CN1086420C

CN1086420C - 一种培育抗黄瓜花叶病毒病甜椒的方法

Info

Publication number: CN1086420C
Application number: CN95102802A
Authority: CN
Inventors: 陈章良
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 1995-03-29
Filing date: 1995-03-29
Publication date: 2002-06-19
Anticipated expiration: 2015-03-29
Also published as: CN1120586A

Abstract

通过土壤脓杆菌侵染的方法，将基因转化进入甜椒的子叶、真叶、下胚轴，用含GUS基因和CMV外壳蛋白基因的土壤脓杆菌转化苗龄为10-15天的子叶，用含Kanamycin的芽诱导培养基进行筛选、培养，转化子叶分化出新芽和新根。在抗性芽中检测到GUS基因的稳定表达，在转化后的再生小植株中检测到CMV外壳蛋白基因整合到植物基因组中；将所得甜椒植株转入大田，得到转基因抗CMV甜椒支系。

Description

一种用基因工程方法培育的抗黄瓜花叶病毒病甜椒

所属技术领域：本项目属于分子生物学领域中的植物基因工程学科。

现有技术(与本发明最接近的技术)：本项目采用的技术是植物基因工程育种技术，是一个新兴的高科技学科；以往的经典生物学技术和经典的农作物育种技术无法在同一水平上与之比较、培育抗病毒植物的基因工程方法目前有几种本项目采用的是已为国际承认的有效的方法，即利用病毒的外壳旦白的基因转入植物以防止病毒传染的方法。

植物的病毒危害是农业生产上损失最大的病害之一，到目前为止还没有很有效的方法来防治，通常采用的是用农药来杀死、控制传染病毒的昆虫，保护植物免受病毒侵染。这种方法的缺点是不但化学药品的价格较高，而且往往造成严重的环境污染。另一种方法是组织脱毒法，用于无性繁殖的一些植物，取这类植物的茎尖、芽点等病毒尚未入侵到的组织，通过组培的方法，育出大量的无毒苗，用于田间生产。目前在马铃薯、草莓等生产上已经应用。这个方法的缺点是，组培脱毒育苗不但成本高，工作量大，而且由于病毒的田间再侵染，能维持无毒的有效期不长，两三年后产量又会严重下降。还有一种防病毒的方法叫交叉保护(cross protection)法，当把一种病毒的弱株接种到植物上，同种的强病毒再侵染这些植物时，表现出植株受到保护的现象，此时强病毒的侵染能力和致病能力都大大降低。我国从70年代开始，主要将此法用于防止蕃茄上的病毒病，80年代在抗木瓜环斑病毒上也曾使用此法。这个经典的、利用病毒的交叉保护特点建立的方法也存在着一些问题。首先，需要找到一株弱病毒，找到一株适用的这样的病毒，往往需要几年时间；其次，虽然选用的是弱病毒，但仍能在一定程度上降低此种作物的产量；再者，弱病毒株只能与和它相类似的病毒有交叉免疫作用，而对相距较大的病毒种类没有什么作用，有时甚至还能和这些不相关的病毒相互影响，加重病害，使作物遭到更大的损失。加之工作量大，成本高，此法比较难以广泛使用。下面介绍如何利用植物基因工程方法解决病毒防治，现有5种方法。

第一种方法是向植物转入病毒的外壳蛋白基因。1986年，在美国通过植物基因工程成功地获得抗病毒的转基因植株。他们首次地将烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因转移到了烟草和番茄的细胞里去，并培育成株。在这种番茄和烟草的叶片里都测到了烟草花叶病毒的外壳蛋白，并且发现当用烟草花叶病毒侵染这些植物时，这些植株能在一定程度上有抵抗作用。TMV外壳蛋白基因在细胞中的存在，能抑制TMV在寄主细胞中的复制，并能阻止或降低TMV在植株体内的传递。1986年的实验结果是在温室里得到的，后经美国浓业部批准，这种转基因番茄已在美国的几个不同的地区，进行了大田实验。结果表明，它们在大田里的表现和在温室里的表现一致。大田实验的数据说明：有TMV外壳蛋白的番茄，在接种TMV后，只有5％左右的植株得病，而对照植株的发病率是99％。在产量上与无病株相比，含TMV外壳蛋白的番茄几乎不减产，而对照组的产量损失达26-35％。从此提供了一条通过植物基因工程来抗病毒的十分诱人的途径。继抗烟草花病毒的外壳蛋白基因工程成功之后，现在已经完成的还有黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、苜蓿花叶病毒(AIMV)和最近即将报导的大豆花叶病毒(SMV)等的外壳蛋白基因工作。应该说，使用转病毒的外壳蛋白基因方法培育出来的抗病毒植物比较安全。因为外壳蛋白本身并没有毒性，我们平日吃的番茄和马铃薯里就有这些病毒，只是到目前为止我们还没有足够的证据证明这个方法能够解决所有种类的病毒危害。也许这种办法有一定的限度，但是直到目前为止我们还未曾发现它有什么副作用。另一个问题是，如果某种病毒的外壳蛋白能够装配虫传的它种病毒的RNA的话，也许会发生危险。但是，直到目前为止并没有提出任何有这种危险存在的迹象和实际根据。

第二种方法是通过病毒的卫星RNA的植物基因工程来防治病毒。不少种类的病毒有卫星RNA。黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA是用于植物基因工程方面最早获得成功的一个例子抗黄瓜花叶病毒的工程植株(转基因植物)。但是人们普遍地认为，因为病毒的卫星RNA存在着不能彻底地抑制它的互补病毒的复制，本身具有很高的突变率，以及与它种病毒互补后会加强被补病毒的危害等几个问题，如果在生产上使用会有一定的潜在危险。因此，目前这方面的研究存在着一些困难，需要设计一些新的实验。如对卫星RNA的cDNA搞些点突变，作些改造，也许能在农业生产上使用。

