JPH04500154A - キュウリモザイクウイルス外皮蛋白遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、ＣＭＶ−ＷＬからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウィルス３５５ プロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス遺伝子のポリアデニル化シグ ナルを含有する形質転換植物体細胞。

５、請求の範囲第４項記載の形質転換細胞よりなるウリ科またはナス科から選択 される植物体。

６、請求の範囲茅５項記載のウリ科植物体。

７、請求の範囲第５項記載のナス科植物体。

８、請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子を発現するウリ科植物体を増殖させ ることよりなるウィルス耐性ウリ科植物体の生産方法。

９、請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子を発現するナス科植物体を増殖させ ることを特徴とするウィルス耐性ナス科植物体の生産方法。

明細書 キュウリモザイクウィルス外皮蛋白遺伝子発明の分野 本発明は、キュウリモザイクウィルス株ＷＬ　（ＣＭＶ−ＷＬ）の外皮蛋白遺伝 子に関する。さらに詳しくは、本発明は、該遺伝子の製造方法、ならびにトラン スファーベクターへのその組込みおよびＣＭＶウィルス感染に対して耐性である 形質転換植物体細胞および形質転換植物体を得るためのその使用に関する。

発明の背景 キュウリモザイクウィルス（ＣＭ　Ｖ　）は機能的に分けられるゲノムを有する 一本１ｌｌｌ（＋）ＲＮＡ植物ウィルスである。該ウィルスのゲノムは、各々、 ＲＮＡＩ〜４と呼ばれる４種のＲＮＡ；３３８９ヌクレオチド（ｎｔ）、３０３ ５ｎ　ｔ、２１９３ｎｔおよび１０２７ｎｔを含有する（ベデンおよびシモンズ （Ｐｅｃｉｅｎ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）　。

１９７３；ボルドおよびシモンズ（Ｇｏｕｌｄ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）、　１ ９８２　；レザイアンら（Ｒｅｚａｉａｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９８４；レザイア ンら（Ｒｅｚａｉａｎｅｔ　ａｌ）、１９８５）、ＲＮＡｌ−３のみが感染性Ｉ こ必要である（ペデンおよびシモンズ（Ｐｅｄｅｎ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）　 ＋　１９７３　）。何故ならば、ＲＮＡ４によってコード付けされる外皮蛋白は ＲＮＡによってもコード付けされるからである。ＣＭＶ　ＲＮＡの翻訳により、 ＲＮＡ１から９５ＫＤａｌポリペプチド、ＲＮＡ３から９４ｋＤａｌポリペプチ ド（ゴルドンら（Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、ｌ　９８３）およびＲＮ　Ａ　３ から２種のポリペプチドが得られ：その５″端部は３５ＫＤａｌポリペプチドを コード付けし、その３′端部は２４．５ｋＤａｌポリペプチドをコード付けする （ボルドおよびシモンズ（にｏｕｌｄ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）。

１９８２）、該２４．５ｋＤａ、ＩポリペプチドはＲＮＡ４によってコード付け されるものと同一であって、外皮蛋白である。

血清学（デベル不オよびカルディン（Ｄｅｖｅｒｇｎｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｄｉｎ ）、１９７３．１９７５）、宿主範囲（マロウら（Ｍａｒｒｏｗ　ｅｔ　ａｌ） 、１９７５）、ペプチドの７７ビング（ユドワーズおよびゴンサルベズ（Ｅ＋ｊ ｗａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ）、ｌ　９８３　）　、および核酸ハ イブリダイゼーション（ビアゾロら（Ｐｉａｚｚｏｌｏ　ｅｔ　ａｌ）、Ｉ　９ ７９　；ボンダおよびシモンズ（Ｇｏｎｄａ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）　、ｌ　 ９７８　）を用い、キュウリモザイクウィルスのいくつかの株が分類されている 。これらのＣＭＶ株はＳおよびＷＴと呼ばれる２つの群に分けることができる。

ＣＭＶ−Ｑ株のゲノムは完全に配列決定されている（レザイアンら（Ｒｅｚａｉ ａｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９８４，１９８５．ボルドおよびシモンズ（Ｇｏｕｌｄ 　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）、１９８２；デビエスおよびシモンズ（Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ）　１９８８　）　ａ該Ｑ株は３メンバーよりなる５群の うちの１メンバーである。該ＷＴ群は少なくとも１７メンバーをもつことが知ら れている。ヌクレオチド配列分析およびＣＭＶ−ＣおよびＣＭＶ−ＷＬからの外 皮蛋白遺伝子の比較（クエマダら（Ｑｕｅｍａｄａ　ｅｔａｌ）、執箪中の原稿 ；第１：を参照）から、本発明者らは、０株はＷＴ群に属し、一方、ＷＬは５群 に属することを突き止めた。株ＣおよびＷＬからの外皮蛋白遺伝子のヌクレオチ ドおよびアミノ酸配列は各々２２．７％および１６％異なる（第２章および第３ を参照）。

いくつかのウィルス［タバコモザイクウィルス（ボウェルーアベルら（Ｐｏｗｅ ｌｌ−Ａｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ）、ｌ　９８６）　、アルファルファモザイクウィ ルス（レソシューフリエスら（Ｌｏｅｓｃｈ−Ｆｒｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ）、Ｉ　 ９８７；トウー？−ら（Ｔｕｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ｌ　９８７　）　、キュウ リモザイクウィルス（クオゾら（Ｃｕｏｚｚｏ　ｅｔ　ａｌ）、１９８８　；ク ユマダおよびスライトム（Ｑｕｅｍａｄａ　ａｒｉｄ　Ｓｌｉｇｈｔｏｍ）、執 箪中）、およびジャガイモウィルスｘ（ヘメンウエイら（Ｈｅｍｅｎｗａｙ　ｅ ｔ　ａｌ）、ｌ　９８８］について示されているごとく、遺伝子導入植物体にお ける外皮蛋白の発現の結果、各ウィルスによる感染ｌ二対して耐性な植物体が得 られる。

