CN113234734B - 一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用。本发明提供的可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用，抗性包括抗旱、抗盐、抗病。所述可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明CsMYB30超表达导致了更多的蜡质富集在植株表面，增加的表皮蜡质能导致表皮渗透性降低并赋予增强的抗干旱、抗盐性和抗病原菌的能力。

Description

一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用
技术领域
本发明涉及植物抗病基因鉴定及基因工程技术领域，具体涉及为一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用。
背景技术
农业作为第一产业，是国家经济和国民生活的战略性保障。其中，作物栽培和果蔬种植是我国农业生产的主体和基础。当前，随着全球气候变化，干旱等极端天气频发，对农业生产带来了越来越多的挑战。另一方面，由于栽培品种愈发单一，致病微生物对作物和果蔬的威胁亦越来越大。细菌和病毒引起的溃疡病、黄脉病、黄龙病等，已经严重威胁柑橘、柠檬、香蕉等产业的发展。如何有效提高植物抗性，是作物栽培和农业生产领域的重大技术问题。
表皮蜡质是植物的第一道天然屏障，与植物抗病性、抗旱性、果实耐贮性等紧密相关。大量研究发现，天然或人工构建的蜡质缺失突变体植物株系，对干旱、盐碱、低温、病菌等均表现出较差的抗性/抵御能力。在实际生产过程中，增强或保护果实表皮蜡质(喷蜡/打蜡、套袋等操作)，可显著降低果实生长过程中的病害发生率、抑制果实采后的水分流失和呼吸强度，从而提高果实的成果率、延缓其衰老、延长保鲜期。因此，增强植物自身的蜡质合成和积累，可改善其茎/叶/果表皮蜡质层的性能，从而提升其抗性和果实的贮藏保鲜能力。寻找有效调控并增强植物蜡质合成的基因，对提高作物抗性、培育抗病抗逆新品种具有重要意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用。
本发明的具体技术方案是：
一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30，其编码区序列如下：SEQ ID NO.1，抗性包括抗旱、抗盐、抗病。
所述可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
包含所述甜橙基因CsMYB30的PH2GW7-CsMYB30超量表达载体。
一种提高植物抗性的方法，所述方法包括获得甜橙基因CsMYB30超表达拟南芥株系的步骤。
优选地，所述方法包括构建PH2GW7-CsMYB30超表达载体的步骤。
优选地，所述构建PH2GW7-CsMYB30超表达载体的方法中：CsMYB30基因开放阅读码区全长扩增引物设计所采用引物序列如下：
att B-CsMYB30-F：AAAAAGCAGGCTCCATGGGGAGACCGCCTTGC；
att B-CsMYB30-R：AGAAAGCTGGGTTCTAAAAGAACCCAACAGTAC。
本发明有益效果：
抗盐评估：种子发芽率计算结果显示：在300mM盐处理下，仅4％的野生型种子发芽，但OE2的发芽率为50％，OE4的发芽率为58.6％，OE5的发芽率为42.5％。该结果表明，CsMYB30的过表达可以增强抗盐性。
抗旱评估：CsMYB30转基因品系的抗旱表型具有可重复性和稳定性。此外，盐处理的种子发芽率和干旱处理的存活率均与三种CsMYB30转基因株系的表达水平呈正相关。表明，CsMYB30的过表达可以增强抗旱性。
抗病评估：野生型叶片中丁香假单胞菌侵染率为64％，而CsMYB30超表达植株叶片中该病原菌的侵染率为20％-45％，抗病能力大幅度增高。表明，CsMYB30的过表达可以增强抵抗病原菌的能力。
CsMYB30超表达导致了更多的蜡质富集在植株表面，增加的表皮蜡质能导致表皮渗透性降低并赋予增强的抗干旱和抗盐性。
附图说明
图1PH2GW7-CsMYB30超表达载体示意图
图2拟南芥植株培养与花浸染：A：播种(0d)；B：种子萌发(4d)；C：植株生长(20d)；D：开花(35d)；E：花浸染(40d)；F：浸染后培养(60d)；
图3CsMYB30超表达植株T1代阳性植株筛选：A：高表达植株半定量分析；B：高表达株系植株生长势；C：高表达株系种子收获量；
图4为野生型拟南芥株系(WT)与CsMYB30基因超表达株系(OE2、OE4、OE5)中CsMYB30表达量(A)和各个株系植株形态(B)；
图5为野生型拟南芥株系(WT)与CsMYB30基因超表达株系(OE2、OE4、OE5)种子在含有0.3mol/L氯化钠培养基上生长势(A)和萌发率(B)的对比；
图6为野生型拟南芥株系(WT)与CsMYB30基因超表达株系(OE2、OE4、OE5)植株干旱处理下植株长势对比；
图7为野生型拟南芥株系(WT)与CsMYB30基因超表达株系(OE4、OE5)叶片对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)的侵染率对比。
