CN101365794A - 编码与非生物性胁迫应答相关的蛋白质的核酸序列和具有增加的环境胁迫耐受性的植物细胞及植物 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及编码与植物中非生物性胁迫应答和非生物性胁迫耐受性相关的蛋白质的核酸序列。本发明还涉及与相应非转化的野生型植物细胞相比具有改变的代谢活性的经转化的植物细胞，其中用编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸转化改变代谢，并且导致与相应非转化的野生型植物细胞相比增加的环境胁迫耐受性和/或抗性。

Description

编码与非生物性胁迫应答相关的蛋白质的核酸序列和具有增加的环境胁迫耐受性的植物细胞及植物
本申请含有＂长＂序列表，该序列表已经通过替代印刷纸质副本的CD-R而提交，并且因而完整地引用作为参考。在2005年7月29日记录的所述CD-R被标记为CRF，分别是＂副本1＂和＂副本2＂，并且每个仅含有一个相同的664Kb文件(00015127.APP)。
本发明一般地涉及编码与植物中非生物性胁迫应答和非生物性胁迫耐受性相关的蛋白质的核酸序列。
本发明还涉及转化的植物细胞，其与相应未转化的野生型植物细胞相比具有改变的代谢活性，其中代谢活性通过用编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸转化得到改变并且产生与相应非转化的野生型植物细胞相比增加的环境胁迫耐受性和/或抗性。
具体地，本发明涉及编码蛋白质的核酸序列，该蛋白质赋予植物干旱、炎热、寒冷和/或盐耐性和/或抗性，特别通过改变引起植物干旱、炎热、寒冷和/或盐耐性和/或抗性的代谢活性实现。本发明还涉及产生、筛选和繁殖此类植物细胞或植物的方法和检测植物细胞或植物中胁迫的方法。
非生物性环境胁迫如干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫和寒胁迫是植物生长和产量的主要限制性因素(Boyer.1982.Science 218，443-448)。由这些胁迫所引起主要作物如稻、玉米(corn)和小麦的作物损失和作物产量的损失代表重要的经济和政治因素并且在多个欠发达国家中造成食品短缺。
植物在其生活周期中经常暴露于环境性水含量降低的环境。大多数植物已经演化出对这些少水或脱水(干旱)条件的自我保护策略。然而，当干旱条件过于严重并且持续时间太长，对多数作物植物的植物发育、生长和产量的影响严重。持续暴露于干旱引起植物代谢上的重大改变。在这些代谢上的重大变化最终引起细胞死亡并且因此引起产量损失。
开发耐受胁迫的植物是具有解决这些问题中某些问题或至少促进其解决的潜力的策略(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping inCultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。然而，开发对这些类型的胁迫表现抗性(耐性)的新植物品系的常规植物育种策略进展相对缓慢并且需要用于与所需要品系杂交的特定抗性品系。有限的胁迫耐受的种质资源和亲缘较远的植物种间杂交的不兼容性是常规育种中遇到的严重问题。此外，引起干旱、寒冷和盐耐性的细胞过程在本质上复杂并涉及细胞适应的多重机制以及多种代谢途径(McKersie和Leshem，1994.Stress andStress Coping in Cultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。胁迫抗性的这种多因素性质不仅使耐性育种基本不成功，而且还限制了使用生物技术方法从遗传上设计耐胁迫植物的能力。
旱胁迫、热胁迫、寒胁迫和盐胁迫具有对植物生长重要的共同主题，即水的可获得性。植物在其整个生活周期内暴露于环境水含量降低的环境。大多数植物已经演化出对于这些环境的自我保护策略。然而，当干旱条件太严重性并且持续时间太长，对大多数作物植物的植物发育、生长和产量的影响严重。因为在某些土壤中的高盐含量导致可得到用于细胞摄取的水更少，所以其效应类似于在干旱条件下观察到的效应。此外，在冰冻温度下，植物细胞因从质外体开始并从共质体抽取水分而形成冰导致失水(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping in Cultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。通常，植物对这类胁迫条件中每种胁迫条件的分子应答机制相似。
目前研究的结果表明干旱耐性是复杂的量的特性并且仍然没有真正的诊断性标志可用。高盐浓度或脱水可以在干旱胁迫期间在细胞水平导致损害，但是确切的伤害并没有完全阐明(Bray，1997.Trends Plant Sci.2，48-54)。缺少机制性理解使设计转基因方法以改进干旱耐性难以进行。然而，损害的重要后果可能是产生引起细胞损伤的活性氧自由基，如脂的过氧化作用或者蛋白质和核酸修饰。已描述了氧自由基化学和它们与细胞器如细胞膜反应的细节(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping inCultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。
本发明的目的是鉴定在表达、不足量表达或过量表达时能够向植物赋予胁迫耐受性的新的独特基因。
本发明又一目的是鉴定、产生和繁殖新的独特的胁迫耐性和/或抗性植物细胞或植物以及在植物或植物细胞中诱导和检测胁迫耐性和/或抗性的方法。
本发明的又一目的是确定检测植物或植物细胞中的胁迫耐受性和/或抗性的新方法。本发明的目的还是鉴定在表达或过量表达时能够向植物赋予胁迫耐受性的新的独特基因。
本发明提供转化的植物细胞，其与相应未转化的野生型植物细胞相比具有改变的代谢活性，其中代谢活性因用编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸转化而改变并且与相应非转化的野生型植物细胞相比，导致增加的环境胁迫耐受性和/或抗性。
本发明提供由编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸所转化的转基因植物细胞，其中所述的核酸选自：a)核酸分子，其编码在序列表中公开的多肽之一或其片段，其中所述多肽或其片段赋予生物或其部分中改变的代谢活性的；b)核酸分子，其包含在序列表中公开的核酸分子中的一种核酸分子；c)核酸分子，其序列可以因遗传密码子的简并性而从由(a)或(b)的核酸分子所编码的多肽序列中推导并且该核酸分子赋予生物或其部分中改变的代谢活性；d)编码多肽的核酸分子，其中所述的多肽与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；e)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并赋予生物或其部分中改变的代谢活性；f)核酸分子，其通过使用如表2内所示引物，扩增来自cDNA文库或基因组文库中的核酸分子而得到并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；g)编码多肽的核酸分子，其中所述的多肽借助针对其的单克隆抗体予以分离，其中该多肽由(a)至(f)的核酸分子之一编码并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；和h)核酸分子，它是通过用包含(a)至(k)的核酸分子的序列之一的探针或其片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库可得到的，其中所述的探针片段具有在(a)至(g)中得到表征并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性的核酸分子的至少15nt，优选20nt，30nt，50nt，100nt，200nt或500nt。
如本文中所用，术语“代谢物”指细胞或植物内合成代谢和分解代谢期间出现的中间物质，优选地是低分子量的中间物质，换句话说是由代谢产生或消耗的物质。
术语“改变的代谢活性”指相对于对照、参考或野生型的对应体积(例如在生物、组织、细胞或细胞区室中)，特定体积中代谢物的量、浓度或活性(为化学反应和/或其它质量作用目的，这里意指有效浓度)的变化(增加或减少)，包括活性和表达的从头产生，其中所述的变化例如由本文中以下所述的方法之一测量，与相应非转化的野生型植物细胞相比发生改变或改变(增加或减少)。
术语“增加”、“升高”、“延长”、“增强”、“改善”或“扩大”涉及相应特性在生物或生物的部分，如组织、种子、根、叶、花等中或在细胞中的改变并且可互换使用。当增加或增强涉及基因产物活性的增加或增强时，体积内的整体活性优选地增加或增强，无论基因产物的数量或该基因产物的特异活性或两者是否增加或增强或者编码该基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效率是否增加或增强。术语“减少”、“降低”、或“缺失”涉及相应特性在生物或生物的部分如组织、种子、根、叶、花等中或在细胞中的改变。当减少、降低或缺失涉及基因产物活性的减少时，体积内的整体活性优选地减少、降低或缺失，无论基因产物的数量或该基因产物的特异活性或两者是否减少、降低或缺失或者编码该基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效率是否减少、降低或缺失。
术语“提高”或“降低”涉及相应特性在生物中或生物的部分如组织、种子、根、叶、花等中或在细胞中的改变。当增加涉及基因产物活性的增加时，无论基因产物的数量或该基因产物的特异活性或两者是否得到增加或产生，或者编码该基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效率是否得到增加，体积内的整体活性优选地得以增加。
在“特性的改变”中，应当理解为基因产物的活性、表达水平或数量或代谢物含量在特定体积内相对于对照、参考或野生型的相应体积受到改变，包括此活性或表达的从头(de novo)产生。
术语“提高”或“降低”包括仅在本发明主题的部分中所述特性的改变，例如，修饰作用可以在细胞区室如细胞器，或在植物的部分如组织、种子、根、叶、花等内存在，但是当检测完整主题即完整细胞或植物时，修饰作用检测不到。优选地，增加或减少在细胞水平上存在，因此术语“活性的增加”或“代谢物含量的增加”涉及与野生型细胞相比细胞水平的增加。
因此，术语“提高”或“降低”意指酶的特异活性及化合物或代谢物的量，例如多肽、核酸分子的量或本发明精细化学品或编码性mRNA或DNA的量可以在一定体积内得到提高或降低。
术语“野生型”、“对照”或“参考”可以互换并且可以是这样的细胞，或生物的部分如器官或组织，或者生物，尤其微生物或植物，其未受根据本文中所述的本发明方法修饰或处理。因此用作野生型、对照或参考的细胞，或生物的部分如器官或组织，或者生物，尤其微生物或植物尽可能与细胞、生物或其部分对应，并且除了在本发明方法的结果的方面以外，在其它任何特性上与本发明的主题尽可能完全相同。因此，野生型、对照或参考受到了完全相同或尽可能完全相同地处理，也即仅不影响所测试特性的品质的条件或特性可以不同。
优选地，任何比较均在相似条件下开展。术语“相似条件”意指这样的全部条件，例如培养条件或生长条件、测定条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原株、浓度等)在待比较的实验间保持相同。
“参考”、“对照”或“野生型”优选地是这样的对象，例如细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其根据本发明未受本文中所述的本发明方法修饰或处理并且在任何其它特性上尽可能与本发明对象相似。参考、对照或野生型在其基因组、转录组、蛋白质组或代谢组方面尽可能与本发明的对象相似。优选地，术语“参考-”、“对照-”或“野生型-”细胞器、-细胞、-组织或-生物尤其植物或微生物涉及这样的细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其与本发明的细胞器、细胞、组织或生物尤其微生物或植物，或其部分优选地95％、更优选地98％、甚至更优选地99.00％、尤其99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更多在遗传上几乎相同。最优选地，“参考”、“对照”或“野生型”优选地是这样的对象，例如细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其除了原因性或赋予活性的核酸分子或由它们编码的基因产物根据本发明方法受到改变、操作、交换或导入以外，与根据本发明所用的生物、细胞或细胞器在遗传上相同。
优选地，参考、对照或野生型仅在本发明多肽的细胞活性方面例如因为本发明核酸分子的水平增加或本发明多肽特异活性的增加，例如因为或由于具有胁迫相关性蛋白(SRP)活性的蛋白质或其同系物的表达水平或活性、该蛋白质的生物化学原因或遗传原因以及改变的代谢活性。
当仅因不是本发明方法的对象而不能提供与本发明对象不同的对照、参考或野生型时，对照、参考或野生型可以是这样的生物，在其中已经恢复或撤除了调节赋予改变的代谢活性或如本文中所述本发明核酸分子表达的原因，例如通过敲除原因性基因产物的表达，例如通过反义抑制、通过失活激活剂或激动剂、通过活化抑制剂或拮抗剂、通过添加抑制性抗体进行抑制、通过添加活性化合物如激素、通过导入负显性突变体等。基因的生产可以例如通过导入引起酶活性抑制或者使结合辅因子的能力不稳定或抑制该能力等的失活性点突变敲除。
因此，优选的参考对象是本发明方法的起始对象。优选地，将该参考和本发明主题在标准化和归一化后比较例如总RNA、DNA或蛋白质的量，或者参考基因如持家基因例如遍在蛋白、肌动蛋白或核糖体蛋白的活性或表达。
存在一系列这样的机制，通过此类机制对蛋白质例如本发明多肽的修饰可以直接或间接影响氨基酸的产量、产生和/或产率。
例如，可以增加多肽分子或核酸分子的分子数或特异活性。当本发明的多肽或核酸在缺乏所述蛋白质活性的生物中从头表达时，可以产生更多精细化学品。然而，还可能例如通过修饰对基因的调节或通过增加相应mRNA的稳定性或由本发明核酸分子编码的相应基因产物的稳定性，或通过导入受不同方式调节例如反馈不敏感的来自其它生物的同源基因增加生物中天然存在基因的表达。
这还类似地适用于本发明核酸分子或其基因产物增加的表达，其与氨基酸生物合成途径中例如用于合成精细化学品的其它酶增加的表达组合。
增加、减少或调节根据本发明可以是组成型的，例如原因在于稳定持久的转基因表达或在于编码本发明核酸分子的相应内源性基因内的稳定突变或在于对赋予本发明多肽表达的基因的表达或行为的调节，或者是短暂的，例如原因在于瞬时转化或临时添加调节剂如激动剂或拮抗剂，或者是诱导型的，例如在以携带受控于诱导型启动子的本发明核酸分子的可诱导构建体转化并添加例如四环素或如下文所述的诱导物后。
多肽活性在细胞、组织、细胞器、器官或生物或其部分中的增加与对照、参考或野生型相比优选地达到至少5％、优选地至少20％或至少50％、特别优选地至少70％、80％、90％或更高，特别优选地至少200％、最优选地至少500％或更高。
由本发明核酸分子编码的多肽的特异活性或本发明多肽的特异活性可如实施例中所述测试。特别地，在细胞如植物细胞或微生物内表达所讨论的蛋白质以及检测与对照相比精细化学品水平的增加是容易的试验并且可如本领域所述开展。
术语“增加”包括将化合物或活性从头导入细胞或该化合物或活性以前检测不到，换句话说它是“生成”的。
因此，下文中，术语“增加”还包含术语“生成”或“激发”。增加的活性本身表现为精细化学品的增加。
将转化的植物细胞与相同属和种的相应的未转化野生型在除非声明否则完全相同的条件(例如培养条件、植物年龄等)下比较。在本文中，与未转化的生物相比，代谢活性改变
优选地，转化植物细胞的代谢物浓度上的改变是与相应非转化的野生型加以比较的改变。优选地，代谢物浓度的改变由HPLC测量并通过每种分析物(代谢物)的峰高或峰面积除以各自内部标准的峰面积进行计算。数据使用各样品的鲜重进行归一化。将产生的值除以对在对照条件下培育并以相同顺序受到分析的野生型植物所计算的平均值，产生所谓的比率，该比率代表独立于分析顺序的值。这些比率指示与野生型对照植物内代谢物浓度相比，转化植物的代谢物浓度的行为。
根据这种方法，与相应非转化野生型相比，转化的植物细胞的至少一种代谢物浓度的改变是至少10％、有利地是至少20％、优选是至少40％、60％或80％、特别优选是至少90％、100％或200％、极特别优选至少700％、800％、900％、1000％或更高。
数据显著性通过本领域技术人员已知的全部统计方法、优选通过t检验，更优选通过斯氏t检验加以确定。
改变的代谢活性也指与相应非转化的野生型植物细胞相比，在转化后不产生或仅在转化后才产生的代谢物。
本发明优选的代谢物是2，3-二甲基-5-植基醌醇、2-羟基-棕榈酸、或3，4-二羟基苯丙氨酸(＝多巴)、3-羟基-棕榈酸、5-氧代脯氨酸、丙氨酸、α亚麻酸(c18:3(c9，c12，c15))、α-生育酚、氨基己二酸、葡糖酐、精氨酸、天冬氨酸、β-阿朴胡萝卜素醛、β-胡萝卜素、β-谷甾醇、β-生育酚、(Δ-7-顺，10-顺)-十六碳二烯酸、十六碳三烯酸、十七烷酸、Δ-15-顺-二十四碳烯酸、阿魏酸、菜油甾醇、蜡酸(c26:0)、瓜氨酸、隐黄质、二十碳烯酸(20:1)、果糖、延胡索酸、半乳糖、γ-氨基丁酸、γ-生育酚、葡糖酸、葡萄糖、谷氨酸、谷胺酰胺、甘油酸、甘油醛、甘油、甘油-3-磷酸、甘氨酸、高丝氨酸、肌醇、异亮氨酸、异麦芽糖、异戊烯焦磷酸、亮氨酸、二十四烷酸(c24:0)、亚油酸(c18:2(c9，c12))、叶黄素(luteine)、番茄红素、苹果酸、甘露糖、甲硫氨酸、甲基呋喃半乳糖苷、甲基吡喃半乳糖苷、甲基吡喃半乳糖苷、棕榈酸(c16:0)、苯丙氨酸、磷酸、脯氨酸、腐胺、丙酮酸、棉子糖、核糖酸、丝氨酸、莽草酸、芥子酸、硬脂酸(c18:0)、琥珀酸、蔗糖、苏氨酸、三十烷酸、色氨酸、酪氨酸、泛醌(ubichinone)、udp-葡萄糖、缬氨酸或玉米黄质。
代谢活性还可以就一种或多种以上代谢物的一种或多种衍生物上受到改变。
优选地，代谢活性就选自全部以上代谢物的一种或多种代谢物上受到改变。
备选地，代谢活性就选自甘露糖、肌醇、磷酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、γ-氨基丁酸、甘油醛、蔗糖、菜油甾醇、缬氨酸、β-生育酚、泛醌、棕榈酸(c16:0)、2-羟基-棕榈酸、2，3-二甲基-5-植基醌醇、β-胡萝卜素、α-亚麻酸(c18:3(c9、c12、c15))、番茄红素的一种或多种代谢物上受到改变。
备选地，代谢活性就选自甲基呋喃半乳糖苷、β-谷甾醇、Δ-15-顺-二十四碳烯酸(c24:1 me)、十七烷酸(c17:0 me)、硬脂酸(c18:0)、甲基吡喃半乳糖苷、γ-生育酚、亚油酸(c18:2(c9、c12))、十六碳三烯酸(c16:3 me)、莽草酸、棉子糖、谷氨酸、谷胺酰胺、udp-葡萄糖、脯氨酸、苏氨酸、异戊烯焦磷酸、5-氧代脯氨酸、阿魏酸、芥子酸的一种或多种代谢物上受到改变。
备选地，代谢活性在选自色氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘油酯、精氨酸、3-羟基-棕榈酸、腐胺、3，4-二羟基苯丙氨酸(＝多巴)、α-生育酚、氨基己二酸、葡糖酐、β-阿朴胡萝卜素醛、Δ-7-顺，10-顺-十六碳二烯酸(c16:2me)、蜡酸(c26:0)、隐黄质、二十碳烯酸(20:1)、果糖、延胡索酸中的一种或多种代谢物上受到改变。
备选地，代谢活性在选自半乳糖、葡糖酸、葡萄糖、甘油、甘油-3-磷酸、甘氨酸、高丝氨酸、异麦芽糖、二十四烷酸(c24:0)、叶黄素、苹果酸、三十烷酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙酮酸、核糖酸、琥珀酸、酪氨酸、玉米黄质中的一种或多种代谢物上受到改变。
本发明提供转基因植物细胞，其中所述核酸序列在植物细胞中的表达引起与相应的未转化野生型植物细胞相比较改变的代谢活性，导致对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。一种优选的野生型植物细胞是未转化的拟南芥菜属(Arabidopsis)植物细胞。本文的例子是拟南芥菜属野生型C24(诺丁汉拟南芥菜贮藏中心(Nottingham Arabidopsis Stock Centre)，UK；NASCStock N906)。
其它优选的野生型植物细胞是来自如下所选植物的未转化的野生型植物细胞：玉米(maize)、小麦、黑麦(rye)、燕麦(oat)、黑小麦(triticale)、稻、大麦(barley)、大豆、花生、棉花、油菜籽(rapeseed)、卡诺拉油菜(canola)、木薯(manihot)、胡椒(pepper)、向日葵(sunflower)、亚麻(flax)、琉璃苣(borage)、红花、亚麻子(linseed)、报春花(primrose)、油菜籽、甘蓝型油菜(turnip rape)、万寿菊(tagete)、茄科植物(solanaceousplant)、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种(Vicia species)、豌豆(pea)、苜蓿(alfalfa)、咖啡(coffee)、可可(cacao)、茶(tea)、柳属物种(Salix species)、油棕榈(oil palm)、椰子(coconut)、多年生草本和饲料作物。
更优选的野生型植物细胞是亚麻属植物的未转化细胞，优选是亚麻(linum usitatissimum)，更优选是变种Brigitta、Golda、Gold Merchant、HeIIe、JuNeI、Olpina、Livia、Marlin、Maedgold、Sporpion、Serenade、Linus、Taunus、Lifax或Liviola的未转化细胞，向日葵属(Heliantus)植物的未转化细胞胞，优选是向日葵(Heliantus annuus)，更优选是变种Aurasol、Capella、Flavia、Flores、Jazzy、PaIuIo、Pegasol、PIR64A54、Rigasol、Sariuca、Sideral、Sunny、Alenka、Candisol或Floyd的未转化细胞，或者芸苔属(Brassica)植物的未转化细胞，优选地是欧洲油菜，更优选地是变种Dorothy、Evita、Heros、Hyola、Kimbar、Lambada、Licolly、Liconira、Licosmos、Lisonne、Mistral、Passat、Serator、Siapula、Sponsor、Star、Caviar、Hybridol、Baical、Olga、Lara、Doublol、Karola、Falcon、Spirit、Olymp、Zeus、Libero、Kyola、Licord、Lion、Lirajet、Lisbeth、Magnum、Maja、Mendel、Mica、Mohican、Olpop、Ontarion、Panthar、Prinoe、Pronio、Susanna、Talani、Titan、Transfer、Wiking、Woltan、Zeniah、Artus、Contact或Smart的未转化细胞。
所述核酸序列在植物细胞中的表达可以直接地或间接地影响转化植物细胞的代谢活性。优选地，它们影响上述代谢物的活性。
优选地，代谢活性可以通过用一种或多种编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸转化得以改变，其中所述核酸选自序列表内的核酸或前述序列的同源物。
本发明的范围包括鉴定靶植物、尤其作物植物内由选自序列表的核酸和/或其同源物中的核酸序列所编码的基因，和随后表达相应的基因以实现改变的代谢活性，导致增加的环境胁迫耐受性和/或抗性。因此，本发明不限于具体的植物。
具有赋予代谢活性改变的活性的蛋白质优选地具有本文中所述多肽的结构，尤其具有如此多肽的结构，其中所述多肽包含在序列表中公开的多肽或如本文中所述的其功能性同源物的共有序列，或该蛋白质由本文中表征的核酸分子或本发明核酸分子，例如由序列表中所示的核酸分子或其在本文中所述的功能性同源物编码，并且该蛋白质具有本文中所提到的活性。
还有可能通过对植物细胞筛选与非胁迫条件相比的改变的代谢活性而在植物细胞或植物中检测环境胁迫。这允许监测植物中的胁迫水平，甚至在症状不可见时进行监测。因此可以更及早地采取对抗措施，并且例如可以通过及时浇水使作物损失最小化。
本发明的范围还包括通过对胁迫条件下的植物细胞筛选与非胁迫条件相比的改变代谢活性而对植物细胞或植物筛选增加的环境胁迫耐受性和/或抗性。这允许选择具有增加的环境胁迫耐受性和/或抗性的植物，不必鉴定基因或视观症状。
借助本发明，还有可能通过对胁迫条件下的植物细胞筛选与非胁迫条件相比的改变代谢活性并选择具有增加的环境胁迫耐受性和/或抗性的那些植物细胞，将植物细胞或植物向增加的环境胁迫耐受性和/或抗性方向育种。对代谢物活性的筛选比例如对基因的筛选更快而更容易
对本领域技术人员而言，筛选是众所周知的并且通常指搜索特定的特点或性状。在本发明中，植物或植物细胞中的这种性状优选地是代谢物的浓度，尤其优选以上所述代谢物的浓度。用于筛选的方法和设备为本领域技术人员熟知并且包括GC(气相色谱)、LC(液相色谱)、HPLC(高效(高压)液相色谱)、MS(质谱)、NMR(核磁共振)波谱学、IR(红外)光谱学、光量法等及这些方法的组合。
育种对于本领域技术人员也是常规知识。这应当理解为将特定属性或性状定向并且稳定地引入植物或植物细胞。
多种育种步骤由充分定义的人类干预加以表征，如选择待杂交的品系，亲代品系定向授粉或选择适宜的子代植物。可以采用不同的育种方法，这取决于所需要的特性。所有技术均为本领域技术人员充分已知并包括但不限于例如杂交、近交、回交育种、多系育种、变种融合、种间杂交、非整倍体技术等。杂交技术还可以包括使植物不育化以便通过机械方法、化学方法或生物化学方法产生雄性不育植物或雌性不育植物。雄性不育植物与不同品系的花粉交叉授粉确保雄性不育植物而非雌性不育植物的基因组均一地得到两个亲代品系的特性。本发明转基因的种子和植物因此可以用于改良植物品系的育种，其可以提高常规方法如除草剂或杀虫剂处理法的效率，或其因本发明转基因的种子和植物已修饰的遗传特性允许人们省去所述方法。或者，可以得到具有改善的胁迫耐性、优选地是干旱胁迫耐性和温度胁迫耐性的新作物，其因它们优化的遗传“设施”产生质量比不能耐受相当的不利发育条件的产物更好的收获产物。
本发明提供环境胁迫可以是盐度、干旱、温度、金属、化学品、病原性和氧化胁迫或其组合，优选地是干旱和/或温度。
本发明目的是转基因的植物细胞，其中SRP(＝胁迫相关性蛋白)优选地选自酵母，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或者大肠杆菌(E.coli.)或者植物，优选欧洲油菜、大豆(Glycine max)或稻(Oryzasativa)。
本发明的目的还是转基因植物细胞，其中编码SRP的核酸与序列表中的核酸之一同源性至少为约50％。
在本发明的转基因植物细胞中，所述核酸的表达引起与相应的未转化野生型植物细胞相比较对环境胁迫增加的耐性，其优选通过改变代谢活性实现。在本文中，环境胁迫选自盐度、干旱、温度、金属、化学性、病原性和氧化胁迫或其组合，优选地是干旱和/或温度。
术语“表达”指转录和/或翻译编码性基因片段或基因。通常，得到的产物是mRNA或蛋白质。然而，表达产物还可以包括功能性RNA如反义核酸、tRNA、snRNA、rRNA、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是全身性、局部性或暂时性的，例如限于某些细胞类型、组织、器官或时间段。
除非另外说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本上下文中可以互换。除非另外说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本上下文中可以互换。术语“序列”可能涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于术语“序列”在其中使用的上下文。如本文中所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任意长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核苷酸。本类术语仅指分子的一级结构。
因此，如本文中所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链的DNA和RNA。它们还包括已知形式的修饰，例如甲基化、“加帽”、以类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸。优选地，本发明的DNA或RNA序列包含了编码本文中所定义的多肽的编码序列。
“编码序列”是当置于适宜的调节序列控制下转录为mRNA和/或翻译为多肽的核苷酸序列。编码序列的边界由5′末端的翻译起始密码子和3′末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，虽然内含子也可以在某些情况下存在。
为了本发明目的，复数通常包括单数并且反之亦然。
此外，转基因植物细胞衍生自单子叶植物。或者，转基因植物细胞衍生自双子叶植物。优选地，转基因植物细胞选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、玻璃、红花、胡麻、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)。此外，本发明的转基因植物细胞可以衍生自裸子植物。优选地，该植物选自云杉(spruce)、松(pine)和冷杉(fir)。
本发明还提供经编码SRP的核酸转化的转基因植物所产生的种子，其中与野生型植物细胞相比，植物对于对环境胁迫增加的耐性(这优选地通过改变代谢活性实现)是纯合的。转基因植物可以是单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。本发明还提供由表达SRP的转基因植物产生的种子，其中与野生型植物细胞相比，植物对于对环境胁迫增加的耐性(这优选地通过改变代谢活性实现)是纯合的。本发明涉及由转基因植物产生的种子，其中，该种子对于赋予与野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性(这优选地通过改变代谢活性实现)的转基因是遗传纯合的。
本发明还提供由任意如下所述转基因植物产生的农产品、植物部分如叶、花瓣、花药、根、块茎、茎、芽、花或种子。本发明还提供包含编码SRP的核酸的已分离的重组表达载体。
本发明还提供产生含有编码SRP的核酸的转基因植物的方法，其中与相应未转化的野生型植物细胞相比，所述核酸在植物中的表达引起对环境胁迫增加的耐受性和/或抗性，这优选地通过改变代谢活性实现，所述方法包括：a)用包含编码SRP的核酸的表达载体转化植物细胞，其中核酸选自序列表中的核酸和/或其同源物或部分；并且b)从植物细胞产生与相应非转化的野生型植物相比，具有增加的环境胁迫耐受性的转基因植物。
就本文中所描述的本发明而言，“转化”或“转基因”意指已经通过遗传操作方法产生的全部植物或其部分，其中：a)一个或多个基因，其优选地由如在序列表中公开的一种或多种核酸序列和/或同源物编码；或b)与如在序列表中公开的一种或多种核酸序列和/或同源物功能性连接的遗传调节元件，例如，启动子；或c)“a)”和“b)”不在它/它们的天然遗传环境中存在或已经通过遗传操作方法修饰，对于修饰而言有可能例如是一个或多个核苷酸残基的置换、添加、缺失、倒置或插入。
“天然遗传环境”意指在起源生物中的天然染色体位点或在基因组文库中的存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地仍然至少部分保留。此环境分布在核酸序列的至少一侧并具有至少50bp、优选地至少500bp、特别优选地至少1000bp、极特别优选地至少5000bp的序列长度。
在用于产生包含SRP的转基因植物的所述方法中，编码SRP的核酸选自如在序列表中公开的核酸和/或前述序列的同源物。此外，在所述方法中所用的编码SRP的核酸与如在序列表中公开的核酸序列之一至少约50％同源。
将植物或植物细胞视为对特定性状为“纯育的”，当它对此性状基因纯合至如此程度，以至当这种纯种植物自我授粉时，没有在子代中观察到该性状显著量地自由分离。在本发明中，性状由已导入植物细胞或植物的一种或多种DNA序列的转基因表达产生。
本发明还提供修饰植物胁迫抗性的方法，包括调节植物中SRP核酸的表达水平。本发明提供一种产生转基因植物的方法，其中该转基因植物具有通过增加SRP基因转录发挥作用的合成性、新颖或修饰的转录因子。理论上，还可能获得该基因表达的减少。
检测植物细胞或植物中环境胁迫的方法也在本发明的范围之内，其中所述方法包括对植物细胞筛选与非胁迫条件相比的改变的代谢活性。
此外，对植物细胞或植物筛选增加的环境胁迫耐受性和/或抗性的方法也在本发明中包括，其中所述方法包括对胁迫条件下的植物细胞筛选与非胁迫条件相比的改变的代谢活性。
本发明还包括将植物细胞或植物向对环境胁迫增加的耐性和/或抗性方向育种的方法，包括与非胁迫条件相比在胁迫条件下筛选植物细胞改变的代谢活性以及选择具有对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的那些植物细胞。
在这些方法中，代谢物活性优选地就以上所述的代谢物和代谢物组方面受到改变。
本发明还包含改变的代谢活性和/或如在序列表中公开的编码SRP的核酸和/或前述序列的同源物或其部分的用途，作为选择具有增加的环境胁迫耐受性的植物或植物细胞的标志物。
本发明还包含改变的代谢活性和/或如在序列表中公开的编码SRP的核酸和/或前述序列的同源物或其部分的用途，作为检测植物或植物细胞中胁迫的标志物。
本发明还提供修饰作物植物胁迫抗性的方法，包括利用编码SRP的核酸序列鉴定对增加或减少的环境胁迫耐性(DNA标志)分离的群落中的单个植物。
在修饰植物的胁迫耐受性的所述方法中，编码SRP的核酸可以选自如在序列表中公开的核酸和/或前述序列的同源物。此外其中所用的编码SRP的核酸可以与如在序列表中公开的核酸之一至少约50％同源。如在本发明中描述的表达载体也可以在所述方法中使用
在所述修饰作物植物胁迫耐性的方法的变异方法中，将植物以指导SRP表达的诱导型启动子转化。例如，该启动子具有组织特异性。在变异方法中，所用启动子受发育调节。
在又一个实施方案中，修饰胁迫抗性的方法包括一个或多个如下步骤：a)稳定引起由本发明核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽的增加表达的蛋白质，其中本发明的多肽具有改变代谢活性的本文提到的活性；b)稳定引起由本发明核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽的增加表达的mRNA，其中本发明的多肽具有改变代谢活性的本文提到的活性；c)增加引起由本发明核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽的增加表达的蛋白质的特异活性或者减少本发明多肽的抑制性调节作用；d)产生或增加内源性或人工转录因子的表达，该转录因子介导引起由本发明核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽的增加表达的蛋白质的表达，其中本发明多肽具有改变代谢活性的本文提到的活性；e)通过将一个或多个外源诱导因子添加至生物或其部分而刺激引起由本发明核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽的增加表达的蛋白质的活性，其中本发明多肽具有改变代谢活性的本文提到的活性；f)表达编码引起由本发明核酸分子所编码多肽或本发明多肽的增加表达的蛋白质的转基因性基因，其中本发明多肽具有改变代谢活性的本文提到的活性；和/或g)增加引起核酸分子的增加表达的基因拷贝数，该核酸分子编码由本发明核酸分子所编码多肽或具有改变代谢活性的本文提到的活性的本发明多肽；h)通过添加正向表达元件或除去负向表达元件而增加编码本发明多肽或其同系物的内源基因的表达，例如同源重组可以用于将正向调节元件如用于植物的35S增强子导入启动子或用于从调节区域中除去阻遏物元件。其它基因转换方法可用于破坏阻遏物元件或用于增强正向元件的活性-正向元件可以通过T-DNA或转座子诱变随机导入植物并且可以鉴定这样的株系，在其中正向元件已经整合至本发明基因附近因而本发明基因的表达得到增强；和/或i)以如此方式调节植物的生长环境，以致编码本发明蛋白质的基因或蛋白质本身的表达或活性得到增强；和j)从天然来源或诱变来源中选择具有本发明蛋白质的预期高度活性的生物并将它们育成目标生物，如精品作物。
优选地，所述的mRNA是本发明的核酸分子，和/或引起由本发明核酸分子编码的蛋白质的表达增加的蛋白质或者具有本文中所提及活性的多肽是例如通过改变代谢活性赋予对环境胁迫的耐性增加的本发明多肽。
通常，细胞或生物的区室内的mRNA、多核苷酸或核酸分子的量与所编码蛋白质的量以及因此与编码的蛋白质在所述体积内的总活性相关。该相关并非总为线性，体积内的活性依赖于分子稳定性、分子的降解或激活性或抑制性辅助因子的存在。此外，酶的产生和离析抑制作用众所周知，例如Zinser等“Enzyminhibitoren/Enzyme inhibitors”。
以上提及的蛋白质和/或由本发明核酸分子所编码多肽的活性可以以多种方式提高。例如，活性在生物或其部分如细胞中通过增加基因产物数目例如通过提高表达速率，如导入更强的启动子，或者通过提高已表达mRNA的稳定性因而提高翻译速率和/或提高基因产物的稳定性因而减少蛋白质降解进行提高。此外，酶的活性或周转可以以如此方式加以影响以致实现降低反应速率或提高或修饰(减少或增加)对得到的底物的亲和力。例如在作为酶的本发明多肽的催化中心内突变可以调节酶的周转速率，例如敲除必需氨基酸可以导致降低或完全敲除酶活性，或缺失或突变调节物结合位点可以降低负调节作用，如反馈抑制(或底物抑制，当底物水平也提高时)。本发明酶的特异活性可以得到提高以至提高周转速率或改善辅助因子的结合。改善编码性mRNA或蛋白质的稳定性可以增加基因产物的活性。活性的刺激也处于术语“提高的活性”范围内。
此外，对以上所提及核酸序列的调节作用可以受到修饰以至增加基因表达。这可以有利地借助异源调节序列或通过修饰例如突变现存的天然调节序列实现。这些有利的方法可以相互组合。
通常，基因产物在生物或其部分中，特别地在植物细胞、植物或植物组织或者其部分中或在微生物中的活性可以通过增加特异编码性mRNA或相应的蛋白质在该生物或其部分中的量提高。将“蛋白质或mRNA的量”理解为意指在生物、组织、细胞或细胞区室中多肽或mRNA分子的分子数。蛋白质的量“增加”意指与野生型、对照或参考相比该蛋白质的分子数在生物、组织、细胞或细胞区室或其部分内的定量性增加-例如通过本文如下所述的方法之一定量。
分子数的增加优选地达到至少1％，优选地超过10％，更优选地达到30％或更高，特别优选地达到50％、70％或更高，极特别优选地达到100％，最优选地达到500％或更高。然而，将从头表达也视作本发明的主题。
修饰，即增加或减少，可以由内源性或外源性因素引起。例如在生物或其部分中活性的增加可以由将基因产物或前体或者激活剂或激动剂添加至介质或营养基引起或可以通过将所述主题瞬时或稳定地导入生物引起。
在一个实施方案中，代谢活性在植物或其部分如细胞、组织、器官或细胞器等中的增加或减少通过提高本发明多肽的内源性水平实现。因此，在本发明的实施方案中，本发明涉及这样的方法，在其中增加编码多核苷酸或本发明核酸分子的基因的基因拷贝数。此外，本发明多肽的内源性水平可以例如通过修饰该多肽的转录性或翻译性调节作用进行提高。
在一个实施方案中，在植物或其部分中代谢活性可以通过定向诱变或随机诱变本发明的内源基因加以改变。例如同源重组可以用于将正向调节元件如用于植物的35S增强子导入启动子或用于从调节区域中除去阻遏物元件。此外，基因转换如Kochevenko和Willmitzer(Plant Physiol.2003May；132(1)：174-84)及其中引文所述的方法可用于破坏阻遏物元件或用于增强正向元件的活性-正向元件可以通过T-DNA或转座子诱变随机地导入植物并且可以鉴定这样的株系，在其中正向元件已经整合至本发明基因附近，本发明基因的表达因此得到增强。通过增强子元件的随机整合活化植物基因已由Hayashi等，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等，2000(Plant Physiol.122，1003-1013)及其中引用的其它文献描述。
鉴定目的基因附近的插入物(其最终携带活化元件)的反向遗传策略已经有诸多描述，例如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)；Sessions等，2002(Plant Cell 2002，14，2985-2994)；Young等，2001，(PlantPhysiol.2001，125，513-518)；Koprek等，2000(Plant J.2000，24，253-263)；Jeon等，2000(Plant J.2000，22，561-570)；Tissier等，1999(PlantCell 1999，11，1841-1852)；Speulmann等，1999(Plant Cell 1999，11，1853-1866)。简而言之，收获来自受T-DNA或转座子诱变的大植物群体中全部植物的材料并制备基因组DNA。随后将此基因组DNA按照例如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)中所述的特异性构造原理进行汇集。随后，通过检测插入的致变物(例如T-DNA或转座子)与目的基因间组合的特异性多重PCR反应筛选基因组DNA库。随后，用T-DNA或转座子边界组合的特异性引物和基因特异性引物在DNA库上开展此PCR反应。用于引物设计的一般原则可再次取自Krysan等，1999(PlantCell 1999，11，2283-2290)。再次筛选较低水平DNA库导致鉴定其中插入的致变物活化目的基因的单个植物。
增强正调节元件或破坏或弱化负调节元件可以通过常规诱变技术实现：产生化学性或放射性突变群体是普通技术并且为技术人员所知。用于植物的方法由Koorneef等1982及其中引文并且由Lightner和Caspar在“Methods in Molecular Biology”第82卷中描述。这些技术通常诱导可使用如TILLING(Colbert等2001)的方法在任何已知基因中加以鉴定的点突变。
因此当编码引起本发明多肽的增加表达的多肽的内源基因，尤其包含本发明核酸分子的基因，通过同源重组、Tilling方法或基因转换作用加以修饰时，表达水平可以提高。
可以将调节序列有效地连接至内源蛋白质的编码区并且控制该蛋白质的转录和翻译或编码性mRNA或已表达的蛋白质的稳定性或降解。为了修饰和控制表达，启动子、UTR、剪接位点、加工信号、聚腺苷酸化位点、终止子、增强子、阻遏物、转录后或翻译后修饰位点可以进行改变、添加或修正，例如通过增强子元件的随机插入激活植物基因已经由Hayashi等，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等，2000(Plant Physiol.122，1003-1013)及其中其它引文所述。内源蛋白质的表达水平可以通过用更强的转基因启动子替换内源启动子或通过用提供更好稳定性而不修正编码区的3′UTR替换内源3′UTR加以调节。此外，转录性调节作用可以如实施例中所述通过导入人工转录因子进行调节。备选的启动子、终止子、和UTR如下描述。
活化具有如上所提及的活性例如改变代谢活性后引起对环境胁迫增加的耐性的内源多肽还可以通过导入结合至编码本发明蛋白质的编码区的基因附近并激活该基因转录的合成性转录因子实现。可以构建包含特异性DNA结合结构域和活化域如单纯疱疹病毒VP16结构域的嵌合锌指蛋白。特异性DNA结合结构域可以结合至蛋白质编码区的调节区域。嵌合转录因子在植物中的表达引起本发明蛋白质的特异性表达，参见例如WO01/52620、Oriz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，Vol.99，13290或Guan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，Vol.99，13296。
在本发明又一个方法的实施方案中，使用这样的植物，在其中将以上提及的基因之一或以上提及的核酸之一以如此方式突变以至与未突变的蛋白质相比所编码的基因产物的活性更少受到细胞性因子影响，或根本不受影响。例如，众所周知的酶活性调节机制是底物抑制或反馈调节机制。用于在相应序列中导入一个或多个碱基、核苷酸或氨基酸的替换、缺失或添加的方法和技术在本文以下相应段落和这里所列的参考文献例如在Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Habour，NY，1989中描述。本领域技术人员能够通过如下方式鉴定调节物的调节结构域和结合位点，即通过包含用于鉴定结合位点和调节结构域的算法的计算机软件方法将本发明的核酸分子或其表达产物的序列与现有技术比较，或通过将系统突变导入核酸分子中或至蛋白质内并分析会导致每体积、尤其每细胞内特异活性增加或活性增加的那些突变。
因此在植物内表达从进化亲缘关系远的生物中所衍生的本发明的核酸分子或本发明的多肽有利，例如在真核宿主内使用原核基因，因为在这些情况下宿主细胞的调节机制可能不会弱化基因或其表达产物的(细胞或特异)活性。
将突变以如此方式导入以至于氨基酸的产生未受到不利影响。
将对基因及其基因产物的调节影响较小理解为意指减少对引起基因或其产物增加的特异性或细胞性活性的酶活性的调节。将酶活性的增加理解为意指这样的酶活性，其与起始生物相比增加至少10％、有利地至少20、30或40％，尤其有利地至少50、60或70％。
本发明提供可以开展以上增加胁迫抗性的方法。还有可能获得胁迫抗性的降低。
本发明不限于具体核酸、具体多肽、具体细胞类型、具体宿主细胞、具体条件或具体方法等，但可以变化并且众多的修饰和变化对本领域技术人员而言显而易见。还应当理解本文中所用的术语仅仅用于描述具体实施方案的目的并且不意图进行限制。
本发明还涉及分离的胁迫相关性蛋白(SRP)，其如在序列表中公开，或其同源物。优选地，本发明的分离的胁迫相关性蛋白(SRP)选自酵母或大肠杆菌(E.coli)。另外，本发明涉及分离的编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸，其中所述核酸选自序列表的核酸和/或其同源物。这里，分离的编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸优选地编码选自酵母或大肠杆菌的SRP。
本发明提供选自如在序列表中公开的酵母的核酸的胁迫相关性基因序列，其中所述的核酸优选来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或大肠杆菌。
