CN111465321B - 用于植物细胞的细胞重编程的系统和方法 - Google Patents

Abstract

通过将植物细胞用细胞重编程因子处理来改变细胞命运和发育。胚发生诱导形态发育基因用作细胞重编程因子，特别地包含编码基因产物的多肽或多核苷酸，所述基因产物用于从配子产生双单倍体或单倍体植物。通过使分离的细胞与纯化的外源重组胚发生诱导形态发育基因多肽接触来处理玉米小孢子，导致胚发生。当用包括调节元件和结构基因的基因构建体转化时，玉米植物的配子发育为胚状体，其中所述调节元件和结构基因能够以级联方式发挥作用以改变植物细胞的细胞命运。从基因构建体表达的发育形态蛋白用于非原位处理方法和原位细胞重编程。

Description

用于植物细胞的细胞重编程的系统和方法

技术领域

本公开涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及开发重组近交系。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月13日提交的美国临时申请号62/572,007的优先权，所述临时申请通过引用以其全文特此结合。

以电子方式递交的序列表的引用

序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20181001_7488WOPCT_SequenceListingTXT-569832，创建于2018年10月1日且具有98,592字节大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

背景技术

植物育种计划通过筛选许多植物以鉴定具有所需特征的个体来鉴定新品种。典型地，理想地跨多年和多种环境培养和评估来自杂交的大量后代，以选择具有最需要的特征的植物。

典型的育种方法使两种亲本植物杂交，并且子代1杂交体(F₁杂交体)是第一子代后代。当来自不同杂合组的两种亲本株(典型地近交株)杂交时，观察到商业F₁杂交体中的杂交体活力。杂交体活力(组合了其亲本的遗传贡献后产生的任何生物品质的改善的或增加的功能)对于商业玉米种子生产是重要的，并且商业杂交性能的改善需要持续开发新的近交亲本系。

玉米近交系开发方法使用母本(产生雌性特征的)双单倍体生产，其中从第一代杂交产生的植物穗(已经用来自所谓的“单倍体诱导”系的花粉受精)受精后，选择母本单倍体胚。与继承母本和父本基因组二者的拷贝相反，用单倍体诱导株的花粉对雌花进行授粉导致仅含有单倍体母本基因组的胚珠水平升高，因此产生母本单倍体胚。雌花内的胚珠是减数分裂的产物，并且每个母本胚珠都是独特的减数分裂重组单倍体基因组，从而允许使用包括染色体加倍处理在内的体外组织培养方法分离和处理未成熟的母本单倍体胚，以使得快速产生母本双单倍体重组群体成为可能。用来自玉米单倍体诱导系的花粉对目标植物的受精产生的许多玉米母本单倍体胚无法再生为可育的、双单倍体植物，并且如果有的话，也很少有体外组织培养和小植株再生方法会从一个单倍体胚繁殖出多个可育植物。因此，需要改善生产适用于玉米中母本配子双单倍体的双单倍体植物的方法。

大多数玉米近交株对小孢子分离、体外组织培养和小植株再生方法产生父本(产雄性特征的)配子双单倍体具有顽固性。因此，需要一种产生适用于玉米中的父本配子双单倍体的双单倍体植物的方法。

因此，植物育种者将受益于开发重组近交系群体的方法，所述重组近交系不需要大量授粉控制方法或不需要延长将自体受精系繁殖为等基因态所需的时间。

发明内容

在一方面，提供了一种生成单倍体植物胚的方法，所述方法包括(a)通过为植物小孢子提供胚发生调节因子以调节植物小孢子中的小孢子胚发生来获得胚发生的小孢子，所述胚发生调节因子选自由以下组成的组：(i)胚发生诱导多肽；或(ii)胚发生诱导化合物；或(iii)(i)和(ii)的组合；以及(b)从胚发生的小孢子产生单倍体植物胚。在一方面，所述胚发生诱导多肽不是由小孢子中稳定整合的重组DNA构建体产生的。在一方面，所述胚发生诱导化合物是选自以下的激酶抑制剂：N-[(2R)-2，3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘代苯胺基)苯甲酰胺、蒽(1，9-cd)吡唑-6(2H)-酮：4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑或N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)-1，3-噻唑-4-甲酰胺。在一方面，所述胚发生诱导化合物是氯化血红素(hemin)。在一方面，所述胚发生诱导多肽选自由以下组成的组：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，所述胚发生诱导多肽还包含细胞穿透肽(CPP)。在一方面，所述胚发生调节因子存在于组织培养基中。在一方面，所述方法包括将所述小孢子与胚发生诱导悬浮饲养细胞培养物(embryogenesis inducing suspension feeder cell culture)共培养，其中所述胚发生诱导悬浮饲养细胞培养物表达胚发生诱导多肽，或在所述培养基中将所述小孢子与所述胚发生调节因子共培养。在一方面，所述胚发生诱导多肽选自由以下组成的组：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，所述方法还包括培养单倍体植物胚。在一方面，所述方法包括使所述单倍体植物胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体植物胚的时间段。在一方面，所述方法其中所述小孢子获自玉米、水稻、高粱、芸苔属(brassica)、大豆、小麦和棉花。在一方面，所述方法其中所述胚发生调节因子包含细胞穿透肽。

在一方面，提供了生成单倍体植物胚的方法，所述方法包括(a)提供包含表达盒的植物，其中所述表达盒包含绒毡层细胞偏好性调节元件，所述绒毡层细胞偏好性调节元件可操作地连接到编码胚发生诱导多肽的多核苷酸；(b)使(a)的植物与野生型近交植物杂交以提供F₁杂交体；(c)从(b)的F₁杂交体回收胚发生的小孢子；以及(d)从胚发生的小孢子产生单倍体植物胚。在一方面，所述胚发生诱导多肽是形态发育多肽。在一方面，所述形态发育多肽选自由以下组成的组：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，所述方法还包括通过位点特异性核酸酶修饰基因组DNA。在一方面，所述表达盒还包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸。在一方面，所述位点特异性核酸酶选自由锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALEN和CRISPR-Cas内切核酸酶组成的组。在一方面，所述CRISPR-Cas核酸酶是Cas9或Cpfl核酸酶。在一方面，在小孢子胚发生期间，通过Cas内切核酸酶进行基因组DNA的修饰。在一方面，DNA的所述修饰是插入、缺失或取代突变。在一方面，从表达盒中表达所述Cas内切核酸酶，所述Cas内切核酸酶还包含细胞穿透肽。在一方面，所述方法还包括提供从所述表达盒表达的指导RNA。在一方面，通过向所述胚发生的小孢子外源地提供指导RNA和Cas内切核酸酶作为核糖核蛋白复合物进行DNA的所述修饰。在一方面，所述植物对于所述表达盒是纯合的。在一方面，所述表达盒还包含信号肽。在一方面，所述表达盒还包含细胞穿透肽(CPP)。在一方面，所述方法还包括使所述单倍体植物胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体植物胚的时间段。在一方面，所述植物是玉米、水稻、高粱、芸苔属、大豆、小麦或棉花。在一方面，所述方法还包括从所述双单倍体植物胚再生成双单倍体植物。

在一方面，提供了生成双单倍体植物的方法，所述方法包括(a)提供包含表达盒的植物，其中所述表达盒包含胚乳细胞偏好性调节元件，所述胚乳细胞偏好性调节元件可操作地连接到编码胚发生诱导多肽的多核苷酸；(b)使(a)的植物与野生型F₁杂交体杂交；(c)从(b)的杂交回收单倍体胚；(d)使单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体胚的时间段；以及(e)从(d)的双单倍体胚再生成双单倍体植物。在一方面，所述胚发生诱导多肽是形态发育多肽。在一方面，所述形态发育多肽选自由以下组成的组：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，所述表达盒还包含编码基因编辑核酸酶的多核苷酸。在一方面，所述方法还包括通过位点特异性核酸酶修饰基因组DNA。在一方面，所述表达盒还包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸。在一方面，所述位点特异性核酸酶选自由锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALEN和CRISPR-Cas内切核酸酶组成的组。在一方面，所述CRISPR-Cas核酸酶是Cas9或Cpfl核酸酶。在一方面，在单倍体胚胚发生期间，通过Cas内切核酸酶进行基因组DNA的修饰。在一方面，DNA的所述修饰是插入、缺失或取代突变。在一方面，从表达盒中表达所述Cas内切核酸酶，所述Cas内切核酸酶还包含细胞穿透肽。在一方面，所述方法还包括提供从所述表达盒表达的指导RNA。在一方面，通过向所述胚发生的单倍体胚外源地提供指导RNA和Cas内切核酸酶作为核糖核蛋白复合物进行DNA的所述修饰。在一方面，所述植物对于所述表达盒是纯合的。在一方面，所述表达盒还包含信号肽。在一方面，所述表达盒还包含细胞穿透肽(CPP)。在一方面，所述表达盒还包含编码可操作地连接到调节元件的颜色标记物或荧光标记物的多核苷酸。在一方面，回收所述单倍体胚包括针对所述颜色标记物、所述荧光标记物或所述调节元件的存在或不存在进行筛选。在一方面，所述筛选在用于自动荧光检测的细胞活力和细胞分选微流控设备中发生，以鉴定、分选和选择包含所述表达盒的单倍体胚与不包含所述表达盒的单倍体胚。

在一方面，提供了一种胚发生的小孢子，所述胚发生的小孢子与对照小孢子相比包含增加量的胚发生诱导多肽，其中在所述小孢子中不产生所述多肽。在一方面，提供了一种从胚发生的小孢子产生的胚状体或胚发生的组织。在一方面，提供了一种胚发生的小孢子，所述胚发生的小孢子包含异源细胞重编程剂，其中在所述小孢子中不产生所述异源细胞重编程剂。在一方面，所述细胞重编程剂选自由以下组成的组：(i)胚发生诱导多肽；或(ii)胚发生诱导化合物；或(iii)(i)和(ii)的组合。在一方面，所述胚发生诱导多肽选自由以下组成的组：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，所述胚发生诱导化合物是氯化血红素或激酶抑制剂或其组合。在一方面，所述胚发生的小孢子能够产生单倍体胚。在一方面，所述胚发生的小孢子是玉米胚发生的小孢子。在一方面，所述胚发生的小孢子来自水稻、高粱、芸苔属、大豆、小麦或棉花。在一方面，提供了一种包含表达盒的植物细胞，其中所述表达盒包含绒毡层细胞偏好性调节元件，所述绒毡层细胞偏好性调节元件可操作地连接到编码胚发生诱导多肽的多核苷酸，并且其中所述胚发生诱导多肽能够被分泌或转运到小孢子中。在一方面，所述胚发生诱导多肽包含细胞穿透肽。在一方面，所述胚发生诱导多肽是选自由以下组成的组的形态发育多肽：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，提供了一种包含表达盒的植物细胞，其中所述表达盒包含胚乳细胞偏好性调节元件，所述胚乳细胞偏好性调节元件可操作地连接到编码胚发生诱导多肽的多核苷酸，并且其中所述胚发生诱导多肽在胚乳细胞、胚周区(ESR)、基底胚乳转移层(BETL)或其组合中产生，并且能够被分泌或转运到胚细胞中。在一方面，提供了一种包含所述植物细胞和所述胚细胞的植物细胞群体，其中所述胚细胞包含分泌或转运的胚发生诱导多肽。在一方面，所述胚发生诱导多肽是选自由以下组成的组的形态发育多肽：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。

附图说明

图1A示出在9％蔗糖诱导培养基(对照)中分离后，培养21天的ATCC40520细胞的原胚发育的立体显微镜显微图像。

图1B示出在补充有氯化血红素(1uM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养21天的ATCC40520细胞的原胚发育的立体显微镜显微图像。

图1C示出在补充有1μM氯化血红素的9％蔗糖诱导培养基中进行体外组织培养8天后，在ATCC40520细胞的99％置信水平(p＜0.01)下，四(4)个胚发生生物标记物基因(1-GRMZM2G145440；2-GRMZM2G057852；3-GRMZM2G162184；和4-GRMZM2G037368)和四(4)个花粉成熟生物标记物基因(5-GRMZM2G177391；6-GRMZM2G176595；7-GRMZM2G469689；和8-GRMZM2G126196)的胚样结构表达响应(相对mRNA水平)的条形图。

图1D示出在9％蔗糖诱导培养基(对照)中分离后，培养21天的衍生自近交EH小孢子的细胞的原胚发育的立体显微镜显微图像。

图1E示出在补充有氯化血红素(1uM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养21天的衍生自近交EH小孢子的细胞的原胚发育的立体显微镜显微图像。

图1F示出小孢子发育响应的条形图，代表在9％蔗糖诱导培养基(对照)和在补充有氯化血红素(1μM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养21天的衍生自近交EH小孢子的多细胞结构(MCS)和胚样结构(ELS)的响应性百分比。

图2A示出在无PD0325901(N-[(2R)-2，3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘代苯胺基)苯甲酰胺)(阴性对照)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2B示出在补充有PD0325901(0.19mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2C示出在补充有PD0325901(0.39mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2D示出在补充有PD0325901(1.5mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2E示出在无SP600125(蒽(1，9-cd)吡唑-6(2H)-酮)(阴性对照)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2F示出在补充有SP600125(0.19mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2G示出在补充有SP600125(6.25mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2H示出在补充有SP600125(50mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2I示出在无SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)(阴性对照)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2J示出在补充有SB203580(0.78mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2K示出在补充有SB203580(3.22mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2L示出在补充有SB203580(50mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2M示出在无噻唑维(thiazovivin)(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)-1，3-噻唑-4-甲酰胺)(阴性对照)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2N示出在补充有噻唑维(0.39mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2O示出在补充有噻唑维(12.5mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图2P示出在补充有噻唑维(50mM终浓度)的9％蔗糖诱导培养基中分离后，培养7天的ATCC40520细胞的立体显微镜显微图像。

图3A示出使用具有

Plus2预染标准品(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)目录号LC5925)(泳道1)以及纯化的重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白质样品重复1(泳道2)和重复2(泳道3)的12％Bis-tris凝胶的考马斯蓝染色。

图3B示出使用一级抗His单克隆抗体和二级抗鼠-HRP抗体(1∶5,000)与重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白重复1(泳道1)、重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白重复2(泳道2)和

Plus2预染标准品(泳道3)，描述于图3A的纯化的重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白的蛋白质印迹分析。

图3C示出无重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白处理的情况下野生型小孢子胚发生。

图3D示出在用纯化的重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白处理的野生型小孢子中诱导细胞重编程以活化小孢子发生的生物活性。观察到小孢子衍生的具有发育的胚根和根毛的胚。

图4A示出在黑暗条件下在4％蔗糖诱导培养基中培养32天后，无纯化的重组WUSCHEL蛋白并且无转染试剂处理的情况下小孢子胚发生发育的立体显微镜显微图像。

图4B示出在黑暗条件下在4％蔗糖诱导培养基中培养32天后，在具有纯化的重组WUSCHEL蛋白并且无转染试剂处理的情况下小孢子胚发生发育的立体显微镜显微图像。

图4C示出在黑暗条件下在4％蔗糖诱导培养基中培养32天后，无纯化的重组WUSCHEL蛋白并且具有转染试剂处理的情况下小孢子胚发生发育的立体显微镜显微图像。

图4D示出在黑暗条件下在4％蔗糖诱导培养基中培养32天后，在具有纯化的重组WUSCHEL蛋白并且具有转染试剂处理的情况下小孢子胚发生发育的立体显微镜显微图像。

图5A是用于产生表达WUSCHEL-GFP融合蛋白的稳定玉米小孢子活化株的构建体的示意图。

图5B是用于产生表达WUSCHEL蛋白的稳定玉米小孢子活化株的构建体的示意图。

图5C是用于产生表达WUSCHEL-糖皮质激素受体(GR)融合蛋白的稳定玉米小孢子活化株的构建体的示意图。

图6A是描绘示意性产生T₀小孢子活化株的转化方法的示意图。

图6B示出使用定制的多克隆抗WUSCHEL抗体(蛋白质标准品(泳道1)、纯化的重组WUS-GFP融合蛋白的泳道(泳道2、3和4)、其他池(池1，泳道7和8；池2，泳道9和10；池3，泳道12和13；池4，泳道15和16；以及池5，泳道18和19，叶样品示于泳道11、14、17和20)从花药(A)和叶(L)中分离的蛋白质样品的蛋白质印迹。

图6C示出使用抗GFP抗体(蛋白质标准品(泳道1)、纯化的重组WUS-GFP融合蛋白的泳道(泳道2、3和4)、其他池(池1，泳道7和8；池2，泳道9和10；池3，泳道12和13；池4，泳道15和16；以及池5，泳道18和19，叶样品示于泳道11、14、17和20)从花药(A)和叶(L)中分离的蛋白质样品的蛋白质印迹。

图7是描绘用于从半合Ms44-WUS小孢子活化杂交体杂交中选择野生型小孢子衍生的胚的方法的示意图。

图8A示出代表响应于体内WUS-GFP活性的来自半合Ms44-WUS活化杂交体杂交的体外小孢子培养物的胚发生响应性水平增加的条形图。

图8B示出产生小孢子衍生的单倍体植物的胚再生之前和之后，小孢子衍生的胚样结构的图像。

图8C示出描绘了每个玉米染色体1至10(Chr；x轴)与相对于遗传图谱位置(cM(厘摩)；y轴)放置的遗传的等位基因模式(亲本1-黑色区域；亲本2-灰色区域；非信息、单态-浅灰色区域)的减数分裂重组断点的核型模式图。

