KR100927803B1

KR100927803B1 - 식물 형질전환체를 선별하기 위한 마커로서 ｇｐｔ 유전자

Info

Publication number: KR100927803B1
Application number: KR1020070119959A
Authority: KR
Inventors: 전재흥; 김현순; 김윤식; 이영화; 김미선; 민성란; 정원중; 권석윤; 정혁
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-11-23
Filing date: 2007-11-23
Publication date: 2009-11-23
Also published as: KR20090053230A; WO2009066919A3; WO2009066919A2

Abstract

본 발명은 GPT (UDP-N-acetylglucosamine:dolichol phosphate-N-acetylglucosamine-phosphotransferase) 유전자로 이루어진, 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커, GPT 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 투니카마이신 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 선별 방법 및 상기 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법에 관한 것이다.

GPT, 벡터, 식물 선별, 마커, 종자

Description

식물 형질전환체를 선별하기 위한 마커로서 ＧＰＴ 유전자{GPT gene as a marker for selecting plant transformant}

본 발명은 식물 유래의 GPT 유전자를 이용한 유전자 조작 식물체 선별 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 GPT 유전자로 이루어진, 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커, GPT 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 투니카마이신 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 선별 방법 및 상기 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법에 관한 것이다.

유전자 조작이란 한 종으로부터 유전자를 얻은 후에 이를 다른 종에 삽입하는 기술로서, 1953년 왓슨과 크릭에 의해 DNA의 구조가 밝혀지고 1970년대 이후 DNA를 자르는 것이 가능해지면서 이러한 기술도 가능해졌다.

유전자 조작은 원하는 특성을 나타내는 유전자를 인위적으로 떼어내어 다른 생명체에 집어넣기 때문에 그 특성의 발현 가능성이 높고 시간이 적게 걸린다는 장점이 있어 이제는 매우 일반화되어 있다. 이런 방식으로 새롭게 만들어진 생명체를 유전자 조작 생물체(geneticcally modified organisms; GMO)라고 부르며 벼나 감자, 옥수수, 콩 등의 농작물에 행해지면 유전자 조작 농작물이라 하고, 이를 가공하면 유전자 조작 식품이라고 한다.

유전자 조작 농작물은 해충과 잡초에도 잘 견디는 품종을 단시간 내에 다량 수확할 수 있기 때문에 식량문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 맛과 영양을 획기적으로 개선하거나 약용 성분을 주입하여 영양 결핍을 해결할 수도 있다. 우리나라에서 1995년부터 두부, 간장, 두유, 메주 제조용으로 수입한 콩의 30% 가량이 유전자 변형 콩으로 추정되고 있으며 우리 국민의 대다수는 이미 유전자 조작 농산물의 맛을 보았고 유전자 조작 농작물의 애용은 계속 증가할 추세이다.

그러나, 형질 전환된 식물체만 선별하기 위해 항생제나 제초제 저항성 유전자 등 표지 유전자를 사용하는데, 이 유전자가 외부 자연으로 퍼질 경우 제초제에 강한 수퍼 잡초나 페니실린 등의 항생제에 죽지 않는 수퍼 박테리아 등이 만들어져 생태계를 파괴할 수 있다는 우려가 있어 실용상업화로 이어지는 걸림돌이 되고 있다.

상기 문제를 극복하면서도 상품성이 우수한 유전자 조작 농작물의 개발을 위해서는, 생태계 교란을 일으킬 수 있는 항생제나 제초제 내성 유전자 대신 사용할 수 있는 환경 친화적인 유전자를 발굴해야 하며 이런 노력은 유전자 조작 식품의 안전성을 위해 필수적이다.