前述序列的同源物可以有利地分离自酵母、真菌、病毒、藻类、细菌，如醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)(醋杆菌亚属(subgen.Acetobacter))；嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)；不动杆菌(Acinetobacter sp.)；放线杆菌(Actinobacillus sp)；杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；气生超嗜热菌(Aquifex aeolicus)；化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogene)；翠菊黄化植原体(Aster yellows phytoplasma)；芽孢杆菌(Bacillus sp.)；双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)；布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)；扩展短杆菌(Brevibacterium linens)；马耳他布氏菌(Brucella melitensis)；巴克纳氏菌(Buchnera sp.)；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；衣原体(Chlamydia sp.)；嗜性衣原体(Chlamydophila sp.)；泥生绿菌(Chlorobium limicola)；腐蚀柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)；梭菌(Clostridium sp.)；睾丸酮丛生单胞菌(Comamonas testosteroni)；棒状菌(Corynebacterium sp.)；伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)；耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)；节瘤腐蹄杆菌(Dichelobacter nodosus)；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)；肠杆菌(Enterobacter sp.)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；黄杆菌(Flavobacterium sp.)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)；弗兰克氏菌(Frankia sp.CpH)；具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)；嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)；嗜血菌(Haemophilus sp.)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；乳杆菌(Lactobacillus sp.)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；李斯特氏菌(Listeria sp.)；溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)；百脉根中间根瘤菌(Mesorhizobium loti)；深海噬甲基菌(Methylophagathalassica)；铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)；微颤菌PRE1(Microscilla sp.PRE1)；莫拉氏菌TA144(Moraxella sp.TA144)；分枝杆菌(Mycobacterium sp.)；支原体(Mycoplasma sp.)；奈瑟氏球菌(Neisseria sp.)；亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)；念珠藻PCC7120(Nostoc sp.PCC 7120)；Novosphingobium aromaticivorans；酒酒球菌(Oenococcus oeni)；柠檬泛菌(Pantoea citrea)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；戊糖片球菌((Pediococcus pentosaceus)；坑形席藻(Phormidium foveolarum)；植原体(Phytoplasma sp.)；鲍氏织线藻(Plectonema boryanum)；栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)；丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)；普通变形菌(Proteusvulgaris)；假单胞菌(Pseudomonas sp.)；罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)；根瘤菌(Rhizobium sp.)；马红球菌(Rhodococcus equi)；海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；立克次氏体(Rickettsia sp.)；鸭瘟立默氏菌(Riemerella anatipestifer)；黄化瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)；沙门氏菌(Salmonella sp.)；反刍月形单胞菌(Selenomonasruminantium)；嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)；志贺氏菌(Shigellasp.)；苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)；葡萄球菌(Staphylococcussp.)；链球菌(Streptococcus sp.)；链霉菌(Streptomyces sp.)；聚球藻(Synechococcus sp.)；集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)；热海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；密螺旋体(Treponema sp.)；解脲脲支原体(Ureaplasma urealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；耶尔森氏菌(Yersinia sp.)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选地是沙门氏菌或大肠埃希氏菌或植物，优选地分离自酵母，如来自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或植物，如拟南芥菜、玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、红花、胡麻、报春花属、欧洲油菜、卡诺拉油菜和甘蓝型油菜、木薯属、胡椒属、向日葵属、万寿菊属、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、灌木植物如咖啡、可可、茶、柳属物种，树如油棕榈、椰子、多年生草本、如黑麦草和羊茅(fescue)、和饲料作物如苜蓿和三叶草(clover)以及例如来自云杉、松或冷杉。更优选地，前述序列的同系物可以分离自酿酒酵母、大肠杆菌或植物，优选地是欧洲油菜、大豆、或稻。
本发明的胁迫相关性蛋白优选地通过重组DNA技术产生。例如，将编码蛋白质的核酸分子克隆至表达载体例如双元载体，将此表达载体导入宿主细胞，例如拟南芥菜野生型NASC N906或如参见如下所述实施例中所述的任何其它植物细胞，并且在所述宿主细胞中表达胁迫相关性蛋白。双元载体的实例是pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreen或pPZP(Hajukiewicz，P等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994和Hellens等，Trends in Plant Science(2000)5，446-451.)。
有利地，将本发明的核酸序列或具有至少一种报道基因的基因构建体克隆至表达盒，其中通过载体导入生物或直接进入基因组。报道基因应当允许通过生长、荧光、化学性、生物发光或抗性分析或通过光量方法容易地进行检测。可以提到的报道基因实例是抗生素抗性或杀虫剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代谢基因或生物合成基因如Ura3基因、Ilv2基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脱氧葡萄糖-6磷酸磷酸酶基因、β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因、β-内酰胺酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因或BASTA(＝草甘膦抗性)基因。这些基因允许容易地测量和定量基因的转录活性并且因此测量和定量基因的表达。以这种方式，可以鉴定显示不同产量的基因组位置。
在优选的实施方案中，核酸构建体，例如表达盒，在上游即在编码序列5′端包含启动子并且在下游即在3′端包含聚腺苷酸化信号和任选地其它调节元件，其中其它调节元件有效连接至与序列表中公开的核酸在一起的间隔性编码序列。通过有效的连接意指以如此方式顺序排列启动子、编码序列、终止子和任选地其它调节元件以至每种调节元件可以以应有方式满足它在表达编码序列中的功能。优选用于有效连接的序列是用于确保在质体中亚细胞定位的靶向序列。然而还可以应用确保在线粒体、在内质网(ER)、在细胞核、在油小体或其它区室中亚细胞定位的靶向序列以及翻译启动子，如烟草花叶病毒中的5’前导序列(GaINe等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。
核酸构建体，例如表达盒可以例如包含组成型启动子或组织特异性启动子(优选地USP或油菜籽蛋白启动子)、待表达的基因和ER滞留信号。对于ER滞留信号，优选使用KDEL(SEQ ID NO：531)氨基酸序列(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)或KKX氨基酸序列(赖氨酸-赖氨酸-X-终止子、其中X意指任何其它的已知氨基酸)。
对于在原核或真核宿主生物例如微生物如真菌或植物中的表达，有利地将表达盒例如通过质粒、噬菌体或允许基因在宿主生物中最佳表达的其它DNA插入载体。合适质粒的实例是例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI、链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361、芽孢杆菌属(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214、棒状杆菌属中的pSA77或pAJ667。在真菌中的pALS1、plL2或pBB116；其它有利的真菌载体由Romanos，M.A.等，[(1992)“Foreign gene expressionin yeast：a review”，Yeast 8：423-488]和由van den Hondel，C.A.M.J.J.等[(1991)“Heterologous gene expression in filamentous fungi”以及在MoreGene Manipulations in Fungi[J.W.Bennet & L.L.Lasure编辑，第396-428页：Academic Press：San Diego]以及在“Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi”[van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，PJ.(1991)在Peberdy，J.F.等编辑的Applied Molecular Genetics of Fungi第1-28页、Cambridge University Press：Cambridge]所述。有利的酵母启动子实例是2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子的实例是pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKH或pDH51(参见Schmidt、R.和Willmitzer、L.，1988)。如以上已鉴定的载体或如以上已鉴定载体的衍生物是可能载体的小部分选择。其它质粒对本领域技术人员而言是众所周知的并且可以在例如书籍Cloning Vectors(编者Pouwels P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985 ISBN 0 444904018)。合适的植物载体尤其在“Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology”(CRC Press)第6/7章第71-119页内描述。有利的载体已知为在大肠杆菌和农杆菌内复制的穿梭载体或双元载体。
载体意指除了质粒，本领域技术人员所知的其它所有载体，例如通过例如噬菌体、病毒如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线形或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或以染色体方式复制，优选以染色体方式复制。
在载体的又一个实施方案中，本发明的表达盒还可以有利地以线性DNA方式导入生物并通过异源或同源重组整合至宿主生物基因组。这种线性DNA可以由线性化质粒组成或仅由作为本发明的载体或核酸序列的表达盒组成。
在又一个有利的实施方案中，本发明的核酸序列还可以自行导入生物。
除了本发明的核酸序列以外，当还有其它基因待导入生物时，所有这些基因与单个载体中的一个报道基因一起或每个独立基因在每种情况下随同每个载体中的报道基因可以导入生物，因而不同载体载体可以同时或依次连续地导入。
载体有利地含有至少一个拷贝的本发明核酸序列和/或本发明的表达盒(＝基因构建体)。
本发明还提供包含如上所述SRP核酸的分离的重组表达载体，其中载体在宿主细胞中的表达引起与宿主细胞的野生型品种相比较对环境胁迫增加的耐性，如本文中所用，术语“载体”指能够转运与之连接的另一种核酸分子的核酸分子。一个类型的载体实例是“质粒”，即环状双链DNA环，其中可连入额外的DNA节段。另一类型的载体是病毒载体，其在本文中有可能将额外的DNA节段连接至病毒基因组内。某些载体能够在导入这些载体的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合至宿主细胞基因组，并且因此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因表达。在本文中此类载体称为“表达载体”。通常，用于DNA重组技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意图包含表达载体的其它形式，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其发挥等效功能。
本发明的重组表达载体包含处于适合核酸在宿主细胞内表达的形式中的本发明核酸，这意味重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞进行选择并有效连接至待表达核酸序列的一个或多个调节序列。如本文中所用就重组表达载体而言，“有效地连接”意指目的核苷酸序列以如此方式连接至调节序列以至允许表达所述核苷酸序列(例如在体外(in vitro)转录/翻译系统内或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞内)。术语“调节序列”将包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)，此类调节序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)以及Gruber和Crosby在Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，编者Glick和Thompson，第7章，89-108，CRC Press：Boca Raton，Florida，包括其中参考文献里描述。调节序列包括指导核苷酸序列在众多类型宿主细胞中组成型表达的那些调节序列和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在特定条件下表达的那些调节序列。本领域技术人员将理解表达载体的设计取决于这样的因素，如选择待转化细胞、所需多肽的表达水平等。本发明的表达载体可以导入宿主细胞并因而产生由本文中所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或融合肽(例如，SRP、SRP的突变形式、融合多肽等)。
本发明的重组表达载体可以设计用于在原核细胞和/或真核细胞中表达SRP。例如，SRP基因可以在细菌细胞如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或其它真菌细胞(Romanos，M.A.等，1992，Foreign gene expression in yeast：a review，Yeast 8：423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.等，1991，Heterologous gene expression infilamentous fungi在：More Gene Manipulations in Fungi，编者J.W.Bennet和L.L.Lasure，第396-428页：Academic Press：San Diego和vanden Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.，1991，Gene transfer systems andvector development for filamentous fungi在：Applied Molecular Geneticsof Fungi，编者Peberdy，J.F.等，第1-28，Cambridge University Press：Cambridge)、藻类(Falciatore等，1999，Marine Biotechnology1(3)：239-251)、类型为全毛亚纲(Holotrichia)、缘毛亚纲(Peritrichia)、旋毛亚纲(Spirotrichia)、吸管亚纲(Suctoria)、四膜虫(Tetrahymena)、草履虫属(Paramecium)、豆形虫属(Colpidium)、瞬目虫属(Glaucoma)、匙口虫属(Platyophrya)、Potomacus、伪康纤虫属(Pseudocohnilembus)、游仆虫属(Euplotes)、Engelmaniella、尾棘虫属(Stylonychia)的纤毛虫，其中尤其根据PCT申请号WO 98/01572中所述的转化方法以载体在浮萍棘尾虫(Stylonychia lemnae)中，以及多细胞植物的细胞(参见Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988，High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants，PlantCell Rep.583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，第6/7章，S.71-119(1993)；F.F.White，B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，编者Kung和R.Wu，128-43，Academic Press：1993；Potrykus，1991，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42：205-225及其中引用的参考文献)或哺乳动物细胞内表达。合适的宿主细胞还在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中讨论。备选地，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7-启动子调节序列和T7聚合酶。
多肽在原核生物中的表达最经常使用包含指导融合多肽或非融合多肽表达的组成型启动子或诱导型启动子的载体实施。融合载体将众多氨基酸添加至载体中所编码的多肽上，通常添加至重组多肽氨基末端，也至其羧基末端，或融合至多肽的合适区域。此类融合载体通常起三种作用：1)增加重组多肽的表达；2)增加重组多肽的可溶性并且3)在亲和纯化中充当配体辅助纯化重组多肽。通常在融合表达载体中，将蛋白酶剪切位点导入至融合部分与重组多肽的接合处以便能够将重组多肽与融合部分隔开，随后纯化融合多肽。此类酶及其天然识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
例如，植物表达盒可以安置在pRT转化载体内((a)Toepfer等，1993，Methods Enzymol，217：66-78；(b)Toepfer等1987，Nucl.Acids.Res.15：5890 ff.)。
备选地，重组载体(＝表达载体)还可以在体外转录和翻译，例如使用T7-启动子和T7RNA聚合酶。
用于原核生物中的表达载体经常利用具有或不具有融合蛋白或融合寡肽的诱导型系统，其中这些融合物可以以氨基末端和羧基末端方式连接或连接在蛋白质的其它有用结构域内。此类融合载体通常具有这些目的：i.)提高RNA表达速率；ii.)提高可得到蛋白质的合成速率；iii.)增加蛋白质的可溶性；iv.)通过用于亲和层析的结合序列简化纯化。允许切割融合蛋白的部分并纯化的蛋白酶剪切位点也经常通过融合蛋白导入。此类用于蛋白酶的识别序列由例如因子Xa、凝血酶和肠激酶识别。
典型的有利融合及表达载体是pGEX[Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)基因67：31-40]、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其包含谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白或蛋白A。
在一个实施方案中，将SRP的编码序列克隆至pGEX表达载体以产生编码融合多肽的载体，该融合多肽从氨基末端至羧基末端包含GST-凝血酶切割位点-X多肽。融合多肽可以使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析纯化。与GST不融合的重组PKSRP可以通过用凝血酶切割融合多肽加以回收。
大肠杆菌表达载体的其它实例是pTrc[Amann等，(1988)基因69：301-315]和pET载体[Studier等，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；Stratagene，Amsterdam，The Netherlands]。
来自pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚合酶自杂合trp-lac融合启动子的转录。来自pET11d载体的靶基因表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导自T7 gn10-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)自携带受到lacUV5启动子转录性控制的T7 gn1基因的定居λ原噬菌体提供。
使重组多肽表达最大化的一个策略是在具有受损的重组多肽蛋白酶解切割能力的宿主中表达多肽(Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一个策略是改变待插入表达载体的核酸序列以至于每一氨基酸的单个密码子都是在选择用于表达的细菌如谷氨酸棒杆菌内得到偏好性利用的那些密码子(Wada等，1992，Nucleic acids Res.20：2111-2118)。对本发明核酸序列进行如此改变可以通过标准DNA合成技术开展。
用于酵母的其它有利载体是pYepSeC1(Baldari，等，(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54：113-123)和pYES衍生物(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。用于丝状真菌中的载体在：van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“Gene transfer system and vectordevelopment for filamentous fungi”在：Applied Molecular Genetics ofFungi，J.F.Peberdy等编辑，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge中描述。
备选地，昆虫细胞表达载体还可以有利地用于例如在Sf 9细胞中的表达。这些载体是例如pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)的载体。
此外，植物细胞或藻类细胞可以有利地用于基因表达。植物表达载体的实例可以在Becker，D.，等(1992)“New plant binary vectors withselectable markers located proximal to the left border”，Plant Mol.Biol.20：1195-1197或在Bevan，M.W.(1984)“Binary Agrobacterium vectors forplant transformation”，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721中找到。
此外，核酸序列还可以在哺乳动物细胞、有利地在非人的哺乳动物细胞中表达。相应表达载体的实例是参见Seed，B.(1987)Nature 329：840或Kaufman等(1987)EMBO J.6：187-195中的pCDM8和pMT2PC。与此同时，优选使用的启动子为病毒来源启动子，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒或猴病毒40的启动子。其它的原核和真核表达系统参考Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989的第16及第17章。
在本发明的优选实施方案中，将SRP在植物和植物细胞如单细胞植物的细胞(例如藻类)(参见Falciatore等，1999，Marine Biotechnology1(3)：239-251及其中参考文献)和来自高等植物的植物细胞(例如种子植物，如作物植物)中表达。SRP可以通过任何方法导入植物细胞，包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染法等。本领域技术人员已知的一个转化方法是将正开花的植物浸入农杆菌溶液，其中农杆菌含有SRP核酸，随后繁殖已转化的配子。
其它适用于转化或转染包括植物细胞在内的宿主细胞的方法可以在Sambrook，等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989和其它实验手册如Methods in MolecularBiology，1995，Gartland和Davey编辑的第44卷，AgrobacteriumProtocols，，Humana Press，Totowa，New Jersey中找到。由于生物性胁迫和非生物性胁迫耐性是希望遗传至多种植物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、欧洲油菜和卡诺拉油菜、木薯属、胡椒属、向日葵属和万寿菊属、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属物种、树(油棕榈、椰子)、多年生草本和饲料作物的常见形状，因此这些作物植物也是优选的靶植物用于作为本发明又一个其它实施方案的遗传设计。饲料作物包括但不限于小麦草(wheatrass)、虉草(Canarygrass)、雀麦草(Bromegrass)、披碱草(Wildrye Grass)、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百脉根(Birdsfoot Trefoil)、杂三叶(Alsike clover)、红三叶(red clover)和草木樨(Sweet clover)。
在本发明的一个实施方案中，SRP转染至植物通过农杆菌介导的基因转移实现。农杆菌介导的植物转化可以使用例如根瘤农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)进行。转化可以通过标准转化和再生技术(Deblaere等，1994，Nucl.Acids Res.13：4777-4788；Gelvin，Stanton B.和Schilperoort，Robert A，Plant Molecular BiologyManual，第二版-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-在Sect，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick，BernardR.；Thompson，John E.，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993 360 S.，ISBN 0-8493-5164-2)开展。例如，油菜可以通过子叶转化法或下胚轴转化法(Moloney等，1989，Plant cell Report 8：238-242；De Block等，1989，Plant Physiol.91：694-701)转化。用于农杆菌和植物选择的抗生素取决于所用于转化的双元载体和农杆菌。油菜的选择通常使用作为植物可选择标志的卡那霉素进行。农杆菌介导至亚麻属植物的基因转移可以使用例如由Mlynarova等，1994，PlantCell Report 13：282-285所述的技术进行。此外，大豆的转化可以使用如欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中所述技术实施。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或通过碳化硅纤维法技术(见例如Freeling和Walbot“The maize handbook”Springer Verlag：NewYork(1993)ISBN 3-540-97826-7)完成。玉米转化的具体实例存在于美国专利号5,990,387中，并且小麦转化的具体实例存在于PCT申请号WO93/07256内。
根据本发明，导入的SRP可以在它导入非染色体的自主复制体内或整合至植物染色体内时稳定维持在植物细胞内。或者，导入的SRP可以存在于染色体外的非复制性载体中并且得以瞬时表达或具有瞬时活性。
在一个实施方案中，可以产生同源重组的微生物，其中SRP整合至染色体，制备了含有这样的SRP基因的至少部分的载体，在所述SRP基因中已导入缺失、添加或替换以改变，例如功能性地破坏SPR基因。SRP基因优选地是酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆或稻的SRP基因，但是它可以是来自相关植物或甚至来自哺乳动物或昆虫的同源物。在一个实施方案中，如此设计载体以至当发生同源重组时，内源SRP基因受到功能性破坏(即不再编码功能性多肽；也称作敲除载体)。或者，载体可以如此设计以至当发生同源重组时，内源SRP基因受到突变或改变，但仍编码功能性多肽(如上游调节区可被改变从而改变内源SRP的表达)。为了通过同源重组产生点突变，DNA-RNA杂交体可以在称做嵌合修复的技术中使用(Cole-Strauss等，1999，Nucleic acids Research 27(5)：1323-1330和Kmiec，1999 Gene therapy American Scientist.87(3)：240-247)。在小立碗藓(Physcomitrella patens)中的同源重组方法也在本领域众所周知并且预期用于本文。
当存在于同源重组载体内时，SRP基因的改变的部分在其5′和3′端侧分布SRP基因的额外核酸分子以允许在微生物或植物中载体所携带的外源SPR基因与内源SRP基因间的同源重组发生。这种侧翼分布的额外SRP核酸分子的长度足够用于与内源基因成功发生同源重组。一般地，在载体内包含(在5′端和3′端)数百个碱基对至数千碱基对的侧翼DNA。参见例如Thomas，K.R.，和Capecchi，M.R.，1987，Cell 51：503对同源重组载体的描述或Strepp等，1998，PNAS，95(8)：4368-4373对在小立碗藓中基于cDNA的重组的描述)。将载体导入微生物或植物细胞(例如通过聚乙二醇介导的DNA)并且使用本领域已知技术选择其中所导入PKSRP基因已经与内源PKSRP基因同源重组的细胞。
在另一个实施方案中，可以产生重组微生物，其含有允许导入的基因发生受调节表达的选择的系统。例如，在将SRP基因置于lac操纵子控制下的载体内包含SRP基因允许仅存在IPTG时SRP基因才表达。此类调节系统在本领域内众所周知。
无论SRP多核苷酸是否存在于染色体外的非复制性载体或整合至染色体的载体内，SRP多核苷酸优选地位于植物表达盒内。植物表达盒优选地包含能够在植物细胞中驱动基因表达的有效连接以至每一序列可充分实现其功能的调节序列，如通过聚腺苷酸化信号终止转录。优选的聚腺苷酸化信号不但是源自根瘤农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)中称作章鱼碱合酶的基因3或其功能等同物的那些聚腺苷酸化信号，而且在植物中呈功能活性的所有其它终止子也是适合的。由于植物基因表达往往不在转录水平上受限，因此植物表达盒优选地包含有效连接的其它序列，如翻译增强子，如含有来自烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列的增强每RNA对多肽比率的超驱动序列(GaINe等，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括那些在Becker，D.等，1992，New plant binary vectors with selectable markers locatedproximal to the left border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197和Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacterium vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；以及Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在：Transgenic Plants，第一卷，Engineering and Utilization，编者Kung和R.Wu，Academic Press，1993，S.15-38中详述的植物表达载体。
“转化”在本文中定义为将异源DNA导入植物细胞、植物组织或植物的过程。这可以使用本领域众所周知的多种方法在天然或人工条件下发生。转化可以取决于任何用来将核酸序列插入原核宿主细胞或真核宿主细胞的已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞选择并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质体转染和粒子轰击。如此“转化”的细胞包括稳定转化的细胞，在其中插入的DNA作为自主复制型质粒或者作为宿主染色体的部分能够复制。这些细胞还包括在有限时间里瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。将转化的植物细胞、植物组织或植物理解为不仅包括转化过程的终产物，还包括转基因的子代本身。
术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”指在其中已导入异源核酸分子的宿主生物，如细菌或植物。核酸分子可以稳定整合至宿主的基因组或者该核酸分子还可以作为染色体外分子存在。此种染色体外分子可以自我复制。将转化的植物细胞、植物组织或植物理解为不仅包括转化过程的终产物，还包括转基因的子代本身。“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指不含异源核酸分子的野生型生物，例如野生型细菌或植物。
“转基因植物”，如本文中所用，指含有插入其核基因组或细胞器基因组的外来核苷酸序列的植物。它还包含后续世代，即T1-、T2-以及连续的世代或BC1、BC2和连续的世代以及其与非转基因植物或其它转基因植物的杂种。
宿主生物(＝转基因的生物)有利地包含至少一个拷贝的本发明核酸和/或本发明的核酸构建体。
原则上所有植物均可以用作宿主生物。优选的转基因植物例如选自槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacadiaceae)、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)并优选来源于选自槭树科、漆树科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科植物。优选作物植物，如有利地选自如下属的植物：花生、欧洲油菜、卡诺拉油菜、向日葵属、红花、橄榄(olive)、芝麻(sesame)、榛子(hazelnut)、扁桃(almond)、鳄梨(avocado)、月桂(bay)、南瓜(pumpkin/squash)、胡麻、大豆(soya)、阿月混子(pistachio)、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高粱(sorghum)和粟(millet)、黑小麦、稻、大麦、木薯(cassava)、马铃薯、甜菜、茄子、苜蓿和多年生草本和饲用植物、油棕榈、蔬菜(芸苔属植物、根用蔬菜、块茎类蔬菜、荚果蔬菜、果类蔬菜、葱蒜类蔬菜、叶用蔬菜和茎用蔬菜)、荞麦(buckwheat)、菊芋(Jerusalem artichoke)、蚕豆(broad bean)、野豌豆(vetches)、小扁豆(lentil)、四季豆(dwarfbean)、lupin、三叶草和Lucerne，此处仅提到它们中的某些。
在一个优选的实施方案中，宿主植物选自槭树科、漆树科、伞形科、菊科、十字花科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、Carifolaceae、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科并优选来源于选自槭树科、漆树科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科植物。优选作物植物并且特别是本文中以上提到的植物作为宿主植物，如以上提到的科和属，例如优选的物种是腰果(Anacardium occidentale)、金盏花(Calendula officinalis)、红花(Carthamus tinctorius)、菊芋(Cichorium intybus)、洋蓟(Cynarascolymus)、向日葵(Helianthus annus)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)、细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)；胡萝卜(Daucuscarota)；欧洲榛(Corylus avellana)、土耳其榛(Corylus colurna)、琉璃苣(Borago officinalis)；欧洲油菜、芜青(Brassica rapa ssp.)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、芥菜原变种(Brassicajuncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra、Brassicasinapioides、Melanosinapis communis)、甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥菜、凤梨(Anana comosus)、Ananas ananas、Bromelia comosa、番木瓜(Carica papaya)、大麻(Cannabis sative)、甘薯(lpomoea batatus)、提琴叶牵牛花(lpomoea pandurata)、Convolvulus batatas、Convolvulustiliaceus、甘薯(lpomoea fastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯(lpomoeatriloba)、Convolvulus panduratus、甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Betavulgaris var.altissima)、甜菜(原变种)(Beta vulgaris var.vulgaris)、沿海甜菜(Beta maritima)、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva、Beta vulgaris var.esculenta、笋瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、油橄榄(Olea europaea)、木薯(Manihot utilissima)、Janipha Manihot、Jatropha manihot、Manihotaipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihot esculenta)、蓖麻(Ricinus communis)、豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、早生矮豌豆(Pisum humile)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicagovaria)、大豆、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida、Soja max、椰子(Cocos nucifera)、茶簏子天竺葵(Pelargonium grossularioides)、Oleum cocoas、月桂(Laurusnobilis)、鳄梨(Persea americana)、花生(Arachis hypogaea)、亚麻(linum usitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linumcatharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linumnarbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perennevar.lewisii)、linum pratense、linum trigynum、石榴(Punica granatum)、陆地棉Gossypium hirsutum、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)、香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa paradisiaca)、芭蕉(Musa spp.)、油棕(Elaeis guineensis)、东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、Papaver dubium、胡麻(Sesamum indicum)、树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Piper cubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜菝(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata、大麦(Hordeumvulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeum aegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon.、Hordeum hexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦(原变种)(Avena fatuavar.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)、双色高粱(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcussorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorgnum lanceolatum、多脉高粱草(Sorghumnervosum)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcushalepensis)、黍(Sorghum miliaceum)(谷子(millet))、稷(Panicummilitaceum)、玉米、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare)、咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)、大果咖啡(Coffea liberica)、辣椒(Capsicumannuum)、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米椒(Capsicumfrutescens)、辣椒(Capsicum annuum)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄(Solanum melongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum.)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)、番茄(Solanum lycopersicum)、可可树(Theobroma cacao)或大叶茶(Camellia sinensis)。
漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如物种阿月混子(Pistacia vera)[pistachios、Pistazie]、芒果(Mangifer indica)[Mango]或腰果(Anacardium occidentale)[Cashew]；菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如物种金盏花[Marigold]、红花[safflower]、矢车菊(Centaurea cyanus)[cornflower]、菊苣(Cichorium intybus)[blue daisy]、洋蓟[Artichoke]、向日葵[sunflower]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、Lactuca esculenta、Lactuca scariola L.ssp.sativa、Lactuca scariola L.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、Lactuca sativa subsp.romana、Locusta communis、莴苣缬草(Valerianaiocusta)[lettuce]、香叶万寿菊、万寿菊或细叶万寿菊[Marigold]；伞形科如胡萝卜属(Daucus)例如物种胡萝卜[carrot]；桦木科(Betulaceae)如榛属(Corylus)例如物种欧洲榛或土耳其榛[hazelnut]；紫草科(Boraginaceae)如琉璃苣属(Borage)例如物种琉璃苣[borage]；十字花科如芸苔属、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、拟南芥菜属例如物种欧洲油菜、芜青[卡诺拉油菜、欧洲油菜、甘蓝型油菜]、野欧白芥、芥菜、芥菜(原变种)、皱叶芥菜、大叶芥菜、黑芥、黑芥(Brassica sinapioides)、黑芥(Melanosinapis communis)[mustard]、甘蓝[fodder beet]或拟南芥菜；凤梨科如the genera凤梨属(Anana)、Bromelia例如物种凤梨、Ananasananas或Bromelia comosa[菠萝]；番木瓜科如番木瓜属例如物种番木瓜[papaya]；大麻科(Cannabaceae)如大麻属例如物种大麻[hemp]、旋花科(Convolvulaceae)如番薯属、旋花属例如物种甘薯、提琴叶牵牛花、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoea fastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯或Convolvulus panduratus[sweet potato、Manof the Earth、wild potato]、藜科(Chenopodiaceae)如甜菜属即物种甜菜、甜萝卜、甜菜(原变种)、沿海甜菜、Beta vulgaris var.perennis、Betavulgaris var.conditiva或Beta vulgaris var.esculenta[sugar beet]；葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如物种笋瓜、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦或南瓜[pumpkin、squash]；胡颓子科(Elaeagnaceae)如胡颓子属例如物种油橄榄[olive]；杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如物种宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、窄叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmia microphylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmiaoccidentalis、Cistus chamaerhodendros或Kalmia lucida[American laurel、阔叶月桂、calico bush、spoon wood、sheep laurel、alpine laurel、bog laurel、western bog-laurel、swamp-laurel]；大戟科如木薯属、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)例如物种木薯、Janipha manihot、Jatrophamanihot、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihotmelanobasis、Manihot esculenta[Manihot、arrowroot、tapioca、cassava]或蓖麻[castor bean、Castor Oil Bush、Castor Oil plant、Palma Christi、Wonder Tree]；豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja例如物种豌豆、饲料豌豆、早生矮豌豆[pea]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、大叶合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albiziaberteriana、Albizzia berteriana、Cathormion berteriana、Feuilleaberteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acaciajulibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosajulibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[bastard logwood、silk tree、East Indian Walnut]、紫花苜蓿、野苜蓿、杂交苜蓿[苜蓿]、大豆、Dolichos soja、宽叶蔓豆、Glycinehispida、Phaseolus max、Soja hispida或Soja max[大豆]；牻牛儿苗科如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum例如物种椰子、茶簏子天竺葵或Oleum cocois[椰子]；禾本科如甘蔗属例如物种甘蔗(Saccharum officinarum)；核桃科(Juglandaceae)如核桃属、Wallia例如物种核桃(Juglans regia)、Juglans ailanthifolia、山核桃Juglanssieboldiana、灰核桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglansintermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、Juglansmicrocarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[walnut、black walnut、common walnut、Persian walnut、white walnut、butternut、black walnut]；樟科如鳄梨属、月桂属例如物种月桂[bay、laurel、bay laurel、sweet bay]、鳄梨、鳄梨(Persea gratissima)或鳄梨(Persea persea)[avocado]；豆科如落花生属(Arachis)例如物种花生[peanut]；亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)、Adenolinum例如物种亚麻(linum usitatissimum)、linumhumile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linumangustifolium)、泻亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linumperenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perenne var.lewisii)、linum pratense、linum trigynum[亚麻属、胡麻]；Lythrarieae如石榴属(Punica)例如物种石榴[pomegranate]；锦葵科如棉花属(Gossypium)例如物种陆地棉、树棉、海岛棉、草棉或瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)[棉花]；芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如物种香蕉、小果野蕉、大蕉、芭蕉[banana]；柳叶菜科(Onagraceae)如Camissonia、月见草属(Oenothera)例如物种月见草(Oenothera biennis)或Camissonia brevipes[primose、evening primosel；棕榈科如油棕属(Elacis)例如物种油棕榈(Elaeisguineensis)[oil plam]；罂粟科如罂粟属(Papaver)例如物种东方罂粟、虞美人、长果罂粟(Papaver dubium)[poppy、oriental poppy、corn poppy、field poppy、shirley poppies、field poppy、long-headed poppy、long-podpoppy]；胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻属例如物种胡麻[sesame]；胡椒科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia例如物种树胡椒、Piper amalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎叶、毕澄茄、荜菝、胡椒、假荜菝、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[Cayennepepper、wild pepperl；禾本科如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属、小麦属(Triticum)例如物种大麦、芒颖大麦草、鼠大麦、黑麦状大麦草、栽培二棱大麦、三叉大麦、栽培六棱大麦、栽培六棱大麦(Hordeumhexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草[barley、pearl barley、foxtail barley、wall barley、meadow barley]、黑麦(Secale cereale)[rye]、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、野燕麦(原变种)、杂种野燕麦、双色高粱、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghumarundinaceum、卡佛尔高粱、垂穗高粱草、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草、Sorghum guineense、Sorghumlanceolatum、多脉高粱草、甜高粱、Sorghum subglabrescens、Sorghumverticilliflorum、高粱、石茅高粱(Holcus halepensis)、黍(Sorghummiliaceum millet)、稷(Panicum militaceum)[Sorghum、millet]、稻、玉米[corn、maize]、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticum hybernum、马卡小麦、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)[wheat、bread wheat、common wheat]、山龙眼科(Proteaceae)如澳洲坚果黍(Macadamia)例如物种澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[macadamia]；茜草科如咖啡属例如物种咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[coffee]；玄参科如毛蕊花属(Verbascum)例如物种毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、南欧毛蕊花(Verbascumchaixii)、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascumlongifolium、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、Verbascum phlomoides、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascumthapsus)[mullein、white moth mullein、nettle-leaved mullein、密花毛蕊花(dense-flowered mullein)、silver mullein、长叶毛蕊花、white mullein、dark mullein、希腊毛蕊花(greek mullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫花毛蕊花(purple mullein)、hoary mullein、great mullein]；茄科如辣椒属、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如物种辣椒、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米椒[辣椒]、辣椒[红辣椒(paprika)]、烟草、花烟草(Nicotiana alata)、Nicotiana attenuate、光烟草(Nicotiana glauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草]、马铃薯[potato]、茄[egg-plant]、番茄、番茄、梨形番茄、红茄或番茄[番茄]；梧桐科(Ste rculiaceae)如可可属例如物种可可树[可可]；山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如物种茶(Camellia sinensis)[茶]。
将根据本发明的核酸、表达盒或载体导入生物例如植物，原则上可以通过本领域技术人员已知的所有方法完成。核酸序列的导入产生重组生物或转基因生物。
当是微生物时，本领域技术人员可以在教材Sambrook，J.等(1989)Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press、F.M.Ausubel等(1994)Current Protocols in molecularbiology，John Wiley and Sons、D.M.Glover等，DNA Cloning第一卷，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963476-9)、Kaiser等(1994)Methods inYeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press或Guthrie等Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，1994，Academic Press中找到适宜的方法。
将外来基因转移至植物的基因组内称作转化。在转化时，将描述用于转化植物和从植物组织或植物细胞再生植物的方法用于瞬时转化或稳定转化。合适的方法是通过聚乙二醇诱导的DNA摄取的原生质体转化、使用基因抢的“生物射弹”方法-其称作粒子轰击法、电穿孔、在DNA溶液中温育干燥胚法、微注射法和通过农杆菌介导的基因转移。所述方法例如在B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer在：Transgenic Plants，第一卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)128-143和在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。将待表达的核酸或构建体优选地克隆至适用于转化根瘤农杆菌的载体内，如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由此载体转化的农杆菌随后可以以已知方式用于转化植物，尤其作物植物例如烟草植物，例如通过将擦伤的叶子或切开的叶子浸泡在具有农杆菌的溶液内，随后将它们培养在合适的培养基上。通过根瘤农杆菌转化植物例如由Hófgen和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或尤其自F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，在Transgenic Plants，第一卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
通过本发明表达载体转化的农杆菌类似地可以用于以已知方式转化植物如试验植物比如拟南芥菜属植物，或者作物植物，如谷物作物、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、卡诺拉油菜、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、红辣椒、欧洲油菜、木薯(tapioca)、木薯(cassava)、木薯(arrowroot)、万寿菊、苜蓿、莴苣(lettuce)和多种树、坚果植物和藤本植物物种，特别是含油的作物植物如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉花、亚麻、欧洲油菜、椰子、油棕榈、红花或可可(cocoa bean)，例如通过将擦伤的叶子或切开的叶子浸泡在具有农杆菌的溶液内，随后将它们培养在合适的培养基上。
经遗传修饰的植物细胞可以通过本领域技术人员所知的所有方法进行再生。适宜的方法可以在参考以上S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Hófgen和Willmitzer的出版物中找到。
因此，本发明的另一个方面涉及由至少一种根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的转基因生物以及细胞、细胞培养物、组织、部分如在植物生物的情况下，例如叶、根等或衍生自此类生物的繁殖材料。术语“宿主生物”、“宿主细胞”、“重组的(宿主)生物”和“转基因(宿主)细胞”本文中可互换使用。当然这些术语不仅涉及特定宿主生物或特定靶细胞，还涉及这些生物或细胞的后代或有活力的后代。因为突变或环境影响，某些修饰可以出现在后续世代中，这些后代不必与亲代细胞完全相同但是仍由本文中所用的术语包含。
为了本发明目的，“转基因的”或“重组的”就例如对核酸序列、表达盒(＝基因构建体、核酸构建体)或含有本发明核酸序列的载体或由本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物而言意指所有通过遗传工程方法产生的这类构建体，在其中：a)如在序列表中公开的核酸序列或它的衍生物或其部分；或者b)功能性连接至(a)中所述核酸序列的遗传控制序列，例如3′和/或5′的遗传控制序列如启动子或终止子，或者c)(a)和(b)均不存在于它们的天然遗传环境里或均已经通过基因工程方法加以修饰，其中修饰可以例如是替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸。天然遗传环境意指起源生物中或在宿主生物内的天然基因组位点或染色体位点或存在于基因组文库内。当是基因组文库时，核酸序列的天然遗传环境优选地得以部分保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并具有至少50bp、优选地至少500bp、特别优选地至少1,000bp、最特别优选地至少5,000bp的序列长度。天然存在的表达盒-例如本发明核酸序列的天然启动子与相应Δ-8-去饱和酶基因、Δ-9-延伸酶基因和/或Δ-5-去饱和酶基因天然存在的组合-变成了转基因的表达盒，当后面这些基因通过非天然、合成(人工)方法例如诱变加以修饰时。适宜的方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。
适用于本发明核酸、表达盒或载体的生物或宿主生物原则上有利地是适合表达如上所述重组基因的全部生物。另一些可以提到的实例是植物如拟南芥菜属、菊科如金盏花属或作物植物如大豆、花生、蓖麻、向日葵、亚麻、玉米、棉花、亚麻、欧洲油菜、椰子、油棕榈、红花或可可豆。
本发明的又一目的涉及核酸构建体例如表达盒用于转化植物细胞、组织或植物部分的用途，其中核酸构建体包含编码在序列表中公开的多肽的DNA序列或与其杂交的DNA序列。
在转化时，根据选择的启动子，在序列表中公开的序列可以特异性地在植物的叶、种子、节、根、茎或其它部分内表达。这些过量产生在序列表中公开的序列的转基因植物、其繁殖材料、以及植物细胞、组织或其部分也是本发明的目的。此外，本发明含有在序列表中公开的序列的表达盒或核酸序列或构建体也可以用于转化例如以上实例所确定的生物，如细菌、酵母、丝状真菌和植物。
在本发明的上下文中，改变的代谢活性意指与未经遗传修饰的初始植物相比至少在至少一个植物世代期间例如以人工方式获得的生物合成性能增加的性状，其原因在于序列表中公开的序列在本发明生物，有利地在本发明转基因植物中过量表达。
此外，在序列表中公开的外源序列的组成型表达是有利。然而，另一方面，诱导型表达也可能是想要的。
例如在体外通过茎端分生组织繁殖，可以确定表达在序列表中公开的序列的效率。此外，可以在温室试验里的试验植物中测试在序列表中公开序列在性质和水平上被修饰的表达及其对代谢途径性能的影响。本发明的又一目的包含由表达盒转化的转基因生物如转基因植物，其中表达盒包含序列表中公开的序列或与其杂交的DNA序列，以及此类植物的转基因的细胞、组织、部分和繁殖材料。在此情况下特别优选转基因作物植物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、稻、棉花、甜菜、欧洲油菜和卡诺拉油菜、向日葵、亚麻、大麻、thistle、马铃薯、烟草、番茄、木薯、木薯、木薯、苜蓿、莴苣和多种树、坚果和藤本植物物种。
为了本发明目的，植物是单子叶植物和双子叶植物、藓类或藻类。
根据本发明的又一个体现是如上所述的转基因植物，其含有本发明的核酸序列或构建体或者本发明的表达盒。
此外，衍生物意指序列表中公开的序列的同源物，例如真核同源物、截短的序列、编码或非编码DNA序列的单链DNA或编码或非编码DNA序列的RNA。
此外，序列表中公开的序列的同源物意指衍生物，例如启动子变体。这些变体可以通过交换一个或多个核苷酸，通过插入和/或缺失加以修饰，然而却没有不利地影响启动子的功能性或效率。此外，启动子可以通过改变它们的序列使其效率提高或完全由更有效的甚至源自外来生物的启动子。
衍生物还有利地意指这样的变体，其核苷酸序列已经在起始密码子上游从-1至-2000的区域内以如此方式受到改变以至基因表达和/或蛋白质表达受到修饰，优选地得以提高。此外，衍生物还意指在3′端受到修饰的变体。
表达盒中的合适启动子原则上是可以控制外来基因在生物如微生物如原虫如纤毛虫、藻类如绿藻、褐藻、红枣或蓝藻如Euglenia、细菌如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、酵母如酿酒酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属或者真菌如孢霉(Mortierella)、破囊壶菌(Thraustochytrium)或裂殖壶菌(Schizochytrium)或者植物，有利地在植物或真菌中表达。特别优选地利用植物启动子或衍生自植物病毒的启动子。对本发明方法有利的调节序列例如在革兰氏阴性细菌内有利地加以使用的启动子，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或在λ-PL启动子中找到。其它有利的调节序列例如在革兰氏阳性细菌的启动子amy和SPO2、在酵母或真菌的启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或在植物的启动子CaMV/35S[Franck等，Cell21(1980)285-294]、SSU、OCS、Iib4、STLS1、B33、nos(＝胭脂氨酸合成酶启动子)或在遍在蛋白或菜豆蛋白启动子中找到。表达盒还可以含有化学诱导型启动子，转化到生物中的序列表中公开的序列的表达可以通过该启动子有利地在植物中在特定时间上进行控制。此类型的有利植物启动子是例如PRP1启动子[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)，361-366]、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 388 186)、四环素诱导型启动子[Gatz等，(1992)Plant J.2,397-404]、水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、脱落酸诱导型启动子(EP 335 528)和乙醇或环己酮诱导型启动子(WO93/21334)。可以有利地加以使用的其它植物启动子实例是来自马铃薯的胞浆FBP酶启动子、来自马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)、来自大豆的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子(还参见Genebank登录号U87999)或如中所述的节特异性启动子。特别有利地是这样植物启动子，其在其中脂肪酸生物合成发生或存在其前体阶段的组织或植物部分/器官内确保表达，例如在胚乳或在正在发育的胚胎内。尤其值得注意的是确保种子特异性表达的有利启动子，例如USP启动子或其衍生物、LEB4启动子、菜豆蛋白启动子或油菜籽蛋白启动子。本发明特别有利的USP启动子或其衍生物介导种子发育期间极早期基因表达[Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67]。其它有利的可用于单子叶或双子叶植物的种子特异性启动子是适用于双子叶植物的启动子，如可能作为实例引用的来自欧洲油菜(US5,608,152)的油菜籽蛋白基因启动子、来自拟南芥菜属(WO98/45461)的油质蛋白启动子、菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、来自芸苔属的Bce4启动子(WO91/13980)或豆科植物的B4启动子(LeB4，Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：233-239)或者适用于单子叶植物的启动子如大麦的Ipt2或Ipt1基因的启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或在WO99/16890中所述的大麦的醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的米谷蛋白基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因或黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子。
此外，特别优选确保例如在脂肪酸、油和脂的生物合成和其前体阶段存在的组织或植物部分内表达的那些启动子。尤其值得注意的是确保种子特异性表达的启动子。值得注意的启动子是来自欧洲油菜的油菜籽蛋白基因的启动子(US5,608,152)、来自蚕豆的USP启动子来自(USP＝未知的种子蛋白质，Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、来自拟南芥菜属植物的油质蛋白基因的启动子(WO98/45461)、菜豆蛋白启动子(US5,504,200或豆球蛋白B4基因的启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，PlantJournal，2(2)：233-9)。将提到的其它启动子是介导单子叶植物中种子特异性表达的来自大麦的Ipt2或Ipt1基因的启动子(WO95/15389和WO95/23230)。其它有利的种子特异性启动子是公开于WO 99/16890的来自稻、玉米或小麦的启动子或者Amy32b、Amy6-6或aleurain(US5,677,474)、Bce4(油菜，US5,530,149)、大豆球蛋白(大豆，EP571741)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆，JP 06/62870)、ADR12-2(大豆，WO 98/08962)、异柠檬酸酶(油菜，US5,689,040)或β-淀粉酶(大麦，EP 781849)。
如上所述，表达构建体(＝基因构建体、核酸构建体)还可以含有待导入生物的其它基因。这些基因可以受到独立地调节或接受如序列表中公开的序列相同的调节区域调节。这些基因例如是允许增加合成的其它生物合成基因，有利地用于脂肪酸生物合成、维生素生物合成等。
原则上，可以使用具有自身调节序列的所有天然启动子，如那些以上提及用于本发明表达盒和本发明方法的那些天然启动子。此外，还可以有利地使用合成性启动子。
在制备表达盒时，可以操作多种DNA片段以便获得按正确方向有效阅读并以配置正确阅读区域(reading raster)的核苷酸序列。为了使DNA片段(＝本发明的核酸)相互连接，可以将衔接头或连接体附加至片段。
可以有效提供在转录方向上带着含有用于插入该序列的一个或多个限制性位点的连接体或多连接体的启动子和终止子区。通常连接体具有1至10个、大多数是1至8个、优选地2至6个限制性位点。通常，连接体在调节区域内的大小小于100bp、往往小于60bp、但至少是5bp。启动子既可以对宿主生物例如对宿主植物是天然或同源的，也是可以是外来或异源的。在5′-3′转录方向上，表达盒含有启动子、编码本文公开的核酸的DNA序列以及用于转录终止的区域。不同终止区域可以以任意所需要的方式彼此交换。
此外，可以采用提供合适的限制性界面或除去多余的DNA或限制性界面的操作。当考虑插入、缺失或替换如转换和颠换，可以采用体外诱变、引物修复、限制性酶切或连接。在用于平末端的合适操作中如限制性酶切，削短或填充突出端，片段的互补末端可以提供用于连接。
为了有利的高表达，特异性ER滞留信号SEKDEL(SEQ ID NO：532)的附加可能尤其重要(Schouten，A.等，Plant Mol.Biol.30(1996)，781-792)。以这种方式，平均表达水平可以增至三倍或甚至四倍。在定位于ER的植物蛋白质和动物蛋白质中天然存在的其它滞留信号也可以用于构建表达盒。在另一个优选实施方案中，将质体靶向序列如Napier J.A.所述加以利用[Targeting of foreign proteins to the chloroplast，Methods Mol.Biol.，49，1995：369-376]。优选使用的包含所述质体靶向序列的载体由ColinLazarus公开[Guerineau F.，Woolston S.，Brooks L.，Mullineaux P.“Anexpression cassette for targeting foreign proteins into chloroplast”；Nucleic.Acids Res.，Dec 9，16(23)，1988：11380]。
优选的聚腺苷酸化信号是植物的聚腺苷酸化信号，优选地是基本上对应于来自根瘤农杆菌T-DNA的聚腺苷酸化信号，特别来自pTiACH5中T-DNA的基因3(章鱼碱合酶)聚腺苷酸化信号(Gielen等，EMBOJ.3(1984)，835 et seq.)和相应的功能等同物。
表达盒通过如T.Maniatis、E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)以及TJ.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-lnterscience(1987)中所述的常规重组和克隆技术，将合适的启动子与序列表中公开的合适序列融合而产生。
在制备表达盒时，可以操作多种DNA片段以便获得按正确方向有效阅读并以配置正确阅读区域(reading raster)的核苷酸序列。可以将衔接头或连接体附加至DNA片段以连接它们。
可以有效提供在转录方向上带着含有用于插入该序列的一个或多个限制性位点的连接体或多连接体的启动子和终止子区。通常连接体具有1至10个、大多数是1至8个、优选地2至6个限制性位点。通常，连接体在调节区域内的大小小于100bp、往往小于60bp、但至少是5bp。启动子既可以对宿主生物例如对宿主植物是天然或同源的，也是可以是外来或异源的。在5′-3′转录方向上，表达盒含有启动子、编码序列表中公开的序列的DNA序列以及用于转录终止的区域。不同终止区域可以以任意所需要的方式彼此交换。
在制备表达盒时，可以操作多种DNA片段以便获得按正确方向有效阅读并以配置正确阅读区域(reading raster)的核苷酸序列。可以将衔接头或连接体附加至DNA片段以连接它们。
编码本发明方法中所用核酸序列如序列表中公开的序列的DNA序列含有为实现相应的生物合成正确定位所需的全部序列特征。因此，进一步的靶向序列本身不再需要。然而。这种定位可以受到欢迎并且有利，并且因此受到人工方式修饰和增强，以至这类融合构建体也是本发明优选的有利实施方案。
特别优选确保靶向至质体的序列。在某些情况下，也可能欢迎靶向至其它区室(在Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423中报道)，例如至液泡、线粒体、内质网(ER)、过氧化物酶体、脂类结构的相应有效序列、或由于缺乏滞留在原有区室、细胞浆。
如本文中所用，术语“环境胁迫”指任何次优生长条件并且包括但不限于与盐度、干旱、温度、金属、化学性、病原性和氧化胁迫或其组合相关的次优条件。在优选的实施方案中，环境胁迫可以是盐度、干旱、热和低温，或其组合，并且特别可以是低水含量和低温。其中干旱胁迫意指引起植物中水缺乏和供给植物的水减少的环境胁迫，其中低温胁迫意指低于+4℃的植物冷冻以及低于15℃的植物冷藏并且其中高温胁迫意指例如高于35℃的温度。胁迫和胁迫反应的类型取决于本发明所用的不同植物，即它在例如一种植物如小麦和另一种植物如拟南芥菜之间不同。植物对环境胁迫的常见反应是产量损失和品质损失。还应当理解如本说明书和权利要求书中所用，“一个”可以意指一个或多个，这取决于它所用于的上下文。因此涉及“一个细胞”可以意指可以使用至少一种细胞。
还如本文中所用，术语“核酸”和“核酸分子”意指包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物所生成的DNA或RNA的类似物。该术语还包括位于基因编码区3′和5′末端的非翻译序列：距离基因编码区5′末端上游至少约1000个核苷酸的序列和距离基因编码区3′末端下游至少约200个核苷酸的序列。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选地是双链DNA。
“分离的”核酸分子是与在该核酸的天然来源中存在的其它核酸分子基本分开的一种核酸分子。这意指基于目的核酸的重量，其它核酸分子以低于5％重量、优选地低于2％重量、更优选地低于1％重量、最优选地低于0.5％重量的量存在。优选地，“分离的”核酸不含在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布于该核酸两侧的某些序列(即位于该核酸5′和3′末端的序列)。例如，在多种实施方案，分离的编码胁迫相关性蛋白的核酸分子可以含有少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布在该核酸两侧的核苷酸序列。此外，“分离的”核酸分子，如cDNA分子可以不含与该核酸分子天然结合在一起的某些其它细胞材料，或当核酸分子通过重组技术产生时不含培养基，或当核酸分子化学性合成时不含其它化学品。
本发明的核酸分子，例如编码在植物中赋予环境胁迫耐性和/或抗性的SRP或其部分的核酸分子，可以使用标准分子生物学技术和本文中所提供的序列信息分离。例如，编码拟南芥菜胁迫相关性蛋白的cDNA可以自拟南芥菜cDNA文库，使用序列表内公开序列之一的全部或部分来分离。此外，包含序列表中公开的完整序列之一的核酸分子或其部分可以使用基于该序列所设计的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应分离。例如，mRNA可以自植物细胞(例如通过Chirgwin等，1979 Biochemistry 18：5294-5299的异硫氰酸胍提取法)分离并且cDNA可以使用逆转录酶(例如自Gibco/BRL，Bethesda，MD可得到的Moloney MLV逆转录酶或自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL可得到的AMV逆转录酶)制备。用于聚合酶链反应扩增的合成性寡核苷酸引物可以基于序列表中公开的核苷酸序列之一设计。本发明的核酸分子可以使用cDNA或者备选地基因组DNA作为模板以及适宜的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术扩增。如此扩增的核酸分子可以克隆至适宜的载体并通过DNA测序分析进行表征。此外，与编码SRP编码的核苷酸序列对应的寡核苷酸可以通过标准合成技术制备，例如使用自动化DNA合成仪。
在优选的实施方案中，本发明分离的核酸分子包含编码SRP的序列表中公开的序列的核苷酸序列之一(即“编码区”)，以及5′非翻译序列和3′非翻译序列。
此外，本发明核酸分子可以仅包含序列表中公开的序列之一的部分编码区，例如，可用作探针或引物的片段或编码SRP的生物活性部分的片段。
由本发明编码SRP的核酸分子所编码的蛋白质的部分优选是本文中所述的生物活性部分。如本文中所用，术语SRP的“生物活性部分”意在包括在植物中参与胁迫耐性和/或抗性反应的胁迫相关性蛋白的部分，例如结构域/基序。为确定SRP或其生物活性部分是否在植物中引起增加的胁迫抗性，可以对该SRP的植物开展胁迫分析。此类分析方法对本领域技术人员而言众所周知，如实施例中详述。更具体地，编码SRP生物活性部分的核酸片段可以这样制备，即通过分离序列表中公开的序列之一部分，该部分表达SRP或肽的编码部分(例如通过体外重组表达)，并且评估SRP或肽的编码部分的活性。
SRP的生物活性部分包含在本发明中并包括这样的肽，其包含衍生自编码SRP的基因的氨基酸序列或与SRP同源的蛋白质的氨基酸序列，其中所述蛋白质包含少于全长SRP或与SRP同源并表现SRP至少某些酶活性的全长蛋白质的氨基酸。一般地，生物活性部分(例如，长度例如为5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多个氨基酸的肽)包含具有SRP的至少一种活性的结构域或基序。此外，可以通过重组技术制备其中缺失该蛋白质的其它区域的其它生物活性部分并评估本文中所述的一种或多种活性。优选地，SRP的生物活性部分包括所选择的一个或多个域/基序或者其具有生物学活性的部分。
术语“生物活性部分”或“生物学活性”意指仍具有天然酶或起始酶至少10％或20％、优选地20％、30％、40％或50％、特别优选地60％、70％或80％酶活性的SRP或SRP的部分。
包含本方法中所用的核酸分子完整序列例如本发明的多核苷酸或其部分的核酸分子还可以使用基于该序列或基于其部分的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应分离。例如，包含完整序列或其部分的核酸分子可以使用基于该序列所产生的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应分离-例如mRNA可以(例如通过Chirgwin等(1979)Biochemistry 18：5294-5299的异硫氰酸胍提取方法)自细胞分离并且cDNA可以借助逆转录酶生成(例如例如自Gibco/BRL，Bethesda，MD可得到的Moloney MLV逆转录酶或自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL可得到的AMV逆转录酶)。
此外，通过聚合酶链反应用于扩增的合成性寡核苷酸引物，例如，如表2中所示，可以基于序列表中公开的序列或衍生自序列表中公开的序列。
此外，有可能通过以本发明方法中所用的多肽，特别以保守区域并且随后简并引物可以从中衍生的本发明多肽的序列开展蛋白质序列比对而鉴定来自多种生物的保守区域。
简并引物随后可以用于通过PCR扩增具有如上提及的活性，例如具有SPR活性的新蛋白质的片段，或来自其它生物的本发明多肽的其它功能性同源物。
这些片段随后可以作为杂交探针用于分离完整的基因序列。作为备选，丢失的5′和3′序列可以通过RACE-PCR(快速扩增cDNA末端)分离。本发明的核酸分子可以使用cDNA或备选地基因组DNA作为模板以及合适的寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术扩增。扩增的核酸分子随后可以克隆至合适的载体并通过DNA序列分析表征。与本方法中所用核酸分子之一相对应的寡核苷酸可以通过标准合成方法生成，例如使用自动DNA合成仪。
对本发明方法有利的核酸分子可以基于它们与本文中所公开的核酸分子的同源性，使用其序列或部分作为杂交探针并按照标准杂交技术在严格杂交条件下进行分离。在本上下文中，有可能使用例如长度至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸、优选地至少15、20或25个核苷酸的分离的核酸分子，其在严格条件下与如上所述的核酸分子，特别与包含本发明的核酸序列、用于本发明中或本发明方法中的核酸分子或编码本发明中所用蛋白质的核酸分子的核苷酸序列或本发明核酸分子的核苷酸序列杂交。也可以使用具有30、50、100、250或更多个核苷酸的核酸分子。
除了本文中所述的SRP的片段外，本发明还包括植物中天然存在的SRP和编码SRP的核酸的同源物和类似物。
将“同源物”在本文中定义为分别具有相似、或“同源”核苷酸序列或氨基酸序列的两种核酸或蛋白质。同源物包括如下文所定义的SRP的等位变体、直向同源物、旁向同源物、激动剂和拮抗剂。术语“同源物”还包含这样的核酸分子，其因密码子简并性与具序列表中公开的序列的核苷酸序列之一不同并且因而编码如具有序列表中公开的序列的氨基酸序列所编码的相同SRP。如本文中所用“天然存在的”SRP指在自然界存在的SRP氨基酸序列。
术语“同源性”意指各个核酸分子或其所编码的蛋白质在功能和/或结构上等效。与以上所述的核酸分子同源并且是所述核酸分子的衍生物的核酸分子例如是所述核酸分子的变异，其代表具有相同生物学功能的修饰，尤其代表对编码具有相同或基本相同生物学功能的蛋白质的修饰。它们可以是天然存在的变异，例如来自其它植物变种或物种的序列，或是突变。这些突变可以天然存在或可以通过诱变技术得到。等位变异可以是天然存在的等位变体和以合成方式产生的变体或基因工程变体。结构等效物可以例如通过测试所述的多肽对抗体的结合或基于计算机预测加以确定。结构等效物具有相似的免疫学特征，例如包含相似的表位。
通过替换、插入或缺失自根据本发明如序列表中公开的多肽之一衍生的功能等同物具有与本发明如序列表中公开的的多肽之一至少30％、35％、40％、45％或50％，优选地至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选地至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，极特别优选地至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且通过如序列表中公开的多肽的基本相同的特性加以区分。
通过替换、插入或缺失自根据本发明如序列表中公开的核酸序列衍生的功能等同物与本发明如序列表中公开的多肽之一至少30％、35％、40％、45％或50％，优选地至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选地至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，极特别优选地至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且编码具有与序列表中公开的多肽基本相同的特性的多肽。
无论如何将功能等同物“基本相同的特性”理解为意指该功能等同物具有如上提及的活性，例如引起精细化学品量的增加同时在生物例如微生物、植物或者植物组织或动物组织、植物细胞或动物细胞或者其部分中增加所述功能等同物的蛋白质的量、活性或功能。
杂交意指此类核酸分子在常规杂交条件，优选地在例如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))或在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中所述的严格条件下杂交。
根据本发明，本发明核酸的DNA分子和RNA分子可以作为探针使用。此外，作为用于鉴定功能性同源物的模板，可以开展RNA印迹分析以及DNA印迹分析。RNA印迹分析有利地提供关于表达的基因产物的其它信息：例如表达模式、加工步骤如剪接和加帽等的发生。DNA印迹分析提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织方式的额外信息。
