CN116536345B - 一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法 - Google Patents

一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法，属于基因改造技术领域。本发明利用了集胞藻中苯丙氨酸密码子的简并性，利用基因工程改造的方法改造了氯霉素抗性基因中的苯丙氨酸对应的偏好与稀有密码子的比例，操控了抗生素基因的表达效率。该方法建立了偏好/稀有密码子比例‑对应氨基酸抗性基因翻译‑细胞生长三者之间的直接联系，在抗性筛选压力下通过检测蓝藻细胞实时生长状态，可实时反应蓝藻细胞中用于外源生物合成的苯丙氨酸的相对含量。

Description

一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含 量的方法
技术领域
本发明属于基因改造技术领域，具体涉及一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法。
背景技术
苯丙氨酸作为8种必需氨基酸之一直接参与了生命活动体现者蛋白质的翻译过程，对于生命活动的正常进行发挥着多方面的功能。其在体内的合成由莽草酸循环与芳香族氨基酸合成两部分组成，而每部分均包含了多个反应步骤。苯丙氨酸在体内经苯丙氨酸羟化酶催化作用氧化成酪氨酸，并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素，被证实在抗抑郁等医学症状方面有很好的效果。另外，苯丙氨酸也为苯丙酮酸(Liu et al.，2015)和其他芳香族化合物的合成，以及多种植物次生代谢生物活性物质，如黄酮类化合物合成提供底物(Dempo et al.，2014)(图1)。因此，苯丙氨酸在医药及保健产品开发中具有重要的地位，但目前研究表明，苯丙氨酸仅可以在植物和一些微生物体内合成，而不能在哺乳动物细胞中发生。同时苯丙氨酸在植物中的含量较低，其合成途径往往伴随着强烈的产物反馈抑制，因此近年来利用微生物细胞工厂合成氨基酸(Brey et al.，2020)成为了一种重要的替代方法。
在早期的研究中，更多的利用大肠杆菌和酵母作为氨基酸类化合物异源生物合成的先驱平台，并取得了系列的成果(Brey et al.，2020)。但氨基酸作为生命体的体现形式和初级代谢的重要底物，在细胞中并没有过多的游离形式可用于生物工程当中的异源产物合成。因此，生物工程研究人员往往通过基因工程改造以及不定向化学诱变等方法期望得到可以进行高产苯丙氨酸合成的菌株。随着全球气候恶化等问题目益突出，碳中性的光合生物合成底盘蓝藻受到了更多的关注。蓝藻作为合成底盘可以通过直接吸收空气中的二氧化碳，产生附加值较高的生物活性物质，且不与农业抢耕地便于集约系统化培养，因此很快发展成为了一种新的绿色“生物智造”平台，得到了极大的关注与发展(Jin et al.，2021)。
苯丙氨酸及其所衍生的大多数化合物往往结构复杂且分子量较大，产物通常无法自由透过细胞的膜壁结构分泌到细胞外或透膜能力较低，因此产物的提取需对细胞进行破壁。而蓝藻由于其细胞壁结构的特殊性，生物酶解以及超声破碎往往难以达到理想的效果，因此蓝藻中苯丙类化合物的提取往往包含了费时费工的细胞离心收集、高强度机械破壁、产物抽提以及利用高效液相色谱进一步进行仪器检测，该传统方法无法进行实时监测。如何在实际工作中对利用基因工程改造或化学诱变的细胞中苯丙氨酸相对含量进行快速界定便成为了摆在研究人员面前的首要问题。
参考文献
Jin，H.，Wang，Y.，Zhao，P.，Wang，L.，Zhang，S.，Meng，D.，Yang，Q.，Cheong，L.-Z.，Bi，Y.，Fu，Y.，2021.Potential of Producing Flavonoids Using Cyanobacteria As aSustainable Chassis.J.Agric.Food Chem.69,12385-12401.https://doi.org/10.1021/acs.jafc.1c04632
Liu，S.P.，Zhang，L.，Mao，J.，Ding，Z.Y.，Shi，G.Y.，2015.Metabolicengineering of Escherichia coli for the production of phenylpyruvatederivatives.Metab.Eng.32.55-65.https://doi.org/10.1016/j.ymben.2015.09.007
Zheng，B.，Ma，X.，Wang，N.，Ding，T.，Guo，L.，Zhang，X.，Yang，Y.，Li，C.，Huo，Y.-X.，2018.Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acidoverproducers.Nat.Commun.9，3616.https://doi.org/10.1038/s41467-018-05830-0.
BREY L F，WLODARCZYK A J，BANG THOFNER J F，et al.2020.Metabolicengineering of Synechocystis sp.PCC 6803 for the production of aromatic aminoacids and derived phenylpropanoids.Metab Eng[J]，57：129-139.
DEMPO Y,OHTA E,NAKAYAMA Y,et al.2014.Molar-based targeted metabolicprofiling of cyanobacterial strains with potential for biologicalproduction.Metabolites[J]，4：499-516.