しかしながら、この設計した干渉作用が特定のウィルスのすべての株まで拡張さ れるか否かは突き止められていない。２のＣＭＶ群は外皮蛋白遺伝子が約１６％ だけ異なるようであり、かくして、両ウィルス外皮蛋白の発現には野生条件下で 期待できるＣＭＶ感染に対する設計しｊ；干渉作用を確実とする必要があろう。

ＣＭＶ外友外向蛋白遺伝子物ゲノムに移入され組み込まれたときにその発現に必 要なシグナルを含有していない。その翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の５′側に構成 的プロモーターおよびその翻訳終始フトンの３′側にポリＡ付加シグナル（ＡＡ ＴＡＡＡ）を含有するよう設計しなければならない。植物体で機能するいつくか のプロモーターが利用できるが、本発明者らは、最良のプロモーターはカリフラ ワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）からの３５３＊成的プロモーダーであると信 する。該ポリＡシグナルはＣａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓ遺伝子またはいずれかの数の よく特徴付けられている植物遺伝子、すなわちツバリンシンターゼ（ベバンら（ Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ）、ｌ　９８３　）　、オクトビンシンターゼ（デビソ カーら（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ｌ　９８２　）、および豆類貯蔵蛋 白遺伝子ファゼオリン（スライトムら（Ｓｌｉｇｈｔｏｍｅｔ　ａｌ）、ｌ　９ ８３）から得ることができる。主要部分を参照により一体化する「キュウリモザ イクウィルス外皮蛋白遺伝子（ＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｃ ０ａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅ）」なる発明の名称で、１９８７年１２月２ １日出願の米国特許比ａ１３５５９１号の優先権を主張するｗｏ８９１０５８５ ８号として１９８９年６月２９日に公開さしｆ：　Ｐ　ＣＴ特許ｆｆｌ［＋１Ｐ ｃＴ／ＵＳ８８１０４３２１ｊ：おけるＣ　Ｍ　Ｖ−Ｃ外皮蛋白の発現で用いた のと構築は同様である。

情報の開示 ウィルス病に耐性の植物体およびその生産方法がＥＰ２２３４５２号ｌ；記載さ れている。

以下の文献に含まれる情報もまた、遺伝子導入植物体での発現用ウィルス外皮蛋 白遺伝子を設計する興味ある物質、手法、および結果を記載している。

アン−シイら（Ａｎ、Ｇ−、ｅｔ　ａｌ）、　（１９８５）、［高等植物の形質 転換用の新しいクローニングビヒクル（Ｎｅｗ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｈｉｃｌ ｅｓ　ｆｏｒＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔ ｓ）　Ｊ　、　ＥＭＢＯＪ、　４　：　２２７〜２８４゜ アン・シイ（Ａｎ、Ｇ、）、　（１９８５）、「形質転換タバコ細胞における植 物体発現ベクターの開発およびツバリンシンターゼプロモーターの分化活性の分 析（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅ　ｆｏｒ　ａｎａｌ ｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ　ｎｏｐａ ｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅ ｄ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｃｅｌｌｓ）Ｊ。

プラント−フイジオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、８１：８６−８ ９゜ベバン・−ｚムら（Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、ｅｔ　ａｌ）、　（］　９８３）、 　ｒＴ−ＤＮ、Ａのツバリンシンターゼ遺伝子領域の構造および転写（Ｓｔｒｕ ｃｔｕｒｅ　ａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｐａｌｉ ｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ−ＤＮＡ）」、ヌ クリイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ）。

１１　：　３６９〜３７９゜ クオゾーＬムら（Ｃｕｏｚｚｏ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ）、　（１９８８）、　ｒキ ュウリモザイクウィルス外皮蛋白またはそのアンチセンスＲＮＡを発現する遺伝 子導入タバコ植物体におけるウィルス保護（Ｖｉｒａｌ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ　ｃｏａｔ　ｐｒ ｏｔｅｉｎ　ｏｒ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡＪ　、バイオ／チク（ Ｂｉ。

／１ｅｃｈ）、６．５４９−５５７゜ デビｘスーンイおよびシモンズ・アール（Ｄａｖｉｅｓ、Ｃ，ａｎｄ　Ｓｙｍｏ ｎｓ。

Ｒ，）、（］　９８８　）、ｒキュウリモザイクウィルスＲＮＡ３に基づく三深 裂植物ウィルス間の進化の関係についてのさらなる含意（Ｆｕｒｔｈｅｒｉｍｐ ｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｒｅｌａｔ ｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｒｉ−ｐａｒｔｉｔｅ　ｐｌａｎｔ　ｖ ｉｒｕｓｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕ ｓ　ＲＮＡ３）Ｊ、バイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）ｌ　６４　：印刷中。

デピカー・エイら（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ）、　ｒツバリンシン ターゼ：トランスクリプトマツピングおよびＤＮＡ配列（Ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ ｙｎｔｈａｓｅ：ｔｒａｎｃｒｉｐｔ　ｍａｐｐｉｎｇａｎｄ　ＤＮＡ　５ｅｑ ｕｅｎｃｅ力、ジャーナル・オブ°モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネ ティックス（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ−Ｇｅｎｅｔ、）、１　：　５６１−５７３ ゜デベルグネ・ジェイおよびカルディン・エル（ＤｅｖｅｒＨｎｅ、Ｊ、　ａｎ ｄＣａｒｄｉｎ、Ｌ、）、　（１９７３）　、　ｒキュウリモザイクウィルス（ ＣＭＶ）の研究に対する寄与。■その抗原構造に基づくいくつかの単離体の分類 寮験（Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａ　ｌ’ｅｔｕｄｅ　ｄｕ　ｖｉｒｕｓ　ｄ ｅ　Ｉａ　ｍｏｓａｉｑｕｅ　ｄｕｅｏｎｃｏｍｂｒｅ（ＣＭＶ）、ｆｆ　Ｅｓ ５ａｉ　ｄｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｄｅ　ｐｌｕｓｉｅｕｒｓ　ｊ ｓｏｌａ−ｔｓ　ｓｕｒ　Ｉａ　ｂａｓｅ　ｄｅ　１ｅｕｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒ ｅ　ａｎ＋ｊｇｅｎｉｑｕｅ）」、アヌ＋フイトバソル（Ａｎｎ、Ｐｈｙｔｏｐ ａｔｈｏｌ、）　、５　：　４０９−４３０゜デベルニ・ジェイおよびカルディ ン・工ＪしくＤｅｖｅｒｇｎｅ、Ｊ、　ａｎｄＣａｒｄｉｎ、Ｌ、）、（１９７ ５）　、ｒククモウイルス（ＣＭＶ、ＴＡＶ。

