Stamm CM4-184 ist eine natürlich vorkommende Deletionsmutante des Stammes CM1841. Die Nucleotidsequenzen der Stämme CM1841 (Gardner et al. (1981)) und Cabb-S (Franck et al. (1980)) von CaMV sind veröffentlicht worden, wie auch einige partielle Sequenzen eines anderen CM4-184- Klons (Dudley et al. (1982)). Die Nucleotidsequenzen der 35S-Promotoren all dieser Stämme sind sehr ähnlich. Die Hinweise auf Nucleotidzahlen ("n...") in der nachfolgenden Diskussion entsprechen denen der von Gardner et al. (1981) offenbarten Sequenz von CM1841.
Der 35S-Promotor wurde von dem Klon pOS-1 von CM4-184 als ein AluI(n 7143)-EcoRI*(n 7517)-Fragment isoliert, das zunächst in Plasmid pBR322 inseriert wurde, das mit BamHI geschnitten und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt und schließlich mit EcoRI geschnitten worden war. Das Promotorfragment wurde dann aus pBR322 mit BamHI und EcoRI ausgeschnitten, mit Klenow-Polymerase behandelt und in die SmaI-Schnittstelle von M13 mp8 (Messing & Vieira (1982)) inseriert, so daß die EcoRI-Schnittstelle des mp8-Multilinkers am 5'Ende des Promotorfragments lag. Ortsspezifische Mutagenese (Zoller & Smith (1982)) wurde dann verwendet, um einen Guanidinrest am Nucleotid 7464 einzuführen, um eine BglII-Schnittstelle zu kreieren.
Das 35S-Promotorfragment wurde dann aus M13 als ein 330 bp-EcoRI- BglII-Fragment ausgeschnitten, das den 35S-Promotor, die Transkriptionsinitiationsstelle und 30 Nucleotide des 5'nichttranslatierten Leaders, jedoch nicht einen der Translationsinitiatoren von CaMV oder das 35S- Transkript-Polyadenylierungssignal enthält, das 180 Nucleotide stromabwärts vom Start der Transkription lokalisiert ist; Covey et al. (1981); Guilley et al. (1982). Das 35S-Promotorfragment wurde mit einem synthetischen Multilinker und einem 260 bp-Sau3A-Fragment (Nucleotide 665-417) des pTiT37-Nopalin-Synthasegens (Bevan et al. (1983)) von der NOS-3'nichttranslatierten Region verbunden; das so erhaltene Segment wurde dann in pMON200 inseriert, um pMON316 zu erhalten (Abb. 3). Die vollständige Sequenz des 35S-Promotors, des Multilinkers und des NOS-3'Segments ist in Abb. 4 angegeben. Diese Sequenz beginnt mit einer XmnI-Schnittstelle, die durch Behandlung mit Klenow-Polymerase zur Entfernung der EcoRI-Schnittstelle am 5'Ende des 35S-Promotorsegments erhalten wurde.
Das Plasmid pMON316 ist ein intermediärer Vektor des cointegrierenden Typs mit einmalig vorkommenden Restriktionsschnittstellen für die Restriktionsendonudeasen BglII, ClaI, KpnI, XhoI und EcoRI, die zwischen dem 5'Leader und den NOS-Polyadenylierungssignalen lokalisiert sind. Die Schnittstellen erlauben die Insertion kodierender Sequenzen, die ihre eigenen Translationsinitiationssignale unmittelbar neben der 35S-Transkript-Leadersequenz tragen. Das Plasmid pMON316 hat alle der Eigenschaften von pMON200 erhalten, einschließlich Spectinomycinresistenz zur Selektion in E. coli und A. tumefaciens wie auch ein chimäres Kanamycingen (NOS-NPTII'NOS) zur Selektion von transformiertem Pflanzengewebe und des Nopalin-Synthasegens, um ohne weiteres Transformanten und die Vererbung an die Nachkommen ermitteln zu können. Das Plasmid pMON316 enthält die vorstehend beschriebene CaMV35S-Promotor-NOS-Kassette, die in pMON200 fehlt, wird jedoch im wesentlichen in der gleichen Weise verwendet, wie letzteres Plasmid; siehe Fraley et al. (1985), Rogers et al. (1986).
Die Insertion des 700 bp-Segments, das für das TMV-Hüllprotein kodiert, liefert die geeigneten Signale für die Synthese dieses Proteins in transformierten Pflanzenzellen. Das resultierende Plasmid, bezeichnet mit "pMON319", erscheint in Abb. 5.
B. Insertion des CP- Gen-enthaltenden DNA-Konstrukts in Pflanzenzellen Plasmid pMON319 wurde gemäß Fraley et al. (1985) in A. tumefaciens- Zellen inseriert, die ein entschärftes Ti-Plasmid mit der Bezeichnung "pTiB6S3-SE" enthielten. Dieses Plasmid enthält keine vollständig funktionelle T-DNA-Region; es enthält eine linke T-DNA-Grenze.
Das Plasmid pMON319 trägt ein Markergen, das selektierbare Resistenz gegenüber Spectinomycin (Spc) und Streptomycin (Str) in Bakterien verleiht, sowie eine Homologieregion, die ein Crossover-Ereignis verursachen kann, um pMON319 mit pTiB6S3-SE zu kombinieren, wobei auf diese Weise Ti-Plasmidcointegrate kreiert werden, die rekonstituierte T-DNA-Regionen aufweisen, die das CaMV35S/TMV-CP/NOS-Konstrukt enthalten. pMON319 kann jedoch in A. tumefaciens-Zellen nicht unabhängig replizieren. In Anwesenheit von Spc und Str sind daher die einzigen A. tumefaciens-Zellen, die überleben können, jene, die cointegrierte Plasmide aufweisen.
Eine Kultur von A. tumefaciens mit dem Ti-Plasmidcointegrat wurde mit Blattscheibchen, die von Tabakpflanzen erhalten wurden (Nicotiana tabacum cv. "Samsun"), wie von Horsch et al. (1985) beschrieben, kontaktiert. Die Agrobacterium-Zellen inserierten die DNA-Konstrukte in die Chromosomen der Pflanzenzellen. Pflanzenzellen, die gegenüber Kanamycin resistent waren, wurden selektiert und in differenzierte Pflanzen nach dem in Horsch et al. (1985) beschriebenen Verfahren regeneriert.
Die Pflanzen, die als experimentelle Kontrollen fungierten, enthielten entweder (1) keine Fremdgene oder (2) lediglich das Plasmid pMON200.
Eine Kultur von A. tumefaciens-Zellen, die das pMON319::pTiB6S3-SE- Cointegratplasmid enthielten, wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der ATCC hinterlegt und mit der Zugangsnummer 53294 versehen.

C. Expression viraler RNA in Pflanzenzellen

RNA wurde aus Blättern regenerierter Pflanzen nach dem Verfahren von Lane & Tremiates-Kennedy (1981) extrahiert. RNAs wurden anhand der Größe durch Elektrophorese in Agarosegelen, die Formaldehyd enthielten, separiert und im Blotverfahren auf Nitrocellulose überführt, wie in Maniatis et al. (1982) beschrieben.
Virale RNA wurde auf der Nitrocellulose durch Hybridisierung mit dem ³²P-rnarkierten DNA-Klon nachgewiesen unter Verwendung von Verfahren, die in Maniatis et al. (1982) beschrieben sind.
Aufgrund dieser RNA-Hybridisierungsanalyse wurde festgestellt, daß transformierte Pflanzen (jene, die pMON319 enthielten) virale RNA enthielten, wohingegen Pflanzen, die lediglich pMON200 enthielten, keine virale RNA aufwiesen. Die Anwesenheit von TMV-Hüllprotein wurde in Pflanzen nachgewiesen, die pMON319, nicht jedoch pMON200 enthielten. Proteine wurden aus Blättern durch Mahlen in Probenpuffer nach Laemmli (1970) extrahiert. Eine Portion von 50 µg Protein wurde einer Elektrophorese in 12%igen Polyacrylamidgelen, die SDS enthielten, unterzogen, wie von Laemmli (1970) beschrieben. Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrocellulose transferiert, wie von Towbin et al. (1979) beschrieben.
Durch Blotverfahren überführte Proteine wurden mit Antiserum umgesetzt, das in Kaninchen gegen gereinigtes TMV erzeugt worden war, wie von Symington et al. (1981) beschrieben. Kaninchenantikörper, die an das TMV auf der Nitrocellulose gebunden waren, wurden durch Bindung mit ¹²&sup5;I-markiertem Esel-Anti-Kaninchen-Antiserum (Amersham Co., Chicago) nachgewiesen.
Ausgehend von den Resultaten der Immunoblot-Analyse wurde festgestellt, daß transformierte Pflanzen (die pMON319 enthielten) TMV- Hüllprotein produzierten, wohingegen Pflanzen, die lediglich pMON200 enthielten, kein TMV-Hüllprotein produzierten. Die Menge an Hüllprotein, die in diesen Blättern produziert wurde, betrug etwa 50 ng Hüllprotein in 50 µg an gesamtem Blattprotein, oder 0,1%.