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量的方法，以含有极端偏好密码子与极端稀有密码子的氯霉素基因的野生型蓝藻转化子分别作为上限生长参比菌株与下限生长参比菌株，将含有极端稀有密码子氯霉素基因转入目标菌株中，通过比对目标菌株与上、下限生长参比菌株的生长关系从而快速鉴定目标菌株细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量方面的性能。
本发明提供了一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量的方法，包括以下步骤：
分别构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子和极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体，分别转入蓝藻中，得到含极端偏好密码子的蓝藻工程菌株和含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株；
将构建的含极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体转入待检测的蓝藻菌株中，得到改造后的待测蓝藻菌株；
将所述改造后的待测蓝藻菌株和极端偏好密码子的蓝藻工程菌株、含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株分别在含氯霉素、色氨酸和酪氨酸的液体培养基中培养，比较三种菌株的生长曲线，当改造后的待测蓝藻菌株的生长曲线比含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株的生长曲线有显著性提高时，则说明所述待检测的蓝藻菌株细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸含量方面具有优势。
优选的，构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子或极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体的方法，包括以下步骤：
将蓝藻氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子全部替换为TTT偏好密码子，人工合成含强启动子序列、核糖体结合位点、极端偏好密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段，或者将蓝藻氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子全部替换为TTC稀有密码子，人工合成含强启动子序列、核糖体结合位点、极端稀有密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段；
将合成的融合基因片段克隆至骨架载体中，得到重组载体；
将所述重组载体转化至蓝藻宿主中，得到含极端偏好密码子的蓝藻工程菌株或含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株。
优选的，所述极端偏好密码子的氯霉素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述极端稀有密码子的氯霉素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的，所述强启动子包括Trc1O启动子；
所述Trc1O启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选的，所述含强启动子序列、核糖体结合位点、极端偏好密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述含强启动子序列、核糖体结合位点、极端稀有密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
优选的，所述液体培养基中氯霉素的浓度为4.5～5.5μg/ml。
优选的，所述液体培养基中氯霉素的浓度为5.0μg/ml。
优选的，所述液体培养基为标准BG11培养基。
优选的，所述色氨酸和酪氨酸的浓度均为0.25mM；
所述生长曲线的比较时间为培养120～160h。
优选的，所述蓝藻为集胞藻6803菌株。
本发明提供了一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法，本发明利用密码子的简并性，即为同一种氨基酸在参与蛋白翻译的过程中往往对应多个密码子从而能够缓冲由于基因突变对物种带来的影响。不同的生物体对密码子的偏好性不同，依据每种密码子所对应的tRNA的丰度，可以将同一物种中的密码子分为偏好密码子(preferred-codon)和稀有密码子(rare-codon)两大类。细胞中偏好密码子所对应的tRNA较多而稀有密码子对应的tRNA则相对较少，当将目标基因中密码子改造为稀有密码子的时候，稀有密码子对应tRNA转运该种氨基酸的效率较低，从而影响编码基因的表达(图3)；而当菌株可以过量产生对应氨基酸时，便可以弥补由于稀有密码子存在所导致的翻译效率的延迟，使菌体可以达到较好甚至等同于含有偏好密码子目标基因在细胞中的表达效率。当将密码子的简并性与抗生素基因的翻译相结合候，通过调节抗生素基因中所含有的对应氨基酸密码子中偏好与稀有的比例影响抗生素基因的表达效率，而在抗生素筛选压力下的表达效率可以通过细胞的生长状况相对直观地表现出来。当稀有密码子含量丰富的目标菌株在抗生素筛选压力下的长势能够比拟甚至优于含有丰富偏好密码子的参比菌株的长势时，便可初步判断该目标菌株中极有可能含有相对较高含量的对应氨基酸。因此本发明创建了一种利用极端偏好密码子和极端稀有密码子改造的氯霉素抗性基因对蓝藻细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量的快速检测方法，可以直接针对液体培养体系下生长的培养液进行。本发明将含有极端偏好密码子与极端稀有密码子的氯霉素基因的野生型蓝藻转化子分别作为该方法的上限生长参比菌株与下限生长参比菌株，而将含有极端稀有密码子氯霉素基因转入待检测蓝藻菌株中，通过比对待检测蓝藻菌株与上、下限生长参比菌株的生长关系，便可对目标菌株中苯丙氨酸和参比菌株中苯丙氨酸的相对含量做初步预估。通过该方法测量蓝藻细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸的含量避免了传统检测方法中破坏细胞、测量步骤繁琐、且无法进行实时监测的缺陷，从而成为了一种实时、快速、可高通量进行且操作简单的快速检定方法。