图8为野生型拟南芥株系(WT)与CsMYB30基因超表达株系(OE4、OE5)表皮蜡质晶体微观结构的对比；
图9为野生型拟南芥株系(WT)与CsMYB30基因超表达株系(OE4、OE5)表皮蜡质总量的对比；
图10为野生型拟南芥株系(WT)与CsMYB30基因超表达株系(OE4、OE5)叶片叶绿素浸出率的对比；
具体实施方式
本技术所用到的实验材料包括提取CsMYB30基因的甜橙果皮，模式植物拟南芥野生型(WT，Col-1)，以及用以构建CsMYB30基因超表达拟南芥株系的质粒(PH2GW7)、农杆菌(GV3101)等。
实施例1：甜橙基因CsMYB30超表达拟南芥株系的获得
一、CsMYB30植物超表达载体构建
1、CsMYB30基因开放阅读码区全长扩增
1.1纽荷尔脐橙果皮总RNA的提取和转录
以幼嫩时期和成熟时期的纽荷尔脐橙果实为试验材料，用一次性刀片分离含有表皮细胞的果皮组织进行RNA提取。根据电泳结果及A260/A280的比值确保RNA的质量。取1.5μg RNA用于c DNA的合成，使用Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit(ThermoScientific)，具体操作步骤参照说明书。
1.2CsMYB30基因开放阅读码区全长扩增引物设计
基于甜橙基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)中的序列信息，参考Primer 5软件，手动设计CsMYB30(Cs6g21210)的ORF全长扩增引物，引物序列见表1。
表1用于构建目的基因植物超表达载体的引物
Figure BDA0003102770740000041
1.3CsMYB30基因开放阅读码区全长PCR扩增
PCR反应
基于设计引物和两个样品c DNA混合样品为模板，进行两轮PCR扩增。扩增体系及PCR程序如表2所示。
吸取以上5μL PCR反应产物进行胶检，胶检结果与预期片段大小一致，进行第二轮PCR反应，反应体系和程序见表3。
表2 Gateway载体构建-第一轮PCR扩增体系及程序
第一轮PCR体系 20μL PCR反应
2xEasyPfu PCR SuperMix 10 94 3min
cDNA 2 94 30sec
att B-CsMYB30-F 1 60 30sec
att B-CsMYB30-R 1 72 1min 20sec
无菌蒸馏水 6 30循环(2-4步)
72 7min
表3 Gateway载体构建-第二轮PCR扩增体系及程序
Figure BDA0003102770740000042
Figure BDA0003102770740000051
PCR产物回收
以上获得的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段(回收步骤参照回收试剂盒进行)，最后加入35μL elution buffer溶解目的片段。
2、CsMYB30-pDONOR221中间载体构建
BP反应
通过BP反应将目的片段连入pDONOR221载体中(BP反应体系见表4)。
表4 Gateway载体构建BP和LR反应体系
Figure BDA0003102770740000052
热激转化
1.将以上BP反应产物加入到50μL大肠杆菌DH5α感受态中，吸打混匀；
2.冰上放置30min后，于42℃水浴90s，冰上放置2min；
3.加入800μL的LB液体培养基，37℃摇床中200r/min培养1h；
4.吸取200μL菌液均匀涂布于LB固体培养皿中(含100mg/L卡那霉素)，37℃培养箱中培养14h；
5.挑取单克隆于800μL含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃摇床中200r/min培养8h。
菌液PCR检测
以上述转化子菌液为模板，att B-CsMYB30-F和att B-CsMYB30-R为引物，进行PCR扩增(反应体系和程序见表5)，选取3个琼脂糖凝胶电泳检测为阳性的菌株进行测序，选取具有完全正确的序列进行下一步。
表5菌液PCR扩增体系及程序
菌液PCR体系 20μL PCR反应
2xEasyPfu PCR SuperMix 10 94 10min
菌液 2 94 30sec
att B-CsMYB30-F 1 60 30sec
att B-CsMYB30-R 1 72 1min 20sec
无菌蒸馏水 6 30循环(2-4步)
72 7min
p DONOR221-CsMYB30质粒提取
吸取适量以上携带正确序列的菌液于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床中200r/min培养12h。菌体中的构建好的重组载体pDONOR221-CsMYB30按照QIAGEN plasmidMidi Kit试剂盒说明书提取质粒DNA。
测序后得到CsMYB30基因开放阅读码框的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
