-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie,
insbesondere die Regulierung der Genexpression in Pflanzen.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Eine
Expression von heterologen DNA-Sequenzen in einem Pflanzenwirt ist
vom Vorliegen eines funktionell verknüpften Promotors abhängig, der
innerhalb des Pflanzenwirts funktionell ist. Die Wahl der Promotorsequenz
wird bestimmen, wann und wo die heterologe DNA-Sequenz innerhalb des Organismus exprimiert wird.
Wenn eine kontinuierliche Expression durch die Zelle einer Pflanze
gewünscht
wird, werden konstitutive Promotoren verwendet. Wenn dagegen eine
Genexpression als Reaktion auf einen Stimulus gewünscht wird, sind
induzierbare Promotoren das regulatorische Element der Wahl. Wenn
eine Expression in spezifischen Geweben oder Organen erwünscht ist,
können
gewebespezifische Promotoren verwendet werden. D.h., sie können eine
Expression in spezifischen Geweben oder Organen steuern. Solche
gewebespezifischen Promotoren können
konstitutiv oder induzierbar sein. In jedem Fall können zusätzliche
regulatorische Sequenzen stromaufwärts und/oder stromabwärts von
der Kernpromotorsequenz in Expressionskonstrukten von Transformationsvektoren
enthalten sein, um variierende Expressionslevel von heterologen
Nucleotidsequenzen in einer transgenen Pflanze zustande zu bringen.
-
Häufig ist
es wünschenswert,
eine konstitutive oder induzierbare Expression einer DNA-Sequenz in besonderen
Geweben oder Organen einer Pflanze zu haben. Beispielsweise könnte ein
erhöhter
Nährwert
einer Pflanze durch genetische Manipulation des Pflanzengenoms erreicht
werden, so dass ein Samen-bevorzugter Promotor funktionell an ein
heterologes Gen gebunden enthalten ist, so dass Proteine mit erhöhtem Aminosäuregehalt
im Samen der Pflanze produziert werden.
-
Alternativ
könnte
es wünschenswert
sein, eine Expression einer nativen DNA-Sequenz in Geweben einer
Pflanze zu inhibieren, um einen gewünschten Phänotyp zu erreichen. In diesem
Fall könnte
eine solche Inhibierung mit Transformation der Pflanze, um einen
gewebespezifischen Promotor funktionell mit einer Antisense-Nucleotidsequenz
verknüpft
zu umfassen, erreicht werden, so dass eine Expression der Antisense-Sequenz
ein RNA-Transkript produziert, das mit einer Translation der mRNA
der nativen DNA-Sequenz interferiert.
-
Eine
Samenentwicklung involviert eine Embryogenese und Reifungsereignisse,
wie auch physiologische Anpassungsprozesse, die innerhalb des Samens
ablaufen, um ein Überleben
der Nachkommenschaft zu sichern. Sich entwickelnde Pflanzensamen
akkumulieren und speichern Kohlenhydrat, Lipid und Protein, die anschließend während der
Keimung verwendet werden. Eine Expression von Speicherproteingenen
in Samen erfolgt in erster Linie in der Embryoachse und in den Kotyledonen
und im Endosperm von sich entwickelnden Samen, aber niemals in rei fen
vegetativen Geweben. Im Allgemeinen sind die Expressionsmuster von
Samenproteinen in hohem Maße
reguliert. Diese Regulierung beinhaltet eine räumliche und zeitliche Regulierung während der
Samenentwicklung. Eine Vielzahl von Proteinen akkumulieren und nehmen
während
der Embryogenese und Samenentwicklung ab und stellen ein ausgezeichnetes
System zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Genregulation,
wie auch zur Bereitstellung regulatorischer Sequenzen zur Verwendung
bei der genetischen Manipulation von Pflanzen bereit.
-
Demnach
werden die Isolierung und Charakterisierung von Samen-bevorzugten
Promotoren, die als regulatorische Regionen zur Expression von heterologen
Nucleotidsequenzen von Interesse in Samen-bevorzugter Art dienen
können,
zur genetischen Manipulation von Pflanzen benötigt.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
einer neuen Nucleotidsequenz zur Modulierung der Genexpression in
einer Pflanze.
-
Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines isolierten Promotors, der fähig ist, eine Transkription
in Samen-bevorzugter Art zu steuern.
-
Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur verbesserten Kontrolle eines endogenen oder
exogenen Produktes in Samen einer transformierten Pflanze.
-
Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur Bereitstellung nützlicher Änderungen im Phänotyp eines
Samens einer transformierten Pflanze.
-
Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur Erzeugung eines neuen Produkts im Samen einer
transformierten Pflanze.
-
Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur Erzeugung einer neuen Funktion im Samen einer
transformierten Pflanze.
-
Daher
betrifft die vorliegende Erfindung nach einem Aspekt:
einen
isolierten Promotor, der fähig
ist, eine Transkription in Samen-bevorzugter Art zu steuern, wobei
der Promotor umfasst:
- (a) die in SEQ ID NO:
1 oder 7 angegebene Nucleotidsequenz; oder
- (b) eine Sequenz, die wenigstens 60% Sequenzidentität zu SEQ
ID NO: 1 oder 7 hat, wobei die % Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 oder 7 auf
der gesamten Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder 7 basiert und durch eine
GAP-Version 10-Analyse unter Verwendung von Default-Parametern bestimmt
wird; oder
- (c) eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID
NO: 7 hybridisiert; oder
- (d) eine Nucleinsäure,
die zu einer Nucleinsäure
von (a), (b) oder (c) komplementär
ist.
-
Nach
anderen Aspekten bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Expressionskassetten,
die den Promotor funktionell mit einer Nucleotidsequenz verknüpft umfassen,
Vektoren, die die Expressionskassette enthalten, und Pflanzen, die
in stabiler Weise mit wenigstens einer Expressionskassette transformiert
sind.
-
Nach
einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf
ein Verfahren zum Modulieren der Expression im Samen einer stabil
transformierten Pflanze, umfassend die Schritte (a) Transformieren
einer Pflanze mit einer Expressionskassette, die den Promotor der
vorliegenden Erfindung funktionell mit wenigstens einer Nucleotidsequenz
verknüpft
umfasst; (b) Wachsenlassen der Pflanzenzelle unter Pflanzenwachstumsbedingungen
und (c) Regenerieren einer stabil transformierten Pflanze aus der
Pflanzenzelle, wobei eine Expression der Nucleotidsequenz den Phänotyp des
Samens verändert.
-
Zusammensetzungen
und Verfahren zur Regulierung der Expression von heterologen Nucleotidsequenzen
in einer Pflanze werden bereitgestellt. Die Zusammensetzungen sind
neue Nucleotidsequenzen für Samen-bevorzugte
Pflanzenpromotoren, insbesondere Regionen zur transkriptionalen
Initiierung, die aus den Pflanzengenen Cim 1 (Cytokinin-induzierte
Message); cZ19B1 (Mais-19KDa-Zein); und mi1ps (Myoinositol-1-phosphat-Synthase)
isoliert wurden. Es wird ein Verfahren zum Exprimieren einer heterologen
Nucleotidsequenz in einer Pflanze unter Verwendung der Transkriptionsinitiierungssequenzen,
die hierin offenbart sind, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst
das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Transformationsvektor,
der eine heterologe Nucleotidsequenz funktionell mit einem der Pflanzenpromotoren
der vorliegenden Erfindung verknüpft
umfasst, und Regenerieren einer stabil transformierten Pflanze aus
der transformierten Pflanzenzelle. Auf diese Weise sind die Promotorsequenzen
zur Kontrolle der Expression von endogenen wie auch exogenen Produkten
in Samen-bevorzugter Weise einsetzbar.
-
Stromabwärts von
der samenspezifischen Region und unter der transkriptionalen Initiierungsregulation
wird eine Sequenz von Interesse sein, die für eine Modifikation des Phänotyps des
Samens sorgen wird. Eine solche Modifikation beinhaltet Isolieren
der Produktion eines endogenen Produktes bezüglich Menge, relativer Verteilung
oder dergleichen oder Produktion eines exogenen Expressionsproduktes,
um für
eine neue Funktion oder ein neues Produkt im Samen zu sorgen.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Gemäß der Erfindung
werden Nucleotidkonstrukte bereitgestellt, die eine Transkriptionsinitiierung
in Samen ermöglichen.
Konstrukte der Erfindung umfassen regulierte Transkriptionsstartregionen,
die mit Samenbildung und Samengewebe assoziiert sind. So umfassen
die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung neue Nucleotidsequenzen
für Pflanzenpromotoren,
insbesondere Samen-bevorzugte Promotoren für die Gene Cim 1 (Cytokinin-induzierte
Message); cZ19B1 (Mais-19kDa-Zein); und mi1ps (Myoinositol-1-phosphat-Synthase).
-
Die
Promotoren für
diese Gene können
aus der 5'-untranslatierten
Region, die ihre jeweiligen Transkriptionsinitiierungsstellen flankiert,
isoliert werden. Verfahren zur Isolierung von Promotorregionen sind
auf dem Fachgebiet gut bekannt. Mit „isoliert" ist gemeint, dass die Promotorsequenzen
durch molekulare Techniken extrahiert oder durch chemische Mittel
synthetisiert werden können.
In jedem Fall wird der Promotor von mindestens einer seiner flankierenden
Sequenzen in seinem nativen Zustand entfernt. Sequenzen für die Promotorregionen
werden dargestellt wie oben angegeben.
-
Verfahren
zur Hybridisierung von Nucleinsäuresequenzen
sind auf dem Fachgebiet leicht verfügbar. Promotorsequenzen aus
anderen Pflanzen können
nach gut bekannten Techniken auf der Basis ihrer Sequenzhomologie
zu den hierin genannten Promotorsequenzen isoliert werden. Bei diesen
Techniken wird die bekannte Promotorsequenz ganz oder ein Teil davon
als Sonde verwendet, die selektiv an andere Sequenzen, die in einer
Population klonierter genomischer DNA-Fragmente (d.h. genomische
Bibliotheken) aus einem ausgewählten
Organismus vorliegen, hybridisiert.