D. Resistenz von Tabakpflanzen gegenüber TMV

Die transformierten Pflanzen und die Kontrollpflanzen wurden bis zu einer Höhe von etwa zwei Fuß kultiviert und dann in Ableger aus Stammsektionen mit Achselknospen aufgeteilt, die zur Wurzelbildung gebracht und zu einzelnen Pflanzen regeneriert wurden. Diese Pflanzen wurden mit TMV inokuliert, indem Schleifpartikel zu einer wäßrigen Suspension der Viruspartikel zugegeben wurden und die Schleifmittellösung auf die Blätter gerieben wurde. Genauer gesagt wurde TMV in 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) suspendiert. Ungefähr 50 µl Lösung wurde unter Reiben auf Tabakblätter appliziert, die mit Carborundum-Staub (320 Grit, hergestellt von Fisher Scientific Co.) behandelt worden waren. Nachdem die Blattoberfläche getrocknet war, wurden die Blätter mit Wasser gespült und die Pflanzen in ein Gewächshaus oder eine Kultivierungskammer (growth chamber) plaziert.
Kontrollpflanzen zeigten Infektionssymptome innerhalb von etwa drei bis fünf Tagen nach Inokulation. Im Gegensatz dazu produzierten die Pflanzen, die das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt enthielten, Symptome nicht vor acht bis zehn Tage nach Inokulation. Diese Resultate wurden in drei unabhängigen Reihen von Experimenten bestätigt.
In einem weiteren Experiment wurde Samen, die von zwei verschiedenen transformierten Pflanzen mit pMON319 produziert wurden, erlaubt zu keimen, und die Sämlinge wurden in Erde kultiviert. Jeder Sämling wurde bezüglich der Anwesenheit oder Abwesenheit von TMV-Hüllprotein mittels der vorstehend beschriebenen Immunoblot-Technik getestet. Eine Zahl von insgesamt 39 Sämlingen wurde, wie vorstehend beschrieben, blind mit einer Suspension mit TMV (0,25 µg/ml) inokuliert, d.h. ohne vorher zu wissen, ob der Sämling TMV-Hüllprotein enthielt. Die experimentellen Resultate zeigten, daß 11 von 39 Pflanzen Hüllprotein enthielten; der Rest enthielt kein Hüllprotein und diente als Kontrolle für dieses Experiment.
Fünf Tage nach Inokulation produzierten 3 von 11 (27%) der Kontrollpflanzen typische Symptome von TMV-Infektion. Keine der Pflanzen, die TMV-Hüllprotein enthielten, zeigte solche Symptome.
Sechs Tage nach Inokulation produzierten 45% der Kontrollpflanzen typische Symptome von TMV-Infektion. Hingegen zeigten lediglich 18% der Pflanzen mit TMV-Hüllprotein solche Symptome.
Sieben Tage nach Inokulation produzierten 82% der Kontrollpflanzen typische Symptome von TMV-Infektion. 57% der Pflanzen mit TMV- Hüllprotein zeigten solche Symptome.
Acht Tage nach Inokulation hatten 82% der Kontrollpflanzen Symptome produziert, die typisch für TMV-Infektion sind. 64% der Pflanzen mit TMV-Hüllprotein zeigten solche Symptome.
Die Beobachtung einer wesentlichen Verzögerung im Ausbruch der Symptome angesichts einer massiven Attacke durch das Virus ist ein Anzeichen, daß die transformierten Pflanzen wesentlich resistenter gegenüber dem Virus sind, als die nichttransformierten Pflanzen. Das Ausmaß der in diesen Experimenten beobachteten erhöhten Resistenz zeigt, daß die transformierten Pflanzen in der Lage sind, der Art von infektiösem Kontakt zu widerstehen, der wahrscheinlich auf offenem Feld oder in einem Gewächshaus stattfindet.

Beispiel 3: Charakterisierung der Resistenz gegenüber Viruserkrankung in transgenen Pflanzen

A. Dosis-abhängige Reaktion in Tabak

Für diese Experimente wurden Sämlinge von in Beispiel 2 beschriebenen transformierten Tabakpflanzen verwendet. Pflanzen, für die mittels der vorstehend beschriebenen Immunoblot-Techniken bestimmt worden war, daß sie die CP-kodierende Sequenz exprimieren oder die CP-kodierende Sequenz nicht exprimieren, wurden in drei Gruppen geteilt und mit einer TMV-haltigen Suspension (gemeiner Stamm U1) inokuliert, wie vorstehend beschrieben. Die drei Gruppen wurden mit einer Suspension mit TMV bei Konzentrationen von 0,4 µg/ml, 0,8 µg/ml bzw. 2,0 µg/ml inokuliert. Die inokulierten Pflanzen wurden in ein Gewächshaus gestellt und hinsichtlich Symptomen von Virusinfektion beobachtet. Das Balkendiagramm von Abb. 6 zeigt die Resultate dieses Experiments. Die Daten zeigen eindeutig, daß die Pflanzen, die das Hüllprotein exprimierten, bei ungefähr 0,4 µg/ml oder weniger ziemlich resistent gegenüber dem Virus waren.

B. Dosis-abhängige Reaktion in Tomate

Eine Kultur von A. tumefaciens-Zellen, die das Cointegratplasmid pMON319::pTiB6S3-SE enthielten, wurde wiederum unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens mit Blattscheibchen kontaktiert, die von Tomatenpflanzen gewonnen worden waren. Kanamycinresistentes Gewebe, das das CaMV35S/TMV-CP/NOS-Konstrukt enthielt, wurde selektiert und zu Pflanzen regeneriert. Die Testpflanzen waren Sämlingnachkommen der selbstbefruchteten transgenen Tomatenpflanzen. Die Kontrollpflanzen fiir dieses Experiment waren nichttransformierte parentale Pflanzen und nichtexprimierende Sämlingnachkommen.
Test- und Kontrollpflanzen wurden mit einer TMV-haltigen Suspension bei Konzentrationen zwischen 0,5 µg/ml und 20 µg/ml nach dem Inokulationsverfahren von Beispiel 2 inokuliert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abb. 7 dargestellt. Wie in Abb. 7 gezeigt, zeigten alle Kontrollpflanzen Symptome viraler Infektion innerhalb der 30 Tage-Periode. Zusätzlich zeigten Kontrollpflanzen einen unmittelbareren Ausbruch von Symptomen mit erhöhter Menge an viralem Inokulum. Im Gegensatz dazu waren die Sämlinge, die das TMV-Hüllprotein exprimierten, im wesentlichen gegenüber TMV-Infektion resistent und entwickelten, wenn überhaupt, Infektionssymptome nicht vor 30 Tage nach Inokulation.

C. Vergleich mit genetischer Resistenz

Um die Resistenz weiter zu charakterisieren, die den vorstehend beschriebenen Sämlingnachkommen erfindungsgemäß verliehen worden war, wurde die Antwort von Tomatenpflanzen, die bekannt dafur sind, daß sie eine genetische Determinante für ToMV-Resistenz enthalten, auf ToMV- Inokulation mit der entsprechenden Antwort transgener Pflanzen verglichen, die unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2 hergestellt worden waren. Genauer gesagt wurden Pflanzen der Sorte "Craigella", in die die Resistenzdeterminanten Tm-2 oder Tm-2a mittels herkömmlicher Züchtungstechniken eingeführt worden waren, mit einem ToMV-Stamm mit der Bezeichnung "ToMV2" bzw. "ToMV2A" angeimpft. (Daten bezüglich der relativen Sensitivitaten von Pflanzen, die verschiedene Resistenzdeterminanten gegenüber ToMV-Infektion verschiedener Stämme tragen, einschließlich ToMV2 und 2a, sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.) Eine Testgruppe, die transgene Pflanzen einer ansonsten ToMV2-sensitiven Sorte umfaßte ("VF36"), wobei die Pflanzen transformiert worden waren und TMV-Hüllprotein exprimierten, wurde ebenfalls mit den gleichen Virusstämmen inokuliert wie eine Kontrollgruppe nichttransformierter VF36-Pflanzen. Pflanzengruppen ToMV-Stämme Transgen * = TMV-Stamm PV230 + = Empfänglich - - Resistent
14 Tage nach Inokulation wurden fünf Pflanzen in jeder Gruppe in bezug auf Krankheitssymptome bewertet. Innerhalb von 14 Tagen nach Inokulation entwickelten sowohl alle Kontrollpflanzen als auch alle Pflanzen, die die Tm-2-Determinante enthielten, Symptome von ToMV2-Infektion; drei von fünf transgenen Pflanzen zeigten Symptome über den gleichen Zeitraum (siehe Abb. 8). Die Daten in der vorstehenden Tabelle zeigen, daß transgene Pflanzen einen Grad an Resistenz zeigen, der wesentlich besser ist als der der nichttransformierten Kontrollen und darüber hinaus gegenüber mehreren Stämmen von ToMV nicht selektiv ist (siehe auch Abb. 8). Im Gegensatz dazu ist die genetische Resistenz in ihrem Umfang deutlich enger. Unter den Testpflanzen zeigten am Ende 60% Zeichen von Infektion, die Symptome waren jedoch weniger schwer als die der Tm-2-Pflanzen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die durch CP-Expression in den Testpflanzen verliehene Resistenz gegenüber ToMV2 vergleichbar, wenn nicht gar besser war, als die genetische Resistenz, die durch TM-2 kodiert wird.

