JP2001503992A

JP2001503992A - 線虫誘導性調節ｄｎａ配列

Info

Publication number: JP2001503992A
Application number: JP52321998A
Authority: JP
Inventors: アンドリアスオウル，ステファン; デルリー，フレデリークマリアンヌヴァン; ヨハネスマリアゴッディン，オスカー; クラップ，ジョーク; クリスチャンシモンズ，ピーター
Original assignee: モーヘンインターナショナルエヌ．ブイ．
Priority date: 1996-11-18
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2001-03-27
Also published as: AU731525B2; EP0948634A1; BG103405A; WO1998022599A1; CA2270872C; CN1150329C; AR009614A1; HUP0000493A3; PL333437A1; AU5553598A; BR9714314A; HUP0000493A2; ZA9710270B; US6395963B1; CN1240483A; CA2270872A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Arabidopsis thalianaから入手可能であり、植物に再導入される場合に、関連DNA配列の根瘤およびシスト線虫誘導性転写を促進し得るDNAフラグメント、およびこのDNAフラグメントの使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】線虫誘導性調節DNA配列本発明は、植物細胞においてDNA配列を発現するために使用され得る線虫誘導性調節DNA配列に関する。本発明はさらに、植物細胞において発現されるDNAに作動可能に連結する調節DNA配列を含むキメラDNA、ならびそれらの細胞において、このようなキメラDNAを含む植物を含む。本発明はさらに、植物寄生線虫もしくはその影響に耐性であるかまたは少なくともあまり感受性でない植物を作製するための方法、ならびに細胞、植物、およびその一部に関する。技術水準国際特許出願WO92/17054において、線虫応答性調節DNA配列の、Arabidopsis t halianaからの同定および続く単離のための方法が開示されている。 WO 92/21757において、いくつかの調節DNA配列は、Lycopersicon esculentum （これは、根瘤線虫Meloidogyne incognitaに応答性である）から単離されている。これらの調節配列のいくつか(LEMMI's、Lycopersicon esculentum-Meloidog yne incognitaについて）は刺激され、一方、他のものは線虫によって抑制されるようである。任意の誘導性調節配列が、広範な範囲の線虫によって刺激されるかどうかは知られていない。根瘤線虫Meloidogyne incognitaによって誘導可能な別の調節配列は、WO 93/0 6710に開示される。この調節配列TobRb7の欠点は、多数のシスト線虫(Heteroder aおよびGlobodera種の間）によって活性化されないことである。これは、例えば、ジャガイモにおけるシスト線虫耐性（resistamce）を目的とするキメラ構築異物における使用には不適切なTobRb7を作製する。本発明の目的は、シストおよび根瘤線虫の両方によって誘導可能であり、そして線虫の摂食構造内のそれらの制御下で異種DNA配列を発現するのに使用され得るが、好ましくは実質的に摂食部位特異的方法において必要でない、調節DNA配列を提供することである。発明の要旨本発明は、Arabldopsis Thalianaから入手可能であり、植物に再導入される場合に関連DNA配列の根瘤およびシスト線虫誘導性転写を促進し得るDNAフラグメントを提供する。本発明に好ましいのは、配列番号１におけるヌクレオチド1〜348 4によって示される配列である。植物に再導入される場合に関連DNA配列の根瘤およびシスト線虫誘導性転写を促進し得る、本発明のDNAフラグメントの部分または改変体もまた予見される。本発明のなおさらなる好ましい局面は、実質的に線虫摂食構造である調節DNAフラグメントを含む。本発明のさらなる実施態様は、転写の方向で本発明の調節DNAフラグメントを含むキメラDNA配列、ならびにその転写制御下で発現され、そしてこのDNAフラグメントの転写条件下に天然には存在しないDNA配列を含む。本発明のキメラDNA配列で好ましいのは、発現されるDNA配列が植物細胞破壊物質（例えば、バルナーゼ）の産生を引き起こすものである。異なる実施熊様において、細胞破壊物質は、細胞生存に必須なRNAに相補的なRNAを含む。なお別の実施態様において、発現されるDNA配列は、誘導性線虫に毒性の物質の産生を引き起こす。本発明は、本発明のDNAフラグメントまたはキメラDNA配列を含むレプリコン、このようなレプリコンを含む微生物、ならびにそれらのゲノムに本発明のキメラ DNA配列が取り込まれている植物細胞において、さらなる使用を見いだす。さらに有用な実施熊様は、本質的に本発明の細胞からなる植物の根瘤、ならびに本質的に本発明の細胞からなる完全生長植物（好ましくは双子葉植物、より好ましくはジャガイモ植物）である。本発明の根系に接ぎ木される植物、ならびに種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉、および木から選択される植物部分ならびにこのような植物を含む農作物もまた予見される。本発明はまた、植物において関連DNA配列の転写を促進し得るサブフラグメントを同定するための、本発明のDNAフラグメントの使用を包含する。植物を形質転換するための本発明のキメラDNA配列の使用もまた予見される。本発明はさらに、ハイブリッド調節DNA配列を作製するための、本発明の調節DNAのフラグメント、部分、または改変体の使用を提供する。以下の図は、本発明をさらに例証する。図面の説明図１。バイナリーベクターpMOG23の略図プラスミドマップ。図２。バイナリーベクターpMOG800の略図プラスミドマップ。図３。バイナリーベクターpMOG2553の略図プラスミドマップ。図４。バイナリーベクターpMOG919の略図プラスミドマップ。図５。バイナリーベクターpMOG821の略図プラスミドマップ。図６。いくつかのpMG821形質転換Arabidopsis thaliana系統のNFSの外側の発現パターン。図７。線虫耐性植物を操作するための２成分系における、NFS破壊遺伝子および中性化因子（neutraiser）遺伝子の略図示。図８。バイナリーベクターpMOG944の略図プラスミドマップ。本発明ならびに種々の熟語の意味を実施するいくつかの方法は、以下により詳細に説明される。