CN116970055B - 橡胶树HbSTRAP1基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种橡胶树HbSTRAP1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明提供了首次从橡胶树中克隆获得橡胶树HbSTRAP1基因，研究显示该基因编码蛋白能够与HbHMGR2、HbMVD2、HbGPS1、HbFPS2、HbGGPS3、HbCPT8、HbREF1、HbSRPP1等多个MVA途径成员及橡胶粒子膜蛋白相互作用，将橡胶树HbSTRAP1基因在橡胶草中过表达可以显著增加天然橡胶分子量，可用于橡胶树产量遗传改良。本发明为提高天然橡胶分子量等方面的研究提供新的候选基因。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树HbSTRAP1基因及其应用。
背景技术
天然橡胶是一种由聚异戊二烯链为主要特征的天然高分子化合物，其分子量通常大于100万道尔顿。天然橡胶的分子量与性能密切相关，高分子量天然橡胶是制备高端橡胶产品的优良原材料，在生产、生活、国防等很多领域有着不可替代的作用。虽然有超过2,000种植物可以产生天然橡胶，橡胶树目前仍是世界所需天然橡胶的主要来源。位于橡胶树树皮内层的乳管细胞是合成和贮存天然橡胶的场所。橡胶粒子是乳管细胞中一种由半个单位膜构成的特殊细胞器，在其膜上分布有与橡胶烃聚合相关的蛋白质，如橡胶转移酶（HRT），小橡胶粒子蛋白（SRPP）和橡胶延伸因子（REF）等。作为一种典型的类异戊二烯化合物，长期以来人们普遍认为天然橡胶合成所需的直接底物异戊烯基焦磷酸（IPP）是由细胞质基质中的甲羟戊酸途径（MVA）提供，而天然橡胶高分子链的延伸发生在橡胶粒子上。但这种时空上的隔离很难解释乳管细胞能高效合成天然橡胶这一事实。
我们从胶乳中鉴定到一个HbSTRAP1基因，其编码蛋白可以和多个橡胶生物合成途径关键酶相互作用，通过对橡胶草的异源转化可以显著提高转基因橡胶草的天然橡胶分子量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种橡胶树HbSTRAP1基因及其应用，将HbSTRAP1编码基因在橡胶草中过表达可以显著增加天然橡胶分子量，可用于橡胶树产量遗传改良。
本发明的第一个方面是提供一种橡胶树HbSTRAP1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述橡胶树HbSTRAP1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述橡胶树HbSTRAP1基因编码区的重组载体。
其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采pGBKT7载体、pCAMBIA1300表达载体等，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
优选地，所述重组载体的原始载体为pGBKT7载体，橡胶树HbSTRAP1基因编码区位于pGBKT7载体的EcoR I和BamH I两限制性内切酶位点之间。
优选地，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1300载体，橡胶树HbSTRAP1基因编码区位于pCAMBIA1300载体的EcoR I和BamH I两限制性内切酶位点之间。
本发明的第四个方面是提供含有本发明第一个方面所述橡胶树HbSTRAP1基因编码区的宿主菌或表达盒。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbSTRAP1基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质、或者本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌或表达盒在增加天然橡胶分子量中的应用。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbSTRAP1基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质、或者本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌或表达盒在与HbHMGR2、和/或HbMVD2、和/或HbGPS1、和/或HbFPS2、和/或HbGGPS3、和/或HbCPT8、和/或HbREF1、和/或HbSRPP1互作中的应用。
本发明的第七个方面是提供一种提高天然橡胶分子量的方法，将本发明第一个方面所述的橡胶树HbSTRAP1基因、或者本发明第三个方面所述重组载体遗传转化至橡胶草或者橡胶树。
本发明的第八个方面是提供一种引物对，所述引物对为：ATGGATAAGAAAAGGGTGGC和TCAGTCCTTCCCTGCTTCTTCCT，或者所述引物对为：CGGAATTCATGGATAAGAAAAGGGTGG和CGGGATCCGTCCTTCCCTGCTTCTTCCT，或者所述引物对为：GAGGGCTTCCACATTTCAGA和AGTCGGGTCAACCACATCAA。
本发明提供了首次从橡胶树中克隆获得橡胶树HbSTRAP1基因，研究显示该基因编码蛋白能够与HbHMGR2、HbMVD2、HbGPS1、HbFPS2、HbGGPS3、HbCPT8、HbREF1、HbSRPP1等多个MVA途径成员及橡胶粒子膜蛋白相互作用，将橡胶树HbSTRAP1基因在橡胶草中过表达可以显著增加天然橡胶分子量，可用于橡胶树产量遗传改良。本发明为提高天然橡胶分子量等方面的研究提供新的候选基因。