ｐｓｖ間の血清学的関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｑｕｅｓ　ｅ ｎｔｒｅ　ｃｕｃｕｍｏｖ１ｒｕｓ　（ＣＭＬ　ＴＡＶ、ＰＳＶ）Ｊ、アヌ・フ ィトパソル（Ａｎｎ、Ｐｙｔｏｐａｔｈｏｌ、）。

７：２５５〜２７６゜ ドソズ・ジェイー１イら（Ｄｏｄｄｓｊ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ）、（１９８５）、 「キュウリモザイクウィルスの株間の干渉作用：宿主および接種のタイプが攻撃 様のピリオンおよび二本鎖ＲＮＡの蓄積に与える影響（Ｃｒｏｓｓ　ｐｒｏｔｅ ｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｍｏ ｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｏｓｔ　ａｎｄ　ｔｙｐｅ　ｏ ｆ　ｉｎｏｅｕｌｕｍ　ｏｎ　ａｅｃｕｍｕｌａｉｔｏｎ　ｏｒ　ｖｉｒｉ−ｏ ｎｓ　ａｎｄ　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈ ａｌｌｅｎｇｅ　５ｔｒａｉｎ）、、１　、バイオロジー（Ｖｉｔｏｌｏｇｙ） 、１４４　：　３０１−３０９゜エドワーズ・エムおよびゴンサルベズ・ディ（ Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｍ、　ａｎｄＧｏｎｓａｌｖｅｓ、　Ｄ、）、（１９８３）　 、ｒペプチドマツピングによるキュウリモザイクウィルスの７種の生物学的には っきりとした単離体のグループ分け（Ｇｒｏｕｐｉｎｉｇ　５ｅｖｅｎ　ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　１ｓｏｌａｔｅｓｏｆ　ｃｕｃｕｍｂｅ ｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｂｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍａｐｐｉｎｇ）Ｊ　 、フイトパソロジ−（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、　７３　：　ｌ　ｌ　 １７−１１２０゜ゴング・ティおよびシモンズ・アール（Ｇｏｎｄａ、Ｔ、　ａ ｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ、Ｒ，）（１９７８）、ｒ植物ウィルス株間のＲＮＡ配列相 同性を決定するための相補的Ｄ　Ｎ　Ａとのハイブリダイゼーション分析の使用 ：そのククモウイルスのいくつかの株への適用（Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｈｙｂ ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒ ｙ　ＤＮＡ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ＲＮＡ　５ｅｑｕｅ−ｎｃｅ 　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｖ ｉｒｕｓｅｓ：Ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａ＋、１−ｏｎ　ｔｏ　５ｅｖｅｒａｌ　 ５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）」、パイロロジー（Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ）、８８　：　３６１−３７０゜ゴンサルベ７．−ディら（Ｇｏｎ ｓａｌｖｅｓ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ）、（１９８２）　。

「トマト白菜：明白なサテライトＲＮＡおよびキュウリモザイクウィルスの関係 （Ｔｏｍａｔｏ　ｗｈｉｔｅｌｅａｆ：Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏ ｆ　ａｎ　ａｐｐａｒ−ｅｎｔ　５ａｔｅｌｌｉｔｅ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｃｕｃ ｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ）Ｊ　、フイトバソロジー　（Ｐｈｙｔ ｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、　８　２　二　１　５　３　３−１　５　３　８　。

ゴルドン・ケイら（Ｇｏｒｄｏｎ、に、ｅｔ　ｓｌ）、（１９８２）　、ｒ高度 に精製したキュウリモザイクウィルスで誘導したＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー ゼはいずれのゲノミックＲＮＡの全長翻訳産物も含有しない（Ｈｉｇｈｌｙ　ｐ ｕｒｉｆｉｅｄ　ｅｕｃｕＩＩＩｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ−４ｎｄｕ ｃｅｄ　ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮ、Ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｄｏ ｅｓ　ｎｏｔ　ｃｏｎｔａｉｎ　ａｎｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ 　ｔｒａｎｓｌａｉｔｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ 　ＲＮＡ５Ｊ、パイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、ｌ　２３　：　２８４〜２ ９５゜ゴウルド・エイおよびシモンズ・アール（Ｇｏｕｌｄ、Ａ、　ａｎｄ　Ｓ ｙｍｏｎｓ。

Ｒ，）、（１９８２）、ｒキュウリモザイクウィルスＲＮＡ３゜ヌクレオチド配 列の決定は蛋白３Ａおよびウィルス外皮蛋白のアミノ酸配列を提供する（Ｃｕｃ ｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ＲＮＡ３、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ ｎ　ｏｆｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ 　ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｃｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎ　 ３Ａ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊニーロビーアン・ジ ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１２６ ：２１７〜２２７゜ ヘメンウニイ・シイら（Ｈｅｍｅｎｗａｙ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ）、　（１９８８ ）、　ｒジャガイモウィルスＸ外皮蛋白またはそのアンチセンスＲＮＡを発現す る遺伝子導入植物体における保護のメカニズムの分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓ ｇｅｎｊｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅ　ｐｏｔａｔｏ　ｖｉ ｒｕｓ　Ｘ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｒ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　 ＲＮＡ）　Ｊ　。