-
Die
gesamte Promotorsequenz oder Teile davon können beispielsweise als Sonden
verwendet werden, die fähig
sind, spezifisch an entsprechende Promotorsequenzen zu hybridisieren.
Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielzahl von Bedingungen
zu erreichen, umfassen solchen Sonden Sequenzen, die einzigartig
sind, und haben vorzugsweise eine Länge von wenigstens etwa 10
Nucleotiden und am bevorzugtesten eine Länge von wenigstens etwa 20
Nucleotiden. Solche Sonden können
eingesetzt werden, um entsprechende Promotorsequenzen aus einem
ausgewählten
Organismus durch das gut bekannte Verfahren der Polymerasekettenreaktion
(PCR) zu amplifizieren. Diese Technik kann eingesetzt werden, um
zusätzliche
Promotorsequenzen aus einem gewünschten
Organismus zu isolieren oder als diagnostischer Assay eingesetzt werden,
um das Vorliegen der Promotorsequenzen in einem Organismus zu bestimmen.
-
Derartige
Techniken beinhalten ein Hybridisierungsscreening von plattierten
DNA-Bibliotheken
(entweder Plaques oder Kolonien; siehe Innis et al. (1990) PCR Protocols,
A Guide to Methods and Applications, Herausg., Academic Press).
-
Die
Ausdrücke "stringente Bedingungen" oder "stringente Hybridisierungsbedingungen" beinhalten eine
Bezugnahme auf Bedingungen, unter denen eine Sonde zu einem detektierbar
größeren Ausmaß als andere
Sequenzen (z.B. wenigstens zweifach im Vergleich zum Hintergrund)
an ihre Zielsequenz hybridisieren wird. Stringente Bedingungen sind
Sequenz-abhängig
und werden unter verschiedenen Umständen verschieden sein. Durch
Kontrolle der Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen
können
Zielsequenzen identifiziert werden, die zu 100% zu der Sonde komplementär sind (homologe
Sondierung). Alternativ können
Stringenzbedingungen so eingestellt werden, dass sie in Sequenzen
Fehlpaarungen zulassen, so dass geringere Ähnlichkeitsgrade detektiert
werden (heterologe Sondierung). Im Allgemeinen hat eine Sonde eine
Länge von
weniger als etwa 1000 Nucleotiden, vorzugsweise weniger als etwa
500 Nucleotiden.
-
Typischerweise
werden stringente Bedingungen solche sein, bei denen die Salzkonzentration
weniger als etwa 1,5 M Na-Ion-, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0
M Na-Ion-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist
und die Temperatur wenigstens etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis
50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. größer als
50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch durch Zusatz von
destabilisierenden Agentien, z.B. Formamid, erreicht werden. Beispiele
für Bedingungen niedriger
Stringenz umfassen eine Hybridisierung mit einer Pufferlösung von
30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei
37°C und
ein Waschen in 1X bis 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat)
bei 50 bis 55°C.
Beispielhafte moderate Stringenzbedingungen umfassen Hybridisierung
in 40 bis 45% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,5X bis
1X SSC bei 55 bis 60°C.
Beispiele für
Bedingungen hoher Stringenz umfassen Hybridisierung in 50% Formamid,
1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C
und ein Waschen in 0,1X SSC bei 60 bis 65°C. Hybridisierungszeiten können von
etwa vier Stunden bis etwa sechzehn Stunden reichen und definieren
nicht die Stringenz des Protokolls.
-
Spezifität ist typischerweise
die Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschgängen, wobei die kritischen
Faktoren die Ionenstärke
und die Temperatur der Endwaschlösung
sind. Für
DNA-DNA-Hybride kann die Tm aus der Gleichung
von Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138:267–284 (1984): Tm =
81,5°C +
16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61
(% Form) – 500/L
genähert
werden; worin M die Molarität
von einwertigen Kationen ist, %GC der prozentuale Anteil von Guanosin-
und Cytosin-Nucleotiden in der DNA ist, %-Form der prozentuale Anteil
von Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des
Hybrids in Basenpaaren ist. Die Tm, ist
die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei
der 50% einer komplementären
Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisiert. Tm wird um etwa 1°C für jedes 1% Fehlpaarung reduziert;
auf diese Weise können
Tm Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen so eingestellt werden,
dass an Sequenzen der gewünschten
Identität
hybridisiert wird. Wenn z.B. Sequenzen mit >90% Identität gesucht werden, kann die
Tm 10°C
gesenkt werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass
sie etwa 5°C
unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm)
für die
spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und
definiertem pH liegen. Allerdings können stark stringente Bedingungen
eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 1, 2, 3 oder 4°C unter dem
thermischen Schmelzpunkt (Tm) verwenden; moderat stringente Bedingungen
können
eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C unter dem
thermischen Schmelzpunkt (Tm) verwenden.
Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder
ein Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt
(Tm) verwenden. Unter Verwendung der Gleichung,
der Hybridisierungs- und Waschzusammensetzungen und der gewünschten
Tm wird der Fachmann erkennen, dass die
Reaktionen in der Hybridisierungsstrin genz und/oder bei den Waschlösungen inhärent beschrieben
sind. Zu Zwecken der Definition der Erfindung werden stringente
Bedingungen solche sein, die ein Waschen bei etwa 5°C unter dem
thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische
Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und
definiertem pH umfassen. Wenn der gewünschte Grad der Fehlpaarung
zu einer Tm von niedriger als 45°C (wässrige Lösung) oder
32°C (Formamidlösung) führt, ist
es bevorzugt, die SSC-Konzentration so zu erhöhen, dass eine höhere Temperatur
verwendet werden kann. Eine ausführliche
Anleitung für
die Hybridisierung von Nucleinsäuren
wird in Tijsen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel
2 „Overview
of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe
assays", Elsevier,
New York (1993); und Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel
2, Ausubel, et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience,
New York (1995) gefunden. Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N. Y.). Im Allgemeinen werden Sequenzen, die
Promotorsequenzen der Erfindung entsprechen und an die hierin offenbarte
Promotorsequenz hybridisieren, wenigstens zu 50% homolog, 70% homolog
oder sogar 85% homolog oder noch stärker homolog mit den offenbarten
Sequenzen sein. D.h., die Sequenzähnlichkeit von Sequenzen liegt
in einem Bereich, in dem wenigstens etwa 50%, etwa 70% und sogar
etwa 85% Sequenzähnlichkeit
geteilt werden.
-
Die
Promotorregionen der Erfindung können
aus einer beliebigen Pflanze isoliert werden; diese umfassen, sind
aber nicht beschränkt
auf: Mais (Zea mays), nicht-vegetabile Brassica (Brassica napus,
Brassica rapa ssp.), Luzerne (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa),
Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare),
Sonnenblume (Helianthus annuus), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne
(Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum),
Erdnüsse
(Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Süßkartoffel
(Ipomoea batatus), Manihot (Manihot esculenta), Kaffee (Cofea spp.),
Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Zitrusbaum
(Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis),
Banane (Musa spp.), Avokado (Persea americana), Feige (Ficus casica),
Guayave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea
europaea), Hafer, Gerste, Gemüse,
Zierpflanzen und Koniferen. Vorzugsweise umfassen die Pflanzen Mais,
Sojabohne, Sonnenblume, Safflor, Brassica, Weizen, Gerste, Roggen,
Luzerne und Sorghum.
-
Die
codierende Sequenz, die durch die Promotoren der Erfindung exprimiert
wird, kann zur Veränderung
des Phänotyps
der Samen verwendet werden. Es sind verschiedene Veränderungen
im Phänotyp
von Interesse, einschließlich
Modifizieren der Fettsäurezusammensetzung
in Samen, Verändern
des Stärke-
oder Kohlenhydratprofils, Ändern
des Aminosäuregehalts
des Samens und dergleichen. Diese Resultate können erreicht werden, indem
die Expression von heterologen Produkten oder eine verstärkte Expression
von endogenen Produkten in Samen erreicht wird. Alternativ können die
Resultate erreicht werden, indem für eine Verringerung der Expression
eines endogenen Produktes oder mehrerer endogener Produkte, insbesondere
Enzy me oder Cofaktoren, im Samen gesorgt wird. Diese Veränderungen
führen
zu einer Veränderung
im Phänotyp des
transformierten Samens.
-
Gene
von Interesse umfassen im Allgemeinen solche, die in Öl-, Stärke-, Kohlenhydrat- oder Nährstoff-Metabolismus
involviert sind, wie auch solche, die die Körnergröße in Saccharosegehalt und
dergleichen beeinflussen.
-
Allgemeine
Kategorien von Genen, die für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung von Interesse sind, umfassen
z.B. solche Gene, die bei der Information involviert sind, z.B.
Zinkfinger, solche, die bei der Kommunikation involviert sind, z.B.
Kinasen, und solche, die bei der „Haushaltsführung" involviert sind,
z.B. Hitzeschockproteine. Spezifischere Kategorien von Transgenen
z.B. umfassen Gene, die für
agronomisch wichtige Merkmale codieren, für Insektenresistenz, Krankheitsresistenz,
Herbizidresistenz und für
Kommerkmale codieren. Es ist bekannt, dass ein beliebiges Gen von
Interesse funktionell mit dem Promotor der Erfindung verknüpft sein
kann und im Samen exprimiert werden kann.