附图说明
图1为苯丙氨酸在体内代谢示意图；
图2为本发明保护的技术方案的示意图；
图3为利用稀有密码子鉴定蓝藻细胞内用于外源生物合成的氨基酸相对含量的原理图；
图4为蓝藻氨基酸密码子偏好性分析及载体的构建；其中A为蓝藻Sy6803基因组当中苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Tyr)密码子使用的频率，B为蓝藻Sy6803中常用的羧苄青霉素(Cb)、卡那霉素(Km)、氯霉素(Cm)和壮观霉素(Sp)等4个抗生素基因中苯丙氨酸密码子的偏好(红色标注)与稀有(黑色标注)比例及位点示意图，C为本发明中合成含有极端偏好以及极端稀有密码子的片段示意图，D为本发明所使用的蓝藻Sy6803质粒载体示意图；
图5为本发明构建的12株蓝藻菌株在含不同浓度的抗生素的液体培养基中筛选培养长势情况。其中A、C和E分别为强启动子(Trc1O)诱导的极端密码子改造的含有羧苄青霉素(Cb)、卡那霉素(Km)、氯霉素(Cm)抗生素基因以及空载体质粒的菌株分别在25μg/ml梭卞青霉素、25μg/ml卡那霉素、以及5μg/ml氯霉素的筛选压力和无抗生物筛选条件下的生长趋势；B、D和F分别为弱启动子(RbcL1A)诱导下的转化子菌株在对应条件下的生长趋势；G和H分别为E和F中对应的极端密码子改造菌株在5μg/ml氯霉素的筛选压力下生长OD730数值的柱状图；
图6为氯霉素浓度的精细筛选结果；A、B、C、D分别为由强启动子诱导的极端密码子以及空载体质粒的菌株在2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml以及10μg/ml氯霉素的筛选压力和无抗生素筛选下的生长趋势；
图7为含载体骨架菌株在正常培养基和分别外源添加0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM苯丙氨酸的生长状况；
图8为含载体骨架菌株在正常培养基和添加外源氨基酸时的生长情况；其中5个不同处理分别是在正常的BG11培养基上(NC-0)，以及培养基分别中添加了0.5mM苯丙氨酸，0.5mM苯丙氨酸和0.25mM色氨酸，0.5mM苯丙氨酸和0.25mM酪氨酸，0.5mM苯丙氨酸、0.25mM色氨酸以及0.25mM酪氨酸的生长状况；
图9为外源添加氨基酸对含苯丙氨酸稀有密码子的蓝藻菌株生长的回补状况；其中A、C和E为由强启动子诱导的极端密码子以及空载体质粒的菌株在5μg/ml氯霉素的筛选压力下，分别通过利用正常BG11培养基，在BG11中添加了0.25mM的色氨酸(Tyr)和0.25mM酪氨酸(Typ)的培养基，以及在BG11中添加了0.5mM苯丙氨酸(Phe)、0.25mM的色氨酸(Tyr)和0.25mM酪氨酸(Typ)三种芳香族氨基酸培养基中的生长状况；B、D和F则是A、C、E中的改造菌株在5μg/ml氯霉素的筛选压力下生长OD730数值的柱状图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内可用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量的方法，见图2，包括以下步骤：
分别构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子和极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体，分别转入蓝藻中，得到含极端偏好密码子的蓝藻工程菌株和含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株；
将构建的含极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体转入待检测的蓝藻菌株中，得到改造后的待测蓝藻菌株；
将所述改造后的待测蓝藻菌株和极端偏好密码子的蓝藻工程菌株、含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株分别在含氯霉素、色氨酸和酪氨酸的液体培养基中培养，比较三种菌株的生长曲线，当改造后的待测蓝藻菌株的生长曲线比含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株的生长曲线有显著性提高时，则说明所述待检测的蓝藻菌株细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量方面具有优势。
本发明首先分别构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子和极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体，分别转入蓝藻中，得到含极端偏好密码子的蓝藻工程菌株和含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株。
在本发明中，构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子或极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体的方法，优选包括以下步骤：