GPT는 돌리콜(dolichol) 경로 안에서 돌리콜-포스포-포스포-올리고당(dolichol-p-p-oligosaccharides)의 합성을 위해 필요한 초기 반응을 촉매하고, N-결합 당 단백질의 당질화 안에 포함되는 중요한 효소이며, 아스파라진과 연쇄된 글리칸(Asn-linked glycans)의 생합성을 촉매 한다(Tine Kring Sorensen et al., 2003, Biochimica et Biophysica Acta, 1619: 89-97). 아스파라진과 연쇄된 글리칸의 중요한 기능 중 하나는 소포체에서 샤페론에 의해 폴리펩티드의 정확한 접힘(folding)을 필요로 한다는 것이다. 부정확하게 접힌 단백질들은 UPR (unfolded protein response)과 같은 스트레스 반응을 유도하게 되어 BiP(binding protein)와 같은 소포체 내에 있는 샤페론의 상위조절(up-regulation)에 관여하게 된다. UPR은 단백질들이 아미노산 유사체(amino acid analogs), 또는 아스파라진과 연쇄된 글리칸 형성의 저해재인 투니카마이신이 존재하여 합성되어질 때 유도된다. 아스파라진과 연쇄된 당질화가 투니카마이신에 의해 저해될 때, BiP의 전사가 유도되고, 이러한 유도는 UPR을 발현시킨다. 투니카마이신은 글리칸 생합성 경로에서 첫번째 효소인 GPT의 강력한 저해제이고, 초기의 폴리펩티드에서 다음으로 부착하기 위해 글리칸의 합성을 방해한다. 그러나 투니카마이신은 다른 N-아세틸글루코사민 전이효소(N-acetylglucosamine transferase)를 억제하지는 않는다고 보고되어있다(Nozomu Koizumi et al., 1999, Plant Physiology, 121: 353-361).

이에, 본 발명자들은 투니카마이신을 선별 물질로, 식물 유래의 GPT 유전자를 선별 마커로 사용하여 유전자 조작 식물체 선별 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 식물 유래의 GPT 유전자를 선별 마커로 사용하고 투니카마이신으로 유전자 조작 식물체를 선별하는 방법을 제공함으로써 환경친화적인 유전자 조작 식물체의 안전성을 향상시키고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 GPT (UDP-N-acetylglucosamine:dolichol phosphate-N-acetylglucosamine-phosphotransferase) 유전자로 이루어진, 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 GPT 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 투니카마이신 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 선별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 GPT 유전자를 조작 식물체의 선별 마커로 사용이 가능하며, 생태계 교란을 일으킬 수 있는 항생제나 제초제 내성 유전자 대신 사용할 수 있어 유전자 조작 식물체의 안정성을 높여 유전자 조작 식품 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GPT (UDP-N-acetylglucosamine:dolichol phosphate-N-acetylglucosamine-phosphotransferase) 유전자로 이루어진, 식물의 형질전환 여부를 선별하기 위한 마커를 제공한다.

GPT 유전자는 돌리콜 경로(dolichol pathway) 안에서 돌리콜-포스포-포스포-올리고당(dolichol-p-p-oligosaccharides)의 합성을 위해 필요한 초기 반응을 촉매하고, 아스파라진과 연쇄된 글리칸(Asn-linked glycans)의 생합성을 촉매한다. 또한, GPT는 대부분의 동물이나 식물에 모두 존재하는 단백질이므로, 형질전환 작물에 사용된 후에 자연 속으로 퍼져도 생태계를 교란시키는 문제를 해소하여 유전자 조작 식물체의 안전성을 높일 수 있다.

투니카마이신은 GPT의 강력한 저해제이므로, 식물체를 투니카마이신 함유 배지에서 키우면 식물체의 GPT가 투니카미이신에 의해 저해되어 식물이 생존할 수 없게 된다. 본 발명에서, GPT 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시키고, 상기 형질전환시킨 식물 세포를 투니카마이신 함유 배지에서 증식시키면 재조합 식물 발현 벡터가 형질전환된 식물 세포는 GPT가 과발현되므로, 발현된 GPT의 일부는 배지 중의 투니카마이신에 의해 저해되지만, 여분의 GPT는 투니카마이신에 의해 저해를 받지 않으므로, 형질전환된 식물체는 투니카마이신 함유 배지에서 생존할 수 있다. 그러나, 재조합 식물 발현 벡터가 형질전환되지 않은 식물 세포는 GPT가 발현되지 않아 배지 중의 투니카마이신이 식물체의 GPT를 저해하므로, 식물체는 투니카마이신 함유 배지에서 생존할 수 없게 된다. 이러한 방식으로, GPT 유전자는 식물의 형질전환 여부를 선별할 수 있는 선별 마커(selection marker)로 활용될 수 있는 것이다.