-
Agronomisch
wichtige Merkmale, wie Öl-,
Stärke-
und Proteingehalt, können,
außer
unter Verwendung traditioneller Züchtungsmethoden, genetisch
verändert
werden. Modifikationen umfassen eine Erhöhung des Gehalts an Ölsäure, gesättigten
und ungesättigten Ölen, eine
Erhöhung
der Konzentrationen an Lysin und Schwefel und Bereitstellung essentieller
Aminosäuren
und auch eine Stärkemodifikation.
Hordothioninprotein-Modifikationen werden z.B. in den U.S.-Serial
Nrn. 08/838,763, eingereicht am 10. April 1997 (U.S. Patent Nr.
5,990,389), 08/824,379, eingereicht am 26. März 1997 (U.S. Patent Nr. 5,885,801);
und 08/824,382, eingereicht am 26. März 1997 (U.S. Patent Nr. 5,885,802)
beschrieben. Ein anderes Beispiel ist Lysin- und/oder Schwefel-reiches
Samenprotein, das durch das Sojabohnen-2S-Albumin codiert wird und
in U.S.-Serial Nr. 08/618,911, eingereicht am 20. März 1996,
(WO 97/35023) beschrieben wird, und der Chymotrypsininhibitor aus
Gerste, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99–106. Um
die Konzentration an vorher ausgewählten Aminosäuren in
dem codierten Polypeptid zu erhöhen,
können
Derivate der folgenden Gene durch ortsspezifische Mutagenese hergestellt
werden. Beispielsweise ist das Gen, das für Gerste-Polypeptid mit hohem Lysingehalt
(BHL) codiert, vom Gerste-Chymotrypsininhibitor abgeleitet; U.S.-Serial
Nr. 08/740,682, eingereicht am 1. November 1996, und PCT/US97/20441,
eingereicht am 31. Oktober 1997 (WO 98/20133). Andere Proteine umfassen
Methionin-reiche Pflanzenproteine, z.B. aus Sonnenblumenkernen (Lilley
et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein
Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs; Applewhite, H.
(Herausg.); Amercian Oil Chemists Soc., Champaign, IL:497–502), Mais
(Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al.
(1988) Gene 71:359) und Reis (Musumura et al. (1989) Plant Mol.
Biol. 12:123). Andere agronomisch wichtige Gene codieren für Latex,
Fluory 2, Wachstumsfaktoren, Samenspeicherfaktoren und Transkriptionsfaktoren.
-
Agronomische
Merkmale in Samen können
verbessert werden, indem die Expression von Genen, die die Reaktion
von Samenwachstum und -entwicklung während Umweltstress beeinflussen
(Cheikh-N et al. (1994) Plant Physiol. 106(1):45–51) und von Genen, die den
Kohlenhydratmetabolismus unter Reduzierung der Körnerabortion bei Mais kontrollieren,
Zinselmeier et al. (1995) Plant Physiol. 107(2):385–391, verändert wird.
-
Insektenresistenzgene
können
für eine
Resistenz gegenüber
Schädlingen,
die starke Ernteeinbußen nach
sich ziehen, z.B. Wurzelnematogen, Erdraupe, Maiszünsler und
dergleichen, codieren. Solche Gene umfassen z.B. Bacillus thuringiensis-Endotoxin-Gene
(U.S. Pat. Nrn. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593;881;
Geiser et al. (1986) Gene 48:109); Lectine (Van Damme et al. (1994)
Plant Mol. Biol. 24:825) und dergleichen.
-
Gene,
die für
Krankheitsresistenzmerkmale codieren, können Detoxifizierungsgene,
z.B. gegen Fumonosin U.S. Patentanmeldung Nr. 08/484,815, eingereicht
am 7. Juni 1995; Avirulenz (avr)- und Krankheitsresistenz (R)-Gene
(Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science
262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1989) und dergleichen
umfassen Die Kornqualität
spiegelt sich in Merkmalen, z.B. Konzentrationen und Typen an Ölen, gesättigten
und ungesättigten,
Qualität
und Quantität
von essentiellen Aminosäuren
und Cellulosekonzentrationen wider. In Mais liefern modifizierte
Hordothionin-Proteine, die in U.S.-Serial Nr. 08/838,763 (U.S. Patent Nr.
5,990,389), eingereicht am 10. April 1997; 08/824,379, eingereicht
am 26. März
1997 (U.S. Patent Nr. 5,885,801); und 08/824,382, eingereicht am
26. März
1997 (U.S. Patent Nr. 5,885,802) beschrieben sind, Beispiele für Modifikationen
von Proteinen für
gewünschte
Zwecke.
-
Kommerzielle
Merkmale können
auch auf einem Gen (auf Genen) codiert sein, das (die) z.B. Stärke für die Produktion
von Papier, Textilien und Ethanol verändern oder erhöhen kann
(können),
oder eine Expression von Proteinen mit anderen kommerziellen Verwendungen
bereitstellen kann (können).
Eine andere wichtige kommerzielle Verwendung von transformierten
Pflanzen ist die Produktion von Polymeren und Biokunststoffen, wie
sie z.B. im U.S. Patent Nr. 5,602,321, erteilt am 11. Februar 1997,
beschrieben ist. Gene, wie z.B. β-Ketothiolase,
PHBase (Polyhydroxybutyratsyntase) und Acetoacetyl-CoA-Reduktase
(siehe Schubert et al. (1988) J. Bacteriol 170(12):5837–5847) erleichtern
eine Expression von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs).
-
Exogene
Produkte umfassen Pflanzenenzyme und -produkte, wie auch solche
aus anderen Quellen, einschließlich
Prokaryoten und anderer Eukaryoten. Solche Produkte umfassen Enzyme,
Cofaktoren, Hormone und dergleichen. Die Konzentration an Samenproteinen,
insbesondere modifizierten Samenproteinen mit verbesserter Aminosäureverteilung
zur Vebesserung des Nährwerts
des Samens, kann erhöht
werden. Dies wird durch die Expression von Proteinen mit erhöhtem Aminosäuregehalt
erreicht.
-
Wie
erwähnt
wurde, kann die heterologe Nucleotidsequenz, die funktionell mit
einem der hierin offenbarten Promotoren verknüpft ist, eine Antisense-Sequenz
für ein
targetiertes Gen sein. Mit „Antisense-DNA-Nucleotidsequenz" ist eine Sequenz
gemeint, die in umgekehrter Orientierung zu der normalen 5'-zu-3'-Orientierung jener
Nucleotidsequenz ist. Bei Abgabe in eine Pflanzenzelle verhindert
eine Expression der Antisense-DNA-Sequenz eine normale Ex pression
der DNA-Nucleotidsequenz für
das targetierte Gen. Die Antisense-Nucleotidsequenz codiert für ein RNA-Transkript,
das komplementär
zu der endogenen Messenger-RNA (mRNA) ist, welche durch Transkription
der DNA-Nucleotidsequenz für
das targetierte Gen produziert wird, und fähig ist, an diese zu hybridisieren.
In diesem Fall wird eine Produktion des nativen Proteins, das durch
das targetierte Gen codiert wird, inhibiert, um eine gewünschte phänotypische
Antwort zu erreichen. Auf diese Weise können die hierin offenbarten
Promotorsequenzen funktionell mit Antisense-DNA-Sequenzen verknüpft sein,
um eine Expression eines nativen Proteins in Pflanzensamen zu reduzieren
oder zu inhibieren.
-
Mit „Promotor" oder „Transkriptionsstartregion" ist eine regulatorische
Region von DNA gemeint, die üblicherweise
eine TATA-Box umfasst, welche fähig
ist, RNA-Polymerase II zu steuern, um eine RNA-Synthese an der geeigneten
Transkriptionsinitiierungsstelle für eine bestimmte codierende
Sequenz zu initiieren. Ein Promotor kann zusätzlich andere Erkennungssequenzen
umfassen, die im Allgemeinen stromaufwärts oder 5' zu der TATA-Box positioniert sind,
die als stromaufwärts-Promotor-Elemente
bezeichnet werden, welche die Transkriptionsinitiierungsrate beeinflussen.
Es wird erkannt, dass, wenn die Nucleotidsequenzen für die hierin offenbarten
Promotorregionen identifiziert sind, es im Rahmen des Standes der
Technik liegt, weitere regulatorische Elemente in der 5'-untranslatierten
Region stromaufwärts
von den bestimmten hierin identifizierten Promotorregionen zu isolieren
und zu identifizieren. Demnach werden die hierin offenbarten Promotorregionen im
Allgemeinen weiter dadurch definiert, dass sie stromaufwärts gelegene
regulatorische Elemente umfassen, z.B. solche, die für eine Gewebe- und temporale Expression
der codierenden Sequenz, der Enhancer und dergleichen verantwortlich
sind. Auf die gleiche Weise können
die Promotorelemente, die eine Expression in dem gewünschten
Gewebe, z.B. dem Samen, ermöglichen,
identifiziert, isoliert und mit anderen Kernpromotoren verwendet
werden, um eine Samen-bevorzugte Expression zu bestätigen.
-
Die
regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung ermöglichen,
wenn sie funktionell mit einer heterologen Nucleotidsequenz von
Interesse verknüpft
sind und in einen Transformationsvektor insertiert sind, eine Samen-bevorzugte
Expression der heterologen Nucleotidsequenz in den Samen einer Pflanze,
die mit diesem Vektor stabil transformiert ist. Mit „Samenbevorzugt" ist eine Expression
in Samen, einschließlich
wenigstens einem von Embryo, Kern bzw. Korn, Pericarp, Endosperm,
Kern, Aleuron, Pedicel und dergleichen, gemeint.
-
Mit „heterologe
Nucleotidsequenz" ist
eine Sequenz gemeint, die natürlicherweise
nicht mit der Promotorsequenz auftritt. Obgleich diese Nucleotidsequenz
für die
Promotorsequenz heterolog ist, kann sie für den Pflanzenwirt homolog
oder nativ oder heterolog oder fremd sein.