Beispiel 4: Cross-Protection gegenüber verschiedenen Stämmen von Tabakmosaik-Virus

Transformierte Tomatenpflanzen, die das CaMV35S/TMV-CP/NOS-Konstrukt enthielten, wurden in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise hergestellt. Sämlingnachkommen von selbstbefruchteten transgenen Tomatenpflanzen waren die Testpflanzen für dieses Experiment. Kontrollpflanzen waren Sämlingnachkommen, die nicht das TMV-Hüllprotein exprimierten, sowie normale nichttransforrnierte Pflanzen des parentalen Typs.
Test- und Kontrollpflanzen wurden mit zwei verschiedenen Stämmen von TMV inokuliert:
PV-230: Ein virulenter Stamm von TMV der von der ATCC erhalten wurde (Zugangs-Nr. PV-230).
L-TMV: Ein Stamm, der bekannt dafür ist, daß er Tomatenpflanzen infiziert.
Test- und Kontrollpflanzen wurden mit jedem der vorstehend genannten TMV-Stämme bei Konzentrationen von 2 µg/ml bzw. 20 µg/ml nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren inokuliert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abb. 9 dargestellt. Die Daten zeigen deutlich, daß die transgenen Tomatenpflanzen, die das TMV-Hüllprotein exprimierten, gegenüber TMV-Infektion resistent waren. Resistenz wurde gegenüber beiden getesteten TMV-Stämmen gezeigt. Darüber hinaus entwickelte ein größerer Prozentsatz von Tomatenpflanzen (von 40% bis 100%) innerhalb von 29 Tagen nach Inokulation keine Symptome, trotz der Verwendung des virulenten Stammes PV-230 bei einer so hohen Konzentration wie 20 µg/ml.

Beispiel 5: Kontrolle des Virus-Hüllproteingens durch verschiedene Promotoren

Es wurde ein Experiment durchgeführt, um die Verwendung anderer Promotoren in der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren und die Korrelation zwischen dem Grad der Hüllproteinexpression und der Virusresistenz zu zeigen.
Die Gruppe I-Pflanzen waren Sämlingnachkommen transgener Tabakpflanzen, die, wie in Beispiel 2 beschrieben, transformiert worden waren, damit sie das CaMV35S/TMV-CP/NOS-Konstrukt enthielten.
Die Gruppe II- und III-Pflanzen waren Sämlingnachkommen transgener Tabakpflanzen, die wie die Gruppe 1-Pflanzen zur Expression des TMV- Hüllproteingens transformiert worden waren, mit dem Unterschied, daß der CaMV35S-Promotor durch einen ssRUBISCO-Promotor von Petunien (Tumer et al. (1986)) mittels des folgenden Verfahrens ersetzt wurde.
Das 11A-Kleine-Untereinheit-(ss)-Promotorfragment von Petunien wurde durch Spaltung mit EcoRI aus einem im Bakteriophagen Lambda enthaltenen genomischen Klon (Tumer et al. (1986)) isoliert. Bin resultierendes 1,3 kb-EcoRI-Fragment, das den Promotor trägt, wurde weiter mit PstI verdaut und für ortsspezifische Mutagenese zwischen die PstI- und Eco-RI-Schnittstellen des Phagen M13 mp8 inseriert, um eine BglII-Schnittstelle in die 5'nichttranslatierte Sequenz des Kleine-Untereinheit-Transkripts einzuführen (Abb. 10). Eine partielle Sequenz des Petunia-11A-ss- Promotors und des Mutageneseprimers erscheint in Abb. 11. Nach Schneiden mit EcoRI und BglII wurde das resultierende 800 bp-Fragment in Plasmid pMON200 inseriert, das mit EcoRI und BglII geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid pMON8046 wurde mit EcoRI verdaut, mit dem großen Klenow-Fragment der DNA-Polymerase und mit DNA-Ligase behandelt. Es wurde ein Plasmid isoliert, das die EcoRI- Schnittstelle verloren hatte, und pMON8048 genannt (siehe Abb. 10).
Um eine Petunia-ss-NOS-3'Kassette zu konstruieren, wurde das Plasmid pMON311, ein Derivat von pMON200, in dem die SmaI-Schnittstelle durch einen BamHI-Linker ersetzt worden war, aus dem dann durch Behandlung mit Klenow-Polymerase und Ligase die BamHI-Schnittstelle entfernt wurde, mit Stul und HindIII verdaut. Das resultierende 8 kb- Fragment wurde dann mit dem 300 bp-BglII-bis-HindIII-Fragment, das von pMON316 gereinigt worden war, und dem 2,6 kb-StuI-bis-BglII- Fragment von pMON8048 gemischt. Das resultierende Plasmid pMON8049 ist pMON316 ähnlich, mit dem Unterschied, daß der CaMV35S-Promotor durch den Petunia-ss-Promotor ersetzt worden ist (Abb. 12). Das vorstehend beschriebene 700 bp-Fragment mit der für TMV-CP-kodierenden Sequenz, das am 5'Ende eine BglII-Schnittstelle und am 3'Ende eine EcoRI-Schnittstelle enthält, wurde in Plasmid pMON8049 inseriert, das mit BglII und EcoRI geschnitten worden war, um Plasmid pMON8059 (siehe Abb. 12) zu erhalten, das ein Petunia-ss- Promotor/TMV-CP/NOS-Konstrukt trägt.
Die Gruppe IV-Pflanzen wurden transformiert, um lediglich Plasmid pMON200 zu enthalten, und dienten als Kontrollpflanzen.
Jede Gruppe enthielt 30 Pflanzen, die gemäß dem in Beispiel 2(D) beschriebenen Verfahren mit TMV inokuliert wurden. Nach Inokulation wurden die Pflanzen in das Gewächshaus gestellt und bezüglich Symptomen von Virusinfektion beobachtet.
Die relativen Mengen an TMV-Hüllprotein wurden mittels Western Blot- Analyse abgeschätzt. Es wurden die folgenden Bestimmungen durchgeführt, wobei der Durchschnittswert für das Ausmaß der Expression des Hüllproteingens bei den Gruppe I-Pflanzen auf 100% festgesetzt wurde: Durchschnittswert der CP-Expression Gruppe Prozent Pflanzen mit Symptomen Gruppe (Tage nach Inokulation)
Die vorstehend gezeigten Daten stützen die folgenden Schlußfolgerungen:
(1) Der Promotor der kleinen Untereinheit von Ribulose-bis-phosphat- Carboxylase ist ein effektiver Promotor zur erfindungsgemäßen Verwendung, obwohl er in bestimmten Pflanzen nicht so stark wie der CaMV35S-Promotor sein mag;
(2) Es besteht eine positive Korrelation zwischen dem Grad der Expression an Hüllprotein und der Virusresistenz.

Beispiel 6: Resistenz gegenüber Viruserkrankung in transgenen Pflanzen, die ein Virus-Hüllproteingen (Luzernemosaik-Virus) enthalten