바람직하게는, 상기 GPT 유전자는 서열번호 1로 표시된 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, GPT 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, GPT 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 식물의 형질전환 여부를 선별하는데 이용될 수 있다. 선별 방법은 전술한 바와 같다. 상기 GPT 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 표시된 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 벡터는 일반적인 식물 발현 벡터에 이용되는 카나마이신 또는 하이그로마이신 내성 유전자 대신 투니카마이신 내성 유전자를 삽입하여 제조된 벡터로서, GPT 유전자가 CaMV35S 프로모터에 정방향으로 위치하고, 리포터 유전자인 GUS를 포함하고 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 도 2에 기재된 pCAMBIA1301-GPT-GUS 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터에 목적 유전자를 삽입하여 발현시킬 수 있는 것이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않 는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 페투인 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적 당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 식물체는 GPT를 발현한다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식물체는 감자, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도 라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으나, 바람직하게는 감자이다. 본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환시킨 식물 세포를 투니카마이신 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 선별 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물의 선별 방법은 본 발명에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당 하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 감자이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 형질전환시킨 식물 세포를 투니카마이신 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함한다. GPT 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시키고, 상기 형질전환시킨 식물 세포를 투니카마이신 함유 배지에서 증식시키면 재조합 식물 발현 벡터가 형질전환된 식물 세포는 GPT가 과발현되므로, 발현된 GPT의 일부는 배지 중의 투니카마이신에 의해 저해되지만, 여분의 GPT는 투니카마이신에 의해 저해를 받지 않으므로, 형질전환된 식물체는 투니카마이신 함유 배지에서 생존할 수 있다. 그러나, 재조합 식물 발현 벡터가 형질전환되지 않은 식물 세포는 GPT가 발현되지 않아 배지 중의 투니카마이신이 식물 체의 GPT를 저해하므로, 식물체는 투니카마이신 함유 배지에서 생존할 수 없게 된다. 이러한 방식으로, GPT 유전자는 식물의 형질전환 여부를 선별할 수 있는 선별 마커(selection marker)로 활용될 수 있는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 배지 중의 투니카마이신의 농도는 0.05-0.3 ppm인 것이 바람직하다. 투니카마이신의 농도가 0.05 ppm 미만이면 형질전환체와 비형질전환체를 선별하기 어려우며, 0.3 ppm 초과이면 형질전환 식물체의 재분화율이 감소하기 때문이다. 더욱 바람직하게는, 상기 배지 중의 투니카마이신의 농도는 0.05-0.2 ppm, 가장 바람직하게는 0.1 ppm이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계;

상기 형질전환시킨 식물 세포를 투니카마이신 함유 배지에서 증식시키는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

식물 세포를 형질전환하는 방법은 전술한 바와 같으며, 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 투니카마이신 농도에 따른 감자의 내성 정도 확인

감자의 내성 정도를 확인하기 위해, 15일 정도 배양 용기 내에서 배양한 잎을 절단하여 각각 0.01 ㎎/ℓ의 나프탈렌초산(naphthalenacetic acid, NAA), 0.1 ㎎/ℓ의 지베렐린(gibberelin, GA₃), 2.0 ㎎/ℓ의 제아틴(Zeatin) 및 선별 물질로 0.01, 0.05, 0.1, 0.3 ㎎/ℓ의 투니카마이신(Tunicamycin)이 들어 있는 식물 재분화배지(PR 배지)에 배양하였다. 0.01, 0.05 ㎎/ℓ의 투니카마이신 PR 배지에서는 옮겨준 지 10일 경과 후, 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스가 형성되었고, 4주 경과 후부터 소식물체가 출현하였다. 그러나 이 농도보다 높은 투니카마이신 PR 배지에서는 캘러스는 생성되나 한 달 후부터 눈에 띄게 갈변현상이 나타났다(도 1).