将蓝藻氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子全部替换为TTT偏好密码子，人工合成含强启动子序列、核糖体结合位点、极端偏好密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段，或者将蓝藻氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子全部替换为TTC稀有密码子，人工合成含强启动子序列、核糖体结合位点、极端稀有密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段；
将合成的融合基因片段克隆至骨架载体中，得到重组载体；
将所述重组载体转化至蓝藻宿主中，得到含极端偏好密码子的蓝藻工程菌株或含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株。
在本发明中，所述极端偏好密码子的氯霉素基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：1所示。所述极端稀有密码子的氯霉素基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：2所示。所述强启动子优选包括Trc1O启动子；所述Trc1O启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：3所示。所述含强启动子序列、核糖体结合位点、极端偏好密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：4所示。所述含强启动子序列、核糖体结合位点、极端稀有密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：5所示。
在本发明实施例中，分别选择蓝藻中常见的四种抗生素基因(羧苄青霉素(Cb)、卡那霉素(Km)、氯霉素(Cm)和壮观霉素(Sp)等4个抗生素基因)作为候选改造基因，对各基因中苯丙氨酸对应的密码子数量以及对应的偏好密码子和稀有密码子数量的统计，含弃丙苯胺酸密码子数量极低的壮观霉素基因。针对羧苄青霉素(Cb)基因、卡那霉素(Km)基因以及氯霉素(Cm)基因中编码苯丙氨酸的密码子位置，合成了含偏好和稀有两组极端密码子基因序列。同时对两组极端密码子基因序列上分别添加启动表达能力不同的两种启动子，分别得到12种改造的融合基因片段。实验表明，与羧苄青霉素(Cb)基因和卡那霉素(Km)基因相比，在强启动子诱导下含偏好密码子的氯霉素基因的蓝藻菌株长势明显优于稀有密码子的蓝藻菌株，因此氯霉素基因可作为快速检测蓝藻细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量的抗生素基因。
在本发明中，所述骨架载体为含有RSF1010复制子的质粒Ptrc1O-GFP，通过将其本身所含有的卡那霉素抗生素切除并利用红霉素进行替代获得。所述融合基因片段在骨架载体中的多克隆位点为EcoRI和PstI酶切位点。本发明对所述克隆的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的克隆方法即可，例如采用Gibson等温组装的方法完成。所述克隆结束后，优选还包括对重组载体进行验证。所述验证的方法将重组载体转化至大肠杆菌中，经过筛选培养后进行PCR扩增和测序，得到目标片段的大肠杆菌为阳性转化子。所述筛选培养是基于所述骨架载体本身带有红霉素抗性基因，在含有红霉素的培养基中进行筛选培养。所述PCR扩增用引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO：6(GCGTATCACGAGGCAGAATTTCAG)所示的正向引物和SEQ ID NO：7(CCTTTGAGTGAGCTGATACCGC)所示的反向引物。从所述阳性转化子中提取重组载体。
在本发明中，本发明对所述蓝藻宿主的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的蓝藻种类即可。在本发明实施例中，所述蓝藻宿主为Syn6803菌株。
在本发明中，所述重组载体转化至蓝藻的方法优选为三亲接合转化法。转化后优选进行验证。所述验证的方法优选为采用PCR扩增方式检测蓝藻中骨架载体和氯霉素基因的存在。所述PCR扩增用引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的反向引物。
在本发明中，鉴于同一种菌株在固定培养基和液体培养基中生长状态有明显的差异，因此，先在固体培养基进行预培养，结果表明固体培养基无法区分含有偏好密码子的氯霉素基因的蓝藻以及含有稀有密码子的三种抗性基因的蓝藻的长势。因此，改用液体培养基筛选，结果表明，在液体培养条件下相较于羧苄青霉素(Cb)基因和卡那霉素(Km)基因，氯霉素基因(Cm)可作为蓝藻中利用密码子偏好性进行细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量实时快速检测的备选基因。
在本发明中，所述液体培养基优选为标准BG11培养基。所述液体培养基中氯霉素的浓度优选为4.5～5.5μg/ml，更优选为5.0μg/ml。通过对氯霉素筛选浓度的精细化筛选发现，过高或过低的氯霉素浓度不利于含有苯丙氨酸检测体系蓝藻的生长，5μg/ml氯霉素的筛选压力是较合适的抗生素浓度，可用于蓝藻细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸含量高效监测的条件。
在本发明中，所述色氨酸和酪氨酸的浓度均优选为0.25mM。采用外源添加氨基酸的方式来改变细胞内利用的苯丙氨酸的浓度，实验表明，单独添加苯丙氨酸会严重抑制蓝藻细胞生长，而同时添加酪氨酸、色氨酸则会解除该抑制。因此，在培养过程中，添加色氨酸和酪氨酸可以抵消外源苯丙氨酸对蓝藻的生长抑制。此外，在5μg/ml氯霉素的筛选压力下，含有偏好密码子氯霉素基因的蓝藻工程菌株的长势明显优于含有稀有密码子载体的蓝藻工程菌株，而添加0.25mM的色氨酸和0.25mM的酪氨酸并不会影响二者之间的区别。但当我们对含有两种载体的蓝藻转化子中补充0.5mM的苯丙氨酸时，偏好密码子和稀有密码子改造的蓝藻生长无显著差异，说明苯丙氨酸的补充可改变稀有密码子所带来的低翻译效率，从而使得菌体生长得到回复。