Ein DNA-Konstrukt, das die kodierende Sequenz für das Hüllprotein von Luzernemosaik-Virus (alfalfa mosaic virus coat protein; AMV CP) umfaßte, wurde unter Verwendung einer Strategie hergestellt, die der für das Engineering von TMV-Resistenz verwendeten entsprach. Ein cDNA- Klon voller Länge, der für das Hüllprotein von AMV kodierte, wurde erhalten, wie nachstehend beschrieben und in Abb. 13 skizziert. Die AMV-Hüllprotein-cDNA wurde an den CaMV35S-Promotor und das NOS-3'Ende fusioniert, wie vorstehend beschrieben. Das Konstrukt kann dann unter Verwendung des Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems in Pflanzen transferiert werden.
Die vollständige Nucleotidsequenz des dreiteiligen RNA-Genoms von AMV ist bekannt. Die Daten zeigen, daß das AMV-Genom für vier primäre Genprodukte kodiert: Ein 126 Kilodalton(kd)-Protein, das von RNA 1 kodiert wird, ein 90 kd-Protein, das von RNA 2 kodiert wird, und ein 32 kd-Protein, das von RNA 3 kodiert wird. Das Hüllprotein wird von einem subgenomischen Messenger transiatiert, bezeichnet als "RNA 4", der zu den 3'terminalen 881 Nucleotiden von RNA 3 homolog ist; Barker et al. (1983b).
Um eine cDNA voller Länge zu synthetisieren, die für das Hüllprotein von AMV kodiert, wurden synthetische Oligonucleotidprimer sowohl für die Synthese des ersten als auch des zweiten Stranges der cDNA verwendet. Unter Bezugnahme auf Abb. 13 schlossen die verwendeten Primer einmalig vorkommende EcoRI-Schnittstellen an jedem Ende der kodierenden Sequenz für das AMV-Hüllprotein ein. Der erste Strang der cDNA wurde von 5 µg AMV-Gesamt-RNA und 55 ng Primer in einer 100 µl-Reaktion unter Verwendung von 4 mM Natriumpyrophosphat und Reverser Transkriptase synthetisiert. Mittels dieses Verfahrens wurden cDNAs synthetisiert, die ein Molekulargewicht von 1,04 x 10&sup6; (RNA 1), 0,73 X 10&sup6; (RNA 2) und 0,68 X 10&sup6; (RNA 3) Dalton aufwiesen. Nachdem die RNA-Matrize hydrolysiert war, wurden die cDNA-Produkte auf einer P-60-Säule fraktioniert. Die einzeisträngige cDNA wurde mit dem Primer für den zweiten Strang hybridisiert und mit Reverser Transkriptase inkubiert. Die resultierende doppelsträngige cDNA enthielt AMV- Hüllproteinsequenzen flankiert von EcoRI-Schnittstellen an jedem Ende.
Nach Verdauung mit EcoRI wurden die cDNAs in die EcoRI-Schnittstelle von pUC9 inseriert, und E. coli-JM1O1-Zellen wurden transformiert und auf Medien selektioniert, die Ampicillin, IPTG und X-Gal enthielten. Es wurden etwa 1000 Transformanten erhalten. 25% der Transformanten hybridisierten sowohl mit 5' als auch 3'spezifischen Primern. Von 3 Positiven wurde DNA präpariert, und Verdauung mit EcoRI zeigte die Anwesenheit von Inserts der erwarteten Größe (881 bp). Durch Nucleotidsequenzierung ( 100 bp an jedem Ende) wurde bestätigt, daß diese Klone tätschlich Inserts voller Länge des AMV-Hüllproteins enthielten.
Das 881 bp-EcoRI-Fragment, das für das AMV-Hüllprotein kodierte, wurde in den Pflanzenexpressionsvektor pMON316 in Sense-Orientierung (pMON9800) inkorporiert. Die Struktur von pMON9800 ist in Abb. 13 dargestellt. Diese Vektoren wurden dann in Tabak, Tomate und Petunie unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems transferiert.
Um die Expression von AMV-Hüllprotein-mRNA weiter zu untersuchen, wurde Northern Blot-Analyse an Kallus-Gewebe von transgenen Tabakpflanzen (cv. "Samsun") durchgeführt, die das AMV-Hüllproteingen in Sense-Orientierung (pMON9800) enthielten. Gesamt-RNA (40 µg) von pMON9800 und pMON273, einem von pMON200 abgeleiteten Kontrollvektor, dem die für AMV CP-kodierende Sequenz fehlt, wurde auf ein Agarosegel geladen, auf eine Membran (Gene Screen , hergestellt von New England Nuclear) transferiert und dann mit dem 881 bp-cDNA- Insert nachgewiesen, das fur das AMV-Hüllprotein kodierte. Eine Gruppe von Banden, die zur erwarteten Größe des Transkripts (1,2 kb) korrespondierte, zeigte sehr starke Hybridisierung. Es gab auch Transkripte geringerer Größe, die mit der Sonde hybridisierten. Es wurde keine Hybridisierung mit der Kallus-Kontrolle, die mit pMON273 transformiert worden war, nachgewiesen.
Für den Nachweis von AMV-Hüllprotein in transgenen und infizierten Pflanzen wurde auch ein Western Blot-Protokoll entwickelt. Eine kommerziell erhältliche Anti-AMV-IGG-Fraktion (Agdia Inc., Mishawaka, IN) wurde erfolgreich zum Nachweis des Hüllproteins in transgenen Tabakkalli und -blättern und in Blättern von transgenen Tomatenpflanzen verwendet. Genauer gesagt wurden 30 µg Protein von transgenen Tabakkalli und Kontroll-Tabakkalli sowie 40 µg Protein von transgenem Material und Kontrollmaterial von Tomatenpflanzen auf einen Western Blot appliziert, was zu einer immunoreaktiven Bande mit einem Molekulargewicht um 28-29 kd führte, die Comigration mit einem gereinigten Standard von AMV-Hüllprotein zeigte.
Transgene Tabakpflanzen, für die gefünden wurde, daß sie das AMV- Hüllprotein exprimierten, wurden mit AMV inokuliert. Ebenfalls wurden Kontrollpflanzen inokuliert, die entweder nicht transformiert oder mit dem Vektor pMON316 transformiert worden waren. Die Entwicklung von Symptomen wurde täglich in der Kultivierungskammer überprüft. Die verwendeten Kontrollpflanzen und transgenen Pflanzen waren bezüglich Größe, physischer Erscheinung und Entwicklungsstadium (alle begannen Blüten zu bilden) gleich. Drei Blätter der Kontrollpflanzen bzw. der transgenen Pflanzen wurden mit einem Extrakt von ANIV-infizierten Pflanzen inokuliert. Anschließende Titrationsanalyse zeigte, daß die Konzentration des verwendeten AMV in diesem Inokulum etwa bei 50 µg/ml lag.
Die inokulierten Blätter der transgenen Kontrolltabakpflanzen und der nichttransformierten Tabakpflanzen zeigten Symptome eine Woche nach Infektion mit AMM Im Gegensatz dazu zeigte keine der CP-exprimieren den transgenen Pflanzen Symptome innerhalb einer Woche nach Infektion; nach zehn Tagen hatte eine der letzteren Pflanzen eine oder zwei Läsionen auf einem der drei inokulierten Blätter. Zwei Wochen nach Infektion blieb die Zahl der Läsionen auf den inokulierten Blättern der Kontrollpflanzen gleich, jedoch zeigten nicht inokulierte obere Blätter Symptome (chlorotische Ringe), die gleichmäßig über die Oberfläche der Blätter verteilt waren. Die transgenen Testpflanzen, die das ANIV-Hüllprotein produzierten, zeigten keine (oder keine zusätzlichen) Symptome sowohl auf den inokulierten als auch auf den systemischen (nichtinokulierten) Blättern.
Die Replikation von AMV in den transgenen Pflanzen und den Kontrollpflanzen wurde durch Untersuchung der Menge an Hüllprotein mittels Western Blot- und Dot Blot-Analysen bestimmt. Eine Woche nach Infektion wurden in den transgenen Pflanzen durch Western Blotting lediglich Hintergrundmengen an Expression nachgewiesen, d.h. die Menge an nachgewiesener Expression war mit der Menge an endogener Expression der eingeführten Hüllprotein-kodierenden Sequenz vergleichbar. Andererseits enthielten die Kontrollpflanzen wesentlich höhere Mengen an AMV- Hüllprotein. Quantifizierung der Hybridisierungssignale durch densitometrisches Scanning zeigte einen 211fachen Unterschied zwischen den transgenen und den nichttransformierten Kontroll-Tabakpflanzen. Die transgenen Tabakkontrollen zeichneten sich durch AMV-Hüllproteinmengen aus, die zwischen 111- und 815mal höher lagen als die Mengen bei den AMV-Transformanten. Diese Ergebnisse zeigen, daß die AMV-Replikation in transgenen Pflanzen, die das Protein herstellen, wesentlich geringer ist.

Beispiel 7: DNA-Konstrukt, das die kodierende Sequenz für das Hüllprotein von Kartoffel-X-Virus enthält