图9是描绘使用不成熟的F₁胚外植体，从半合Ms44-WUS小孢子活化T₀转基因杂交体中选择野生型小孢子衍生的胚用于转化的方法的示意图。

图10是示出具有三个表达盒的构建体的示意图，所述表达盒可用于产生稳定的玉米胚乳活化株。

图11是描绘使用半合胚乳活化系，选择由诱导杂交产生的由野生型F_1：2衍生的母本单倍体以改善母本双单倍体产生的方法的示意图。

图12A是使用半合单倍体诱导系由单倍体诱导杂交产生的胚F_1：2的条形图。分别确定每个单倍体和二倍体胚的CFP-和CFP+胚乳(分别为野生型发育基因和形态学发育基因，“DevGene”)的平均单倍体胚大小(毫米(mm)；y轴)。

图12B是示出使用具有变化的拷贝数的胚乳活化性状的转基因系(x轴)，每个单倍体诱导杂交的发芽的单倍体胚(y轴)的百分比的条形图。

图13是用于产生具有基因编辑活性的稳定玉米胚乳活化株的构建体的示意图。

图14是描绘使用半合胚乳活化系合并从胚乳到母本单倍体胚的CAS9递送，选择由诱导杂交产生的由野生型F_1：2衍生的母本单倍体以改善基因编辑后代的母本双单倍体产生的方法的示意图。

具体实施方式

将在下文中参考附图更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的方面。实际上，公开内容能以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的方面；而是提供这些方面，使得本公开能满足适用的法律要求。

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也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定方面而不旨在进行限制。如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”可以包括“由......组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求中，将参考本文中所定义的若干术语。

如本文所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“所述”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。

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铁原卟啉IX的氧化形式，氯化血红素，是哺乳动物细胞中基因表达的重要调节剂，并且通过充当构成蛋白质(包括呼吸细胞色素、气体传感器、P450酶(CYP)、过氧化氢酶、过氧化物酶、一氧化氮合酶(NOS)、鸟苷酸环化酶、以及甚至转录因子)一部分或与之组合的非蛋白质修复基团来促进造血祖细胞的生长(Tsiftsoglou等人，(2006)Pharmacol Ther.[药理治疗学]111：327-45)。此外，据报道，在哺乳动物细胞中，血红素(heme)在细胞呼吸和代谢中起着信号传导配体的作用，这表明氯化血红素(hemin)不仅是基因表达的关键调节剂，它可能单独是有用的辅因子，也可以与其他治疗组合以改善应激响应、适应性过程、以及甚至基因的转录，以防止细胞损伤。

特别是对于植物细胞和玉米小孢子，改善朝向胚发生的细胞重编程发育命运的方法包括需要改善由细胞分开和分离技术引起的应激适应过程。需要抑制小孢子内的原生质体发育成淀粉质体的方法、或使淀粉质体去分化为原生质体或促进在玉米小孢子内的自噬的方法。

基于在培养细胞中的实验，氯化血红素阻断了核基因的表达。在质体分化为淀粉质体期间，通过质体信号调节了核基因表达的调节系统。使用血红素阻断了来自质体的逆行信号传导。

本公开提供了产生重组近交系的群体的高效且有效的方法，所述方法包括但不限于在植物细胞中启动胚发生以使得能够产生双单倍体重组群体的方法。本公开还提供了在配子或单倍体细胞发育期间，在非转化细胞中，并且特别是在配子或单倍体细胞中，实现细胞重编程和胚发生的生长刺激的方法。本公开提供了通过使细胞、组织或器官与能够重编程细胞、组织或器官(其中在细胞、组织或器官中诱导胚发生)的胚发生调节因子接触，在植物的细胞、组织或器官中促进小孢子胚发生的方法，所述胚发生调节因子如例如，胚发生诱导外源形态发育基因蛋白产物和/或胚发生诱导化合物。可用在本公开的方法中的胚发生诱导剂包括但不限于蛋白激酶抑制剂小分子，如N-[(2R)-2，3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘代苯胺基)苯甲酰胺、蒽(1，9-cd)吡唑-6(2H)-酮：4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑或N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)-1，3-噻唑-4-甲酰胺。氯化血红素也可用在本公开的方法中用于诱导胚发生。

在许多方面还提供了在配子或单倍体细胞发育期间，在非转化细胞中，并且特别是在配子或单倍体细胞中，通过以下方式产生小孢子衍生的双单倍体群体的方法：在植物组织或器官中异位表达胚发生诱导形态发育基因和易位信号的融合蛋白基因产物，从而实现细胞重编程和胚发生生长刺激。在另一方面，本公开提供了在配子或单倍体细胞发育期间，在非转化细胞中，并且特别是在配子或单倍体细胞中，通过以下方式在植物组织或器官中产生小孢子衍生的双单倍体群体的方法：使用与易位信号和荧光蛋白可操作连接的胚发生诱导形态发育基因并且基于存在或不存在胚发生诱导形态发育基因/易位信号/荧光蛋白融合物选择，从而实现细胞重编程和胚发生生长刺激。本公开在许多方面提供了通过使小孢子与纯化的蛋白质(如用或不用胚发生诱导化合物处理的形态发育胚发生诱导基因产物)共培养来重编程小孢子的方法。在另一方面，提供了通过在表达形态发育胚发生诱导基因产物的细胞的存在下共培养小孢子来重编程小孢子的方法。与胚发生诱导细胞重编程剂共培养(接触)的时间段将根据所处理的小孢子的顽固性而变化。例如，在一方面，小孢子胚发生是通过孢粉素涂层内多细胞结构(MCS)的存在和/或小孢子外壁的破裂和/或胚样结构(ELS)的存在所证明。在一方面，将小孢子与胚发生诱导细胞重编程剂共培养，直到观察到某些特征，如MCS和/或ELS。可替代地，在一方面，其他表型和/或基因型标记物也用于确定胚发生状态或细胞重编程状态。通常，在许多方面，少于1小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天或60天或更长的时间段的共同培养足以使培养的小孢子形成MCS和/或ELS。基于本公开提供的指导，基于胚发生诱导剂的类型和浓度来优化诱导胚发生的孵育或培养时间段。本公开还在许多方面提供了通过以下方式产生小孢子衍生的双单倍体群体的方法：在半合转基因条件下，使用上文所述方法来促进从由两个不同株的遗传杂交产生的子代植物(例如第一代F₁杂交体或可替代地在更靠后的子代中或回交后代中)的组织或器官的小孢子胚发生。

本公开还在许多方面提供了出于产生小孢子衍生的双单倍体群体的目的，促进从第一代F₁杂交体的组织或器官的小孢子胚发生的方法，所述第一代F₁杂交体是通过将F₁胚本身转化到直接在半合转基因条件下再生的所述F₁杂交体衍生而来。在另外的方面，使产生和/或处理的小孢子和/或小孢子衍生的细胞与染色体加倍剂接触，以促进小孢子衍生的胚状体的二倍体化。本公开的另外方面提供了从母本单倍体胚的细胞衍生的小植株的克隆繁殖的方法，所述母本单倍体胚是通过在植物组织或器官中异位表达具有或不具有易位信号的形态学发育基因产生的。在许多方面，还提供了从母本单倍体胚的细胞衍生的多个基因编辑小植株的克隆繁殖的方法，所述母本单倍体胚是通过在植物组织或器官中异位表达形态学发育基因产生的，所述形态学发育基因具有或不具有与核酸酶基因(具有或不具有易位信号)的基因产物融合的易位信号。

在许多方面，本公开还提供了在母本衍生的单倍体胚细胞中，使用转化的单倍体诱导系促进胚乳细胞中胚发生和基因编辑的方法，所述转化的单倍体诱导系表达具有或不具有易位信号的形态学发育基因和具有或不具有受精易位信号的核酸酶基因的胚发生诱导基因产物。在另外的方面，使处理的母本单倍体胚和/或胚衍生的细胞与染色体加倍剂接触，以促进母本衍生的体细胞胚的二倍体化和再生。

如本文所用，“重编程”(“reprogram”或“reprograming”或“reprogramed”)是使成熟的特化细胞回复或敏化为诱导多能干细胞或能够进一步发育为胚或胚样结构的胚/胚发生状态的细胞的过程。在被“重编程”的细胞群体中，预期并非所有细胞都被“重编程”至相同的程度或处于相同的胚状态。通常预期处于重编程的多种状态的细胞的混合或镶嵌性质。与尚未暴露于本文提供的方法和组合物的细胞相比，预期本文提供的方法和组合物可增加重编程的并且处于所需胚发生状态的细胞的比率或百分比。重编程还指生殖细胞发育的重建。当胚发生诱导多肽和/或小分子化合物与植物细胞接触使得植物细胞胚发生时，可发生重编程。在许多方面，本公开的方法使单倍体植物细胞与胚发生诱导剂(如例如，多肽和/或小分子化合物)接触，以重编程细胞命运并且使细胞变为胚发生的。可替代地，在许多方面，可以在植物细胞中引入和表达编码胚发生诱导多肽的多核苷酸，其中所述胚发生诱导多肽影响周围/邻近的细胞，从而使细胞变为胚发生的。可以在原位或非原位重编程细胞。形态(形态学)发育基因及其胚发生诱导多肽产物可用在所公开的方法中。如本文所用，术语“形态发育基因”或“形态学发育基因”意指涉及如下的基因：植物胚发生、细胞重编程、代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。当异位表达形态发育基因时，形态发育基因刺激形成可以产生植物的体细胞衍生结构。形态发育基因的异位表达刺激可以产生植物的体细胞胚或器官发生结构(如芽分生组织)的从头形成。这种刺激的从头形成发生在表达形态发育基因的细胞中或邻近的细胞中。形态发育基因可以是调节其他基因表达的转录因子，或影响植物组织中激素水平的基因，两者均可以刺激形态变化。可以将形态发育基因稳定地掺入到植物的基因组中，或所述形态发育基因可以瞬时表达。胚发生诱导形态发育基因包括但不限于WUS/WOX基因(WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5或WOX9)，参见美国专利7,268,271、7,309,813、7,348,468、7,256,322、7,994,391、8,383,891、8,581,037和9,029,641和美国专利申请公开20170121722、20110258741、20100100981、20040166563和20070271628，通过引用以其整体并入本文；Laux等人(1996)Development[发育学]122：87-96；和Mayer等人(1998)Cell[细胞]95：805-815；van der iGraaff等人，2009，Genome Biology[基因组生物学]10：248；Dolzblasz等人，2016，Mol.Plant[分子植物学]19：1028-39。WUS/WOX的调节预期调节植物和/或植物组织表型，包括植物胚发生、细胞重编程、代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。在这方面也感兴趣的将是MYB118基因(参见美国专利7,148,402)、MYB115基因(参见Wang等人(2008)CellResearch[细胞研究]224-235)、BABYBOOM基因(BBM；参见Boutilier等人(2002)Plant Cell[植物细胞]14：1737-1749)、OVULE DEVELOPMENT PROTEIN 2(ODP2)基因(参见US20110010795、US 20090328252和US 20050257289，通过引用以其整体并入本文，或CLAVATA基因(参见例如，美国专利7,179,963)。

适于本公开的其他胚发生诱导形态发育基因包括但不限于LEC1(Lotan等人，1998，Cell[细胞]93：1195-1205)、LEC2(Stone等人，2008，PNAS[美国科学院院报]105：3151-3156；Belide等人，2013，Plant Cell Tiss.Organ Cult[植物细胞组织器官培养]113：543-553和美国专利8,865,971，通过引用以其整体并入本文)、KN1/STM(Sinha等人，1993.Genes Dev[基因发育]7：787-795)、来自农杆菌属(Agrobacterium)的IPT基因(Ebinuma和Komamine，2001，In vitro Cell.Dev Biol-Plant[体外细胞与发育生物学-植物]37：103-113)、MONOPTEROS-DELTA(Ckurshumova等人，2014，New Phytol.[新植物学家]204：556-566)、农杆菌属AV-6b基因(Wabiko和Minemura 1996，Plant Physiol.[植物生理学]112：939-951)、农杆菌属IAA-h和IAA-m基因的组合(Endo等人，2002，Plant Cell Rep.[植物细胞报告]，20：923-928)、拟南芥属(Arabidopsis)SERK基因(Hecht等人，2001，PlantPhysiol.[植物生理学]127：803-816)、拟南芥属AGL15基因(Harding等人，2003，PlantPhysiol.[植物生理学]133：653-663)。

如本文所用，术语“转录因子”意指通过与启动子的DNA序列结合以及上调或下调表达来控制特定基因的转录速率的蛋白质。转录因子(还可用作胚发生诱导形态发育基因)的实例包括AP2/EREBP家族的成员(包括BBM(ODP2)、plethora和aintegumenta亚家族，CAAT-box结合蛋白(如LEC1和HAP3)，以及MYB、bHLH、NAC、MADS、bZIP、RKD(美国专利申请公开号2013/0180010)和WRKY家族的成员。

本公开在一方面还包括通过本文所公开的任何方法或组合物获得的植物。在许多方面，本公开还包括来自通过本文所公开的任何方法或组合物获得的植物的种子。如本文所用，术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。如本文所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、以及在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药、谷物等。植物细胞包括但不限于来自以下的细胞：种子、悬浮培养物、外植体、未成熟胚、胚、合子胚、体细胞胚、胚发生性愈伤组织、分生组织、体分生组织、器官发生性愈伤组织、原生质体、分生组织区域、从成熟的由穗衍生的种子衍生的胚、叶基、成熟植物的叶、叶尖、未成熟的花序、雄穗、未成熟的穗、丝、子叶、未成熟的子叶、胚轴、分生组织区域、愈伤组织、叶细胞、茎细胞、根细胞、芽细胞、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、未分化的愈伤组织、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、未成熟的子叶、胚轴、悬浮培养细胞、原生质体、叶、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的培养中的细胞(例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。籽粒意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也被包括在本公开的范围内，只要这些后代、变体和突变体是使用本文公开的方法和组合物制造的和/或包含引入的多核苷酸。

如本文使用的，术语“经转化的植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因或转化的植物基因组内，这样使得多核苷酸得以传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。应当理解的是，如本文所用，术语“转基因的”包括其基因型已经通过异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些。转基因植物定义为含有转基因的成熟可育植物。

通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的异源DNA构建体转化植物细胞，所述核酸表达盒包含目的基因；再生由所转移的基因插入所述植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的植物。事件在表型上表征为插入的基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”也指转化株和另一个植物之间有性杂交所产生的后代，其中所述后代包含异源DNA。

本公开的组合物和方法可应用于宽范围的植物物种，包括双子叶植物和单子叶植物。可以根据本文公开的方法处理的植物的代表性实例包括但不限于小麦、棉花、向日葵、红花、烟草、拟南芥属、大麦、燕麦、水稻、玉米、黑小麦、高粱、黑麦、粟、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、土豆、甜菜、葡萄、桉属(Eucalyptus)、小麦草(wheat grass)、草皮草、苜蓿、三叶草、大豆、花生、柑橘、番木瓜、狗尾草属物种(Setaria sp)、可可、黄瓜、苹果、辣椒属(Capsicum)、竹、瓜、观赏植物(包括商业花园和鳞茎花卉物种)、果树、蔬菜物种、芸苔属物种以及种间杂交体。在优选的实施例中，将本公开的组合物和方法应用于玉米植物。

本公开的方法涉及将多肽、多核苷酸(即，DNA或RNA)或核苷酸构建体(即，DNA或RNA)引入植物中。如本文所用，“引入”意在指以使得多核苷酸、多肽或核苷酸构建体得以进入植物细胞内部的方式，将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体呈送给植物。本公开的方法不取决于用于将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体引入植物中的特定方法，只要所述多核苷酸、多肽或核苷酸构建体得以进入所述植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

如本文所用，“稳定转化”是其中引入到植物中的多核苷酸或核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能由其子代继承的转化。“瞬时转化”意指将多核苷酸或核苷酸构建体引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。另外，在某些实施例中，“瞬时”可以表示在细胞中存在胚发生诱导剂，其中这种试剂已经被外源性地应用或分泌到邻近细胞中或从染色体外位置(例如，质粒或另一种独立复制来源)产生，或者不是由相同细胞内的稳定整合的重组DNA构建体产生。

如本文所用，“接触”、“和......接触”或“与......接触”用于意指“直接接触”或“间接接触”，并且意指将细胞置于细胞可以与任何本文公开的胚发生诱导物质接触的条件下，所述胚发生诱导物质包括但不限于胚发生诱导形态发育基因、小分子或加倍剂。允许此类物质存在于细胞存活的环境(例如，培养基或在细胞或邻近细胞中表达)中并且可以在细胞上起作用。例如，包含加倍剂的培养基可以与单倍体细胞直接接触，或者包含加倍剂的培养基可以通过滤纸、植物组织或其他细胞与单倍体细胞分开，因此加倍剂穿过滤纸或细胞被转移到单倍体细胞中。