附图说明
图1为实施例2中诱饵载体pGBKT7-HbSTRAP1的自激活检测。
图2为实施例3中HbSTRAP1和MVA途径成员以及橡胶粒子膜蛋白的酵母双杂互作分析。
图3为实施例4中HbSTRAP1基因对橡胶草的遗传转化。
图4为实施例4中转基因阳性植株检测。A，HbSTRAP1基因的PCR检测结果；B，HbSTRAP1基因的表达量检测结果。
图5为实施例4中野生型橡胶草和转基因阳性植株的天然橡胶分子量测定。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：橡胶树HbSTRAP1基因的克隆
冰上收集橡胶树“热研8-79”胶乳，根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的操作说明，提取总RNA并反转录cDNA。以反转录好的cDNA为模板，以ATGGATAAGAAAAGGGTGGC （SEQ ID NO:3）和TCAGTCCTTCCCTGCTTCTTCCT （SEQ ID NO:4）为引物，扩增获得橡胶树HbSTRAP1基因。PCR扩增反应体系20 μl：2 x PCR buffer 10 μL，SEQID NO:3所示引物（10 μmol·L-1）1 μL，SEQ ID NO:4所示引物（10 μmol·L-1）1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O为7 μL。PCR扩增程序：96 °C预变性10 min；96 °C变性30 s，56 °C退火30s，72 °C延伸1 min 30 s，共35个循环反应；72 °C延伸10 min。扩增产物经回收后进行测序，其序列如SEQ ID No:2所示。
实施例2：橡胶树HbSTRAP1基因编码蛋白酵母诱饵载体构建及自激活检测
以CGGAATTCATGGATAAGAAAAGGGTGG （SEQ ID NO:5）和CGGGATCCGTCCTTCCCTGCTTCTTCCT （SEQ ID NO:6）为引物，扩增测序正确的HbSTRAP1基因。PCR扩增反应体系20 μl：2 x PCR buffer 10 μL，SEQ ID NO:5所示引物（10 μmol·L-1）1 μL，SEQ IDNO:6所示引物（10 μmol·L-1）1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O为7 μL。PCR扩增程序：96 °C预变性10 min；96 °C变性30 s，56 °C退火30 s，72 °C延伸1 min 30 s，共35个循环反应；72 °C延伸10 min。扩增产物经EcoR I和BamH I双酶切后连接到经相同内切酶切后的酵母诱饵载体pGBKT7中，并测序验证，得到重组载体pGBKT7-HbSTRAP1。将pGADT7和测序正确的pGBKT7-HbSTRAP1共同转入Y2Hgold酵母菌株中并涂布于SD/-Trp/-Leu/培养基，对生长的菌落挑选单菌落进行菌落PCR检测，挑选鉴定成功的阳性菌落以及pGADT7-T+pGBKT7-P53（阳性对照）pGADT7-T+pGBKT7-Lam（阴性对照）进行富集培养，然后将其按照10×、100×、1000×和10000×的梯度稀释点在SD/-Trp/-Leu和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上。生长结果显示，pGADT7+pGBKT7-HbSTRAP1在SD/-Trp/-Leu二缺培养基上可正常生长，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上无法生长（图1），说明HbSTRAP1不具有自激活活性，可用于后续的酵母文库筛选实验。
实施例3：橡胶树HbSTRAP1基因编码蛋白和MVA途径成员及橡胶粒子膜蛋白的酵母双杂互作分析
根据NCBI公共数据库提交的HbHMGR2（NCBI登录号ALR72893）、HbMVD2（NCBI登录号AKM12345）、HbGPS1（NCBI登录号XP_021654686）、HbFPS2（NCBI登录号ATA58393）、HbGGPS3（NCBI登录号XP_021646970）、HbCPT8（NCBI登录号AAM92890）、HbREF1（NCBI登录号XP_021653600）、HbSRPP1（NCBI登录号AMO43677）开放阅读框序列，分别设计相应携带同源重组接头的引物（接头引物F：GGACGAGCTCGGTACC，接头引物R：ACGAGATCTGGTCGAC）扩增胶乳cDNA。目的片段经回收纯化后，根据同源重组克隆试剂盒（翌圣生物科技股份有限公司）操作说明连接至pGADT7酵母载体，并测序验证。
提取测序正确的pGBKT7-HbSTRAP1质粒，分别和pGADT7-HbHMGR2、pGADT7-HbMVD2、pGADT7-HbGPS1、pGADT7-HbFPS2、pGADT7-HbGGPS3、pGADT7-HbCPT8、pGADT7-HbREF1、pGADT7-HbSRPP1质粒共转化Y2Hgold酵母菌株中并涂布于SD/-Trp/-Leu/培养基，对生长的菌落挑选单菌落进行菌落PCR检测，挑选鉴定成功的阳性菌落以及pGADT7-T+pGBKT7-P53（阳性对照）pGADT7-T+pGBKT7-Lam（阴性对照）进行富集培养，然后将其按照10×、100×、1000×和10000×的梯度稀释点在SD/-Trp/-Leu和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上。结果显示所有待测质粒组合均可以在四缺培养基上生长（图2），表明HbSTRAP1与HbHMGR2、HbMVD2、HbGPS1、HbFPS2、HbGGPS3、HbCPT8、HbREF1、HbSRPP1间存在互作关系。