ＥＭＢＯＪ、、７　：１２７３〜１２８０゜ヘブバー７−ｘイら（Ｈｅｐｂｕｒ ｎ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ）、（１９８５）　、ｒアグロバクテリウムＴｉ−プラス ミドの遺伝子操作についての中間ベクターとしてのｐＮＪ５０００の使用（Ｔｈ ｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｐＮＪ５０００　ａｓ　ａｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｖ ｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒ−ｉｕｍ　Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄｓ）Ｊ、ジャーナル・オブ・ ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、 ）、　ｌ　３１　：　２９６１〜２９６９゜レシューフリース・ニスら（Ｌｏｅ ｓｃｈ−Ｆｒｉｅｓ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ）、（１９８７）。

「遺伝子導入植物体におけるアルファルファモザイクウィルスＲＮＡ４の発現は ウィルス耐性を付与する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｆａ１４ａｍｏｓ ａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ＲＮＡ４　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　 ｃｏｎｆｅｒｓ　ｖｊｒｕｓ　ｒｅｓｉｓｔ−ａｎｃｅ）、ＥＭＢＯＪ、６：　 １８４５−１８５１゜？Ｏつ・ジエイら（Ｍａｒｒｏｕ、Ｊ、、ａｔ　ａｌ）、 （１９７５）　、’その病原能によるＶＭＣ１２株の特徴付け：分類の試み（Ｃ ａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｄｅ　ｄｏｕｚｅ　５ｏｕｃｈｅｓ　ｄｕ　ＶＭ Ｃｐａｒ　１ｅｕｒｓ　ａｐｔｉｔｕｄｅｓ　ｐａｈＬｏｇｅｎｅｓ：Ｔｅｎｔ ａｔｉｖｅ　ｄｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）Ｊ　、　Ｍｅｄｅｄ−Ｆａ ｃ、Ｌａｎｄｂｏｕｔｉ＋ｗｅｔ、Ｒｉｊｋｓ。

Ｕｎｉｖ、Ｇｅｎｔ、、　４０　＋　ｌ　Ｏ７−１２２゜ベデン・ケイおよびン モンズ・アール（Ｐｅｄｅｎ、に、ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ、Ｒ，）。

（１９７３）、ｒキュウリモザイクウィルスは機能的に分けられるゲノムを含有 する（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａ　 ｆｕｎｃｉｔｏｎａｌｌｙｄｉ＋、「１ｄｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ）　Ｊ　、パイロ ロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、５３：４８７−ビアシラ・ビイら（Ｐｉａｚｚｏ ｌａ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ）、（１９７９）、　ｒ競合ハイブリダ・１′ゼー、ｌ 臼こよって判断した１８のキュウリモザイクウィルス単離体の核酸相同性（Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｏｌｏｌｏｇｉｅｓ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔｅｅｎｃｕｃ ｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　１ｓｏｌａｔｅｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎ ｅｄ　ｂｙ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎｈｙｂｒｉｄｉｚａ口ｏｎ）」、　’；〒 −ナル・オブ・ジェネラル・ノくイロロジ−（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）、４ ５　：　３６１−３６９゜ビニトルザク−ｘムら（Ｐｉｅｔｒｚａｋ、Ｍ、、ｅ ｔ　ａｌ）、（１９８６）Ｊ新し。

い植物発現ベクターでのプロトプラスト形質転換後の２の細菌抗生物質耐性遺伝 子の植物体における発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆｔ ｗｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅ ｎｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｗ ｉｔｈ　ａ　ｎｅｗ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ）」、 ヌクレオチド・アシニーリサーチ（Ｎｕｃ、、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１４　 ：　５８５７−５８６８゜ ポリテス・エイチおよびマロツティ・ケイ（Ｐｏｌｉｔｅｓ、Ｈ，ａｎｄＭａｒ ｏｔｔ、ｉ、Ｌ）。（１９８６）、ｒｃＤＮＡ合成のための段階的プロトコル（ Ａ　ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅ ｓｉｓ）　Ｊ　、バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、　４　 ：　５１４−５２０゜ポウェルーアベル・ビイら（Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌ、Ｐ 、、ｅｔ　ａｌ）、（１９８５）。

「タバコモザイクウィルス外皮蛋白遺伝子を発現する遺伝子導入植物体における 病気発生の遅延（Ｄｅｌａｙ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ 　ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｔｈａｔ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈ ｅ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ　ｇ ｅｎｅ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２　：　７３８−７４３゜ロザイ アンーｓムら（Ｒｏｚａｉａｎ、Ｍ、、ｅｔ　ａυ、（１９８４）、　ｒキュウ リモザイクウィルスＲＮＡ２のヌクレオチド配列は他のウィルスの対応する蛋白 に大いに相同な翻訳産物を明らかとする（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃ ｅ　ｏｆ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ＲＮＡ２　ｒｅｖｅ ａｌｓ　ａ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔ　５１ｇｎ１ｆｉｃａｎｔ ｌｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｏ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅ ｉｎｓｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｖｉｒｕｓｅｓ）　Ｊ　、ニーロビーアン・ジャーナ ル、オブ、７（イオケミストリ−（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、ｌ　４３ 　：　２７７−２８４゜ロザイアンー１ムら（Ｒｅｚａｉａｎ、Ｍ、、ｅｔ　ａ ｌ）、（１９８５）　、ｒキュウリモザイクウィルスＲＮＡ１のヌクレオチド配 列。ウィルスサテライトＲＮＡの一部に相補的な配列および他のウィルスＲＮＡ との相同性の存在（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃｕｃｕ ｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓＲＮＡｌ、　Ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｔｏ　ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔ ｈｅｖｉｒａｌ　５ａｔｅｌｌｉｔｅ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ 　ｗｉｔｈ　ｏｔｂｅｒ　ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ）、　ニーロビーアン・ジャーナ ル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ−Ｊ。