本文提供的方法依赖于使用细菌介导的和/或生物射弹介导的基因转移以产生可再生的植物细胞。可用在本公开的方法中的细菌株包括但不限于卸甲(disarmed)农杆菌、苍白杆菌属(Ochrobactrum)细菌或根瘤菌科(Rhizobiaceae)细菌。粒子轰击(Finer和McMullen，1991，In Vitro Cell Dev.Biol.-Plant[体内细胞发育生物学-植物]27：175-182)、农杆菌属介导的转化(Jia等人，2015，Int J.Mol.Sci.[国际分子科学杂志]16：18552-18543；US 2017/0121722，通过引用以其整体并入本文)或苍白杆菌属介导的转化(US 2018/0216123，通过引用以其整体并入本文)的标准方案可用于本公开的方法和组合物。用于将异源基因引入植物的多种方法是已知的，并且可用于将多核苷酸插入植物宿主中，所述方法包括生物和物理植物转化方案。参见例如，Miki等人，“Procedures forIntroducing Foreign DNA into Plants[用于将外源DNA引入植物的程序]，”Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学和生物技术的方法]，Glick和Thompson，编辑(CRC Press，Inc.[CRC出版公司]，Boca Raton[波卡拉顿]，第67-88页(1993)。所选择的方法随宿主植物变化并且包括化学转染方法(如磷酸钙)、微生物介导的基因转移(如农杆菌属)(Horsch，等人，(1985)Science[科学]227：1229-31)、电穿孔、显微注射和生物射弹轰击。用于植物细胞或组织转化和转基因植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并且可用的。参见例如，Gruber，等人，“Vectors for PlantTransformation[用于植物转化的载体]，”Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology[植物分子生物学和生物技术的方法]，同上，第89-119页。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway，等人，(1986)Biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs，等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5602-5606)、农杆菌属介导的转化(Townsend，等人，美国专利号5,563,055和Zhao，等人，美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski，等人，(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)以及弹道粒子加速(参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes，等人，(1995)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，编辑Gamborg和Phillips(施普林格出版社，柏林)；McCabe，等人，(1988)Biotechnology[分子技术学]6：923-926)和Lec1转化(WO 00/28058)。还参见，Weissinger，等人，(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年度评论]22：421-477；Sanford，等人，(1987)Particulate Science and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou，等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe，等人，(1988)Bio/Technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In VitroCell Dev.Biol.[体外细胞发育生物学]27P：175-182(大豆)；Singh，等人，(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta，等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；Klein，等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉米)；Klein，等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein，等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；Fromm，等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren，等人，(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷物)；Bytebier，等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet，等人，(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作]，Chapman，等人编辑，(Longman[朗文出版社]，纽约)，第197-209页(花粉)；Kaeppler，等人，(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler，等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin，等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li，等人，(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals ofBotany[植物学年报]75：407-413(水稻)；Ishida，等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的玉米)，所有这些通过引用以其整体并入本文。在U.S.2017/0121722中也发现了用于快速植物转化的方法和组合物，通过引用以其整体并入本文。在美国专利申请序列号15/765,521中发现了可用于植物转化的载体，通过引用以其整体并入本文。

收获雄穗的方法(包括灭菌方法)以及雄穗预处理(例如温度预处理)在本领域中是已知的，并且将根据预期的雄穗用途而变化。具体而言，在选择雄穗用于小孢子培养之前，必须使小孢子进入到适当的阶段，通常在单核阶段到双核阶段之间。典型地，对于在适当阶段具有花药和小孢子的雄穗，将这些雄穗解离，并且将每个雄穗单独地包裹在例如铝箔中。

在降低的温度环境中，小孢子的分离典型地发生在雄穗预处理之后以改善产雄性特征的响应。一种常用的技术是将箔包裹的雄穗放置在10℃下持续1到21天。另外，可以在甘露醇溶液(例如0.3M液体甘露醇加50mg/L抗坏血酸)中进行花药的预培养(美国专利5,322,789和美国专利5,445,961，通过引用以其整体并入本文)。

使用前，可以在40％高乐氏(Clorox)(稀释的8.25％次氯酸钠v/v)溶液加两滴吐温80中对雄穗进行表面消毒约十五分钟，同时在往复振动器上轻轻搅动。然后在室温下将雄穗在无菌水中冲洗三次或更多次，并且置于大培养皿中且通常在无菌条件下保持无盖1-1.5小时，以蒸发任何多余的水分。本领域已知的另一种方法包括将从雄穗解离的小穗置于可渗透的篮子中，然后将其浸入40％高乐氏(稀释的8.25％次氯酸钠v/v)溶液加两滴吐温80的溶液中十五分钟，然后如上所述进行冲洗。将小穗置于大培养皿中，通常保持无盖1-1.5小时，以在小孢子分离之前蒸发多余的水分。

玉米花药和小穗的多种分离程序是本领域已知的，包括但不限于玻璃棒浸渍法(Pescitelli，等人，(1990)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]8：628-31)、共混方法、刀片组织切割方法(参见美国专利5,445,961，通过引用以其整体并入本文)、组织匀浆器方法(Gaillard，等人，(1991)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]10：55-8)和组织研磨器方法(Mandaron等人，(1990)Theor Appl Genet[理论与应用遗传学]80：134-138。

从周围的体细胞组织中分离小孢子后，通常在将小孢子与任何花药碎片分离后立即将所述小孢子置于新鲜分离培养基中。许多培养基组合物是本领域已知的。将小孢子从花药碎片中分离的常用的方法是使来自分离程序的共混的小孢子花药碎片浆料通过筛子(Pescitelli(1989)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]7：673-6，Gaillard，等人，(1991)和美国专利5,445,961，通过引用以其整体并入本文)。可替代地，使小孢子花药碎片浆料通过几层粗棉布或筛网过滤器(Coumans，(1989)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]7：618-21)。可以使用不连续密度离心方法或另外的过滤方法进行进一步的分离，所述方法包括但不限于使用蔗糖或Percoll梯度的方法(Coumans，(1989)、Pescitelli等人，(1990))。可替代地，可以使用最终的高蔗糖(0.44M)离心方法进一步分离在225g离心3分钟后在20％-50％范围内的Percoll梯度的20％-30％界面处捕获的细胞的选择(Gaillard，等人，(1991))。分离方法的进一步变化是本领域已知的(Vergne等人，(1991)In：Negrutiu I.(编辑)BioMethods.Birkhauser，Basel，Boston，Bedinger和Edgerton，(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92：474-9，Gaillard，等人，(1991))，并且可以根据需要进行优化。

分离期间使用的具体的培养基，例如通常由6％蔗糖、50mg/L抗坏血酸、400mg/L脯氨酸、0.05mg/L生物素和10mg/L烟酸组成(参见Petolino和Genovesi(1994)The MaizeHandbook[玉米手册]，Freeling，M.，Walbot，V.(编辑)Springer-Verlag[施普林格出版社]，纽约)。用于培养玉米小孢子的各种其他培养基和溶液与用于其他谷物组织培养程序的那些相似，并且可以使用各种修饰(参见Genovesi和Magill，(1982)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]1：257-60，Martin和Widholm，(1996)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]15：781-85，Magnard等人，(2000)Plant Mol Biol[植物分子生物学]44：559-74，Testillano等人，(2002)Int J Dev Biol[国际发育生物学杂志]46：1035-47，Testillano等人，(2004)Chromosoma[染色体学]112：342-9，Shariatpanahi等人，(2006)Plant Cell Rep[植物细胞报告]25：1294-9，Shim等人，(2006)Protoplasma[原生质体学]228：79-86，Soriano等人，(2008)Plant Cell Rep[植物细胞报告]27：805-11，Cistue等人，(2009)Plant Cell Rep[植物细胞报告]28：727-35，Jacquard等人，(2009)Planta[植物]229：393-402，Jacquard等人，(2009)Plant Cell Rep[植物细胞报告]28：1329-39，Shim等人，(2009)Genome[基因组]52：166-74，Sanchez-Diaz等人，(2013)Plant Reprod[植物繁殖]26：287-96)。如以上引用所证明的，玉米培养基的共同特征通常包括使用具有相对较高糖浓度(6％-12％)的N6、NLN或YP基础盐配制品，所述配制品可具有包括三碘苯甲酸(triiobenzoic acid)、各种植物激素和/或脯氨酸的组分。

本公开的组合物和方法包括通过使植物细胞与形态发育胚发生诱导基因蛋白产物接触而从配子中产生双单倍体植物，所述形态发育胚发生诱导基因蛋白产物可以在细胞中诱导细胞重编程并且活化胚发生。还提供了通过用形态发育胚发生诱导基因蛋白产物(如WUSCHEL六组氨酸标签蛋白(“WUS-HISTAG”)(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2))处理分离的小孢子来针对产雄性特征的诱导进行非原位细胞重编程的方法。在另一方面，本公开提供了用包含形态发育胚发生诱导基因蛋白产物和细胞穿透肽的翻译融合蛋白(更具体地为γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(CPP)WUSCHEL六组氨酸标签翻译融合蛋白(“WUS-HISTAG-GZCPP”)(SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47))处理分离的小孢子的方法。

还提供了通过以下方式针对产雄性特征的诱导进行非原位细胞重编程的方法：用形态发育胚发生诱导基因蛋白产物和/或胚发生诱导小分子化合物或其组合处理植物细胞，从而使得能够改善野生型植物细胞(包括但不限于配子型细胞)中细胞重编程和胚发生生长刺激。

还提供了通过以组织特异性方式表达形态发育胚发生诱导基因蛋白产物来针对产雄性特征的诱导进行原位细胞重编程的方法。具体地，通过在花药的绒毡层细胞内，并且更具体地使用玉蜀黍Ms44启动子(“ZM-Ms44 PRO”；SEQ ID NO：3)和与玉蜀黍WUSCHEL2序列(“ZM-WUS2”；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)融合的Ms44 N末端分泌信号肽(“Ms44^SP”；SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5)(以诱导小孢子内细胞重编程和活化胚发生)，表达形态发育胚发生诱导基因蛋白产物。

还提供了通过以下方式进行原位细胞重编程的方法：用由WUSCHEL基因、易位信号和接头序列(“L3”；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)(还可以与荧光蛋白基因例如AC-GFP1(SEQID NO：10和SEQ ID NO：11)和终止子序列“ZM-Ms44 TERM”；SEQ ID NO：12)融合)构成的构建体转化植物组织或器官，并且然后基于存在或不存在转基因而在小孢子衍生的双单倍体群体中选择。

本公开还提供了包含WUSCHEL多肽(SEQ ID NO：7)和易位肽或细胞定位信号序列的翻译融合蛋白(SEQ ID NO：13(“WUS-virF^C36”)、SEQ ID NO：14(“WUS-virF^C36”)，SEQ IDNO：15(“WUS-virF^C127”)、SEQ ID NO：16(“WUS-virF^C127”)，SEQ ID NO：17(“WUS-GALLS(GSC²⁷)”)、SEQ ID NO：18(“WUS-GALLS(GSC²⁷)”))，以产生在本发明的方法中用作在处理的细胞中诱导胚发生的细胞重编程因子的WUSCHEL变体。

在某些方面，本文公开的原位细胞重编程方法还提供了由WUSCHEL基因和基于糖皮质激素受体(GR)的融合蛋白(“WUS-GR”；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49)构成的构建体，以通过将动物激素类似物外部应用到体外组织培养基中而有条件地将蛋白活性定位到细胞核。

本公开还使用了形态发育基因与其胚发生诱导基因蛋白产物(如WUSCHEL蛋白和玉蜀黍ODP2(ZM-ODP2；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，为一种AP2/ERF转录因子))或者其他本领域已知的形态发育基因与其胚发生诱导基因蛋白产物的组合。本公开包括使用翻译融合蛋白，所述翻译融合蛋白包含N末端Ms44 N末端分泌信号肽(ZM-Ms44^SP；SEQ ID NO：5)和玉蜀黍ODP2多肽(ZM-ODP2；SEQ ID NO：20)和C末端细胞穿透肽，所述C末端细胞穿透肽包括但不限于玉蜀黍knotted1 CPP(ZM-KNT1 CPP；SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)TP10 CPP(SP-TP10 CPP；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)、白色念珠菌Zebra CPP(CA-Zebra CPP；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26)、PEP1 CPP(PEP1 CPP；SEQID NO：27和SEQ ID NO：28)、HIV-1 TAT CPP(HIV-1 TAT CPP；SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30)。能够使胚发生诱导多肽转运/转移/分泌到母本组织的发育小孢子或一种或多种胚细胞中的任何信号肽或其他部分适用于和本文公开的组合物一起使用。

本公开提供了用于通过用包含胚发生诱导形态发育基因蛋白的翻译融合蛋白(如WUSCHEL六组氨酸标签蛋白和使用CPP(包括但不限于上述的CPP序列)的C末端融合物)处理分离的小孢子来针对产雄性特征的诱导进行非原位细胞重编程的方法。可以通过用包含胚发生诱导形态发育蛋白的翻译融合蛋白(如WUSCHEL蛋白和转位信号的C末端融合物(如WUSCHEL-virF^C36翻译融合物、WUSCHEL-virF^C127翻译融合物或WUSCHEL-GALLS(GSC²⁷)翻译融合蛋白))处理分离的小孢子获得产雄性特征的诱导。

任选地，本公开的非原位方法使用与表达胚发生诱导形态发育多肽的悬浮“饲养细胞”共培养的分离的小孢子，以进一步促进用以活化小孢子胚发生的细胞重编程。

任选地，本公开的非原位细胞重编程方法可以与从使用本文公开的原位细胞重编程方法产生的植物组织分离的小孢子组合并且与之一起使用。

本公开提供了一种用于通过转化玉米单倍体诱导系以稳定整合并且表达异源表达盒来使母本单倍体胚再生的原位细胞重编程方法，所述异源表达盒编码刺激体细胞胚发生的形态发育多肽以及还编码包括用于基因编辑目的的基因的第二组分。两种组分都可以包含使用可操作地连接到在胚乳内表达的启动子的分泌信号肽的融合肽。可用在本公开中的分泌信号肽包括但不限于可操作地连接到BETL9启动子(“ZM-BETL9 PRO”；SEQ ID NO：33)的基底胚乳转移层9(BETL9)分泌信号肽(“BETL9^SP”；SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32)或可操作地连接到BETL9样启动子(“ZM-BETL9样PRO”；SEQ ID NO：36)的基底胚乳转移层9样(BETL9样)分泌信号肽(“BETL9样^SP”；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35)。原位细胞重编程方法可以任选地使用胚乳内表达的荧光颜色标记物，例如可操作地连接到玉蜀黍FEM2启动子的编码Anemonia majano青色荧光蛋白(CFP)的多核苷酸(“AM--CFP-ZM-FEM2”；SEQ ID NO：39)。

还可以在本公开的表达盒中包括其他报告基因或者选择性标记基因。本领域已知的合适的报告物的实例可以在以下中找到：例如，Jefferson，等人，(1991)PlantMolecular Biology Manual[植物分子生物学年刊]，编辑Gelvin，等人，(Kluwer AcademicPublishers[鲁维尔学术出版社])，第1-33页；DeWet，等人，(1987)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7：725-737；Goff，等人，(1990)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]9：2517-2522；Kain，等人，(1995)Bio Techtniques[生物技术]19：650-655和Chiu，等人，(1996)Current Biology[当前生物学]6：325-330，通过引用以其整体并入本文。

用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的实例包括但不限于编码对如下的耐受性的基因：氯霉素(Herrera Estrella，等人，(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella，等人，(1983)Nature[自然]303：209-213；Meijer，等人，(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16：807-820)；潮霉素(Waldron，等人，(1985)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]5：103-108和Zhijian，等人，(1995)Plant Science[植物科学]108：219-227)；链霉素(Jones，等人，(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard，等人，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：131-137)；博菜霉素(Hille，等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺类(Guerineau，等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：127-36)；溴草腈(Stalker，等人，(1988)Science[科学]242：419-423)；草甘膦(Shaw，等人，(1986)Science[科学]233：478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock，等人，(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)，通过引用以其整体并入本文。

可以在转基因事件的恢复中发挥效用的其他基因将包括但不限于如以下的实例：GUS(β-葡糖苷酶；Jefferson，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学报告]5：387)、GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie，等人，(1994)Science[科学]263：802)、萤光素酶(Riggs，等人，(1987)Nucleic Acids Res.[核酸研究]15(19)：8115和Luehrsen，等人，(1992)MethodsEnzymol.[酶学方法]216：397-414)以及编码花色素产生的玉米基因(Ludwig，等人，(1990)Science[科学]247：449)，通过引用以其整体并入本文。

本公开的方法还提供了使用多顺反子接头(“TA-T2A”；SEQ ID NO：40和SEQ IDNO：41)使多个形态学发育基因在一个表达盒中的表达，所述多顺反子接头可操作地连接到启动子和包括用于基因编辑目的的基因的第二组分，所述用于基因编辑目的的基因包括但不限于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(CRISPR)CAS9核酸酶(“SP-CAS9”；SEQ IDNO：42和SEQ ID NO：43)或Cpf1核酸酶(“AC-Cpfl”；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45)或其他核酸酶蛋白(包括但不限于锌指核酸酶、大范围核酸酶或转录激活因子样效应子核酸酶)。在转化的玉米单倍体诱导系中使用第一组分以使靶植物的母本穗受精，这对改善双单倍体生产是有用的，而第二组分能够改善基因编辑的玉米双单倍体的再生。

本公开还提供了在分离和胚发生诱导方法(用于产生父本配子(产雄性特征的)或母本配子(产生雌性特征的)双单倍体群体)的任何部分之前、期间、之后或与之重叠，使单倍体细胞与一定量的染色体加倍剂接触的方法。