発明の詳細な説明本発明は、Arabidopsis thalianaから入手可能な調節DNA配列を提供し、これは、根瘤およびシスト線虫によって誘導可能であり、そして植物根の特別な線虫摂食構造内の任意の関連DNAによってコードされる化合物の発現の高い優先度を示す。調節DNA配列を単離する方法は、先行出願WO92/17054において開示および請求されており、これを本明細書中で参考として援用する。原則的に、本発明の調節DNA配列は、調節DNA配列の制御下でDNAを配置し、そして公知の方法を用いて、得られるDNA配列で植物を形質転換することによって、任意の選択の植物において任意の異種DNAを発現するために使用され得る。異種DNAは、種々の根瘤線虫（例えば、Meoildogyne incognita）およびシスト線虫（例えば、Heterodera schchtiiおよびGlobodera pallida）（より包括的であるが決して限定されない一覧は、表２に示される）による根の感染において発現される。有利には、異種DNAは、植物寄生線虫に対する減少した感受性を有する植物を作製するために、植物寄生線虫に対して毒性または阻害性である物質をコードする遺伝子からなる。このような毒性物質（例えば、Bacillus thuringiensis の細胞外毒素（例えば、EP 0 352052)）、レクチンなど）の多数の例が存在する。植物寄生線虫に対する減少した感受性を有する植物を作製するためのより好ましいアプローチは、本発明の調節DNA配列の制御下で植物毒素物質を発現することによる、植物根の特別化摂食構造の破壊からなる。このアプローチの一般的にな原理は、国際特許出願WO 92/21757、WO93/10251、およびWO94/10320に開示および請求されており、これらを本明細書中で参考として援用する。一貫性の目的のために、植物毒素物質は、本明細書以後、線虫摂食部位（NFS）破壊物質と称される。本発明の調節DNA配列は、摂食構造に実質的に特異的であるが、その制御下でN FS破壊物質の発現は、非標的（すなわち、非NFS）組織における発現に起因して、植物生存度および／または収率における有害な効果を有することもあり得る。さらに、本発明の調節配列は、形質転換手順における組織培養段階の間に活性であり、この段階の間に中性化（neutralising）物質の使用を必要とすることが見いだされた。有害な効果を減少または排除（潜在的）するために、それゆえ、中性化遺伝子構築物と組み合わせて、本発明のキメラNFS破壊構築物を使用することが強く好ましい。線虫耐性植物の操作のためのこのようないわゆる２成分アプローチの詳細は、WO93/10251に示される。このアプローチに従って、NFS破壊遺伝子遺伝子Ａ）は、NFSにおいて少なくとも活性なプロモーターの制御下、そして好ましくはNFSではないかまたはNFSのほとんど外側に配置される一方、NFSの外側の未所望の植物毒性効果は、これらの組織（ここで破壊物質はNFSを除いて産生される）において少なくとも発現される中性化遺伝子（遺伝子Ｂ）によって中性化される。２成分アプローチにしたがって、適切なプロモーターＡは、NFS内の破壊物質をコードする下流遺伝子の発現を、NFSの代謝および／または機能および／または生存度に有害であるのに有意なレベルで駆動するプロモーターとして規定される一方、このプロモーターは、好ましくは（しかし必須でない）、NFSの外側の組織において不活性であるべきである；破壊物質（遺伝子Ａによってコードされる）が、遺伝子Ｂからの産物によって有意に中性化され得ないこのようなレベルで、NFSの外側を少なくとも活性にしないべきである。本発明の調節DNA配列（略名＃25.1によってもまた示される）の特性は、本明細書中の実施例によって例証されるように、２成分アプローチにおいて調節DNA 配列を高度に有用にする。明らかに、多数の変異が、本発明の調節DNA配列において可能であり、この変異は、それらの意図される使用に決定的な方法で、これらの配列の特性を改変しない。それゆえ、このような変異は、本発明から逸脱しない。さらに、当業者に周知であるように、植物遺伝子の調節領域は、遺伝子発現に関する目的の特性を有する異なるサブ領域からなる。本明細書において意味されるようなサブ領域の例は、転写のエンハンサーであるが、転写のサイレンサーもある。これらのエレメントは、一般的な（構成的な）方法において、または組織特異的様式で作動し得る。いくつかの欠失が、本発明の調節DNA配列において作製され得、そしてサブフラグメントは、関連DNAの発現パターンについて試験され得る。このように得られる種々のサブフラグメント、またはその組合せさえも、線虫耐性を操作する方法、または植物における異種DNAの発現を含む他のアプリケーションにおいて有用である。機能的サブ領域、および植物における遺伝子発現を促進または抑制するための続くその使用もまた、本発明によって包含される。本発明の文脈において、用語NFS破壊物質および中和化物質は、DNAによってコードされる一連の選択された化台物を包含し、化台物は、その遺伝子産物（タンパク質またはRNAもしくはアンチセンスRNAのいずれか）がNFSまたはNFS中の細胞小器官の代謝および／または機能および／または生存能に有害であり、そして中和化物質については、破壊物質と同じ細胞において同時に発現される場合、破壊物質の活性を抑制し得ることが公知である。破壊物質および中和化物質の好ましい組合せは、例えば、Baccilus amyloliquefaciens由来のバルナーゼ／バルスタール（barstar）（Hartley，1988，J.Mol.Blol.202，913-915）、E.coll由来の制限エンドヌクレアーゼ／EcoRIのような対応するメチラーゼ（Greenら、1981， J.Blol.Chem．256,2143-2153）およびEcoRIメチラーゼまたはII型制限改変系についての概説に記載されるのと類似の組合せ（Wilson，1991，Nucl.Acid Res．1 9,2539-2566）、バクテリオシンおよび対応する免疫タンパク質（例えば、コリシンE3／E.coll由来の免疫タンパク質（Lauら、1985，Nucl.AcldRes．12,8733-8 745)）またはプロモーターＢの制御下でアンチセンスRNAの同時産生によって中和化され得る遺伝子をコードする任意の破壊物質（例えば、ジフテリア毒素Ａ鎖をコードするDNA配列）（Czko & An，1991，Plant Physlol．95,687-692）、RNA se TlのようなRNAse、リボヌクレアーゼまたはプロテアーゼである。さらなる可能性は、植物毒性タンパク質をコードするmRNAに対して活性なリボザイムをコードする遺伝子を有することである。本発明の別の局面によれば、破壊および中和化物質の組合せは、それぞれ、細胞生存能に必須であるタンパク質またはポリペプチド産物をコードする内因性遺伝子に対して阻害性の遺伝子、および中和化遺伝子として、その内因性タンパク質またはポリペプチド産物の機能を置換し得るタンパク質またはポリペプチド産物をコードし得る遺伝子を含む。