Ｂｉｏｅｈｅ＋ｎ、）　、ｌ　５０　：　３３１−３３９゜スライトム・ジェイ ら（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ）、　（１９８３）、　ｒインゲンマ メ貯蔵蛋白遺伝子：ファゼオリンの完全なヌクレオチド配列（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ 　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　Ｆｒｅｎｃｈ　ｂｅａ ｎ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｇｅｎｅ：Ｐｈａｓｅｏｌ　ｉｎ）　、プロシーディング ズ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイユンンズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、）Ｕ　Ｓ　Ａ　、　８０　：　１８９７〜ｌ　９０１゜ ヒユーマー−１ヌら（Ｔｕｍｅｒ、Ｎ、、ｅｔ　ａｌ）　、　（１９８７）、’ アルファルファモザイクウィルス外皮蛋白遺伝子の発現は遺伝子導入タバコおよ びトマト植物体において干渉作用を付与する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆａｌ ｆａｌｆａ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ 　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃ−ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇ ｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ａｎｄ　ｔｏｍａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ）、　ＥＭＢ ＯＪ、、　６　：１１８１〜１１８８゜ ビライン・エフおよびカセーデルバート・エフ（Ｖｉｌａｉｎｅ、Ｆ、　ａｎｄ Ｃａｓｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ、Ｆ、）、（１９８７）　、ｒアグロビン型のアグ ロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉプラスミドのＴＬおよびＴＲ領域による形質 転換機の独立誘導（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　１ｎｃｌｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔ ｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｒｏｏｔｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＴＬ　ａｎｄ　ＴＲｒｅｇｉ ｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｏｆ　ａｇｒｏｐｉｎｅｔｙｐｅ 　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、モレキュラー１アン ド０ジエネラル・ジェネティソス（＆ｌｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）、　２０ ６　＋　１７−２３゜発明の要約 本発明は：キュウリモザイクウイルスのＷＬ株（ＣＭＶ−ＷＬ）からの外皮蛋白 遺伝子、 ＣＭＶ−ＷＬからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワ・−モザイクウィルスの３５３ 遺伝子のプロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス３５３遺伝子のポリ アデニル化シグナルよりな乙種物体形質転換ベクター、 ＣＭＶ−ＷＬからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウィルスの３５５プ ロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ選ｆｆｌ子のポリアデニ ル化シグナルよりなる植物体形質転換ベクターを含有する細菌細胞、 ＣＭＶ−ＷＬからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロ モーターおよびカリフラワーモザイクウィルス遺伝子のポリアデニル化シグナル を含有する形質転換植物体細胞、ＣＭＶ−ＷＬの外皮蛋白遺伝子、カリフラワー モザイクウィルス３５５プロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス遺伝 子のポリアデニル化シグナルを含有する形質転換細胞よりなる植物体（本発明の 形質転換植物体はビート、柑橘類、トウモロコシ、キュウリ、コシヨウ、ジャガ イモ、大豆、スクワノシュおよびトマトを包含する。特に好ましいものは、ウリ 科（スクワッ／ユ、キュウリ）およびナス科（コシヨウ、トマト）である）、キ ュウリウィルスのＷＬ株からの外皮蛋白遺伝子を発現する植物体を増殖させるこ とよりなるウィルス耐性植物体の生産方法（特に好ましいものはウリ科およびナ ス科のメンバーの生産方法である）：を提供するものである。

好ましい具体例の記載 チャートｌないし５は本発明の詳細な説明するために記載する。

プラスミドおよびＤＮＡ断片を説明するのに用いるために以下のある種の約束を 用いる。

（１）単一線図は環状および線状二本鎖ＤＮＡを共に表す。

（２）星印（＊）は表す分子が環状であることを示す。星印の欠如は分子が線状 であることを示す。

（３）！能的成分の自然境界の間の結合は水平線に垂直な線によって示す。

（４）遺伝子または機能的成分を示す。

（５）遺伝子および制限部位の間の距離はスケールの通りではない。特に断りの ない限り、図は相対的位置のみを示す。

本発明を実施するのに用いるＤＮＡ組換え法のほとんどは、当業者によく知られ 、例えばここに参照のために挙げるＥＰ−２２３４５２に詳細に記載されている 標準的な手法である。酵素は商業的入手源から手に入れ、販売業者の推奨法また は当業者に公知の他の変形に従って用いる。ここに参照のＩ；めに挙げる、かか る標準的な技術を含有する一般的な文献は、以下の：アール・ウー（Ｒ，Ｗｕ） 編、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　 ６８巻；ジェイ・エイチ・ミラー（Ｊ、Ｈ，、Ｍｉｌｌｅｒ）、（１９７２）　 、分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　；ティ“マニアテイスら（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅ ｔ　ａｌ）、（１９８２）　、分子クローニング：実験室的手法（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｃ１ｃ）ｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｒ＋ｕａＪ） 　；およびディ・エム・グロバー（Ｄ、Ｍ、Ｇ］ｏｖｅｒ）編、（１９８５）、 デイエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｉｆ巻：ニス・ビイ ・ゲルビンおよびアーＪＬ、　・ｉイ・シルベロールト（Ｓ、Ｂ、Ｇｅ１ｖｉｎ 　ａｎｄ　Ｒ，Ａ−５ｃｈｉｌｐ−ｅｒｏｏｒｔ）編、植物体における導入、発 現および遺伝子産物の分析（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｅｘｐｒｅｑｓｉｏ ｎ、　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉ９ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　１ｎＰｌ ａｎｔｓ）を包含する。

実施例］　−ＣＭ　Ｖ　ＲＮ　Ａ　Ｏ！ｉ　１１１ｍキュウリモザイクウィルス 株Ｗ　Ｌ　（ＣＭ　Ｖ　−Ｗ　Ｌ　）をタバコ植物体（品種Ｈａｖａｎａ４２３ ）で増殖させ、標準的な方法。例えばロフトら（Ｌｏｔ　ｅｔ　ａｌ）の方法（ アナルズ・オブ・フイトバソロジ−（Ａｎｎａｌｓｏｆ　ＰｈｙｔｏｐａＬｈｏ ｌｏｇｙ）　４　：　２５　、ｌ　９７２）によってＲＮＡを単離した。蔗糖密 度勾配遠心法によってＲＮＡ３を他のＣＭＶ−ＷＬＲＮＡから分離した。