Ein Konstrukt, das die kodierende Sequenz für das Hüllprotein von Kartoffel-X-Virus (potato Virus X coat protein; PVX CP) enthielt, wurde mittels eines Verfahrens hergestellt, das dem für das Engineering der TMV- und ANIV-Konstrukte verwendeten entsprach. Kartoffel-X-Virus (potato virus X; PVX), das zu der Gruppe der Potexviren gehört, enthält eine einzelne, infektiöse genomische RNA von 2 x 10&sup6; Dalton. Die Region des 3'Endes der PVX-RNA ist kloniert und sequenziert worden. Diese Region enthält das Hüllproteingen, das für ein Protein kodiert, das eine Länge von 237 Aminosäureresten aufweist; Zakharyev et al. (1984).
Eine cDNA-Kopie, die das PVX-Hüllproteingen mit Ausnahme der ersten zehn Kodons des 5'Endes enthielt, wurde von polyadenylierter viraler RNA von PVX synthetisiert. Die cDNA-Kopie, bezeichnet mit "Klon p3a", wurde in die PstI-Schnittstelle von pBR322 mittels des dG/dC- Tailingverfahrens von Zakharyev et al. (1984) kloniert. Um das 5'Ende des Gens zu reparieren, wurde ein synthetisches BamHI-PstI-Fragment verwendet, das 18 Basen der authentischen 5'nichtkodierenden Sequenz unmittelbar vor und 22 Kodons nach dem Initiationskodon ATG enthielt, um das kleinere PstI-PstI-Fragment zu ersetzen, das den dG/dC-Schwanz und die Kodons 11 bis 22 enthielt. Der dG/dC-Schwanz und ein Teil des dA/dT-Abschnitts am 3'Ende des Gens wurden durch Bal31-Verdauung des größeren in pUC18 klonierten HpaII-PstI-Fragments subkloniert, und eine ClaI-Schnittstelle wurde durch Linkeraddition kreiert. Das XhoI- ClaI-Fragment (etwa 170 bp) wurde verwendet, um das XhoI-ClaI-Fragment zu ersetzen, das die ursprüngliche 3'Ende-Sequenz von p3a bzw. die PstI-ClaI-Sequenz von pBR322 enthielt.
Das Endkonstrukt enthielt die cDNA mit 18 bp der 5'nichtkodierenden Region, 657 bp der kodierenden Region der Hüllproteinsequenz (einschließlich TAA, dem Translationsterminationskodon), 72 bp der 3'nichtkodierenden Region und 40 bp des dA/dT-Abschnitts in pEMBL12(+) (siehe Abb. 14). Die Sequenz des PVX-Hüllproteingens ist in Abb. 15 dargestellt. Ein horizontaler Pfeil zeigt die 5'Grenze der PVX-Sequenz in p3a. Die von der synthetischen DNA abgeleitete Region ist mit einer gewellten Linie oberhalb der Sequenz markiert. Restriktionsschnittstellen, die fiir die Konstruktion verwendet wurden, sind unterstrichen. Unterschiede zwischen den vorliegenden Sequenzdaten und den von Zakharyev et al. (1984) publizierten sind unterhalb der Sequenz angegeben, und die kodierten neuen Aminosäuren sind oberhalb der ursprünglichen dargestellt.
Die cDNA voller Länge des PVX-Hüllproteingens wurde in von pMON505 abgeleitete Expressionsvektoren inseriert, unter Verwendung entweder des CaMV35S-Promotors (pMON9818) oder des ssRUBISCO- Promotors (pMON9819) und des rbcS-E9-3'Endes; Odell et al. (1985). Die folgenden Vektoren wurden zur Expression des PVX-Hüllproteingens hergestellt und mittels des in Beispiel 2 beschriebenen Agrobacteriumvermittelten Transformationssystems in Tabakpflanzen transferiert:
(a) pMON9809 - Die kodierende Sequenz für das PVX-Hüllprotein wurde in Sense-Orientierung in pMON9818 zwischen den CaMV35S- Promotor und das rbcS-E9-3'Ende inseriert;
(b) pMON9811 - Ein 5'Fragment der kodierenden Sequenz des PVX- Hüllproteins wurde in Sense-Orientierung in pMON9818 inseriert;
(c) pMON9813 - Die kodierende Sequenz für das PVX-Hüllprotein wurde in Sense-Orientierung in pMON9819 zwischen den rbcS8B- Promotor und das E9-3'Ende inseriert.
Die Pflanzen können mit PVX inokuliert werden, und der Grad der Virusresistenz kann bestimmt werden, wie vorstehend beschrieben.
Anders als die mRNA von AMV sind Potexvirus-RNAs polyadenyliert, was einen alternativen Ansatz für die cDNA-Synthese erlaubt, indem für die Synthese des ersten Stranges Oligo-dT als Primer und für die Synthese des zweiten Stranges DNA-Polymerase oder Reverse Transkriptase von Avian-myoblastosis-Virus verwendet wird. Die doppelsträngige DNA kann, wie vorstehend in diesem Beispiel ausgeführt, zur Isolierung und Expression der Hüllprotein-Sequenz in Pflanzen manipuliert werden.

Beispiel 8: DNA-Konstrukt, das die kodierende Sequenz für das Hüllprotein von Tomato-golden-mosaic-Virus enthält

Ein Plasmid, das ein DNA-Konstrukt mit einer kodierenden Sequenz umfaßte, die in der Lage war, die Produktion der mRNA für das Hüllprotein von Tomato-golden-mosaic-Virus (TGMV) zu verursachen, wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid pBH404 (Bisaro et al. (1982)) wurde mit XHoII verdaut, und das Fragment von etwa 1 kb, das sich von Nucleotid 312 bis 1285 erstreckte (Hamilton et al. (1984)), das die kodierende Sequenz des TGMV-Hüllproteins (TGMV coat protein; TGMV CP) trägt, wurde isoliert (siehe Abb. 16). Das Fragment wurde in pMON530 inseriert, wobei dieses Plasmid durch Spaltung von pMON200 mit NdeI zur Entfernung eines NdeI-Fragments von 900 bp konstruiert worden war. Dies üihrte zu Plasmid pMON503, das mit HindIII und SmaI geschnitten und mit dem Plasmid pTJS75 (Schmidhauser & Helinski (1985)) gemischt wurde, das ebenfalls mit HindIII und SmaI geschnitten worden war. Ein resultierendes Plasmid, welches das 3,8 kb-HindIII-SmaI-Fragment von pTJS75 verbunden mit dem 8 kb- pMON503-Fragment enthielt, wurde gewonnen und pMON505 genannt. Die CaMV35S-NOS-Expressionskassette von pMON316 (siehe Abb. 3) wurde auf einem 2,4 kb-StuI-HindIII-Fragment isoliert und mit pMON505-DNA gemischt, die mit StuI und HindIII geschnitten worden war.
Das resultierende Plasmid pMON530 (siehe Abb. 16) wurde mit BglII verdaut, und das 1 kb XHoII-Fragment mit der kodierenden Sequenz für das TGMV-Hüllprotein wurde inseriert. Es wurde ein Plasmid identifiziert, das das 1 kb-Fragment in der Sense-Orientierung enthielt. Dieses Plasmid, genannt "pMON401", trug ein CaMV35S/TGMV-CP/NOS-Konstrukt (siehe Abb. 16). Mittels im wesentlichen dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Tabakpflanzen mit pMON401 transformiert. Selbstbefruchtung dieser Pflanzen, die gegenüber Kanamycin resistent waren, ergab Sämlingnachkommen, die gemäß dem vorstehend ausgeführten Ansatz bezüglich Virusresistenz gestestet werden können.

Beispiel 9: Klonierung des Hüllproteingens von Gurkenmosaik-Virus (Cucumber Mosaic Virus; CuMV)

Der Größe nach fraktionierte genomische RNA des Stammes CuMV-D (erhältlich von J.M. Kaper, USDA Agricultural Research Service, Beltsville, Maryland), die bezüglich RNA 4 angereichert war, wurde in der Weise polyadenyliert, daß die geschätzte Anzahl von AMP-Resten pro CuMV-RNA-Molekül etwa 30 betrug. Um doppelsträngige cDNA zu synthetisieren, wurde die Verfahrensweise von Wickens et al. (1978) zur Herstellung des ersten Stranges der cDNA adaptiert. Genauer gesagt wurden 80 µl eines Reaktiongemisches, das 3 µg der polyadenylierten CuMV-RNA 4, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 140 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 19 mM beta-Mercaptoethanol, 1,5 µg (dT)&sub1;&sub5;, 0,5 mM dNTPS, 20 µCi [alpha-³²P]-dCTP (3000 Ci/mmol; New England Nuclear) und 48 Einheiten Reverse Transkriptase von AMV (Life Sciences, Inc.) enthielt, für 90 Minuten bei 42ºC inkubiert. 4 µl 0,5 M EDTA wurden dann zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, das anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann mit 20 µl 0,5 Tris-HCl (pH 7,5) erneut extrahiert wurde. Das Produkt wurde durch zwei aufeinanderfolgende Präzipitationen mit einem Drittel Volumenteil 8 M Ammoniumacetat und zwei Volumenteilen Ethanol frei von Nucleotiden gewonnen.
Die cDNA der vorstehend genannten Reaktion wurde getrocknet und in 40 µl Wasser resuspendiert. Die Synthese des zweiten Stranges wurde von Gubler & Hoffman (1983) adaptiert. Die cDNA in 40 µl Wasser wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, das 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 5 mM MgCl&sub2;, 100 mM KCl, 0,2 mg/ml BSA, 0,1 mM dNTPS, 30 Einheiten DNA-Polymerase I (New England Biolabs), 20 µCi [alpha-³²P]-dCTP und 2 Einheiten RNAse H (BRL) in einem Volumen von 0,1 ml enthielt. Dieses Reaktionsgemisch wurde zunächst bei 11ºC für eine Stunde und dann bei 22ºC für eine Stunde inkubiert. Das Produkt wurde in der gleichen Weise, wie bezüglich der Synthese des ersten Stranges der cDNA beschrieben, gewonnen.
Gemäß den bei Huynh et al. (1985) beschriebenen Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA mit EcoRI-Methylase methyliert, mit phosphorylierten EcoRI-Linkern (New England Biolabs) ligiert, mit dem Enzym EcoRI verdaut und dann von überschüssigen Linkem abgetrennt. Die cDNA wurde dann mittels Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel mit Marker-DNA in flankierenden Spuren aufgetrennt. Die Marker wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, und ein Gelstückchen, das cDNA mit Größen von etwa 900-1300 bp enthielt, wurde ausgeschnitten. Die cDNA wurde elektroeluiert, in Anwesenheit von 5 µg Glykogenträger (Boehringer Mannheim Biochemicals) präzipitiert und in einem Volumen H&sub2;O resuspendiert, das mit einem Ligationsreaktionsvolumen von 10 µl vereinbar war. Die cDNA wurde dann bei Raumtemperatur für vier Stunden mit 20 ng EcoRI-verdauter, mit Phosphatase behandelter pEMBLI2(+)-DNA ligiert. Die resultierenden Plasmide wurden dann in E. coli des Stammes JM101 transformiert. Kolonien wurden anhand von Ampicillinresistenz wie auch anhand weißer Färbung auf Platten selektiert, auf denen 0,6 mg X-Gal und IPTG verteilt worden waren. Die Insertgröße wurde durch EcoRI-Verdauung von Minipräp- DNA (Maniatis et al. (1982)) bestimmt.
Sechzehn Klone mit Inserts im Bereich zwischen 600 und 1300 bp wurden einem weiteren Screening mittels Didesoxy-Sequenzierung unterzogen, um die Anwesenheit von Sequenzen zu bestimmen, die zum CMV-Hüllprotein des Stammes X homolog waren, wie von Gold & Symons (1982) berichtet. Der längste Klon wurde vollständig sequenziert, um zu bestätigen, daß cDNA voller Länge für CuMV CP erhalten worden war. Die kodierende Sequenz für das CuMV-Hüllprotein kann in die Expressionsvektoren pMON9818 und pMON9819 (siehe das vorstehende Beispiel 7) kloniert werden. Diese Vektoren können verwendet werden, um aus der kodierenden Sequenz des CuMV-Hüllproteins Sense- Sequenzen herzustellen.
Die folgenden Vektoren wurden konstruiert und in Pflanzen transferiert:
pMON9816 - Die kodierende Sequenz für das CuMV-Hüllprotein in pMON9818 in Sense-Orientierung.
Diese Vektoren wurden in Agrobacterium-Zellen gemäß Beispiel 2 eingeführt, und es wurden transformierte Tomaten- und Tabakpflanzen hergestellt. Diese Pflanzen können, wie vorstehend beschrieben, mit CuMV inokuliert werden, und der Grad der Virusresistenz kann bestimmt werden.