-
Es
wird erkannt, dass die Promotoren mit ihren nativen codierenden
Sequenzen verwendet werden können,
um eine Expression zu verstärken
oder zu verringern, was in einer Änderung des Phänotyps im
transformierten Samen resultiert.
-
Die
isolierten Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können modifiziert
werden, um für
eine Reihe von Expressionsleveln der heterologen Nucleotidsequenz
zu sorgen. So können
weniger als die gesamten Promotorregionen genutzt werden und die
Fähigkeit,
eine Samen-bevorzugte Expression zu steuern, beibehalten werden.
Es wird allerdings erkannt, dass Expressionslevel von mRNA durch
Deletionen von Teilen der Promotorsequenzen gesenkt werden können. Im
Allgemeinen werden wenigstens etwa 20 Nucleotide einer isolierten
Promotorsequenz verwendet werden, um eine Expression einer Nucleotidsequenz
zu steuern.
-
Es
ist bekannt, dass zur Erhöhung
von Transkriptionsleveln Enhancer in Kombination mit den Promotorregionen
der Erfindung verwendet werden können.
Enhancer sind Nucleotidsequenzen, die wirken, um die Expression
einer Promotorregion zu erhöhen.
Enhancer sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen die SV40-Enhancerregion,
das 35S-Enhancerelement und dergleichen.
-
Modifikationen
der isolierten Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können für einen
Expressionsbereich der heterologen Nucleotidsequenz sorgen. So können sie
modifiziert sein, so dass sie schwache Promotoren oder starke Promotoren
sind. Unter einem „schwachen
Promotor" versteht
man im Allgemeinen einen Promotor, der eine Expression einer codierenden
Sequenz bei niedrigem Level steuert. Mit „niedrigem Level" sind Level von etwa
1/10.000 Transkripte bis 1/100.000 Transkripte bis etwa 1/500.000
Transkripte gemeint. Umgekehrt steuert ein starker Promotor die
Expression einer codierenden Sequenz auf einem hohen Level oder
mit etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/00 Transkripten bis etwa 1/1000
Transkripten.
-
Promotorfragmente,
z.B. die, die aus einer ortsspezifischen Mutagenese resultieren,
werden von den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit
umfasst.
-
Biologisch
aktive Varianten der Promotorsequenzen werden vom erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls
mit umfasst. Solche Varianten sollten Promotoraktivität, insbesondere
die Fähigkeit,
eine Expression in Samen oder Samengeweben zu steuern, beibehalten.
Biologisch aktive Varianten umfassen z.B. die nativen Promotorsequenzen
der Erfindung, die eine oder mehrere Nucleotidsubstitution(en),
-deletion(en) oder -insertion(en) haben. Promotoraktivität kann durch
Northern Blot-Analyse, Reporteraktivitätsmessungen, wenn transkriptionale
Fusionen verwendet werden, und dergleichen gemessen werden. Siehe
z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N. Y.).
-
Die
folgenden Ausdrücke
werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren oder
Polynucleotiden zu beschreiben: (a) „Referenzsequenz", (b) „Vergleichsfenster", (c) „Prozentwert
der Sequenzidentität" und (d) „substantielle
Identität".
- (a)
Wie hierin verwendet ist der Ausdruck „Referenzsequenz" eine definierte
Sequenz, die als Basis zum Sequenzvergleich verwendet wird. Eine
Referenzsequenz kann ein Teilstück
oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein, z.B. ein
Segment einer Volllängen-Promotorsequenz oder
die vollständige Promotorsequenz.
- (b) Der hierin verwendete Ausdruck „Vergleichsfenster" bezieht sich auf
ein fortlaufendes und spezifiziertes Segment an der Polynucleotidsequenz,
in dem die Polynucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz verglichen
werden kann und worin der Teil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster
Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz
(die keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Anordnung
der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen hat das Vergleichsfenster eine
Länge von
wenigstens 20 fortlaufenden Nucleotiden und kann optional eine Länge von
30, 40, 50, 100 oder mehr fortlaufenden Nucleotiden haben. Der Fachmann
weiß,
dass zur Vermeidung einer hohen Ähnlichkeit
mit einer Referenzsequenz infolge des Einschlusses von Lücken (gaps)
in die Polynucleotidsequenz typischerweise ein „gap penalty" eingeführt wird
und von der Zahl der Übereinstimmungen
abzogen wird.
-
Methoden
zur Anordnung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet
gut bekannt. Eine optimale Anordnung von Sequenzen zum Vergleich
kann durch den Homologie-Anordnungs-Algorithmus
von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, durchgeführt werden.
Eine Durchführung
dieses Algorithmus mittels Computer beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf,
GAP und BLAST im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group (GCG)(575 Science Drive, Madison, Wisconsin). Ein Beispiel
für Programme
der BLAST-Familie, die zum Suchen nach Database-Sequenzähnlichkeit
zu Zwecken der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfasst
das BLASTN-Programm zur Abfrage von Nucleotidsequenzen aus der Nucleotidsequenz-Datei.
Siehe Ausubel et al., Herausg. (1995) Current Protocols in Molecular
Biology, Kapitel 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New
York). Der BLAST-Homologie-Anordnungs-Algorithmus ist zum Vergleich
von Fragmenten der Referenz-Nucleotid- oder Aminosäuresequenz
mit Sequenzen aus öffentlichen
Dateien bzw. Datenbanken einsetzbar. Es ist dann erforderlich, eine
Methode der Anordnung der vollständigen
Referenzsequenz an die Datenbank-Sequenzen anzuwenden, um den Prozentwert
der Identität
(im Fall von Polynucleotiden) oder den Prozentwert der Ähnlichkeit
(im Fall von Polypeptiden) zu entwickeln. Der GAP-Algorithmus ist
eine derartige Methode.
-
GAP
verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (T. Mol. Biol.
48:443–453,
1970), um die Anordnung von zwei vollständigen Sequenzen, die die Anzahl
der Übereinstimmungen
maximiert und die Anzahl von Lücken
minimiert, zu finden. GAP zieht alle möglichen Anordnungen und Lücken-Positionen
in Betracht und erzeugt die Anordnung mit der größten Zahl von übereinstimmenden
Basen und den wenigsten Lücken.
Es ermöglicht
die Bereitstellung eines „gap
creation penalty" und
eines „gap
extension penalty" in
Einheiten von gepaarten Basen. GAP muss für die „gap creation penalty" mit der Anzahl der Übereinstimmungen, für jede Lücke, die
insertiert wird, einen numerischen Gewinn machen. Wenn ein „gap extension
penalty" von größer als
null gewählt
wird, muss GAP zusätzlich
für jede
eingefügte
Lücke einen
numerischen Gewinn mit dem Wert Länge der Lücke mal der „gap extension
penalty" machen.
Default gap creation penalty-Werte und gap extension penalty-Werte
in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package für Proteinsequenzen sind
8 bzw. 2. Für
Nucleotidsequenzen ist die default gap creation penalty 50, während die
default gap extension penalty 3 ist. Die gap creation und gap extension
penalties können
als ganze Zahl ausgedrückt
werden, die aus der Gruppe ganzer Zahlen, die von 0 bis 200 reicht,
ausgewählt
wird. So können
beispielsweise die gap creation und gap extension penalties 0, 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,
60, 65 oder größer sein.
-
GAP
präsentiert
ein Mitglied der Familie bester Anordnungen. Es können viele
Mitglieder dieser Familie sein, aber kein anderes Mitglied hat eine
bessere Qualität.
GAP zeigt vier Leistungspunkte zur Anordnung: Qualität, Verhältnis, Identität und Ähnlichkeit.
Qualität
ist das Maß,
das zur Anordnung der Sequenzen maximiert wird. Verhältnis ist
die Qualität,
dividiert durch die Anzahl der Basen im kürzeren Segment. Prozentwert der
Identität
ist der prozentuale Anteil der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Prozentwertähnlichkeit
ist der Prozentsatz der Symbole, die ähnlich sind. Symbole, die Lücken gegenüberliegen,
werden ignoriert. Ähnlichkeit
wird bewertet, wenn der Scoring-Matrix-Wert für ein Symbolpaar größer oder
gleich 0,50, die Schwellenähnlichkeit,
ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package verwendete
Scoring Matrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:10915).
-
Wenn
nichts anderes angegeben ist, so ist für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung die bevorzugte Methode zur Bestimmung des Prozentwerts
der Sequenzidentität
die durch den GAP Version 10-Algorithmus unter Verwendung von Default-Parametern.
- (c) Der Ausdruck „Prozentwert Sequenzidenität", wie er hierin verwendet
wird, meint den Wert, der durch Vergleich von zwei optimal angeordneten
Sequenzen über
ein Vergleichsfenster bestimmt wird, wobei der Teil der Polynucleotidsequenz
im Vergleichsfenster in Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine
Additionen oder Deletionen umfasst) für eine optimale Anordnung der
zwei Sequenzen Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) umfassen
kann. Der Prozentwert wird errechnet, indem die Anzahl von Positionen
bestimmt wird, bei der in beiden Sequenzen die identische Nucleinsäurebase
auftritt, um die Anzahl von übereinstimmenden
Positionen zu erhalten, die Anzahl von übereinstimmenden Positionen
durch die Gesamtzahl von Positionen im Vergleichsfenster dividiert
wird und das Resultat mit 100 multipliziert wird, wodurch der Prozentwert
der Sequenzidentität
erhalten wird.
- (d) Der Ausdruck „substantielle
Identität" von Polynucleotidsequenzen
bedeutet, dass ein Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens
70% Sequenzidentität,
vorzugsweise mindestens 80%, bevorzugter mindestens 90% und am bevorzugtesten
mindestens 95% Sequenzidentität
bei Vergleich mit einer Referenzsequenz hat, wobei eines der beschriebenen
Anordnungsprogramme unter Verwendung von Standardparametern eingesetzt
wird.