如本文所用，对于在生物的组织外部的植物细胞(例如已经分离用于实验和/或在外部环境中完成测量的所提取的细胞)，使用细胞重编程剂(胚发生诱导多肽或胚发生诱导化合物)或细胞重编程处理称为“非原位”处理或处理方法。

如本文所使用的“重组体”意指细胞或载体，其已经通过引入异源核酸或衍生自已经如此修饰的细胞而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达未在天然(非重组)细胞中以相同形式或位置发现的基因的细胞、或以不同于天然(非重组)细胞的表达模式表达天然基因的细胞，例如，由于故意的人为干预，天然基因异常表达、表达不足、表达降低或根本不表达。如本文所用的术语“重组”不涵盖由于自然发生的事件(例如，自发突变、自然转化/转导/转位)(如在没有故意的人为干预的情况下发生的事件)而引起的细胞或载体的改变。

如本文所使用的，“重组表达盒”是以重组或合成方式产生的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件的核酸构建体。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括，除了其他序列之外，待转录的核酸和启动子。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。

如本文所用，可用于本公开的方法中的多肽可以用细胞穿透肽(本文称为“CPP”)进一步工程化。可用在本发明的方法中的CPP是一类短肽，其具有跨细胞膜易位并充当用于将蛋白质递送到植物细胞中的纳米载体的性质。示例性CPP家族包括但不限于衍生自蛋白质转导结构域、两亲性肽和合成阳离子多肽(例如聚赖氨酸、聚组氨酸和聚精氨酸)或树状聚阳离子分子的CPP。可用在本公开的方法中的示例性CPP包括但不限于肽血管内皮钙粘蛋白CPP、转运素CPP、HIV-1TAT基本结构域Cpp的单体和二聚体、穿透素CPP、合成的阳离子高精氨酸寡肽CPP(参见Eudes和Chugh.(2008)Plant Signal Behav.[植物信号行为]3：549-550)和γ玉米醇溶蛋白CPP(参见US 8581036，通过引用以其整体并入本文)。本公开提供了使用γ-玉米醇溶蛋白CPP形态发育蛋白翻译融合蛋白以用于使γ-玉米醇溶蛋白连接的结构与植物细胞接触并且允许将γ-玉米醇溶蛋白连接的结构摄取到植物细胞中以改变植物细胞的细胞命运的方法。

如本文所用，“细胞重编程因子”或“胚发生诱导剂”包括但不限于在细胞命运重编程中独立或协同地发挥功能(包括例如，小孢子胚发生诱导)的小分子、化合物和形态发育胚发生诱导基因产物。当细胞与小分子接触时，认为这些重编程分子活化在接触的细胞中引发胚发生响应的细胞内的内源基因的表达。如本文所用，“细胞重编程处理”是本文公开的在接触的细胞中引发胚发生响应的任何处理。

如本文所用，在细胞分离或细胞提取用于实验和/或在外部环境中完成测量之前，对于在生物的组织内部的植物细胞，使用细胞重编程剂(胚发生诱导多肽或胚发生诱导化合物)或细胞重编程处理称为“原位”处理或处理方法。

术语“调节元件”是指具有基因调节活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸的转录和/或翻译表达模式的核酸分子。因此，术语“基因调节活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，从而影响这种可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调节活性可为正向和/或负向，并且所述影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应，还可通过定量指示或定性指示来表征。

如本文所用，“启动子”是示例性调节元件，并且通常是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列包含近端元件和较远端上游元件，后一元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，用来增强启动子的水平或组织特异性。启动子可以全部衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的核苷酸片段。本领域技术人员应当理解，不同的调节元件可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境条件的表达。

植物启动子是能够在植物细胞中起始转录的启动子。示例性植物启动子包括但不局限于从植物、植物病毒以及包含在植物细胞中表达的基因的细菌(如农杆菌属或根瘤菌属)获得的那些启动子。实例是优先在某些组织(如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)中启动转录的启动子。这样的启动子称为“组织偏好性”启动子。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调节型”启动子是指在环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光照的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育期间驱动表达的启动子。组织偏好性启动子、细胞类型特异性启动子、发育调节启动子和诱导型启动子是“非组成性”启动子类别的成员。“组成型”启动子是导致核酸片段在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子。

“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全处理的mRNA上游。翻译前导序列可以影响多种参数，包括初级转录物到mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner和Foster(1995)Mol.Biotechnol.[分子生物技术]3：225-236)。

如上所述，技术人员将认识到适当的启动子可用于调节父本或母本胚发生。对于父本胚发生，示例性启动子包括雄穗偏好性启动子、花药偏好性启动子和绒毡层偏好性启动子。已知的组织特异性、组织偏好性或阶段特异性调节元件进一步包括花药特异性LAT52(Twell，等人，(1989)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]217：240-245)、小孢子特异性启动子(如apg基因启动子)(Twell，等人，(1993)Sex.Plant Reprod.[有性植物繁殖]6：217-224)和绒毡层特异性启动子(如TA29基因启动子)(Mariani，等人，(1990)Nature[自然]347：737；美国专利号6,372,967)、雄蕊特异性启动子，如MS26基因启动子、MS44基因启动子、MS45基因启动子、5126基因启动子、BS7基因启动子、PG47基因启动子(美国专利号5,412,085；美国专利号5,545,546；Zheng等人，(1993)Plant J[植物杂志]3(2)：261-271)、SGB6基因启动子(美国专利号5,470,359)、G9基因启动子(美国专利号5,8937,850；美国专利号5,589,610)、SB200基因启动子(WO 2002/26789)等。在雄性生殖器官的细胞中有活性的组织偏好性启动子可特别用在本公开的某些方面中。

对于母本胚发生，示例性启动子包括种子偏好性启动子。“种子偏好性”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子发芽性”启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。参见Thompson等人，(1989)BioEssays[生物测定]10：108，其通过引用并入本文。此类种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信号)启动子；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)启动子；和milps(肌醇-1-磷酸盐合酶)启动子(参见WO 00/11177和美国专利号6,225,529，通过引用以其整体并入本文)。可用在本公开的方法中的其他启动子包括但不限于胚乳特异性启动子，如γ-玉米醇溶蛋白启动子(Boronat等人(1986)Plant Science[植物科学]47：95-102)和胚特异性启动子，如球蛋白-1(Glob-1)启动子。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa启动子、22kDa玉米醇溶蛋白启动子、27kDa玉米醇溶蛋白启动子、γ-玉米醇溶蛋白启动子、糯质基因启动子(waxy promoter)、超甜基因1启动子(shrunken1promoter)、超甜基因2启动子、球蛋白1启动子等。还参见WO 00/12733，其公开了来自endl和end2基因的种子偏好性启动子。另外的种子偏好性启动子包括油质蛋白启动子(WO 00/0028058)、脂质转移蛋白(LTP)启动子(美国专利号5,525,716)、Lec1启动子、Jip1启动子和milps3启动子(参见WO 02/42424)。

如本文所用，“信号肽”或“分泌信号肽”序列是指与蛋白质转运系统相互作用并且易位或靶向蛋白质以递送至特定目的地的蛋白质区域。可用在本公开的方法中的信号肽或分泌信号肽的实例包括但不限于将蛋白质靶向植物细胞的细胞外基质的信号肽，如白花丹叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)延伸基因信号肽(DeLoose，等人，(1991)Gene[基因]99：95-100)；导致蛋白质分泌的信号肽，如PRIb信号肽(Lind，等人，(1992)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]18：47-53)或大麦α淀粉酶(BAA)信号肽(Rahmatullah，等人，(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12：119)。

包含在双功能抑制剂/植物脂质转移蛋白/种子存储螺旋结构域蛋白(特征性地编码对二级结构重要的八个保守半胱氨酸残基)的超家族中发现的结构域的分泌信号肽包括但不限于脂质转移蛋白，如LILY-LIM2(Q43534)、高粱(XP_002445754)、大麦(BAK05897)、水稻-OSC4(BAD09233)、水稻-MEN-8(XP_006660357)和玉米-MZm3-3(NP_001105123)，它们可用于将可用在本公开的方法中的雄性表达的植物特异性蛋白工程化。将蛋白质从胚乳靶向到胚的分泌信号肽可用于使可用在本公开的方法中的雌性表达的翻译融合蛋白工程化。

如本文所用，“异源”是指源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行实质性修饰得到的核酸。例如，可操作地连接到异源结构基因的启动子，所述异源结构基因来自与衍生结构基因的物种不同的物种，或者，如果来自相同的物种，则其中一者或二者从其原始形式和/或基因组位置进行了实质性的修饰。

在一方面，可以在用于在目的植物中表达的表达盒中提供可用在本公开的方法中的胚发生诱导形态发育基因。所述表达盒可以包括可操作地连接到本文公开的胚发生诱导形态发育基因序列的5′和3′调节序列。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作的连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接(融合蛋白)时，可操作地连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。所述盒可以另外包含至少一个待共转化到生物中的另外的基因。可替代地，所述一个或多个另外的胚发生诱导形态发育基因可以在多个表达盒上提供。此类表达盒具有用于插入胚发生诱导形态发育基因序列的多个限制性位点，所述胚发生诱导形态发育基因序列将位于调节区域(一个或多个启动子)的转录调节之下。表达盒可另外包含选择性标记基因。

如本文所用，嵌合信号肽-形态发育基因融合物可以用在多肽C末端上的易位或核定位信号序列进一步工程化以促进改善的细胞重编程效率和胚发生诱导。本公开的方法提供了编码WUSCHEL蛋白的基因构建体，所述WUSCHEL蛋白与赋予分泌蛋白原位易位的衍生自细菌毒力蛋白的多肽融合。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是植物病原体的实例，所述植物病原体可以以依赖于细菌毒力(Vir)蛋白质易位的方式将位于转移的DNA(T-DNA)上的由质粒编码的细菌基因转移到植物细胞中。Cre重组酶与Vir蛋白多肽(具体是VirE2或VirF肽序列)之间的融合物的易位，直接证明了由Vir肽赋予的将蛋白质易位到植物细胞中的作用(Vergunst等人，(2000)Science[科学]290：979-82)。此外，示出毛根农杆菌GALLS蛋白的C末端27个氨基酸在蛋白质转运和核定位中起作用(Hodges等人，(2006)J.Bacteriol.[细菌学杂志]188：8222-30)。使用编码易位或核定位信号的肽是本领域已知的(参见US 6800791，通过引用以其整体并入本文)。

如本文所用，可用在本公开的方法中的表达盒可以含有编码如下的多核苷酸：具有易位或核定位信号序列的Ms44信号肽-WUSCHEL融合物、或者类似的具有易位融合肽的Ms44信号肽-ODP2融合物，所述易位融合肽可以用细胞穿透肽(在本文中称为“CPP”)进一步工程化。可用在本发明的方法中的CPP是一类短肽，其具有跨细胞膜易位并充当用于将蛋白质递送到植物细胞中的纳米载体的性质。示例性CPP家族包括但不限于衍生自蛋白质转导结构域、两亲性肽和合成阳离子多肽(例如聚赖氨酸、聚组氨酸和聚精氨酸)或树状聚阳离子分子的CPP。可用在本公开的方法中的示例性CPP包括但不限于肽血管内皮钙粘蛋白CPP、转运素CPP、HIV-1 TAT基本结构域Cpp的单体和二聚体、穿透素CPP、合成的阳离子高精氨酸寡肽CPP(参见Eudes和Chugh.(2008)Plant Signal Behav.[植物信号行为]3：549-550)和γ玉米醇溶蛋白CPP(参见US 8581036，通过引用以其整体并入本文)。本公开提供了使用γ-玉米醇溶蛋白CPP形态发育蛋白翻译融合蛋白以用于使γ-玉米醇溶蛋白连接的结构与植物细胞接触并且允许将γ-玉米醇溶蛋白连接的结构摄取到植物细胞中以改变植物细胞的细胞命运的方法。还提供了用在本公开的方法中的工程化胚发生诱导形态发育蛋白，所述工程化胚发生诱导形态发育蛋白包含与ODP2蛋白融合的CPP，以用于与嵌合信号肽-WUSCHEL融合蛋白组合使用。使这些基因构建体工程化以向小孢子递送胚发生诱导形态发育蛋白并使小孢子和胚发生诱导形态发育蛋白接触，所述胚发生诱导形态发育蛋白包含与ODP2蛋白融合的CPP，以用于与可操作地连接到花药特异性启动子或更具体地绒毡层特异性启动子的嵌合信号肽-WUSCHEL融合蛋白组合使用。

如本文所用，也可以工程化此类基因构建体以向胚递送胚发生诱导形态发育蛋白并且使胚与胚发生诱导形态发育蛋白接触，所述胚更具体地为玉米单倍体胚。还提供了用在本公开的方法中的表达盒，所述表达盒包含与ODP2蛋白融合的CPP，以用于与嵌合信号肽-WUSCHEL融合蛋白可操作地组合使用，由此这些蛋白质是使用基因构建体被工程化，所述基因构建体被设计为具有可操作地连接到胚乳特异性启动子的嵌合胚乳或转移细胞层信号肽-WUSCHEL融合蛋白，以及编码胚乳或转移细胞层信号肽-ODP2-CPP融合肽的多核苷酸，以使表达的蛋白质从胚乳易位到胚。

如本文所用，“花药”是含有附着于丝状体的小孢子囊的雄蕊的一部分。在被子植物(开花植物)中，所述小孢子囊产生小孢子母细胞(microsporocyte)(也称为小孢子母细胞(microspore mother cell))，所述小孢子母细胞然后通过减数分裂产生四个小孢子。小孢子通过有丝分裂进行分裂，产生花粉粒。

如本文所用，“子房室”是在小配子发生期间含有雄性配子的花药内的隔室。

术语“小配子发生”是植物繁殖中的过程，其中小配子体(本文中称为“小孢子”)发育为三细胞花粉粒。

如本文所用，“小孢子囊(microsporangium)”或复数“小孢子囊(microsporangia)”是产生孢子的孢子囊，所述孢子产生雄性配子体。在几乎所有陆地植物中，孢子囊都是减数分裂的位点，并且产生遗传上不同的单倍体孢子。

术语“小孢子胚发生”意指在小孢子中，将引起或诱导小孢子处于胚发生状态的产雄性特征的胚发生进行活化。

术语“小孢子衍生的胚”或“小孢子衍生的胚状体”意指衍生自具有经历胚发生的细胞的细胞命运和发育特征的小孢子的一个或多个细胞。

术语“产雄性特征的”意指孤雄生殖的诱导，其中胚仅含有单倍体或二倍体细胞的父本染色体(单性生殖)。

如本文所用，“单倍体”植物具有单组染色体(基因组)，并且单倍体植物中减少的染色体数目(n)等于配子中的染色体数目。

如本文所用，“二倍体”植物具有两组(基因组)染色体，并且染色体数目(2n)等于受精卵中的染色体数目。

如本文所用，“双单倍体”或“双单倍体植物或细胞”是通过对单倍体染色体组进行加倍而发育的。从双单倍体植物(自交任何代数)获得的植物或种子仍然可以被鉴定为双单倍体植物。双单倍体植物被认为是纯合植物。如果植物是可育的，则其是双单倍体，即使植物的整个营养部分不是由具有加倍染色体组的细胞组成。例如，如果植物含有活的配子，即使其是嵌合的，也会被认为是双单倍体植物。

如本文所用，“双单倍体胚”是具有一个或多个细胞的胚，所述细胞含有之后可以生长为双单倍体植物的2组纯合染色体。

术语“培养基”包括呈液态、气态或固态的化合物。

本公开提供了如下方法，所述方法中染色体可以在小孢子阶段、胚阶段、成熟种子阶段、或在植物授粉和单倍体种子萌发前之间的任何时间加倍。可替代地，还可以发生自发加倍。

本公开的非原位方法通过使分离的小孢子与胚发生诱导形态发育蛋白接触来促进小孢子胚发生和细胞重编程。分离的小孢子可以与外源胚发生诱导形态发育蛋白特异性接触，以改善玉米小孢子胚发生。例如，如本文所公开的，非原位胚发生诱导形态发育蛋白处理细胞重编程方法使用异源表达系统以产生纯化的重组WUSCHEL蛋白(SEQ ID NO：2)。本公开的方法包括将所述蛋白质递送到植物细胞，例如使用转染试剂以进一步促进将外源WUSCHEL蛋白递送到分离的小孢子细胞。在一些方面，具有或不具有转染试剂的蛋白质递送方法可以包括在进一步促进将外源胚发生诱导形态发育蛋白递送到小孢子细胞中的试剂(如二甲基亚砜(DMSO)、佐剂、表面活性剂等)的存在下进行的电穿孔方法和/或声处理方法。

还提供了非原位方法，其包括使分离的小孢子与诸如小分子或化合物等试剂接触或用所述试剂处理，所述试剂实现细胞命运重编程并且刺激胚发生的细胞增殖。本公开提供了包括在补充有小分子或化合物的诱导培养基中共培养分离的小孢子的方法。在一些方面，在本公开的方法中使用蛋白质激酶的小分子抑制剂以对植物细胞进行细胞重编程。

本公开的方法还提供了将蛋白质递送细胞重编程方法与或不与转染试剂、与和不与电穿孔方法和/或声处理方法组合，其可以在上述试剂(如二甲基亚砜(DMSO)、佐剂、表面活性剂等)以及使用上述小分子或化合物进行细胞重编程处理的存在下进行，以改善植物细胞的细胞重编程。