实施例4：橡胶树HbSTRAP1基因转化橡胶草
以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6引物扩增测序正确的HbSTRAP1基因，扩增反应体系和反应程序参照实施例2。扩增产物经EcoR I和BamH I双酶切后连接到经相同内切酶切后的植物表达载体pCAMBIA1300中，并测序验证。将测序正确的pCAMBIA1300-HbSTRAP1转化至农杆菌AGL1中，挑选正常生长的单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定成功的阳性菌落通过叶盘法进行橡胶草遗传转化，得到5个转化株系（图3）。提取转基因植株DNA，以SEQ ID NO:3和SEQID NO:4引物进行阳性植株鉴定，PCR反应体系和反应程序参照实施例1，结果显示5个转化株系OE1-OE5均为阳性（图4A）。
提取转基因植株总RNA并反转录cDNA，采用正向荧光定量引物GAGGGCTTCCACATTTCAGA（SEQ ID NO:7）和反向荧光定量引物AGTCGGGTCAACCACATCAA （SEQID NO:8），通过荧光定量PCR方法对转基因植株进行HbSTRAP1基因的表达量分析。以橡胶草TkRP基因为内参（NCBI登陆号GO664824），对应引物序列分别为qTkRP-F：CGTCGATCTCAAGGATGTTGTC和qTkRP-R：GGAGCTTTGAGAAGAACCAACG。使用BioRad公司的CFX-96荧光定量PCR仪器进行荧光定量PCR。荧光定量PCR扩增反应体系20 μl：2 x TaKaRa SYBRPremix Ex Taq TMII 10 μL，SEQ ID NO:7所示引物（10 μmol·L-1）1 μL，SEQ ID NO:8所示引物（10 μmol·L-1）1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O为7 μL。荧光定量PCR扩增程序：96 °C预变性2 min；96 °C变性10 s，56 °C退火10 s，72 °C延伸10 s，共45个循环反应。扩增结束后绘制熔解曲线，从50 ℃逐渐升高至96 °C，升温速度为0.2 °C/s，全过程检测荧光信号。结果显示5个转化株系均成功表达HbSTRAP1基因，其中OE1、OE2、OE5表达丰度最高（图4B）。提取对照组CK以及转基因株系OE1、OE2、OE5根部天然橡胶，进行分子量检测，结果显示转基因株系OE1、OE2、OE5的橡胶分子量较对照组CK分别增加了25%、58%、32%（图5）。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (8)
1.橡胶树HbSTRAP1基因、或者橡胶树HbSTRAP1基因编码的蛋白质、或者含有橡胶树HbSTRAP1基因编码区的重组载体、或者含有橡胶树HbSTRAP1基因编码区的宿主菌或表达盒在增加天然橡胶分子量中的应用，
所述橡胶树HbSTRAP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示，
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pGBKT7载体，橡胶树HbSTRAP1基因编码区位于pGBKT7载体的EcoR I 和BamH I 两限制性内切酶位点之间。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1300载体，橡胶树HbSTRAP1 基因编码区位于pCAMBIA1300 载体的EcoR I 和BamH I 两限制性内切酶位点之间。
4.橡胶树HbSTRAP1基因、或者橡胶树HbSTRAP1基因编码的蛋白质、或者含有橡胶树HbSTRAP1 基因编码区的重组载体、或者含有橡胶树HbSTRAP1基因编码区的宿主菌或表达盒在与HbHMGR2、或HbMVD2、或HbGPS1、或HbFPS2、或HbGGPS3、或HbCPT8、或HbREF1、或HbSRPP1互作中的应用，
所述橡胶树HbSTRAP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pGBKT7载体，橡胶树HbSTRAP1基因编码区位于pGBKT7载体的EcoR I 和BamH I 两限制性内切酶位点之间。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1300载体，橡胶树HbSTRAP1基因编码区位于pCAMBIA1300载体的EcoR I 和BamH I 两限制性内切酶位点之间。
7.一种提高天然橡胶分子量的方法，其特征在于，将权利要求1所述的橡胶树HbSTRAP1基因或者含有权利要求1所述的橡胶树HbSTRAP1基因编码区的重组载体遗传转化至橡胶草或者橡胶树。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1300载体，所述的橡胶树HbSTRAP1基因编码区位于pCAMBIA1300载体的EcoR I 和BamH I 两限制性内切酶位点之间。
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