KR100985971B1 - 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 선발표지 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트, 상기 카세트를 포함하는 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터, 상기 벡터를 이용하여 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물체에 관한 것이다.

본 발명의 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터에 따르면, 형질전환 식물체의 상업화를 위한 위해성 및 안전성 평가에 소요되는 많은 시간과 비용을 줄일 수 있다. 또한, 상기 벡터에 목적 유전자의 클로닝이 매우 용이하므로, 형질전환 식물체의 제조가 용이하다.

Cre, argE, 선발표지 유전자, 카세트, 벡터, 형질전환

Description

선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터{Transformation vector for eliminating selection marker gene}

본 발명은 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 선발표지 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트, 상기 카세트를 포함하는 선발표지 유전자 제거용 벡터, 상기 벡터를 이용하여 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물체에 관한 것이다.

식물체에 외래 유전자를 도입하는 기술인 '식물체 형질전환법'에는 토양미생물(Agrobacterium tumefaciens 등)에 의한 방법과 직접 전달방법(미세입자 bombarding 방법, 화학물질에 의한 방법)이 있다. 이들 기술들은 모두 항생제 내성 유전자나 제초제 저항성 유전자와 같은 선발표지 유전자(Selection Marker Gene)에 의존하고 있다. 즉, 식물체에 도입하고자 하는 유전자와 선발표지 유전자를 하나의 DNA 단편에 실어서 식물체에 전달함으로써, 이 DNA 단편이 전달된 식물세포만 이 항생제나 제초제에 대한 저항성을 갖게 되고, 연구자는 이들 형질전환된 세포로부 터 재분화된 형질전환 식물체를 획득할 수 있다.

하지만, 형질전환 식물체의 제작과정에서 필수불가결한 항생제나 제초제 내성에 관한 잠재적인 해악에 사회적 관심이 집중되어 있어, 개발된 형질전환 식물체의 상업화에 지대한 장애를 초래하고 있다. 또한, 유럽연합은 2004년부터 형질전환작물에 임상적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자의 사용을 금지하고 있다.

뿐만 아니라, 여러 개의 외래유전자를 도입하여 식물체를 개량하고자 하는 경우 한번 사용된 선발표지 유전자는 재사용이 불가하여, 한번 사용된 것들은 반드시 제거되어야만 한다. 즉, 이러한 이유로 선발표지 유전자의 제거기술의 개발이 필요하다.

따라서, 원하는 유전자만이 도입된 형질전환 작물의 개발을 위해서 선발표지 제거용 형질전환 벡터 제작 및 이를 이용한 형질전환 작물의 개발은 형질전환 작물의 조기 품종화에 매우 중요하다.

음성 선발(negative selection) 및 동시 형질전환(co-transformation)은 선발표지 유전자와 도입하고자 하는 외래 목적유전자를 각각 다른 T-DNA에 삽입하고 동시에 식물에 도입시키는 방법이다. 선발표지와 목적유전자가 식물체의 게놈상에 서로 다른 위치에 삽입되어 후대에 선발표지 유전자와 목적 유전자를 갖는 자손으로 분리되어 마커프리 형질전환식물체를 획득할 수 있다. 벡터의 제작이 용이하나 세대가 긴 목본성 작물이나 영양번식 작물에는 적용하기 어려운 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 위치 특이적 재조합 (site-specific recombination)을 이용한 선발표지 유전자 제거 기술로서, Cre recombinase와 이 단백질이 특이적으로 인식하는 loxP site를 이용하는 방법으로, 두 개의 loxP site 사이에 선발마커 유전자가 있고 그 외부에 목적유전자가 위치하는 T-DNA를 도입한 후 Cre recombinase의 발현을 화학적으로 유도하여 선발마커를 제거할 수 있다. 또한 화학적 유도로 선발표지 유전자가 남아 있는 세포들을 효과적으로 제거할 수 있는 음성 선발 마커가 필요하다. 이러한 방법은 동시 형질전환 방법을 적용하기 어려운 영양번식 작물에 적용할 수 있다.

본 발명자는 그동안의 연구에서, 특정 화학물질 (tunicamycin, Tm)에 의해서 강력히 발현이 유도되는 애기장대 유래의 Bip -L 프로모터를 발굴하였으며, 미생물 유래의 argE 유전자(ornithine deacetylase)를 이용하여 형질전환된 세포만을 선택적으로 사멸시키는 음성 선발 기술을 확보하고 있다. 본 발명에서는 이 두 기술을 결합시켜, 선발표지 유전자를 갖지 않는 형질전환체 식물을 만드는데 사용될 선발표지 (SM) 유전자 제거용 벡터를 제작하였다. 상기 벡터는 목적 유전자의 클로닝을 용이하게 하기 위해 유전자 재조합을 통해 제한효소 자리를 많이 변형하였다. 따라서, 다중 클로닝 자리에 목적 유전자를 손쉽게 클로닝하여 식물 형질전환체를 제조할 수 있는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 선발표지 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 카세트를 포함하는 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터에 따르면, 형질전환 식물체의 상업화를 위한 위해성 및 안전성 평가에 소요되는 많은 시간과 비용을 줄일 수 있다. 또한, 상기 벡터에 목적 유전자의 클로닝이 매우 용이하므로, 형질전환 식물체의 제조가 용이하다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pBip-L 프로모터에 작동가능하게 연결된 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 선발표지 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트를 제공한다.

본 발명의 카세트는 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 선발표지 유전자를 포함한다. 구체적으로, Cre (Cre recombinase) 유전자는 pBip-L 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 상기 BiP는 루미날 결합 단백질(luminal binding protein)로서, ER에 위치해 있는 HSP70 샤페론 패밀리의 한 종류이고, 포유동물에서는 글루코스-조절 단백질 (glucose-regulated protein) 78 이라고 불린다 (Gething, Semin. Cell. Dev. Biol., 10, pp465-472, 1999). BiP는 ER을 통과하는 단백질의 이동(translocation), 접힘(folding) 및 결합(assembly)에 중요한 역할을 한다. pBip-L 프로모터는 투니카마이신 (tunicamycin, Tm)에 의해서 강력히 발현이 유도되는 애기장대 유래의 프로모터이다. 본 발명에서, '작동가능하게 연결된'은 pBip-L 프로모터에 의해 Cre 유전자가 정상적으로 발현이 되도록 하는 것을 의미한다. Cre 유전자에 의해 발현되는 Cre recombinase는 loxP site를 특이적으로 인식하여, 두 개의 loxP site 사이에 존재하는 선발표지 유전자를 제거할 수 있다.