严格杂交条件优选的非限制性实例是在6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)在大约45℃的杂交，随后在50至65℃例如在50℃、55℃或60℃在0.2×SSC、0.1％ SDS中的一个或多个洗涤步骤。技术人员知道随核酸类型的不同以及例如存在有机溶剂时，涉及温度和缓冲液浓度的这些杂交条件发生变化。在“标准杂交条件”下温度例如作为核酸类型的函数在42℃和58℃间、优选地在45℃和50℃间在浓度为0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4×或5×SSC(pH7.2)的含水缓冲液中不同。当以上提及的缓冲液中存在有机溶剂时，例如50％甲酰胺，“标准杂交条件”下的温度大约是40℃、42℃或45℃。用于DNA:DNA杂交体的杂交条件优选地例如是0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选地在30℃和45℃间。用于DNA:RNA杂交体的杂交条件优选地是0.1×SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，优选地在45℃和55℃之间。以上提及的杂交温度测定用于例如不存在甲酰胺时对长度大约100bp(碱基对)并具有50％G+C含量的核酸。技术人员借助教材，例如以上所提及的教材，或来自如下教材：Sambrook，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Hames和Higgins(编辑)1985，“Nucleic Acids杂交ation：A PracticalApproach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(编辑)1991，“Essential Molecular Biology：A Practical Approach”，IRL Pressat Oxford University Press，Oxford或“Current Protocols in MolecularBiology”，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)知道确定所需要的杂交条件。
如此的又一个严格杂交条件的实例是在65℃ 4×SSC杂交，随后在65℃在0.1×SSC中洗涤1小时。备选地，示例的严格杂交条件是42℃在50％甲酰胺、4×SSC中。此外，洗涤步骤期间的条件可以选自通过低严格条件(大约2×SSC在50℃)和高严格条件(大约0.2×SSC在50℃、优选地在65℃)所界定的条件范围(20×SSC：0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH7.0)。此外，洗涤步骤期间的温度可以从在室温，大约22℃的低严格条件提高至在大约65℃的较高严格条件。两个参数-盐浓度和温度可以同时变化，或两个参数之一保持恒定而另一参数变化。在杂交期间也可以应用变性剂例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在下，杂交优选地在42℃实施。相关因素i)处理时间的长度、ii)盐条件、iii)去污剂条件、iv)竞争性DNA、v)温度和vi)探针的选择可以逐个进行组合，因此在本文中没有提及所有的可能性。
因此在优选的实施方案中，将RNA印迹条与Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)在68℃预杂交2小时。杂交以放射性标记探针在68℃过夜实施。随后的洗涤步骤在68℃以1×SSC开展。
对于DNA印迹分析，膜与Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)在68℃预杂交2小时。杂交以放射性标记探针在68℃过夜实施。随后丢弃杂交缓冲液并且将滤膜用2×SSC、0.1％SDS短暂洗涤。在丢弃洗涤缓冲液后，添加新鲜2×SSC、0.1％SDS缓冲液并且在68℃温育15分钟。开展该洗涤步骤两次，随后使用1×SSC、0.1％SDS在68℃开展额外的洗涤步骤10分钟。
一些用于DNA杂交(DNA印迹分析)和洗涤步骤的条件的其它实例如下文显示：
杂交条件可以例如选自下列条件：a)4X SSC在65℃；b)6X SSC在45℃；c)6X SSC，100mg/ml变性片段化的鱼精DNA在68℃；d)6XSSC，0.5％SDS，100mg/ml变性鲑精DNA在68℃；e)6X SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性片段化的鲑精DNA，50％甲酰胺在42℃；f)50％甲酰胺，4X SSC在42℃；g)50％(vol/vol)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠在42℃；h)2X或4X SSC在50℃(低严格性条件；或i)30-40％甲酰胺，2X或4X SSC在42℃(低严格性条件)。
洗涤步骤可以例如选自下列条件：a)0.015 M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS在50℃；b)0.1X SSC在65℃；c)0.1X SSC，0.5％SDS在68℃；d)0.1X SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺在42℃；e)0.2X SSC，0.1％SDS在42℃；f)2X SSC在65℃(低严格性条件)。
在又一个实施方案中，根据所讨论的核酸，标准条件意指例如温度42℃-58℃间，在浓度0.1-5x SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2)或额外存在50％甲酰胺的缓冲水溶液中，如例如42℃在5 x SSC，50％甲酰胺中。用于DNA：DNA杂交体的杂交条件有利地是0.1×SSC并且温度约20℃-45℃，优选约30℃-45℃。用于DNA：RNA杂交体的杂交条件有利地是0.1×SSC并且温度约30℃-55℃，优选约45℃-55℃。这些用于杂交的所述温度是计算例如用于长度约100核苷酸及G+C含量50％的核酸在甲酰胺不存在下的解链温度。用于DNA杂交的实验条件在相关遗传学教材例如Sambrook等，“Molecular Cloning，”ColdSpring Harbor Laboratory，1989中描述并且可以例如作为核酸长度、杂交体性质或G+C含量的函数由本领域技术人员已知的公式计算。本领域技术人员可以参考下列教材获得关于杂交的进一步信息：Ausubel等(编辑)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York；Hames和Higgins(eds)，1985，Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(ed)，1991，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
具有如上所提及活性(即赋予改变的代谢活性)的衍生自其它生物的多肽可用由其它DNA序列编码，其中所述的其它DNA序列与在序列表中公开的序列在松弛的杂交条件下杂交并且在表达时编码赋予改变的代谢活性的肽。
此外，一些应用必须在低严格性杂交条件下进行，而对杂交的特异性无任何影响。例如，对总DNA的DNA印迹分析可以用本发明的核酸分子在低严格性条件(55℃在2×SSPE、0.1％SDS内)进行探测。此杂交分析可能仅揭示如此基因的简单模式，其中所述的基因编码本发明的多肽或在本发明方法中使用的多肽，例如该多肽具有本文中提及的增加精细化学品的活性。此类低严格性杂交条件的又一实例是4×SSC在50℃下或在42℃存在30-40％甲酰胺下的杂交。此类分子包含如此分子，它们是本发明的或在本发明方法中使用的多肽的片段、类似物或衍生物，并且所述分子因如此方式而与以上所述的氨基酸序列或编码它们的核苷酸序列不同，其中所述的方式是单独或组合的氨基酸和/或核苷酸缺失、插入、替代、添加和/或重组或者本领域已知的任何其它修饰。然而，优选使用高严格性杂交条件。
杂交应当有利地用至少5、10、15、20、25、30、35或40bp、有利至少50、60、70或80bp、优选至少90、100或110bp的片段实施。最优选是长度至少15、20、25或30bp的片段。也优选用至少100或200bp、极特别优选至少400bp的片段进行杂交。在特别优选的实施方案中，杂交应当用完整的核酸序列以如上所述的条件实施。
术语“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”意指所提及初始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)可以在长度上大幅度变化；最小尺寸是如此的尺寸，其大小足以为序列提供所提及的初始序列的至少相当的功能和/或活性，或与本发明的或在本发明方法中使用的核酸分子在严格条件下杂交，而最大尺寸不是关键性的。在一些应用中，最大尺寸通常没有明显大于为提供初始序列的想要的功能和/或活性所需要的尺寸。
除本文中所述的SRP的片段和融合多肽外，本发明还包括植物中天然存在的SRP和编码SRP的核酸的同源物和类似物。“同源物”在本文中定义为分别具有相似或基本上相同的核苷酸序列或氨基酸序列的两种核酸或多肽。同源物包括如下文所定义的SRP的等位基因变体、直向同源物、旁向同源物、激动剂和拮抗剂。术语“同源物”还包含如此核酸分子，其因遗传密码子的简并性而与序列表中公开的核苷酸序列(及其部分)之一相异并且因而编码如由序列表中公开的核苷酸序列所编码SRP那样的相同SRP。如本文中所用，“天然存在的”SRP指在自然界存在的SRP氨基酸序列。优选地，天然存在的SRP包含选自在序列表中公开的多肽的氨基酸序列。
SRP的激动剂可以基本保留相同或部分的SRP生物学活性。SRP的拮抗剂可抑制SRP天然存在形式的一种或多种活性。例如，SRP拮抗剂可以竞争性地与细胞膜成分代谢级联中包括SRP在内的下游成员或上游成员结合，或与介导化合物跨膜转运的SRP结合，因而阻止转运发生。
与SRP cDNA的天然等位变体和类似物、直向同源物和旁向同源物对应的核酸分子可以基于它们在本文中所述与酿酒酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆或稻的SRP核酸的同一性，使用SRP cDNA或其部分作为探针根据标准杂交技术在严格杂交条件进行分离。在备选的实施方案中，SRP同源物可以通过对SRP突变体如截短突变体的组合文库筛选SRP激动剂或拮抗剂的活性进行鉴定。在一个实施方案中，SRP变体的混杂文库通过在核酸水平上的组合诱变产生并由混杂的基因文库编码。SRP变体的混杂文库可以通过例如将合成性寡核苷酸混合物用酶连接为基因序列以至可以将成套简并有效的SRP序列表达为含有成套本文中SRP序列的独立多肽或备选地是一套更大的融合多肽(例如对于噬菌体展示)。存在可以用于从简并性寡核苷酸序列中产生有效SRP同源物的文库的多种方法。简并性基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪上开展，并且随后将合成基因连接至合适表达载体。使用成套简并性基因允许在一种混合物内提供编码所需要的成套有效SRP序列的全部序列。用于合成简并性寡核苷酸的方法在本领域已知。参见例如，Narang，S.A.，1983，Tetrahedron 39：3；ltakura等，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；ltakura等，1984，Science 198：1056；Ike等，1983，Nucleic Acid Res.11：477。
此外，SRP编码区的片段文库可以用于生成SRP片段的混杂群体以筛选并随后选择SRP的同源物。在一个实施方案中，编码序列的片段文库可以如此生成：用核酸酶于仅在每分子切割大约一次的条件下处理SRP编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性以形成双链DNA，其可能包含来自不同的带切口的产物的有义/反义对，通过S1核酸酶处理从再次形成的双链体中除去单链部分，并且将得到的片段文库连接至表达载体。通过此方法，可以衍生编码SRP的多种大小的氨基端、羧基末端和中段片段的表达文库。
在本领域中数种技术已知用于筛选通过点突变或截短所产生的组合文库的基因产物并用于cDNA文库筛选以得到具有选定特性的基因产物。此类技术适应于快速筛选由SRP同源物的组合诱变所生成的基因文库。对于高通量分析可操作的最广泛地用于筛选庞大基因文库的技术一般包括将基因文库克隆至可复制的表达载体，用得到的载体文库转化适宜细胞并在如此条件下表达组合性基因，在该条件下检测所需要的活性有利于分离编码其产物受到检测的基因的载体。一种提高文库中功能性突变体出现频率的新技术Recursive ensemble诱变(REM)可以与筛选分析法组合使用以鉴定SRP同源物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS 89：7811-7815；Delgrave等，1993，多肽Engineering 6(3)：327-331)。在另一个实施方案中，可以使用本领域众所周知的方法采用基于细胞的分析法以分析混杂的SRP文库。本发明还提供鉴定新SRP的方法，包括(a)产生与如本文中所述的SRP或其片段反应的特异性抗体；(b)用这种抗体筛选推测的SRP材料，其中抗体对此材料的特异性结合表示存在潜在的新的SRP；并且(c)与已知SRP相比，分析结合的材料以确定它的新颖性。
如上所述，本发明包括SRP及其同源物。为测定两种氨基酸序列的序列同一性百分数(例如序列表中公开的的序列之一及其突变形式)，将序列为最佳比较目的进行比对(例如可以将缺口导入一种多肽的序列用于与另一种多肽或核酸最佳比对)。比较相应氨基酸位置上的相应氨基酸残基。当在一种序列(例如序列表中公开的序列之一)中的一个位置由另一序列(例如选自根据序列表中公开的多肽的序列的突变形式)中相应位置上的相同氨基酸残基占据时，则两种分子在此位置相同。相同类型的比较可以在两种核酸序列间开展。
两种序列间的序列同一性百分数是两种序列间共有的相同位置数的函数(即同一性百分数＝相同位置数/总位置数×100)。优选地，本发明中所包含的分离的氨基酸同源物与根据序列表中公开的完整氨基酸序列至少约50-60％、优选地至少约60-70％，并且更优选地至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，并且最优选地至少约96％、97％、98％、99％或更高相同。在又一个实施方案中，本发明中所包含的分离的氨基酸同源物与根据序列表中公开的核酸序列所编码的完整氨基酸序列至少约50-60％、优选地至少约60-70％，并且更优选地至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，并且最优选地至少约96％、97％、98％、99％或更高地同一。在其它实施方案中，SRP的氨基酸同源物在序列表中公开的序列在至少15连续氨基酸残基、更优选至少25连续氨基酸残基和最优选至少35连续氨基酸残基上的具有序列同一性。
在另一个优选的实施方案中，本发明分离的核酸同源物包含核苷酸序列，其与序列表中公开的核苷酸序列或与其包含至少20、30、40、50、60个连续核苷酸的部分至少约50-60％、优选地至少约60-70％、更优选地至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％并且甚至更优选地至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高地同一。用于核酸序列比较的优选长度是编码区的至少75个核苷酸、更优选地至少100个核苷酸并且最优选地是编码区的完整长度。
还优选本发明分离的核酸同源物编码SRP或其部分，其与序列表中公开的的氨基酸序列至少85％同一并且在植物中发挥环境胁迫应答调节剂的功能。在更优选的实施方案中，核酸同源物在植物中的过量表达提高植物对环境胁迫的耐性。
为了本发明目的，两种核酸序列或两种多肽序列间的序列同一性百分数使用Vectro NTI 6.0(PC)软件包(InforMax，7600 Wisconsin Ave.，Bethesda，MD 20814)测定。缺口开口罚值15和缺口延伸罚值6.66用于测定两种核酸的同一性百分数。缺口开口罚值10和缺口延伸罚值0.1用于测定两种多肽的同一性百分数。所有其它参数设置为默认环境。为了多重对比(Clustal W算法)目的，使用blosum62矩阵，缺口开口罚值为10并且缺口延伸罚值是0.05。应当理解为了测定序列同一性，在DNA序列与RNA序列比较时，胸苷核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。
在另一个方面，本发明提供分离的核酸，其包含与序列表中公开的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。更特别地，本发明分离的核酸分子长至少15个核苷酸并且在严格条件下与包含序列表中公开的核苷酸序列的核酸分子杂交。在其它实施方案中，核酸长度是至少30、50、100、250或更多个核苷酸。优选地，本发明分离的核酸同源物包含这样的核苷酸序列，其在高度严格条件下与序列表中公开的核苷酸序列杂交，并且在植物中发挥胁迫抗性调节物的功能。在又一个优选的实施方案中，分离的核酸同源物在植物中的过量表达提高植物对环境胁迫的耐性。
如本文中所用，对用于DNA与DNA印迹法的杂交而言，术语“严格条件”在一个实施方案中指在10×Denharts溶液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中60℃杂交过夜。将印迹膜在62℃依次在3×SSC/0.1％SDS、随后在1×SSC/0.1％ SDS并且最后在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤，每次30分钟。还如本文中所用，“高度严格条件”指在10×Denharts溶液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中65℃杂交过夜。将印迹膜在65℃依次在3×SSC/0.1％ SDS、随后在1×SSC/0.1％SDS并且最后在0.1×SSC/0.1％ SDS中洗涤，每次30分钟。用于核酸杂交方法在Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138：267-284；编者Ausubel等，1995，Current Protocols in Molecular Biology，第2章，GreenePublishing和Wiley-lnterscience，New York；以及Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology：Hybridization with Nucleic Acids，第一部分，第2章，Elsevier，NewYork中描述。优选地，在严格条件或高度严格条件下与序列表中公开的序列杂交的本发明分离的核酸分子对应于天然存在的核酸分子。如本文中所用，“天然存在的”核酸分子指具有在自然界存在的核苷酸序列(例如编码天然多肽)的RNA或DNA分子。在一个实施方案中，核酸编码天然存在的酿酒酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆或稻的SRP。
使用以上所述方法以及本领域技术人员所知的其它方法可以分离SRP的同源物，其包含序列表中公开的氨基酸序列。这些同源物的一个亚类是等位变体。如本文中所用，术语“等位变体”指含有导致在SRP氨基酸序列中的改变并在天然群体(例如植物物种或变种)内存在的多态性的核苷酸序列。此类天然的等位变异通常可以引起SRP核酸中1-5％变异。等位变体可以通过对大量不同植物中的目的核酸序列测序加以鉴定，其可以通过使用旨在鉴定这些植物中相同的SRP遗传位点的杂交探针轻易地实施。本发明的范围将包括SRP中不改变SRP功能性活性并且作为天然等位变异结果的任何和所有此类核酸变异以及得到的氨基酸多态性或变异。
编码与序列表中公开的多肽序列具有序列同一性的SRP的分离核酸分子可以如此产生，即通过将一个或多个核苷酸的替换、添加或缺失分别导入序列表中公开的核苷酸序列以至将一个或多个氨基酸替换、添加或缺失导入所编码的多肽。突变可以通过标准技术如位点定向诱变和PCR介导的诱变导入序列表中公开的序列之一。优选地，对一个或多个预测为非关键氨基酸残基开展保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的氨基酸替换。
具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、带非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此将SRP中预测的非关键氨基酸基优选地替换为来自相同侧链家族的另一种基酸残基。备选地，在另一个实施方案中，突变备选地可以沿SRP编码序列的全部或其部分随机导入，例如通过饱和诱变，并且可以对本文中所述SRP活性筛选得到的突变体以鉴定保留SRP活性的突变体。在诱变序列表中公开的序列后，可以重组地表达其所编码的蛋白质，并且可以如本文中所述测定表达此多肽的植物的胁迫抗性。
此外，可以产生优化的SRP核酸。如本文中所用，“优化的”指经遗传设计以增加其在给定植物或动物中表达的核酸。为了提供植物以优化的SRP核酸，可以修饰基因的DNA序列以1)包含通过高表达的植物基因优化的密码子；2)包含在植物大量存在的核苷酸碱基组成中的A+T含量；3)形成植物起始序列；或4)消除引起RNA不稳定化、不适宜的聚腺苷酸化、降解和终止的序列、或形成次级发夹结构或RNA剪接位点的序列。SRP核酸在植物中增加的表达可以通过利用常见植物或特定植物中的密码子分布频率实现。用于优化植物中核酸表达的方法可以在EPA 0359472；EPA0385962；PCT申请号WO 91/16432；美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；Perlack等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3324-3328和Murray等，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498中找到。
如本文中所用，“优选的密码子使用频率”指由特定宿主细胞在使用编码给定氨基酸的核苷酸密码子上所表现的偏好。为测定特定密码子在基因中的使用频率，将该密码子在基因中的出现次数除以在基因中编码同一氨基酸的所有密码子出现的总次数。类似地，由宿主细胞所表现的优选的密码子使用频率可以通过将宿主细胞所表达的多种基因中优选的密码子使用频率平均化进行计算。优选使该分析限于宿主细胞高度表达的基因。如此计算用于合成性基因的优选的密码子使用频率对宿主细胞所用的优选密码子使用频的偏离百分数，首先通过测定单个密码子使用频率对宿主细胞的使用频率的偏离百分数，随后得到所有密码子的平均偏离。如本文中定义，该计算包括特殊的密码子(即ATG和TGG)。通常而言，优化基因的密码子使用频率对宿主细胞的密码子使用频率的整体平均偏离使用等式1A＝n＝1Z Xn-Yn Xn乘以100Z计算，在等式中Xn＝宿主细胞中密码子n的使用频率；Yn＝合成性基因中密码子n的使用频率；n代表编码氨基酸的单个密码子并且密码子的总数是Z。密码子使用频率对全部氨基酸的整体偏离A应当优选地低于大约25％并且更优选地低于大约10％。
因此，可以如此优化SRP核酸以至它的密码子分布频率优选地不超过25％并且更优选地不超过约10％地偏离于高度表达的植物基因的密码子分布频率。此外，考虑简并性第三碱基的G+C百分含量(单子叶植物基因似乎在该位置上偏好G+C，而双子叶植物基因则否)。还认识到XCG(其中X是A、T、C或G)核苷酸是双子叶植物中最不被优选的密码子而XTA密码子在单子叶植物和双子叶植物中均应当避开。本发明优化的SRP核酸优选地还具有CG和TA双联体避免指数(avoidance index)，其非常接近所选择的宿主植物(即欧洲油菜、大豆或稻)的CG和TA双联体避免指数。更优选地，这些指数与宿主指数的偏离不超过约10-15％。
除了编码以上所述SRP的核酸分子之外，本发明另一方面涉及反义的分离的核酸分子。据认为反义多核苷酸通过特异性结合靶多核苷酸并干扰靶的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性抑制靶多核苷酸的基因表达。本领域中已描述用于将反义多核苷酸靶向至染色体DNA、至初级RNA转录物或至已加工的mRNA的方法。优选地，靶区域包括剪接位点、翻译起始起始密码子、翻译终止密码子和可读框内的其它序列。
术语“反义”，为了本发明目的，指这样的核酸，其包含与基因、初级转录物或加工的mRNA的全部或部分足够互补以至干扰内源基因表达的多核苷酸。“互补性”多核苷酸是能够根据Watson-Crick互补原则发生碱基配对的那些多核苷酸，具体地，嘌呤将与嘧啶碱基配对以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)以及在DNA例子中腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA中腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。应当理解两种多核苷酸可以相互杂交，即便它们没有彼此完全互补，只要每一多核苷酸具有与另一种多核苷酸基本互补的至少一个区域即可。术语“反义核酸”包括可以转录以产生反义RNA的单链RNA表达盒和双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能够与编码多肽的初级转录物或mRNA选择性杂交的反义RNA分子，其中所述多肽具有与序列表中公开的多肽至少80％的序列同一性。
反义核酸可以与完整的SRP编码链互补或仅与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子对编码SRP的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指核苷酸序列中包含翻译为氨基酸残基的密码子的区域。在另一个实施方案中，反义核酸分子对编码SRP的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”指分布在编码区的不翻译为氨基酸的指5′和3′序列(即也称作为5′和3′非翻译区)。反义核酸分子可以与SRPmRNA的完整编码区互补，但是更优选仅对SRP mRNA编码区或非编码区的部分为反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与PKSRP mRNA的翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸长度可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。一般地，本发明反义分子包含RNA，其具有与序列表中公开的核酸之一的至少14个连续核苷酸60-100％的序列同一性。优选地，序列同一性是至少70％、更优选地是至少75％、80％、85％、90％、95％、98％并且最优选地是99％。
本发明的反义核酸可以利用化学合成和酶连接反应，使用本领域已知的方法构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中设计修饰的核苷酸旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸和有义核酸间所形成的双链体物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰的核苷酸实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲基酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。备选地，反义核酸可以使用其中核酸已经在反义方向上亚克隆的表达载体以生物方式产生(即从已插入的核酸转录出的RNA将对靶目的核酸呈反义方向，这在如下部分中进一步描述)。
在又一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补性RNA形成特异的双链杂交体，在此双链体中与常见的β单元相反，链彼此呈平行分布(Gaultier等，1987，Neuleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic acids Res.15：6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
本发明的反义核酸分子通常施用至细胞或在原位(in situ)生成以至它们与编码SRP的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交，因而例如通过抑制转录和/或翻译而抑制多肽的表达。杂交可以是因常规的核苷酸互补性以形成稳定的双链体，或例如在结合至DNA双链体的反义核酸分子情形，通过在双螺旋的大沟内的特异性相互作用实现。可以如此修饰反义分子以至它特异性结合至选择的细胞表面的受体或抗原，例如通过将反义核酸分子连接至结合细胞表面的受体或抗原的肽或抗体。反义核酸分子还可以使用本文中所述的载体送递至细胞。为实现反义分子在细胞内足够的浓度，优选其中使反义核酸分子置于强的原核启动子、病毒启动子或真核(包括植物)启动子控制下的载体。
作为反义多核苷酸的备选，可以使用核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)以减少SRP多肽表达。“核酶”意指具有核糖核酸酶活性的基于催化性RNA的酶，其能够切割与之具有互补区域的单链核酸如mRNA。可以使用核酶(例如在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：585-591中所述的锤头核酶)以催化性切割SRP mRNA转录物以便因此抑制SRP mRNA的翻译。对编码SRP的核酸呈特异性的核酶可以基于如本文中所公开的SRP cDNA的核苷酸序列(即序列表中公开或说明书其他地方公开)或基于根据本发明中已教授的方法而分离的异源序列设计。例如，可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，在其中活性位点的核苷酸序列与编码SRP的mRNA中待受到切割的核苷酸序列互补。参见例如Cech等的美国专利号4,987,071和5,116,742。备选地，可以使用SRP mRNA以在RNA分子库内选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Barte1，D.和Szostak，J.W.，1993，Science 261：1411-1418。在优选的实施方案中，核酶将含有具备至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸并且更优选地7或8个核苷酸的与靶RNA的部分具有100％互补性的部分。用于产生核酶的方法对本领域技术人员为已知。例如参见美国专利号6,025,167；5,773,260和5,496,698。
术语“dsRNA”，如本文中所用，指包含两条RNA链的RNA杂交体。dsRNA可以在结构上为线性或环状。在优选的实施方案中，dsRNA对这样的多核苷酸呈特异性，其编码根据序列表中公开的多肽或具有与序列表中公开的多肽至少70％序列同一性的多肽。杂交的RNA可以是基本互补或完全互补。“基本互补”意指当使用如上所述的BLAST程序优化比对两种杂交的RNA时，杂交的部分至少95％互补。优选地，dsRNA的长度将是至少100个碱基对。一般地，杂交的RNA长度相同，没有突出的5′或3′端并且没有缺口。然而，达100个核苷酸的具有5′或3′突出端的dsRNA可以用于本发明的方法中。
dsRNA可以包含核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物如2′-O-甲基核糖基或其组合。例如，参见美国专利号4,130,641和4,024,222。dsRNA聚核糖次黄苷酸:聚核糖胞苷酸在美国专利4,283,393中描述。用于产生和使用dsRNA的方法在本领域已知。一个方法包括在体内或在体外单个反应混合物内同时转录两条互补的DNA链。例如，参见美国专利号5,795,715。在一个实施方案中，dsRNA可以通过标准技术直接导入植物或植物细胞。或者，dsRNA可以在植物细胞中通过转录两种互补的RNA得到表达。
用于抑制内源基因表达的其它方法，如三股螺旋的形成(Moser等，1987，Science 238：645-650和Cooney等，1988，Science 241：456-459)和共抑制(Napoli等，1990，The Plant Cell 2：279-289)在本领域已知。部分长度和全长的cDNA已用于共抑制内源性植物基因。例如，参见美国专利号4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等，1990，ThePlant Cell 2：291-299；Smith等，1990，Mol.Gen.Genetics 224：477-481和Napoli等，1990，The Plant Cell 2：279-289。
对于有义抑制，认为导入有义多核苷酸封闭相应靶基因的转录。有义多核苷酸具有与靶植物基因或靶RNA至少65％的序列同一性。优选地，同一性百分数是至少80％、90％、95％或更高。导入的有义多核苷酸不必在全长上与靶基因或转录物相关。优选地，有义多核苷酸具有与序列表中公开的核酸之一中至少100个连续核苷酸至少65％的序列同一性。同一性的区域可以包含内含子和/或外显子和非翻译区域。导入的有义多核苷酸可以短暂存在于植物细胞中，或可以稳定整合至植物染色体或染色体外复制子。
此外，编码来自相同或其它物种的SRP如SRP类似物、直向同源物和旁向同源物的核酸分子处于本发明的范围内。如本文中所用，术语“类似物”指具有相同或相似功能，但在不相关的生物中独立演化的两种核酸。如本文中所用，术语“直向同源物”指通过物种形成从共同先祖基因演化的来自不同物种的两种核酸。通常，直向同源物编码具有相同或相似功能的蛋白质。还如本文中所用，术语“旁向同源物”指因在基因组中重复作用而相关的两种核酸。旁向同源物通常具有不同功能，不过这些功能可能相关(Tatusov，R.L.等1997 Science 278(5338)：631-637)。天然存在的胁迫相关蛋白的类似物、直向同源物和旁向同源物可以因翻译后修饰、因氨基酸序列差异或这两种原因与天然存在的胁迫相关蛋白不同。翻译后修饰包括多肽在体内和体外的化学衍生作用，如乙酰化作用、羧化作用、磷酸化作用和糖基化作用。并且此类修饰可以在多肽合成和加工期间发生或随后以分离的修饰酶进行处理。特别地，本发明的直向同源物通常显示与天然存在性胁迫相关蛋白的全部或部分氨基酸序列至少80-85％、更优选90％、91％、92％、93％、94％并且最优选地95％、96％、97％、98％或甚至99％的同一性或同源性，并且显示类似于胁迫相关蛋白的功能。本发明的直向同源物还优选地能够在植物中参与胁迫反应。
除了群体中可以存在的胁迫相关蛋白序列的天然存在性变体外，技术人员认识到可以将改变通过突变导入核苷酸序列SEQ ID NO：(4n+1)其中n＝0至54和SEQ ID NO：(2n+1)其中n＝110至487，因而在所编码的胁迫相关蛋白的氨基酸序列中引起改变，而不改变胁迫相关蛋白的功能性能力或增强胁迫相关蛋白的功能性能力。例如，引起在“非关键”氨基酸残基上氨基酸替换的核苷酸替换可以在序列SEQ ID NO：(4n+2)其中n＝0至54和SEQ ID NO：(2n+2)其中n＝110至487中开展。“非关键”氨基酸残基是可以在胁迫相关性蛋白之一的野生型序列中加以改变而不改变胁迫相关蛋白活性的残基，而“关键”氨基酸残基为胁迫相关蛋白的活性所需。然而，其它氨基酸残基(例如那些在具有SRP活性的结构域内非保守或仅半保守的氨基酸残基)可能对活性不是必需的，并且因此有可能对改变而言是可操作的，同时不改变SRP活性。
因此，本发明的另一个方面涉及编码在对胁迫相关蛋白活性为非关键的氨基酸残基中含有改变的胁迫相关性蛋白的核酸分子。此类SRP在氨基酸序列上与序列表中公开的序列不同，但仍保留至少一种如本文中所述的胁迫相关蛋白活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中该蛋白质包含与序列表中公开的氨基酸序列至少约50％同源的氨基酸序列。优选地，由该核酸分子编码的蛋白质与序列表中公开的序列之一至少约50-60％同源、更优选地与序列表中公开的序列之一至少约60-70％同源，甚至更优选地与序列表中公开的序列之一至少约70-80％，80-90％，更优选地与序列表中公开的序列之一90％、91％、92％、93％、94％同源并且最优选地与序列表中公开的序列之一至少约96％、97％、98％或99％同源。本发明优选的胁迫相关蛋白的同源物优选地能够在植物中参与胁迫抗性反应。在整个氨基酸范围计算同源性(＝同一性)。所用程序是PileUp(J.Mol.Evolution.，25(1987)，351-360，Higgins等，CABIOS，5 1989：151-153)。
还将序列表中公开的序列的同源物理解为意指例如具有在衍生的氨基酸水平上至少30％同源性(＝同一性)、优选地至少50％、60％、70％或80％同源性、特别优选地至少85％同源性、极特别优选地90％、91％、92％、93％、94％同源性、最优选地95％、96％、97％、98％或99％同源性的同源物、类似物、直向同源物和旁向同源物。在整个氨基酸范围计算同源性(＝同一性)。所用程序分别是PileUp(J.Mol.Evolution.，25(1987)，351-360，Higgens等，CABIOS，5 1989：151-153)或程序Gap和BestFit[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)以及Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))，其是GCG软件包[Genetics ComputerGroup，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)]的部分。以上提及的序列同源性百分数用程序BestFit或Gap，优选地是Gap对整个序列长度进行计算，所用参数如下：缺口权重：8，长度权重：2。
还应当包括变体，尤其应当包括可以从序列表中公开的序列中通过核苷酸的缺失、插入或替代而得到的功能性变体，其中这种衍生的合成性蛋白质的酶活性得以保留或受到增强。
编码与序列表中公开的蛋白质序列同源的胁迫相关性蛋白的分离核酸分子可以通过将一个或多个核苷酸的替换、添加或缺失导入序列表中公开的核苷酸序列以至将一个或多个氨基酸的替换、添加或缺失导入编码的蛋白质。突变可以通过标准技术，如位点定向诱变和PCR-介导的诱变而导入序列表中公开的序列。公开于欧洲公开号EP-A-O 909 821的酶诱变的另一种方式是使用特异性大肠杆菌菌株XL1-Red以产生突变体和改变的酶活性的方法。
优选地，在一个或多个预测为非关键氨基酸残基上开展保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的氨基酸替换。
具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、带非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此将胁迫相关蛋白中预测的非关键氨基酸基优选地替换为来自相同侧链家族的另一种基酸残基。备选地，在另一个实施方案中，突变可以沿着胁迫相关蛋白编码全部序列或其部分随机导入，例如通过饱和诱变，并且可以为如本文中所述的胁迫相关蛋白活性筛选得到的突变体以鉴定出保留胁迫相关蛋白活性或表现增强的胁迫相关蛋白活性的突变体。在诱变序列表中公开的核酸序列之一后，可以重组地表达编码的蛋白质，并且可以如以下实施例中所述分析表达该蛋白质的植物的胁迫耐性。
确定基因转录水平(基因产物的可用于翻译的mRNA数量的指示)的有用方法是开展RNA印迹(参考文献见例如，Ausubel等，1988 CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley：New York)。此信息至少部分地说明基因的转录程度。细胞总RNA可以通过数种方法自细胞、组织或器官内制备，所述方法在本领域均众所周知，如那些在Bormann，E.R.等，1992Mol.Microbiol.6：317-326中描述的方法。为评估自mRNA转录的蛋白质的存在或相对量，可以采用标准技术，如蛋白质印迹。这些技术对本领域技术人员为众所周知(例如参见Ausubel等，1988 Current Protocols inMolecular Biology，Wiley：New York)。
本发明还涉及植物表达盒，其包含选自序列表中公开的序列和/或同源物或其部分的编码SRP的核酸，该核酸有效地连接至调节序列和/或靶向序列。
此外，本发明的目的是表达载体，其包含选自序列表中公开的序列和/或同源物或其部分的编码SRP的核酸或如以上所述的植物表达盒，因而编码SRP的核酸在宿主细胞中的表达引起与相应的未转化野生型宿主细胞相比较对环境胁迫增加的耐性，其优选通过改变代谢活性实现。
本发明还提供分离的重组表达载体，其包含如以上所述的编码胁迫相关蛋白的核酸，其中载体或编码胁迫相关蛋白的核酸各自在宿主细胞内的表达引起与相应的未转化野生型宿主细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性，其优选通过改变代谢活性实现。如本文中所用，术语“载体”指能够转运与之连接的另一种核酸分子的核酸分子。一个类型的载体实例是“质粒”，其指向其中可以连接额外DNA节段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中可以将额外DNA节段连接至病毒的基因组内。其它类型的载可以是线性化的核酸序列，如转座子，其是可以拷贝并自我插入的DNA片段。存在两种类型的已知转座子：称作插入序列的简单转座子以及组合转座子，其可以具有数种基因以及为转座所需要的基因。
某些载体能够在导入这些载体的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合至宿主细胞基因组，并且因此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。通常，用于DNA重组技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意图包含表达载体的其它形式，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其发挥等效功能。
植物表达盒优选地包含调节序列，此类调节序列能够在植物细胞中驱动基因表达并有效地连接以至每一序列可以充分实现它的功能，如通过聚腺苷酸化信号终止转录。优选的聚腺苷酸化信号不但是源自根瘤农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)中称作章鱼碱合酶的基因3或其功能等同物的那些聚腺苷酸化信号，而且在植物中呈功能活性的所有其它终止子也适合。
由于植物基因表达并不总是在翻译水平受限，因此植物表达盒优选地含有有效连接的其它序列，如转录增强子，如含有来自烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列的增强每RNA对多肽比率的超驱动序列(GaINe等，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。
基因表达必须有效地连接至赋予基因以时间、细胞或组织特异性方式表达的适宜启动子。优选的启动子是驱动组成型表达的启动子(Benfey等，1989EMBO J.8：2195-2202)，如那些衍生自植物病毒如35S CaMV(Franck等，1980 Cell 21：285-294)、19S CaMV(还参见美国专利号5352605和PCT专利申请号8402913)的启动子，或植物启动子，如那些在美国专利号4,962,028中所述来自Rubisco小亚基的启动子。
额外有利的调节序列例如包含在植物启动子如CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、Iib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos中或者包含在遍在蛋白、油菜籽蛋白或菜豆蛋白启动子内。诱导型启动子在本上下文中也有利，如在EP-A-O 388 186(苯磺酰胺诱导型)、Plant J.2，1992：397-404(Gatz等，四环素诱导型)、EP-A-O 335 528(脱落酸诱导型)或WO 93/21334(乙醇或环己酮诱导型)中描述的启动子。额外有利的植物启动子是马铃薯的胞浆FBP酶启动子或马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)、大豆的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子(还参见Genebank登录号U87999)或如EP-A-O 249 676中所述节特异性启动子。额外特别有利的启动子是可以用于单子叶植物或双子叶植物并且在US5,608,152(来自欧洲油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO 98/45461(来自拟南芥菜属的油质蛋白启动子)、US5,504,200(来自菜豆的菜豆蛋白启动子)、WO91/13980(来自芥属的Bce4启动子)和Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：233-239(来自豆科植物的LEB4启动子)中描述的种子特异性启动子。所述启动子用于双子叶植物中。如下启动子用于例如单子叶植物：来自大麦中Ipt2或Ipt1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子。其它有用的启动子在WO99/16890中描述。
原则上，可以使用具有其调节序列的所有天然启动子，如以上提及的用于新方法的那些天然启动子。除此之外，还可能并且可以有利地使用合成性启动子。
基因构建体还可以包含待插入生物并例如参与胁迫抗性的其它基因。在宿主生物中插入并表达调节基因是可能的并且是有利的，例如编码诱导物、阻遏物或通过其酶活性干预调节作用的酶的基因，或者生物合成途径中一种或多种或全部酶的基因。这些基因在来源上可以是异源或同源的。插入的基因可以具有它们自己的启动子或处于如与序列表中公开的核酸序列或其同源物的相同启动子控制下。
为了表达存在的其它基因，基因构建体有利地包含根据已选择的宿主生物和基因选择用于最佳表达的3′和/或5′末端调节序列以增强表达。
这些调节序列用于使如上所述的基因特异性表达和蛋白质表达成为可能。根据宿主生物，这可以意指例如仅在诱导后基因才得以表达或过量表达或基因立即得以表达和/或过量表达。
调节序列或因子还可以优选地有益影响导入的基因的表达并且因此提高表达。有可能通过使用强转录信号，如启动子和/或增强子以这种方式有利地在转录水平增强调节元件。然而，除此此外，还有可能例如通过改善mRNA的稳定性增强翻译。
优选用于植物基因表达盒的其它序列是指导基因产物进入适宜细胞区室所需要的靶向序列(综述参见Kermode，1996 Crit.Rev.Plant Sci.15(4)：285-423及其中引用的参考文献)，如进入液泡、细胞核、所有类型的质粒如淀粉体、叶绿体、细胞外空间、线粒体、色质体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞的其它区室。
植物基因表达还可以通过诱导型启动子进行促进(综述参见Gatz，1997Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。当基因表达需要以时间特异性方式发生时，化学诱导型启动子特别合适。
表1列出了可用于调节编码胁迫相关蛋白核酸的序列转录的启动子的数个实例
表1：植物中组织特异性和胁迫诱导型启动子的实例。
 