-
Ein
weiterer Hinweis dafür,
dass Nucleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn
zwei Nucleinsäuremoleküle unter
stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren. Im Allgemeinen
werden stringente Temperaturbedingungen so gewählt, dass sie bei einer definierten
Ionenstärke
und definiertem pH etwa 5°C
bis etwa 2°C
unter dem Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische
Sequenz liegen. Die Denaturierung oder das Schmelzen von DNA tritt über einen engen
Temperaturbereich auf und stellt die Spaltung der Doppelhelix in
ihre komplementären
Einzelstränge
dar. Das Verfahren wird üblicherweise
durch die Temperatur des Übergangsmittelpunkts
Tm charakterisiert, die manchmal als die
Schmelztemperatur beschrieben wird. Auf dem Fachgebiet sind Formeln
zur Bestimmung von Schmelztemperaturen verfügbar. Typischerweise sind stringente
Waschbedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration bei pH
7 etwa 0,02 molar ist und die Temperatur 50, 55 oder 60°C ist.
-
Die
Nucleotidsequenzen für
die Samen-bevorzugten Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung
offenbart sind, wie auch Varianten und Fragmente davon, sind in
der genetischen Manipulation einer beliebigen Pflanze einsetzbar,
wenn sie funktionell mit einer heterologen Nucleotidsequenz verknüpft sind,
deren Expression kontrolliert werden soll, um eine gewünschte Phänotypantwort
zu erhalten. Mit „funktionell
verknüpft" ist gemeint, dass
die Transkription oder Translation der heterologen Nucleotidsequenz
unter dem Einfluss der Promotorsequenz ist. Auf diese Weise können die
Nucleotidsequenzen für
die Promotoren der Erfindung in Expressionskassetten zusammen mit
heterologen Nucleotidsequenzen zur Expression in der Pflanze von
Interesse, insbesondere im Samen der Pflanze, bereitgestellt werden.
-
Solche
Expressionskassetten werden eine Transkriptionsstartregion umfassen,
die eine der Promotor-Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung
oder Varianten oder Fragmente davon funktionell mit der heterologen
Nucleotidsequenz, deren Expression durch die hierin offenbarten
Samen-bevorzugten Promotoren zu kontrollieren ist, verknüpft, umfasst.
Eine solche Expressionskassette ist mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen
zur Insertion der Nucleotidsequenz, die unter der Transkriptionsregulation
der regulatorischen Regionen sein soll, ausgestattet. Die Expressionskassette
kann zusätzlich
selektierbare Markergene enthalten.
-
Die
Expressionskassette wird in der 5'-zu-3'-Transkriptionsrichtung eine Transkriptions- und Translationsstartregion,
eine heterologe Nucleotidsequenz von Interesse und eine Transkriptions-
und Translationsterminierungsregion, die in Pflanzen funktionell
sind, umfassen. Die Terminierungsregion wird mit der Transkriptionsstartregion,
die eine der Promotor-Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung
umfasst, nativ sein, kann mit der DNA-Sequenz von Interesse nativ
sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche
Terminierungsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens
verfügbar,
z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminerungsregionen.
Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141–144; Proudfoot
(1991) Cell 64:671–674;
Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141–149; Mogen et al. (1990) Plant
Cell 2:1261–1272;
Munroe et al. (1990) Gene 91:151–158; Ballas et al. (1989)
Nucleic Acids Res. 17:7891–7903;
Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627–9639.
-
Die
Expressionskassette, die die Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung
funktionell an eine heterologe Nucleotidsequenz verknüpft umfasst,
kann auch wenigstens eine zusätzliche
Nucleotidsequenz für ein
Gen, das in den Organismus cotransformiert werden soll, enthalten.
Alternativ kann (können)
die zusätzliche(n)
Sequenze(n) auf einer anderen Expressionskassette bereitgestellt
werden.
-
Wenn
es passend ist, können
die heterologe Nucleotidsequenz, deren Expression unter der Kontrolle der
Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung erfolgen soll, und eine
beliebige zusätzliche
Nucleotidsequenz (zusätzliche
Nucleotidsequenzen) für
eine verstärkte
Expression in der transformierten Pflanze optimiert werden. D.h.,
diese Nucleotidsequenzen können
unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons für eine verbesserte Expression
synthetisiert werden. Zur Synthese von Pflanzen-bevorzugten Nucleotidsequenzen stehen
Methoden auf dem Fachgebiet zur Verfügung. Siehe z.B. U.S. Patente
Nrn. 5,380,831 und 5,436,391 und Murray et al. (1989) Nucleic Acids
Res. 17:477–498,
die hierin durch Referenz eingearbeitet gelten.
-
Es
ist bekannt, dass zusätzliche
Sequenzmodifikationen die Genexpression in einem cellulären Wirt erhöhen. Diese
umfassen Eliminierung von Sequenzen, die für Pseudo-Polyadenylierungssignale,
Exon-Intron-Splicestellensignale Transposon-artige Wiederholungen
und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen codieren, welche
für die
Genexpression schädlich
sein können.
Der G-C-Gehalt der heterologen Nucleotidsequenz kann auf Level eingestellt
werden, die für
einen gegebenen cellulären
Wirt durchschnittlich sind, wie sie durch Referenz auf bekannte
Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, errechnet werden. Wenn
möglich
wird die Sequenz so modifiziert, dass vorausgesagte Haarnadel-sekundär-mRNA-Strukturen vermieden
werden.
-
Die
Expressionskassetten können
zusätzlich
5'-Leadersequenzen
im Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Solche Leadersequenzen
können
zur Verstärkung
der Translation wirken. Translationsleader sind auf dem Fachgebiet
bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, z.B. EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nichtcodierende
Region)(Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126–6130);
Potyvirus-Leader, z.B. TEV-Leader (Tabakätzvirus)(Allison et al. (1986));
MDMV-Leader (Mais-Verzwergungs-Mosaik-Virus)(Virology, 154:9–20); humanes
Immunglobulin-schwere-Kette-Bindungsprotein (BiP)(Macejak et al. (1991)
Nature 353:90–94);
untranslatierte Leader aus Hüllprotein
mRNA von Luzerne-Mosaik-Virus
(AMV RNA 4)(Jobling et al. (1987) Nature 325:622–625); Tabakmosaikvirus-Leader
(TMV)(Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, Seiten 237–256); und
Mais-Scheckungs-Virus-Leader
(MCMV)(Lommel et al. (1991) Virology 81:382–385). Siehe auch Della-Cioppa
et al. (1987) Plant Physiology 84:965–968. Andere Methoden, von
denen bekannt ist, dass sie die Translation und/oder mRNA-Stabilität erhöhen, können ebenfalls
eingesetzt werden, z.B. Introns und dergleichen.
-
In
solchen Fällen,
wo es erwünscht
ist, das exprimierte Produkt der heterologen Nucleotidsequenz auf eine
bestimmte Organelle, insbesondere das Plasmid, den Amyloplast oder
die Vacuole oder in das endoplasmatische Retikulum gesteuert zu
haben oder an der Zelloberfläche
oder extracellulär
sezerniert zu haben, kann die Expressionskassette außerdem eine
codierende Sequenz für
ein Transitpeptid umfassen. Solche Transitpeptide sind auf dem Fachgebiet
gut bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, das Transitpeptid
für das
Acylträgerprotein,
die kleine Untereinheit von RUBISCO, Planzen-ESP-Synthase und dergleichen.
-
Bei
der Herstellung der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente
manipuliert werden, um so dafür
zu sorgen, dass die DNA-Sequenzen in der geeigneten Orientierung
und dementsprechend im passenden Leserahmen vorliegen. Dazu können Adapter
oder Linker verwendet werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden,
oder es können
andere Manipulationen involviert werden, um für zweckdienliche Restriktionsstellen,
Entfernung von überflüssiger DNA,
Entfernung von Restriktionsstellen oder dergleichen zu sorgen. Zu
diesem Zweck können
eine in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Annealing, Resubstitutionen,
z.B. Transitionen oder Transversionen, involviert werden.
-
Reportergene
oder selektierbare Markergene können
in den Expressionskassetten enthalten sein. Beispiele für geeignete
Reportergene, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können z.B.
in Jefferson et al. (1991) in Plant Molecular Biology Manual, Herausg.
Gelvin et al. Kluwer Academic Publishers), S. 1–33; DeWet et al. (1987) Mol.
Cell. Biol. 7:725–737;
Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517–2522; Kain et al. (1995) BioTechniques
19:650–655;
und Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325–330 gefunden werden.
-
Selektierbare
Markergene zur Selektion von transformierten Zellen oder Geweben
können
Gene umfassen, die Antibiotikaresistenz oder Resistenz gegenüber Herbiziden
verleihen. Beispiele für
geeignete selektierbare Markergene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
Gene, die für
Resistenz gegenüber
Chloramphenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987–992); Methotrexat
(Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209–213; Meijer et al. (1991)
Plant Mol. Biol. 16:807–820);
Hygromycin (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103–108; Zhijan
et al. (1995) Plant Science 108:219–227); Streptomycin (Jones
et al. (1987) Mol. Genet. 210:86–91); Spectinomycin (Bretagne-Sagnard
et al. (1996) Transgenic Res. 5:131–137); Bleomycin (Hille et
al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171–176); Sulfonamid (Guerineau
et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127–136); Bromoxynil (Stalker
et al. (1988) Science 242:419–423);
Glyphosat (Shaw et al. (1986) Science 233:478–481); Phosphinothricin (DeBlock
et al. (1987) EMBO J. 6:2513–2518)
codieren.
-
Andere
Gene, die bei der Gewinnung von transgenen Ereignissen nützlich sein
könnten,
im Endprodukt aber nicht erforderlich sind, würden umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf, Beispiele, wie GUS (Glucuronidase; Jefferson (1987) Plant Mol.