第三种方法是利用病毒的反义RNA。这个方法最早用在动物病毒上，具体的作法是将病毒的基因组反向地结合在启动子后，这样就能在转基因的细胞里编码出反义基因。当外源的病毒RNA侵染进入植物细胞之后，和这些细胞里编码出来的反义RNA形成互补，构成双链的RNA，使得病毒无法复制，减轻了病毒的危害。利用植物基因工程的技术，已经成功地将植物的一些病毒基因组反过来接在植物的启动子后面，转到植物细胞里去，出现了能抵抗这些病毒侵染的结果。但是，这个方法也还有一些缺点，主要问题是需要比较大量的反义RNA才能彻底抵抗外源病毒的入侵。它的产量起码还要提高50倍，而目前的植物启动子都还达不到这个水平。所以，这个方法可以抵抗不太严重的病毒侵染；当入侵病毒的数量大时，它所起的作用就很小了。

第四个方法是利用植物自己编码的抗病基因。有些植物在受病毒侵染时，表现出一定的抵抗能力，最明显的例子是有的番茄品种能抗烟草花叶病毒。育种家们有许多带抗原的材料。我们可以通过克隆这类抗原基因，得到抗某种病毒的转基因植物。这方面的工作的困难在于分离到能被利用的基因。但是如果这种方法成功，这种转基因植物的危险性应该最小。

第五，利用病毒上的其他基因。前面说到过的是利用病毒中的一个外壳蛋白基因。在病毒基因组中除了外壳蛋白基因外，还有其他一些基因，其中有转移基因、复制酶基因等等，我们有可能用改造基因组的办法得到抗病毒的基因。这个办法目前尚处于探索阶段。

在上述5种方法中，比较成功的还是前三种，在国外都已达到得到转基因植物的阶段，有的甚至已经进入大田实验。我国已经开展这方面的工作，并且已得到了不少成果。针对一些国内广泛流行严重危害的作物病毒，我们实验室开展了它们的外壳蛋白基因分离和转化的工作。现已成功地分离并合成了编码烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和另外几种常见的作物病毒的外壳蛋白基因，并对这些基因作了序列等方面的分析；同时还得到了其中一些病毒外壳蛋白基因对我国现生产用的烟草、番茄优良品种的基因转化植物。全世界每年由植物病毒危害造成的作物减产，至少以10％计。我们这么大的农业国家，其损失难以计数。植物基因工程这一方面的工作对农业增产会有立竿见影的好处，我国需要大力开展这方面的工作。

发明的目的

1、甜椒是在世界范围内广泛种植，并为各国人民喜爱和接受的一种通用蔬菜，它常年使用，和普遍出现在各种挡次的餐桌上，具有十分重要的经济价值。

我国的甜椒栽培品种到目前为止除仅有少数几个略耐CMV的品种之外，几乎全都不抗CMV。而CMV在我国不分地域全都产生严重危害，轻者减产30％以上。重则绝产，幼株染病则很难成活。

本发明即针对以上问题而设计，提供了一种抗CMV的甜椒种子，经田间试验，在对照组99％染重病的情况下，只有2％染病而且病势轻微，证明解决了CMV感染这一问题。

2、甜椒一直是在组培再生产方面尚有一定困难的植物，特别是基因转化后的再生问题，国际几个知名实验室若干年来，长期未能克服不易组培产生转化再生株的问题，这个问题直接阻碍着甜椒的转基因育种工作，针对这一问题本发明提供了一种获得转基因组培苗并提高甜椒组培苗再生能力的方法。

发明的内容及方案

a.分离出流行于我国的CMV病毒，并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因，并作了全序列测定及比较。

b.找到了一种提高甜椒组培苗出苗率的方法。

c.培育出了抗CMV的基因工程植株并进行了田间试验。

发明的具体内容：

a.从我国山东大田的发病烟草叶片中分离出流行于我国的CMV病毒。

b.克隆编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因。

c.通过对DNA全序列的测定和比较，确定所分离的CMV属CMV-D亚组。

d.将此基因，利用土壤农杆菌侵染的转化方法，分别转入苗龄为10-15天的甜椒子叶、真叶、下胚轴等外植体。

e.诱导出芽，及使芽伸长的培养基见说明书。

g.以MS+IAA0.5mg/l+蔗糖30％的培养基诱导生根，形成甜椒与小植株。

f.诱芽培养基中含卡那霉素对获得外源目的基因的再生芽进行筛选。

h.在转化后的再生小植株中检测到CMV外壳蛋白基因。

i.将组培所得植株移入温室，盆栽，经接CMV病毒检测抗CMV。

j.子二代大田种植，遗传性状稳定，抗性表现良好。

优点及效果

1、甜椒对CMV的感染十分敏感并普遍缺乏抗性，本发明可选用任一品质优良的甜椒品种，将本发明所克隆的CMV-CP基因转入，以提高它们对CMV的抗性，从而提高了它们的产量，使之成为一个带有新的抗病遗传基因的甜椒品系。

2、由于增加了抗CMV能力和进一步的组培单系选育，由基因工程技术所育得的新品系在产量和品质方面都优于原始材料。

3、田间试验，在对照组99％染重病的情况下，基因工程植株只有2％染病，且病势轻微。

4、本项目中对甜椒的组培进行了大量的研究和试验，找到了最佳培养基配方，使不宜组培的甜椒苗诱导率达100％。

实施例：

一、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定及比较

近年来，植物基因工程技术的迅速发展为培育抗病毒植物提供了一条新的途径。Powell等人将编码烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的基因加上植物基因启动子，并导入烟草细胞中使之表达，首次获得了可以抵抗TMV的转基因烟草和番茄。随后，人们用类似的方法分别获得了可以抗黄瓜花叶病毒(CMV)、苜蓿花叶病毒、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)的烟草、番茄、马铃薯等，成为目前培育抗病毒植物的一条很重要的途径。

CMV是一种在世界上分布很广的植物正链RNA病毒，可以侵染单子叶和双子叶植物的85科365属中的775种植物，由于缺乏合适的育种抗原材料，而且其传播媒介—蚜虫又难于控制，对蔬菜、烟草、香蕉等作物造成很大的经济损失。CMV的RNA基因组中含有四种组分(RNA1-4)，属于Q株系的RNA1-4的核苷酸序列都已被确定。编码外壳蛋白的基因分别在RNA4(1.0kb)和RNA3(2.2kb)之中。我们从山东大田的发病烟草中分离出流行于我国的CMV病毒，并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因。通过对DNA全序列的测定及比较，发现我们所分离的CMV属于CMV-D所在的亚组，利用转基因植物来表达这一基因以达到抗黄瓜花叶病毒的工作正在进行。