実施例２　ＣＭＶ−ＷＬ　ＲＮ狂９クローニング（ａ）二本鎖ｃＤＮＡ３の合成 オリゴｄＴプライマーのアニーリング用部位を生じさせるために精製シたＣ　Ｍ 　Ｖ　−Ｗ　Ｌ　ＲＮ　Ａ　３をポリアデニル化した。反応緩衝液は以下の通り であった：５μｆｆ、ＩＭトリスｐＨ７，９；　ｌｌｌθ。

ＩＭ　ＭｇＣＱ、：　２．５ｐＱ　、０．１Ｍ　ＭｎＣＯ３：　５μ（１，５μ ｆｆＮａＣＱ　；０．５ｐＱ、１００ｍＭ　ＡＴＰ＋　１８μ４．２．８ｒｎｇ ／　ｍ　Ｑウシ血清アルブミン。この緩衝液３．２μａをＣＭ　Ｖ　−Ｗ　Ｉ− ＲＮ、Ａ３　２μｇと混合した。水３．８μｇおよびポリＡポリメラーゼ１μａ を添加し、反応混合物を３７°Ｃで１０分間インキュベートしプこ。

０．７５ｍＭ　ＫＣＱを５０ｍＭ　ＮａＣＱの代わりに用い、１３０μＣｉ　／ 　ｌ　ＯＯｐＱ”Ｐ−ｄＣＴＰを１０〜５０μＣｉ　／　ｌ　ＯＯｐＱの代わり に用いる以外は、得られたポリアデニル化ＲＮＡを、ボリテスおよびマロソティ （Ｐｏｌｉｔｅｓ　ａｎｄ　Ｍａｒｏｔｔｉ）　（バイオテクニックス（Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）４　：　５１４　、ｌ　９８６　）のｃＤＮＡ合成プロ トコルで用いた。

ｄｓ−ｅＤＮＡを合成した後、Ｇ−１ｏｏカラムクロマトグラフイーによってそ れを精製し、ユタ７′−ルで沈殿させ、ＩＸ　ＥｃｏＲＩメチラーゼ緩衝液（ｌ ｏＯｎＭ　Ｎａ（Ｊｌ　、ｌｏｏｍＭ　トリス−ＨＣＱ　ｐＨ８，ｏ、ＩｍＭ　 ＥＤＴＡ、８０μＭ　Ｓ−アデノシルメチオニ７、　ｌ　ＯＯ／７　ｇ／ｍＯ， ウシ血清アルブミン）２０μρに懸濁し。

た。引き統いてのゲル分析用に２μｇ分を取り出した後、３２ｍＭ５−アデノシ ルメチオニン１μ０、次いでＲｃｏＲＩメチラーゼ１μＱ　（２０ユニット）を さらに反応混合物ミックスに添加した。

反応物を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、７０℃における１０分間のイン キュベーションによって停止した。

前記反応からの２μｇを取り出し、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｄ　Ｎ　Ａポリ メラーゼ■クレーノー断片１μＱ　（５ユニツト）を添加した。

反応物を３７°Ｃで１０分間インキュベートし、次いでエタノールでの沈殿前に フェノール／クロロホルムで抽出した。ベレットを７０％エタノール、次いで７ ０％エタノール１０．３Ｍ酢酸ナトリウム中で洗浄した。

ベレットを乾燥し、（コルラポラティブ・リサーチ・インコーホレイテッド（Ｃ ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、）、マサチューセッツ 州０２１７３、レキンントン、スプリング・ストリート（Ｓｐｒｉｎｇ　５ｔｒ ｅｅｔ）１２８番地から入手できる）０，５μｇ／μαリン酸化ＥｃｏＲＩリン カ−８μＱに再懸濁した。ＩＯＸリガーゼ緩衝液（８００ｒｎＭトリスーＨＣＱ 　ｐＨ８，０，２００ｍＭ　ＭｇＣＬ、１５０ｍＭＤ丁Ｔ、１０ｍＭ　ＡＴＰ） １ｐＯおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼ（４ユニツト／μＱ）１μＱを添加し、反応 物を１５°Ｃで一晩インキユベートした。

次いで、結んだ反応物を６５°Ｃにおける１０分間のインキュベーションによっ て停止した。水６０μｇ、１０ＸＥｃｏＲＩ塩（９００ｍＭ）リス　ｐＨ８，０ ，１００ｍＭ　ＭｇＣＱ２．１００ｍＭＮａＣ（１）ｌ　ＯｐＱ　１およびＥｃ ｏＲＩ（１０ユニツト／ｐＱ　）ｌ　ＯｐＱを添加し、反応物を３７℃で１時間 インキュベートした（引き統いてのゲル分析の開始時に５μＱ分を取り出した） 。フェノール／クロロホルムおよびクロロホルム抽出によって反応を停止した。

ゲル分析のために５μＱ分を取り出し、残りの半分を後で使用するために凍結し た。他の半分をＧ−１００カラムクロマトグラフイーによって精製したｅ　ｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａを含有するＧ−１００画分をブタノール抽出、エタノールでの沈殿に よって濃縮し、水１０μａに再懸濁した。引き続いての分析のために３μＱを取 り出した後、（ストラタジーン・コーポレイション（Ｓｔｒａ、ｔａｇｅｂｅ　 Ｃｏ、）　、カリフォルニア９２１２１、サンジエゴ、タンディ・ストリート３ ７７０番地より入手できる）ラムダｇｔｌｌまたはＺａｐミルアーム１μ、ＩＯ Ｘリガーゼ緩衝液１ｐＱ、およびＴ４　ＤＮＡリガーゼｌμａを添加し、反応物 を１５°Ｃで一晩インキユベートした。