Biol. Rep. 5:387), GFP (grünes
Fluoreszenzprotein; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), Luziferase
(Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8115; Luehrsen et
al. (1992) Methods Enzymol. 216:397–414) und Maisgene, die für Anthocyaninproduktion
codieren (Ludwig et al. (1990) Science 247:449).
-
Transformationsprotokolle,
wie auch Protokolle zur Einführung
von Nucleotidsequenzen in Pflanzen, können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze
oder der Pflanzenzelle, d.h. Monocotyle oder Dicotyle, die Ziel der
Transformation ist, variieren. Geeignete Methoden zur Einführung von
Nucleotidsequenzen in Pflanzenzellen und anschließende Insertion
in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986)
Biotechniques 4:320–344),
Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. US 83:5602–5606),
Agrobacterium vermittelte Transformation (Townsend et al., U.S. Patent
Nr. 5,563,055; Zhao et al. WO US98/01268), direkten Gentransfer
(Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717–2722) und Beschleunigung von ballistischen
Partikeln (siehe z.B. Sanford et al., U.S. Patent Nr. 4,945,050;
Tomes et al. (1995) „Direct
DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardement" in Plant Cell, Tissue
and Organ Culture: Fundamental Methods, Herausg. Gamborg und Philipps
(Springer-Verlag Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology
6:923–926).
Siehe auch Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421–477; Sanford
et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27–37 (Zwiebel);
Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671–674 (Sojabohne); McCabe et
al. (1988) Bio/Technology 6:923–926
(Sojabohne); Finer und Mc-Mullen
(1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175–182 (Sojabohne); Singh et
al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319–324 (Sojabohne); Datta et
al. (1990) Biotechnology 8:736–740
(Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305–4309 (Mais);
Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559–563 (Mais); Tomes, U.S. Patent
Nr. 5,240,855; Buising et al., U.S. Patent Nrn. 5,322,783 und 5,324,646;
Tomes et al. (1995) "Direct
DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardement" in Plant Cell, Tissue
and Organ Culture: Fundamental Methods, Herausg. Gamborg (Springer-Verlag,
Berlin)(Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440–444 (Mais); Fromm
et al. (1990) Biotechnology 8:833–839 (Mais); Hooykaas-Van Slogeteren
et al. (1984) Nature (London) 311:763–764; Bowen et al., U.S. Patent
Nr. 5,736,369 (Getreide); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:5345–5349
(Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Exprimental Manipulation
of Ovule Tissues, Herausg. Chapman et al. (Longman, New York), S.
197–209
(Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415–418 und
Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560–566 (Wedel
(Whisker)-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495–1505 (Elektroporation);
Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250–255 und Christou und Ford
(1995) Annals of Botany 75:407–414
(Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745–750 (Mais
via Agrobacterium tumefaciens).
-
Die
Zellen, die transformiert wurden, können auf herkömmlichen
Wegen zu Pflanzen wachsengelassen werden. Siehe z.B. McCormick et
al. (1986) Plant Cell Reports 5:81–84. Diese Pflanzen können dann wachsen
gelassen werden und entweder mit demselben transformierten Stamm
oder unterschiedlichen Stämmen
bestäubt
werden und die resultierende Hybride mit konstitutiver Expression
mit gewünschtem
phänotypischen
Merkmal identifiziert werden. Es können zwei oder mehr Generationen
wachsen gelassen werden, um sicherzustellen, dass eine konstitutive
Expression des gewünschten
phänotypischen
Merkmals in stabiler Weise aufrechterhalten wird und vererbt wird,
dann werden Samen gesammelt, um sicherzustellen, dass eine konstitutive
Expression des gewünschten
phänotypischen
Merkmals erreicht wurde.
-
Die
Expressionskassette, die die bestimmte Promotorsequenz der vorliegenden
Erfindung funktionell mit einer heterologen Nucleotidsequenz von
Interesse verknüpft
umfasst, kann zum Transformieren einer beliebigen Pflanze verwendet
werden. Auf diese Weise können
gene tisch modifizierte Pflanzen, Pflanzenzellen, genetisch modifiziertes
Pflanzengewebe, genetisch modifizierter Pflanzensamen und dergleichen
erhalten werden.
-
Die
folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angeführt.
-
EXPERIMENTELLES
-
Promotorregionen
für die
Maisgene Cim 1 (Cytokinin-induzierte Message)(Genbank-Zugangsnr. U03860);
cZ19B1 (Mais-19KDa-Zein)(Genbank-Zugangsnr. M12143); und mi1ps (Myoinositol-1-phosphat-Synthase)(Genbank-Zugangsnr.
U32511) wurden aus Maispflanzen isoliert und geklont. Diese Gene
wurden als Quellen für
Samen-bevorzugte Promotoren auf der Basis der räumlichen Expression ihrer Genprodukte
ausgewählt.
Das Verfahren zu ihrer Isolierung wird unten beschrieben.
-
Beispiel 1: Isolierung
von Promotorsequenzen
-
Das
Verfahren zur Promotorisolierung wird im Benutzerhandbuch für den Genome
Walker-Kit, verkauft von Clontech Laboratories Inc., Palo Alto,
Kalifornien, beschrieben. Genomische DNA aus der Maislinie V3-4-A63
wurde hergestellt, indem Blätter
von 10 Tage alten Keimlingen in flüssigem Stickstoff vermahlen
wurden und die DNA präpariert
wurde, wie es von Chen und Dellaporta (1994) in The Maize Handbook,
Herausg. Freeling und Walbot (Springer-Verlag, Berlin) beschrieben
ist, allerdings mit wenigen kleineren Modifikationen. Präzipitierte
DNA wurde unter Verwendung einer Impföse entnommen und in ein 1,5
ml-Eppendorf-Röhrchen überführt, das
500 l TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) enthielt. Die DNA wurde
sich bei Raumtemperatur über
15 Minuten auflösen
gelassen, mit Phenol extrahiert und mit 2-Propanol in 700 l präzipitiert.
Das Präzipitat wurde
isoliert und mit 70% Ethanol gewaschen. Die DNA wurde dann in ein
sauberes 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen
gegeben, an der Luft getrocknet und in 200 l TE resuspendiert. RNase
A wurde zu 10 g/ml zugesetzt und das Gemisch wurde für mehrere
Stunden bei 37°C
inkubiert. Die DNA wurde dann einmal mit Phenol-Chloroform, dann
Chloroform extrahiert, danach mit Ethanol präzipitiert und in TE resuspendiert.
Die DNA wurde dann genau wie im Genome Walker-Benutzerhandbuch (Clontech
PT3042-1 Version PR68687) beschrieben, verwendet. Kurz gesagt, die
DNA wurde getrennt mit den Restriktionsenzymen DraI, EcoRV, PvuII,
ScaI und StuI, alle Schneidemittel für stumpfe Enden, verdaut. Die
DNA wurde mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert, danach mit
Ethanol präzipitiert.
Die Genome Walker-Adapter wurden an die Enden der restringierten DNA
ligiert. Die resultierende DNA wird als DL1–DL5 bezeichnet.
-
Zur
Isolierung von spezifischen Promotorregionen wurden zwei nichtüberlappende
genspezifische Primer (Länge
27–30
bp) vom 5'-Ende
der Maisgene, die aus Sequenzdatenbanken identifiziert worden waren, entwickelt.
Die Primer wurden entwickelt, um die Region stromaufwärts der
codierenden Sequenz, d.h. die 5'-untranslatierte
Region und Promotor des gewählten
Gens, zu amplifizieren. Die Sequenz der Primer wird unten für jeden
Promotor beschrieben. Die erste Runde der PCR wurde an jeder DNA-Probe
(DL1–5)
mit dem Clontech-Primer AP1 und den genspezifischen Primern (gsp)1
mit den in SEQ ID NO: 1, 5 oder 8 angegebenen Sequenzen durchgeführt.
-
Die
PCR wurde in einem Thermal Cycler, Modell PTC-100, mit HotBonnet
von MJ Research (Watertown, MA) durchgeführt, wobei Reagentien verwendet
wurden, die mit dem Genome Walker-Kit geliefert wurden. Es wurden
die folgenden Zyklusparameter verwendet: 7 Zyklen bei 94°C für 2 Sekunden,
dann 72°C
für 3 Minuten,
gefolgt von 32 Zyklen bei 94°C
für 2 Sekunden
und 67°C
für 3 Minuten.
Schließlich
wurden die Proben für
4 Minuten bei 67°C
gehalten und dann bei 4°C
bis zur weiteren Analyse.
-
Wie
im Benutzerhandbuch beschrieben ist, wurde die DNA aus der ersten
PCR-Runde dann verdünnt und
als Matrize in einer zweiten PCR-Runde unter Verwendung des Clontech-AP2-Primers und genspezifischer
Primer (gsp)2 mit den in SEQ ID NO: 3, 6 oder 9 gezeigten Sequenzen
verwendet.
-
Die
Zyklusparameter für
die zweite Runde waren: 5 Zyklen bei 94°C für 2 Sekunden, dann 72°C für 3 Minuten.
Schließlich
wurden die Proben für
4 Minuten bei 67°C
gehalten und dann bei 4°C
gehalten. Etwa 10 l jeder Reaktion wurden an einem 0,8% Agarosegel
laufen gelassen und Banden (üblicherweise
500 bp oder größer) wurden
ausgeschnitten, mit dem Sephaglas BandPrep-Kit (Pharmacia, Piscataway,
NJ) gereinigt und in den TOPOTO-Vektor pCR2.1 (Invitrogen, Karlsbad,
CA; www.invitrogen.com) kloniert. Klone wurden zur Bestätigung sequenziert.