材料与方法

cDNA合成试剂盒、DNA序列分析试剂盒均购自Promega公司。α-³²P-dNTP为Amersham产品。限制性内切酶等生化制剂购自华美公司。

1、病毒及其RNA的提取从山东大田的发病烟叶中，以改进的Peden等人的方法提取病毒，即用聚乙二醇6000沉淀植物组织抽提液，经差速离心、超速离心和蔗糖密度梯度离心(10-40％)后，得到提纯的病毒，将病毒液用蛋白酶K消化，苯酚氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀，得到病毒RNA。

2、cDNA合成和克隆人工合成一段含24个核苷酸的DNA序列作为引物，5′-TGGTCTCCTTATG GAGAACCTGTG-3′。该引物由北京大学生物系生命中心ABI DNA合成仪合成，可以与CMV RNA 1-4的3′端互补。cDNA的合成是以CMV的总RNA为模板，用Gubler和Hoffman报道的方法进行的。

双链cDNA用T4 DNA聚合酶进行末端补平，将质粒Bluescript用EcoRV切开作为载体，用T4 DN A连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5细胞中，转化菌经筛选后，挑出其中的白色菌落进行分析。

3、筛选和鉴定重组质料根据文献报道，CMV外壳蛋白基因中有一个EcoRI位点，其它RNA序列中没有。故用EcoRI酶切的方法筛选重组质粒。

4、DNA序列分析将全长的cDNA克隆用多种限制性内切酶切开，并亚克隆在Bluescript载体上，以双脱氧核苷酸链终止法，直接用双链DNA测定其cDNA序列。即先将超螺旋的质粒DNA在0.2mol/L NaOH中变性5min，再以0.4倍体积的5mol/L NH₄Ac中和，乙醇沉淀，变性的质粒和序列引物一起退火，然后按Chen和Seeburg的方法测定DNA序列。

结果：

1、cDNA的合成

在合成cDNA的第一链和第二链时，都加入了α-³²P-dATP。经碱性胶电泳后，得到放射自显影的X光片。最长的cDNA片段可达3kb。而CMV RNA基因组在1.0-3.4kp范围内，所以从合成的cDNA中有希望获得外壳蛋白基因的完整序列。

cDNA合成电泳照片，a. λDNA/Hind III；b.cDNA第一链；c. cDNA第二链；d. T4 DNA聚和酶补成平末端的cDNA。图1为质粒pHC210插入片段的部分限制性内切酶图谱及亚克隆片段A质粒pHC210中载体多位点接口的部分酶切位点和插入片段的部分酶切图谱。cDNA插入位点为EcoRV；B.为进行插入片段全长的DNA序列分析所做的亚克隆片段，自上而下为：Hind III-Hind III片段、Sa II-Sa II片段、EcoR I-EcoR I片段、SaII-EcoR I片段。图2为质粒pHC210插入片段全长的DNA序列及由序列推出的氨基酸序列与CMV-D相应序列的比较自上而下为：pHC210插入片段的氨基酸序列、pHC210插入片段的DNA序列，CMV-D相应片段的DNA序列(与第二行的核苷酸相同者标以“+”，不同者则列出相应的核苷酸)、CMV-D外壳蛋白的按基酸序列(与第一行相同者标以“*”，不同者则列出)。

2、重组质粒的筛选和鉴定

cDNA经连接转化后，得到900多个白色菌落，经小链提取质粒，EcoRI酶切分析后，得到21个阳性克隆，插入片段在0.5-2.0kp之间，对其中的一个质粒pH210的插入片段进行了部分DNA序列分析，发现与发表的CMVD株系的外壳蛋白基因序列吻合良好。

3、pHC210质粒插入片段的完整序列分析及与其它株系间外壳蛋白基因同源性的比较

经酶切测定，pHC210质粒的插入片段约有1kb，为了测定其完整序列，先分析了这段DNA的物理图谱并进而做了不同酶切片段的亚克隆。这段DNA的限制性内切酶位点是：Sa II(0.1kb)，EcoR I(0.35kb)，Hind III(0.36kb)，Xho I(0.63kb)，Sa II(0.6kb)，其中EcoR I(0.35kb)和Sa II(0.66kb)是CMV-D的相应序列中所没有的，其它位点和CMV-D一致。DNA序列分析的结果证实了这一点。

通过对pHC210质粒插入片段的四种亚克隆的DNA序列分析，得到了该质粒完整插入片段的序列(见图2)。经与CMV-D的外壳蛋白基因比较，发现该质粒中含有完整的CMV外壳蛋白基因。该片段全长1008bp，5′端非编码区53bp，3′端具有完整的301bp的非编码区，外壳蛋白基因编码区654bp。这段1008bp的序列与CMV-D的相应序列相比，同源率为92.6％，其中基因编码区的同源率为93.9％。与CMV-Q的相应序列相比，同源序列占73.1％，基因编码区的同源序列占77.1％。由这段序列推知该基因编码的蛋白含218个氨基酸残基，分子量为24060。与CMV-D外壳蛋白所含氨基酸残基数相等，分子量也很接近(后者分子量为24100)。序列同源率为96.3％。CMV-Q外壳蛋白含有较多的氨基酸残基(236个)，相比之下，二者的同源氨基酸序列占71.5％。

近年来的研究结果表明，根据血清学反应和核酸序列同源性的比较可以将CMV的绝大部分株系分为两个亚组。CMV-Q、CMV-R、CMV-S等属于一个亚组，CMV-D、CMV-C、CMV-Ma等属于另一个亚组。上述cDNA序列同源性比较表明，流行于我国的这种CMV株系应属于CMV-D所在的亚组。

二、甜椒的离体再生和基因转化：

1、材料和方法

分别以甜椒的子叶、真叶、下胚轴为材料在培养基MS+6mg/L BA+0.5mg/L IAA+3％蔗糖和MS+6mg/L BA+3％蔗糖上诱导出芽，继而通过芽伸长，转入生根培养基MS+0.5mg/L IAA+3％蔗糖，诱导其生根，形成甜椒小植株。