本公开的方法还提供了非原位和/或原位方法可以随后包括与具有胚发生和细胞重编程特性的玉米悬浮“饲养细胞”接触的所分离的小孢子的共培养。具体而言，所述方法包括在转基因玉米悬浮细胞培养物的存在下共培养所分离的小孢子，所述转基因玉米悬浮细胞培养物用表达胚发生诱导形态发育基因蛋白(如WUSCHEL蛋白(SEQ ID NO：7)和或ODP2(SEQ ID NO：20))的基因构建体转化。

在一方面，将饲养细胞工程化以表达编码参与生长刺激、胚发生、细胞重编程和/或细胞周期刺激的多肽的多核苷酸，以增加单倍体胚的频率、以增加小孢子衍生的胚的起始频率和/或以刺激和增加染色体加倍效率。可用在本公开的方法中的多核苷酸包括但不限于胚发生诱导形态发育基因和细胞周期基因，包括细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白C、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白F、细胞周期蛋白G和细胞周期蛋白H；Pinl；E2F；Cdc25；RepA基因和类似的编码复制相关蛋白的植物病毒多核苷酸。参见美国专利公开号2002/0188965，通过引用以其整体并入本文。

在一方面，本公开提供了方法，所述方法包括在非转基因玉米悬浮细胞培养物(饲养细胞)的存在下(更具体地使用从具有响应性产雄性特征表型的基因型衍生的饲养细胞)共培养所分离的小孢子，所述饲养细胞如例如为ATCC40520或ATCC40519(参见US5306864A，通过引用以其整体并入本文)、或非转基因的响应性近交株(如HF1(Martin和Widholm，(1996)))。

本公开的原位方法通过在组织或器官中或在邻近组织或器官中异位表达形态发育蛋白来促进从植物组织或器官的胚发生。提供时空表达和定位于植物的特定组织或器官的基因元件可用在本公开的方法中。

在一方面，在本公开的方法中采用的启动子是天然玉蜀黍Ms44启动子(SEQ IDNO：3)，所述天然玉蜀黍Ms44启动子导致利用了Ms44(花药特异性基因)的时空表达和定位特征特性，所述Ms44首次在通过单核小孢子发育中持续存在的减数分裂期间在绒毡层细胞中被检测到(参见Fox等人，(2017)Plant Biotechnol.J.[植物生物技术杂志]，doi：10.1111/pbi.12689中的图S1b)。

可用在本公开的方法中的信号肽是天然玉蜀黍Ms44信号肽(SEQ ID NO：5；还参见美国申请14/384715、14/384743、14/384854和14/384890，通过引用以其整体并入本文)。

在本公开中，将编码调节花药特异性Ms44信号肽(SEQ ID NO：5)的Ms44启动子(SEQ ID NO：3)的异源表达盒与编码WUSCHEL肽(SEQ ID NO：7)的多核苷酸融合，从而在小配子发生期间异位表达胚发生诱导形态发育基因。本公开的方法允许在绒毡层细胞中胚发生诱导形态发育基因蛋白的合成和加工，以分泌到子房室中，从而导致与小孢子接触和胚发生诱导形态发育蛋白的活性，以诱导细胞重编程并且活化小孢子胚发生。

如本文所用，“嵌合基因表达盒”是包含可操作地连接到转录起始区的编码序列的表达盒，所述转录起始区与所述编码序列异源，并且所述表达盒可以在转录的5′-3′方向上包括转录起始区域(即启动子)和翻译起始区、分泌信号肽、胚发生诱导形态发育基因序列、荧光蛋白序列以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。

在一方面，可用在本公开的方法中的基因构建体是编码以下的多核苷酸：Ms44启动子和与WUSCHEL蛋白融合的Ms44分泌信号肽，所述WUSCHEL蛋白还与C末端36个氨基酸VirF易位肽序列(SEQ ID NO：14)(本文称为“virF^c36”)融合、或任选地与C末端127个氨基酸VirF易位肽序列(SEQ ID NO：16)(本文称为“virF^C127”)融合、或任选地与来自毛根农杆菌GALLS蛋白的27个氨基酸易位信号肽(SEQ ID NO：18)(本文称为“GS^C27”)融合，以促进增加的形态活性和细胞重编程。

在一方面，可用在本公开的方法中的具有胚发生诱导形态发育基因蛋白活性(细胞重编程和胚发生诱导活性)的基因构建体还可以包括胚发生诱导形态发育基因与细胞穿透肽的融合物，以增加以细胞非自主方式的细胞递送和活性(增加对周围/相邻细胞的胚发生诱导影响)。

在一方面，可用在本公开的方法中的具有胚发生诱导形态发育基因蛋白活性(细胞重编程和胚发生诱导活性)的基因构建体还可以包括胚发生诱导形态发育基因与基于糖皮质激素受体(GR)的融合蛋白系统的融合物(SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49)，以通过将动物激素类似物外部应用到体外组织培养物而将蛋白质活性有条件地定位于细胞核。

可用在本公开的方法中的启动子包括ZmBETL9和5’非翻译区或者ZmBETL9样启动子和5’非翻译区(分别为SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：36)，其与编码胚发生诱导形态发育基因蛋白(如WUSCHEL肽(SEQ ID NO：7)或胚珠发育蛋白2(ODP2)(SEQ ID NO：20))的多核苷酸融合，从而在胚发生期间异位调节胚发生诱导形态发育基因表达。

胚乳分泌信号肽(如N末端ZmBETL9分泌信号肽或ZmBETL9样分泌信号肽(分别为SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35))可用在本公开的方法中，所述胚乳分泌信号肽与胚发生诱导形态发育基因蛋白融合，从而使蛋白质能在胚发生期间从胚乳易位到胚细胞。任选地，包含分泌信号肽和胚发生诱导形态发育基因蛋白的翻译融合蛋白可以与易位信号肽融合。在一方面，翻译融合蛋白可以包含细胞穿透肽。本文公开的方法实现在植物细胞中改善的胚发生和细胞重编程，这也改善了后续植物组织培养方法中的细胞响应。

本公开的原位细胞重编程方法改善了母本单倍体胚再生的产生率并且实现基因编辑以提供再生的经基因编辑的玉米双单倍体，其中所处理的细胞(但是为非转基因的)与衍生自三倍体胚乳细胞的胚发生诱导形态发育基因蛋白接触，所述三倍体胚乳细胞包含表达作为稳定转化体的性状的一个父本等位基因。

在一些方面，编码ZmBETL9启动子、5’非翻译区(SEQ ID NO 33)和N末端ZmBETL9分泌信号肽(SEQ ID NO：31)或者ZmBETL9样启动子、5’非翻译区(SEQ ID NO：36)和N末端ZmBETL9样分泌信号肽(SEQ ID NO：34)的异源表达盒融合至编码胚发生诱导形态发育蛋白(如WUSCHEL肽(SEQ ID NO：7)或胚珠发育蛋白2(ODP2)肽(SEQ ID NO：20))的多核苷酸，用于本公开的方法，从而在胚发生期间异位调节胚发生诱导形态发育基因表达。

在一方面，单倍体细胞可以与一定量的染色体加倍剂接触以促进染色体加倍，然后从经处理的单倍体细胞再生纯合二倍体植物。在小孢子胚发生或胚成熟之前、期间或之后，可以使单倍体小孢子细胞与加倍剂接触。染色体加倍后，加倍的单倍体胚将含有2拷贝的由父本衍生的染色体。用于从单倍体胚获得双单倍体植物的方法的效率可以大于10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％或90％。单倍体细胞与染色体加倍剂之间接触的持续时间可以变化。接触时间可以是从少于24小时(例如4-12小时)至约一周。接触的持续时间通常为从约8小时至2天。

染色体加倍的方法公开于Antoine-Michard，S.等人，Plant cell，tissue organcult.[植物细胞、组织器官培养]，荷兰科尔德雷赫特，Kluwer Academic Publishers[Kluwer学术出版社]，1997，48(3)：203-207；Kato，A.，Maize Genetics CooperationNewsletter[玉米遗传合作新闻通讯]1997，36-37；和Wan，Y.等人，TAG，1989，77：889-892；Wan，Y.等人，TAG，1991，81：205-211。将所公开的内容通过引用并入本文。典型的加倍方法涉及使细胞与秋水仙碱、抗微管剂或抗微管除草剂、拿草特、一氧化二氮或任何有丝分裂抑制剂接触，以产生纯合的双单倍体细胞。培养基中使用的秋水仙碱的量通常是0.01％-0.2％，或可以使用约0.05％的甲基胺草磷(APM)(5-225μM)。秋水仙碱的量可以是在约400-600mg/L的范围或约500mg/L。培养基中拿草特的量是约0.5-20μM。表1中包括有丝分裂抑制剂的实例。其他试剂可以与有丝分裂抑制剂一起使用以改善加倍效率。此类试剂包括二甲基亚砜(DMSO)、佐剂、表面活性剂等。

表1

本公开的原位方法提供了稳定的转基因“小孢子活化”亲本近交系，用于与第二野生型亲本近交系进行遗传杂交以产生第一代F₁杂交体。

在一方面，本公开的方法使用此半合转基因F₁杂交体，以用于产生不成熟的雄穗，所述不成熟的雄穗可以与含有发育的小孢子的花药一起产生小花。小孢子是减数分裂的产物，并且因此，由于减数分裂期间的染色体互换事件，每种雄性配子都具有从亲本沿着重组染色体继承的基因的独特组合。在减数分裂期间，在处于半合状态的单个基因座上的单一拷贝转基因可以以1∶1的比率分离，这导致一半配子为野生型，另一半配子具有遗传的转基因基因座。减数分裂后，野生型和转基因配子继续原位发育，其中所有发育的小孢子暴露于胚发生诱导形态发育基因蛋白，所述胚发生诱导形态发育基因蛋白是从孢子体的绒毡层细胞中分泌的，源自半合F₁基因组中转基因的单拷贝的蛋白质翻译。从雄穗组织中分离小孢子后，本公开的方法在小配子发生期间诱导细胞重编程活性，以改善小孢子胚发生响应性和体外细胞重编程。使用本领域技术人员已知的方法选择非转基因小孢子衍生的胚状体。

在一方面，使两种不同的近交株进行异花受精，以产生在母本的受精穗中发育的第一代F₁合子胚。每个F₁合子胚具有两组(基因组)染色体，各自来自每个亲本。受精后，例如受精后8至16天，出于转化的目的，可以随后从母本穗中分离不成熟的F₁合子胚，以将编码胚发生诱导形态发育细胞重编程因子的多核苷酸稳定整合到F₁植物基因组中。以这种方式，可以选择在半合状态中具有单拷贝的胚发生诱导形态发育细胞重编程基因构建体的F₁植物，以对在花药中产生小孢子的雄穗组织取样。关于插入的胚发生诱导形态发育细胞重编程转基因，小孢子在配子发生过程中将以1∶1的比率分离，导致一半配子为野生型，另一半配子具有遗传的转基因胚发生诱导形态发育细胞重编程基因座。由此，本公开的方法允许从半合F₁杂交体中选择具有改善的胚发生响应性的F₂代野生型小孢子，以产生双单倍体群体。

在一方面，本公开的方法还提供了原位蛋白递送。所述方法包括转化玉米单倍体诱导系以稳定整合并且表达编一个或多个异源表达盒，所述异源表达盒编码两种主要功能活性：一种活性包含用于诱导体细胞胚发生和细胞重编程的蛋白质，另一种活性包含用于基因编辑目的的蛋白质。两种组分均可操作地连接到胚乳内(特别是胚周区(ESR)和或基底胚乳转移层(BETL))表达的一个或多个启动子。本公开的方法使用转化的单倍体诱导系以用于使靶植物的母本穗受精，以产生具有改善的双单倍体小植株再生和/或改善的经基因编辑的双单倍体后代再生的单倍体胚。在这些方法中，包含来自三倍体胚乳细胞内父本等位基因的胚发生诱导形态发育基因蛋白的异源表达盒的表达导致使所述蛋白质使用胚乳转移细胞特有的分泌信号肽通过转移细胞而易位到单倍体胚中。一旦将拯救的单倍体胚进行体外培养，本发明的方法则提供了胚发生水平和小植株再生能力提高的母本单倍体胚。

SEQ ID NO：1-49的总结示于表2。

表2.SEQ ID NO：1-49的总结。

在一方面，所公开的方法和组合物可用于以提高的效率和速度向植物细胞和器官引入多核苷酸，所述多核苷酸可用于靶向源自体细胞胚的植物的基因组中的特定位点以进行修饰。可以用所公开的方法和组合物引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，所述方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开案2013/0019349)，或通过使用位点特异性DNA切割技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。例如，所公开的方法和组合物可以用于将CRISPR-Cas系统引入植物细胞或植物中，以用于以下目的：对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，选择植物，缺失碱基或序列，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入植物或植物细胞的基因组中。因此，所公开的方法和组合物可以与CRISPR-Cas系统一起使用以提供用于修饰或改变在植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。在一方面，所述Cas内切核酸酶基因是植物优化的Cas9内切核酸酶，其中植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。

基因组编辑技术(如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)或归巢大范围核酸酶)可用于产生靶向基因组扰动。

所述Cas内切核酸酶由指导核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将所述双链断裂引入细胞的基因组中。所述CRISPR-Cas系统提供用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。进一步提供了使用指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的方法和组合物，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和编辑细胞基因组中的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定出基因组靶位点，就可以采用多种方法来进一步修饰靶位点，这样使得它们包含多种目的多核苷酸。所公开的组合物和方法可以用于引入CRISPR-Cas系统，所述系统用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可以位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点内部或外部。

CRISPR基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(又称SPIDR-间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由部分回文的短而高度保守的DNA重复序列(通常为24至40bp，重复从1至140次，也称为CRISPR重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，依赖于CRISPR基因座(WO2007/025097，2007年3月1日公开))间隔。

Cas基因包括通常与侧翼CRISPR基因座偶合、相关或相近或相邻的基因。术语“Cas基因”和“CRISPR相关的(Cas)基因”在本文中可互换地使用。

Cas内切核酸酶涉及由Cas基因编码的Cas蛋白质，其中所述Cas蛋白质能够将双链断裂引入DNA靶序列中。Cas内切核酸酶由指导多核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将所述双链断裂引入细胞的基因组中。如本文所用，术语“指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统”包括能够将双链断裂引入DNA靶序列的Cas内切核酸酶和指导多核苷酸的复合物。当由指导核苷酸识别靶序列时，Cas内切核酸酶紧邻基因组靶位点解开DNA双链体，并且切割两个DNA链，但前提是正确的前间区序列邻近基序(PAM)被大致定向在靶序列的3’端(参见2015年2月26日公开的WO/2015/026883的图2A和图2B)。在一方面，Cas内切核酸酶基因是Cas9内切核酸酶。

在另一方面，Cas内切核酸酶基因是植物、玉米或大豆优化的Cas9内切核酸酶，如但不限于US2016/0208272的图1A中所示的那些，并且通过引用并入本文。

术语“Cas蛋白”或“Cas内切核酸酶”或“Cas核酶”或“Cas多肽”是指由Cas(CRISPR-相关的)基因编码的多肽。Cas蛋白包括但不限于Cas9蛋白、Cas9直系同源物、Cpfl(Cas12)蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas 5、Cas7、Cas8、Cas10或这些的组合或复合物。当与适合的多核苷酸组分复合时，Cas蛋白可以是能够识别、结合特定多核苷酸靶序列的全部或部分、并任选地使特定多核苷酸靶序列的全部或部分产生切口或切割特定多核苷酸靶序列的全部或部分的“Cas内切核酸酶”。本文描述的Cas内切核酸酶包含一个或多个核酸酶结构域。Cas蛋白被进一步定义为天然Cas蛋白的功能性片段或功能性变体，或与天然Cas蛋白的至少50个、50至100个、至少100个、100至150个、至少150个、150至200个、至少200个、200至250个、至少250个、250至300个、至少300个、300至350个、至少350个、350至400个、至少400个、400至450个、至少500个或大于500个连续氨基酸共享至少50％、50％至55％、至少55％、55％至60％、至少60％、60％至65％、至少65％、65％至70％、至少70％、70％至75％、至少75％、75％至80％、至少80％、80％至85％、至少85％、85％至90％、至少90％、90％至95％、至少95％、95％至96％、至少96％、96％至97％、至少97％、97％至98％、至少98％、98％至99％、至少99％、99％至100％或100％的序列同一性并且保留至少部分活性的蛋白质。

术语“指导RNA/Cas内切核酸酶复合物”、“指导RNA/Cas内切核酸酶系统”、“指导RNA/Cas复合物”、“指导RNA/Cas系统”、“gRNA/Cas复合物”、“gRNA/Cas系统”、“RNA指导的内切核酸酶”和“RGEN”在本文中可互换地使用并且指能够形成复合物的至少一种RNA组分和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述指导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶引导至DNA靶位点，使Cas内切核酸酶能够识别、结合DNA靶位点并任选地使DNA靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)DNA靶位点。在一些方面，提供这些组分作为Cas内切核酸酶蛋白和指导RNA的核糖核蛋白复合物(“RNP”)。