-
Beispiel 2: Expressionsdaten
unter Verwendung von Promotorsequenzen
-
Drei
Promotor::GUS-Fusionskonstrukte wurden durch die unten beschriebenen
Verfahren hergestellt. Alle Vektoren wurden unter Verwendung von
Standard-Molekularbiologie-Techniken
(Sambrook et al., a.a.O.) konstruiert. Ein Reportergen und ein selektierbares
Markergen zur Genexpression und Selektion wurden zwischen die Mehrfach-Klonierungsstellen
des pBluescript-Klonierungsvektors (Stratagene Inc., 11011 N. Torrey Pines
Rd., La Jolla, CA; www.stratagene.com) insertiert. Das Reportergen
war das Glucuronidase (GUS)-Gen (Jefferson, R. A. et al., 1986,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:8447–8451), in dessen codierende
Region das zweite Intron aus dem Kartoffel-ST-LS1-Gen (Vancanneyt
et al., Mol. Gen. Genet. 220:245–250, 1990) insertiert war,
um Intron-GUS zu produzieren, um eine Expression des Gens im Agrobacterium
zu verhindern (siehe Ohta, S. et al., 1990, Plant Cell Physiol.
31(6):805–813).
Die jeweiligen Promotorregionen wurden im Raster an Stellen 5' zu dem GUS-Gen ligiert.
Ein Fragment, das die Basen 2 bis 310 aus dem Terminator des Kartoffel-Proteinaseinhibitors
(pinII)-Gen (An et al., Plant Cell 1:115–122, 1989) enthielt, wurde
am stumpfen Ende stromabwärts
der GUS-codierenden Sequenz ligiert, um so die GUS-Expressionskassette
zu erzeugen. Das 3'-Ende
des Terminators trug eine NotI-Restriktionsstelle.
-
cZ19B1::GUS::pinII
wurde unter Verwendung des obigen Plasmids konstruiert, mit NcoI
verdaut, mit Klenow-Enzym aufgefüllt
und dann mit NotI verdaut, um Insertionsstellen für den Promotor
bereitzustellen. Das Plasmid mit dem isolierten cZ19B1-Promotor
im TOPOTA- Klonierungsvektor
wurde mit BsaI verdaut, mit Klenow gefüllt und mit NotI verdaut. Das
Fragment wurde in die verdaute Expressionskassette ligiert und eine
erfolgreiche Subklonierung wurde durch Restriktionsverdau mit EcoRI
und Sequenzierung bestätigt.
-
cim1::GUS::pinII
wurde unter Verwendung der GUS::pinII-Kassette konstruiert. Die
Kassette wurde mit NcoI verdaut, mit Klenow gefüllt und erneut mit BamHI verdaut.
Der Cim1-Promotor,
der im TOPOTA-Klonierungsvektor enthalten war, wurde durch Verdau
mit BssHII isoliert, mit Klenow gefüllt und anschließend zweifach
mit BamHI/PvuI verdaut. Das Fragment wurde in den Vektor ligiert
und es erfolgte eine Bestätigung
durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung.
-
mi1ps::GUS::pinII
wurde unter Verwendung der GUS::pinII-Kassette, verdaut mit NcoI,
hergestellt, mit Klenow gefüllt
und mit XbaI erneut verdaut. Der mi1ps-Promotor in TOPOTA wurde
mit BsmI verdaut, aufgefüllt und
dann mit XbaI geschnitten. Das Fragment wurde dann in den Vektor
ligiert und es erfolgte eine Bestätigung durch Restriktionsanalyse
und Sequenzierung.
-
Das
cim1::GUS::pinII-Agrobacterium-Transformationsplasmid wurde konstruiert,
indem die GUS-Expressionskassette als ein HindIII/NotI-Fragment
und die BAR-Expressionskassette als ein NotI/SacI-Fragment zwischen
die rechte und linke T-DNA-Grenze in pSB11 an HindIII- und SacI-Stellen
insertiert wurde. Die GUS-Kassette wurde neben der rechten T-DNA-Grenze
insertiert. Das Plasmid pSB11 wurde von Japan Tobacco Inc. (Tokio,
Japan) erhalten. Die Konstruktion von pSB11 aus pSB21 und die Konstruktion
von pSB21 aus Ausgangsvektoren ist von Komari et al. (1996, Plant
J. 10:165–174)
beschrieben. Die T-DNA des Plasmids wurde durch homologe Rekombination
zwischen beiden Plasmiden in das superbinäre Plasmid pSB1 integriert.
Das Plasmid pSB1 wurde auch von Japan Tobacco Inc. erhalten. E.
coli-Stamm HB101, der die Expressionskassetten enthielt, wurde mit
dem Agrobacterium-Stamm LBA4404, der pSB1 beherbergt, gepaart, um das
Cointegrationsplasmid in Agrobacterium zu bilden, wobei die Methode
von Ditta et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347–7351, 1980)
verwendet wurde. Die erfolgreiche Rekombination wurde durch einen
SalI-Restriktionsverdau des Plasmids verifiziert.
-
Beispiel 3: Transformation
und Regeneration von Maiscallus über
Agrobacterium Herstellung von Agrobacteriumsuspension:
-
Agrobacterium
wurde aus einem bei –80° gefrorenen
Aliquot auf einer Platte ausgestrichen, die PHI-L-Medium enthielt,
und bei 28°C
im Dunkeln für
3 Tage kultiviert. PHI-L-Medium
umfasst 25 ml/l Stammlösung
A, 25 ml/l Stammlösung
B, 450,9 ml/l Stammlösung
C und Spectinomycin (Sigma Chemicals), das zu einer Konzentration
von 50 mg/l in sterilem ddH2O zugesetzt war (Stammlösung A:
K2HPO4 60,0 g/l, NaH2PO4 20,0 g/l, eingestellt auf pH 7,0 w/KOH
und autoklaviert; Stammlösung
B: NH4Cl 20,0 g/l, MgSO4·7 H2O
6,0 g/l, KCl 3,0 g/l, CaCl2 0,20 g/l, FeSO4·7H2O 50,0 mg/l, autoklaviert;
Stammlösung
C: Glucose 5,56 g/l, Agar 16,167 g/l (#A-7049, Sigma Chemicals,
St. Louis, MO) und autoklaviert).
-
Die
Platte kann bei 4°C
gelagert werden und üblicherweise
für etwa
1 Monat verwendet werden. Aus der Masterplatte wurde eine Einzelkolonie
herausgenommen und auf einer Platte ausgestrichen, die PHI-M-Medium
enthielt [Hefeextrakt (Difco) 5,0 g/l; Pepton (Difco) 10,0 g/l;
NaCl 5,0 g/l; Agar (Difco) 15,0 g/l; pH 6,8, enthaltend 50 mg/l
Spectinomycin] und bei 28°C
im Dunkeln für
2 Tage inkubiert.
-
Fünf ml entweder
PHI-A [CHU(N6)-Basalsalze (Sigma C-1416) 4,0 g/l, Eriksson's-Vitamin-Mischung (1000X, Sigma 1511)
1,0 ml/l; Thiamin·HCl
0,5 mg/l (Sigma); 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D,
Sigma) 1,5 mg/l; L-Prolin (Sigma) 0,69 g/l; Saccharose (Mallinckrodt)
68,5 g/l; Glucose (Mallinckrodt) 36,0 g/l; pH 5,2] für das PHI-Basismediumsystem
oder PHI-I [MS-Salze (GIBCO BRL) 4,3 g/l; Nicotinsäure (Sigma)
0,5 mg/l; Pyridoxin·HCl
(Sigma) 0,5 mg/l; Thiamin·HCl
1,0 mg/l; Myoinositol (Sigma) 0,10 g/l; Vitaminassay-Casaminosäuren (Difco
Lab) 1,0 g/l; 2,4-D 1,5 mg/l; Saccharose 68,50 g/l; Glucose 36,0
g/l; pH eingestellt auf 5,2, w/KOH und Filter-sterilisiert] für das PHI-System
mit kombiniertem Medium und 5 ml 100 mM (3'-5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenon,
Aldrich Chemicals) wurden in ein 14 ml-Falcon-Rohr unter einer Haube
gegeben. Etwa 3 volle Ösen
(5 mm Ösengröße) Agrobacterium
wurden von der Platte gesammelt und in Röhrchen suspendiert, dann wurde
das Röhrchen
in einem Vortex-Gerät
behandelt, um eine einheitliche Suspension herzustellen. Ein ml
der Suspension wurde in ein Spektralphotometerröhrchen übertragen und die OD der Suspension
entweder durch Zugabe von mehr Agrobacterium oder mehr desselben
Suspensionsmediums bei 550 nm auf 0,72 eingestellt, um eine Agrobacterium-Konzentration
von etwa 0,5 × 109
kbE/ml bis 1 × 109
kbE/ml zu erhalten. Die End-Agrobacterium-Suspension wurde in 2
ml-Mikrozentrifugenröhrchen
als Aliquots verteilt, von denen jedes 1 ml der Suspension enthielt.
Die Suspensionen wurden dann möglichst
schnell verwendet.
-
Embryo-Isolierung, Infektion
und Co-Kultivierung:
-
Etwa
2 ml desselben Mediums (hier PHI-A oder PHI-I), das für die Agrobacterium-Suspension verwendet
wurde, wurden in ein 2 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Unreife Embryos
wurden aus einer sterilisierten Ähre
mit einem sterilen Spatel (Baxter Scientific Products S1565) isoliert
und direkt in das Medium in Röhrchen gegeben.