甜椒基因转化通过土壤农杆菌侵染的转化方法，分别用含GUS基因和CMV外壳蛋白基因的土壤农杆菌转化苗龄为10-15天的甜椒子叶，用含kanamycin的芽诱导培养基进行筛选、培养，未转化的子叶发黄死去，转化的子叶分化出新芽和根。在抗性芽中检测到GUS基因的稳定表达，在转化后的再生小植株中检测到CMV外壳蛋白基因整合到植物基因组中。

植物材料

甜椒品种选用市售品种。

种子消毒方法：清水浸泡半小时，70％酒精消毒30秒，10％次氯酸钠溶液浸泡30分钟，再用无菌水漂洗3-4次。

消毒后的种子置于1/2MS固体培养基上，于25℃的光照培养箱中培养成无菌苗，分别取5天，15天，30天苗龄的子叶，10天苗龄的下胚轴，30天苗龄的真叶为外植体进行培养和转化。

植物的组织培养：

在超净工作台内将外植体取出接种于培养基上，基本培养基为MS+3％蔗糖。在此基础上分别加不同种类及浓度的激素，以诱发不同的外植体器官的发生。试验的培养基见表<1>。

细菌菌株和质粒：

供试菌种：R1000PBI：带有GUS和NPT-II基因，属双元载体系统

A32：带有CMV外壳蛋白基因和NPT-II基因，属共整和载体系统。其中黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因是从我实验室在山东大田发病烟草中分离出的病毒中克隆的。

在平板上挑单菌落，R1000PBI置于液体LB+50mg/Lkana培养基中，A32置于液体LB+50mg/L ka na+50mg/L spc培养基中，于27℃摇床上培养20-25小时。至细菌处于对数生长期时，3000rpm离心10分钟，弃上清。菌体用1/2MS液体培养基悬浮并稀释5-10倍，至OD₆₀₀值＝0.1-0.2。稀释好的菌液用于转化。

哺育细胞：

使用生长迅速的胡萝卜悬浮细胞系。由本实验室提供。

基因转化步骤：

在超净工作台内剪下外植体，其中子叶、真叶完整地连叶柄剪下，下胚轴要注意去除生长点。将剪好的外植体放入稀释好的菌液中浸泡2-3分钟。用无菌滤纸吸干表面菌液。

用无抗生素的MS固体培养基倒入直径为12CM的培养皿中，待其冷却，在其上铺少许胡萝卜细胞，放上一层无菌滤纸，将吸干菌液的外植体置其上，培养皿封上Parafilm后置于暗箱中3-4天，进行培养与转化。

将转化后的外植体转入含不同激素条件的诱导培养基上，其中加入100mg/L kana，500mg/L card，进行筛选与诱导，直至再生抗性芽及植株的产生。取其中的叶片和愈伤组织用于检测。

检测：

GUS检测，大肠杆菌GUS基因编码一个β-葡萄糖醛酸苷酶，该酶可以分解β-葡萄糖醛酸苷类化合物，若以4-甲基伞形酮酰-β-D葡萄糖醛酸苷为底物，可以生成带有荧光的4-甲基伞形酮。这个产物可以在激发兴365nm，发射光455nm波长下检测到。

试剂：

1.反应缓冲液：50mM NaPO₄(PH＝7.0)1mM EDTA0.1％Triton-100

10mMβ-meroaptoethanol

2.底物缓冲液：1mM4-methylumbelliferyL-β-Dglucusonide

(MUG)用反应缓冲液配制。

3.终止缓冲液：0.2N NaCO₃

步骤：

1.植物材料收集后，用液氮破碎，加100μl冷反应缓冲液，离心2分钟；2.取60μl样品，加60μl底物缓冲液，留一半作对照；3.另一半37℃保温过夜；4.加2.0μlNa₂Co₃；5.测荧光，激发光365nm，发射光445nm，10nM4-甲基伞形酮为标准。

蛋白测定：

取20μl步骤1所得上清楚，测OD280、OD260，同时用考马斯亮兰法较正。

比较生成4-甲基伞形酮随时间变化的斜率，计算空白与样品间的差异。

PCR检测

提取植物DNA步骤：

采用CTAB方法，过程如下：

1、取植物叶片，液氮碾磨，放入Eppendoff管中；2、加入500μl 160℃预热数分钟的2×CTAB提取缓冲液(0.2％β-球基乙醇，2％CTAB，1.4N Nacl，0.1M Tris.Cl PH：8.0，0.02M EDTA)置60℃水浴45分钟；3、加等体积24∶1氯仿∶异戊醇，温和晃动数次，5000rpm离心5分钟；4、上层水相转移到新管中，用24∶1氯仿∶异戊醇再抽提一次，条件同上；5、加2/3体积的异丙醇，-20℃沉淀30分钟；6、10000rpm离心2分钟，弃去上清；7、重悬于100μlTE(PH：8.0)中，加1/10体积2M NaOAc和2.5体积无水乙醇沉淀；8、10000rpm离心2分钟，弃去上清；9、70％乙醇洗涤两次；10、常温下风干，DNA沉淀重悬于TE中；11、电泳，检验植物总DNA含量。

反应体系：

使用无菌的0.5ml硅化离心管按下列标准进行加样和操作：反应物加样顺序体积终浓度10X缓冲液 1 5μl 1X缓冲液4XdNTPMix 2 5μl 200μM/per dNTPPrimer1 3 2μl 50pmol/per reactionPrimer2 4 2μl 50pmol/per reaction模板DNA 5 2.5μ 0.5μg/per reactionTag DNA酶 6 3U 2.5-3U/per reactionDMSD 6 2.5μl -加无菌去离子水至100μl