Beispiel 10: Manipulation von RNA von Kartoffelblattroll-Virus

Gereinigtes Kartoffelblattroll-Virus (potato leafroll virus; PLRV) wurde von Dr. Pete Thomas (USDA Agricultural Research Station, Prosser, Washington) erhalten, und intakte virale RNA mit einer Größe von etwa 6 kb wurde davon isoliert. Diese RNA kann mittels E. coli-poly(A)- Polymerase polyadenyliert werden; der erste Strang der cDNA kann dann, wie vorstehend beschrieben, durch Priming mit Oligo-dT synthetisiert werden. Anschließend kann der zweite Strang der cDNA unter Verwendung von DNA-Polymerase 1 in Anwesenheit von RNAse H gemäß Gubler & Hoffman (1983) synthetisiert werden.
Die so hergestellte doppelsträngige cDNA kann mit EcoRI-Methylase methyliert, mit EcoRI-Linkern ligiert und dann mit EcoRI-verdautem pEMBLI2(+) gemäß dem vorstehenden Beispiel 9 ligiert werden. Die resultierenden Plasmide können in E. coli JM1O1 (Messing & Vieira (1982)) transformiert werden, und die so erhaltenen rekombinanten Klone können unter Verwendung von Antikörpern gegen PLRV wie von Thomas (1983) beschrieben, einem Screening unterzogen werden. Ein cDNA- Segment, für das gefunden wurde, daß es für das virale Hüllprotein kodiert, kann erhalten werden, indem man eine neue Restriktionsschnittstelle und ein ATG-Translationsinitiationskodon unmittelbar neben (vis- - vis dem 5'Ende) dem Kodon für die NH&sub2;-terminale Aminosäure des reifen Hüllproteins einführt. Dies kann mittels des Verfahrens von Zoller & Smith (1982) erreicht werden.

Beispiel 11: Manipulation von DNA von Blumenkohlmosaik-Virus

Die kodierende Sequenz für das Hüllprotein von Blumenkohlmosaik-Virus (cauliflower mosaic virus; CaMV) kann auf einem 1,6 kb-Fragment durch Spaltung des Plasmids posl (Howarth et al. (1981)) mit AccI, gefolgt von Behandlung mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase und Spaltung mit BamHI erhalten werden; das Plasmid selbst kann von Dr. Robert Shepherd (University of Kentucky, Lexington) erhalten werden. Nachdem das 1,6 kb-Fragment elektrophoretischer Auftrennung auf einem Gel unterzogen worden ist, kann es unter Verwendung einer NA-45- Membran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) gereinigt und mit pMON316-DNA gemischt werden, die mit EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt und mit BglII verdaut wurde.
Behandlung mit Ligase ergibt ein rekombinantes Plasmid, das die kodierende Sequenz für das CaMV-Hüllprotein enthält, wobei dieses Plasmid, wie vorstehend beschrieben, für die Transformation von Zellen verwendet werden kann. Diejenigen Zellen, die das Plasmid mit der kodierenden Sequenz in Sense-Orientierung enthalten, können durch Verdau der Plasmid-DNA mit Hindill identifiziert werden, d.h. diese DNA wird HindIII-Fragmente von 1,1 und 0,7 kb sowie ein größeres Fragment des Restes des Plasmids zeigen. Plasmid-DNA, die eine korrekt orientierte kodierende Sequenz für das CaMV-Hüllprotein enthält, kann dann kloniert und in Pflanzenzellen eingeführt werden, die wiederum zu vollständigen Pflanzen regeneriert werden können. Die Virusresistenz dieser transformierten Pflanzen kann anschließend gemäß dem vorstehend ausgeführten grundlegenden Ansatz bestimmt werden. Beispielsweise kann die Resistenz transformierter Tabakpflanzen durch Inokulation mit den CaMV-Stämmen W260, W262 und W283 getestet werden, die Tabak infizieren; Gracia & Shepherd (1985).

Beispiel 12: DNA-Konstrukt mit der kodierenden Sequenz für das TMV- Hüllprotein, kontrolliert durch den MAS-(2')-Promotor

Ein DNA-Fragment mit dem MAS-Promotor wurde aus dem Plasmid pNW 34C-2-1 (Garfinkel et al. (1981)) ausgeschnitten, das das BamHI-2- Fragment des Octopin-Typ-pTiA6-Plasmids mit EcoRI (21.631) und ClaI (20.138) enthält (die Zahlen in den Klammern sind die Koordinaten der Spaltungsstellen aus der publizierten Sequenz der Octopin-Typ-Ti-Plasmid- T-DNA-Sequenz von Barker et al. (1983a)). Das resultierende 1503 bp Fragment wurde gereinigt und in das EcoRI und ClaI-gespaltene Plasmid pMON505 (Horsch & Klee (1986)) inseriert, um pMON706 herzustellen. Das NOS3'Ende wurde aus pMON530 mit BglII und BamHI ausgeschnitten. Das 298 bp-NOS3'Fragment wurde neben dem 3'Ende des MAS-Promotors in die BglII-Schnittstelle von pMON706 eingeführt, um pMON707 herzustellen.
Die resultierende MAS-Promotor-NOS3'Kassette in pMON707 wurde in einen Vektor des cointegrierenden Typs transferiert, indem pMON707 mit StuI und HindIII geschnitten und dann das 3,2 kb-Fragment, das das chimäre NOS-NPTII'NOS-Kanamycinresistenzgen und die MAS-Promotor- NOS3'Kassette trug, isoliert wurde. Dieses Fragment wurde zu dem 7,7 kb-StuI-bis-HindIII-Fragment von pMON200 gegeben. Das resultierende Plasmid, pMON9741, ist analog zu pMON316, enthält jedoch eine Expressionskassette, in der der MAS-Promotor den CaMV35S-Promotor ersetzt.
Die kodierende Sequenz für TMV-CP kann erhalten werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, oder durch Verdau von pTM319-DNA mit BglII und BamHI, wie von Abel et al. (1986) beschrieben. Das CP-kodierende 700 bp-Fragment kann dann in das Plasmid pMON9741 inseriert werden, das mit BglII geschnitten wurde. Ein Plasmid, bei dem das CP-Insert in bezug auf den Promotor und NOS3' in Sense-Orientierung vorliegt, kann durch Verdau der Plasmid-DNA mit BglII und EcoRI identifiziert werden, um den MAS-Promotor auf einem 1,5 kb-Fragment und die CP- kodierende Sequenz auf einem Fragment von 700 bp freizusetzen. Das resultierende Plasmid kann dann durch Mating in A. tumefaciens gebracht werden, und A. tumefaciens-Zellen, die das MAS/TMV-CP/NOS3' Konstrukt enthalten, können verwendet werden, um, wie vorstehend beschrieben, transformierte Tabak- und Tomatenpflanzen zu erhalten. Die transformierten Pflanzen können in der vorstehend beschriebenen Weise bezüglich Virusresistenz getestet werden.

Beispiel 13: Transformation von Pflanzenzellen mit freien DNA-Vektoren unter Verwendung einer Elektroporationstechnik

Die folgende Beschreibung umreißt ein nicht auf Agrobacterium basierendes Verfahren zur Einführung freier DNA, um für die Zwecke, Resistenz gegenüber Viruserkrankung zu erhalten, Plasmid-DNA in eine Vielzahl von Pflanzenzellen einzuführen, von denen die äußeren Membranen entfernt wurden (Protoplasten).