실시예 2: GPT 유전자를 발현시키는 식물 발현 벡터의 제조

<2-1> 식물 발현용 플라스미드

감자에 형질전환시키기 위한 플라스미드 벡터 pCAMBIA1301-GPT-GUS(도 2B)를 제조하였다. 선별 마커로 하이그로마이신(hygromycin)을 사용하는 pCAMBIA1301 벡터(CAMBIA GPO Box3200, 도 2A)에서 XhoⅠ 제한효소로 하이그로마이신 저항성 유전 자를 제거한 후, 서열번호 1로 기재되는 감자의 GPT 유전자 서열을 기반으로 감자의 cDNA로부터 PCR 합성하여 서열을 확인한 후 이를 CaMV35S 프로모터에 정방향으로 결합시켜 제조하였다. 이때, GPT 유전자는 XhoⅠ 제한효소부위를 이용하여 결합하였는데 제한효소부위를 도입하는 방법은 다음의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법에 의하였다. 먼저, CaMV35S 프로모터와 CaMV35S 폴리A 사이에 발현되도록 양 프라이머의 말단 부위에 인위적으로 5' 말단과 3' 말단의 XhoⅠ제한효소부위를 첨가하였다. 제조된 프라이머로 PCR을 수행하여 클로닝에 이용될 벡터에 도입될 수 있게 GPT 유전자를 증폭시켰다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 45초의 순서로 30회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다 (도 2B).

상기와 같이 제조된 각 벡터의 플라스미드 pCAMBIA1301-GPT-GUS를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404)로 도입하고 식물의 형질전환에 사용하였다. 또한, 형질전환의 기본조건을 조사하기 위하여 리포터 유전자가 GUS인 pCAMBIA1301 플라스미드를 이용하였다.

실시예 3: 선별 유전자로서 GPT 유전자의 효용성 확인

<3-1> 아그로박테리아를 이용한 pCAMBIA1301-GPT-GUS의 형질전환

감자의 잎을 잘라 재분화 전배지에서 6시간 동안 배양한 후 pCAMBIA1301-GPT-GUS를 포함한 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404와 15분 동안 공동 배양하 여 형질전환 하였다. 상기의 형질전환된 잎 절편을 3일 동안 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid)가 들어있는 캘러스 유도 배지(CC 배지)에서 배양하였다. 이때 캘러스 유도 배지는 MS 배지에 3%의 수크로스, 0.8% 한천 및 2.0 ㎎/ℓ의 2,4-D를 첨가하고, 배지의 pH를 5.8로 조정한 배지를 사용하였다. 그 후, 0.01 ㎎/ℓ의 나프탈렌초산, 1000 ㎎/ℓ의 카베니실린(Carbenicillin disodium), 2.0 ㎎/ℓ의 제아틴 및 선별 물질로 0.1 ㎎/ℓ의 투니카마이신(Tunicamycin)이 들어 있는 식물 재분화배지(PR 배지)로 옮겨주었다. 옮겨준 지 10일 경과 후, 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스가 형성되었고, 4주 경과 후부터 소식물체가 출현하였다. 상기 소식물체를 분리가 가능할 정도까지 배양한 다음, MS 기본배지로 옮겨 주어 정상 식물과 동일한 과정으로 증식시켰다.

<3-2> PCR을 통한 형질전환 식물체의 선별

형질전환 후 GPT 유전자가 식물내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하였다. 구체적으로, 투니카마이신이 함유된 배지에서 선발된 소식물의 잎 절편으로부터 염색체 DNA를 분리한 후, 정방향 프라이머 5'-CCA CAA GTG ACA CAC AGT GAG AAA GAG-3'(서열번호 2)와 역방향 프라이머 5'-AGC TGA TCT CGT ATC ACA GCT TCA-3'(서열번호 3), 그리고 정방향 프라이머 5'-CGT GAA ATC AAA AAA CTC GAC GGC-3'(서열번호 4)와 역방향 프라이머 5'-AAG TCC GCA TCT TCA TGA CGA CCA-3'(서열번호 5)를 각각 PCR 반응에 이용하였다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시 킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 45초의 순서로 30회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다(도 3A). 도 3A에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 감자 식물체 (#8, 14, 16)에서는 GPT 유전자 및 GUS 유전자 모두 PCR 산물을 관찰할 수 있었다.