ATGGGGAGGCCACCTTGTTGTGACAAAATTGGTATCAAGAAAGGGCCATGGACTCCAGAAGAAGATATCATTTTAGTTTCTTATATTCAAGAGCATGGCCCTGGAAATTGGAGGGCTGTTCCCACTAATACAGGATTGCTTAGATGCAGCAAAAGTTGCAGGCTTAGATGGACTAATTACCTAAGGCCAGGGATCAAGCGTGGGAATTTCACTGATCAAGAAGAGAAGATGATAATTCATCTGCAAGCACTTTTGGGCAACAGATGGGCTGCTATTGCTTCTTATCTCCGTCAGAGAACTGACAATGACATCAAGAACTATTGGAATACTCACTTGAAGAAGAAGGTTAAGAAGCTGCAACTAGCTGCTGCTGGCTGCTCTGAAGATAATAGCCAATATAGAGATGAGCTAGCTTCAGCTTCTTCACAGCAAATCTCAAGGGGCCAGTGGGAGAGAAGGCTGCAGACTGATATTCACATGGCTAAGCAAGCTCTATGTGCGGCCTTGTCACCAGATAAAGCGAGTATTTTGTCTGAATTGAAGCCTGCAAATGGGTTCATTTCCTACACAAAACCAGCAGTTCAAGCACCAACTTACGCTTCAAGCACTGAGAACATTGCTAAGTTGCTCAAAGGGTGGACCAGAAACGCTCAAAAAAGTGCTTCTTCGAACTCAGGTGTTACTGATCAGAATTCAATTAATAACAATGTTAATCACATTGCTGGGGCAGAATCTGCTTCTAGTGAAGAGACTCCAAGCAAAGTTGCAAGCAACAGTACTGCCATAGAATTATCAGAGGCTTTTGAATCGTTGTTTGGTTTTGAGTCTTTTGATTCGTCAAATTCTACCGATTTATCTCAATCTGTGACCCCTGAGTCTAGCGCTTTTCAAGATTATGAGAGCAAGCAATTGTTATTAGATCCCAGTGCTGGTGCTGATGATGATCAAATGCCACAGCTGTCATTGCTTGAGAAGTGGCTTTTTGATGATCAAGGTGGGAAAGATTATCTTAATGA
ATGGGGAGGCCACCTTGTTGTGACAAAATTGGTATCAAGAAAGGGCCATGGACTCCAGAAGAAGATATCATTTTAGTTTCTTATATTCAAGAGCATGGCCCTGGAAATTGGAGGGCTGTTCCCACTAATACAGGATTGCTTAGATGCAGCAAAAGTTGCAGGCTTAGATGGACTAATTACCTAAGGCCAGGGATCAAGCGTGGGAATTTCACTGATCAAGAAGAGAAGATGATAATTCATCTGCAAGCACTTTTGGGCAACAGATGGGCTGCTATTGCTTCTTATCTCCGTCAGAGAACTGACAATGACATCAAGAACTATTGGAATACTCACTTGAAGAAGAAGGTTAAGAAGCTGCAACTAGCTGCTGCTGGCTGCTCTGAAGATAATAGCCAATATAGAGATGAGCTAGCTTCAGCTTCTTCACAGCAAATCTCAAGGGGCCAGTGGGAGAGAAGGCTGCAGACTGATATTCACATGGCTAAGCAAGCTCTATGTGCGGCCTTGTCACCAGATAAAGCGAGTATTTTGTCTGAATTGAAGCCTGCAAATGGGTTCATTTCCTACACAAAACCAGCAGTTCAAGCACCAACTTACGCTTCAAGCACTGAGAACATTGCTAAGTTGCTCAAAGGGTGGACCAGAAACGCTCAAAAAAGTGCTTCTTCGAACTCAGGTGTTACTGATCAGAATTCAATTAATAACAATGTTAATCACATTGCTGGGGCAGAATCTGCTTCTAGTGAAGAGACTCCAAGCAAAGTTGCAAGCAACAGTACTGCCATAGAATTATCAGAGGCTTTTGAATCGTTGTTTGGTTTTGAGTCTTTTGATTCGTCAAATTCTACCGATTTATCTCAATCTGTGACCCCTGAGTCTAGCGCTTTTCAAGATTATGAGAGCAAGCAATTGTTATTAGATCCCAGTGCTGGTGCTGATGATGATCAAATGCCACAGCTGTCATTGCTTGAGAAGTGGCTTTTTGATGATCAAGGTGGGAAAGATTATCTTAATGACCTTAAATTAGATGATCATGAGGACACTGATATGTTCTGA
该基因可编码出具有如下氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的蛋白质：
MGRPPCCDKIGIKKGPWTPEEDIILVSYIQEHGPGNWRAVPTNTGLLRCSKSCRLRWTNYLRPGIKRGNFTDQEEKMIIHLQALLGNRWAAIASYLRQRTDNDIKNYWNTHLKKKVKKLQLAAAGCSEDNSQYRDELASASSQQISRGQWERRLQTDIHMAKQALCAALSPDKASILSELKPANGFISYTKPAVQAPTYASSTENIAKLLKGWTRNAQKSASSNSGVTDQNSINNNVNHIAGAESASSEETPSKVASNSTAIELSEAFESLFGFESFDSSNSTDLSQSVTPESSAFQDYESKQLLLDPSAGADDDQMPQLSLLEKWLFDDQGGKDYLNDLKLDDHEDTDMF*