在本发明中，所述生长曲线的比较时间优选为培养120～160h，更优选为144h。当所述改造后的待测蓝藻菌株的生长曲线越接近于极端偏好密码子的蓝藻工程菌株，远离含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株，说明待检测蓝藻菌株细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸含量方面具有更好的优势。本发明对所述待检测的蓝藻菌株的来源没有特殊限制，可如本发明中通过添加外源氨基酸的方式，或者采用本领域所熟知的物理化学方法诱导获得的潜在高产苯丙氨酸菌株以及基因工程改造的高产苯丙氨酸的蓝藻菌株均可。
下面结合实施例对本发明提供的一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中涉及的配方如下：
表1 BG11培养基详细配方
成分 终浓度(g/L)
NaNO3 1.5
CaCl2·2H2O 0.036
Ferric ammonium citrate 0.006
Na2.EDTA 0.001
K2HPO4 0.04
MgSO4·7H2O 0.075
Na2CO3 0.02
Citric Acid 0.006
其它微量元素 1毫升
双蒸水 至1升
表2微量元素混合液的组成成分
实施例1筛选抗生素基因种类的确定和基因片段的合成
基于Kazusa密码子使用数据库，(https://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝1148)，发现蓝藻Syn6803基因组注释共有3623条注释编码序列，涉及1161949个密码子。分析发现，苯丙氨酸和色氨酸这两个芳香族氨基酸都有两个密码子与它们相对应。苯丙氨酸的TTT和TTC密码子的比例为2.8∶1，酪氨酸的TAT和TAC密码子的比例为1.46∶1，说明TTT和TAT密码子编码苯丙氨酸及酪氨酸的使用频率分别是TTC和TAC的2.8倍和1.46倍(图4中A)。因此，将TTT定义为编码苯丙氨酸的偏好密码子，将TAT定义为编码酪氨酸的偏好密码子。同时将TTC和TAC分别定义为稀有密码子。考虑到苯丙氨酸的显著密码子偏好及其在芳香族衍生物代谢中的重要地位，在接下来的研究中主要关注苯丙氨酸。
选取蓝藻Sy6803中常用的羧苄青霉素(Cb)、卡那霉素(Km)、氯霉素(Cm)和壮观霉素(Sp)等4个抗生素基因进行苯丙氨酸含量分析。
基因中密码子偏好性分析首先进入密码子偏好性分析网页http://www.kazusa.or.jp/codon/，进入该网页后点击进入附加服务中可进行基因片段密码子偏好性的统计；点击Countcodon program后进入的界面中贴入需要进行密码子偏好性分析的基因序列，贴入后点击生成便可统计出该段基因序列中各个氨基酸对应密码子的使用频率及机会。如图4中B所示，这些基因具有不同数量的苯丙氨酸密码子分布，在每个基因中偏好密码子用红色标记而稀有密码子用黑色标记，其中羧苄青霉素基因当中的苯丙氨酸偏好密码子9个而稀有密码子1个，卡那霉素基因当中的苯丙氨酸偏好密码子11个而稀有密码子5个，氯霉素基因当中的苯丙氨酸偏好密码子10个而稀有密码子9个。壮观霉素基因中由于苯丙氨酸密码子含量低(仅5个)，苯丙氨酸密码子操纵没有太大的空间，因此放弃壮观霉素基因的后续的研究。
针对羧苄青霉素(Cb)、卡那霉素(Km)以及氯霉素(Cm)基因中编码苯丙氨酸的密码子位置，合成了两组极端密码子(偏好和稀有)基因序列，具体见表3。其中一条基因的苯丙氨酸对应密码子改造为极端偏好的TTT密码子(红条)，而另一条的苯丙氨酸对应密码子则改造为极端稀有的TTC密码子(黑条)(图4中C)。
另外，所有合成基因都采用了不同强度的启动子进行表达，以分析其基于苯丙氨酸密码子的抗生素基因选择的可行性。两种不同的组成型启动子被用来驱动两个极端库抗生素基因，一个是强启动子Trc1O，虽然强启动子可以有效地驱动下游基因表达，但它存在过度积累的抗生素耐药蛋白对宿主细胞毒性太大影响其生长，或者产生过量基于苯丙氨酸稀有密码子的抗生素基因转录子，从而在抗生素选择性培养基上错误地支持细胞生长的风险。因此，同时补充了另一个弱启动子——rbcL1A。融合基因片段的合成及其序列在北京祥鸿生物科技有限公司完成。各融合基因片段对应的序列见表3。
表3融合基因片段的序列信息
实施例2重组载体的构建方法
采用Gibson等温组装(Gibson et al.，2009)，所有与上下游片段重叠20bp的部分，选用Phusion高保真DNA聚合酶扩增或者北京祥鸿生物科技有限公司进行DNA片段合成的方式获取。构建所用的载体基于含有RSF1010复制子的质粒Ptrc1O-GFP改造获得，Ptrc1O-GFP质粒来自于于申请人早期合作的国外实验室发表于2010年核酸研究第38卷第8期页码从2577-2593上的研究论文。本实施例对该质粒采用EcoRI和PstI酶切，所用酶切体系为60μl反应体系：10×FastDigest buffer，6μl；质粒DNA(3μg)，11μl；EcoRI内切酶，3μl；PstI内切酶，3μl；加水37μl至60μl。所用酶切条件为：37℃，2h。
将酶切生成的DNA片段载体骨架进行切胶回收并利用Gibson等温组装的方式与合成的DNA片段进行连接，连接所用反应体系为：载体DNA片段骨架50ng，3μl；合成基因片段20ng，1μl；GibsonMasterMixer，10μl；加水至20μl。在50℃条件下反应55分钟，并将其转化进入大肠杆菌当中。大肠杆菌的转化方法为：将大肠杆菌感受态放置于冰上解冻，将5ng～50ng的质粒DNA加入到50μl的大肠杆菌感受态中并用枪头小心混合并冰浴30min，然后用42℃水浴热激35s，再冰浴2min，加入250μlLB培养基混合，在37℃震荡培养1h，最后在含有对应抗生素的平板中在37℃下培养12～16h后挑选生长良好的菌落。