表达 参考文献
Cor78-寒冷、干旱、盐、ABA、创伤-诱导型 Ishitani，等，Plant Cell 9：1935-1949(1997).Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，Plant Cell 6：251-264(1994).
Rci2A-寒冷、脱水-诱导型 Capel等，Plant Physiol 115：569-576(1997)
Rd22-干旱、盐 Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，Mol Gen Genet 238：17-25(1993).
Cor15A-寒冷、脱水、ABA Baker等，Plant Mol.Biol.24：701-713(1994).
GH3-植物生长素诱导型 Liu等，Plant Cell 6：645-657(1994)
ARSK1-根、盐诱导型 Hwang和Goodman，Plant J 8：37-43(1995).
PtxA-根、盐诱导型 GenBank登录号X67427
SbHRGP3-根特异性 Ahn等，Plant Cell 8：1477-1490(1998).
KST1-保卫细胞特异性 Plesch等，Plant Journal.28(4)：455-64，(2001)
KAT1-保卫细胞特异性 Plesch等，基因249：83-89(2000)Nakamura等，Plant Physiol.109：371-374(1995)
水杨酸诱导型 PCT申请号WO 95/19443
四环素诱导型 Gatz等Plant J.2：397-404(1992)
乙醇诱导型 PCT申请号WO 93/21334
病原体诱导型PRP1 Ward等，1993 Plant.Mol.Biol.22：361-366
热诱导型hsp80 美国专利号5187267
寒冷诱导型α-淀粉酶 PCT申请号WO 96/12814
创伤诱导型 欧洲专利号375091
RD29A-盐-诱导型 Yamaguchi-Shinozalei等(1993)Mol.Gen.Genet.236：331-340
质体特异性病毒RNA聚合酶 PCT申请号WO 95/16783和WO 97/06250
其它启动子例如超级启动子(Ni等，Plant Journal 7，1995：661-676)、遍在蛋白启动子(CaINs等，J.Biol.Chem.，1990，265：12486-12493；US5,510,474；US6,020,190；Kawalleck等，Plant.Molecular Biology，1993，21：673-684)或34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)类似地用于本发明并且为本领域技术人员所知。
发育阶段优选的启动子在发育的某个阶段优先受到表达。组织和器官优选的启动子包括在特定组织或器官如叶、根、种子或木质部中优先受到表达的那些启动子。组织优选的启动子包括但不限于果实优选的、胚珠优选的、雄性组织优选的、种子优选的、珠被优选的、块茎优选的、柄优选的、果皮优选的和叶优选的、柱头优选的、花粉优选的、花药优选的、花瓣优选的、萼片优选的、花梗优选的、长角果优选的、茎优选的、根优选的启动子等。种子优选的启动子在种子繁育和/或萌发期间优先受到表达。例如，种子优选地启动子可以是胚优选的、胚乳优选和种衣优选的启动子。参见Thompson等，1989，BioEssays 10：108。种子优选的启动子实例包括但不限于纤维素合成酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。
其它在本发明表达盒中有用的启动子包括但不限于主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-伴大豆球蛋白启动子、油菜籽蛋白启动子，大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、萎缩1、萎缩2和青铜色启动子、Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)以及合成性或其它的天然启动子。
额外灵活地在植物中控制异源基因表达可以通过使用来自异源的DAN结合结构域和反应元件(即来自非植物的DNA结合结构域)达到。异源DNA结合结构域的实例是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell 43：729-736).
本发明还提供包含以反义方向克隆至该表达载体的本发明SRP DNA分子的重组表达载体。即DNA分子以如此方式有效连接至调节序列，该方式允许(通过DNA分子转录)与SRP mRNA呈反义的RNA分子表达。可以选择有效地连接至以反义方向克隆的核酸分子的调节序列，其指导反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达。例如，可以选择指导反义RNA组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子，或调节序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，在其中反义核酸在高效调节区域的控制下产生。调节区域的活性可以通过向其中导入载体的细胞类型加以测定。对于使用反义基因调节基因表达的讨论，参见Weintraub，H.等，1986，反义RNA as a molecular tool for geneticanalysis，Reviews-Trends in Genetics，第一卷(1)，和MoI等，1990，FEBSLetters 268：427-430。
本发明的另一方面涉及已导入本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组的宿主细胞”在本文中可交换使用。应当理解此术语不仅指特定的主题细胞，它们还适用于此类细胞的子代或有活力的子代。由于某些改变可以在后续世代中因突变或环境影响而出现，此类子代实际上与亲代细胞不完全相同，但是如本文中所用仍包含在本发明的范围内。宿主细胞可以是任何的原核细胞或真核细胞。例如，SRP可以表达在细菌细胞如谷氨酸棒杆菌、酵母、大肠杆菌、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其它微生物如谷氨酸棒杆菌。其它合适的宿主细胞对本领域技术人员为已知。
本发明的宿主细胞如培养的原核宿主细胞或真核宿主细胞可以用于产生(即表达)SRP。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞用于产生SRP的方法。在一个实施方案中，此方法包括将本发明的宿主细胞(其中已导入编码SRP的重组表达载体或其中编码野生型或改变的SRP的基因已导入基因组)在合适培养基内培养直至产生SRP。在另一个实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞分离SRP。
本发明的另一方面涉及分离的SRP、及其生物活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分在通过重组DNA技术产生时基本不含某些细胞性材料，或在通过化学合成时基本不含化学前体或其它化学品。词组“基本不含细胞性材料”包括这样的SRP制品，在所述SRP制品中该多肽与从其中天然或重组地产生此多肽的细胞的某些细胞器分开。在一个实施方案中，词组“基本不含细胞材料”包括这样的SRP制品，其具有少于大约30％(干重)的非SRP材料(本文中也称作“杂质多肽”)、优选地少于大约20％的非SRP材料、仍更优选地少于大约10％的非SRP材料并且最优选地少于大约5％的非SRP材料。
当重组产生SRP或其生物学活性部分时，它还优选地基本不含培养基，即培养基占蛋白质制品的体积少于大约20％、更优选地少于大约10％并且最优选地少于大约5％。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括SRP制品，在其中该多肽与参与合成此多肽的化学前体或其它化学品分开。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括SRP制品，其具有少于大约30％(干重)的化学性前体或非SRP化学品、更优选地少于大约20％的化学性前体或非SRP化学品、仍更优选地少于大约10％的化学性前体或非SRP化学品并且最优选地少于大约5％的化学性前体或非SRP化学品。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分没有来自在其中衍生SRP的同一生物的杂质多肽。一般，如此产生此类多肽，例如通过在植物中而非酿酒酵母、大肠杆菌或微生物如谷氨酸棒杆菌、纤毛虫、藻类或者真菌中重组表达酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、玉米或稻的SRP。
本文中所述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可用于一个或多个如下方法中：鉴定酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、或稻以及相关生物；与酿酒酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆、或稻相关的生物的基因组作图；鉴定和定位酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或稻的目的序列；进化研究；鉴定SRP中为功能所需的区域；SRP活性的调节；调节一种或多种细胞功能的代谢；调节一种或多种化合物的跨膜转运；调节胁迫抗性和调节SRP核酸的表达。
本发明的SRP核酸分子还用于进化和多肽结构研究。本发明分子所参与的代谢过程和转运过程由种类广泛的原核细胞和真核细胞所利用；通过将本发明核酸分子的序列与来自其它生物的编码类似酶的核酸分子的序列比较，可以评估生物的进化相关性。类似地，此类比较研究允许评估序列的哪些区域保守而哪些区域不保守，这可能有助于确定多肽的哪个区域对酶的功能关键。这种类型的确定对于多肽工程研究极有意义并且可以提供多肽可以耐受何种诱变而不丧失功能的线索。
对本发明SRP核酸分子的操作可以导致具有不同于野生型SRP的功能的本发明分子产生。这些多肽可以在效率或活性上得以改良，可以在细胞中已比通常细胞中更多的量存在，或可以在效率或活性上降低。
存在多种机制，籍此改变本发明的SRP可以直接影响胁迫反应和/或胁迫耐性。在表达SRP的植物例子中，增加的转运可以引起植物组织和器官中改善的盐和/或溶质分布。通过增加从细胞中输出离子性分子的转运分子的数量或活性，可能影响细胞的耐盐性。
遗传修饰在植物、谷氨酸棒杆菌、真菌、藻类或纤毛虫中对胁迫抗性的影响可以通过将修饰的微生物或植物在亚适宜的环境下生长，并且随后分析植物的生长特征和/或代谢。此类分析技术对本领域技术人员而言众所周知，并且包括干重、湿重、多肽合成、糖合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、整体的植物和/或作物产量、开花、繁殖、结种、根生长、呼吸速率、光合作用速率等(Applications of HPLC in Biochemistry in：LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等，1993 Biotechnology，第3卷，第三章：Product recovery and purification，第469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等，1988，Bioseparations：downstream processing for biotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，Recovery processes for biological materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.，1988，Biochemsicalseparations，在Ulmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry中，第B3卷，第11章，第1-27页，VCH：Weinheim；和Dechow，F.J.，1989，Separationand purification techniques in biotechnology，NoyesPublications)。
例如，可以构建包含本文中所公开的核酸或其片段的酵母表达载体并使用标准方案转化至酿酒酵母。随后可以分析得到的转基因细胞对干旱、盐和温度胁迫的耐性丧失或改变。类似地，可以构建包含本文中公开的核酸或其片段的植物表达载体并使用标准方案转化至适宜的植物细胞如拟南芥菜、大豆、油菜、玉米、小麦、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等。随后可以分析得到的转基因细胞和/或从其中衍生的植物对干旱、盐和温度胁迫的耐性和倒伏性的丧失或改变。
设计本发明的一种或多种SRP基因还可以产生具有改变活性的间接影响藻类、植物、纤毛虫或真菌或其它微生物如谷氨酸棒杆菌的胁迫反应和/或胁迫抗性的SRP。例如，代谢的正常生物化学过程导致可以干扰这些相同代谢过程的多种产物(例如过氧化氢和其它活性氧类)产生。例如已知过氧亚硝酸盐使酪氨酸侧链硝化，因此致使某些在活性位点内具有酪氨酸的酶失活(Groves，J.T.，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3(2)：226-235)。在通常排出这些产物的同时，可以遗传地改变细胞以与野生型细胞的常见量相比转运更多的产物。通过优化参与输出特定分子如盐分子的本发明的一种或多种PKSRP的活性，有可能改良细胞的胁迫抗性。
此外，本文中公开的序列或其片段可以用于在多种生物基因组如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞中产生敲除突变(Girke，T.，1998，ThePlant Journal 15：39-48)。得到的敲除细胞随后可以就它们耐受多种胁迫条件的能力或潜能，它们对多种胁迫条件的反应和突变对表型和/或基因型的影响进行评估。对于基因失活的其它方法，参见美国专利号6,004,804“Non-Chimeric Mutational Vectors”以及Puttaraju等，1999，Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy，Nature Biotechnology 17：246-252。
用于引起增加的胁迫抗性的SRP的前述提及的诱变策略不是限制性的，在这些策略上的变化对于本领域技术人员将是非常显而易见的。使用此类策略并包括本文中所公开的机制，本发明的核酸和多肽分子可以用于生成表达突变的PKSRP核酸和多肽分子以至改善胁迫抗性的藻类、纤毛虫、植物、真菌或其它微生物如谷氨酸棒杆菌。
本发明还提供特异性结合至如由本文中所述的核酸编码的SRP或其部分的抗体。抗体可以通过众多众所周知的方法产生(参见例如Harlow和Lane，“Antibodies；A LaboratoryManual”，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1988))。简而言之，可以将纯化的抗原以足以激发免疫反应的量和间隔期注射至动物。可以直接纯化抗体，或可以自该动物获得脾脏细胞。随后将此细胞与永生细胞系融合并对抗体分泌进行筛选。抗体可用于对核酸克隆文库筛选针分泌抗原的细胞。随后可以将那些阳性克隆测序。参见例如，Kelly等，1992，Bio/Technology10：163-167；Bebbington等，1992，Bio/Technology 10：169-175。
短语与多肽“选择性结合”和“特异性结合”指可确定多肽在异源多肽群体和其它生物中存在的结合反应。因此，在指定的免疫分析条件下，结合至特定多肽的指定抗体不以显著量结合至样品中存在的其它多肽。抗体在如此条件下的选择性结合可能需要因其对特定多肽的特异性而选择的抗体。多种免疫方法可以用于选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如固相ELISA免疫分析常规地用于选择与多肽发生选择性免疫反应的抗体。对于可以用于测定选择性结合的免疫方法和条件的描述，参见Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)。
在某些情况下，需要制备来自多种宿主的单克隆抗体。用于制备此类单克隆抗体的技术的描述可以在Stites等编辑，“Basic和ClinicalImmunology，”(Lange Medical Publications，Los Altos，Calif.，第五版和及其中引用的参考文献，和在Harlow和Lane，“Antibodies，A LaboratoryManual，”Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)中找到。
植物中的基因表达受蛋白质转录因子与基因调节区域内特定核苷酸序列相互作用的调节。常见类型的转录因子含有锌指(ZF)基序。每一ZF模块的长度是大约30个氨基酸，在锌离子周围折叠。ZF蛋白质的DNA识别结构域是插入DNA双螺旋大沟内的α-螺旋结构。模块含有结合至DNA的三个氨基酸，每一氨基酸接触靶DNA序列中的单个碱基对。ZF基序以模块重复方式排列以形成一套识别连续DNA序列的指。例如，三指ZF基序将识别DNA的9个bp。已证实数百个蛋白质含有ZF基序，每一蛋白质中有2至37个ZF模块(Isalan M，等，1998 Biochemistry 37(35)：12026-33；Moore M，等，2001 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(4)：1432-1436和1437-1441；美国专利US 6007988和US 6013453)。
植物基因的调节区域含有众多起到识别包括ZF蛋白在内的转录因子的短DNA序列(顺式作用元件)。不同基因中类似的识别结构域允许通过常见转录因子在代谢途径中协同表达数个编码酶的基因。基因家族成员的识别结构域中的变化有利于同一基因家族内部在基因表达的差异，例如在组织和发育阶段以及对环境条件的反应中。
常见ZF蛋白不仅含有DNA识别结构域，还含有使ZF蛋白激活或抑制特定基因转录的功能域。实验上，已经将激活域用于激活靶基因转录(美国专利5789538和专利申请WO9519431)，不过还有可能将转录阻遏物域连接至ZF并且因而抑制转录(专利申请WO00/47754和WO2001002019)。已报道酶的功能如核酸切割可以与ZF联合(专利申请WO00/20622)。
本发明提供方法，其允许本领域技术人员从植物细胞基因组中分离编码胁迫相关蛋白的一个或多个基因的调节区域并且设计与基因调节区域相互作用的功能域连接的锌指转录因子。可以以如此方式设计锌指蛋白与植物基因的相互作用以至改变基因的表达并且因此优选地改变代谢活性以赋予对非生物性胁迫如干旱增加的(或减少的)耐性。本发明提供产生具有转基因的转基因植物的方法，其中该转基因编码这种设计的转录因子或备选地编码天然转录因子，所述转录因子调节胁迫相关蛋白、尤其胁迫相关蛋白基因的转录以提供对环境胁迫增加的耐性，其优选通过改变代谢活性实现。植物基因通过多指的人造锌指如此进行调节已经由Ordiz等(Regulation of transgene Expression in plants with polydactyl zinc fingertranscription factors，Ordiz等，PNAS，99(20)13290-13295，2002)或Guan等(Hertiable endogenous gene regulation in plants with designed polydactylzinc finger transcription factors，PNAS，Vol.99(20)，13296-13301(2002))演示。
特别地，本发明提供产生具有编码胁迫相关蛋白的核酸的转基因植物的方法，其中该核酸在植物中的表达引起与野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性，，其优选通过改变代谢活性实现，包括：(a)以包含编码胁迫相关蛋白的核酸的表达载体转化植物细胞和(b)从植物细胞生成具有与野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性的转基因植物。对于此类植物转化，可以使用双元载体如pBinAR(Hófgen和Willmitzer，1990 Plant Science66：221-230)。此外，合适的双元载体是例如pBIN19、pBI101、pGPTV或pPZP(Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994)。
双元载体的构建可以通过将cDNA连接至T-DNA进行。位于该cDNA5′端的植物启动子激活cDNA的转录。聚腺苷酸化序列位于cDNA的3′端。组织特异性表达可以通过使用如上所列的组织特异性启动子实现。此外，可以使用任何其它启动子元件。对于在完整植物中的组成型表达，可以使用CaMV35S启动子。可以使用信号肽将表达的蛋白质靶向至细胞区室例如质体、线粒体或内质网(Kermode，1996 Crit.Rev.Plant Sci.4(15)：285-423)。将信号肽以符合cDNA读框方式克隆至5’端以实现融和蛋白的亚细胞定位。此外，对非生物性胁迫反应的启动子可以与例如拟南芥菜启动子RD29A一起使用。本领域技术人员认识到所用的启动子应当有效地连接至核酸以至该启动子引起核酸的转录，导致合成编码多肽的mRNA。
另一种转染方法包括通过电穿孔或农杆菌介导的基因转移将DNA直接转移至发育的花中。农杆菌介导的植物转化可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986 Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Ooms等，Plasmid，1982，7：15-29；Hoekema等，Nature，1983，303：179-180)根瘤农杆菌菌株开展。转化可以通过标准转化和再生技术(Deblaere等，1994 Nucl.Acids.Res.13：4777-4788；Gelvin和Schilperoort，Plant Molecular Biology Manual，第二版.-Dordrecht：Kluwer AcademicPubl.，1995.InSect，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick，B R和Thompson，J E，Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993.-360S.，ISBN0-8493-5164-2)开展。例如，油菜可以通过子叶或下胚轴转化作用加以转化(Moloney等，1989 Plant Cell Reports 8：238-242；De Block等，1989 PlantPhysiol.91：694-701)。用于农杆菌的抗生素以及植物选择取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。油菜的选择通常使用作为可选择植物标记的卡那霉素开展。农杆菌介导至亚麻属植物的基因转移可以使用例如由Mlynarova等，1994 Plant Cell Report 13：282-285描述的技术开展。此外，大豆的转化可以使用例如由欧洲专利号0424 047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770描述的技术开展。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或碳化硅纤维技术(见例如Freeling和Walbot“The maize handbook”Springer Verlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)实现。转化玉米的具体实例在美国专利号5,990,387中找到并且转化小麦的具体实例在PCT申请号WO 93/07256中找到。
本发明编码胁迫相关蛋白的核酸分子具有多种应用。最重要的，本发明的核酸和氨基酸序列可以用于转化植物细胞或植物，因而诱导对胁迫如干旱、高盐度和寒冷的耐性。本发明因此提供经编码胁迫相关蛋白的(编码或反义)核酸转化的转基因植物，其中核酸序列在植物中的表达引起与野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性。增加的胁迫抗性表现为植物产量或品质的提高。转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物或裸子植物。本发明还提供可以选自如下的转基因植物：玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、红花、胡麻、报春花、欧洲油菜、卡诺拉油菜和甘蓝型油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、小灌木植物如咖啡、可可、茶、柳属物种、树如油棕榈、椰子、多年生草本如黑麦草和羊茅以及饲料作物如苜蓿和三叶草和拟南芥菜。此外，转基因植物可以例如选自云杉、松或冷杉。
特别地，本发明描述利用胁迫相关性蛋白的表达以设计耐干旱、耐盐和/或耐寒的植物。这种策略已经在本文中展示用于拟南芥菜、黑麦草、苜蓿、欧洲油菜籽/卡诺拉油菜、大豆、玉米和小麦，但其应用不限于这些植物。因此，本发明提供转基因植物，其含有选自序列表中公开的核酸和/或前述序列同源物的编码胁迫相关蛋白的基因，其中环境胁迫是干旱、增加的盐或者降低或升高的温度，但本发明的申请不限于这些不利环境。例如可以获得对其它不利条件如热、空气污染、重金属和化学毒物的保护。在优选的实施方案中，环境胁迫是干旱。
本发明还提供调节植物胁迫抗性的方法，包括调节编码胁迫相关蛋白的基因在植物中的表达。本发明提供此方法可以如此实施以致提高胁迫抗性。这可以通过使用转录因子完成。特别地，本发明提供产生转基因植物的方法，该转基因植物因胁迫相关蛋白在植物中增加的表达而具有与野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性。
在胁迫条件下生长修饰的植物并且随后筛选和分析生长特征和/或代谢活性而评估植物中遗传性修饰对胁迫耐性和/或抗性的影响。此类分析技术对本领域技术人员而言众所周知。这些技术包括分析筛选后(RómppLexikon Biotechnologie，Stuttgart/New York：Georg Thieme Verlag 1992，“Screening”第701页)干重、湿重、蛋白质合成、糖合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、植物和/或作物整体、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸速率、光合作用速率等(Applications of HPLC in Biochemistry in：LaboratoryTechniques in Biochemistry和Molecular Biology，第17卷；Rehm等，1993Biotechnology，vol.3，Chapter III：Product recovery and purification，page469-714，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等，1988 Bioseparations：downstream processing for biotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992 Recovery processes for biological materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.，1988 Biochemsicalseparations，在Ulmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry中，第B3卷，第11章，第1-27页，VCH：Weinheim；和Dechow，F.J.，1989，Separation and purification techniques in biotechnology，NoyesPublications)。
对本发明一种或多种编码胁迫相关蛋白的基因的设计还可以产生胁迫相关性蛋白，其具有间接影响植物胁迫反应和/或胁迫抗性的改变的活性。例如，代谢的正常生物化学过程导致产生多种产物(例如过氧化氢和其它活性氧类)，其可以活跃地干扰这些相同的代谢过程(例如，已知过氧亚硝酸盐使酪氨酸侧链硝化，因此使某些在活性位点内具有酪氨酸的酶失活(Groves，J.T.，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3(2)：226-235)。通过优化本发明的一种或多种胁迫相关蛋白(酶)的活性，有可能改良细胞的胁迫抗性。
在本申请通篇内参考了多种公开物。所有这些公开物和这些公开物中所引用的参考文献的公开内容在本文中完整引用至本申请，以更充分地描述本发明所涉及的技术的状态。
还应当理解前述内容涉及本发明的优选实施方案并且多种改变和变化可以在其中开展而不脱离本发明的范围。本发明进一步通过如下实施例说明，这些实施例无论如何不得解释为限制性的实施例。相反，应当清楚地理解在阅读本文中的描述后，多种其它的实施方案、修改及其等效物对本领域技术人员可以不言自明而未脱离本发明精神和/或权利要求书的范围。
本发明还涉及选自序列表中公开的核酸和/或前述序列同源物的编码SRP的核酸的用途，用于产生具有对环境胁迫增加的耐性(其优选通过改变代谢活性实现)的植物细胞。所述序列还可以用于产生具有对环境胁迫增加的耐性的植物。
本发明的目的还是改变的代谢活性和/或编码SRP的核酸的用途，用作标志物选择具有对环境胁迫增加的耐性的植物或用作标志物在植物或植物细胞中检测应激，其中核酸选自序列表中公开的核酸和/或前述序列同源物。
实施例1：通过过量表达胁迫相关蛋白基因设计耐受胁迫的拟南芥菜属植物
基因克隆和拟南芥菜的转化-扩增
将Pfu DNA聚合酶或Pfu/Taq DNA聚合酶混合物(Herculase)的标准方案用于扩增方法。扩增的ORF片段通过凝胶电泳分析。每一引物由通用的5’端和ORF特异性的3’端组成，因而通用序列与正向引物和反向引物(正向引物序列含有用于酵母的EcoRI限制性位点或用于大肠杆菌的SmaI限制性位点，并且反向引物序列含有用于酵母的SmaI限制性位点或用于大肠杆菌的SacI限制性位点)不同，这通常允许成功进行单向克隆。
使用Pfu或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)的方案扩增。条件是：1×PCR缓冲液、0.2mM dNTP、100ng酿酒酵母(S288C)基因组DNA或60ng大肠杆菌K-12(MG1655)基因组DNA，25pmol正向引物、25pmol反向引物、2.5u Pfu或Herculase DNA聚合酶。首次循环在94℃对酵母3分钟，对大肠杆菌2分钟，随后94℃，30秒，对酵母55℃，30秒或对大肠杆菌60℃，30秒以及72℃，5-6分钟，共25个循环，随后在72℃，610分钟循环一次，最后在4℃保存。
表2：用于ORF扩增的正向引物和反向引物序列(SEQ ID NOS257-508，按出现先后排序)
 