3、角质膜相关的MYB家族转录因子植物超表达载体构建
LR反应
通过LR反应将目的片段连入植物超表达载体PH2GW7载体中(LP反应体系见表3)。
热激转化(与1.2相同，筛选抗生素为壮观霉素)
菌液PCR检测(与1.2相同)
PH2GW7-CsMYB30质粒提取(与1.2相同，抗生素为壮观霉素)
二、植物超表达载体农杆菌转化
以上得到的重组超量表达载体PH2GW7-CsMYB30转入农杆菌菌株GV3101中。
热激转化
1.取2μg质粒加入到100μL农杆菌GV3101感受态中，吸打混匀；
2.冰上放置30min后用液氮急冻5min，液氮中取出样品于37℃水浴5min，冰上放置2min；
3.加入800μL的LB液体培养基，28℃摇床中200r/min培养4-5h；
4.取出菌液样品，吸取200μL均匀涂布于LB固体培养皿中(培养皿含100mg/L壮观霉素)，28℃培养箱中培养2d；
5.挑取单克隆于800μL含有壮观霉素的LB液体培养基，28℃摇床中200r/min培养14h。
农杆菌菌液PCR检测
1.取200μL农杆菌菌液，12000rpm离心2min，去上清，加入50μL蒸馏水，吸打混匀后沸水浴8min，取出用液氮冻2min，放于冰上冻融，即可进行PCR鉴定(PCR反应体系和程序与1.2同)
菌液PCR产物测序
选取2个琼脂糖凝胶电泳检测为阳性的菌株交由华大基因测序，对测序结果进行分析，选取具有完全正确的序列进行下一步。
本研究中，植物超表达载体选用gateway载体PH2GW7，插入基因替换掉原载体中的ccdB致死基因，具有壮观霉素和潮霉素抗性标记，分别用于原核生物筛选标记和拟南芥植株筛选标记。成功构建命名为PH2GW7-CsMYB 30的超表达载体(图1)。
三、农杆菌介导目标基因在拟南芥中的遗传转化
1、拟南芥植株种植
植株健壮程度对拟南芥转基因阳性植株得率至关重要。尽管拟南芥对生长环境要求较低，但依需精心培养才能得到健壮植株。其中培养钵中的水量，虫害的清理，移栽过程中根的保护是决定其长势的关键。一定的培养条件摸索后，本实验得到了较为健壮的植株，其培养过程见图2(A-D)。植株首次开花后1w左右，从基部减去花苔，去其顶端优势，促进更多的花序生成。待第二次开花1w左右时，可进行花浸染。
2、花序侵染法转化拟南芥
(1)将携带超量表达载体PH2GW7-CsMYB30的农杆菌GV3101接种在3mL含壮观霉素的LB培养液中，28℃，200r/min，培养16h。
(2)将以上活化菌液接种至400-500mL含卡纳抗生素的LB培养液中，28℃，200r/min，培养至细菌OD600值为1-1.5。4000r/min离心10min收集细胞并悬浮于约等体积的渗透培养液(50mL/L MS大量，50g/L蔗糖，5mL/L 200VB，2g/L MgCl2·6H2O，200μL/L silwetL-77)。
(3)在500mL烧杯内倒入悬浮有农杆菌的渗透液。
(4)剪掉果荚后，将培养钵小心地反扣在上述器皿上，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中大约40-60s，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净(图2E)。
(5)将处理过的植物用塑料盖盖上避光16h培养。
花浸染时，需要注意侵染液中silwett-77的浓度，浓度过高，容易导致植株损伤，浓度过低，侵染效率低。经过多次的浓度摸索(50μL/L，100μL/L，200μL/L，300μL/L)，发现silwett-77在300μL/L浓度下，会导致植株萎蔫。因此silwett-77最终选用的浓度为200μL/L，侵染后植株组织健康。侵染结束后，暗培养16h，为农杆菌提供最为合适的浸染环境，而后正常培养(图2F)，直至成熟，其种子即为T1代种子。
四、PH2GW7-CsMYB30超表达阳性植株及阳西植株纯系筛选
1、T1代阳性植株鉴定
对潮霉素筛选后植株进行培养，取相同部位的组织提取DNA，以各个转基因的序列特异性区域进行PCR检测：CsMYB30筛选出55个阳性株系。
2、CsMYB30超表达T1代阳性植株筛选
在初步筛选出阳性植株的基础上，综合对比分析阳性植株叶片中CsMYB30的表达量(部分结果见图3A)、植株表型特征(图3B)、种子收获量(图3C)等指标，得到CsMYB30高表达量植株5株，与植株自身高表达量的eIF4a表达丰度相似，分别为13、48、51、55、65。其植株表型有较大差异，13号和65号植株健壮，种子收获量多，种子败育率较小；48号和55号植株长势中等，种子收获量较少，种子败育率较小。51号植株长势弱小，严重败育，种子收获量极少。得到CsMYB30较高表达量植株5株，分别为38、52、44、30和83。我们对以上初选的10个株系的T2代株系进行纯系筛选。
3、CsMYB30基因超表达植株T2代纯系筛选