Insgesamt wurden etwa 100 Embryos in das Röhrchen gegeben. Die optimale
Größe der Embryos war
etwa 1,0–1,2
mm. Die Kappe wurde dann auf dem Röhrchen verschlossen und das
Röhrchen
wurde mit einem Vortex-Mischer
(Baxter Scientific Products 58223-1) für 5 s bei maximaler Geschwindigkeit
verwirbelt. Das Medium wurde entfernt und es wurden 2 ml frisches
Medium zugesetzt und das Verwirbeln wurde wiederholt. Das gesamte
Medium wurde abgezogen und 1 ml Agrobacterium-Suspension wurde den
Embryos zugesetzt und das Röhrchen
wurde für
30 s einer Vortex-Behandlung unterzogen. Das Röhrchen wurde für 5 min unter
der Abdeckung stehengelassen. Die Suspension von Agrobacterium und
Embryos wurde in eine Petri-Schale gegossen, die entweder PHI-B-Medium
[CHU(N6)-Basalsalze (Sigma C-1416) 4,0 g/l; Eriksson's-Vitamin-Mischung
(1000X, Sigma-1511)
1,0 ml/l; Thiamin·HCl
0,5 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-Prolin 0,69 g/l; Silbernitrat 0,85 mg/l; Gelrite
(Sigma) 3,0 g/l; Saccharose 30,0 g/l; Acetosyringon 100 mM; pH 5,8]
für das
PHI-Basismediumsystem
oder PHI-J-Medium [MS-Salze 4,3 g/l; Nicotinsäure 0,50 mg/l; Pyridoxin·HCl 0,50
mg/l; Thiamin·HCl
1,0 mg/l; Myoinositol 100,0 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; Saccharose 20,0
g/l; Glucose 10,0 g/l; L-Prolin 0,70 g/l; MES (Sigma) 0,50 g/l;
8,0 g/l Agar (Sigma A-7049, gereinigt) und 100 mM Acetosyringon
mit einem End-pH von 5,8 für
das PHI-System mit kombiniertem Medium. Embryos, die im Röhrchen geblieben
waren, wurden unter Verwendung eines sterilen Spatels auf die Platte übertragen.
Die Agrobacterium-Suspension wurde abgezogen und die Embryos wurden
mit der Achse nach unten auf das Medium gelegt. Die Platte wurde
mit Parafilm-Band oder Pylon Vegetative Combine Tape (Produkt mit
dem Namen „E.G.CUT", das in Größen von
18 mm × 50
m erhältlich
ist; Kyowa Ltd., Japan) dicht versiegelt und im Dunkeln für etwa 3
Tage Co-Kultivierung bei 23–25°C inkubiert.
-
Ruhe-, Selektions- und
Regenerierungsschritte:
-
Für den Ruheschritt
wurden alle Embryos auf eine neue Platte transferiert, die PHI-C-Medium [CHU(N6)-Basalsalze
(Sigma C-1416) 4,0 g/l; Eriksson's
Vitamin-Mischung (1000X Sigma-1511) 1,0 ml/l; Thiamin·HCl 0,5
mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-Prolin 0,69 g/l; Saccharose 30,0 g/l; MES-Puffer
(Sigma) 0,5 g/l; Agar (Sigma A-7049, gereinigt) 8,0 g/l; Silbernitrat
0,85 mg/l; Carbenicillin 100 mg/l; pH 5,8] enthielt. Die Platte
wurde mit Parafilm oder Pylon-Band versiegelt und im Dunkeln bei
28°C für 3–5 Tage
inkubiert.
-
Längere Co-Kultivierungsperioden
können
das Fehlen eines Ruheschritts kompensieren, da der Ruheschritt wie
der Co-Kultivierungsschritt einen Zeitraum für den Embryo zur Kultivierung
in Abwesenheit eines selektiven Mittels bereitstellt. Der Fachmann
auf diesem Gebiet kann leicht Kombinationen aus Co-Kultivierung und
Ruhezeiten testen, um die Transformation zu optimieren oder zu verbessern.
-
Zur
Selektion wurden alle Embryos aus dem PHI-C-Medium auf neue Platten
transferiert, die PHI-D-Medium als Selektionsmedium enthielten [CHU(N6)-Basalsalze
(SIGMA C-1416) 4,0
g/l; Eriksson's
Vitamin-Mischung (1000X, Sigma-1511) 1,0 ml/l; Thiamin·HCl 0,5
mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-Prolin 0,69 g/l; Saccharose 30,0 g/l; MES-Puffer
0,5 g/l; Agar (Sigma A-7049, gereinigt) 8,0 g/l; Silbernitrat 0,85
mg/l; Carbenicillin (ICN, Costa Mesa, CA) 100 mg/l; Bialaphos (Meiji
Seika K. K, Tokio, Japan) und zwar 1,5 mg/l für die ersten zwei Wochen, danach
3 mg/l für
die restliche Zeit; pH 5,8], wobei etwa 20 Embryos auf jede Platte
gelegt wurden. Die Platten wurden wie oben beschrieben versiegelt
und im Dunkeln bei 28°C
für die
ersten zwei Selektionswochen inkubiert. Die Embryos wurden in Zwei-Wochen-Intervallen
auf frisches Selektionsmedium transferiert. Das Gewebe wurde subkultiviert,
indem es für
insgesamt etwa 2 Monate auf frisches Selektionsmedium übertragen
wurde. Die Herbizid-resistenten Calli wurden dann „in der
Masse vermehrt" (bulked-up),
indem sie für
weitere zwei Wochen auf demselben Medium wachsen gelassen wurden,
bis der Durchmesser der Calli etwa 1,5–2 cm war.
-
Zur
Regeneration wurden die Calli dann auf PHI-E-Medium [MS-Salze 4,3
g/l; Myoinositol 0,1 g/l; Nicotinsäure 0,5 mg/l; Thiamin·HCl 0,1
mg/l, Pyridoxin·HCl
0,5 mg/l, Glycin 2,0 mg/l, Zeatin 0,5 mg/l, Saccharose 60,0 g/l,
Agar (Sigma, A-7049) 8,0 g/l, Indolessigsäure (IAA, Sigma) 1,0 mg/l,
Abscisinsäure
(ABA, Sigma) 0,1 mM, Bialaphos 3 mg/l, Carbenicillin 100 mg/l, eingestellt
auf pH 5,6] im Dunkeln bei 28°C
für 1–3 Wochen
kultiviert, um somatische Embryos reifen zu lassen. Die Calli wurden
dann auf PHI-F-Medium (MS-Salze 4,3 g/l; Myoinositol 0,1 g/l; Thiamin·HCl 0,1
mg/l, Pyridoxin·HCl
0,5 mg/l, Glycin 2,0 mg/l, Nicotinsäure 0,5 mg/l; Saccharose 40,0
g/l; Gelrite 1,5 g/l; pH 5,6] bei 25°C mit einem Lichtprogramm von
16 h Licht (270 uE m-2s-1) und 8 h Dunkelheit kultiviert, bis sich
Keimlinge und Wurzeln entwickelt hatten. Jedes kleine Pflänzchen wurde dann
in ein 25 × 150
mm-Röhrchen,
das PHI-F-Medium enthielt, transferiert und unter denselben Bedingungen für etwa eine
weitere Woche wachsen gelassen. Die Pflänzchen wurden in Töpfe mit
Erdgemisch in einem Gewächshaus
umgetopft. GUS+-Ereignisse wurden im Callus-Stadium oder im Stadium
der regenerierten Pflanze bestimmt.
-
Für Hi-II
war ein optimiertes Protokoll 0,5 × 109 kbE/ml Agrobacterium,
ein 3–5
Tage-Ruheschritt
und kein AgNO3 im Infektionsmedium (PHI-A-Medium).
-
Beispiel 4: In situ-Lokalisierung
von Cim1-mRNA in 5 DAP-Maiskörnern.
-
Eine
in situ-Hybridisierung wurde unter Verwendung des Protokolls von
Jackson, D. P. (1991) In situ Hybridization in Plants, Molecular
Plant Pathology: A Practical Approach, D. J. Bowles, S. J. Gurr
und M. McPherson, Herausg. Oxford University Press, England, S.
63–74
durchgeführt.
Es wurde sowohl eine Sense- als auch eine Antisense-Sonde, die einem
Protein der Cim1-cDNA entspricht, verwendet. Sonden wurden nicht-isotypisch
mit Digoxigenin markiert und mit verschiedenen Abschnitten von 5
DAP (Tage nach Bestäubung)-Maiskörnern, die
fixiert und eingebettet worden waren, inkubiert. Nach extensivem
Waschen zur Entfernung nicht-gebundener Sonde wurden Schnitte mit
Anti-Digoxigenin-alkalischer Phosphatase inkubiert, um Bereiche
der Sondenhybridisierung zu detektieren. Für Cim1 wurde mRNA spezifisch
mit der Antisense-Sonde detektiert und auf Nucellus-Gewebe beschränkt. Die
Sense-Kontrollsonde hybridisierte nicht.
-
Beispiel 5: Northern Analyse
der Genexpression in vegetativem Gewebe und sich entwickelnden Körnern
-
Gesamt-RNA
(10 g) wurde der Größe nach
an einem 1% Formaldehyd-Agarosegel fraktioniert und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.
Membranen wurden unter stringenten Bedingungen mit 32P-markierten
Sonden hybridisiert, welche cDNA-Fragmente der verschiedenen Gene
darstellen. Nach extensivem Waschen zur Entfernung nicht-gebundener
Sonde wurden Membranen auf einem Röntgenfilm belichtet. RNA-Proben
wurden aus vegetativen Geweben, wie auch aus sich entwickelnden
Maiskörnern
erhalten.
-
Das
Cim1-Expressionsmuster zeigt keine Expression in vegetativen Geweben
oder in isoliertem Embryo oder Endosperm von sich entwickelnden
Körnern.
Cim1 wurde vornehmlich im frühen
(5 DAP) ganzen Korn exprimiert. Das Gen für mi1ps wurde vornehmlich im
Embryo von sich entwickelnden Körnern
(13–40 DAP)
exprimiert, während
cZ19B1 im Endosperm der mittleren oder späteren Körnerentwicklung (13–40) exprimiert
wurde. Weder milps noch cZ19B1 wurden in vegetativen Geweben exprimiert.
-
-
-
-