このような破壊遺伝子は、以下からなる群より選択され得る：（ａ）内因性RNA転写物に対するリボザイムをコードする遺伝子、（ｂ）転写される場合、細胞生存能に必須である内因性遺伝子のRNA転写物に相補的または少なくとも部分的に相補的なRNA転写物を産生する遺伝子（遺伝子発現のアンチセンス阻害として公知の方法（EP-A 240 208に開示される））、ならびに（ｃ）転写される場合、細胞生存能に必須である内因性遺伝子の転写物に同一または少なくとも非常に類似であるRNA転写物を産生する遺伝子（同時抑制と呼ばれる遺伝子発現の阻害のなお未知の方法として、Napoll C．ら、1990，Th e Plant Cell 2.279-289に開示される）。本発明の好ましい実施態様によれば、細胞生存能に必須の内因性遺伝子の発現を阻害するアンチセンス遺伝子の使用がなされる。この遺伝子は、前記アンチセンス遺伝子の上流に融合した本発明の調節DNA配列によって、線虫摂食構造において発現される。生命維持に必要な内因性遺伝子に対して阻害性のアンチセンス遺伝子によってもたらされる破壊効果は、規定されるようなプロモーターＢの制御下で、中和化遺伝子Ｂの発現によって中和化される。この遺伝子Ｂは、発現される場合、内因性の生命維持に必要な遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドに同一または類似であり、そして宿主植物における内因性遺伝子産物の機能を置換し得るタンパク質またはポリペプチド産物を産生する。中和化遺伝子によってコードされるRNA転写物のヌクレオチド配列は、可能な同時抑制効果を回避するために、内因性の生命維持に必要な遺伝子RNA転写物とは相違することが好ましい。それゆえ、中和化遺伝子は、内因性の不可欠な遺伝子と本質的に同じ機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするが、相違するRNA転写物中間体を介することが好ましい；この説明に適合する中和化遺伝子は、異なる植物種からまたは異なる非植物種（例えば、酵母、動物、真核生物、または原核生物）からさえ入手可能な遺伝子について、データベースをスクリーニングすることによって適切に得られ得る。好ましくは、破壊性アンチセンストランスジーンおよび中和化センストランスジーンによってコードされる転写物のヌクレオチド配列同一性は、90％未満であり、好ましくは80％未満であり、なおより好ましくは、中和化センストランスジーンは、破壊される遺伝子産物に対してアミノ酸配列が同一でないタンパク質またはポリペプチド遺伝子産物をコードし、そしてここで、中和化トランスジーンによってコードされる転写物のヌクレオチド配列同一性は、75％未満である。アンチセンス破壊因子遺伝子についての標的遺伝子は、細胞生存能に必須である酵素（ハウスキーピング酵素とも呼ばれる）をコードするものから選択され、好ましくは単コピー遺伝子として核にコードされるべきであるが、小サイズの遺伝子ファミリーもまた本発明の目的に適切である。さらに、この遺伝子のアンチセンス発現の効果は、このような酵素に正常に合成される酵素産物の、他の細胞または細胞小器官からの拡散またはトランスロケーションによって無効にされてはならない。好ましくは、膜トランスロケーティング酵素をコードする遺伝子が選択される。なぜならば、これらは、細胞小器官膜を横切る化学勾配を確立することに関与するからである。このようなタンパク質のアンチセンス発現による阻害は、当然ながら、これらのタンパク質が存在する膜を横切る物質の拡散によって解除され得ない。トランスロケートされる化合物は、有機分子に限定されず、無機性質のものであり得る；例えば、P、H、OH、または電子。好ましくは、膜トランスロケーティング酵素は、寄生の間に数が増加する細胞小器官に存在するべきであり、それにより、このような細胞小器官が、NFSを含む細胞において有する本質的な役割を例証する。このような細胞小器官についての特定の例は、ミトコンドリア、小胞体、および原形質連絡である（Husseyら、 1992 Protoplasma 167;55-65、Magnusson & Golinowski 1991 Can.J.Botany 69; 44-52）。標的酵素の一覧は、表１に示される、これは例示の目的であり、本発明は、この表に示される酵素に限定されない。より詳細な一覧は、Biochemistry of Plants（Stumpf & Conn，1988-1991,第1-16巻、Academic Press）またはEnc yclopedia of Plant Physiology（New Series，1976，Springer-Verlag，Berlin ）のような双書から集められ得る。いくつかの場合においてのみ、これらの酵素をコードする遺伝子は単離されており、それゆえ遺伝子コピーの数は一般には公知ではないが、満たさなければならない判断基準は、本発明において説明される。表１。NFSにおけるアンチセンス発現についての標的酵素の例適切なプロモーターＢは、遺伝子Ａが発現される実質的に全ての細胞における発現を駆動するプロモーターとして定義される。ただし、このプロモーターは、線虫摂食構造内での発現を駆動しないか、または効果的ではない。（「実質的に全ての細胞」とは、少なくとも、このような植物の商業的開拓に必要な正常な植物の生長および／または発育を得るために生存可能であるべきである細胞を意味する）。破壊効果が宿主植物の正確に全ての細胞において中和化されない植物、ならびにそれにもかかわらず、生存可能で商業的開拓に適切である植物の例示として、雄しべ細胞において本発明の破壊因子遺伝子を発現するものが挙げられ得る；これは雄性不稔植物を生じ、これは、いくつかの農作物において商業的に魅力的な形質としてみなされさえする。プロモーターＢ型の適切な例は、植物または植物ウイルスから入手可能であり得るか、または化学的に合成され得る。調節配列はまた、CaMVの35Ｓプロモーターに見いだされるようなエンハンサー配列（ Kayら、1987，Science236,1129-1302）、およびアルファルファモザイクウイルスRNA4のリーダー配列のようなmRNA安定化配列（Brederodeら、1980,Nucl.Acids Res.8,2213-2223）、または類似の様式で機能する任意の他の配列を含む。あるいは、全てまたは事実上全ての植物組織における発現を提供するために、プロモーターＢもプロモーターＢ'もいずれもNFSにおける発現を駆動しないという条件で、プロモーターＢ／遺伝子Ｂは、プロモーターＢ／遺伝子Ｂに部分的に重複または全部が補完的な発現パターンを有する第２プロモータ−Ｂ'／遺伝子Ｂで補完され得る。ハイブリッドプロモーター（本明細書中で規定されるような必要な発現パターンを提供するように組み合わせた、異なるプロモーター（の部分）を含む）もまた、本発明の範囲内である。