T1代阳性植株一般为杂合体Aa，T2代的种子通常包括3种：阳性纯合体AA，杂合体Aa和阴性纯合体aa。因此，还需要对T2代种子进行潮霉素筛选，以其阳性植株进行后续实验。MS培养基抗生素筛选结果表明，大多数T1代株系植株T2代种子中约有1/4种子不能正常生长，与预期吻合。44和38号在T1代即为纯系。综合考虑种子收获量和CsMYB30表达量，我们选择5个株系进行后续研究，分别为：13，38，44，48和65。T1代种子播种在潮霉素筛选培养基中，对萌发率进行统计，选择纯系中长势良好的植株移栽至土壤中，每个株系选择若干植株进行后期表型观察。
实施例2：CsMYB30超表达拟南芥株系的抗性
1、CsMYB30超表达对拟南芥生长和生殖的影响
为了深入研究CsMYB30超表达对拟南芥蜡质代谢的影响，选择具有代表性的三个超表达株系，开展后续深入研究。这三个株系被命名为OE2(原编号44)、OE5(原编号65)和OE4(原编号13)，我们对其T3代植株再次通过半定量对CsMYB30进行表达量分析，结果表明其CsMYB30表达量分别为低、中和高三种水平(图4A)。在相同条件下进行培育，在播种后四周，CsMYB30转基因株系与野生型植物显示出相似的生长和发育性能(图4B)。
2、CsMYB30超表达对拟南芥抗性的影响
前期研究显示，MYB30转录因子通常会参与非生物胁迫和生物胁迫的调控。为了探索柑橘CsMYB30对拟南芥种子和植株对抗盐、抗旱和抗病原菌的影响。
抗盐评估：将CsMYB30超表达植株种子和野生型种子种植在添加不同浓度NaCl(200mM，300mM)的MS培养基(1/2MS盐，0.05％MES，1％琼脂，pH 5.7)中，对种子萌发率进行统计。在正常MS培养基中，CsMYB30转基因株系显示出与WT株系相似的发芽率，在200mM盐处理下，野生型植株和转基因植株的萌发率和生长势相似。而在更高浓度的300mM盐处理下，转基因株系对盐的耐受性显著提高(图5A)。种子发芽率计算结果显示：在300mM盐处理下，仅4％的野生型种子发芽，但OE2的发芽率为50％，OE4的发芽率为58.6％，OE5的发芽率为42.5％(图5B)。该结果表明，CsMYB30的过表达可以增强抗盐性。
抗旱评估：将CsMYB30超表达植株种子和野生型种子播种在土壤中，在正常培养条件下(16h光照/8h黑暗，湿度60％，温度22℃)生长3周后，在土壤中不再添加水，对植株进行连续2周缺水处理，实施干旱胁迫，然后给水考察其恢复/生存情况。结果显示，与野生型的低存活率(约三分之一)相比，转基因株系显示出较轻的干旱症状(图6)。大约三分之二的OE2株系在恢复给水后能够幸存，而所有OE4和OE5株系都存活。抗旱性试验共重复进行了2次，结果显示CsMYB30转基因品系的抗旱表型具有可重复性和稳定性。此外，盐处理的种子发芽率和干旱处理的存活率均与三种CsMYB30转基因株系的表达水平呈正相关。这些结果表明，CsMYB30的过表达可以增强抗旱性。
抗病评估：将将活化好的Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000单菌落培养至OD600＝0.8。离心收集菌体，用10mmol/L MgCl2重悬菌体至OD600＝0.02。接种采用无枪头注射器压力法注射培养四周的拟南芥叶片。病原菌处理后的拟南芥置于黑暗条件下保湿培养24h，再置于正常条件培养，观察植株发病情况。结果表明，野生型叶片中丁香假单胞菌侵染率为64％，而CsMYB30超表达植株叶片中该病原菌的侵染率为20％-45％，抗病能力大幅度增高(图7)。该结果表明，CsMYB30的过表达可以增强抵抗病原菌的能力。
实施例3：CsMYB30超表达拟南芥株系的表皮蜡质与形貌
为了弄清楚CsMYB30超表达植株抗逆性增强的原因，我们对植株表面蜡质晶体结构和含量进行了分析。我们通过3种方法比较野生型和超表达植株(OE4和OE5)蜡质差异：(1)通过扫描电子显微镜(SEM)观察植株表面蜡质超微结构；(2)通过气相-质谱(GC-MS)分析植株中总蜡含量；(3)通过测定叶片叶绿素渗透率分析表面透性。
蜡质晶体结构观察：首先我们用扫描电镜对表皮蜡晶体进行了观察。选取在土壤中生长的野生型和CsMYB30超表达植株(四周龄)相同部位的花茎进行观察。然后，使用标准扫描电镜制备技术处理这些样品，在3％的戊二醛中固定，脱水以及用金颗粒包被，最后用扫描电镜(FEI Quanta 650，Thermo Fisher Scientific，德国)进行观察。结果表明，野生型植株茎表面仅极少量可见的蜡质晶体，而CsMYB30的两个转基因株系OE4和OE5植株富集了大量的多层的片状晶体(图8)。有趣的是，这些积累的片状蜡质晶体是在柑橘类果实表面典型的蜡质晶体结构，而在野生型拟南芥茎上不常见。
蜡质含量测定：CsMYB30超表达植株富集了大量的多层的片状晶体，而野生型表面可见的晶体很少，甚至难以观测到。我们进一步通过气相-质谱(GC-MS)分析叶片中总蜡含量，结果表明野生型叶片蜡质含量为152μg/g，CsMYB30超表达植株叶片蜡质最高达到275μg/g(图9)。这说明，CsMYB30超表达导致了更多的蜡质富集在植株表面，这可能是其抗性提高的重要原因。