본 발명의 argE (ornithine deacetylase) 유전자는 역선발표지 유전자(Negative Selectable Marker Gene)에 해당하며, 이는 형질전환된 세포만을 선택적으로 사멸시키는 효소를 코딩하는 유전자로서, 식물 형질전환체에 N-아세틸 포스피노트리신을 처리하면 argE를 갖는 세포만 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 상기 유전자는 미생물 유래일 수 있다. 역선발표지 유전자는 선발표지 유전자가 없는 식물세포만을 선별적으로 선발하고자 하는 경우에 사용되는 유전자를 의미한다. 이러한 역선발표지 유전자는 식물세포의 성장을 저해하거나 사멸시키는 화학물질을 대사하는 효소들을 코딩한다. 역선발표지 유전자를 갖지 않는 식물체의 경우 주어 진 독성물질의 전구체에 대해 아무런 영향을 받지 않지만, 이를 갖는 식물체의 경우 전구체로부터 독성물질을 만드는 효소의 작용에 의해 식물체는 성장이 저해되거나 사멸한다. 이러한 역선발표지 유전자에 의한 식물체 선발법을 역선발법(Negative selection)이라고 한다. 이러한 역선발표지 유전자는 현재까지 많은 수가 보고된 바 있다. 이들 유전자의 예로는 codA, argE, iaaH, P450 su1 등이 있으며, 이들에 의해 코딩되는 효소들은 무독성 기질들을 독성의 산물로 바꾸어 역선발표지 유전자를 갖는 식물체의 성장을 방해한다. codA 유전자는 대장균에서 유래하고, 이 유전자의 발현으로 생성된 시토신 디아미나제(cytosine deaminase)는 무독성의 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine:5-FC)을 디아미네이션시켜 DNA의 복제를 방해하는 독성의 5-플루오로우라실(5-fluorouracil:5-FU)로 전환시키는 기작을 통해 5-플루오로시토신에 대한 민감성을 부여한다.

본 발명의 선발표지 유전자는 NPTII(neomycin phosphotransferase II) 유전자, HPT(hygromycin phosphotransferase) 유전자, bar 유전자 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 선발표지 유전자란 식물체에 목적 유전자와 함께 형질전환되어, 형질전환 식물체만을 선택적으로 선발할 수 있도록 하는 유전자를 의미한다. 선발표지 유전자는 현재 무수히 많은 종류가 보고되어 있으며, 이러한 유전자의 대표적인 예로는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자, 웅성 불임성 유전자, 과실 완숙방지 유전자 등이 있다. 즉, 토양미생물을 이용한 식물체 형질전환단계에서 항생제나 제초제 등을 배지에 넣어주면 목적 유전자와 바로 인접한 선발표지 유전자가 전달된 식물세포만이 선별 적으로 증식하게 된다. 이와 같이, 식물세포로의 선발표지 유전자의 도입은 목적유전자를 갖는 형질전환식물체를 선발하는 역할을 수행한다.

nptii 유전자의 발현으로 생성된 카나마이신 포스포트랜스퍼라제(kanamycin phosphotransferase)는 카나마이신을 인산화시켜 불활성화하는 기작을 통해 항생제인 카나마이신에 대한 저항성을 부여한다. hpt 유전자의 발현으로 생성된 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase)는 하이그로마이신을 인산화시켜 불활성화하는 기작을 통해 항생제인 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여한다. bar 유전자의 발현으로 생성된 포스피노스리신 아세틸트랜스퍼라제(phosphinothricin acetyltransferase)는 포스피노스리신을 아세틸레이션시켜 불활성화하는 기작을 통해 제초제인 '바스타'(Basta, 주성분: phosphinothricin)에 대한 저항성을 부여한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 nptii 및 hpt 유전자를 사용하였다.

본 발명의 일 구현예에 따른 카세트는 도 11 또는 도 12에 기재된 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트일 수 있다. 도 11에 기재된 카세트는 선발표지 유전자로서 nptii 유전자를 가지며, 도 12에 기재된 카세트는 선발표지 유전자로서 hpt (hphi와 상호교환하여 사용함) 유전자를 가진다.

도 11에 기재된 카세트는 양 말단에 loxP 사이트가 있으며, 그 내부에 pBip-L 프로모터에 작동가능하게 연결된 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 NPTII(neomycin phosphotransferase II) 선발표지 유전자가 존재한다. Cre 유전자는 프로모터로서 Bip-L 프로모터, 터미네이터 로서 nos 터미네이터를 가지고 있으며, argE 유전자는 프로모터로서 CaMV 35S 프로모터, 터미네이터로서 nos 터미네이터를 가지고 있으며, nptii 유전자는 프로모터로서 nos 프로모터, 터미네이터로서 nos 터미네이터를 가지고 있으며, 카세트 내부에는 HindIII 제한효소 자리가 하나 존재한다.

도 12에 기재된 카세트는 양 말단에 loxP 사이트가 있으며, 그 내부에 pBip-L 프로모터에 작동가능하게 연결된 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 HPT(hygromycin phosphotransferase) 선발표지 유전자가 존재한다. Cre 유전자는 프로모터로서 Bip-L 프로모터, 터미네이터로서 nos 터미네이터를 가지고 있으며, argE 유전자는 프로모터로서 CaMV 35S 프로모터, 터미네이터로서 nos 터미네이터를 가지고 있으며, hpt (또는 hphi) 유전자는 프로모터로서 nos 프로모터, 터미네이터로서 nos 터미네이터를 가지고 있으며, 카세트 내부에는 HindIII 제한효소 자리가 하나 존재한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 카세트에서, 상기 도 11 또는 도 12에 기재된 카세트는 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 카세트는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서 열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pBip-L 프로모터에 작동가능하게 연결된 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 선발표지 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트를 포함하는 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 형질전환 벡터는 도 11 또는 도 12에 기재된 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트를 포함할 수 있다. Cre 유전자, argE 유전자, 및 NPTII 또는 HPT 선발표지 유전자는 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 벡터는 도 19에 기재된 pSYCAN 벡터 또는 pSYCAH 벡터일 수 있다. 상기 pSYCAN 벡터 또는 pSYCAH 벡터는 Cre 유전자, argE 유전자, 및 NPTII 또는 HPT 선발표지 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트를 포함하며, 벡터 내부에 기존에 존재하던 제한효소 자리를 많이 제거하여 다중 클로닝 자리에 목적 유전자를 용이하게 삽입하도록 하였다. 상기 pSYCAN 벡터 또는 pSYCAH 벡터는 더욱 바람직하게는 각각 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루질 수 있다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터에 목적 유전자를 삽입하여 재조합 식물 발현 벡터를 제조하는 단계;

상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 형질전환하는 단계; 및

선발표지 유전자가 제거된 형질전환체를 선발하는 단계를 포함하는 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물의 제조 방법은 본 발명의 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터에 목적 유전자를 삽입하여 재조합 식물 발현 벡터를 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명의 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터는 바람직하게는 pSYCAN 벡터 또는 pSYCAH 벡터일 수 있으며, 이는 전술한 바와 같다.

본 발명의 벡터에 도입될 수 있는 목적유전자에는 어떠한 제한도 없다. 본 발명의 실시예에서는 목적유전자를 대신하여 리포터 유전자(reporter gene)인 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS)가 사용되고 있다. GUS는 기질인 X-Gluc에 작용하여 청색의 다중체를 형성하는 효소활성을 가지므로, 형질전환된 식물체를 확 인하는데 있어서 매우 유용하다.