基因 正向序列
b0025 ATGAAGCTGATACGCGGCATAC
b0061 ATGTTAGAAGATCTCAAACGCCA
b0141 ATGTCTAAAAAATTAGGTTTTGCCCT
b0144 ATGCTCCCGCCTTATTTTTTGTTC
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b0318 ATGAGTATAAAAAATCTACCTGCCG
b0328 ATGATGCAGTTAGTTCACTTATTTATG
b0361 ATGGATAGCGCACGCGCCCTTA
b0723 ATGAAATTGCCAGTCAGAGAATTTG
b0726 ATGCAGAACAGCGCTTTGAAAGC
 
b0880 ATGGAAAAGGGTACTGTTAAGTG
b1069 ATGAATTTATTAAAATCGCTGGCCG
b1080 ATGATTAAATTTCTCTCTGCATTAATTC
b1130 ATGCGCGTACTGGTTGTTGAAGA
b1221 ATGAGTAATCAGGAACCGGC
b1350 ATGAGCACAAAACCACTCTTCCTG
b1392 ATGACAACGTTTCATTCCTTAAC
b1557 ATGTCAAATAAAATGACTGGTTTAGTA
b1650 ATGTCATCTGAAAAACTGTATTCCC
b1717 ATGCCAAAAATTAAGACCGTACGC
b1779 ATGACTATCAAAGTAGGTATCAACG
b2164 ATGGATATAATGAGAAGTGTTGTGG
b2194 ATGAGGTTTTTATTGGGCGTGCTG
b2197 ATGAATATTCGCCGTAAAAACCG
b2231 ATGAGCGACCTTGCGAGAGAAAT
b2246 ATGACAACGGTAACGCCCACATAT
b2287 ATGGATTATACGCTCACCCGCAT
b2488 ATGCTGAAGTTACTGAAAACTATTATG
b2699 ATGGCTATCGACGAAAACAAACAG
b2733 ATGAGTGCAATAGAAAATTTCGA
b2886 ATGATGAAATCGTTAATTATCGTTAATC
b2926 ATGTCTGTAATTAAGATGACCG
b2980 ATGAAAGATGAACGTCGCCCTATT
b2987 ATGCTAAATTTATTTGTTGGCCTTGA
b3030 ATGACGCAAACTTATAACGCTG
b3066 ATGGCTGGACGAATCCCACGC
b3067 ATGGAGCAAAACCCGCAGTCAC
b3358 ATGTGGCGCAGACTGATTTATCAC
b3604 ATGATTGTTTTACCCAGACGCCTG
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b3811 ATGACCGATTTACACACCGATGTA
 