叶绿素渗透率测定：植物叶片蜡质成分或含量的改变常常引起叶片表面透性的变化。我们将在土壤中培养4周的植株中的第三至第七片莲座叶剪下，对其叶绿素的浸出率进行测定。将完整的的叶片在冰上孵育30分钟后，在室温下于黑暗中浸泡于装有40mL 80％乙醇的50mL锥形管。每隔15分钟从浸提液中取出1ml样品，使用UV1901PC分光光度计在647和664nm处测量吸光度。Chl含量计算公式为mmol Chl/鲜重(g)＝[19.53(A647)+7.93(A664)]/鲜重(g)。结果表明，CsMYB30超表达株系的离体叶片中叶绿素浸出速率远低于野生型(图10)。因此，增加的表皮蜡质能导致表皮渗透性降低并赋予增强的抗干旱和抗盐性。
Figure BDA0003102770740000141
Figure BDA0003102770740000151
Figure BDA0003102770740000161
Figure BDA0003102770740000171
SEQUENCE LISTING
<110> 成都大学
<120> 一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及应用
<130> 528
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1056
<212> DNA
<213> Citrus sinensis
<400> 1
atggggaggc caccttgttg tgacaaaatt ggtatcaaga aagggccatg gactccagaa 60
gaagatatca ttttagtttc ttatattcaa gagcatggcc ctggaaattg gagggctgtt 120
cccactaata caggattgct tagatgcagc aaaagttgca ggcttagatg gactaattac 180
ctaaggccag ggatcaagcg tgggaatttc actgatcaag aagagaagat gataattcat 240
ctgcaagcac ttttgggcaa cagatgggct gctattgctt cttatctccg tcagagaact 300
gacaatgaca tcaagaacta ttggaatact cacttgaaga agaaggttaa gaagctgcaa 360
ctagctgctg ctggctgctc tgaagataat agccaatata gagatgagct agcttcagct 420
tcttcacagc aaatctcaag gggccagtgg gagagaaggc tgcagactga tattcacatg 480
gctaagcaag ctctatgtgc ggccttgtca ccagataaag cgagtatttt gtctgaattg 540
aagcctgcaa atgggttcat ttcctacaca aaaccagcag ttcaagcacc aacttacgct 600
tcaagcactg agaacattgc taagttgctc aaagggtgga ccagaaacgc tcaaaaaagt 660
gcttcttcga actcaggtgt tactgatcag aattcaatta ataacaatgt taatcacatt 720
gctggggcag aatctgcttc tagtgaagag actccaagca aagttgcaag caacagtact 780
gccatagaat tatcagaggc ttttgaatcg ttgtttggtt ttgagtcttt tgattcgtca 840
aattctaccg atttatctca atctgtgacc cctgagtcta gcgcttttca agattatgag 900
agcaagcaat tgttattaga tcccagtgct ggtgctgatg atgatcaaat gccacagctg 960
tcattgcttg agaagtggct ttttgatgat caaggtggga aagattatct taatgacctt 1020
aaattagatg atcatgagga cactgatatg ttctga 1056
<210> 2
<211> 352
<212> PRT
<213> Citrus sinensis
<400> 2
Met Gly Arg Pro Pro Cys Cys Asp Lys Ile Gly Ile Lys Lys Gly Pro
1 5 10 15
Trp Thr Pro Glu Glu Asp Ile Ile Leu Val Ser Tyr Ile Gln Glu His
20 25 30
Gly Pro Gly Asn Trp Arg Ala Val Pro Thr Asn Thr Gly Leu Leu Arg
35 40 45
Cys Ser Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Gly
50 55 60
Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Asp Gln Glu Glu Lys Met Ile Ile His