본 발명의 형질전환 식물의 제조 방법은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 형질전환하는 단계를 포함한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 형질전환 식물의 제조 방법은 선발표지 유전자가 제거된 형질전환체를 선발하는 단계를 포함하는데, 이는 형질전환된 식물체에 투니카마이신 및 N- 아세틸 포스피노트리신을 처리하여 수행할 수 있다. 즉, 투니카마이신을 처리하여 pBip-L 프로모터를 강력하게 발현을 유도하며, 발현이 유도된 pBip-L 프로모터에 의해 Cre recombinase가 발현이 되며, 이는 loxP site를 특이적으로 인식하여, 두 개의 loxP site 사이에 존재하는 선발표지 유전자를 제거한다. 또한, N-아세틸 포스피노트리신을 처리하여 argE를 갖는 세포만 선택적으로 사멸시킨다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 선발된 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물체를 제공한다. 형질전환을 요하는 대상 식물체에 대해서는 어떠한 제한도 없다. 따라서, 어떠한 식물체도 본 발명의 대상이 되는 식물체로서 유효하며, 이는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으나, 바람직하게는 담배이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 제한효소 인지 부위가 제거된 선발표지 유전자 제거용 카세트의 제조

1) pLoxC3 에 Bip -L: Cre 카세트의 도입

도 1은 pLoxC3에 Bip -L: Cre 카세트의 도입을 보여주는 그림이다. 본 실험실에 보유하고 있던 pLoxC2의 MCS (multiple cloning site)의 구조를 변경한 pLoxC3 벡터를 프라이머 어닐링 방법으로 제작하였다 (도 1A). 이 벡터는 MCS를 기준으로 Cre - recombinase (Cre) 인지부위인 LoxP site를 양쪽에 가지고 있으며, Bip-L 프로모터에 Cre 유전자를 클로닝한 카세트 (도 1B)의 도입이 가능하도록 제작하였다 (도 1C). PBip -L: Cre 카세트를 PstI과 SalI으로 전체 ORF를 절단하여 (도 1B), pLoxC3에 도입하였다 (도 1C). 그리고 PBip -L: Cre 카세트가 pLoxC3에 정확하게 도입되었는지를 확인하기 위하여 PstI과 SalI으로 pLoxC3 + Bip -L: Cre를 절단한 결과 PBip -L: Cre 카세트가 들어간 클론들 (#2, 6, 7, 8)이 확인되었다(도 1D).

2) pLoxC3 + Cre 에 P35S : argE 카세트의 도입

도 2는 pLoxC3 + Cre 에 P35S : argE 카세트의 도입을 보여주는 그림이다. 위에서 제작한 pLoxC3 + Cre에 역선발표지 유전자인 argE ( P35S : argE )를 pLoxC3의 Pst1과 EcoRI 사이에 도입하였다 (도 2C). 그리고 argE ( P35S : argE ) 카세트 (도 2B)가 pLoxC3 + Cre에 도입되었는지 확인하기 위해 PstI과 EcoRI으로 절단한 결과, 도 2D에서 보듯이 P35S : argE 카세트가 들어간 클론들 (#1, 2, 3, 4, 5, 7, 8)을 확인할 수 있었다.

3) pLoxC3 + Cre + argE 의 MCS의 변형(modification)

도 3은 pLoxC3 + Cre + argE 의 MCS 변형을 보여주는 그림이다. 위에서 제작된 벡터에 양성 선발표지 유전자(positive selectable marker gene)를 도입하기 위해 pLoxC3의 MCS에 있는 몇몇 제한효소 자리를 변형시켰다. 이를 위해 pLoxC3+Cre+argE 를 SphI과 EcoRI로 처리하고, 프라이머 쌍을 합성하여 이 두 제한효소 자리를 제거하였다. 그리고 그 사이에 도 3에서 보는 바와 같이 EcoRI, KpnI, SphI 제한효소 자리를 도입하였다. 이렇게 하여 만들어진 벡터를 'pLoxC3+Cre+argE_Modified' 로 명명하였다.

4) pLoxC3 + Cre + argE _Modified에 양성 선발표지 유전자인 Nptii와 hphi의 도입

도 4 및 5는 각각 pLoxC3 + Cre + argE _Modified에 양성 선발표지 유전자인 Nptii 및 hphi 유전자를 도입한 그림이다. 이어서 pLoxC3 + Cre + argE _Modified에 양성 선발표지 유전자인 Nptii ( P35s : Nptii )와 hphi ( P35 : hphi )를 각각 KpnI과 EcoRI 사이에 도입하였다. 도 4 및 5에서 보는 바와 같이, pLoxC3+Cre+argE_Modified 벡터에 Nptii ( P35s : Nptii )와 hphi ( P35 : hphi )가 도입되었는지 확인하기 위하여 KpnI과 EcoRI으로 절단한 결과, Nptii ( P35s : Nptii )가 들어간 재조합 클론들 (#2, 3, 4, 8, 9)을 겔 전기영동으로 확인하였으며 (도 4D), 또한 hphi ( P35 : hphi )가 들어 간 재조합 클론들 (#1, 2, 3, 6, 7, 8, 9)도 확인할 수 있었다 (도 5D).

5) 카세트 내의 제한효소 인지 부위의 제거

도 6은 선발표지 유전자 제거용 카세트의 주요 제한효소 인지 부위를 나타낸다. 상기 제조된 선발표지 제거용 카세트는 총 길이가 6kb나 되고, 또 다양한 제한효소 인지 부위를 가지고 있어, 실제로 형질전환용 벡터에 사용되는 데에 많은 어려움이 발생하였다. 카세트 내의 제한효소 인지부위를 효율적으로 제거하기 위해서는, 먼저 카세트를 이루는 각 부분을 따로 분리하고, 각각의 부분에서 제한효소 인지부위를 제거한 후, 다시 재조합해야 한다. 이를 위해 cLoxC3 - CAN 카세트와 cLoxC3 - CAH 카세트를 구성하는 각 부분을 클로닝하였다 (도 7). 도 7은 카세트를 이루는 각 부분을 나타낸다.

(1) non-ORF 인지부위의 제거

카세트의 각 부분들의 제한효소 인지부위 중, 클로닝에 사용된 서열 특이적이지 않은 제한효소 인지부위들을 E. coli Klenow fragment와 T4 DNA polymerase를 이용하여 제거하였다 (표 1).

표 1. 제거된 non-ORF 제한효소 인지부위

▶ BiP -L:: CREi (Pst I-Sal I) T4 DNA polymerase 제거 Sac I	▶ p35s :: argE (Pst I-Kpn I) Klenow fragment 제거 Xba I Bam HI T4 DNA polymerase 제거 Sac I Sph I
▶ p35s :: nptII (Kpn I-Eco RI) Klenow fragment 제거 Xba I T4 DNA polymerase 제거 Sac I	▶ p35s :: hphi (Kpn I-Eco RI) T4 DNA polymerase 제거 Pst I

이를 통해 만들어진 카세트는 다음과 같다 (도 8). 도 8은 non-ORF 인지부위 제거 후 카세트를 이루는 각 부분을 나타낸다.

(2) ORF 내의 제한효소 인지부위의 제거

ORF 내의 제한효소 인지부위는 각 코돈에 변이가 생기지 않도록, PCR 기법을 이용한 site-specific single point mutation 기법을 이용하여 인지부위를 제거하였다 (표 2와 도 9). 도 9는 제한효소 인지부위가 모두 제거된 카세트의 각 부분들을 나타낸다.