CMV外壳蛋白基因两端引物的结构：

Primer1：5′＞ATG GAC AAA TCT GAA＜3′

Primer2：5′＞TCA AAC TGG GAG TCA＜3′

实验操作程序：

将未加Tag DNA polymerase的反应管中的样品混匀，反应管放入95℃水浴中反应10分钟。取出反应管，在台式离心管上快速离心，使冷凝于管盖的液滴沉下，然后，加入Tag DNA Poly merase，混匀并离心，最后加上50→80μl石蜡油，于72℃反应2分钟，即可循环：

循环参数： 93℃变性反应30秒

55℃退火反应90秒

72℃延伸反应150秒

经过30→36个循环后，在进行到最后一个循环时，72℃延伸反应增加5分钟，反应结束后，取出反应管，使之冷却到室温后放于4℃保存，并进一步分析，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳。

甜椒的组织培养：

甜椒子叶在培养基MS+BA6mg/L+3％蔗糖上培养两周后，在子叶上切口处诱导出绿色小芽，每个外植体10-20个，芽长至1-1.5cm后不再长大，此时将其转入MS+1mg/LGA3+2mg/LZT，2-3周后叶片展开，并有茎的伸长，但伸长率很低。共得到4株伸长的芽，将其转入MS+0.5mg/LI AA+3％蔗糖的生根培养基上生根，得到再生小植株。该植株正在继续培养，以便移入土壤。

在甜椒的离体再生培养过程中，考查了激素、苗龄、位置效应对于分化的影响。

①激素条件：

考查了离体再生的不同阶段中的最佳激素条件。由表(1)的结果，确定了以子叶为外植体的培养过程中，MS+6mg/LBA+0.5mg/LIAA为最佳芽诱导培养基，MS+1mg/LGA3+2mg/LZT为伸长培养基，MS+0.5IAA为生根培养基。所以下一步的基因转化诱导抗性植株过程中均使用这几种激素条件。

②苗龄：

子叶外植体的生理年龄是影响器官再生的因素之一，在本实验中，比较了5天，12天，30天苗龄的子叶分化的情况(见表2)。结果表明：12天苗龄的子叶分化能力最强，30天苗龄的子叶诱导出芽时间长，分化能力有所降低，芽伸长也较难；5天苗龄的子叶只能诱导出胚性愈伤和少数芽点。

③位置效应：

在甜椒再生过程中，位置效应也是一个重要的影响因素。在这方面，Fari，M和Czako，M曾于1981年报道下胚轴的分化情况，即基部的下胚轴分化出根，上端胚段分化出芽。我将子叶横切为二，置于培养基MS+6mg/LBA+0.5mg/LIAA上。发现上半部分几乎无分化能力，而带有叶柄的基部子叶分化频率为100％。而且两端切口处呈现不同分化趋势：从基部分化出根，从端部分化出芽。这个效应对以后的芽伸长及再生有较大影响。

三、甜椒的基因转化的观察结果：

1.GUS基因转化结果：

R1000PBI菌种转化甜椒叶片在含Kanamycin的培养基上生长的抗性芽上生长的抗性芽以及对照在转入含Kanamycin培养基一周后死去。

取在含Kanamycin培养基上长出的抗性芽进行MUG荧光检测(见表3)，由表3中数据可知：转化样品MU含量为对照样品MU含量的8倍，表明转化样品有GUS基因活性。

2.黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化结果：

土壤农杆菌A32含有一个35s启动子引导的CMV外壳蛋白的基因，该基因大约600bp，不存在于正常植物中，PCR扩增结果表明转化植物在600bp有一特征条带。而在未转化对照植株中看不到这一条带。表明我们已经将CMV外壳蛋白基因整合到甜椒染色体中。

四、甜椒的离体再生株的获得：

以苗龄10-16天的子叶为外植体，经过芽诱导、芽伸长、根诱导、移入土壤四个步骤的离体培养，已获得能正常开花结实的再生植株。所用培养基以MS为基本培养基，附加不同种类不同浓度的植物激素。最适的芽诱导培养基为MS+4-6mg/L BA+0.5mg/L IAA，芽诱导率可达100％。诱导出的芽转入MS+2mg/L zeatin或2mg/L BA+1-2mg/L GA的培养基上，可使芽伸长，伸长率为35％左右。已伸长的芽在生根培养基MS或MS+0.1-0.5mg/L NAA上生根后，转入土壤成为正常植株。

一般认为甜椒是一种较难进行遗传操作的蔬菜作物。自从1978年，Gunay和Rao首次报道从C.annuum的3个品种中成功地再生芽以来，国外曾陆续有一些有关C.annuum组织培养的报道。但这些报道中，有的再生周期较长，有的只停留在芽诱导阶段，没有详细涉及芽的伸长及再生完整植株。本发明首次利用我国甜椒栽培品种的子叶进行离体培养，成功地获得再生植株，并已正常开花结实。同时进行甜椒的抗病毒基因转化。

表1 不同激素配比对甜椒外植体的诱导作用：外植体 6-BA IAA NAA ZT 出芽生根愈伤12天子叶 2 - - - +++ - +12天子叶 4 - - - ++++ - -12天子叶 6 - - - ++++ - -12天子叶 8 - - - +++ - +12天子叶 2 0.5 - - +++ + ++12天子叶 6 0.5 - - ++++ + -12天子叶 - 0.5 - - - +++ ++12天子叶 - - 0.5 2 - +++ +++

说明：出芽(根、愈伤)率：

++++：＞80％ +++：60-80％ ++：40-60％ +：20-40％激素浓度单位：mg/l

表2苗龄接种外植体数分化外植体数每外植体出芽数最长芽出芽率5天 20 2 4 0.4 10％12天 20 20 15 1.3 100％30天 20 12 6 0.8 57％

表3 甜椒GUS荧光检测结果：

未转化对照芽转化芽

保温前荧光值 0.079 0.071

保温后荧光值 0.692 1.503

蛋白量(OD值) 0.381 0.142

MU生成量(nM/mg蛋白) 29.4 240.7

附图说明：

图1质粒pHC210插入片段的部分限制性内切酶图谱及亚克隆片段

A质粒pHC210中载体多位点接口的部分酶切位点和插入片段的部分酶切图谱，cDNA插入位点为EcoRV。

B.为进行插入片段全长的DNA序列分析所做的亚克隆片段，自上而下为：Hind III-Hind III片段、Sa II-Sa II片段、EcoR I-EcoR I片段、Sa II-EcoR I片段。