65 70 75 80
Leu Gln Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ala Ala Ile Ala Ser Tyr Leu
85 90 95
Arg Gln Arg Thr Asp Asn Asp Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu
100 105 110
Lys Lys Lys Val Lys Lys Leu Gln Leu Ala Ala Ala Gly Cys Ser Glu
115 120 125
Asp Asn Ser Gln Tyr Arg Asp Glu Leu Ala Ser Ala Ser Ser Gln Gln
130 135 140
Ile Ser Arg Gly Gln Trp Glu Arg Arg Leu Gln Thr Asp Ile His Met
145 150 155 160
Ala Lys Gln Ala Leu Cys Ala Ala Leu Ser Pro Asp Lys Ala Ser Ile
165 170 175
Leu Ser Glu Leu Lys Pro Ala Asn Gly Phe Ile Ser Tyr Thr Lys Pro
180 185 190
Ala Val Gln Ala Pro Thr Tyr Ala Ser Ser Thr Glu Asn Ile Ala Lys
195 200 205
Leu Leu Lys Gly Trp Thr Arg Asn Ala Gln Lys Ser Ala Ser Ser Asn
210 215 220
Ser Gly Val Thr Asp Gln Asn Ser Ile Asn Asn Asn Val Asn His Ile
225 230 235 240
Ala Gly Ala Glu Ser Ala Ser Ser Glu Glu Thr Pro Ser Lys Val Ala
245 250 255
Ser Asn Ser Thr Ala Ile Glu Leu Ser Glu Ala Phe Glu Ser Leu Phe
260 265 270
Gly Phe Glu Ser Phe Asp Ser Ser Asn Ser Thr Asp Glx Leu Ser Gln
275 280 285
Ser Val Thr Pro Glu Ser Ser Ala Phe Gln Asp Tyr Glu Ser Lys Gln
290 295 300
Leu Leu Leu Asp Pro Ser Ala Gly Ala Asp Asp Asp Gln Met Pro Gln
305 310 315 320
Leu Ser Leu Leu Glu Lys Trp Leu Phe Asp Asp Gln Gly Gly Lys Asp
325 330 335
Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Leu Asp Asp His Glu Asp Thr Asp Met Phe
340 345 350
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Citrus sinensis
<400> 3
aaaaagcagg ctccatgggg agaccgcctt gc 32
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Citrus sinensis
<400> 4
agaaagctgg gttctaaaag aacccaacag tac 33

Claims (4)

1.一种提高植物抗性的方法，其特征在于，所述方法采用可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30，其编码区序列如下：SEQ ID NO.1，抗性包括抗旱、抗盐、抗病，甜橙基因CsMYB30编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括构建PH2GW7-CsMYB30超表达载体的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括获得甜橙基因CsMYB30超表达拟南芥株系的步骤。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述构建PH2GW7-CsMYB30超表达载体的方法中： CsMYB30基因开放阅读码区全长扩增引物设计所采用引物序列如下：
att B-CsMYB30-F：AAAAAGCAGGCTCCATGGGGAGACCGCCTTGC；
att B-CsMYB30-R：AGAAAGCTGGGTTCTAAAAGAACCCAACAGTAC。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114292318B (zh) * 2021-12-31 2023-05-05 江西农业大学 一种增强植物非生物胁迫抗性的蛋白、编码基因、引物对、表达载体及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000060089A1 (en) * 1999-04-07 2000-10-12 Mendel Biotechnology, Inc. Genetic trait breeding method