표 2. site-specific single point mutation 기법을 이용한 ORF 내의 제한효소 인지부위 제거

pBiP -L:: CREi

Bam HI	CGG CGG ATC CGA	→ CGG CGA ATC CGA
	Arg Arg Ile Arg	Arg Arg Ile Arg

p35s :: argE

Hind III	GGC AAG CTT TAC	→ GGC AAG CTA TAC
	Gly Lys Leu Tyr	Gly Lys Leu Tyr
Sal I	GAT GTC GAC GTC	→ GAT GTC GAT GTC
	Asp Val Asp Val	Asp Val Asp Val
Sal I	ACG GTC GAC GAG	→ ACG GTC GAT GAG
	Thr Val Asp Glu	Thr Val Asp Glu

p35S :: nptII

Sph I	GCG CGC ATG CCC	→ GCG CGT ATG CCC
	Ala Arg Met Pro	Ala Arg Met Pro

(3) 선발표지 유전자 제거용 카세트의 재조합 및 제한효소 인지부위의 제거

인지부위가 제거된 각 부분을 다시 pLoxC3 벡터에 클로닝하였다. 즉, 도 6에서 보였던 다양한 제한효소 인지부위가 제거된 카세트를 만들었다 (도 10). 도 10은 재조합된 선발표지 유전자 제거용 카세트를 나타낸다.

그리고 Klenow fragment와 T4 DNA polymerase를 이용하여, 재조합에 사용한 제한효소 인지부위를 다시 제거하였다. 즉, 제한효소 인지부위를 최소화한 선발표지유전자 제거용 카세트를 완성하였다 (도 11 및 도 12). 도 11은 nptii 유전자를 포함하는 제한효소 인지부위가 제거된 선발표지 유전자 제거용 카세트 (cLoxC3-CAN)를 나타낸다. 도 12는 hpt (hphi 라고도 칭함) 유전자를 포함하는 제한효소 인지부위가 제거된 선발표지 유전자 제거용 카세트(cLoxC3-CAH)를 나타낸다. 도 13은 도 6 및 도 11 및 도 12의 카세트를 제한효소로 처리한 후 전기영동한 결과이다. (A) 패널은 pLoxC3 - CAN 이며, (B) 패널은 pLoxC3 - CAH 이며, 별표는 pLoxC3 벡터 골격(2.9kb)을 나타낸다. 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 최종 카세트는 제한효소 인지부위가 많이 제거되었다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: pSYCAN 벡터 및 pSYCAH 벡터의 제조

pBI121의 RK2 oriV, nptIII-L 및 TrfA를 포함하는 pJM121 (참고문헌 [Xiang et al., 1999, Plant Molecular Biology, 40, pp. 711-717]에서 pCB299)을 구축하였다. 구체적으로, pBI121으로부터 PCR 증폭된 단편 (도 14의 좌측 맵에서 적색 막대로 표시함)을 XbaI 및 XhoI으로 절단한 후, Klenow filling에 의해 NotI 제한효소 자리를 제거하였다. 도 14는 Klenow filling에 의해 NotI 제한효소 자리를 제거한 pJM121 벡터의 맵이다.

pJM121에 T-DNA 경계 서열을 도입하여 pJM122를 제조하였다. 구체적으로, pBI121으로부터 PCR 증폭된 T-DNA 단편 (도 15의 좌측 맵에서 적색 막대로 표시함)을 SpeI으로 절단한 후, XbaI으로 절단된 pJM121에 도입하였으며, SpeI 및 XbaI 자리는 라이게이션시 제거되었다. 도 15는 pJM122 벡터의 맵이다.

pJM122에 다중 클로닝 자리 (multiple cloning site)를 도입하여 pNS 벡터를 제조하였다. 구체적으로, pJM122로부터 PCR 증폭하여 (도 16의 좌측 맵에서 적색 막대로 표시함) pNS 벡터를 제조하였다. 도 16은 pNS 벡터의 맵이다.

pBI121 벡터로부터 P35S::GUS::Tnos 단편 (도 17의 좌측 맵에서 적색 막대로 표시함)을 분리한 후, EcoRI/HindIII 이중 절단에 의해 pNS 벡터에 도입하고, BamHI 및 XbaI 사이에 NotI 인지 부위를 삽입하여 pNS-GUS 벡터를 제조하였다. 도 17은 pNS-GUS 벡터의 맵이다.

cLoxC3-CAN 카세트 (도 11) 및 cLoxC3-CAH 카세트 (도 12)를 NotI 인지 부위에 삽입하여 각각 pNS-GUS CAN 벡터 및 pNS-GUS CAH 벡터를 제조하였다. 도 18은 pNS-GUS CAN 벡터의 맵이다.

SacI/BamHI 이중 절단에 이은 T4 DNA polymerase erasing에 의해 GUS::Tnos 단편을 제거하였다. 35S 프로모터 단편을 XbaI/KpnI 이중 절단에 의해 pBluescriptII SK+의 다중 클로닝 자리에 의해 치환하여 pSYCAN 및 pSYCAH을 완성하였다. 도 19는 pSYCAN 벡터 및 pSYCAH 벡터의 맵이다.

실시예 3: 시험용 형질전환 벡터 및 형질전환 식물 제작

선발표지 유전자를 제거하기 위하여, 본 발명에서 개발한 두 가지 방법 중, 2 벡터 시스템에 비교했을 때 카세트 제거 시스템의 가장 중요한 장점은, 세대를 거치지 않고 캘러스 상태에서 선발표지 유전자를 제거할 수 있다는 점이다. 따라서, 캘러스 상태에서 형질전환식물을 선발하고 선발표지유전자의 제거를 확인할 수 있는 모델 식물인 담배를 시험 대상으로 삼아 시험용 벡터를 제작하고 시험용 형질전환 식물을 제작하였다.

먼저, 모델 식물인 담배 (Nicotiana tabacum)에서 선발표지 제거 시스템을 시험 적용하기 위하여, 본 발명에서 제작한 카세트 제거 시험용 식물 형질전환 벡터인 pNS-GUS CAN (도 18 참고)을 담배 형질전환을 위하여 Agrobacterium tumefaciens (LBA4401) 박테리아에 형질도입한 후, leaf disc 형질전환 기법을 통하여 Nicotiana tabacum (Samsun line)에 도입하였다. 형질을 도입한 후, 카나마이신이 들어간 MS 배지에서 3주간 캘러스 생장을 유도하여 1차 선발을 하였다.

1차 선발을 통해 줄기가 유도된 캘러스를 뿌리 유도용 배지로 옮겨 1달간 배 양하여 뿌리를 유도하고 PCR 기법을 이용하여 형질전환 여부를 확인하였다 (도 20). 도 20은 GUS 코딩 서열에 대한 게놈 PCR 결과를 나타낸다. 총 24개의 식물체가 유도되었으나, PCR 기법을 통하여 확인된 형질전환체는 6 개체 (Line number 2, 4, 5, 6, 15, 17)로 확인되었다.