构建重组载体中含有红霉素抗性基因，其可成功用于维持载体在大肠杆菌及蓝藻中的成功复制而不会依赖于筛选抗生素基因的表达(图4中D)。将在大肠杆菌中构建好的载体以克隆PCR的方式通过引物(GCGTATCACGAGGCAGAATTTCAG，SEQ ID NO：6和CCTTTGAGTGAGCTGATACCGC，SEQ ID NO：7)进行测序验证，PCR反应体系为20μl体系：2×EsTaq MasterMix，10μl；正向引物，1μl；反向引物，1μl；菌落模板以及加水补足至20μl反应体系。所用的反应程序为：预变性，94℃3min；变性，94℃30s；引物退火，57℃30s：引物延伸，72℃2Kb/min；循环数，30循环；最后延伸，72℃5min；最后保持4℃用于PCR产物的短期保存。待测序验证正确后，将所构建的载体通过三亲结合的方式转化到蓝藻Syn6803中进行进一步分析。
实施例3蓝藻的转化与筛选
蓝藻的转化采用三亲结合的方式，具体步骤如下：
三亲结合采用的菌株包括蓝藻宿主菌株Syn6803、DH5a或Z1菌株中携带pQKEm的质粒载体以及接合质粒(DBS-0003 pRL443菌株)，将大肠杆菌(质粒载体和接合质粒)从新鲜的选择板上接入加有抗生素的LB培养基中过夜培养。将过夜培养的大肠杆菌种子液按照1∶20的比例接种到不含抗生素的LB培养基中培养，将含有pRL433结合质粒的菌株与携带pQKEm载体的菌株离心收集培养物，将培养物重悬后取等体积的两种培养物在培养管中混合并在含有抗生素的选择平板上划线，在37℃下过夜培养，此外，相同体积的每个菌株作为阴性对照，以确定质粒载体与接合质粒成功重组。从过夜培养的新鲜选择性平板上将重组的大肠杆菌刮到不加抗生素的LB中培养，在没有抗生素选择压力的情况下，在37℃，LB培养基中培养2h(180～200rmp)，将蓝藻培养至OD730≈0.5-0.8，将蓝藻和重组后的大肠杆菌均进行重悬，接合时取不同体积的蓝藻和大肠杆菌进行配比，在1.5ml的小离心管中轻轻混合，在30℃静置培养4-5小时，然后在BG11+葡萄糖的培养基平板上点接，最后将培养蓝藻与大肠杆菌的接合平板在光照培养箱中30℃培养48h。
蓝藻转化子的筛选步骤如下：用离心管和BG11培养基收集接合平板上的菌落，将培养物在30℃、含Em25μg/ml的BG11固体培养基上进行培养，待长出新菌落后转接至新鲜筛选平板数次，然后挑取单个菌落，并在无抗生素的LB琼脂平板上生长，以确认没有大肠杆菌污染。之后提取转化子的基因组DNA并以其为模板进行PCR检测，验证质粒及抗生素片段的存在。其中扩增用引物为GCGTATCACGAGGCAGAATTTCAG(SEQ ID NO：6)和CCTTTGAGTGAGCTGATACCGC(SEQ ID NO：7)，确定获得了由强(Trc1O)、弱(rbcL1A)两种启动子，并且分别具有含有极端偏好密码子和极端稀有密码值的羧苄青霉素、氯霉素、卡那霉素的菌株共12株。
实施例4苯丙氨酸密码子修饰对应抗生素种类的筛选
1.固体培养基初步筛选
对羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素分别选用0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的浓度配制固体培养基，蓝藻生长初始OD730＝0.1，每个蓝藻转化子在对应的不同浓度的抗生素筛选压力下进行生长，其中在DH5α或Z1菌株中的质粒载体为pQKEm(红霉素200μg/ml)作为阴性对照，通过观察蓝藻转化子的生长状态(颜色与OD730浓度)，对比同一抗生素浓度压力下改造的含偏好密码子基因的蓝藻和含稀有密码子的基因的蓝藻生长状态，以便确定其合成苯丙氨酸的能力。通过实验结果发现，强启动子(Trc1O)诱导的蓝藻在固体培养基上几乎不生长，而弱启动子(rbcL1A)诱导的蓝藻在低浓度下含偏好密码子的基因与含稀有密码子的基因区别较小，因此选用了区别相对较为明显的浓度范围进行液体培养实验，分别为羧苄青霉素25μg/mL、卡那霉素25μg/mL、氯霉素5μg/mL。
2.液体培养基筛选
由于同一种菌株在固体和液体培养下的状态具有差异，故而在液体和固体培养基中分别进行了实验。通过固体培养初步筛选出三种抗生素的浓度，分别为羧苄青霉素25μg/mL、卡那霉素25μg/mL、氯霉素5μg/mL对蓝藻进行液体培养，将经过验证的12株蓝藻转化子在对应的抗生素筛选压力下进行培养，将质粒载体作为阴性对照，蓝藻生长初始OD730＝0.1，每个样本设置三个生物重复，每隔12h测量一次OD730，每个样本测量三次作为技术重复，持续测量5天。数据经过处理后得出结论，在羧苄青霉素25μg/mL的筛选压力下，含有强启动子诱导的稀有密码子基因的蓝藻长势反而优于含偏好密码子基因蓝藻，弱启动子诱导的偏好与稀有密码子基因的蓝藻长势并无明显区别，达不到筛选苯丙氨酸含量差异的效果(图5中A和B)；在卡那霉素25μg/mL的筛选压力下，虽然在强弱启动子诱导下有含偏好密码子基因的蓝藻长势略优于稀有密码子的蓝藻，但差距不够显著，也无法达到筛选苯丙氨酸含量差异的效果(图5中C和D)；而在氯霉素5μg/mL的筛选压力下，弱启动子诱导下的蓝藻由于抗生物基因表达较弱，具有含偏好密码子基因菌株与稀有密码子基因的蓝藻生长几乎无差距，但在强启动子的诱导下，具有偏好密码子氯霉素基因的蓝藻生长显著优于稀有密码子基因的蓝藻(图5中E，F，G，H)。该部分的研究结论表明，在液体培养条件下相较于羧苄青霉素(Cb)基因和卡那霉素(Km)基因，氯霉素基因(Cm)可作为蓝藻中利用密码子偏好性进行细胞内苯丙氨酸含量表征的备选基因。当将氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子改造为极端的偏好密码子以及极端稀有密码子的情况下，所含极端基因片段的转化子在含有5μg/ml的氯霉素培养基中可显示出明显的生长速率以及最终细胞浓度的差异，即为含有极端偏好密码子的蓝藻转化子生长速率与浓度明显高于含有极端稀有密码子的转化子。
实施例5筛选抗生素浓度的精细定位
通过对三种抗生素的筛选，最终选用强启动子诱导下的氯霉素作为蓝藻细胞内可用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量快速鉴定方法的抗生素。