A. Protoplastenisoliemng und Kultivierung in Dicotyledonen-Arten

Zellkulturen von Sojabohne [Glycine max (GM)], Petunie [Petunia hybrida Mitchell (MP4)] und Karotte [Daucus carota (TC)] wurden gemäß Widholm (1977) in 250 ml-Erlenmeyerkolben auf Rotationsschüttlern (135 U/min; 27-28ºC), in 50 ml MS-Kulturmedium (Murashige & Skoog (1962)), das 0,4 mg/l 2,4-D für TC und GM oder 0,2 mg/l p-Chlorphenoxyessigsäure für MP4 enthielt, kultiviert.
Protoplasten von GM bzw. TC wurden durch Inkubieren eines Volumens von 10 ml gepackte Zellen von exponentiell wachsenden Suspensionskulturzellen für etwa 12 Stunden in 40 ml Enzym, das in 10% Manitol und 0,1% CaCl&sub2; x 2H&sub2;O (pH 5,7) gelöst worden war, hergestellt. Das Enzymgemisch enthielt 2% Cellulase R-10 (Klnki Yakult, Nishinomiya, Japan), 0,1% Macerozym R-10 (Kinki Yakult) und 0,5% Pectolayase Y- 23 (Seishin Pharmaceutical Co. Ltd., Noda, Chiba, Japan). Die resultierenden Protoplasten wurden isoliert, gereinigt und kultiviert, wie von Hauptmann & Widholm (1982) beschrieben.
Mesophyllprotoplasten von MP4 wurden, wie von Fraley et al. (1984) beschrieben, isoliert und kultiviert, mit dem Unterschied, daß das verwendete Enzymgemisch das gleiche war wie das für die Suspensionskulturen verwendete.

B. Protoplastenisolierung und -kuitivierung in Monocotyledonen-Arten

Zellen von Monocotylen wurden von Weizen [Triticum monococcum (TM) und Triticum aestiuum (TA), wie von Maddock et al. (1983) und Ozias-Aklns & Vasil (1983) beschrieben], Elefantengras [Pennisetum purpureum (PP), wie von Vasil et al. (1983) und Karlsson & Vasil (1986) beschrieben], Guineagras [Panicum maximum (PM), wie von Lu & Vasil (1981) und Karlsson & Vasil (1986) beschrieben], Reis [Oryza sativa (OS), wie von Heyser et al. (1983) und Yamada et al. (1986) beschrieben], Mais [Zea mays (ZM), wie von Meadows (1982) beschrieben], Zuckerrohr [Saccharum officinarum (SC), wie von Ho & Vasil (1983) und Srinivasin & Vasil (1985) beschrieben] und einem zweifach gekreuzten, dreifach spezifischen Hybrid zwischen Pennisetum americanum, P purpureum und P. squamulatum (PAPS), offenbart von Dujardin & Hanna (1984), gewonnen. Suspensionskulturen von PM und PAPS wurden in einem modifizierten MS-Medium (Vasil & Vasil (1981)) kultiviert, das 5% Kokosnußmilch und 2 mg/l 2,4-D enthielt, wohingegen das MS-Medium, das für SC-Kulturen verwendet wurde, zusätzlich 500 mg/l Caseinhydrolysat enthielt. Die TM-Suspensionskultur wurde in Flüssigmedium gemäß Dudits et al. (1977) kultiviert. Die anderen monocotylen Zellkulturen wurden kultiviert, wie jeweils in den vorstehend zitierten Referenzen beschrieben. Ausgenommen TM und PAPS, die zweimal wöchentlich subkultiviert wurden, wurden alle Suspensionen nach einem 7-Tage-Subkultivierungsschema kultiviert, mit 2-8 ml Inokulum in 35 ml Medium. Vor der Protoplastenisolierung wurden die Suspensionen am vierten bis fünften Tag mit 5-8 ml Inokulum in 25-35 ml Medium subkultiviert.
Protoplasten wurden für jeden monocotylen Zelltyp isoliert, wie von Vasil et al. (1983) beschrieben, unter Verwendung verschiedener Enzymgemische, die in 3 mM MES, 0,45 M Manitol, 7 mM CaCl&sub2; x 2H&sub2;O und 0,7 mM NaH&sub2;PO&sub4;OH (pH 5,6) gelöst worden waren. Die Enzymgemische schlossen 1,0% Cellulase RS (Kinki Yakult) und 0,8% Pectinase (Sigma) für TM und PM, 2% Cellulase RS und 0,7% Pectinase für SC, 3% Cellulase R-10 und 0,7% Pectinase für PP und 2,5% Cellulase R-10 und 0,75% Pectinase für PAPS ein.
Die isolierten monocotylen Protoplasten wurden dann in 8p-Medium (Vasil & Vasil (1980)), wie von Kao & Michayluk (1975) modifiziert, kultiviert. Das Kulturmedium enthielt 0,4-0,5 M Glucose, 0,5-1,0 mg/l 2,4-D und 0,2 mg/l Zeatin und wurde nach einer Woche 1:2,3 mit Protoplasten-Kulturmedium verdünnt. Um die Plattierungseffizienz von PAPS und TM zu bestimmen, wurden nach 2-3 Wochen die Äquivalente von 2 ml der ursprünglichen Protoplastenkultur mit Suspensionskulturmedium, das 0,4% Seaplaque-Agarose (FMC) enthielt, auf 36 ml verdünnt. 3 ml der verdünnten Kultur wurden dann in einer 10 cm Petrischale auf eine Schicht desselben Mediums mit 0,6% Agarose ausplattiert.

C. Einführung freier DNA durch Elektporation

In Anwesenheit von Plasmid-DNA, die das Kanamycin-Resistenzgen enthielt, wurden Protoplasten unter Verwendung des Zimmerman-Cell- Fusion-System (GCA Precision) oder einer Kondensatorentladungsbank (Fromm et al. (1985)) einer Elektroporation unterzogen. Die Elektroporation mit dem Zimmerman-Cell-Fusion-System wurde in einer Zimmerman- Helical-Fusion-Chamber oder in einer aus Küvetten und Platin- oder Aluminiumfolie konstruierten Elektroporationskammer gemäß dem Verfahren von Potter et al. (1984) durchgeführt. Pulse (240 V Gleichstrom) wurden mit 999,9 µsek in Serien von jeweils 9 Pulsen verabreicht. Jede Pulsserie wurde 1-, 10-, 50- bzw. 100mal in Anwesenheit von 14 µg Plasmid-DNA mit und ohne 50 µg Kalbsthymus-DNA in der Protoplasten-Waschlösung verabreicht.
Eine Kondensatorbank wurde konstruiert, um jeweils vier Kondensatoren von 40, 110, 240 und 340 µF zusammen mit einem Kondensator von 100 und einem von 2400 µF (Mallory) zu enthalten; die Kondensatoren konnten einzeln oder parallel geladen und entladen werden. Die Pulsentladung wurde unter Verwendung eines Zwei-Kanal-Aufnahmeoszilloskops (Tectronics Modell 584B) verfolgt. Die Amperezahl wurde während der Elektroporation durch Messung der Entladung über einen Widerstand von 1 Ohm bestimmt.
Vor der Elektroporation wurden die Protoplasten einmal in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl&sub2; und 0,2 M Manitol (pH 7,2) gewaschen und dann auf eine Dichte von ungefähr 3 x 106 Protoplasten/ml unter Verwendung des gleichen Puffers gebracht; Fromm et al. (1985). Zu 1 ml resuspendierter Protoplasten wurden 20 µg Plasmid-DNA hinzugegeben und gemischt. Die Protoplasten wurden unter Verwendung verschiedener Voltzahlen und Kapazitäten einer Elektroporation unterzogen. Die Protoplasten wurden für ungefähr 10 Minuten auf Eis gehalten, wonach das Plattieren in flüssigem Kulturmedium durchgeführt wurde.
Um die Anzahl von dicotylen Protoplasten abzuschätzen, die durch verschiedene Elektroporationsbehandlungen lysiert worden waren, wurde die Dichte an TC-Protoplasten vor und unmittelbar nach Verabreichung der Pulsentladung bestimmt; die gemessenen Werte wurden als Prozent Überleben ausgedrückt. Die Bestimmungen der Überlebensfähigkeit basierten auf Ausschlußfärbung mit Phenosafranin zwei Tage nach Elektroporation, wie von Widholm (1972) beschrieben. Die Ergebnisse wurden als Prozent Überlebensfähigkeit im Vergleich zu einer nicht elektroporierten Kontrolle ausgedrückt. Eine Abschätzung der Plattierungseffizienz einer Elektroporation unterzogener monocotyler Protoplasten wurde durch Zählung der Zahl der Kolonien erhalten, die sich nach 3-4 Wochen Kultivierung gebildet hatten, und wurde als Prozent einer nicht einer Elektroporation unterzogenen Kontrolle ausgedrückt.
Transformierte Kolonien wurden nach Transfer in Kanamycin-haltiges Medium, wie von Fromm et al. (1986) beschrieben, selektiert. In der gleichen Weise können Plasmide wie pMON319, pMON401, pMON9800, pMON9809 und pMON9816, die ein durch Engineering erhaltenes Virus- Hüllprotein und den auf Kanamycin selektierbaren Marker enthalten, für die Transformation mit freier DNA verwendet werden. Regenerierte Pflanzen können bezuglich der Produktion von Hüllprotein-mRNA und Protein unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren untersucht werden.