結んで得られＩニラムダｇｔｌｌまたはＺａｐ／ｃＤＮＡ分子をパッケイジンジ 抽出物の製造業者（ギガバックＣＧｉｇａｐａｃｋ）、まＩ：ストラタジーン（ ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からも入手できる）によって推奨されている手法に従っ てパッケージした。これにより組換体ラムダ７アージを得、これを当業者ｌ二公 知の方法に従って平板培養した。

ＣＭＶ−ＷＬの精製したＲＮＡ４からの放射能標識した一本鎖ｃＤＮＡでのハイ ブリダイゼーシッンによって、外皮蛋白遺伝子を含有するラムダクローンを同定 した。このＲＮＡ４−末鎖ｃ　ＤＮＡは以下のごとくに合成した：ＲＮＡ４　５ ．８μｇを用いた以外はＣＭＶ−ＷＬ　ＲＮＡ３ｉ：ついて前記したごと＜ｌ： ＲＮＡ４分子をポリアデニル化した。第１鎖合成は、非放射性ｄＣＴＰを包含さ ぜる以外はポリテスおよびマロツティ（Ｐｏｌｉｔｅｓ　ａｎｄ　Ｍａｒｏｔｔ ｉ）　（バイオテクニクス（Ｂｉｏｔａｃｈｎｉｑｕｅｓ）　４　：　５１４　 、ｌ　９８６）によって記載されている通りであった。代わりに、放射能活性ｄ ＣＴＰの２６０μｃｉ／１００μｆｆを用イｌ二。

Ｐ６カラムクロマトグラフイーによって標識しｊ；−末鎖ｃ　ＤＮＡを精製し、 前記ラムダファージプレートから上げた複製フィルターをプローブするのに用い た。一本ｆｉ４　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、いくつかのファージクローンからのＤＮＡ とハイブリダイズし、それらが少なくともＣＭＶ−ＷＬ外皮蛋白遺伝子の一部を 含有することを示した。これらのラムダクローンのいくつかを増殖させ、それら からのＤＮＡを当業者に公知の方法に従って単離した。特に、ラムダクローンＷ Ｌ３ｚ８を単離し、約２．Ｏｋ　ｂノそツインサートは５’−１９３ｂｐ以外の ＣＭＶ−ＷＬ　ＲＮＡ３のすべてを含有する。

標準的な方法を用い、（メリーランド２０８７７、ガイセルスブルグ、私書箱６ ００９、ベセスダ・リサーチ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）から入手 できる）プラスミドベクターｐｔＪｃ１９にラムダクローンＷＬ３Ｚ８からのＥ ｃｏＲＮ断片を移し！；。次いで、ｐＵｃＩ９中のＥｃｏＲＩクローン化断片を 、マキサムおよびギルバー）　（Ｍａｘａｍａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）　（メソ ッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） ６５　：　４９９　、　１９８０）によって記載されている技術によって配列決 定した。この情報に基づき、ＣＭＶ−ＷＬ外皮蛋白遺伝子の完全な配列を決定し 、これをチャート】に示す、ＣＭＶ−Ｑ　ＲＮＡ３の完全な配列（ディビスおよ びシモンズ（Ｄａｖｉｓ　ａｎｄＳｙｍｏｎｓ）　、　ｌ　９８８　、バイｏｏ ジー（ＶｉｒｏＪｏｇｙ）　ｌ　６４　；印刷中）との比較によって決定したご とく、さらなる配列決定は、クローンｐＷＬ３Ｚ８．１はｃＭＶ−ＷＬ　ＲＮＡ ３分子の５’１９３ｂｐを除きすべてを含有することを示した。ＣＭＶ−ＷＬお よびＣＭＶ−Ｃのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、各々、２２．７％（チャ ート２＞８よび１６％（チャート３）だけ異なる。

実施例４　ＣａＭＶ　３５Ｓポリアデニル化シグナルと共Ｈｅｗｓ発現可能ＣＭ Ｖ−ＷＬｆｉ皮蛋白遺伝子を含有するミクロＴ−ＤＮＡの構築 ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを結合させるｊ； めに、（ＲＮＡ３の遺伝子開領域に位置する）Ａｐａ１部位から（クローニング 実験の間に結合させｆ）ＥｃｏＲＩ部位まで伸びる断片をラムダクローンＷＬ３ ２８から取り出し、（スイス国、ベイセル（Ｂａｓｅ））、　ＣＨ−４００２， 私書箱２５４３．フリードリソヒ・ミーシャー・インスティテコート（Ｆｒｉｅ ｄｒｉｃｈ　ＭｉｅｓｅｈｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）　、トーマス・ホーン（Ｔ ｈｏｍａｓ　Ｈｏｈｎ）から入手できる）ベクターｐＤＩ−１５１（ビニトルザ クら（Ｐｉｅｔｒｚａｋ　ｅｔ　ａｌ）、　ｌ　９　ｇ　５　）の多重クローン 化部位に結んだ。これは、ＷＬ　３２８をＡｐａｌで完全に、およびＥｃｏＲＩ で部分的に消化して、（マングビーンヌクレアーゼを用いて）適当なＡｐａｌな いＩ、ＥｃｏＲＩ　１ｃ１９０ｂｐ断片より平滑末端を生成させ、引き統いてそ れをｐＤＨ５１のＳｍａ１部位ｊこ結ぶ（チャート４）ことによって達成された 。