好ましくは、プロモーターＢは、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターまたはその誘導体であり、これは一般的に、植物組織における強力な構成プロモーターであるとみなされる（Odellら、1985 Nature 313,810-812）。プロモーターＢについての別の好ましい例は、Agrobacterium rhizogenesのプラスミド pRiA4からの強力な根プロモーターrolDである（Leach & Aoyagi 1991 Plant Sci ．79;69-76）；ORF15の5'隣接領域（Slightomら、1986，J.Blol.Chem．261,108- l21）。プロモーターＢとして使用するためのノパリンシンターゼプロモーター（Bevan，1984，Nucl.Aclds Res．12,8711-8721）またはゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター（EP-A 426 641）のような他の構成プロモーターの適合性は、GUSのようなマーカー遺伝子への融合植物（Jefferson，1987，Plant Mol.Bi ol.Reporter 5,387-405）へのこれらの構築物の移入、および植物寄生線虫（PPN ）での感染後のこのようなトランスジェニック植物の組織化学分析を介して試験され得る。ターミネーター配列およびポリアデニル化シグナルのような他の調節配列は、植物において機能する任意のこのような配列を含み、この選択は、平均的な当業者のレベル内である。このような配列の例は、Agrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼ（nos）遺伝子の3'隣接領域である（Bevan，1984，Nucl.Aclds Res．12,8711-8721）。２成分アプローチのさらなる詳細は、WO93/10251に見いだされ得る（本明細書中で参考として援用する）。植物種の選択は、農業上存在すると見積もられるPPN感染を介する損傷の量、および形質転換に対する植物種の受入度によって主に決定される。本発明によって、農作業の間にPPNににより損傷され、そしてPPNに対して有意に低感受性を生じ得る植物属は、表２に記載される属を含むがこれらに限定されない。本発明の文脈において規定されるような線虫種は、宿主細胞を特別に結合した支持構造に改変する全ての植物寄生線虫を含み、これは、移動性外部寄生虫（例えば、Xiphinema spp.）からより進化した定着性内部寄生虫（例えば、Heterode rlae、Meloldogynae、またはRotylenchulinae）までの範囲である。寄生線虫の一覧は、表２に示されるが、本発明はこの表において記載される種に限定されない。より詳細な一覧は、Zuckermanら（編、in:Plant Parasitic Nematodes,第I 巻、1971，New York，139-162頁）に示される。表２。植物寄生線虫およびそれらの主要な宿主植物の例本発明の文脈内において、植物根の表面で発生する成熟雌の数における統計学的に有意な減少が、制御植物と比較して観察され得る場合、植物は、植物寄生線虫に対して感受性の減少を示すといわれる。成熟雌の数による感受性／抵抗性分類は、シストおよび根瘤線虫の両方についての標準的技法である（例えば、LaMo ndia，1991，Plant Disease 75,453-454；Omwegaら、1990，Phytopathol．80,74 5-748）。本発明のNFSは、最初の支持細胞を含む。これは、侵入線虫の誘導の際に、線虫支持構造になるように運命づけられている細胞または非常に限定された数の細胞を意味する。本発明NFS破壊物質は、NFSのみに対して有害な効果を有することに限定されない；また、破壊効果は、さらに、直接相互作用によって線虫開発における有害効果を有することが意図される。いくつかの技術が、本発明に記載されるようなDNA配列を含む組換えDNAの植物宿主への導入に利用可能である。このような技術としては、カルシウム／ポリエチレングリコール法を用いるプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクション、または（包膜化）粒子銃があげられるがこれらに限定されない（Potrykus，1990，Bio/Technol，8,535-542）。これらのいわゆる直接的DNA形質転換法に加えて、ベクターに関与する形質転換系が幅広く入手可能であり、例えば、ウイルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）から）および細菌ベクター（例えば、Agrobacteriu m属から）があげられる（Potrykus，1990，Bio/Technol，8,535-542）。選択および／またはスクリーニングの後、形質転換された、プロトプラスト、細胞、または植物部分は、当該分野で公知の方法を用いて植物全体に再生され得る（Hors chら、1985，Science 225，1229-1231）。形質転換および／または再生技術の選択は、本発明について重要ではない。本発明の好ましい実施態様に従って、いわゆるバイナリーベクター系（EP-A 1 20 516に開示される）の使用がなされ、ここにおいて、Agrobacterium株が使用され、バイナリーベクターは、病原性遺伝子および適合性プラスミドを有するヘルパープラスミドを含み、形質転換されるための遺伝子構築物を含む。このベクターは、E.coliおよびAgrobacteriumの両方において複製し得る；本明細書中で使用される１つは、バイナリーベクターBin19に由来する（Bevan，1984，Nucl.A cidsRes．12,8711-8721）。この例において使用されるようなバイナリーベクターは、T-DNAの左境界配列と右境界配列との間に、カナマイシン耐性をコードするNPTII遺伝子（Bevan，1984，Nucl．Acids Res．12,8711-8721）および必要な遺伝子構築物においてクローン化するためのマルチクローニング部位を含む。近年の科学発展は、原則的に、単子葉植物は形質転換が可能であり、そして繁殖性トランスジェニック植物は、形質転換細胞から再生され得ることを示す。これらの農作物のための再現可能な組織培養系の開発は、遺伝物質の植物細胞への導入のための強力な方法とともに、形質転換を容易にした。現在、単子葉植物の形質転換のための好ましい方法は、外植片または懸濁細胞の微粒子銃、および直接DNA取り込みまたはエレクトロポレーションである（Shimamotoら、1989，Natu re 338,274-276）。トランスジェニックトウモロコシ植物は、Streptomyces hyg roscopicus bar遺伝子（これは、ホスフィノトリチン（phosphynothricine）アセチルトランスフェラーゼ（除草剤ホスフィノトリチンを不活化する酵素）を、トウモロコシ懸濁培養の胚形成細胞に、微粒子銃によって導入することによって得られている（Gordon-Kamm，1990，Plant Cell，2,603-618）。