REFERENZEN

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung genetisch transformierter Pflanzen, die gegenüber Infektion durch ein Pflanzenvirus resistent sind, umfassend die Schritte:

a) Insertion in das Genom einer Pflanzenzelle eines rekombinanten, doppelsträngigen DNA-Moleküls, umfassend:

i) einen Promotor, der in Pflanzenzellen wirkt, um die Produktion eines mRNA-Polynucleotids zu verursachen;

ii) ein DNA-Polynucleotid mit einer Sequenz, die dem mRNA- Polynucleotid entspricht, wobei das mRNA-Polynucleotid eine Sequenz aufweist, die für das Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, des Pflanzenvirus kodiert;

iii) eine 3'nichttranslatierte Region, die in Pflanzenzellen wirkt, um die Addition von Polyadenylat an das 3'Ende des mRNA-Polynucleotids zu verursachen;

b) Gewinnung transformierter Pflanzenzellen, die Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, exprimieren; und

c) Regeneration genetisch transformierter Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Infektion durch das Pflanzenvirus aufweisen, aus den transformierten Pflanzenzellen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das DNA-Polynucleotid von dem Pflanzenvirus abgeleitet ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Promotor ein Pflanzen-DNA-Virus-Promotor ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin der Promotor ein 35S-Promotor von Blumenkohlmosaik-Virus ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Promotor ein Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Promotor ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Promotor ein Pflanzengenpromotor ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin der Promotor ein Ribulose-bis- phosphat-Carboxylase-Kleine-Untereinheit-Promotor ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Promotor ein Promotor eines Gens ist, das für ein Hydroxyprolin-reiches Glycoprotein kodiert.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Promotor ein Mannopin-Synthase-Promotor ist.

10. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, worin das DNA-Polynucleotid (ii) eine doppelsträngige, virale DNA ist, oder eine doppelsträngige DNA, die von einem viralen DNA- oder RNA-Polynucleotid synthetisiert worden ist.

11. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, worin das Pflanzenvirus ausgewählt ist aus Tabakmosaik-, Sojabohnenmosaik-, Bean-pod-mottle-, Tabakringflecken-, Gerstengelbverzwergungs-, Weizenstrichel-, Weizenspindelstrichel-, Soil-born-mosaic-, Maize-dwarf- mosaic-, Maize-chlorotic-dwarf-, Luzernemosaik-, Kartoffel-X-, Kartoffel-Y-, Kartoffelblattroll-, Tomato-golden-mosaic- und Gurkenmosaik-Virus.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, worin das Pflanzenvirus ein Tabakmosaik-Virus ist.

13. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, worin das Pflanzenvirus ausgewählt ist aus Sojabohnenmosaik-, Bean-pod-mottle-, Tabakringflecken-, Gerstengelbverzwergungs-, Weizenstrichel-, Weizenspindelstrichel-, Soil-born-mosaic-, Maize-dwarf-mosaic-, Maize-chlorotic-dwarf-, Luzernemosaik-, Kartoffel-X-, Kartoffel-Y-, Kartoffelblattroll-, Tomato-golden-mosaic- und Gurkenmosaik-Virus.

14. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, worin die transformierten Pflanzen zur Bestimmung der Resistenz gegenüber dem Pflanzenvirus einem Screening unterzogen werden.

15. Rekombinantes, doppelsträngiges DNA-Konstrukt, das eine Sequenz enthält, die einem Teil eines Pflanzenvirusgenoms entspricht, das für das Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, eines Virus kodiert, das nicht Tabakmosaik-Virus ist, wobei das Konstrukt in der 5'nach-3'Richtung der Transcription umfaßt:

ii) ein DNA-Polynucleotid mit einer Sequenz, die dem mRNA- Polynucleotid entspricht, wobei das mRNA-Polynucleotid eine Sequenz aufweist, die für das Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, eines Pflanzenvirus, das nicht Tabakmosaik-Virus ist, kodiert;

iii) eine 3'nichttranslatierte Region, die in Pflanzenzellen wirkt, um die Addition von Polyadenylat an das 3'Ende des mRNA-Polynucleotids zu verursachen, wobei das DNA-Molekül in der Lage ist, eine ausreichende Expression des Hüllproteins zu verursachen, um eine virale Infektion zu inhibieren oder wesentlich zu reduzieren.

16. DNA-Molekül gemäß Anspruch 15, wobei das Virus ausgewählt ist aus Sojabohnenmosaik-, Bean-pod-mottle-, Tabakringflecken-, Gerstengelbverzwergungs-, Weizenstrichel-, Weizenspindelstrichel-, Soil- born-mosaic-, Maize-dwarf-mosaic-, Maize-chlorotic-dwarf-, Luzernemosaik-, Kartoffel-X-, Kartoffel-Y-, Kartoffelblattroll-, Tomato-golden- mosaic- und Gurkenmosaik-Virus.

17. DNA-Molekül gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei der Promotor der 35S-Promotor eines Blumenkohlmosaik-Virus ist.

18. Pflanzentransformationsvektor, umfassend ein DNA-Molekül gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17.

19. Bakterienzelle, enthaltend einen Pflanzentransformationsvektor gemäß Anspruch 18.

20. Bakterienzelle gemäß Anspruch 19, wobei die Bakterienzelle eine Agrobakterium tumefaciens-Zelle ist.

21. Transformierte Pflanzenzelle, enthaltend DNA gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17.

22. Differenzierte Pflanze, umfassend transformierte Pflanzenzellen gemäß Anspruch 21, die Resistenz gegenüber dem Pflanzenvirus zeigen.

23. Pflanze gemäß Anspruch 22, wobei die Pflanze von einer Familie stammt, ausgewählt aus Leguminosae, Umbelliferae, Cruciferae, Cucurbitaceae und Solanaceae.

24. Pflanze gemäß Anspruch 22, wobei das Pflanzenvirus Luzernemosaik- Virus ist.

25. Pflanze gemäß Anspruch 24, wobei die Pflanze eine Tabakpflanze ist.

26. Pflanze gemäß Anspruch 24, wobei die Pflanze eine Tomatenpflanze ist.

27. Pflanzenvermehrungsmaterial, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17.

28. Genomische Pflanzen-DNA, in der ein DNA-Konstrukt gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17 stabil inkorporiert ist.

29. Verfahren zur Herstellung Virus-resistenter Pflanzen, umfassend die Schritte:

i) Insertion in das Genom einer Pflanzenzelle eines rekombinanten, doppelsträngigen DNA-Moleküls, umfassend:

a) einen Promotor, der in Pflanzenzellen wirkt, um die Produktion eines mRNA-Polynucleotids zu verursachen;

b) ein DNA-Polynucleotid mit einer Sequenz, die dem mRNA- Polynucleotid entspricht, das eine Sequenz aufweist, die für das Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, des Pflanzenvirus kodiert; und

c) eine 3'nichttranslatierte Region, die in Pflanzenzellen wirkt, um die Addition von Polyadenylat an das 3'Ende des mRNA-Polynucleotids zu verursachen;

ii) Gewinnung transformierter Pflanzenzellen, die Hüllprotein, oder einen wesentlichen Teil davon, exprimieren;

iii) Regeneration genetisch transformierter Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Infektion durch das Pflanzenvirus aufweisen, aus den transformierten Pflanzenzellen; und

d) Propagierung der Pflanzen.

30. Verfahren gemäß Anspruch 29, worin das Virus ausgewählt ist aus Tabakmosaik-, Sojabohnenmosaik-, Bean-pod-mottle-, Tabakringflekken-, Gerstengelbverzwergungs-, Weizenstrichel-, Weizenspindelstrichel, Soil-born-mosaic-, Maize-dwarf-mosaic-, Maize-chlorotic-dwarf-, Luzernemosaik-, Kartoffel-X-, Kartoffel-Y-, Kartoffelblattroll-, Tomato- golden-mosaic- und Gurkenmosaik-Virus.

31. Verfahren gemäß Anspruch 29 oder Anspruch 30, worin die transformierten Pflanzen zur Bestimmung der Resistenz gegenüber dem Pflanzenvirus einem Screening unterzogen werden.

32. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 29 bis 31, bei dem die Pflanze durch Kreuzung zwischen einer ersten Pflanze und einer zweiten Pflanze propagiert wird, wobei die erste oder die zweite Pflanze eine Pflanze gemäß Anspruch 29 ist, so daß mindestens einige Nachkommen der Kreuzung Resistenz gegenüber dem Pflanzenvirus zeigen.

33. Verfahren zur Herstellung von Pflanzenvermehrungsmaterial enthaltend ein DNA-Molekül wie in Anspruch 1 definiert, das die Herstellung genetisch transformierter Pflanzen durch ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 oder 29 bis 32 und die Gewinnung des Pflanzenvermehrungsmaterials aus den genetisch transformierten Pflanzen umfaßt.

34. Verfahren gemäß Anspruch 33, worin das Pflanzenvermehrungsmaterial ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 15 enthält.

35. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, worin ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 15 verwendet wird.

36. Verfahren gemäß Anspruch 29, worin ein DNA-Molekül gemäß Anpruch 15 verwendet wird.