ｐ　ＤＨ５１／ＣＰＷＬと命名したこのクローンをマキサムギルバート法によっ て配列決定して植物体における発現のためのその適当性を確認した。

次いで、植物体発現可能外皮蛋白遺伝子をアグロバクテリウム−媒介遺伝子移入 に適したベクターに移動させた５ＥｃｏＲＩでの部分的消化に続き、約１．９ｋ ｂのＥｃｏＲＩないしＥｅｏＲＴ断片をｐＤＨ５１／ＣＰＷＬから取り出し、（ ワシントン州、プルマン（Ｐｕｌｌｍａｎ）、ワシントン州立大学、化学部、ロ バート・カイ（ＲｏｂｅｒｔＫａｙ）から入手可能な）プラスミドｐＵＣ１８１ ３のＥｃｏＲ１部位に入れ、プラスミドｐｕｃｌ　８１３／ＣＰＷＬを得た。部 分的なＨｉｎｄＩＩＩ消化Ｉ：よってこの植物体発現可能ＣＭＶ−ＷＬ外皮蛋白 遺伝子を含有する１、９ｋｂ断片を取り出し、（ワシントン州立大学、生化学研 究所、ギ不フング・アン（Ｇｙｎｅｂｕｏｇ　Ａｎ）から入手できる）ベクター ｐＧＡ４ｇ２（アン（Ａｎ））　、　１９８６）のＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位に結ん だ。プラスミドｐＧＡ４８２は、前記で挙げたＷＯ３９１０５８５８に記載され ている植物体発現可能β−グルクロニド遺公子を含有するように予め修飾し、修 飾したプラスミドをｐＧＡ４８２／Ｇという。発現力セントのクローニングの後 、プラスミドをｐＧＡ−４８２／ＣＰＷＬ／Ｇと命名した（チャート５参照）。

このプラスミド、またはその誘導体は当業者に公知の方法を用いてアグロバクテ リウム株Ａ２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ７０７、Ａ４Ｒ３，Ａ４ Ｒ５（ｐＲｉＢ２７８ｂ）に移入することができる。株Ａ２０８、Ｃ５８、ＬＢ Ａ４４０４、およびＡ４Ｒ５はメリーランド州、ロックビル、バークローン・ド ライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｕｖｅ）　１２３０１番地にあるＡＴＣＣから 入手できる。

Ａ４Ｒ５（ｐＲ１Ｂ２７８ｂ）はフランス国、ベルサイユ、Ｆ７８０００、ロテ ド・セーント・シル（Ｒｏｕｔｅｄｅ　５ａｉｎｔ　Ｃｙｒ）、Ｃ，Ｎ、Ｒ，Ａ 、、エフ・カセーデルバ−（Ｆ、Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ）博士から入手で きる。

Ｃ５８Ｚ７０７は、イリノイ州、ウルバナ（Ｕｒｂａｎａ）　、イリノイ大学、 エイ・シイ・ヘブバーン（Ａ、Ｇ、Ｈｅｐｂｕｒｎ）博士から入手できる。

当業者に公知の手法を用い、または支質的部分をここに参照のために挙げる、Ｐ ＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４４６４として再出願し、ＷＯ３９１０５８５９ として１９８９年６月２９日に公開された［発芽植物体種子のアグロバクテリウ ム媒介形質転換（Ａｇｒｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｒａｎ ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　Ｐｉａｎｔ　５ｅｅｄ ｓ）なる発明の名称の１９８７年１２月２１日出願の米国特許出願１３５６５５ 号に記載されている方法を用いることによって、植物体発現可能ｃＭｖ−ｗＬ外 皮蛋白遺伝子のアグロバクテリウム媒介移入を行う。また、この遺伝子の植物体 細胞への移入は、直接ＤＮＡ摂取（バスズコウスキイら（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ 　ｅｔ　ａｌ）　、ＥＭＢＯＪ、、１９８４．３：３２１７）、マイクロインジ ェクション（クロスウェイら（Ｃｒｏｓｓｗａｙ　ｅｔ　ａｌ）　％モレキュラ ー・アンド・ジェネラル・ジエネティックス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、（、ｅｎｅｔ、 ）　２０２　＋　１７９　）　、電気穿孔法（フロムら（Ｆｒｏ＋ｎｍ　ｅｔ　 ａｌ）　、プロシーデイングズ・オブ・ナシ３ナル・アカデミ−・オブ・サイエ ンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ８２　：　５ ８２４）または高速マイクロインジエクテールズ（ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ 　ｍ１ｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｌｅｓ）　（クラインら（Ｋｌｅｉｎ　ａｔ　ａｌ ）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３２７　：　７０）のごとき他の方法を用 いて行うこチャート２ ＣＭ　Ｖ　−Ｗ　ＬおヨヒＣ：、ＩＶ　−Ｃ外皮蛋白遺伝子の比較チャート３ ＣＭＶ−ＷＬおよびＣＭＶ−Ｃ外皮蛋白の比較チマート４ ・ＲＤＨ５１／ｃｐＷＬの構ミ ＣａＭＶ　３５５ プロモーター チャート５ ｐＧＡ４８２／ＣＰＷＬ／Ｇの構築 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） ＴＬ成３年２目１６日

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．チャート１に示した配列を有するキュウリモザイクウイルスのＷＬ株からの 外皮蛋白遺伝子よりなる組換体ＤＮＡ分子。
2. ２．請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウイルスの ３５Ｓプロモーターおよびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のポリア デニル化シグナルよりなる植物体形質転換ベクター。
3. ３．請求の範囲第２項記載の植物体形質転換ベクターを含有する細菌細胞。
4. ４．ＣＭＶ−ＷＬからの外皮蛋白遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ プロモーターおよびカリフラワーモザイクウイルス遺伝子のポリアデニル化シグ ナルを含有する形質転換植物体細胞。
5. ５．請求の範囲第４項記載の形質転換細胞よりなるウリ科またはナス科から選択 される植物体。
6. ６．請求の範囲第５項記載のウリ科植物体。
7. ７．請求の範囲第５項記載のナス科植物体。
8. ８．請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子を発現するウリ科植物体を増殖させ ることよりなるウイルス耐性ウリ科植物体の生産方法。
9. ９．請求の範囲第１項記載の外皮蛋白遺伝子を発現するナス科植物体を増殖させ ることを特徴とするウイルス耐性ナス科植物体の生産方法。