图2质粒pHC210插入片段全长的DNA序列及由序列推出的氨基酸序列与CMV-D相应序列的比较自上而下为：

pHC210插入片段的氨基酸序列、pHC210插入片段的DNA序列，CMV-D相应片段的DNA序列(与第二行的核苷酸相同者标以“+”，不同者则列出相应的核苷酸)、CMV-D外壳蛋白的按基酸序列(与第一行相同者标以“*”，不同者则列出)。

Claims

1、一种培育抗黄瓜花叶病毒病甜椒的方法，其特征在于所述方法包括：黄瓜花叶病外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定和比较；甜椒的离体再生和基因转化；甜椒的离体再生株的获得；

1)黄瓜花叶病外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定和比较

a.材料与方法

cDNA合成试剂盒、DNA序列分析试剂盒均购自Promega公司，α-³²P-dNTP为Amersham产品，限制性内切酶等生化制剂购自华美公司；

病毒及其RNA的提取从山东大田的发病烟叶中，以改进的Peden等人的方法提取病毒，即用聚乙二醇6000沉淀植物组织抽提液，经差速离心、超速离心和蔗糖密度梯度离心(10-40％)后，得到提纯的病毒。将病毒液用蛋白酶K消化，苯酚氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀，得到病毒RNA；

cDNA合成和克隆人工合成一段含24个核苷酸的DNA序列作为引物：5′-TGGTCTCCTTATG GA GAACCTGTG-3′，该引物由北京大学生物系生命中心ABI DNA合成仪合成，可以与CMV RNA 1-4的3′端互补，cDNA的合成是以CMV的总RNA为模板，用Gubler和Hoffman报道的方法进行的；

双链cDNA用T4 DNA聚合酶进行末端补平，将质粒Bluescript用EcoRV切开作为载体，用T4 DN A连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5细胞中，转化菌经筛选后，挑出其中的白色菌落进行分析；

筛选和鉴定重组质粒CMV外壳蛋白基因中有一个EcoRI位点，其它RNA序列中没有，故用EcoRI酶切的方法筛选重组质粒；

DNA序列分析将全长的cDNA克隆用多种限制性内切酶切开，并亚克隆在Bluescript载体上，以双脱氧核苷酸链终止法，直接用双链DNA测定其cDNA序列，即先将超螺旋的质粒DNA在0.2mol/L NaOH中变性5min，再以0.4倍体积的5mol/L NH₄Ac中和，乙醇沉淀，变性的质粒和序列引物一起退火，然后按Chen和Seeburg的方法测定DNA序列；

b.结果：

cDNA的合成：在合成cDNA的第一链和第二链时，都加入了α-³²P-dATP，经碱性胶电泳后，得到放射自显影的X光片，最长的cDNA片段可达3kb，而CMVRNA基因组在1.0-3.4kb范围内，从合成的cDNA中获得外壳蛋白基因的完整序列；

重组质粒的筛选和鉴定结果如下：cDNA经连接转化后，得到900多个白色菌落，经小链提取质粒，EcoRI酶切分析后，得到21个阳性克隆，插入片段在0.5-2.0kb之间，对其中的一个质粒pH210的插入片段进行了部分DNA序列分析，发现与发表的CMVD株系的外壳蛋白基因序列吻合良好；

pHC210质粒插入片段的完整序列分析及与其它株系间外壳蛋白基因同源性的比较结果如下：

经酶切测定，pHC210质粒的插入片段约有1kb，为了测定其完整序列，分析了这段DNA的物理图谱并进而做了不同酶切片段的亚克隆，这段DNA的限制性内切酶位点是：SaII(0.1kb)，EcoR I(0.35kb)，HindIII(0.36kb)，Xho I(0.63kb)，SaII(0.66kb)，其中EcoR I(0.35kb)和SaII(0.66kb)是CMV-D的相应序列中所没有的，其它位点和CMV-D一致，DNA序列分析的结果证实了这一点；

通过对pHC210质粒插入片段的四种亚克隆的DNA序列分析，得到了该质粒完整插片段的序列，经与CMV-D的外壳蛋白基因比较，发现该质粒中含有完整的CMV外壳蛋白基因，该片段全长1008bp，5′端非编码区53bp，3′端具有完整的301bp的非编码区，外壳蛋白基因编码区654bp，这段1008bp序列与CMV-D的相应序列相比，同源率为92.6％，其中基因编码区的同源率为93.9％，与CMV-Q的相应序列相比，同源序列占73.1％，基因编码区的同源序列占77.1％，由这段序列推知该基因编码的蛋白含218个氨基酸残基，分子量为24060，与CMV-D外壳蛋白所含氨基酸残基数相等，分子量也很接近(后者分子量为24100)，序列同源率为96.3％，CMV-Q外壳蛋白含有较多的氨基酸残基(236个)，相比之下，二者的同源氨基酸序列占71.5％；

根据血清学反应和核酸序列同源性的比较可以将CMV的绝大部分株系分为两个亚组，CMV-Q、CMV-R、CMV-S等属于一个亚组，CMV-D、CMV-C、CMV-Ma等属于另一个亚组，上述cDN A序列同源性比较表明，流行于我国的这种CMV株系应属于CMV-D所在的亚组；

2)甜椒的离体再生和基因转化：

植物材料：

种子消毒方法：清水浸泡半小时，70％酒精消毒30秒，10％次氯酸钠溶液浸泡30分钟，再用无菌水漂洗3-4次；

消毒后的种子置于1/2MS固体培养基上，于25℃的光照培养箱中培养成无菌苗，分别取5天，15天，30天苗龄的子叶，10天苗龄的下胚轴，30天苗龄的真叶为外植体进行培养和转化；

植物的组织培养：

在超净工作台内将外植体取出接种于培养基上，基本培养基为MS+3％蔗糖。在此基础上分别加不同种类及浓度的激素，以诱发不同的外植体器官的发生；

细菌菌株和质粒：

供试菌种：

R1000PBI：带有GUS和NPT-II基因，属双元载体系统；

A32：带有CMV外壳蛋白基因和NPT-II基因，属共整和载体系统，其中黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因是从我实验室在山东大田发病烟草中分离出的病毒中克隆的；