小麦および大麦のような他の単子葉農作物のアリューロンプロトプラストへの遺伝物質の導入が報告されている（Lee，1989，Plant Mol.Blol．13,21-30）。コムギ植物は、胚形成懸濁培養物から、成熟小型および結節状胚形成カルス組織のみを、胚形成懸濁培養の確立のために選択することによって再生されている（Vasil，1990 Bio/ Technol．8,429-434）。これらの農作物のための形質転換系との組合せは、本発明の単子葉植物への適用を可能にする。これらの方法はまた、双子葉植物の形質転換および再生にも適用され得る。以下の実施例は、例証の目的のためにのみ与えられ、そして本発明の範囲を限定することを意図されない。実験部分 DNA手順全てのDNA手順を、Maniatis（Molecular Cloning，A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory，1990）に記載される標準的な方法に従って行った。 Arabidopsisの形質転換形質転換を、Arabidopsis Sthaliana（生態型C24）根セグメントの適切なバイナリーベクターを含有するAgrobacterium株MOG101との共存培養を用いて、Valve kensらによって記載されるように行った（1988，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85,553 6-5540）。これは、以下の通りである： Arabidopsis種子を、発芽前に、４℃にて７日間着化処理した。種子を、70％E tOH中で２分間表面滅菌し、５％NaOCl／0.5％NaDodSO₄に移して、15分間滅菌蒸留水で５回リンスし、そして発芽培地（GM）（表３）を含む150×25mmペトリ皿において発芽させた。ペトリ皿を、気体透過性医療用テープ（Urgopore，Chenov e France）で封入した。植物を、22℃にて、16時間明所／８時間暗所周期で生長させた。同じ生長室条件を、組織培養手順に使用した。全ての植物培地を、0.5g ／リットルの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（pH5.7；1M KOHで調整）で緩衝化し0.8％Difco Bact寒天で凝固させ、そして121℃にて15分間オートクレーブした。ホルモンおよび抗生物質を、ジメチルスルホキシドおよび水にそれぞれ溶解し、そしてオートクレーブして65℃まで冷却した後に培地に添加した。インタクトな根を、凝固した0.5/0.05培地（表３）で３日間インキュベートした。次いで、根を、約0.5cmの小片に切断し（本明細書中で「根外植片」と称する）、そして10mlの液体0.5/0.05培地に移した；0.5〜1.0mlの一晩Agrobacteriu m培養物を添加した。根外植片および細菌を、約２分間穏やかに振盪することによって混合した。続いて、根外植片を、滅菌フィルター紙にブロットして、ほとんどの液体培地を除去し、そして0.5/0.05寒天で48時間培養した。次いで、外植片を、１リットルあたり1000mgのバンコマイシン（Sigma）を含む液体0.5/0.05培地中でリンスした。小片をブロットし、次いで、１リットルあたり750mgのバンコマイシンおよび50mgのKmを補充した0.15/5寒天（表３）においてインキュベートした。キメラneo遺伝子を含むagrobacteriaで感染した３週間後、緑色Km耐性（Km^R）カルスが、黄色がかった根外植片のバックグラウンドにおいて形成された。この時点で、根外植片を、１リットルあたり500mgのバンコマイシンおよび50mgのKmのみを含む新鮮な0.15/5寒天に移した。３週間後、ほとんどの緑色カルスはシュートを形成していた。形質転換したシュートを、GMを含む150×25mmペトリ皿に移し、根または種子またはその両方を形成した。これらのペトリ皿において、多くの再生物が、根を伴わずに種子を形成した。根を形成した植物もまた、種子をセッティングするために土壌に移し得た。以下の改変を行って、最初の根物質を得た：６mgの滅菌Arabidopsis thaliana C24種子を、生育室のロータリーシェーカー（ 100rpm）における50ml GM（250ml Erlenmeyer）において、弱光条件下で９日間発芽させた。トランスジェニック植物を、選択培地（50mg/lカナマイシン）で増殖したシュートから再生させ、根を形成させ、そして発芽培地または土壌に移した。表３。植物培地 L、リットル；IAA、インドール-3-酢酸；Kin、キネチン；2ipAde、N⁶−(2-イソペンテニル)アデニン；CIM、カルス誘導培地；SIM、シュート誘導培地；MS、Mur ashige & Skoog培地；B5、Gamborg B5培地ジャガイモの形質転換 Solaum tuberosum var．kaldalの形質転換については、Hoekemaら、1989 Bio/ Technology 7，273-278に記載のプロトコルを、いくらか改変して使用した。皮をむいて表面滅菌したジャガイモ塊茎を、2mmの厚さのスライスに切断した。これを使用して、スライスの周縁部の周りの直径1cmのディスクを切り出した。ディスクを、WM（Murashige & Skoog培地、１mg/lチアミンHCl、0.5mg/lピロドキシンHcl、0.5mg/lニコチン酸、100mg/l myo-イノシトール、30g/lスクロース、0 .5g/l MES pH5.8を含む）中に回収した。Agrobacterium tumefaciens株EHA105での接種(Hoodら、1993 Transgenic Research 2,208-218）を、LB+適切な抗生物質において0.5〜0.7のOD₆₀₀まで新たに増殖した10mlのAgrobacterium培養物の再懸濁ペレットを含む、100mlの新鮮なWMを有するWMと置換することによって行った。細菌懸濁物中で20分間、塊茎ディスクをインキュベートした後、それらを、20 外植片／ペトリ皿の密度で、凝固したCM（８g/l寒天、3.5mg/lゼアチンリボシド、0.03mg/lインドール酢酸を補充したWM）に移した。２日後、ディスクをPM（20 0mg/lセフォタキシム、100mg/lバンコマイシンを補充したCM）に移して、Agroba cteriaに対して選択した。３日後、ディスクをSIMプレート（250mg/lカルベニシリン、100mg/lカナマイシンを補充したCM）に、10外植片／ペトリ皿の密度で移し、形質転換したシュートの再生について選択した。２週後、組織ディスクを新鮮なSIMに移し、そしてさらに３週後、それらをSEM（10×低濃度のホルモンを含むSIM）に移した。