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YBR101C ATGGAAAAGCTATTACAGTGGTCTA
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基因 反向序列
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YLR128W TTATTGCTGATCCTGTAAGCACTCA
YLR354C TTAAGCGGTAACTTTCTTTTCAATCA
YLR406C TTAAGCATCTTCTTCAACGACAACG
YLR414C TCAAATCAATGGTTTTTCCTCAATTG
YML090W TCAATTACAAATCCATGGATTAAGTTG
YMR217W TCATTCCCATTCAACAGTTGCAGG
YNL010W CTAATTTTCCATCAATTCAGCGACT
YNL065W TTAATTATGATTATCGTTCTGGTCTC
YNL206C TCAATCGTATTCTACTCCGGATCC
YNL276C TTACATTGCCATCACACGTAAACTG
YNL279W TCAGTCAAAGGTGGCTTTGCGAA
YNR015W TTATATATCTGTGGGAAGGGGTACA
YOL055C CTACTCGTATTCTAGCGCAGCG
YPL091W TCATCTCATAGTAACCAATTCTTCTG
YPL151C CTAAAATCTTTTGGCGCTTAAGTTG
YPL197C CTATTGAAGTTGATTGAACCATACGT
YPL224C TTACATCAACAAACTCGACGTCCA
YPR055W TCATTTTTCGTTTGCAGTATGGACA
优选的用于酵母的双元载体1bxbigResgen和用于大肠杆菌的双元载体1bxSuperCoLic以修饰的pPZP双元载体骨架(包含用于细菌选择的卡那霉素基因；Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994)为基础，在其T-DNA上携带受mas1′启动子(Velten等，1984，EMBOJ.3，2723-2730；Mengiste，Amedeo和Paszkowski，1997，PlantJ.，12，945-948)驱动的选择标志bar基因(De Block等，1987，EMBO J.6，2513-2518)。此外，该T-DNA在克隆盒前含有用于酵母的强效双重35S启动子(Kay等，1987，Science 236，1299-1302)或用于大肠杆菌的超级启动子(Ni等，1995，PlantJournal 7，661-676)，此后为nos-终止子(Depicker A.StachelS.Dhaese P.ZambryskiP.Goodman HM.Nopaline synthase：transcript mapping andDNA sequence.Journal of Molecular & Applied Genetics.1(6)：561-73，1982.)。该克隆盒分别由如下序列组成：
酵母：
5`-GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCAATTCCCGGGGATC-3(SEQID NO：533)或
大肠杆菌：5、-TTG CTC TTC CAT GGC AAT GAT TAA TTA ACGAAG AGC AA-3′(SEQ ID NO：534)。
其它选择标志系统，如AHAS标志或其它启动子例如超级启动子(见以上)、35S启动子(见以上)、遍在蛋白启动子(Callis等，J.Biol.Chem.，1990，265：12486-12493；US 5,510,474；US 6,020,190；Kawalleck等，Plant.Molecular Biology，1993，21：673-684)或34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)类似地用于本发明并且对本领域技术人员是已知的。载体使用供应商(MBI Fermentas，德国)提供的标准方案以EcoR和SmaI线性化用于酵母或以SmaI和SacI线性化用于大肠杆菌，并且使用Qiagen柱(Qiagen，Hilden，德国)纯化。
连接和转化
该ORF片段(～100ng)使用供应商(MBI Fermentas，德国)提供的标准方案通过EcoRI和SmaI消化用于酵母并且通过SmaI和SacI消化用于大肠杆菌，使用Qiagen柱(Qiagen，Hilden，德国)纯化并且使用标准方法(Maniatis等)连接至双元载体系统(～30ng)的克隆盒。
在内部EcoRI、SmaI和SacI限制性位点的情况下，采用平末端克隆方法。直接将未消化的ORF片段纯化并连接至双元载体的克隆盒内。在该情况下，EcoRI位点通过Klenow反应再次补平并且SacI位点通过PfuDNA聚合酶钝端化。
使用标准热休克方案(Maniatis等)将连接产物转化至大肠杆菌(DH5α)。转化的集落在37℃在LB培养基上生长并受相应抗生素(Km)选择16小时。阳性克隆使用载体特异性引物和相应的ORF特异性引物的组合通过对照PCR反应加以鉴定。
质粒的制备
质粒DNA使用标准方案(Qiagen Hilden，德国)自阳性克隆制备。
农杆菌的转化
使用热休克方案或电穿孔方案将质粒转化至根瘤农杆菌(GV3101pMP90；Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)。转化的集落在28℃在YEP培养基上生长并受相应抗生素(Rif/Gent/Km)选择2日。将这些农杆菌培养物用于植物转化。
将拟南芥菜根据Bechtold 1993的标准条件((Bechtold，N.，Ellis，J.，Pelletier，G.1993.In planta Agrobacterium mediated gene transfer byinfiltration of Arabidopsis thaliana plants，C.R.Acad.Sci.Paris.316：1194-1199)；Bent等1994(Bent，A.，Kunkel，B.N.，Dahlbeck，D.，Brown，K.L.，Schmidt，R.，Giraudat，J.，Leung，J.，和Staskawicz，B.J.1994；PPCS2 of Arabidopsis thaliana：A leucin-rich repeat class of plant diseaseresistant genes；Science 265：1856-1860)生长并转化。
将转基因的拟南芥植物分别在York生长室内在含有4:1(v/v)土壤和石英砂混合物的花盆内生长。标准生长条件是：16h光照和8h黑暗的光周期、20℃、60％相对湿度以及光流密度150μE。为诱导萌发，将播种的种子在4℃黑暗中培养3日。植物每日浇水直至它们大约3周龄为止，此时干旱通过停止浇水产生。与此同时，将相对湿度以每隔一天10％减量缩减至20％。在停止浇水大约12日后，大多数植物显示损伤视观症状，如萎蔫和叶变黄，因而耐受或抗性的植物判定为视观饱满并呈健康的绿颜色。将植物与临近植物相比连续3日，就干旱损伤症状进行评分。
进行了三个连续的实验。在第一实验中，将10个独立的T2株系播种用于受测试的每一基因。测定不显示损伤视观症状的植物的百分数。在第二实验中，对第一实验中已评定为耐受的株系根据相同实验方法进行验证筛选。在本实验中，将每一耐受株系的植物如前生长并处理。在第三实验中，将最耐受株系中至少7个重复体如前生长并处理。测定在野生型对照于视观上已死亡后干旱幸存者维持的平均天数和最大天数。
在第一实验中，在干旱12日后，试验中非转基因的拟南芥菜对照和表达其它转基因的大多数转基因株系显示极端的胁迫视观症状，包括坏死和细胞死亡。数个表达基因的植株如其饱满外观和维持绿色所示保留了生活力。
第二实验对每一基因比较了较少数量的的独立的转基因株系，但比较了每一独立转化事件中较大数量的子代。此实验证实前述结果。那些含有编码特异性SRP的酵母基因的株系比对照存活更长时间。结果在表3概述。
在第三实验中，一些株系以多个重复体进行测试(每株系4-80个植株)。测定了比野生型存活更长时间的主要株系的植株的平均天数，即数字“1”表示过量表达该ORF的植物比野生型平均而言多存活1天。此值对于该栏内的野生型是“0”。结果在表3中概括。
表3：在对3周龄植物施加干旱胁迫后的转基因拟南芥的干旱耐受性，其中所述的转基因拟南芥表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的多种编码SRP的基因。将干旱耐受性对于所示数目的转基因植物(受测试的植物)度量为在对照(未转化的野生型)已经死亡后存活的转基因植物的平均天数(WT死亡后的平均存活天数)。
 
基因 每株系所测试植物的数目 每ORF所测试株系的数目 WT死亡后的平均存活天数
b0025 19 2 0.6
b0061 19 2 0.9
 
b0141 28 3 0.5
b0144 30 3 0.8
b0148 29 3 0.4
b0318 10 1 0.5
b0328 20 2 0.4
b0361 10 1 0.5
b0723 29 3 0.6
b0726 29 3 0.4
b0880 29 3 0.4
b1069 29 3 0.4
b1080 20 2 0.9
b1130 29 3 1.1
b1221 25 3 0.4
b1350 30 3 0.6
b1392 19 2 0.4
b1557 30 3 0.8
b1650 10 1 0.7
b1717 30 3 0.4
b1779 30 3 1.0
b2164 30 3 0.5
b2194 30 3 0.3
b2197 10 1 0.3
b2231 30 3 0.9
b2246 30 3 0.5
b2287 10 1 0.4
b2488 10 1 0.2
b2699 28 3 0.5
b2733 30 3 0.7
b2886 29 3 0.3
b2926 29 3 0.4
b2980 20 2 0.7
 
b3030 30 3 0.6
b3066 30 3 0.3
b3067 30 3 0.6
b3604 20 3 0.7
b3687 19 2 1.4
b3811 30 3 0.4
b4074 29 3 0.6
b4090 10 1 1.5
b4351 28 3 0.5
YAL005C 11 2 1.7
YAL025C 29 3 0.3
YAL047C 29 3 0.6
YAR028W 20 2 0.3
YAR068W 16 2 0.3
YBL021C 10 1 0.4
YBR101C 15 2 0.5
YBR128C 19 2 1.1
YBR176W 7 1 0.7
YBR204C 25 3 0.2
YBR243C 10 1 0.9
YDL199C 5 1 0.6
YDL212W 30 3 0.3
YDL242W 16 2 0.3
YDL248W 10 1 0.3
YDR446W 18 2 0.9
YDR467C 19 2 0.3
YDR476C 29 3 0.4
YDR524C 4 2 1.0
YDR526C 30 3 0.7
YEL020W-A 5 2 2.8
YEL059W 6 1 1.2
 
YER075C 27 3 0.6
YER085C 26 3 0.5
YER148W 31 4 0.5
YER159C 4 1 0.8
YER185W 27 2 0.7
YFL029C 10 1 0.7
YFL038C 30 3 0.3
YGL028C 29 3 1.0
YGL186C 10 1 0.2
YGL196W 10 1 0.3
YGL217C 10 1 1.3
YGR006W 7 1 0.4
YGR070W 20 2 0.3
YGR111W 20 2 0.4
YGR182C 9 1 0.2
YHR005C-A 30 3 0.3
YHR169W 18 2 0.8
YHR203C 23 3 0.4
YIL012W 20 3 0.6
YIL046W 22 3 0.7
YIL059C 17 2 1.9
YIL096C 3 1 1.3
YIL100W 28 4 1.2
YIL128W 27 3 0.7
YIL166C 37 4 0.4
YIL172C 20 2 0.9
YJL021C 25 3 0.4
YJL038C 30 3 0.2
YJL151C 27 3 0.5
YJR034W 28 3 0.4
YJR078W 17 2 0.2
 
YJR153W 18 3 0.8
YKL026C 16 2 0.3
YKL047W 40 5 0.3
YKL075C 10 2 0.9
YKL081W 13 2 0.4
YKL096W-A 24 3 0.3
YLR104W 35 4 0.9
YLR128W 27 3 0.6
YLR354C 25 3 1.0
YLR406C 18 3 0.4
YLR414C 23 3 0.5
YML090W 26 3 0.3
YMR217W 15 2 0.5
YNL010W 17 3 0.9
YNL065W 30 3 0.7
YNL206C 16 3 0.3
YNL276C 7 2 1.0
YNL279W 25 3 0.4
YNR015W 24 2 0.9
YOL055C 22 3 0.8
YPL197C 29 3 0.4
YPL224C 30 3 0.3
YPR055W 28 3 0.1
表4：在对第三次实验中的3周龄植物施加干旱胁迫后的转基因拟南芥的干旱耐受性，其中所述的转基因拟南芥表达来自酿酒酵母或大肠杆菌中选择的编码SRP的基因。对于转基因植物(测试的植物)的所示数字，将干旱耐性度量为转基因植物在对照(未转化的野生型)死亡后存活的平均天数(WT死亡后存活的平均天数)。
 