실시예 4: GPT 유전자의 노던 블럿 분석

전체 RNA는 페놀/SDS 방법을 이용하여 샘플로부터 추출하였다. 전체 RNA의 25㎍을 2.2 M 포르말린이 포함된 1% 아가로스 겔로 전기영동에 의해 분리하고 나일론 막으로 옮겼다. GPT 프로브는 감자 GPT 유전자 서열로부터 설계된 정방향 프라이머 5'-CCA CAA GTG ACA CAC AGT GAG AAA GAG-3'(서열번호 2)와 역방향 프라이머 5'-AGC TGA TCT CGT ATC ACA GCT TCA-3'(서열번호 3)를 주형으로 하여 클론된 감자 cDNA를 이용하여 PCR을 실시하였다. 나일론 막은 PCR DIG 프로브 합성 키트 (Roche Molecular Biochemicals)를 이용하여 디곡시제닌 (DIG)이 라벨링된 프로브로 혼성화하였다. 혼성화 완충액에서 42℃ 조건으로 16 시간 동안 혼성화를 계속하여 실시하고, 막을 실온에서 5분 동안 2XSSC, 0.1% (w/v) SDS로 2회 세척하였다. 그 후, 68℃에서 0.1XSSC, 0.1% SDS로 15분 동안 세척하고 타깃 DNA를 제조처에서 제시한 방법 (Roche Molecular Biochemicals)으로 DIG 발광 감지 키트를 이용하여 확인하였다 (도 3B). 도 3의 B에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 감자 식물체에서 GPT 전사체를 확인할 수 있었다.

실시예 5: GUS 염색을 통한 형질전환체 확인

우선, 리포터 유전자가 GUS인 pCAMBIA1301이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404를 이용하여 형질전환의 조건을 살펴보았다. pCAMBIA1301 플라스미드가 도입된 LBA4404 아그로박테리아를 식물체에 도입 두 달 후 재분화 배지에서 나온 줄기들을 GUS 염색을 한 후, GUS 발현량을 살펴보았다(도 4A). 이때, GUS 염색은 1mM의 X-글루코(5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-글루쿠로닉산)(X-gluc(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Glucuronic acid)과 pH 7.0로 조정한 100 mM의 Na-포스페이트(phosphate) 및 0.5 mM의 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide)를 혼합한 후, 37℃에서 하루 밤 동안 반응시켜 확인하였다. 그 결과, 형질전환 감자 식물체에서 GUS 발현을 확인할 수 있었다 (도 4A).

도 4B는 다른 선별마커들과 GPT의 형질전환율을 비교한 것이다. 도 4B에서 알 수 있는 바와 같이, GPT의 경우에 하이그로마이신(Hyg)이나 바스타(Bastar) 만큼 형질전환 효율은 높지는 않지만, GPT를 식물의 형질전환 여부를 선별할 수 있는 선별 마커로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있다.

도 1은 감자의 잎 절편을 각기 다른 농도의 투니카마이신(tunicamycin) 재분화 배지에서 조직 배양하여 유도되고 있는 감자의 캘러스 및 재분화 정도를 비교한 것이다.

도 2A는 형질전환 조건을 비교하기 위하여 GUS 유전자가 있는 pCAMBIA1301 식물 형질전환용 벡터를 나타내는 모식도이며, 도 2B는 감자의 GPT 유전자를 pCAMBIA1301의 하이그로마이신 저항성 유전자를 제한효소를 이용하여 자르고 CaMV 35S 프로모터에 결합시켜 선별 마커로 사용한 식물 발현벡터인 pCAMBIA1301-GPT-GUS 벡터를 나타내는 모식도이다.

도 3A는 선별된 식물체로부터 식물체들을 이용하여 gDNA를 추출하고 PCR을 통하여 식물체 게놈상에 도입된 감자의 GPT 유전자를 증폭시켜서 형질전환 여부를 확인한 전기영동 사진이며, 도 3B는 노던 블럿을 통해 음성대조군과 비교해 GPT 형질전환 식물체에서 GPT가 발현됨을 나타낸 사진이다.