为了确定具有显著差异的抗生素浓度，使用0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml进行了预实验，在10μg/ml氯霉素的筛选压力下观察到经过改造的偏好与含稀有密码子的基因的蓝藻已经无法正常生长，故选定强启动子诱导下的2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml进行氯霉素浓度的精细化筛选。根据实验结果得出结论：在2.5μg/ml氯霉素的筛选压力较小，含有偏好密码子氯霉素抗性基因与稀有密码子基因的蓝藻生长趋势无显著差异(图6中A)；在5μg/ml氯霉素的筛选压力下含有偏好密码子抗性基因的蓝藻生长趋势显著优于稀有密码子氯霉素基因(图6中B)；而7.5μg/ml的氯霉素筛选压力下，可能由于该浓度对含有稀有密码子氯霉素基因的蓝藻生长压力较大，使得菌体的生长代谢发生了紊乱并自发调控，从而使细胞中苯丙氨酸更多的流向了氯霉素抗性基因的表达，所以出现了含有稀有密码子氯霉素基因的菌株生长优于偏好密码子氯霉素基因菌株的情况(图6中C)；在10μg/ml的氯霉素筛选压力下，由于该筛选浓度过高，经过改造的偏好与稀有密码子抗性基因的蓝藻均无法正常生长(图6中D)。综合上述结论得出，5μg/ml氯霉素的筛选压力是较合适的用于表征细胞中可用于外源生物合成的苯丙氨酸的抗生素浓度，可用于蓝藻中苯丙氨酸含量高效监测的条件。
实施例6外源添加氨基酸可弥补苯丙氨酸稀有密码子转化子的生长
为了进一步检测本发明所构建的苯丙氨酸表征体系的有效性，尝试通过改变细胞内苯丙氨酸浓度的方法进行验证。在此通过向构建的蓝藻工程菌株培养基中外源添加苯丙氨酸的的方式进行，我们假设含有稀有密码子氯霉素抗性基因的转化子延迟的生长表型可以通过培养基中外源添加进入细胞的苯丙氨酸得到回补，从而接近甚至优于含有偏好密码子氯霉素抗性基因的转化子的生长。
在进一步检测中发现单独添加苯丙氨酸会严重抑制蓝藻细胞生长，而同时添加酪氨酸、色氨酸则会解除该抑制。实验步骤为：在正常培养基中分别添加0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM的苯丙氨酸，蓝藻的初始培养OD730为0.1(使用紫外分光光度计测量)，用无苯丙氨酸添加的蓝藻作为对照，每24h使用酶标仪测量一次OD730，测量168h的结果表明，在外源添加苯丙氨酸的情况下，蓝藻无法正常生长(图7)。为了降低苯丙氨酸对蓝藻的生长抑制作用，在添加苯丙氨酸的培养基中同时补充添加了酪氨酸和色氨酸，从而形成了4种培养基的配置分别为：0.5mM的苯丙氨酸；0.5mM的苯丙氨酸和0.5mM的L-色氨酸；0.5mM的苯丙氨酸和0.5mM的L-酪氨酸；以及0.5mM的苯丙氨酸、0.25mM的L-色氨酸和0.25mM的L-酪氨酸。检测结果表明(图8)，在添加0.25mM的L-色氨酸和0.25mM的L-酪氨酸时，可以抵消外源0.5mM的L-苯丙氨酸对蓝藻的生长抑制，后继的实验也在该条件下进行。补充外源氨基酸的实验步骤为：在5μg/ml氯霉素的筛选压力下分别在强启动子诱导的极端密码子转化菌株中添加两种氨基酸和三种氨基酸，两种氨基酸为0.25mM的L-色氨酸和0.25mM的L-酪氨酸，三种氨基酸为0.5mM的苯丙氨酸、0.25mM的L-色氨酸和0.25mM的L-酪氨酸，蓝藻的初始生长OD730为0.1，每间隔12～24h测量一次OD730。结果表明，在5μg/ml氯霉素的筛选压力下，含有偏好密码子载体的蓝藻转化子的长势明显优于含有稀有密码子载体的转化子(图9中A、B)，而添加0.25mM的L-色氨酸和0.25mM的L-酪氨酸并不会影响二者之间的区别(图9中C、D)。但当对含有两种载体的蓝藻转化子中补充0.5mM的苯丙氨酸时，含稀有密码子改造的蓝藻生长与含偏好密码子转化的蓝藻菌株已无显著差异，说明外源性添加苯丙氨酸可以补充稀有密码子所带来的低翻译效率，从而使菌体生长得到回复(图9中E、F)。在本研究中采用添加外源苯丙氨酸的方法增加蓝藻细胞中可生利用的苯丙氨酸的含量，从而达到了对稀有密码子菌株当中翻译效率的弥补。在后期的专利保护利用当中，也可以针对通过诱变及生物工程改造提高蓝藻细胞中苯丙氨酸生物利用度的菌株中的应用。该部分再一次证实本研究所构建的筛选系统可以高效实时的反应蓝藻细胞中苯丙氨酸的相对含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内苯丙氨酸相对含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子和极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体，分别转入蓝藻中，得到含极端偏好密码子的蓝藻工程菌株和含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株；
将构建的含极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体转入待检测的蓝藻菌株中，得到改造后的待测蓝藻菌株；
将所述改造后的待测蓝藻菌株和极端偏好密码子的蓝藻工程菌株、含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株分别在含氯霉素、色氨酸和酪氨酸的液体培养基中培养，比较三种菌株的生长曲线，当改造后的待测蓝藻菌株的生长曲线比含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株的生长曲线有显著性提高时，则说明所述待检测的蓝藻菌株细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量方面具有优势；