基因 每株系所测试植物的数目 每ORF所测试株系的数目 WT死亡后的平均存活天数
b2699 59 12 2.6
b2987 122 12 1.5
b3358 56 5 2.8
YAL005C 36 8 1.6
YBL100C 45 9 2.0
YBL109W 44 7 1.4
YBR004C 27 9 1.5
YBR204C 38 8 1.7
YDR524C 6 3 1.8
YER185W 31 7 1.6
YFL029C 68 5 0.9
YGR070W 72 10 1.0
YIL172C 46 10 1.4
YJL010C 40 7 2.6
YJL151C 46 9 2.8
YJR078W 6 3 2.2
YJR153W 26 2 1.5
YMR217W 39 8 1.2
YNR015W 39 7 2.4
YPL091W 37 6 1.7
YPL151C 26 8 2.0
YPR055W 47 10 0.8
Figure A200680036538E01151
Figure A200680036538E01152
Figure A200680036538E01161
Figure A200680036538E01181
Figure A200680036538E01191
Figure A200680036538E01201
Figure A200680036538E01211
Figure A200680036538E01221
Figure A200680036538E01231
Figure A200680036538E01241
Figure A200680036538E01261
Figure A200680036538E01271
Figure A200680036538E01281
Figure A200680036538E01291
Figure A200680036538E01311
Figure A200680036538E01321
Figure A200680036538E01331
Figure A200680036538E01341
Figure A200680036538E01351
Figure A200680036538E01361
Figure A200680036538E01371
Figure A200680036538E01381
Figure A200680036538E01391
Figure A200680036538E01401
Figure A200680036538E01411
Figure A200680036538E01421
Figure A200680036538E01431
Figure A200680036538E01441
Figure A200680036538E01451
Figure A200680036538E01461
Figure A200680036538E01471
Figure A200680036538E01481
Figure A200680036538E01491
Figure A200680036538E01501
Figure A200680036538E01511
Figure A200680036538E01521
Figure A200680036538E01541
Figure A200680036538E01551
Figure A200680036538E01561
Figure A200680036538E01571
Figure A200680036538E01581
Figure A200680036538E01591
Figure A200680036538E01621
Figure A200680036538E01631
Figure A200680036538E01641
Figure A200680036538E01651
Figure A200680036538E01661
Figure A200680036538E01681
Figure A200680036538E01691
Figure A200680036538E01701
Figure A200680036538E01711
Figure A200680036538E01721
Figure A200680036538E01731
Figure A200680036538E01741
Figure A200680036538E01751
Figure A200680036538E01761
Figure A200680036538E01771
Figure A200680036538E01781
Figure A200680036538E01791
Figure A200680036538E01801
Figure A200680036538E01821
Figure A200680036538E01851
Figure A200680036538E01861
Figure A200680036538E01891
Figure A200680036538E01901
Figure A200680036538E01911
Figure A200680036538E01921
Figure A200680036538E01931
Figure A200680036538E01941
Figure A200680036538E01951
Figure A200680036538E01961
Figure A200680036538E01971
Figure A200680036538E01981
Figure A200680036538E01991
Figure A200680036538E02001
Figure A200680036538E02011
Figure A200680036538E02021
Figure A200680036538E02031
Figure A200680036538E02041
Figure A200680036538E02051
Figure A200680036538E02061
Figure A200680036538E02071
Figure A200680036538E02081
Figure A200680036538E02091
Figure A200680036538E02101
Figure A200680036538E02111
Figure A200680036538E02121
Figure A200680036538E02131
Figure A200680036538E02151
Figure A200680036538E02171
Figure A200680036538E02181
Figure A200680036538E02191
Figure A200680036538E02201
Figure A200680036538E02221
Figure A200680036538E02231
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Figure A200680036538E02291
Figure A200680036538E02311
Figure A200680036538E02321
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Figure A200680036538E02341
Figure A200680036538E02351
Figure A200680036538E02361
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Figure A200680036538E02391
Figure A200680036538E02401
Figure A200680036538E02411
Figure A200680036538E02421
Figure A200680036538E02431
Figure A200680036538E02441
Figure A200680036538E02451
Figure A200680036538E02461
Figure A200680036538E02471
Figure A200680036538E02481
Figure A200680036538E02491
Figure A200680036538E02501
Figure A200680036538E02511
Figure A200680036538E02521
Figure A200680036538E02541
Figure A200680036538E02551
Figure A200680036538E02561
Figure A200680036538E02571
Figure A200680036538E02581
Figure A200680036538E02591
Figure A200680036538E02601
Figure A200680036538E02611
Figure A200680036538E02621
Figure A200680036538E02631
Figure A200680036538E02641
Figure A200680036538E02651
Figure A200680036538E02661
Figure A200680036538E02671
Figure A200680036538E02681
Figure A200680036538E02691
Figure A200680036538E02711
Figure A200680036538E02721
Figure A200680036538E02761
Figure A200680036538E02771
Figure A200680036538E02791
Figure A200680036538E02821
Figure A200680036538E02831
Figure A200680036538E02851
Figure A200680036538E02861
Figure A200680036538E02881
Figure A200680036538E02901
Figure A200680036538E02911
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Claims (47)

1.经转化的植物细胞，其与相应非转化的野生型植物细胞相比具有改变的代谢活性，其中用编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸转化改变代谢活性并且其导致与相应非转化的野生型植物细胞相比增加的环境胁迫耐受性和/或抗性。
2.权利要求1所述的转化的植物细胞，其中涉及一种或多种代谢物的代谢活性受到改变，所述代谢物选自2，3-二甲基-5-植基醌醇、2-羟基-棕榈酸、3，4-二羟基苯丙氨酸(＝多巴)、3-羟基-棕榈酸、5-氧代脯氨酸、丙氨酸、α亚麻酸(c18:3(c9，c12，c15))、α-生育酚、氨基己二酸、葡糖酐、精氨酸、天冬氨酸、β-阿朴胡萝卜素醛、β-胡萝卜素、β-谷甾醇、β-生育酚、(Δ-7-顺，10-顺)-十六碳二烯酸、十六碳三烯酸、十七烷酸、Δ-15-顺-二十四碳烯酸、阿魏酸、菜油甾醇、蜡酸(c26:0)、瓜氨酸、隐黄质、二十碳烯酸(20:1)、果糖、延胡索酸、半乳糖、γ-氨基丁酸、γ-生育酚、葡糖酸、葡萄糖、谷氨酸、谷胺酰胺、甘油酸、甘油醛、甘油、甘油-3-磷酸、甘氨酸、高丝氨酸、肌醇、异亮氨酸、异麦芽糖、异戊烯焦磷酸、亮氨酸、二十四烷酸(c24:0)、亚油酸(c18:2(c9，c12))、叶黄素(luteine)、番茄红素、苹果酸、甘露糖、甲硫氨酸、甲基呋喃半乳糖苷、甲基吡喃半乳糖苷、甲基吡喃半乳糖苷、棕榈酸(c16:0)、苯丙氨酸、磷酸、脯氨酸、腐胺、丙酮酸、棉子糖、核糖酸、丝氨酸、莽草酸、芥子酸、硬脂酸(c18:0)、琥珀酸、蔗糖、苏氨酸、三十烷酸、色氨酸、酪氨酸、泛醌(ubichinone)、udp-葡萄糖、缬氨酸、玉米黄质。
3.权利要求1或2所述的转基因植物细胞，其中用编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸转化植物改变所述代谢活性，其中所述核酸选自：a)编码在序列表中公开的多肽之一或其片段的核酸分子，其中所述多肽或其片段赋予生物或其部分中改变的代谢活性；b)核酸分子，其包含在序列表中公开的核酸分子之一；c)核酸分子，其序列可以因遗传密码的简并性而从由(a)或(b)的核酸分子编码的多肽序列中推导并且该核酸分子赋予生物或其部分中改变的代谢活性；d)编码多肽的核酸分子，其中所述的多肽与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；e)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并赋予生物或其部分中改变的代谢活性；f)核酸分子，其包含这样的核酸分子，该核酸分子通过使用表2中的引物扩增来自cDNA文库或基因组文库中的核酸分子而得到并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；g)编码多肽的核酸分子，其中所述的多肽借助针对该多肽的单克隆抗体予以分离，其中该多肽由(a)至(f)的核酸分子之一编码并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；和h)核酸分子，它是通过用包含(a)至(g)的核酸分子的序列之一或其片段的探针在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库可得到的，其中所述的片段具有在(a)至(g)中表征的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；或包含与之互补的序列。
4.权利要求3所述的转基因植物细胞，其中环境胁迫选自盐度、干旱、温度、金属、化学品、病原胁迫和氧化胁迫或其组合。
5.权利要求1-4任一项中所述的转基因植物细胞，其来自单子叶植物。
6.权利要求1-5任一项中所述的转基因植物细胞，其来自双子叶植物。
7.权利要求1-6任一项中所述的转基因植物细胞，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥。
8.权利要求1-4任一项中所述的转基因植物细胞，其来自裸子植物。
9.权利要求1-4或6任一项中所述的转基因植物细胞，其中植物选自云杉、松和冷杉。
10.转基因植物，其从根据权利要求1-7任一项中所述的植物细胞产生并且是单子叶植物或双子叶植物。
11.权利要求10所述的转基因植物，其选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥。
12.转基因植物，其从根据权利要求1-4、8或9任一项中所述的植物细胞产生并且是裸子植物。
13.权利要求12所述的转基因植物，其选自云杉、松和冷杉。
14.由权利要求10-13任一项中所述的转基因植物产生的种子，其中种子就赋予改变的代谢活性的转基因，导致与相应非转化的野生型植物相比增加的环境胁迫耐受性而言是遗传纯合的。
15.分离的核酸分子，其包含选自如下的核酸分子：a)编码在序列表中公开的多肽或其片段的核酸分子，其中所述多肽或其片段赋予生物或其部分中改变的代谢活性；b)核酸分子，其包含在序列表中公开的核酸分子；c)核酸分子，其序列可以因遗传密码的简并性而从由(a)或(b)的核酸分子编码的多肽序列中推导并且该核酸分子赋予生物或其部分中改变的代谢活性；d)编码多肽的核酸分子，其中所述的多肽与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；e)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并赋予生物或其部分中改变的代谢活性；f)核酸分子，其包含这样的核酸分子，该核酸分子通过使用表2内所示引物扩增来自cDNA文库或基因组文库中的核酸分子而得到并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；g)编码多肽的核酸分子，其中所述的多肽借助针对该多肽的单克隆抗体予以分离，其中该多肽由(a)至(f)的核酸分子之一编码并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；和h)核酸分子，它是通过用包含(a)至(g)的核酸分子的序列之一或其片段的探针在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库可得到的，其中所述的片段具有在(a)至(g)中表征的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性。
16.分离的核酸分子，包含选择如下的核酸分子：a)编码在序列表中公开的多肽或其片段的核酸分子，其中所述多肽或其片段赋予生物或其部分中改变的代谢活性；b)核酸分子，其包含在序列表中公开的核酸分子；c)核酸分子，其序列可以因遗传密码的简并性而从由(a)或(b)的核酸分子编码的多肽序列中推导并且该核酸分子赋予生物或其部分中改变的代谢活性；d)编码多肽的核酸分子，其中所述的多肽与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；e)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并赋予生物或其部分中改变的代谢活性；f)核酸分子，其包含这样的核酸分子，该核酸分子通过使用表2内所示引物扩增来自cDNA文库或基因组文库中的核酸分子而得到并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；g)编码多肽的核酸分子，其中所述的多肽借助针对该多肽的单克隆抗体予以分离，其中该多肽由(a)至(f)的核酸分子之一编码并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性；和h)核酸分子，它是通过用包含(a)至(g)的核酸分子的序列之一或其片段的探针在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库可得到的，其中所述的片段具有在(a)至(a)中表征的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt并且赋予生物或其部分中改变的代谢活性。
17.赋予权利要求15或16的核酸分子表达的核酸构建体，其包含一种或多种调节元件，其中编码SRP的核酸在宿主细胞中的表达导致改变的代谢活性，导致与相应非转化的野生型宿主细胞相比增加的环境胁迫耐受性。
18.载体，其包含如权利要求15或16中所述的核酸分子或权利要求17的核酸构建体，其中编码SRP的核酸在宿主细胞中的表达导致改变的代谢活性，导致与相应非转化的野生型宿主细胞相比增加的环境胁迫耐受性。
19.宿主细胞，其已经用如权利要求18中所述载体或如权利要求15或16中所述核酸分子或权利要求17的核酸构建体稳定或瞬时转化。
20.分离的胁迫相关性蛋白(SRP)，其选自序列表中公开的序列和/或其同源物。
21.权利要求20所述的分离的胁迫相关性蛋白(SRP)，其选自酵母，优选酿酒酵母，或大肠杆菌、欧洲油菜、大豆或稻。
22.产生与相应非转化野生型植物细胞相比具有改变的代谢活性的转基因植物的方法，其中通过表达编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸改变代谢活性，并导致与相应非转化的野生型植物细胞相比增加的环境胁迫耐受性和/或抗性，所述方法包括用根据权利要求18的表达载体转化植物细胞并从植物细胞产生与相应非转化野生型植物相比具有增加的环境胁迫耐受性的转基因植物。
23.权利要求22所述的方法，其中编码SRP的核酸选自序列表中公开的核酸和/或前述序列的同源物。
24.权利要求22或23任一项中所述的方法，其中编码SRP的核酸与序列表中公开的核酸之一至少约50％同源。
25.修饰植物的胁迫耐受性的方法，其包括修饰植物中SRP的表达水平。
26.权利要求25所述的方法，其中编码SRP的核酸选自序列表中公开的核酸和/或前述序列的同源物。
27.权利要求25或26任一项中所述的方法，其中编码SRP的核酸与序列表中公开的核酸之一至少约50％同源。
28.权利要求25-27任一项中所述的方法，其中使用根据权利要求17或18任一项的表达载体。
29.权利要求25-28任一项中所述的方法，其中胁迫耐受性降低。
30.权利要求25-29任一项中所述的方法，其中所述植物是转基因的。
31.权利要求25-30任一项中所述的方法，其中用指导SRP表达的诱导型启动子转化所述植物。
32.权利要求25-31任一项中所述的方法，其中所述启动子组织特异性的。
33.权利要求25-32任一项中所述的方法，其中启动子是在发育上被调节的。
34.权利要求25-33任一项中所述的方法，其中通过施用与编码SRP的核酸的调节区互补的靶向核酸序列和/或通过转录因子和/或通过锌指蛋白修饰SRP表达。
35.检测植物细胞或植物中环境胁迫的方法，其包括筛选植物细胞的与非胁迫条件相比改变的代谢活性。
36.筛选植物细胞或植物的增加的环境胁迫耐受性和/或抗性的方法，其包括筛选植物细胞在胁迫条件下与非胁迫条件相比改变的代谢活性。
37.将植物细胞或植物向增加的环境胁迫耐受性和/或抗性方向育种的方法，其包括筛选植物细胞在胁迫条件下与非胁迫条件相比改变的代谢活性，并选择具有增加的环境胁迫耐受性和/或抗性的那些植物细胞。
38.权利要求35-37之一所述的方法、其中改变涉及一种或多种代谢物的代谢物活性，所述代谢物选自2，3-二甲基-5-植基醌醇、2-羟基-棕榈酸、3，4-二羟基苯丙氨酸(＝多巴)、3-羟基-棕榈酸、5-氧代脯氨酸、丙氨酸、α亚麻酸(c18:3(c9，c12，c15))、α-生育酚、氨基己二酸、葡糖酐、精氨酸、天冬氨酸、β-阿朴胡萝卜素醛、β-胡萝卜素、β-谷甾醇、β-生育酚、(Δ-7-顺，10-顺)-十六碳二烯酸、十六碳三烯酸、十七烷酸、Δ-15-顺-二十四碳烯酸、阿魏酸、菜油甾醇、蜡酸(c26:0)、瓜氨酸、隐黄质、二十碳烯酸(20:1)、果糖、延胡索酸、半乳糖、γ-氨基丁酸、γ-生育酚、葡糖酸、葡萄糖、谷氨酸、谷胺酰胺、甘油酸、甘油醛、甘油、甘油-3-磷酸、甘氨酸、高丝氨酸、肌醇、异亮氨酸、异麦芽糖、异戊烯焦磷酸、亮氨酸、二十四烷酸(c24:0)、亚油酸(c18:2(c9，c12))、叶黄素(luteine)、番茄红素、苹果酸、甘露糖、甲硫氨酸、甲基呋喃半乳糖苷、甲基吡喃半乳糖苷、甲基吡喃半乳糖苷、棕榈酸(c16:0)、苯丙氨酸、磷酸、脯氨酸、腐胺、丙酮酸、棉子糖、核糖酸、丝氨酸、莽草酸、芥子酸、硬脂酸(c18:0)、琥珀酸、蔗糖、苏氨酸、三十烷酸、色氨酸、酪氨酸、泛醌(ubichinone)、udp-葡萄糖、缬氨酸、玉米黄质。
39.权利要求35-38之一所述的方法，其中用编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸转化实现改变的代谢活性。
40.权利要求35-39之一所述的方法，其中用一种或多种编码胁迫相关性蛋白(SRP)的核酸转化实现改变的代谢活性，所述核酸选自序列表中公开的核酸和/或前述序列的同源物的至少一种。
41.编码SRP的核酸用于制备具有增加的环境胁迫耐受性的植物细胞的用途，其中所述编码SRP的核酸选自序列表中公开的核酸和/或前述序列的同源物。
42.改变的代谢活性和/或编码SRP的核酸的用途，用作选择具有增加的环境胁迫耐受性的植物或植物细胞的标志物，其中所述编码SRP的核酸选自序列表中公开的核酸和/或前述序列的同源物或其部分。
43.改变的代谢活性和/或编码SRP的核酸的用途，用作检测植物或植物细胞中胁迫的标志物，其中所述编码SRP的核酸选自序列表中公开的核酸和/或前述序列的同源物或其部分。
44.赋予权利要求15或16的核酸分子表达的核酸构建体，其包含一种或多种调节元件，其中编码SRP的核酸在宿主细胞中的表达导致与相应非转化的野生型宿主细胞相比增加的环境胁迫耐受性。
45.载体，其包含如权利要求15或16中所述的核酸分子或权利要求44的核酸构建体，其中编码SRP的核酸在宿主细胞中的表达导致与相应非转化的野生型宿主细胞相比增加的环境胁迫耐受性。
46.包含权利要求44的核酸构建体或权利要求45的载体的植物细胞。
47.包含权利要求46的细胞的植物。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559673A (zh) * 2010-12-16 2012-07-11 华中农业大学 甘蓝型油菜缺磷特异诱导表达的启动子
CN103509876A (zh) * 2013-10-24 2014-01-15 上海辰山植物园 一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法
CN112079903A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种错配结合蛋白的突变体及其编码基因
CN113004420A (zh) * 2019-12-19 2021-06-22 华东理工大学 乳酸光学探针及其制备方法和应用
CN113234734A (zh) * 2021-03-22 2021-08-10 成都大学 一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用
CN114214341A (zh) * 2021-12-30 2022-03-22 山西大学 番茄SlSERAT1;1基因或其片段在植物发育过程中的应用
CN116536345A (zh) * 2023-05-16 2023-08-04 北京林业大学 一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102094006B (zh) * 2009-12-11 2013-03-06 上海市农业科学院 一种甘蓝型油菜erf-b3家族转录因子基因及其制备方法
WO2013066144A1 (en) * 2011-10-31 2013-05-10 Felda Agricultural Services Sdn. Bhd. Markers for ganoderma disease diagnosis and a use of thereof
UA116097C2 (uk) * 2011-12-11 2018-02-12 Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре Спосіб модуляції провідності устячка рослини
CN103882025A (zh) * 2012-12-21 2014-06-25 中国科学院沈阳应用生态研究所 双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列及其克隆方法
CN110628804B (zh) * 2019-06-24 2021-04-13 河北工业大学 一种构建对异丁醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法
CN113755624B (zh) * 2021-08-24 2023-06-23 江汉大学 用于木薯品种鉴定的mnp标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4024222A (en) 1973-10-30 1977-05-17 The Johns Hopkins University Nucleic acid complexes
US4283393A (en) 1979-03-13 1981-08-11 Merck & Co., Inc. Topical application of interferon inducers
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
DK162399C (da) 1986-01-28 1992-03-23 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden
JPS62291904A (ja) 1986-06-12 1987-12-18 Namiki Precision Jewel Co Ltd 永久磁石の製造方法
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
KR0154872B1 (ko) 1987-12-21 1998-10-15 로버트 에이. 아미테이지 발아하는 식물종자의 아크로박테리움 매개된 형질전환
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
EP0342926B1 (en) 1988-05-17 1994-09-28 Mycogen Plant Science, Inc. Plant ubiquitin promoter system
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
CA1341467C (en) 1988-07-29 2004-12-07 John C. Rogers Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
WO1990011361A1 (en) 1989-03-17 1990-10-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company External regulation of gene expression
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5086169A (en) 1989-04-20 1992-02-04 The Research Foundation Of State University Of New York Isolated pollen-specific promoter of corn
US5225347A (en) 1989-09-25 1993-07-06 Innovir Laboratories, Inc. Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
DK0472712T3 (da) 1990-03-16 2002-01-14 Calgene Llc Sekvenser, der præferentielt eksprimeres i tidlig frøudvikling og dertil relaterede fremgangsmåder
AU651101B2 (en) 1990-04-18 1994-07-14 Plant Genetic Systems N.V. Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
AU2781892A (en) 1991-10-07 1993-05-03 Ciba-Geigy Ag Particle gun for introducing dna into intact cells
TW261517B (zh) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
FR2685346B1 (fr) 1991-12-18 1994-02-11 Cis Bio International Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications.
DE4208050A1 (de) 1992-03-13 1993-09-23 Bayer Ag Azolylmethyl-fluorcyclopropyl-derivate
CA2092069A1 (en) 1992-03-27 1993-09-28 Asako Iida An expression plasmid for seeds
ATE207962T1 (de) 1992-04-13 2001-11-15 Syngenta Ltd Dna-konstruktionen und diese enthaltende pflanzen
US5496698A (en) 1992-08-26 1996-03-05 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method of isolating ribozyme targets
CA2139661C (en) 1992-07-09 2001-02-20 Rebecca Louise Allen Maize pollen-specific polygalacturonase gene
JPH0662870A (ja) 1992-08-18 1994-03-08 Mitsui Giyousai Shokubutsu Bio Kenkyusho:Kk 大豆ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び５’非翻訳領域
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
NZ278490A (en) 1993-12-09 1998-03-25 Univ Jefferson Chimeric polynucleotide with both ribo- and deoxyribonucleotides in one strand and deoxyribonucleotides in a second strand
AU704601B2 (en) 1994-01-18 1999-04-29 Scripps Research Institute, The Zinc finger protein derivatives and methods therefor
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US5470359A (en) 1994-04-21 1995-11-28 Pioneer Hi-Bred Internation, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
USRE45721E1 (en) 1994-08-20 2015-10-06 Gendaq, Ltd. Relating to binding proteins for recognition of DNA
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5689040A (en) 1995-02-23 1997-11-18 The Regents Of The University Of California Plant promoter sequences useful for gene expression in seeds and seedlings
US5952489A (en) 1995-07-05 1999-09-14 Sapporo Breweries Limited Tissue-specific promoter
DE19626564A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Hoechst Ag Genetische Transformation von Ciliatenzellen durch Microcarrier-Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln
US5981841A (en) 1996-08-30 1999-11-09 Monsanto Company Early seed 5' regulatory sequence
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US6642437B1 (en) 1997-09-30 2003-11-04 The Regents Of The University Of California Production of proteins in plant seeds
DE19743683A1 (de) 1997-10-02 1999-04-08 Basf Ag Verfahren zur Änderung der Substratspezifität von Enzymen
EP0927761A3 (de) * 1997-12-23 2001-09-05 Basf Aktiengesellschaft Gene der Purinbiosyntese aus Ashbya gossypii und deren Verwendung in der mikrobiellen Riboflavinsynthese
US6004804A (en) 1998-05-12 1999-12-21 Kimeragen, Inc. Non-chimeric mutational vectors
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
GB9915126D0 (en) 1999-06-30 1999-09-01 Imp College Innovations Ltd Control of gene expression
EP1276869A2 (en) 2000-01-21 2003-01-22 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
ES2295230T3 (es) * 2000-04-07 2008-04-16 Basf Plant Science Gmbh Proteina fosfatasa relacionada con el estres y metodos de uso en las plantas.
WO2002077183A2 (en) * 2001-03-21 2002-10-03 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
EP2361977A1 (en) * 2003-04-15 2011-08-31 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response, and transgenic plant cells transformed with the same
WO2006076423A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559673A (zh) * 2010-12-16 2012-07-11 华中农业大学 甘蓝型油菜缺磷特异诱导表达的启动子
CN102559673B (zh) * 2010-12-16 2013-07-17 华中农业大学 甘蓝型油菜缺磷特异诱导表达的启动子
CN103509876A (zh) * 2013-10-24 2014-01-15 上海辰山植物园 一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法
CN103509876B (zh) * 2013-10-24 2019-09-03 上海辰山植物园 一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法
CN112079903B (zh) * 2019-06-14 2022-11-18 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种错配结合蛋白的突变体及其编码基因
CN112079903A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种错配结合蛋白的突变体及其编码基因
CN113004420A (zh) * 2019-12-19 2021-06-22 华东理工大学 乳酸光学探针及其制备方法和应用
CN113004420B (zh) * 2019-12-19 2023-02-24 华东理工大学 乳酸光学探针及其制备方法和应用
CN113234734A (zh) * 2021-03-22 2021-08-10 成都大学 一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用
CN113234734B (zh) * 2021-03-22 2022-10-25 成都大学 一种可提高植物抗性的甜橙基因CsMYB30及其应用
CN114214341A (zh) * 2021-12-30 2022-03-22 山西大学 番茄SlSERAT1;1基因或其片段在植物发育过程中的应用
CN114214341B (zh) * 2021-12-30 2023-12-26 山西大学 番茄SlSERAT1;1基因或其片段在植物发育过程中的应用
CN116536345A (zh) * 2023-05-16 2023-08-04 北京林业大学 一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法
CN116536345B (zh) * 2023-05-16 2024-01-26 北京林业大学 一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法

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WO2007020198A2 (en) 2007-02-22

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