本文描述了在小孢子胚发生期间或对于小孢子胚发生诱导的部分，用CRISPR相关(Cas)内切核酸酶进行基因组编辑的方法。在对指导RNA(或指导多核苷酸)和PAM序列进行表征后，包含Cas内切核酸酶和指导RNA(或指导多核苷酸)的核糖核蛋白(RNP)复合物可用于修饰靶多核苷酸，所述靶多核苷酸包括但不限于：其他生物(包括植物)中的合成DNA、分离的基因组DNA或染色体DNA。为了促进最佳表达和核定位(对于真核细胞)，可以如2016年11月24日公开的WO 2016186953中所述将包含Cas内切核酸酶的基因进行优化，然后通过本领域已知的方法将其作为DNA表达盒递送至细胞中。也可以将必需包含活性RNP的组分作为RNA(具有或不具有保护RNA免于降解的修饰)或作为有帽或无帽的mRNA(Zhang，Y.等人，2016，Nat.Commun.[自然通讯]7：12617)或Cas蛋白指导多核苷酸复合物(公开于2017年4月27日的WO 2017070032)、或其任何组合递送。另外，复合物的一个或多个部分可以从DNA构建体表达，而将其他组分作为RNA(具有或不具有保护RNA免于降解的修饰)或以带帽或不带帽的mRNA(Zhang等人2016Nat.Commun.[自然通讯]7：12617)或Cas蛋白指导多核苷酸复合物(公开于2017年4月27日的WO 2017070032)或其任何组合递送。

关于Cas内切核酸酶，术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语意指本公开的Cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中产生双链断裂的能力被保留。

关于Cas内切核酸酶，术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语意指本公开的Cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。这些片段和变体可以经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得。

除了双链断裂诱导剂，还可以实现位点特异性碱基转化，以工程化一个或多个核苷酸变化，从而在基因组中创建一个或多个编辑。这些包括例如，由C·G至T·A或A·T至G·C碱基编辑脱氨酶介导的位点特异性碱基编辑(Gaudelli等人，Programmable baseediting of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage[在无DNA切割时基因组DNA中A·T至G·C的可编程碱基编辑].″Nature[自然](2017)；Nishida等人“Targetednucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immunesystems[使用杂交体原核和脊椎动物适应性免疫系统进行靶向核苷酸编辑].”Science[科学]353(6305)(2016)；Komor等人“Programmable editing of a target base in genomicDNA without double-stranded DNA cleavage[在无双链DNA切割时基因组DNA中靶碱基的可编程编辑].”Nature[自然]533(7603)(2016)：420-4。与胞苷脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶蛋白融合的催化“死亡”或失活Cas9(dCas9)(例如本文公开的Cas9直向同源物的催化失活“死亡”形式)成为特异性的碱基编辑器，其可以改变DNA碱基而不会诱导DNA断裂。碱基编辑器转换C-＞T(或在相反链上，G-＞A)或腺嘌呤碱基编辑器将腺嘌呤转换为肌苷，从而在gRNA指定的编辑窗口内导致A-＞G变化。

如本文所用，术语“指导核苷酸”涉及两个RNA分子-包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA的合成性融合。在一方面，所述指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。

如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及可以与Cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得Cas内切核酸酶能够识别并任选地切割DNA靶位点。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代A、2′-氟代U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导核苷酸”。

指导多核苷酸可以是双分子(也被称为双链体指导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(被称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(被称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子指导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。两个单独的分子可以是RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一方面，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链体指导多核苷酸的第一个分子被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。所述cr核苷酸可以包含天然存在于细菌和古细菌中的cRNA的片段。在一方面，存在于在此公开的cr核苷酸中的在细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段的大小范围可以是，但并不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。

在一方面，包含CER结构域的双链体指导多核苷酸的第二个分子被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时。在一方面，指导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体化的RNA。

指导多核苷酸还可以是单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。“结构域”意指可以为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列的核苷酸的连续延伸。单指导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一方面，单指导多核苷酸包含连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含与CER结构域连接的VT结构域)，其中所述连接是包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。包含来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列的单指导多核苷酸可以被称为“单指导核苷酸”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导DNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导核苷酸-DNA”(当由RNA和DNA核苷酸的组合构成时)。在本公开的一方面，单指导核苷酸包含可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的cRNA或cRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述指导核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。使用单指导多核苷酸对比双链体指导多核苷酸的一个方面是，为了表达单指导多核苷酸，仅需要制造一个表达盒。

术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在此可互换地使用，并且包括与双链DNA靶位点的一个链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一个核苷酸序列结构域(VT结构域)与靶序列之间的互补％可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域的长度可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一方面，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列或其任何组合构成。

术语指导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在此可互换地使用，并且包括与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如指导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)或其任何组合构成。

在本公开的一方面，指导核苷酸包含II型CRISPR/Cas系统中的可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的cRNA(或cRNA片段)和tracrRNA(或tracrRNA片段)，其中所述指导核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。可以使用本领域已知的任何方法(例如但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植物细胞。

在一方面，还可以通过引入重组DNA分子间接地引入指导核苷酸，所述重组DNA分子包含可操作地连接到植物特异性启动子的相应指导DNA序列，所述植物特异性启动子能够在植物细胞中转录所述指导核苷酸。术语“相应指导DNA”包括与RNA分子相同的，但其中“T”取代RNA分子的每个“U”的DNA分子。

在一方面，经由粒子轰击或使用所公开的用于重组DNA构建体的农杆菌转化的方法和组合物来引入所述指导核苷酸，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到植物U6聚合酶III启动子的相应指导DNA。

基于保守的序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族，所述家族是LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H、和His-Cys box家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其DNA底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别表征为针对由独立的ORF、内含子、和内含肽编码的酶的前缀F-、I-、或PI-。在重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或在所述识别位点附近的多核苷酸切割。该切割活性可用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见，Sauer(1994)Curr Op Biotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(Integrase)或解离酶(Resolvase)家族。TAL效应子核酸酶是一类新的序列特异性核酸酶，其可以被用于在植物或其他生物的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(Miller，等人(2011)NatureBiotechnology[自然生物技术]29：143-148)。

锌指核酸酶(ZFN)是由锌指DNA结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，所述锌指结构域典型地包含两个、三个、或四个锌指，例如具有C2H2结构，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自Ms型内切核酸酶，例如Fokl的核酸酶结构域)的工程化DNA结合锌指结构域。另外的功能性可以融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录激活子结构域、转录抑制子结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶DNA中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于所述核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。

术语“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指植物细胞的基因组(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在所述多核苷酸序列处通过Cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源性位点，或者可替代地，靶位点可以与植物异源，从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比，靶位点可以发现于异源基因组位置中。

如本文所用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而意指对于植物的基因组是内源的或天然的靶序列，并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。在一方面，所述靶位点可以相似于由双链断裂诱导剂，例如LIG3-4内切核酸酶(美国专利公开2009-0133152A1(2009年5月21日公开))或MS26++大范围核酸酶(2012年6月19日提交的美国专利申请13/526912)特异性识别和/或结合的DNA识别位点或靶位点。

“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入植物基因组中的靶序列。此类人工靶序列可以在序列上与植物的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。

“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列：所述靶序列当与未改变的靶序列相比时包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。

以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。

实例

本公开的多个方面在以下实例中被进一步定义，其中除非另有说明，否则份数和百分数以重量计，并且度数以摄氏度计。尽管这些实例说明了本公开的多个方面，但仅是通过说明的方式给出的。从以上的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的多个方面的本质特性，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行它们的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，从上述说明书来看，除了本文所示出和描述的那些之外，各种修改对于本领域技术人员来说将是清楚的。此类修改也当视为落入所附权利要求的范围内。

实例1

胚发生诱导剂处理后小孢子胚发生改善

在分离小孢子之后，将ATCC40520小孢子(参见US 5,602,310，通过引用以其整体并入本文)在培养皿中在作为对照的9％蔗糖诱导培养基或补充有1μM终浓度的氯化血红素(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-A1drich)，目录号H9039)的9％蔗糖诱导培养基中在黑暗条件下在28℃下培养。

体外组织培养8天后，从对照和氯化血红素处理的ATCC40520组织培养物(以用于胚发生诱导)中的每个取得增殖胚样结构的四个生物重复样品，并且处理以用于使用本领域已知的方法进行基因表达分析(数据未显示)。

在分离小孢子之后，ATCC40520小孢子和EH(优良近交的，已知相对于ATCC40520基因型响应性较低)各自分别在培养皿中在作为对照的9％蔗糖诱导培养基或补充有1μM终浓度的氯化血红素的9％蔗糖诱导培养基中在黑暗条件下在28℃下培养。

处理(+/-氯化血红素)21天后，对ATCC40520和EH的小孢子表型进行评价。当观察到在周围完整的外壁中随机定向分裂而产生的单细胞衍生结构时，对多细胞结构(MCS)表型进行评价。如果周围的外壁破裂并且观察到细胞释放，则将响应记为增殖性胚样结构(ELS)。

如图1A(对照)和图1B(氯化血红素处理)所示，ATCC40520小孢子的氯化血红素处理增加了细胞增殖和胚样结构(ELS)的发育。处理(+/-氯化血红素)21天后，ELS的数量在响应性培养物中大约加倍。此外，如图1B所示，如通过球形胚状体比例的增加和非球形胚状体比例的降低所证明的，氯化血红素处理改善了胚样结构的质量。

如图1C所示，由相对于花粉相关转录物的相应减少的表达而言胚发生转录物增加的表达所指示的，对照和氯化血红素处理的ATCC40520小孢子的相应基因表达分析示出改善的细胞重编程命运。

如图1D(对照)和图1E(氯化血红素处理)所示，在培养21天后，近交EH小孢子的氯化血红素处理增加了响应培养物中的细胞增殖。如图1F所示，相对于近交对照EH小孢子，氯化血红素处理增加了用MCS表型和ELS表型评价的近交EH小孢子的百分比。

在分离小孢子之后，将ATCC40520小孢子在培养皿中在作为对照的9％蔗糖诱导培养基或补充有变化浓度的小分子化合物的9％蔗糖诱导培养基中进行培养，所述小分子化合物包括：N-[(2R)-2，3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘代苯胺基)苯甲酰胺，本文称为“PD0325901”(ESI BIO 1010大西洋大街，102幢，阿拉米达，加利福尼亚州94501)、蒽(1，9-cd)吡唑-6(2H)-酮，本文称为“SP600125”(ESI BIO 1010大西洋大街，102幢，阿拉米达，加利福尼亚州94501)、4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑，本文称为“SB203580”(ESI BIO 1010大西洋大街，102幢，阿拉米达，加利福尼亚州94501)和N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)-1，3-噻唑-4-甲酰胺，本文称为“噻唑维”(ESI BIO1010大西洋大街，102幢，阿拉米达，加利福尼亚州94501)。将体外组织培养物在28℃下在黑暗条件下孵育，并且在7天后进行评价。

如图2A-图2P示出使用EVOS FL自动数字显微镜(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))以2倍放大倍数拍摄的图像，观察到响应于小分子化合物处理的细胞增殖增加。图2A-图2P示出改善的多细胞结构比例，观察到相对于未处理的对照细胞而言具有增加的球形形状的暗细胞。在使用每种小分子化合物处理激酶抑制剂进行体外培养开始后的7天内，观察到外壁破裂(为小孢子胚生长和进一步发育中的重要步骤)，这表明对小孢子胚发生的诱导增加以及细胞重编程的效率提高。

因此，本公开提供了使用胚发生诱导剂(例如像，小分子化合物)来诱导胚发生并且从分化的细胞或单倍体配子细胞产生重编程细胞的方法。如下文更充分描述的，小分子化合物处理激酶抑制剂可以与胚发生诱导形态发育基因蛋白产物组合使用，以促进细胞的细胞重编程并且增加小孢子胚发生响应性。

实例2

将玉米小孢子与表达胚发生诱导多肽的饲养层悬浮细胞培养物共培养诱导小孢 子胚发生

产生和维持玉米悬浮细胞培养物的方法是本领域技术人员已知的。将分离的小孢子与稳定表达胚发生诱导形态发育基因多肽如WUSCHEL多肽(SEQ ID NO：2))和ZmODP2多肽(SEQ ID NO：20)(为一种AP2/ERF转录因子)的玉米悬浮细胞共培养，以确定用表达胚发生诱导形态发育多肽的玉米悬浮细胞(“饲养细胞”)调节的培养基是否支持在非转基因的所分离小孢子中小孢子胚发生响应改善。如上所述分离小孢子。使用

牌12mm

0.4μm孔聚碳酸酯膜细胞培养插入物(西格玛-奥德里奇公司，目录号CLS3401)，在4％蔗糖液体诱导培养基中将分离的野生型小孢子和转基因悬浮饲养细胞分隔共培养。首先将分离培养基中的小孢子添加到孔中，然后添加Transwell 0.4μm孔聚碳酸酯膜细胞培养插入物，最后将饲养细胞添加到聚碳酸酯膜细胞培养插入物中。调整最终培养基的体积以确保所有细胞均浸没在4％蔗糖液体诱导培养基中。

相反，所述方法可以包括首先将悬浮细胞添加到孔中，然后添加聚碳酸酯膜细胞培养插入物，最后将分离的小孢子添加到聚碳酸酯膜细胞培养插入物中。

共培养约一个月后，将分离的野生型小孢子从共培养条件(4％蔗糖液体诱导培养基)转移到固化的4％蔗糖诱导培养基(0.6％琼脂糖)中，用于随后的胚发生发育。与表达WUSCHEL和ODP2胚发生诱导形态发育基因多肽的组合的转基因饲养细胞共培养的野生型小孢子展现出：在固化的4％蔗糖诱导培养基上放置后的14天内，多细胞结构的发育增强，而即使在固化的4％蔗糖诱导培养基上32天后在未处理的孔(缺少转基因饲养细胞的孔)中也未观察到相应的多细胞结构的发育水平。

这些结果显示，野生型小孢子与表达WUSCHEL和ODP2胚发生诱导形态发育基因多肽的组合的转基因饲养细胞的共培养和/或野生型小孢子在用饲养细胞上清液调节的培养基中的培养支持在非转基因小孢子中小孢子胚发生响应的改善。

实例3

在小孢子胚发生方面对玉米小孢子与外源多肽的非原位共培养的评价

使用表达编码ZmWUS2-六组氨酸标签(SEQ ID NO：1)序列的质粒(所述质粒转化到DH10Bac细胞(赛默飞世尔科技公司，目录号10361012)以产生杆状病毒)的外源表达系统，进行WUSCHEL蛋白表达和纯化。将杆状病毒感染的SF9昆虫细胞(赛默飞世尔科技公司，目录号12552014)在27℃下孵育72小时。通过离心收获感染的昆虫细胞。

使用可商购的蛋白质纯化方法进行重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白(SEQ ID NO：2)的纯化。

从近交EH分离小孢子后，通过使505μL的4％蔗糖诱导培养基、37.5μL的分子级牛血清白蛋白(BSA；20mg/ml)(西格玛-奥德里奇公司，目录号B8667)和7.5μL的蛋白酶抑制剂(西格玛-奥德里奇公司，目录号P9599)与250μL的纯化的重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白合并，对每种培养物进行ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白处理。轻轻混合后，将溶液在无菌环境中使用0.2μm过滤器(颇尔公司(Pall Corporation)，目录号4612)进行过滤除菌。任选地，将分离培养基用还原性L-谷胱甘肽(西格玛-奥德里奇公司，目录号G4251)缓冲。通过将0.075g的还原性L-谷胱甘肽添加到50mL的无菌水中，混合，然后将所述溶液进行过滤除菌，产生还原性L-谷胱甘肽(1.5mg/mL)储备溶液。通过将15.63μL的还原性L-谷胱甘肽储备溶液添加到15.60mL的分离培养基中以产生最终的1.5mg/L浓度，产生工作溶液。

如图3A所示，在两个各自的重复样品重复1(泳道2)和重复2(泳道3)中，以上纯化的所纯化的重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白样品的12％Bis-tris SDS-PAGE电泳凝胶的考马斯染色具有相似的总蛋白质水平。如图3B所示，使用一级抗His单克隆抗体(如上所述)和二级抗小鼠-HRP抗体(如上所述)对纯化的重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白样品的蛋白质印迹分析证实了预期的所纯化的重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白的存在。此纯化的重组ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白用于下述非原位处理。

当与对照(在不存在纯化的ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白的情况下培养的小孢子)(图3C)相比，当用纯化的ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白处理时，如图3D所示，顽固性优良近交的所分离小孢子展现改善的小孢子响应性和胚发生诱导。胚状体发育揭示了具有根毛的胚柄(图3D)，这证明了野生型小孢子中改善的细胞重编程和活化的小孢子胚发生。

实例4

在小孢子胚发生方面对玉米小孢子与融合至外源细胞穿透肽的外源多肽的非原 位共培养的评价

使用表达编码γ玉米醇溶蛋白-ZmWUS2-六组氨酸标签(SEQ ID NO：46)序列的质粒(所述质粒转化到DH10Bac细胞以产生杆状病毒)的外源表达系统，进行γ玉米醇溶蛋白-ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白表达和纯化。将杆状病毒感染的SF9昆虫细胞在27℃下孵育72小时。通过离心收获感染的昆虫细胞。如实例3中所述进行重组γ玉米醇溶蛋白-ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白(SEQ ID NO：47)的纯化。

当与对照(在不存在纯化的γ玉米醇溶蛋白-ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白的情况下培养的小孢子)相比时，预期用纯化的γ玉米醇溶蛋白-ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白处理的所分离小孢子展现改善的小孢子响应性和胚发生诱导。