在平板上挑单菌落，R1000PBI：置于液体LB+50mg/lkana培养基中，A32置于液体LB+50mg/1k ana+50mg/lspc培养基中，于27℃摇床上培养20-25小时，至细菌处于对数生长期时，3000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮并稀释5-10倍，至(OD₆₀₀值＝0.1-0.2)，稀释好的菌液用于转化；

哺育细胞：

使用生长迅速的胡萝卜悬浮细胞系；

基因转化步骤：

采用叶盘法，在超净工作台内剪下外植体，其中子叶、真叶完整地连叶柄剪下，下胚轴要注去除生长点，将剪好的外植体放入稀释好的菌液中浸泡2-3分钟，用无菌滤纸吸下表面菌液；

用无抗生素的MS固体培养基倒入直径为12CM的培养血白，待冷却，在其上铺少许胡萝卜细胞，放上一层无菌滤纸，将吸菌液的外植体置其上，培养血封上Parafilm后置于暗箱中3-4天，进行培养与转化；

将转化后的外植体转入含不同激素条件的诱导培养基上，其中加入100mg/l kana500mg/l card，进行筛选与诱导，直至再生抗性芽及植株的产生，取其中的叶片和愈伤组织用于检测；

GUS检测：

大肠杆菌GUS基因编码一个β-葡萄糖醛酸苷酶，该酶可以分解β-葡萄糖醛酸苷类化合物，若以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷为底物，可以生成带有荧光的4-甲基伞形酮，这个产物可以在激发光365nm，发射光455nm波长下检测到；

试剂：

反应缓冲液：50mM NaPO₄(PH＝7.0)1mM EDTAO.1％ Triton-100

10mM β-meroaptoethanol

底物缓冲液：1mM4-methylumbelliferyL-β-Dglucusonide

(MUG)用反应缓冲液配制

终止缓冲液：0.2N NaCO₃

步骤：

植物材料收集后，用液氮破碎，加100μl冷反应缓冲液，离心2分钟；取60μl样品，加60μl底物缓冲液，留一半作对照；另一半37℃保温过夜；加2.0μlNa₂Co₃；测荧光，激发光365nm，发射光445nm，10nM4-甲基伞形酮为标准；

蛋白测定：

取20μl步骤1所得上清楚，测OD280、OD260，同时用考马斯亮兰法较正；比较生成4-甲基伞形酮随时间变化的斜率，计算空白与样品间的差异；

PCR检测：

提取植物DNA步骤，采用CTAB方法，过程如下：

取植物叶片，液氮碾磨，放入Eppendoff管中；加入500μl 160℃预热数分钟的2×CTAB提取缓冲液(0.2％β-球基乙醇，2％CTAB，1.4N Nacl，0.1MTris.Cl PH：8.0，0.02M EDTA)置60℃水浴45分钟，加等体积24∶1氯仿∶异戊醇，温和晃动数次，5000rpm离心5分钟；上层水相转移到新管中，用24∶1氯仿∶异戊醇再抽提一次，条件同上；加2/3体积的异丙醇，-20℃沉淀30分钟；10000rpm离心2分钟，弃去上清；重悬于100μlTE(PH：8.0)中，加1/10体积2M NaOAc和2.5体积无水乙醇沉淀；10000rpm离心2分钟，弃去上清；70％乙醇洗涤两次；常温下风干，DNA沉淀重悬于TE中；电泳，检验植物总DNA含量。

反应体系：

CMV外壳蛋白基因两端引物的结构：

Primar1：5′＞ATG GAC AAA TCT GAA＜3′

Primer2：5′＞TCA AAC TGG GAG TCA＜3′

实验操作程序：

循环参数：93℃变性反应 30秒

55℃退火反应 90秒

72℃延伸反应 150秒

经过30→36个循环后，在进行到最后一个循环时，72℃延伸反应增加5分钟，反应结束后，取出反应管，使之冷却到室温后放于4℃保存，并进一步分析，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳；

b.甜椒的组织培养筛选获得抗CMV再生植株：

用1、2、3号的甜椒苗的子叶在培养基MS+6mg/LBA+3％蔗糖上培养两周后，在子叶上切口处诱导出绿色小芽，每个外植体10-20个，芽长至1-1.5cm后不再长大，此时将其转入伸长培养基中，2-3周后叶片展开，并有茎的伸长；共得到4株伸长的芽，将其转入生根培养基上生根，得到再生小植株，该植株正在继续培养，以便移入土壤；

在甜椒的离体再生培养过程中，考查了激素、苗龄、位置效应对于分化的影响，在以子叶为外植体的培养过程中，MS+6mg/LBA+0.5mg/LIAA为最佳芽诱导培养基，MS+1mg/LGA3+2mg/LZT伸长培养基，MS+0.5IAA为生根培养基；

苗龄：子叶外植体的生理年龄是影响器官再生的因素之一，在本实验中，比较了5天，12天，30天苗龄的子叶分化的情况，结果表明：12天苗龄的子叶分化能力最强，30天苗龄的子叶诱导出芽时间长，分化能力有所降低，芽伸长也较难；5天苗龄的子叶只能诱导出胚性愈伤和少数芽点；

位置效应：在甜椒再生过程中，位置效应也是一个重要的影响因素，在这方面，Fari，M和Czako，M曾于1981年报道下胚轴的分化情况，即基部的下胚轴分化出根，上端胚段分化出芽，我将子叶横切为二，置于培养基MS+6mg/LBA+0.5mg/LIAA上，发现上半部分几乎无分化能力，而带有叶柄的基部子叶分化频率为100％，而且两端切口处呈现不同分化趋势：从基部分化出根，从端部分化出芽。这个效应对以后的芽伸长及再生有较大影响；