확인된 6 개체를 계대 배양을 위해 뿌리 유도용 배지로 옮기고, 2주간의 순화 과정을 거친 후, 카세트 제거를 위해 투니카마이신 처리를 하였다. 투니카마이신 처리는 5ug/ml의 투니카마이신이 포함되어 있는 0.05% (v/v) DMSO 수용액에 4시간 동안 식물 전체를 담갔으며, 여분의 용액을 제거하고 다시 1주일간 순화 과정을 거쳤다. 순화 과정이 끝난 후 다시 1㎍/ml 의 N-아세틸 포스피노트리신(N-acetyl phosphinothricin)이 포함되어 있는 수용액에 2시간 동안 식물 전체를 담근 후, 여분의 용액을 제거하고 1주일간 식물세포의 괴사를 통해 역선발(negative selection)이 진행되는 것을 관찰하면서 순화 과정을 거쳤다.

카세트 제거와 역선발을 통해 얻어진 형질전환체를 3주간 생장시킨 후, 잎을 얻어 PCR 기법을 통하여, 최종적으로 목적유전자는 도입되었고 선발표지 유전자는 제거되었는지를 확인하였다 (도 21). 도 21은 선발표지 카세트에 대한 게놈 PCR 결과이다. 여섯 개의 형질전환체 중 선발표지 카세트가 완전히 제거된 형질전환체는 15번이었고, 그 외의 다섯 형질전환체에서는 선발표지 카세트가 완전히 제거되지 않았음을 확인할 수 있었다.

얻어진 형질전환체는 모두 투니카마이신과 N-아세틸 포스피노트리신에 별다른 반응을 보이지 않았는데, 이것은 선발표지 카세트가 대부분 제거되어 N-아세틸 포스피노트리신에 의해 세포가 많이 사멸되지 않았기 때문인 것으로 해석된다. 또한 형질전환체는 정상적으로 생장하고 줄기와 뿌리가 유도되었다. 따라서, 투니카마이신과 N-아세틸 포스피노트리신은 식물 분화와 생장에 별다른 문제를 발생시키지 않았다 (도 22). 도 22는 형질전환된 식물을 보여준다. A 내지 C는 각각 형질전환된 담배 (N. tabacum) 라인 2, 4 및 15이다.

도 1은 pLoxC3에 Bip -L: Cre 카세트의 도입을 보여주는 그림이다.

도 2는 pLoxC3 + Cre 에 P35S : argE 카세트의 도입을 보여주는 그림이다.

도 3은 pLoxC3 + Cre + argE 의 MCS 변형을 보여주는 그림이다.

도 4 및 5는 각각 pLoxC3 + Cre + argE _Modified에 양성 선발표지 유전자인 Nptii 및 hphi 유전자를 도입한 그림이다.

도 6은 선발표지 유전자 제거용 카세트의 주요 제한효소 인지 부위를 나타낸다.

도 7은 카세트를 이루는 각 부분을 나타낸다.

도 8은 non-ORF 인지부위 제거 후 카세트를 이루는 각 부분을 나타낸다.

도 9는 제한효소 인지부위가 모두 제거된 카세트의 각 부분들을 나타낸다.

도 10은 재조합된 선발표지 유전자 제거용 카세트를 나타낸다.

도 11은 nptii 유전자를 포함하는 제한효소 인지부위가 제거된 선발표지 유전자 제거용 카세트 (cLoxC3-CAN)를 나타낸다.

도 12는 hpt (hphi 라고도 칭함) 유전자를 포함하는 제한효소 인지부위가 제거된 선발표지 유전자 제거용 카세트(cLoxC3-CAH)를 나타낸다.

도 13은 도 6 및 도 11 및 도 12의 카세트를 제한효소로 처리한 후 전기영동한 결과이다.

도 14는 Klenow filling에 의해 NotI 제한효소 자리를 제거한 pJM121 벡터의 맵이다.

도 15는 pJM122 벡터의 맵이다.

도 16은 pNS 벡터의 맵이다.

도 17은 pNS-GUS 벡터의 맵이다.

도 18은 pNS-GUS CAN 벡터의 맵이다.

도 19는 pSYCAN 벡터 및 pSYCAH 벡터의 맵이다.

도 20은 GUS 코딩 서열에 대한 게놈 PCR 결과를 나타낸다.

도 21은 선발표지 카세트에 대한 게놈 PCR 결과이다.