实例5

使用蛋白质转染将改善的外源多肽蛋白递送到小孢子中

通过将250μL甲醇添加到含有干燥的转染试剂的管中，以最高速度涡旋30秒，并且将10μL的Pro-ject^TM加甲醇分配到1.5mLEppendorf管中，使用基于阳离子脂质的Pro-Ject^TM转染试剂(赛默飞世尔科技公司，目录号89850)进行转染试剂制备。在室温下在化学通风橱中将转染试剂从管中蒸发4小时，然后将管在-20℃下保存直至使用。

使用时，将含有50ng的纯化的ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白的100μL分离培养基添加到每个管中，并且将900μL小孢子培养基分配到每个转染管中以重新水化转染试剂并且囊封蛋白质。将1mL体积的此溶液与1mL体积的从EHxGR遗传杂交的F₁杂交体雄穗分离的小孢子合并。将小孢子悬浮于分离培养基中，并且在24孔微量滴定板(实验室安全供应公司(LabSafety Supply)，目录号11L794)的孔中各自分配2mL体积。

将分离培养基进一步补充牛血清白蛋白、蛋白酶抑制剂和还原性L-谷胱甘肽，具有或没有基于阳离子脂质的Pro-Ject^TM转染试剂，以及具有或有ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白处理(ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白缓冲液作为对照以便与ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白比较)。

将每个板用石蜡膜密封并且在28℃下在黑暗条件下孵育。72小时后，将直径大于或等于70μm的细胞收集起来，并且使用Fisherbrand^TM细胞过滤网(赛默飞世尔科技公司的飞世尔科技，目录号FBH#22-363)洗涤，并且在35mm组织培养皿中用1.5mL的9％蔗糖诱导培养基培养。将每个板用石蜡膜密封并且在28℃下在黑暗条件下孵育。18天后，将所有的细胞收集起来，并且使用70μm Fisherbrand^TM细胞过滤网冲洗，并且评价细胞重编程的活化和小孢子胚发生的诱导。

通过计数质壁分离的、塌陷的细胞(即“非存活”)和与原始状态相对应的半透明球形细胞(即“存活”)来评价小孢子活力。分离后72小时，并且使用4％蔗糖液体诱导培养基的体外培养生长后，细胞活力示出在ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白缓冲液(对照处理)中培养的小孢子中观察到平均2.1倍的改善，以及在ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白(实验处理)中培养的小孢子中观察到细胞活力平均5.1倍的改善。

如图4A所示，培养18天后，相对于ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白处理的细胞(实验处理)(图4B)，对照处理(无ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白)中较少的细胞存活。在不存在ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白的情况下使用转染试剂无法促进任何进一步的胚发生发育(图4C)，而在与基于阳离子脂质的Pro-Ject^TM转染试剂组合的ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白(导致改善了细胞重编程的活化和小孢子胚发生的诱导)中培养的小孢子中看到了细胞增殖(图4D)。

实例6

小孢子电穿孔提供了改善的外源多肽递送

根据制造商的说明，使用了

转染系统(赛默飞世尔科技公司，目录号MPK5000)和

试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号MPK10025)。通过使12.5μL的ZmWUS2-六组氯酸标签蛋白(SEQ ID NO：2；10μg总量，0.8μg/μL储备液)与12.5μLLipofectamin 3000混合，然后在室温下孵育30分钟，制备非原位ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白处理。将蔗糖添加到重悬浮缓冲液(缓冲液R)中至0.4M的终浓度，并且过滤除菌。

将分离的小孢子重悬于2％(V/V)二甲基亚砜(DMSO)/9％蔗糖诱导培养基溶液中，并且在室温下孵育15分钟，将小孢子沉淀并且除去上清液。将小孢子用磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco^TM 10010023)洗涤3次，重悬于电解质缓冲液E(赛默飞世尔科技公司，目录号MPK5000)中，并且与ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白/Lipofectamine 3000溶液混合，然后室温孵育10分钟，并且然后冰上孵育10分钟。

DMSO介导的电穿孔用于通过多个脉冲条件使ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白对分离的小孢子的摄取增加。

电穿孔后，将小孢子在冰上孵育10min，然后在室温下孵育5分钟，然后将100μL的9％蔗糖诱导培养基添加到每个电穿孔的细胞样品中，以5分钟的间隔重复三次。质壁分离复原后，将细胞在使用SeaPlaque^TM琼脂糖(0.6％)固化分离培养基上铺板。

当与对照(在不存在纯化的ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白的情况下培养并且不经受电穿孔的小孢子)相比时，预期用纯化的ZmWUS2-六组氨酸标签蛋白合并电穿孔处理的所分离小孢子辰现改善的小孢子响应性和胚发生诱导。

实例7

玉米小孢子活化株的产生

表达盒被设计为在小孢子分离前增加原位小孢子胚发生。具体地，使用了处于可操作连接中的编码以下的多核苷酸：Ms44启动子(SEQ ID NO：3)、用接头序列(SEQ ID NO：8)与WUSCHEL胚发生诱导形态发育基因序列(SEQ ID NO：6)融合的Ms44信号肽序列(SEQ IDNO：4)、荧光AC-GFP1基因(SEQ ID NO：10)、和Ms44终止子序列(SEQ ID NO：12)(图5A)。此构建体促进了胚发生诱导形态发育基因蛋白的蛋白质表达和从绒毡层细胞到花药的子房室的转运，这样诱导细胞重编程并且在绒毡层细胞的时空定位内启动小孢子胚发生，导致在小配子发生期间蛋白质加工以及将WUSCHEL胚发生调节因子分泌到子房室中。可用在本公开的方法中的另外的表达盒在图5B和图5C中示出。

将表达盒掺入农杆菌属转化载体中。使用本领域已知的标准方案进行农杆菌属转化。可替代地，可以通过通常已知的生物射弹转化方法将转化载体引入植物细胞。

在转化和选择半合的经转化的植物之后(参见图6A)，在开花期从植物获得花药和叶样品，以测试胚发生诱导形态发育基因蛋白的存在。将2至3个T₀半合转化体的花药和叶组织合并为池化样品，从每个池中提取蛋白质，并且使用识别WUSCHEL表位的定制多克隆抗体和抗GFP抗体进行蛋白质印迹。

蛋白质印迹(图6B)示出花药组织中在约60kD处代表WUSCHEL-GFP融合蛋白预期蛋白质大小的条带，并且确认了WUSCHEL-GFP融合蛋白在花药中而不在叶中的组织特异性表达以及胚发生诱导形态发育基因蛋白的时空表达。

将小孢子从T₀半合转化体中分离并且进行培养。培养6天后，观察到小孢子胚发生的开始，这由孢粉素外被内多细胞结构的存在和/或小孢子外壁的破裂所证明。培养11天后，观察到胚样结构。这些结果确认了编码形态发育基因多肽的胚发生诱导多核苷酸的原位表达诱导细胞重编程并且启动小孢子胚发生。

实例8

从半合小孢子活化亲本中选择野生型小孢子胚

实例7中产生的小孢子活化半合T₀植物(图6A)是自花授粉的，并且分选了基因型。选择单拷贝纯合T₁小孢子活化事件。在单拷贝事件纯合T₁小孢子活化株和亲本2野生型近交株之间进行遗传杂交，以产生半合F₁杂交体(参见图7)并且最终在玉米中产生父本配子衍生的(产雄性特征的)双单倍体的群体。可替代地，将单拷贝半合T₀小孢子活化事件与亲本2野生型近交株杂交以产生半合F₁杂交体。类似地，将单拷贝半合T₁小孢子活化事件与亲本2野生型近交株杂交以产生半合F₁杂交体。还通过无效分离子植物(小孢子活化半合T₀转基因植物的后代)与相同的亲本非转基因植物的控制杂交产生F₁杂交体(“无效”)。

在半合F₁杂交体生长后，在生殖组织中发生小配子发生，并且以孟德尔方式分离转基因插入位点。独立于配子发生，在每个绒毡层细胞中，用编码胚发生诱导形态发育基因多肽的单拷贝异源表达盒(图5A)转化的二倍体孢子体绒毡层细胞以半合状态表达并且分泌胚发生诱导形态发育多肽。在小孢子囊发育期间，将胚发生诱导WUSCHEL-GFP融合多肽递送到所有小孢子进行发育的子房室中，这允许所有的小孢子在体内被胚发生诱导形态发育多肽处理，改善了小孢子分离后的体外小孢子胚发生响应。

如图8A所示，当与经受相同的分离后组织培养条件的无效或野生型F₁杂交体小孢子相比时，从半合F₁杂交体中分离并且经受标准组织培养条件(无任何胚发生诱导化合物的诱导培养基)的小孢子在分离后展现胚状体的产生增加和/或胚样结构的产生增加。唯一发芽并且发育成植物的胚状体衍生自半合F₁杂交体供体植物(图8B)，而从无效或野生型F₁供体植物分离的胚状体没有产生任何植物。

使用本领域已知的方法对此再生的小植株进行基因分型，并且沿着玉米基因组绘制其遗传标记物的遗传性(图8C)。如图8C所示，沿着每个玉米染色体的亲本等位基因的遗传性与从杂交体亲本预期的减数分裂重组模式一致，因此确认了这是小孢子衍生的植物。如这些结果证明，本公开的方法在无需授粉控制方法或无需将自体受精系繁殖成同基因态的情况下开发了重组近交系。

从半合F₁杂交体的雄穗中分离的小孢子(在小配子发生期间已经在子房室中经历原位细胞重编程和开始小孢子胚发生)可以经受组织培养方法，所述组织培养方法包括但不限于如本文所述的进一步的细胞重编程和胚发生诱导方法。

使用本领域已知的方法，可以对来自半合F₁杂交体的野生型小孢子衍生的胚进行基因分型并且进行选择，以产生父本配子(产雄性特征的)双单倍体群体(图7)。

可以通过进一步繁殖所选择的稳定转基因个体(包括使纯合转基因系自体受精的方法，或通过使半合系自体受精随后选择纯合后代)来维持所需的单拷贝纯合T₁小孢子活化事件，以用作小孢子活化亲本。

出于一些育种目的，可能特别感兴趣的是产生来自以下的分离材料：杂交(包括但不限于衍生自半合F₁杂交体的F₂或更靠后的子代)，第一代或更靠后的代之后的回交材料和/或回交衍生材料的更靠后的自体受精代，和/或使用在远缘物种之间的远缘杂交(如通过使通常不会彼此有性繁殖的物种或属进行杂交(玉米x小麦，玉米x高粱，玉米x水稻等)而产生的种间和属间杂交体)。本文公开的方法可特别用于此类育种目的。

实例9

父本配子衍生的双单倍体的产生

然后将通过本文公开的用于发育胚的任何方法产生的单倍体小孢子与一定量的染色体加倍剂接触，以促进染色体加倍并且从处理的由单倍体小孢子衍生的单倍体胚、胚样结构或胚状体再生纯合二倍体植物。可以在小孢子胚发生、胚成熟或植物再生之前、期间或之后，使单倍体小孢子细胞与加倍剂接触。多种具有染色体加倍特性的化合物是本领域已知的，包括但不限于表1中公开的那些。

例如，将通过本文公开的任何方法产生的由小孢子衍生的胚状体转移到含有秋水仙碱的培养基中约24小时，然后转移到不含秋水仙碱的培养基中以获得双单倍体胚的群体。大约6-10天后，将小植株转移到光培养室。大约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地上，并且在生长室中生长1周，并随后在温室中生长另外的1-2周，然后转移到盆中并生长至成熟。

实例10

具有胚发生诱导特性的玉米小孢子活化株的产生

为了改善通过小孢子表达盒对胚发生诱导形态发育基因蛋白的转运、易位和/或摄取，构建了相似于图5A所示的那些并且将其用于本公开的方法中。例如，将WUSCHEL多核苷酸用以下多核苷酸替代：编码与WUSCHEL多肽的C末端融合的根癌农杆菌virF蛋白的有36个氨基酸的C末端转位信号的多核苷酸(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)，编码与WUSCHEL多肽的C末端融合的根癌农杆菌virF蛋白的有127个氨基酸的C末端转位信号的多核苷酸(SEQID NO：15和SEQ ID NO：16)，编码与WUSCHEL多肽的C末端融合的来自毛根农杆菌的根诱导(Ri)质粒的GALLS多肽的C末端27个氨基酸的多核苷酸(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)，编码与包含Ms44分泌信号肽(SEQ ID NO：5)、ODP2多肽(SEQ ID NO：20)和C末端CPP多肽(SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30中的任一个)的翻译融合蛋白组合的在此实例10中所述的WUSCHEL序列或在实例3和4中所述的WUSCHEL序列中任一个的多核苷酸，以及编码与糖皮质激素受体(GR)融合的WUSCHEL多肽的多核苷酸(SEQ ID NO：48和SEQ ID NO 49)。

当如实例7所述使用表达盒时，预期在小孢子分离之前原位小孢子胚发生增加。预期这些表达盒促进了胚发生诱导形态发育基因蛋白的蛋白质表达和从绒毡层细胞到花药的子房室的转运，以诱导细胞重编程并且在绒毡层细胞的时空定位内启动小孢子胚发生，导致在小配子发生期间蛋白质加工以及将WUSCHEL胚发生调节因子分泌到子房室中。在编码与糖皮质激素受体(GR)融合的WUSCHEL蛋白(SEQ ID NO：48和SEQ ID NO 49)的表达盒的情况下，预期通过将动物激素类似物外部应用到体外组织培养物将蛋白活性有条件地定位于细胞核。此处理后，可活化的嵌合转录因子提供了一种活化小孢子胚发生以改善胚再生和植物繁殖的手段。

如实例8所述，使用如实例7中产生的小孢子活化半合T₀植物(包含此实例10中以上所述的表达盒)，以产生半合F₁杂交体并且最终在玉米中产生父本配子衍生的(产雄性特征的)双单倍体的群体。在小孢子囊发育期间，预期将胚发生诱导WUSCHEL融合多肽递送到所有小孢子进行发育的子房室中，这允许所有的小孢子在体内被胚发生诱导形态发育多肽处理，改善了小孢子分离后的体外小孢子胚发生响应。预期当与经受相同的分离后组织培养条件的无效或野生型F₁杂交体小孢子相比时，从半合F₁杂交体中分离并且经受标准组织培养条件(无任何胚发生诱导化合物的诱导培养基)的小孢子在分离后展现胚状体的产生增加和/或胚样结构的产生增加。从半合F₁杂交体的雄穗中分离的小孢子(在小配子发生期间已经在子房室中经历原位细胞重编程和开始小孢子胚发生)可以经受组织培养方法，所述组织培养方法包括但不限于如本文所述的进一步的细胞重编程和胚发生诱导方法。另外，使用本领域已知的方法，可以对来自半合F₁杂交体的野生型小孢子衍生的胚进行基因分型并且进行选择，以产生父本配子(产雄性特征的)双单倍体群体。可以通过进一步繁殖所选择的稳定转基因个体(包括使纯合转基因系自体受精的方法，或通过使半合系自体受精随后选择纯合后代)来维持所需的单拷贝纯合T₁小孢子活化事件，以用作小孢子活化亲本。出于一些育种目的，可能特别感兴趣的是产生来自以下的分离材料：杂交(包括但不限于衍生自半合F₁杂交体的F₂或更靠后的子代)，第一代或更靠后的代之后的回交材料和/或回交衍生材料的更靠后的自体受精代，和/或使用在远缘物种之间的远缘杂交(如通过使通常不会彼此有性繁殖的物种或属进行杂交(玉米x小麦，玉米x高粱，玉米x水稻等)而产生的种间和属间杂交体)。本文公开的方法可特别用于此类育种目的。

当如实例3-6中所述使用此实例10中以上所述的序列时，预期当与对照相比时，如此处理的小孢子展现改善的小孢子响应性和胚发生诱导。

实例11

来自半合T0转基因F1杂交体的野生型小孢子胚的选择

将野生型近交亲本1与野生型近交亲本2杂交，以提供在母本的受精穗中发育的F₁合子胚。每个F₁合子胚具有两组染色体，各自来自每个亲本。受精后，例如受精后8至16天，出于转化的目的，分离来自母本穗的不成熟的F₁合子胚，以将本文所述的任一个表达盒整合到F₁植物基因组中。

选择具有单拷贝基因构建体的植物，所述基因构建体以半合状态包含本文所述的任何表达盒，其中花药内发育的小孢子的细胞重编程在原位发生(参见图9)。

在配子发生期间，小孢子以1∶1的比率分离，这导致一半配子为野生型，另一半配子为转基因型(具有遗传的转基因基因座)。预期野生型小孢子将具有来自半合T₀代F₁杂交体的改善的胚发生响应性，以产生双单倍体群体(图9)。