同時培養の約８〜９週後、シュートは、カルス組織からそれらを切断するのに十分大きくなり、そしてそれらを、インビトロでの発根維持および栄養繁殖のために、10mlのRM（0.5×MS塩、0.5×ビタミン、10g/lスクロース、100mg/lセフォタキシム、50mg/lバンコマイシン、および50mg/lカナマイシンを含むWM）を含むガラス管（Sigma，Cat.nr.C5916）に移した。線虫の取り扱い、植物根の生長および感染および20mg/lカナマイシンを含むB5培地上に植え付けた。４℃にて３日後、プレートを、生長チャンバーにおいて、22℃にて、16時間明所／８時間暗所周期で２週間インキュベートした。次いで、カナマイシン耐性植物を、土を充填した半透明プラスチック管（30×15×l20mm、Kelder plastibox b.v.，The Netherlands ）に移した。管を、根が管の底部側面に生長するように垂直軸に60度傾けて配置した。これは、眼によって感染プロセスをモニターすることを可能にし、そして、GUS分析のために、根系を土壌からの除去を容易にした。感染を、２週以上後に、１根系あたり500のHeterodera schachiiの第２段階幼虫（３ml H₂O中）または１根系あたり300のMelolidogyne incognita第２段階幼虫を含む懸濁物を、土壌に注入することによって行った。同様に、カナマイシン含有RM培地に根付いている形質転換したジャガイモのシュートを、土を充填した半透明プラスチック管（30×15×120mm、Kelder plastibo x b.v.，The Netherlands）に移し、そして傾斜させて、さらに２週間、22℃にて16時間明所／８時間暗所周期で生長させた。感染を、１根系あたり500のGlobp dera pallidaの第２段階幼虫（３mlH₂O中）を含む懸濁液を、土壌に注入することによって行った。 GUSアッセイ GUS活性を、感染プロセスの間の種々の時間で、根系を充分に洗浄してほとんどの付着する土壌を除去し、そしてそれらをX-Gluc溶液（１mg/ml X-Gluc、5mM Na PO₄(pH7)、１mM K₄Fe(CN)₆、１mM K K₃Fe(CN)₆、10mM EDTA、0.1％Triton X100 ）中で、37℃にて一晩インキュベートすることによって決定した。クロロフィルを70％エタノールとの数時間のインキュベーションによって組織から除去した後、GUS染色を顕微鏡下でモニターした。 DNA配列決定配列決定を、当業者に公知の標準的な技術を用いて行った。実施例１バイナリーベクターpMOG800の構築バイナリーベクターpMG800は、pMOG23（図１、Centraal Bureau voor schimm ｅlcultures，Oosterstraat 1，Baarn，The Netherlandsに、1990年１月29日に、CBS 102.90で寄託した）の誘導体であり、ここにおいて、さらなるKpnI制限部位を、EcoRIとSmaIとの間のポリリンカーに導入した。このプラスミドは、T-DNA の左ボーダーと右ボーダーとの間に、トランスジェニック植物細胞の選択のためのカナマイシン耐性遺伝子を含む（図２）。E.coli DH5αのサンプル（pMOG800 を有する）を、Centraal Bureau voor Schimmelcultures，Oosterstraat 1，Baa rn,The Netherlandsに、1993年８月12日に、CBS 414.93で寄託した。実施例２プロモーターなしのGUS構築物pMOG553の構築このベクターの構築は、GoddiJinら、1993 Plant J 4，863-873に記載される。この参考文献において、誤差が生じる；構築物は、示されたnosターミネーターのかわりに、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の後ろにCaMV 35S RNAターミネーターを含む。このバイナリーベクターのT-DNAボーダーの間の配列は、アクセス番号X84105の下にEMBLデータベースで入手可能である。pMOG553は、植物形質転換のためのHygRマーカーを保有する（図３）。実施例３ Arabidopsis thalianaにおいて捕捉された NFS優先プロモーターフラグメントの同定および単離バイナリーベクターpMOG553を、Agrobacterium tumefaciens株MOG101（これは、WO 93/10251において詳細に記載される）への三親接合によって動員した。得られる株を、Arabidopsis根の形質転換のために使用した。1100より多いトランスジェニックArabidopsis植物系統を、この方法において得た。トランスジェニック植物を、成熟まで生長させて、自家受粉を可能にし、そして得られる種子（ S1）を採集し、そして春化処理した。続いて、S1種子を、0.6％寒天、10mg/lヒグロマイシンで凝固させた栄養溶液（Goddijinら、1993 Plant J 4,863-873）で発芽させ、そして４℃にて４日の吸水膨潤期の間保存した。５日で、プレートを、発芽のために、室温および穏和な光（1000lux、16h L/8 h D）に移した。14日齢実生を、5000lux（20℃）でのさらなる生長のために、傾斜した半透明のプラスチック管（30×15×120mm）中の鉢植え用土に移した。このようにして植物を生長させることにより、ほとんどの根系が土壌と管の間の境界面において管の底部側面に生長する。２週後、根を、実験部分に記載のように、線虫で感染させる。播種後のいくつかの時点で（２〜14日の範囲）、根系を、実験部分に記載のように、GUS活性について分析した。株pMOG553#25を、Heterodera schachtiiおよびM eloidogyne incognitaによってそれぞれ誘導されるシンシチウムおよび巨大細胞内の多少強力なGUS発現を示す株として同定した。この株の未感染コントロール植物（ならびに感染植物）において、非常に弱いGUS発現を、若い外側根の基底部および先端の維管束円柱（vascular cylinder）において、ならびに植物の種々の緑色部分において検出した。株pMOG553#25が、1:3の比で隔離することを見いだした、これは、GUS構築物は、ゲノムにおいて１つの遺伝子座で存在することを示す。サザン分析によって、４つの異なる（おそらく関連する）T-DNAコピーを同定した。右側T-DNAボーダーに隣接する４つの植物配列のうち、シンシチウムにおけるGUS発現を付与したものを決定するために、ライブラリーを、株pMOG553#25のゲノムDNAから構築した。D NAを、SauIIIaで部分的に消化し、そしてヌクレオチドＴおよびＣで突出部位を部分的充填した後、フラグメントをXhoI消化λGEM11アームに連結した。ここで、制限部位はまた、ヌクレオチドＧおよびＡでも部分的に充填されている。