其中，构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子或极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体的方法，包括以下步骤：将蓝藻氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子全部替换为TTT偏好密码子，人工合成含强启动子序列、核糖体结合位点、极端偏好密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段，或者将蓝藻氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子全部替换为TTC稀有密码子，人工合成含强启动子序列、核糖体结合位点、极端稀有密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段；将合成的融合基因片段克隆至骨架载体中，得到重组载体；
所述极端偏好密码子的氯霉素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述极端稀有密码子的氯霉素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述强启动子为Trc1O启动子；所述Trc1O启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述含强启动子序列、核糖体结合位点、极端偏好密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述含强启动子序列、核糖体结合位点、极端稀有密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述骨架载体为含有RSF1010复制子的质粒Ptrc1O-GFP；所述融合基因片段在骨架载体中的多克隆位点为EcoRI和PstI酶切位点；
所述液体培养基为标准BG11培养基；
所述液体培养基中氯霉素的浓度为5.0μg/ml；
所述色氨酸和酪氨酸的浓度均为0.25mM；
所述蓝藻为集胞藻6803菌株。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述生长曲线的比较时间为培养120～160h。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101365794A (zh) * 2005-08-12 2009-02-11 巴斯福植物科学有限公司 编码与非生物性胁迫应答相关的蛋白质的核酸序列和具有增加的环境胁迫耐受性的植物细胞及植物
CN102146344A (zh) * 2010-11-02 2011-08-10 上海师范大学 优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法
WO2014169787A1 (zh) * 2013-04-15 2014-10-23 上海工业生物技术研发中心 利用蓝藻生产异戊二烯的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI1009977A2 (pt) * 2009-05-01 2015-08-25 Univ California Produção melhorada de hibrocarboneto isopreno usando cianobactérias geneticamente engendradas
US20220411835A1 (en) * 2019-09-03 2022-12-29 Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd Application of transport carrier gene which improves l-tryptophan production efficiency in escherichia coli

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101365794A (zh) * 2005-08-12 2009-02-11 巴斯福植物科学有限公司 编码与非生物性胁迫应答相关的蛋白质的核酸序列和具有增加的环境胁迫耐受性的植物细胞及植物
CN102146344A (zh) * 2010-11-02 2011-08-10 上海师范大学 优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法
WO2014169787A1 (zh) * 2013-04-15 2014-10-23 上海工业生物技术研发中心 利用蓝藻生产异戊二烯的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Haojie Jin, Jiaqi Zhang, Yan Wang, Wanzhao Ge, Yike Jing, Xiaoyu Cao, Yixin Huo, Yujie Fu .A codon-based live-cell biomonitoring system for assessing intracellular phenylalanine bioavailability in cyanobacteria.Biosens Bioelectron .2023,第244卷115792. *
冯国栋 ; 程丽华 ; 徐新华 ; 张林 ; 陈欢林 ; .微藻高油脂化基因工程研究策略.化学进展.2012,第24卷(第07期),1413-1426. *
解鹃 ; 周杰 ; 张海峰 ; 李寅 ; .阻断集胞藻6803 PHB合成途径提高胞内NADPH含量.生物工程学报.2011,第27卷(第07期),998-1004. *
赵薇 ; 陈必链 ; 王明兹 ; 黄建忠 ; .藻类△6脂肪酸脱饱和酶基因密码子偏好性分析.热带海洋学报.2010,第29卷(第03期),126-134. *
齐凤霞 ; 谈晓明 ; 吕雪峰 ; .集胞藻PCC6803高效基因表达平台的构建与评价.生物工程学报.2013,第29卷(第09期),1332-1342. *

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