도 22는 형질전환된 식물을 보여준다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Transformation vector for eliminating selection marker gene <130> PN07125 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cLoxC3-CAN cassette <400> 1 gcggccgctg acggtatcgc gataagctat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt 60 atgaattgtc gatcgacgat ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata atttatccta 120 gtttgcgcgc tatattttgt tttctatcgc gtattaaatg tataattgcg ggactctaat 180 cataaaaacc catctcataa ataacgtcat gcattacatg ttaattatta catgcttaac 240 gtaattcaac agaaattata tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat tcaatcttaa 300 gaaactttat tgccaaatgt ttgaacgatc ggggaaattc ggtcgagcta atcgccatct 360 tccagcaggc gcaccattgc ccctgtttca ctatccaggt tacggatata gttcatgaca 420 atatttacat tggtccagcc accagcttgc atgatctccg gtattgaaac tccagcgcgg 480 gccatatctc gcgcggctcc gacacgggca ctgtgtccag accaggccag gtatctctga 540 ccagagtcat ccttagcgcc gtaaatcaat cgatgagttg cttcaaaaat cccttccagg 600 gcgcgagttg atagctggct ggtggcagat ggcgcggcaa caccattttt tctgacccgg 660 caaaacaggt agttattcgg atcatcagct acaccagaga cggaaatcca tcgctcgacc 720 agtttagtta cccccaggct aagtgccttc tctacacctg cggtgctaac cagcgttttc 780 gttctgccaa tatggattaa cattctccca ccgtcagtac gtgagatatc tttaaccctg 840 atcctggcaa tttcggctat acgtaacagg gtgttataag caatccccag aaatgccaga 900 ttacgtatat cctggcagcg atcgctattt tccatgagtg aacgaacctg taactatcat 960 catcatcata gacacacgaa ataaagtaat cagattatca gttaaagcta tgtaatattt 1020 acaccataac caatcaatta aaaaatagat cagtttaaag aaagatcaaa gctcaaaaaa 1080 ataaaaagag aaaagggtcc taaccaagaa aatgaaggag aaaaactaga aatttacctg 1140 gtcgaaatca gtgcgttcga acgctagagc ctgttttgca cgttcaccgg catcaacgtt 1200 ttcttttcgg attcgccgca taaccagtga aacagcattg ctgtcacttg gtcgtggcag 1260 cccggaccga cgatgaagca tgtttagctg gcccaaatgt tgctggatag tttttactgc 1320 cagaccgcgc gcctgaagat atagaagata atcgcgaaca tcttcaggtt ctgcgggaaa 1380 ccatttccgg ttattcaact tgcaccatgc cgcccacgac cggcaaacgg acagaagcat 1440 tttccaggta tgctcagaaa acgcctggcg atccctgaac atgtccatca ggttcttgcg 1500 aacctcatca ctcgtcgcat cgaccggtaa tgcaggcaaa ttttggtgta cggtcagtaa 1560 attggacatg cgtgggtctt caacctttct cttcttcttt ggagccatct cagatccgga 1620 aacttttgcg tacgatctct ctttttgatt tgaacagaga gcttcctttt gttttctggt 1680 ttttaagctt tgaagaagaa gttaggatgc ttaaataggt ccagtgcccg aaggtgatgg 1740 tgaagtagtc gctttttatg gaagacgaag aaatttaact atgtcatcgg agatgacgtg 1800 gaccaattat cttacgacga tctataatgt caaccaatca gatttggtct tgtgttggag 1860 taatcgtggc cgttggttac ggtccccaga ttagcctttt caatttcaga aagaatgcta 1920 acccacagat ggttagagag gcttacgcag caggtctcat caagacgatc tacccgagca 1980 ataatctcca ggaaatcaaa taccttccca agaaggttaa agatgcagtc aaaagattca 2040 ggactaactg catcaagaac acagagaaag atatatttct caagatcaga agtactattc 2100 cagtatggac gattcaaggc ttgcttcaca aaccaaggca agtaatagag attggagtct 2160 ctaaaaaggt agttcccact gaatcaaagg ccatggagtc aaagattcaa atagaggacc 2220 taacagaact cgccgtaaag actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg 2280 acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac 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ttctggcgac tgctgatgaa 3180 gaaaccagta tggccggagc gcgttatttt gccgaaacta ccgccctgcg cccggattgc 3240 gccatcattg gcgaaccgac gtcactacaa ccggtacgcg cacataaagg tcatatctct 3300 aacgccatcc gtattcaggg ccagtcgggg cactccagcg atccagcacg cggagttaac 3360 gctatcgaac taatgcacga cgccatcggg catattttgc aattgcgcga taacctgaaa 3420 gaacgttatc actacgaagc gtttaccgtg ccatacccta cgctcaacct cgggcatatt 3480 cacggtggcg acgcttctaa ccgtatttgc gcttgctgtg agttgcatat ggatattcgt 3540 ccgctgcctg gcatgacact caatgaactt aatggtttgc tcaacgatgc attggctccg 3600 gtgagcgaac gctggccggg tcgtctgacg gtcgatgagc tgcatccgcc gatccctggc 3660 tatgaatgcc caccgaatca tcaactggtt gaagtggttg agaaattgct cggagcaaaa 3720 accgaagtgg tgaactactg taccgaagcg ccgtttattc aaacgttatg cccgacgctg 3780 gtgttggggc ctggctcaat taatcaggct catcaacctg atgaatatct ggaaacacgg 3840 tttatcaagc ccacccgcga actgataacc caggtaattc accatttttg ctggcattaa 3900 gcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 3960 gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 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cagcccaggt cctggcaaag 7200 ctcgtagaac gtgaaggtga tcggctcgcc gataggggtg cgcttcgcgt actccaacac 7260 ctgctgccac accagttcgt catcgtcggc ccgcagctcg acgccggtgt aggtgatctt 7320 cacgtccttg ttgacgtgga aaatgacctt gttttgcagc gcctcgcgcg ggattttctt 7380 gttgcgcgtg gtgaacaggg cagagcgggc cgtgtcgttt ggcatcgctc gcatcgtgtc 7440 cggccacggc gcaatatcga acaaggaaag ctgcatttcc ttgatctgct gcttcgtgtg 7500 tttcagcaac gcggcctgct tggcctcgct gacctgtttt gccaggtcct cgccggcggt 7560 ttttcgcttc ttggtcgtca tagttcctcg cgtgtcgatg gtcatcgact tcgccaaacc 7620 tgccgcctcc tgttcgagac gacgcgaacg ctccacggcg gccgatggcg cgggcagggc 7680 agggggagcc agttgcacgc tgtcgcgctc gatcttggcc gtagcttgct ggaccatcga 7740 gccgacggac tggaaggttt cgcggggcgc acgcatgacg gtgcggcttg cgatggtttc 7800 ggcatcctcg gcggaaaacc ccgcgtcgat cagttcttgc ctgtatgcct tccggtcaaa 7860 cgtccgattc attcaccctc cttgcgggat tgccccgact cacgccgggg caatgtgccc 7920 ttattcctga tttgacccgc ctggtgcctt ggtgtccaga taatccacct tatcggcaat 7980 gaagtcggtc ccgtagaccg tctggccgtc cttctcgtac ttggtattcc gaatcttgcc 8040 ctgcacgaat accagcgacc ccttgcccaa atacttgccg tgggcctcgg cctgagagcc 8100 aaaacacttg atgcggaaga agtcggtgcg ctcctgcttg tcgccggcat cgttgcgcca 8160 catctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag 8220 gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc 8280 tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa 8340 gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc 8400 cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc 8460 gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt 8520 tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat 8580 ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt 8640 cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga 8700 gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc 8760 cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc 8820 ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag 8880 caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt 8940 ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc tcttttctac agtatttaaa 9000 gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta 9060 aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat 9120 agtatcgacg