部分的充填は、XhoIと適合性のSauIIa部位を生じ、そしてλベクターにおける複数のインサートのクローニングを防ぐ。およそ300.000の組換えファージを、gusAプローブでスクリーニングした。制限分析およびポジティブクローンの部分配列決定は、全ての４つのT-DNA挿入部位（tag1〜tag4）を示すクローンの単離を生じた。以下のRB隣接サブフラグメントを、pMOG819中のgusAの前にクローン化した。pMOG821を生じるtag1の4.0kb SmaI フラグメント、pMOG820を生じるtag2の1.2kb BamHIフラグメント、pMOG847を生じるtag3の1.6kb SmaIフラグメント、およびpMOG848を生じるtag4の2.7kb BamHI フラグメント。BamHIおよびSmaIの両方は、元のタグ化ベクターpMOG553において右側T-DNAボーダーとgusAコード領域との間を切断するので、構築物pMOG820、pM OG821、pMOG847、およびpMOG848において、gusA遺伝子と隣接植物配列との間の正確な配列状況は維持された。実施例４プロモーターなしのGUS構築物pMOG819の構築このベクターを、pMOG553のGUSイントロンコード領域（Vacanneytら、1990，M ol.Gen.Genet．220;245-250）を、pMOG800のポリリンカーにおけるBamHI-EcoRI フラグメントとしてクローニングすることによって構築した。バイナリーベクターpMOG819（図４）は、植物の形質転換後のさらなる発現分析のためのクローン化プロモーターフラグメントを導入することに供する。実施例５ Arabidopsisへの再導入後のプロモーターフラグメントの分析クローン化プロモーターフラグメントの組織特異性活性を決定するために、得られたクローンpMOG820、pMOG821、pMOG847、およびpMOG848を、Agrobacteriumt umefaciensに取り込ませ(mobilise)、そして対応する株を使用して、野生型Arab idopsis thaliana植物を形質転換した。構築物あたり、19〜31の形質転換体を産生した。初代形質転換体からの種子を回収し、そして実験項に記載されるような Heterodera schachtiiでの感染アッセイのために生育させた。線虫感染後のGUS 分析は、pMOG821（タグ１）で形質転換した植物のみが、シンシチウムにおいてレポーター遺伝子を発現することを示した。この結果は、タグ１の右側のボーダーに隣接する植物配列（続いて#25.1と称される）は、シンシチウムにおけるGUS発現を付与することを提供する。この発現は、試験した29のpMOG821のうち21において見い出された。いくつかの弱い発現もまた、側根の維管束組織の一部、およびいくつかの着生殖物において見い出された。シンシチウムの外側でのGUS発現は、株から株への強力な変異を示した（図６を参照のこと）。この副活性でさえ、一般にシンシチウムの内側でのGUS活性よりかなり弱く、シンシチウムポジティブ株は、摂食部位(feeding site)に全く特異的ではなかった。 GUS発現もまた、Heterodera schachtiiにより誘導されたシンシチウムにおいてGUSを発現した同じ株において、Meloidogyne incognitaでの感染により誘導された巨大細胞において見い出された。これは、#25.1配列が、Meloidogyne incog nitaおよびHeterodera schachtiiに対する減少した感受性を有する操作植物に対する、ほぼ摂食部位特異的プロモーターとして使用され得ることを示す。組織培養段階の間、#25.1調節配列もまたプロモーターとして活性であることが観察され、従って、#25.1プロモーターフラグメントを、その制御下で植物細胞破壊(disruptive)遺伝子（例えば、バルナーゼ）を有するArabidopsisに移入する場合、中和化(neutralizing)遺伝子を使用する必要性を促進する（実施例７および８を参照のこと）。実施例６株pMOG553#25からのプロモータータグ１〜４の配列決定タグ2-4の右側T-DNAボーダーに隣接する植物配列を、部分的に決定した。タグ 1の４kb SmaIフラグメントを、全体的に配列決定した。配列は、この配列の最も遠位の（5'）0.5kbが、λベクターに由来し、植物プロモーター配列の3448bpを残すことを明らかにした。配列決定を、CsCl精製DNAにおけるプライマーウォーキングストラテジーを用いて、Pharmaciaの自動化シークエンサーALFで行った。蛍光dATPを、AutoRead配列決定キットと組み合わせて用いた。手順は、Vossら、（1992）Mol Cell Biol 3,153-155に記載される。配列を、配列番号４に示す。実施例７バルナーゼの前の#25.1のクローニングバルナーゼコード領域を含むフラグメントを、プライマー5’CGGACTCTGGATCCG GAAAGTG 3'および5’CTGCTCGAGCCTAGGCACAGGTTATCAACACGTTTG 3'を用いて、pMT4 16（Hartley（1988）J Mol Biol 202,913-915）からPCR増幅した。これらのプライマーは、隣接BamHIおよびXhoI制限部位を導入して、フラグメントのクローニングを容易にした。フラグメントを、Taqプロモーター（細菌においてバルナーゼの毒性を克服するのに必要）の制御下で、さらなるバルスタール遺伝子を含むベクターにおける、ノパリンターミネーター配列の上流にクローン化した。続くクローニング工程におけるバルナーゼ発現の毒性を排除するために、ST-LS1イントロンを、バルナーゼのStyI部位に挿入した。NcoI部位を、プライマー5’CGGAC TCTGGATCCGGAAAGTG 3'および5’CTTACTCGAGCCATGGTAAGTTTCTGC 3'を用いて、組換えPCRによってバルナーゼ翻訳開始コドンに作製し、pOG16.1を得た。続いて、バルナーゼコード領域に隣接するBamHI部位を、BamHIでpOG16.1を切断することによって破壊し、突出末端をKlenowポリメラーゼで平滑化しそして再連結し、pF L17を得た。バルナーゼの5'非翻訳領域配列をさらに改変して、以下のオリゴヌクレオチド5’GATCTAGACTCGAGAAGCTTGGATCCCCGGGTAGGTCAGTCCCC 3'および5’CAT GGGGGACTGACCTACCCGGGGATCCAAGCTTCTCGAGTCTA 3'をアニーリングし、そしてpOG1 6.1のBgIII部位とNcoI部位との間の得られるアダプターを連結することによって、本来の株pMOG53#1164における対応する配列に類似化させ(resemble)、クローンpFL18を得た。株25タグ１からの４kbプロモーターを、BamHIフラグメントとしてpMOG821からクローン化し、そしてクローンpFL18の固有のBamHI部位において、バルナーゼコード領域の5'のすぐ隣に挿入し、バルナーゼ翻訳開始コドンまでの株25の本来の配列状況(context)を回復し、pFL38を得た。