3)甜椒的离体再生株的获得：

以苗龄10-16天的子叶为外植体，经过芽诱导、芽伸长、根诱导、移入土壤四个步骤的离体培养，已获得能正常开花结实的再生植株，所用培养基以MS为基本培养基，附加不同种类不同浓度的植物激素，最适的芽诱导培养基，芽诱导率可达100％，诱导出的芽转入芽伸长培养基上，可使芽伸长，伸长率为35％左右，已伸长的芽在生根培养基MS或MS+0.1-0.5mg/LIAA上生根后，转入土壤成为正常植株；

最适合的芽诱导培养基是：MS+4-6mg/LBA+0.5mg/LIAA；芽伸长培养基是：MS+2mg/L zeatin或2mg/LBA+1-2mg/LGA；生根培养基配方为MS+0.5mg/LIAA+3％蔗糖。

2、根据权利要求1所述的黄瓜花叶病外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定，其特征是得到了该质基因的序列如下：

Met Asp Lys Ser Glu 5AGAGAGTCTGTGTTGTGTTTTCTCTTTTTGTGTCGTAGATACTTGAGTCGAGTC ATG GAC AAA TCT GAA 68+++T++A++++C++++++++++++++++++++++++++ + ++++++++++++ +++ +++ +++ +++ +++

* * * * *Ser Thr Ser Ala Gly Arg Asn Arg Arg Arg Arg Pro Arg Ala Gly Ser Arg Ser Ala 24TCA ACG AGT GCT GGT CGC AAC CGT CGA CGT CGT CCG CCT CCT GCT TCG CGC TCC GCT 125+++ +++ +++ +++ +++ ++T +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ CG+ +++ +++ +++ +++ ++C* * * * * * * * * * * * * Arg * * * * *Ser Ser Ser Ala Asp Ala Asn Phe Arg Val Leu Ser Gln Gln Leu Ser Arg Leu Asn 43TCC TCC TCC GCG GAT GCC AAC TTT AGA GTG TTG TCG CAG CAA CTT TCG CGA CTT AAT 182C++ +++ +++ +++ +++ ++T +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++G +++ +++ +++ +++ +++Pro * * * * * * * * * * * * * * * * * *Lys Thr Leu Ala Ala Gly Arg Pro Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Val Gly Ser Glu 62AAG ACG TTG GCA GCT GGT CGT CCT ACC ATT AAC CAC CCA ACC TTT GTA GGG AGT GAA 239+++ +++ ++A +++ +++ +++ +++ ++A ++T +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * * * *Arg Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ile Thr Leu Lys Pro Pro Lys Ile Asp 81CGC TGT AAA CCT GGG TAC AGG TTC ACA TCT ATC ACC CTG AAG CCA CCG AAA ATA GAC 296+++ +++ +G+ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++T +++ ++A +++ +++ ++A +++ +++ +++* * Arg * * * * * * * * * * * * * * * *Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Lys Arg Leu Leu Leu Pro Asp Ser Val Thr Glu Phe Asp 100CGG GGG TCT TAT TAT GGT AAA AGG TTG TTA TTA CCT GAT TCA GTC ACG GAA TTC GAT 353++T +++ +++ +++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ C++ +++ +++ +++ +++ +++ ++T +AT +++* * * * * * * * * * * * * * * * Asp Tyr *Lys Lys Leu Val Ser Arg Ile Gln Ile Arg Val Asn Pro Leu Pro Lye Phe Asp Ser 119AAG AAG CTT GTT TCG CGC ATT CAA ATT CGA GTT AAT CCT TTG CCG AAA TTT GAT TGT 410+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * * * *Thr Val Trp Val Thr Val Arg Lys Val Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser Val Thr Ala 138ACG GTG TGG CTG ACA GTC CGT AAA GTT CCT GCC TCC TCG GAC TTA TCC GTC ACC GCC 467+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++T G++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * * Ala *Ile Ser Ala Met Phe Ala Asp Gly Ala Ser Pro Val Leu Val Tyr Gln Tyr Ala Ala 157ATC TCT GCT ATG TTT GCG GAC GGA CCC TGA CCG GTA CTG GTT TAT CAG TAT GCT GCA 524+++ +++ +++ +++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++C +++* * * * * * * * * * * * * * * * * * *Ser Gly Val Gln Ala Asn Asn Lys Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Met Arg Ala Asp 176TCC GGA GTC CAA GCC AAC AAT AAG TTG TTG TAT GAT CTT TCG GCG ATG CCC GCT GAT 581++T +++ +++ +++ +++ +++ ++C +++ C++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * * * *Ile Gly Asp Met Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr Ser Lys Asp Asp Val Leu Glu 195ATT GGC GAC ATG CGA AAG TAC GCC GTA CTC GTG TAT TCA AAA GAC GAT GTC CTC GAG 638++A ++T +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +CG +++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * Ala * *Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp Ile Glu His Gln Arg Ile Pro Thr Ser Gly 214ACG GAT GAG CTA GTA CTT CAT GTC GAC ATA GAG CAC CAA CGC ATT CCC ACA TCT GGG 695+++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ ++T +++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++A* * * * * * * * * * * * * * * * * * *Val Leu Pro Val --- 218GTG CTC CCA GTT TGA ATCCGTGTTTCCCAGAACCCTCCCTCGAGTTTTCTGAGGCGGGAGCTGAGTTGGC 765+C+ +++ +++ ++G +++ T++++++++ +++++++++++++++++GA+C+ +++T++T+++++++++++++++Ala * * * *AGTTCTCCTATAAACTGTCTGAAGTCACTAAACGCTTTGTGGTGAACGGGTTGTCCATCCAGCTTACGGCTAAAA 840++++++++++C+++++++++++++++++++++++T+++AC+++++++++++++++++++++++++++++++++++TGGTCAGTCGTGGAGAAATCCACGCCAGTAGACTTACAAGTCTCTGAGGCGCCTTTGAAACCATCTCCTAGGTTT 915++++++++++++++++++++++++++++++++T++++++A+++++++++++++++++++++++++++++++++++CTTCGGAAGGACTTCGGTCCGTGTAGTTCTACCACAAGATGCTAGTTTCAGGGTACGGGTGGTGCTC TC TG 986++++++++++++++++++++++++++C++++++++++CG+++++++++++++++++++++++CC+C+CA+TTTC+T GGGAGCTCCATAAGGAGACCA 1008+G+++GC+++++A++++++++++