도 4A는 양성대조군과 음성대조군, 그리고 GPT가 형질전환된 식물체의 GUS 염색을 통해 형질전환된 식물체에서 GUS가 발현됨을 나타내는 그림이고, 도 4B는 다른 선별마커들과 GPT의 형질전환율을 비교한 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> GPT gene as a marker for selecting plant transformant <130> PN07094 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1584 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <220> <221> gene <222> (1)..(1584) <223> Potato GPT gene <400> 1 gtctcccaca agtgacacac agtgagaaag agagatcgaa acaatggcag ctaaaaagcg 60 accgtcaacg gcggcgccgg cgaccgtgaa tcaaccggaa tcatccataa acacggaaaa 120 gcctaaatcc ggtgactcct caacggaacc tcctatagcg ccggcgaaag tttacttaat 180 tttcaaaatc tctttgatat tcttaatccc gtacttatac ttgatatttt atcactacaa 240 aatcgaatcg gagctccgac gatcgattct catcaatgca attgttagct tgatcggatt 300 cttcgtcact gttactatga ttcctgttgc ctctaagtac gtattgagaa ggaatttatt 360 tggatatgat atcaacaaaa aaggcactcc tcaaggctct gtcaaagtac ctgagtcact 420 aggcattatt gttggggctg tgttcttggt cgtggcaatc ttgtttcaat atttcaactt 480 cacagctgat tcaaattggc ttgttgagta caatgctgca ttatcttcaa tctgcttcat 540 gatgctactt gggtttgtgg atgacgtcct tgatgtacct tggagagtga aactgctatt 600 accctccatt gcagctcttc cattgttgat ggcatatgct gggcatacaa ctattattat 660 accgaaaccc cttgtatcat atgttggatt agagatcttg gatctaggat gtatctacaa 720 attatatatg tggctattgg caatattttg cacaaattca atcaatatcc acgctggtat 780 caatggcctt gaagttgggc agacagtcgt tatcgcagct gctattttga tacacaacat 840 catgcaaatt ggagcatctg ctgatcctga atacaaacta gcccatgctt tttctattta 900 ccttgttcag ccaatgcttg ctacttcctt ggctttacta tcatacaact ggtatccttc 960 ctcagttttc gttggtgata cctttacata ttttgctgga atgaccatgg cagtggctgg 1020 aatcttgggt cactttagtg aaacactgct tatattcttt ttgccgcaag ttttgaactt 1080 cctactatca gtacctcagc ttgctggtat tgtaccttgt ccaaggcatc ggctccctaa 1140 gtttgatcct cagactggct tattgaccgg aacaaatgat gggacgctag tgaacctttt 1200 cttaaggcaa ttgggcagaa tgtcagaaca gtccctttgt gtcgtgctac tagtcttcca 1260 ggccctgtgc tgtggcttct gttttctgct gagatggctc cttacgggtt ggtacaaatg 1320 aagctgtgat acgagatcag ctatttcaat aggcgaattc catcagaaca ttaacttaaa 1380 cctgcatgaa gaggttttta ttttatgaag aaacgatgat accatatttt gaagaaagtg 1440 acagccatat acatcatgca ttatagttga aacttgtaat ctatactgat tccctaggag 1500 aattttgtta gaaactgcat tagcacatgt tgtacttagc tttctttgta cgattttgat 1560 gttgggagac gcatttatct tggt 1584 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ccacaagtga cacacagtga gaaagag 27 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 agctgatctc gtatcacagc ttca 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 cgtgaaatca aaaaactcga cggc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 aagtccgcat cttcatgacg acca 24

Claims

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서열번호 1로 표시된 염기서열로 이루어지는 GPT (UDP-N-acetylglucosamine:dolichol phosphate-N-acetylglucosamine-phosphotransferase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 0.05-0.3 ppm의 투니카마이신(tunicamycin) 함유 배지에서 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 선별 방법.
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서열번호 1로 표시된 염기서열로 이루어지는 GPT (UDP-N-acetylglucosamine:dolichol phosphate-N-acetylglucosamine-phosphotransferase) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 감자 식물 세포를 형질전환하는 단계;

상기 형질전환시킨 감자 식물 세포를 0.05-0.3 ppm의 투니카마이신(tunicamycin) 함유 배지에서 증식시키는 단계; 및

상기 형질전환된 감자 식물 세포로부터 형질전환 감자 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 감자 식물의 제조 방법.
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