実施例８構築物rolD-B^★ 構築物pFL11は、バイナリーベクターにおいてキメラバルスタール遺伝子を含む。この構築物を、以下の方法においてクローン化した。バルスタールコード領域は、構築物pMT316におけるHindIII/BamHIフラグメントに存在する（Hartley（ 1988）J Mol Biol 202,913-915）。HindIII部位を、この部位において、自己アニーリングアダプター5’AGCTCGGATCCG 3'（配列番号８）に連結することによって、BamHI部位に変化させた。続いて、得られるBamHIフラグメントを、発現カセットpMOG180（WO93/10251に記載される）における二重増強したCaMV 35Sプロモーターとnosターミネーターとの間にクローン化して、pOG30を得た。アダプター 5’GGCTGCTCGAGC 3'を用いて、nosターミネーターの3'末端のHindIII部位を、Xh oI部位に変化させ、そしてプロモーターの5'末端のEcoRI部位を、アダプター5’ AATTGACGAAGCTTCGTC 3'を用いて、HindIII部位に変化させた。次いで、35Sプロモーターを、Agrobacterium rhizogenes RolD遺伝子からのプロモーターによって置換した。このプロモーターを、構築物pDO2（F.Leachから得た）（LeachおよびAoyagi（1991）Plant Sci 79,69-76）からHindIII/BamHIフラグメントとして切り出した。得られるクローン（pOG38）から、プロモーターおよびターミネーターを含むバルスタール遺伝子を、HindIIIおよびXhoIで消化することによって切り出し、そしてpMOG800におけるポリリンカーのそれぞれの部位に挿入し、pFL 11を得た。実施例９ジャガイモ植物のpMOG944での形質転換および Globodera pallidaに対する増加した耐性についての試験バイナリーベクターpMOG944を、Agrobacterium tumefaciensに移し、そして得られた株を実験項に記載のように、ジャガイモ栽培品種Kardalからの塊茎花盤の形質転換のために使用した。全部で80のトランスジェニック株を得た。これらの系統を、少なくとも１つの節を含むセグメントでシュートを切断し、そしてそれらをインビトロで発根することによって、植物的に繁殖させた。１系統あたり15 の植物を、実験項に記載の用にGlobodera palliodaに対する増加した耐性について試験した。バルナーゼ／バルスタール構築物を含んだpMOG944で形質転換したジャガイモ植物は、（発生する）線虫摂食構造内のバルナーゼの線虫誘導性発現に起因して、Globodera palliodaに対する減少した感受性を示すことが予測される。上記の実施例は、本発明を例示するように供するにすぎず、そしてその限定を示すことを意味しない。多数の改変が、当業者には容易に思い浮かび、これは本発明の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 9/22 9/22 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ゴッディン，オスカーヨハネスマリアオランダ国エヌエル―2312 エヌエルライデン，オードヘレングラチ５ (72)発明者クラップ，ジョークオランダ国エヌエル―6865 エイケイドアウェルス，デゼルメン 49 (72)発明者シモンズ，ピータークリスチャンオランダ国エヌエル―1075 ジーケイアムステルダム，バレリウスストラート 210 アイブイ

Claims

【特許請求の範囲】１．植物に導入される場合の関連DNA配列の根瘤およびシスト線虫誘導性転写を促進し得る単離された調節DNA配列であって、該DNA配列が配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む点で特徴づけられる、単離された調節DNA配列。２．前記DNA配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列のサブフラグメントであり、関連DNAの根瘤およびシスト線虫誘導性転写をなお促進し得る点で特徴づけられる、請求項１に記載の単離された調節DNA配列。３．転写する方向において、請求項１または２に記載の調節DNA配列、ならびにその転写制御下で発現され、該調節DNA配列の転写制御下では天然ではないDNA配列を含む、キメラDNA配列。４．植物寄生線虫の代謝および／または機能および／または生存度に有害である RNAをコードする、請求項３に記載のキメラDNA。５．前記RNAがアンチセンス配向にある、請求項４に記載のキメラDNA。６．前記RNAが、植物寄生線虫に毒性または阻害性であるタンパク質をコードする、請求項４にさらに記載のキメラDNA。７．前記RNAが、植物寄生線虫摂食部位の代謝および／または機能および／または生存度に有害なタンパク質をコードする、請求項４にさらに記載のキメラDNA 。８．前記タンパク質がバルナーゼである、請求項７に記載のキメラDNA。９．請求項３〜８のいずれか１つに記載のキメラDNA配列を含む、レプリコン。１０．転写する方向において、請求項１または２に記載の調節DNA配列、ならびに該調節DNA配列の転写制御下で発現されるDNA配列の挿入のためのエンドヌクレアーゼについての少なくとも１つの認識部位を含む、レプリコン。１１．請求項９または１０に記載のレプリコンを含む、微生物。１２．請求項３〜８のいずれか１つに記載のキメラDNA配列がそのゲノムに取り込まれている、植物細胞。１３．本質的に請求項１２に記載の細胞からなる、植物の根系。１４．請求項１３に記載の根系に接ぎ木された、植物。１５．実質的に請求項１２に記載の細胞からなる、植物。１６．前記植物が双子葉類植物である点において特徴づけられる、請求項１５に記載の植物。１７．前記植物がジャガイモ植物である点において特徴づけられる、請求項１６に記載の植物。１８．請求項１５に記載の植物から得られる、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉、および木から選択される、植物の一部。１９．植物寄生線虫に対する植物耐性を増加させる方法であって、請求項３から８のいずれか１つに記載のキメラDNAを植物に導入する工程、植物をそこから再生する工程、および植物寄生線虫に対する増加した耐性を有するこれらの植物を、再生した植物の集団から選択する工程、を包含する方法。２０．植物において関連DNA配列の転写を促進し得るサブフラグメントの同定のための、請求項１に記載のDNA配列の使用。２１．植物を形質転換するための、請求項３〜８のいずれか１つに記載のキメラ DNA配列の使用。２２．ハイブリッド調節DNA配列を作製するための、請求項１に記載のDNA配列またはそのサブフラグメントの使用。