CN101365794A (zh) * 2005-08-12 2009-02-11 巴斯福植物科学有限公司 编码与非生物性胁迫应答相关的蛋白质的核酸序列和具有增加的环境胁迫耐受性的植物细胞及植物
CN101880681A (zh) * 2010-04-30 2010-11-10 成都大学 麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重组蛋白制备方法
CN107674882A (zh) * 2011-01-28 2018-02-09 加利福尼亚大学董事会 植物中经空间修饰的基因表达
CN110607316A (zh) * 2019-08-23 2019-12-24 兰州理工大学 扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因及其编码蛋白和克隆方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1086420C (zh) * 1995-03-29 2002-06-19 北京大学 一种培育抗黄瓜花叶病毒病甜椒的方法
AU2005234725B2 (en) * 2003-05-22 2012-02-23 Evogene Ltd. Methods of Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass in Plants and Plants Generated Thereby
KR101548938B1 (ko) * 2013-11-18 2015-09-02 전남대학교산학협력단 애기장대 유래 myb96 유전자를 이용한 가뭄 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체
JP6103607B2 (ja) * 2014-07-31 2017-03-29 岡山県 高密度植栽に好適な植物体およびその利用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000060089A1 (en) * 1999-04-07 2000-10-12 Mendel Biotechnology, Inc. Genetic trait breeding method
CN101365794A (zh) * 2005-08-12 2009-02-11 巴斯福植物科学有限公司 编码与非生物性胁迫应答相关的蛋白质的核酸序列和具有增加的环境胁迫耐受性的植物细胞及植物
CN101880681A (zh) * 2010-04-30 2010-11-10 成都大学 麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重组蛋白制备方法
CN107674882A (zh) * 2011-01-28 2018-02-09 加利福尼亚大学董事会 植物中经空间修饰的基因表达
CN110607316A (zh) * 2019-08-23 2019-12-24 兰州理工大学 扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因及其编码蛋白和克隆方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ectopic expression of CsMYB30 from citrus sinensis enhances salt and drought tolerance by regulating wax synthesis in Arabidopsis thaliana;Xuefei Wen等;《Plant Physiol Biochem》;20210629(第166期);全文 *
Predicted:Citrus sinensis myb-related protein 306-like(LOC102610405),mRNA;NCBI;《Genbank Database》;20180516;Accession No.XM_006482527 *
果树对盐胁迫的响应和耐盐机制研究进展;吴强盛等;《长江大学学报(自科版)农学卷》;20071215(第04期);全文 *
柑橘MYB转录因子调控果实采后汁胞木质化的功能研究;贾宁;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20200315(第3期);全文 *
植物抗旱耐盐基因的研究进展;陈丽萍等;《基因组学与应用生物学》;20100628(第03期);全文 *
黄瓜蜡质合成基因CsCER10的表达模式及生物学信息分析;王世峰等;《山西农业科学》;20190520(第05期);全文 *

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