gagccgattt tgaaaccaca attatgggtg atgctgccaa ctcgagcggg 9180 ccgggagggt tcgagaaggg ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg 9240 cgcagccctg gttaaaaaca aggtttataa atattggttt aaaagcaggt taaaagacag 9300 gttagcggtg gccgaaaaac gggcggaaac ccttgcaaat gctggatttt ctgcctgtgg 9360 acagcccctc aaatgtcaat aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg 9420 tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg 9480 cacttatccc caggcttgtc cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt 9540 cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat 9600 ctgtcaacgc cgcgccgggt gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt 9660 cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg gcggccggcc gcggtgtctc 9720 gcacacggct tcgacggcgt ttctggcgcg tttgcagggc catagacggc cgccagccca 9780 gcggcgaggg caaccagccc ggtgagcgtc 9810 <210> 4 <211> 9967 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSYCAH vector <400> 4 gctcaccggg ctggttgccc tcgccgctgg gctggcggcc gtctatggcc ctgcaaacgc 60 gccagaaacg ccgtcgaagc cgtgtgcgag acaccgcggc cggccgccgg cgttgtggat 120 acctcgcgga aaacttggcc ctcactgaca gatgaggggc ggacgttgac acttgagggg 180 ccgactcacc cggcgcggcg ttgacagatg aggggcaggc tcgatttcgg ccggcgacgt 240 ggagctggcc agcctcgcaa atcggcgaaa acgcctgatt ttacgcgagt ttcccacaga 300 tgatgtggac aagcctgggg ataagtgccc tgcggtattg acacttgagg ggcgcgacta 360 ctgacagatg aggggcgcga tccttgacac ttgaggggca gagtgctgac agatgagggg 420 cgcacctatt gacatttgag gggctgtcca caggcagaaa atccagcatt tgcaagggtt 480 tccgcccgtt tttcggccac cgctaacctg tcttttaacc tgcttttaaa ccaatattta 540 taaaccttgt ttttaaccag ggctgcgccc tgtgcgcgtg accgcgcacg ccgaaggggg 600 gtgccccccc ttctcgaacc ctcccggccc gctcgagttg gcagcatcac ccataattgt 660 ggtttcaaaa tcggctccgt cgatactatg ttatacgcca actttgaaaa caactttgaa 720 aaagctgttt tctggtattt aaggttttag aatgcaagga acagtgaatt ggagttcgtc 780 ttgttataat tagcttcttg gggtatcttt aaatactgta gaaaagagga aggaaataat 840 aaatggctaa aatgagaata tcaccggaat tgaaaaaact gatcgaaaaa taccgctgcg 900 taaaagatac ggaaggaatg tctcctgcta aggtatataa gctggtggga gaaaatgaaa 960 acctatattt aaaaatgacg gacagccggt ataaagggac cacctatgat gtggaacggg 1020 aaaaggacat gatgctatgg ctggaaggaa agctgcctgt tccaaaggtc ctgcactttg 1080 aacggcatga tggctggagc aatctgctca tgagtgaggc cgatggcgtc ctttgctcgg 1140 aagagtatga agatgaacaa agccctgaaa agattatcga gctgtatgcg gagtgcatca 1200 ggctctttca ctccatcgac atatcggatt gtccctatac gaatagctta gacagccgct 1260 tagccgaatt ggattactta ctgaataacg atctggccga tgtggattgc gaaaactggg 1320 aagaagacac tccatttaaa gatccgcgcg agctgtatga ttttttaaag acggaaaagc 1380 ccgaagagga acttgtcttt tcccacggcg acctgggaga cagcaacatc tttgtgaaag 1440 atggcaaagt aagtggcttt attgatcttg ggagaagcgg cagggcggac aagtggtatg 1500 acattgcctt ctgcgtccgg tcgatcaggg aggatatcgg ggaagaacag tatgtcgagc 1560 tattttttga cttactgggg atcaagcctg attgggagaa aataaaatat tatattttac 1620 tggatgaatt gttttagtac ctagatgtgg cgcaacgatg ccggcgacaa gcaggagcgc 1680 accgacttct tccgcatcaa gtgttttggc tctcaggccg aggcccacgg caagtatttg 1740 ggcaaggggt cgctggtatt cgtgcagggc aagattcgga ataccaagta cgagaaggac 1800 ggccagacgg tctacgggac cgacttcatt gccgataagg tggattatct ggacaccaag 1860 gcaccaggcg ggtcaaatca ggaataaggg cacattgccc cggcgtgagt cggggcaatc 1920 ccgcaaggag ggtgaatgaa tcggacgttt gaccggaagg catacaggca agaactgatc 1980 gacgcggggt tttccgccga ggatgccgaa accatcgcaa gccgcaccgt catgcgtgcg 2040 ccccgcgaaa ccttccagtc cgtcggctcg atggtccagc aagctacggc caagatcgag 2100 cgcgacagcg tgcaactggc tccccctgcc ctgcccgcgc catcggccgc cgtggagcgt 2160 tcgcgtcgtc tcgaacagga ggcggcaggt ttggcgaagt cgatgaccat cgacacgcga 2220 ggaactatga cgaccaagaa gcgaaaaacc gccggcgagg acctggcaaa acaggtcagc 2280 gaggccaagc aggccgcgtt gctgaaacac acgaagcagc agatcaagga aatgcagctt 2340 tccttgttcg atattgcgcc gtggccggac acgatgcgag cgatgccaaa cgacacggcc 2400 cgctctgccc tgttcaccac gcgcaacaag aaaatcccgc gcgaggcgct gcaaaacaag 2460 gtcattttcc acgtcaacaa ggacgtgaag atcacctaca ccggcgtcga gctgcgggcc 2520 gacgatgacg aactggtgtg gcagcaggtg ttggagtacg cgaagcgcac ccctatcggc 2580 gagccgatca ccttcacgtt ctacgagctt tgccaggacc tgggctggtc gatcaatggc 2640 cggtattaca cgaaggccga ggaatgcctg tcgcgcctac aggcgacggc gatgggcttc 2700 acgtccgacc gcgttgggca cctggaatcg gtgtcgctgc tgcaccgctt ccgcgtcctg 2760 gaccgtggca agaaaacgtc ccgttgccag gtcctgatcg acgaggaaat cgtcgtgctg 2820 tttgctggcg accactacac gaaattcata tgggagaagt accgcaagct gtcgccgacg 2880 gcccgacgga tgttcgacta tttcagctcg caccgggagc cgtacccgct caagctggaa 2940 accttccgcc tcatgtgcgg atcggattcc acccgcgtga agaagtggcg cgagcaggtc 3000 ggcgaagcct gcgaagagtt gcgaggcagc ggcctggtgg aacacgcctg ggtcaatgat 3060 gacctggtgc attgcaaacg ctagggcctt gtggggtcag ttccggctgg gggttcagca 3120 gccagcgctt tactctagtg gactgatggg ctgcctgtat cgagtggtga ttttgtgccg 3180 agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa 3240 ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt taatgtactg gggtggtttt 3300 ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcctgcag 3360 cccgggggat ccactagttc tagagcggcc gctctagcat aacttcgtat agcatacatt 3420 atacgaagtt atgatcccgg ggaattaatt ctttagtact ggattttggt tttaggaatt 3480 agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat 3540 gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc cttatctggg aactactcac 3600 acattattat ggagaaactc gaagatccgt cgagcttgtc gatcgacaga tccggtcggc 3660 atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca ctatcggcga 3720 gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt tgtgtacgcc 3780 cgacagtccc ggctccggat cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc caagctgcat 3840 catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg cggagcatat 3900 acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag tagcgcgtct 3960 gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc tcgtattggg 4020 aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca ttgtccgtca 4080 ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg cagtcctcgg 4140 cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg tcgtccatca 4200 cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca cgccatgtag 4260 tgtattgacc gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg ctaagatcgg 4320 ccgcagcgat cgcatccatg gcctccgcga ccggcggtcc cccgtgttct ctccaaatga 4380 aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc 4440 cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct 4500 tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag 4560 gcatcttcaa cgatggcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc 4620 ttttccacta tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt 4680 ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca attgcccttt ggtcttctga gactgtatct 4740 ttgatatttt tggagtagac aagtgtgtcg tgctccacca tgttgacgaa gattttcttc 4800 ttgtcattga gtcgtaagag actctgtatg aactgttcgc cagtctttac ggcgagttct 4860 gttaggtcct ctatttgaat ctttgactcc atggcctttg attcagtggg aactaccttt 4920 ttagagactc caatctctat tacttgcctt ggtttgtgaa gcaagccttg aatcgtccat 4980 actggaatag tacttctgat cttgagaaat atatctttct ctgtgttctt gatgcagtta 5040 gtcctgaatc ttttgactgc atctttaacc ttcttgggaa ggtatttgat ttcctggaga 5100 ttattgctcg ggtagatcgt cttgatgaga cctgctgcgt aagcctctct aaccatctgt 5160 gggttagcat tctttctgaa attgaaaagg ctaatctggg gacgcaagcg ctaattcccg 5220 atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt 5280 gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat 5340 aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta 5400 tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat 5460 gtttgaacga tcggggaaat tcgcttaatg ccagcaaaaa tggtgaatta cctgggttat 5520 cagttcgcgg gtgggcttga taaaccgtgt ttccagatat tcatcaggtt gatgagcctg 5580 attaattgag ccaggcccca acaccagcgt cgggcataac gtttgaataa acggcgcttc 5640 ggtacagtag ttcaccactt cggtttttgc tccgagcaat ttctcaacca cttcaaccag 5700 ttgatgattc ggtgggcatt catagccagg gatcggcgga tgcagctcat cgaccgtcag 5760 acgacccggc cagcgttcgc tcaccggagc caatgcatcg ttgagcaaac cattaagttc 5820 attgagtgtc atgccaggca gcggacgaat atccatatgc aactcacagc aagcgcaaat 5880 acggttagaa gcgtcgccac cgtgaatatg cccgaggttg agcgtagggt atggcacggt 5940 aaacgcttcg tagtgataac gttctttcag gttatcgcgc aattgcaaaa tatgcccgat 6000 ggcgtcgtgc attagttcga tagcgttaac tccgcgtgct ggatcgctgg agtgccccga 6060 ctggccctga atacggatgg cgttagagat atgaccttta tgtgcgcgta ccggttgtag 6120 tgacgtcggt tcgccaatga tggcgcaatc cgggcgcagg gcggtagttt cggcaaaata 6180 acgcgctccg gccatactgg tttcttcatc agcagtcgcc agaatgtaga gcggtttttt 6240 cagtttcgtg acatcgacat cgcgtagcgc atcaaggata aacgcaaaaa agcctttcat 6300 gtcggcggtg cctaagccgt atagcttgcc gtcatgctcc gtcagtgtaa acggatcgcg 6360 cgtccagcga ccgtcatcaa atggcaccgt atcggtatgc cccgccagca acaagccgcc 6420 agccccctgt ccgatacttg ccagcatatt gaatttgttg cgagttcctg gaacaggctg 6480 cacttccaca ttgaagccca aatctttaaa ccagtccgcc agcagagtga ttaaatctgc 6540 attgctttga 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ttcctggaga ttattgctcg ggtagatcgt cttgatgaga cctgctgcgt 7440 aagcctctct aacctgtggg ttagcattct ttctgaaatt gaaaaggcta atctggggac 7500 gcctgcaata gctttgcaga gtgacggccg ccattagggt tggtttgcct gttttgttgt 7560 tatccaatat ccaattctta ttgtgcattg attccaatac aaatacaaca ctgagagtaa 7620 ttagaaaatg gcatatttct tatatatatg tctgcgtgat aaataaatgg agtggttaag 7680 cattagtcat gttcttccaa atattacacc tcaccgcata tgcagtagtt ttggcattac 7740 actaattcat taataacaaa agaaattatc cttatgtaaa ttatgacgca aatcttttta 7800 ttttattaat cggtacacga aaaaaatctt ttaataattc atgcatgtga taaaaacatt 7860 gttaataatt taattttgat tataatgata attgttttgg ataactatac atacatacga 7920 agaagtcgta aaacctttga aagattttgc gatgacgatt taatgtcacg tgtctgcttg 7980 tgattgggta ctttacgtgt gtaaaaagta aggagcgcgc caacacaaaa taacccatta 8040 agcttacgtg tcaagaagtg attggagagg acactctacc gaggctaaat acgaatcata 8100 ctgaagcaca tataaataga cgacgaactt catactcttc caaataaact aacaaacgag 8160 atcgaagaag agttctcagg atctcgatgg ctccaaagaa gaagagaaag gttgaagacc 8220 cacgcatgtc caatttactg accgtacacc aaaatttgcc tgcattaccg gtcgatgcaa 8280 cgagtgatga ggttcgcaag aacctgatgg acatgttcag ggatcgccag gcgttttctg 8340 agcatacctg gaaaatgctt ctgtccgttt gccggtcgtg ggcggcatgg tgcaagttga 8400 ataaccggaa atggtttccc gcagaacctg aagatgttcg cgattatctt ctatatcttc 8460 aggcgcgcgg tctggcagta aaaactatcc agcaacattt gggccagcta aacatgcttc 8520 atcgtcggtc cgggctgcca cgaccaagtg acagcaatgc tgtttcactg gttatgcggc 8580 gaatccgaaa agaaaacgtt gatgccggtg aacgtgcaaa acaggctcta gcgttcgaac 8640 gcactgattt cgaccaggta aatttctagt ttttctcctt cattttcttg gttaggaccc 8700 ttttctcttt ttattttttt gagctttgat ctttctttaa actgatctat tttttaattg 8760 attggttatg gtgtaaatat tacatagctt taactgataa tctgattact ttatttcgtg 8820 tgtctatgat gatgatgata gttacaggtt cgttcactca tggaaaatag cgatcgctgc 8880 caggatatac gtaatctggc atttctgggg attgcttata acaccctgtt acgtatagcc 8940 gaaattgcca ggatcagggt taaagatatc tcacgtactg acggtgggag aatgttaatc 9000 catattggca gaacgaaaac gctggttagc accgcaggtg tagagaaggc acttagcctg 9060 ggggtaacta aactggtcga gcgatggatt tccgtctctg gtgtagctga tgatccgaat 9120 aactacctgt tttgccgggt cagaaaaaat ggtgttgccg cgccatctgc caccagccag 9180 ctatcaactc gcgccctgga agggattttt gaagcaactc atcgattgat ttacggcgct 9240 aaggatgact ctggtcagag atacctggcc tggtctggac acagtgcccg tgtcggagcc 9300 gcgcgagata tggcccgcgc tggagtttca ataccggaga tcatgcaagc tggtggctgg 9360 accaatgtaa atattgtcat gaactatatc cgtaacctgg atagtgaaac aggggcaatg 9420 gtgcgcctgc tggaagatgg cgattagcgc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca 9480 ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct 9540 gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg 9600 ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata 9660 gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgtgcaat 9720 tcataacttc gtatagcata cattatacga agttatagct tatcgcgata ccgtcagcgg 9780 ccgcgcagat tgtcgtttcc cgccttcagt ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt 9840 ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt attagaataa tcggatattt aaaagggcgt 9900 gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tccccagaac 9960 tagagac 9967

Claims (11)

1. pBip-L 프로모터에 작동가능하게 연결된 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 선발표지 유전자를 포함하며, 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 도 11 또는 도 12에 기재된 식물체 형질전환용 벡터의 선발표지 유전자 제거용 카세트.
2. 삭제
3. 삭제
4. pBip-L 프로모터에 작동가능하게 연결된 Cre (Cre recombinase) 유전자, argE (ornithine deacetylase) 유전자, 및 선발표지 유전자를 포함하며, 각각 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루지는 도 19에 기재된 pSYCAN 벡터 또는 pSYCAH 벡터인 것을 특징으로 하는 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제4항의 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터에 목적 유전자를 삽입하여 재조합 식물 발현 벡터를 제조하는 단계;

   상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 형질전환하는 단계; 및

   형질전환된 식물체에 투니카마이신 및 N-아세틸 포스피노트리신을 처리하여 선발표지 유전자가 제거된 형질전환체를 선발하는 단계를 포함하는 선발표지 유전자가 제거된 형질전환 식물의 제조 방법.
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