实例12

用胚乳活化性状转化玉米母本单倍体诱导系

具有处于可操作连接中的三个表达盒的构建体(见图10)用于产生稳定的玉米胚乳活化系。

第一表达盒包含处于可操作连接中的编码以下的多核苷酸序列：ZmBETL9启动子和5’非翻译区(SEQ ID NO：33)、N末端ZmBETL9基底胚乳转移层分泌信号肽(SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32)、和与根癌农杆菌virF蛋白的有127个氨基酸的C末端易位信号融合的WUSCHEL肽(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)(可替代地，可以使用本文所述的任何WUSCHEL变体翻译融合蛋白并且所述WUSCHEL变体翻译融合物可操作地连接到在基底胚乳转移层中表达的启动子)。第二表达盒包含处于可操作连接中的编码以下的多核苷酸序列：ZmBETL9样启动子和5’非翻译区(SEQ ID NO：36)、N末端ZmBETL9样基底胚乳转移层分泌信号肽(SEQID NO：34和SEQ ID NO：35)、有445个氨基酸的C末端ODP2肽、GALLS^C27肽、最小FLAG表位(SEQID NO：37和SEQ ID NO：38)、以及KNOTTED1细胞穿透肽(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)(可替代地可以使用本文所述的任何ODP2变体翻译融合蛋白，并且所述ODP2变体翻译融合蛋白可操作地连接到在基底胚乳转移层中表达的启动子)。

第三表达盒，用于验证在胚乳细胞中父本等位基因的表达，包含处于可操作连接中的编码可操作地连接到ZmFEM2启动子的Anemonia majano青色荧光蛋白(CFP)的多核苷酸序列(SEQ ID NO：39)。(图10)。

通过农杆菌属介导的转化，将玉米单倍体诱导系自体受精12-14天后从发育的玉米籽粒中分离的不成熟二倍体胚外植体用胚乳活化性状构建体(参见图10和图11)转化。基于父本基因组对于胚的贡献，诱导系在二倍体胚中表达R-scm2颜色标记物(Kato A.(2002)Plant breeding[植物育种]121：370-377和美国专利申请20030005479，通过引用以其整体并入本文)。所述胚颜色标记物可用于鉴定由于单倍体胚中不存在父本基因组而不表达R-scm2形态标记物的母本单倍体胚。另外，将此诱导系先前用表达盒稳定转化，所述表达盒包含编码可操作地连接到黄色荧光蛋白(YFP)的玉米泛素启动子的多核苷酸，所述黄色荧光蛋白允许分别基于检测YFP蛋白的表达的存在或不存在，从母本单倍体胚识别具有父本基因组贡献的二倍体胚。

农杆菌属介导的诱导株的转化产生了转基因玉米胚乳活化单倍体诱导半合T₀系(图11)，所述半合T₀系表达具有N末端分泌信号肽的两种胚发生诱导形态发育融合蛋白，每种融合蛋白均在胚乳启动子的调节下(这些融合蛋白在三倍体胚乳细胞中表达，更具体地在基底胚乳转移层细胞中表达，这允许在母本单倍体胚中进行蛋白易位和细胞重编程，并且改善了母本衍生的玉米单倍体植物的产生。

实例13

使用玉米母本单倍体诱导胚乳活化株改善双单倍体玉米植物的小植株再生

选择、杂交两个亲本系(亲本1野生型测试株和亲本2野生型测试株)，然后种植所得的育种杂交F₁种子并且使其生长，并且将这些育种杂交F₁植物的雌花或穗用于受精(花粉接受器)。种植来自实例12中产生的转基因玉米胚乳活化单倍体诱导半合T_o系的种子并且使其生长，并且将这些转基因玉米胚乳活化单倍体诱导半合T₀植物的雄花或雄穗用于受精(花粉供体)(参见图11)。进行诱导杂交，即在穗丝出现之前对花粉接受器的穗的芽装袋，并且用从花粉供体植物的花药中收集的花粉粒对这些花粉接受器的穗的穗丝进行授粉(参见图11)。此诱导杂交采用在玉米育种项目中常规使用的方法，以避免任何外来花粉污染。

此诱导杂交授粉方法导致每个穗中以25％到约50％范围的频率产生单倍体胚。在授粉后约9-16天，收获未成熟的穗。将未成熟的穗在30％高乐氏漂白剂加0.5％米克罗(Micro)洗涤剂中进行表面灭菌20分钟，用无菌水冲洗两次，将发育籽粒中的未成熟的胚解剖，并且在无菌条件下置于植物组织培养基上。使用本领域已知的方法，植物组织培养基可以补充有染色体加倍剂(参见表1)以产生玉米双单倍体。

在诱导杂交中受精的植物会发育出二倍体胚和单倍体胚二者，并且所有的胚乳组织都是三倍体，在胚乳细胞中具有3组染色体，其中两组染色体来自花粉接受器，一组染色体来自花粉供体。如分别通过检测ZmFEM2：CFP胚乳颜色标记物的存在或不存在所检测的，此诱导杂交允许在存在和不存在表达胚乳活化性状的父本等位基因之间进行直接比较。

在如上所述对野生型胚乳或具有胚乳活化性状的胚乳进行胚乳评价之后，在两个胚乳类别中拯救并且分离单倍体胚，并且然后通过确定从诱导系继承的标记物基因产物来分选二倍体和单倍体胚。父本对胚的贡献可通过YFP表达来检测，从而检测到表达父本等位基因的二倍体胚，而单倍体胚则是无色的并且被观察为YFP阴性。

使用解剖刀将两类单倍体玉米胚(从野生型胚乳分离的那些(CFP阴性胚乳)和在原位与衍生自胚乳活化性状的形态发育蛋白接触后分离的那些(CFP阳性胚乳))分离，并且置于含有秋水仙碱的培养基上。大约24小时后，将胚转移到不含秋水仙碱的培养基中，并且置于黑暗中。大约6-10天后，将小植株转移到光培养室。大约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地上，并且在生长室中生长1周，随后在温室中生长另外的1-2周，然后转移到盆中并生长至成熟。这些植物是双单倍体植物的异质群体。使这些可育的双单倍体玉米植物自交，并且出于育种目的对其进行评价。

相对于使用常规(野生型)单倍体诱导系产生的单倍体胚，预期通过与胚发生诱导形态发育基因蛋白(从胚乳转移细胞被转运到胚)原位接触发育而来并且用染色体加倍剂处理的单倍体胚具有增加的小植株再生水平。

对于在诱导杂交中受精的植物，二倍体胚的平均胚大小是相等的，与胚乳活性无关。与具有野生型胚乳的单倍体胚相比，在存在形态学发育基因蛋白的情况下，在原位发育的拯救胚的平均大小具有增加的单倍体胚大小(图12A)。这些结果表明，衍生自母本单倍体胚的植物细胞与衍生自胚乳活化性状的胚发生诱导形态发育翻译融合蛋白的原位接触改善了单倍体胚的发育。

对经秋水仙碱处理并且然后转移到光培养室的拯救胚各自进行评价，以评估响应于胚乳中原位发育基因表达的单倍体植物再生。在父本单倍体诱导系中，单倍体植物的再生具有响应于编码胚乳活化性状的转基因的拷贝数丰度、以及因此蛋白质剂量的正相关(图12B)。在光条件下在体外培养期间，胚乳中增加的WUSCHEL和ODP2融合蛋白水平对从单倍体胚再生的小植株具有积极影响，并且当与染色体加倍处理组合实践时，将改进使用母本(产雌性特征的)系统产生双单倍体玉米植物的生产力。

实例14

用胚乳活化-编辑性状转化玉米母本单倍体诱导系

具有处于可操作连接中的表达盒的构建体(参见图13A和图13B)用于产生稳定的玉米胚乳活化系，所述稳定的玉米胚乳活化系用于促进选择野生型F₁₂衍生的母本单倍体的方法中，所述野生型F_1：2衍生的母本单倍体是使用“胚乳活化”系与核酸酶蛋白递送方法相组合进行诱导杂交而产生的，以改进基因编辑后代的母本双单倍体产生(参见图14)。

第一构建体包含含有多核苷酸序列的表达盒，所述多核苷酸序列编码处于可操作连接中的ZmBETL9样启动子和5’非翻译区(SEQ ID NO：36)、N末端ZmBETL9样基底胚乳转移层分泌信号肽(SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35)、ODP2肽(SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)、明脉扁刺蛾β四体病毒多顺反子样T2A接头(SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41)(介导核糖体跳跃事件，从而使得能够从一个mRNA产生多个分开的肽产物)、N末端ZmBETL9样基底胚乳转移层分泌信号肽(SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35)以及WUSCHEL肽(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)。(可替代地，可以使用本文所述的任何WUSCHEL和/或ODP2变体翻译融合蛋白，并且所述翻译融合物可操作地连接到在基底胚乳转移层中表达的启动子)。

相同的表达盒或第二构建体包含处于可操作连接中的编码以下的多核苷酸序列：BETL9启动子和5’UTR(SEQ ID NO：33)、N末端ZmBETL9基底胚乳转移层分泌信号肽(SEQ IDNO：31和SEQ ID NO：32)、以及酿脓链球菌Cas9(SpCAS9 MO)(SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43)(可替代地，可以使用本文所述的任何基因编辑核酸酶，并且所述基因编辑核酸酶可操作地连接到在基底胚乳转移层中表达的启动子)。此外，介导核糖体跳跃事件从而使得能够从一个mRNA产生多个分开的肽产物的明脉扁刺蛾β四体病毒多顺反子样T2A接头(SEQ IDNO：40和SEQ ID NO：41)可用于在第二构建体中组合两个或更多个基因编辑组分。

在具体的配置中，第二构建体的第二表达盒被设计为转录与调节元件处于可操作连接中的指导RNA分子(参见Svitashev等人，Plant Physiol[植物生理学](2015)169：931-45(使用具有多种指导RNA的ZmU6启动子)。根据基因编辑靶标，设计指导RNA。可替代地，使用与指导RNA处于可操作连接中的其他启动子，例如胚乳偏好性启动子。此外，可以使用本领域已知的方法(包括但不限于生物射弹递送、电穿孔或农杆菌属介导的递送)将合成指导RNA分子或合成指导RNA分子的组合外源地递送到具有预先整合的基因编辑性状的细胞中，如先前由Svitashev等人，(2015)描述的。在另一个选择中，所述指导RNA不必从表达盒表达，而可以例如在培养基中外源递送。类似地，包含指导RNA和Cas内切核酸酶的核糖核蛋白(“RNP”)复合物可以通过外源应用递送至胚发生的母本单倍体胚。将RNP直接递送到胚发生的母本单倍体胚的这种递送不需要涉及转化步骤。

通过农杆菌属介导的转化，将玉米单倍体诱导株自体受精12-14天后从发育的玉米籽粒中分离二倍体胚外植体，用胚乳活化性状包构建体(参见图13和图14)转化。基于父本基因组对于胚的贡献，诱导系在二倍体胚中表达R-scm2颜色标记物(Kato A.(2002)Plant breeding[植物育种]121：370-377和美国专利申请20030005479，通过引用以其整体并入本文)。所述胚颜色标记物可用于鉴定由于单倍体胚中不存在父本基因组而不表达R-scm2形态标记物的母本单倍体胚。另外，将此诱导系先前用表达盒稳定转化，所述表达盒包含编码可操作地连接到黄色荧光蛋白(YFP)的玉米泛素启动子的多核苷酸，所述黄色荧光蛋白允许分别基于检测YFP蛋白的表达的存在或不存在，从母本单倍体胚识别具有父本基因组贡献的二倍体胚。

农杆菌属介导的诱导株的转化产生了转基因玉米胚乳活化基因编辑半合T₀系(图14)，所述半合T₀系表达具有N末端分泌信号肽的两种胚发生诱导形态发育融合蛋白，每种融合蛋白均在胚乳启动子的调节下(这些融合蛋白在三倍体胚乳细胞中表达，更具体地在基底胚乳转移层细胞中表达，这允许在母本单倍体胚中进行蛋白易位和细胞重编程，并且改善了母本衍生的玉米单倍体植物的产生。

实例15

使用具有胚乳活化-胚编辑性状的玉米母本单倍体诱导株改善经基因组编辑的双 单倍体玉米植物的小植株再生

选择、杂交两个亲本系(亲本1野生型测试株和亲本2野生型测试株)，然后种植所得的育种杂交F₁种子并且使其生长，并且将这些育种杂交F₁植物的雌花或穗用于受精(花粉接受器)。采用在玉米育种项目中常规使用的方法，从实例14中产生的转基因玉米胚乳活化基因编辑半合T₀系产生胚乳活化基因编辑纯合T₁系。种植来自这种转基因玉米胚乳活化基因编辑纯合T₁系的种子并且使其生长，并且将这些转基因玉米胚乳活化基因编辑纯合T₁植物的雄花或雄穗用于受精(花粉供体)(参见图14)。进行诱导杂交，即在穗丝出现之前对花粉接受器的穗的芽装袋，并且用从花粉供体植物的花药中收集的花粉粒对这些花粉接受器的穗的穗丝进行授粉(参见图14)。此诱导杂交采用在玉米育种项目中常规使用的方法，以避免任何外来花粉污染。可替代地，可以使用转基因玉米胚乳活化基因编辑半合T₀系作为花粉供体进行诱导杂交。

预期此诱导杂交授粉方法将导致每个穗中以25％到约50％范围的频率产生单倍体胚。在授粉后约9-16天，收获未成熟的穗。将未成熟的穗在30％高乐氏漂白剂加0.5％米克罗洗涤剂中进行表面灭菌20分钟，用无菌水冲洗两次，将发育籽粒中的未成熟的胚解剖，并且在无菌条件下置于植物组织培养基上。使用本领域已知的方法，植物组织培养基补充有染色体加倍剂(参见表1)以产生玉米双单倍体。

在诱导杂交中受精的植物会发育出二倍体胚和单倍体胚二者，并且所有的胚乳组织都是三倍体，在胚乳细胞中具有3组染色体，其中两组染色体来自花粉接受器，一组染色体来自花粉供体。如分别通过检测ZmFEM2：CFP胚乳颜色标记物的存在或不存在所检测的，此诱导杂交允许在存在和不存在表达胚乳活化性状的父本等位基因之间进行直接比较。

在如上所述对野生型胚乳或具有胚乳活化性状的胚乳进行胚乳评价之后，在两个胚乳类别中拯救并且分离单倍体胚，并且然后通过确定从诱导系继承的标记物基因产物来分选二倍体和单倍体胚。父本对胚的贡献可通过YFP表达来检测，从而检测到表达父本等位基因的二倍体胚，而单倍体胚则是无色的并且被观察为YFP阴性。

使用解剖刀将两类单倍体玉米胚(从野生型胚乳分离的那些(CFP阴性胚乳)和在原位与衍生自胚乳活化性状的形态发育蛋白接触后分离的那些(CFP阳性胚乳))分离，并且置于含有秋水仙碱的培养基上。大约24小时后，将胚转移到不含秋水仙碱的培养基中，并且置于黑暗中。大约6-10天后，将小植株转移到光培养室。大约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地上，并且在生长室中生长1周，随后在温室中生长另外的1-2周，然后转移到盆中并生长至成熟。这些植物是双单倍体植物的异质群体。使这些可育的双单倍体玉米植物自交，并且出于育种目的对其进行评价。

相对于使用常规(野生型)单倍体诱导系产生的单倍体胚，预期通过与胚发生诱导形态发育基因蛋白和基因编辑机器(从胚乳转移细胞被转运到胚)原位接触发育而来并且用染色体加倍剂处理的单倍体胚将具有增加的经基因组编辑的小植株再生水平。

对于在诱导杂交中受精的植物，预期二倍体胚的平均胚大小将是相等的，与胚乳活性无关。与具有野生型胚乳的单倍体胚相比，在存在形态学发育基因蛋白的情况下，在原位发育的拯救胚的平均大小具有增加的单倍体胚大小。这些结果表明，衍生自母本单倍体胚的植物细胞与衍生自胚乳活化性状的胚发生诱导形态发育翻译融合蛋白的原位接触改善了单倍体胚的原位发育。

对经秋水仙碱处理并且然后转移到光培养室的拯救胚各自进行评价，以评估响应于胚乳中原位发育基因表达的单倍体植物再生。在父本单倍体诱导系中，单倍体植物的再生具有响应于编码胚乳活化性状的转基因的拷贝数丰度、以及因此蛋白质剂量的正相关。胚乳中增加的WUSCHEL和ODP2融合蛋白水平对从单倍体胚再生的小植株具有积极影响，并且当与染色体加倍处理组合实践时，展现出使用母本(产雌性特征的)系统产生双单倍体玉米植物的改进的生产力。

实例16

玉米小孢子活化-编辑系的产生和用玉米小孢子活化编辑系转化提供了改善的基 因组编辑植物的小植株再生

具有处于可操作连接中的表达盒的构建体被设计为在小孢子分离之前在原位增加小孢子胚发生并且提供基因编辑。通过在目的靶细胞中位点特异性核酸酶例如Cas内切核酸酶的选择性存在，在小孢子胚发生诱导阶段期间还进行基因组编辑。

在一个实例中，第一构建体包含表达盒，所述表达盒包含处于可操作连接中的编码以下的多核苷酸：绒毡层细胞偏好性调节元件、用接头序列与胚发生诱导形态发育基因序列融合的绒毡层细胞信号肽序列、和荧光蛋白基因。

在一个实例中，第二构建体包含绒毡层细胞偏好性调节元件、绒毡层细胞信号肽序列、Cas9和多顺反子样接头，所述多顺反子样接头介导核糖体跳跃事件，从而使得能够从一个mRNA产生多个分开的肽产物，所述多顺反子样接头用于在第二构建体中组合两个或更多个基因编辑组分。第二构建体的第二表达元件包含处于可操作连接中的调节元件和指导RNA分子，被设计为转录与调节元件可操作地连接的指导RNA分子。预期这些构建体促进胚发生诱导形态发育基因蛋白和基因编辑组分的蛋白质表达和从绒毡层细胞到花药的子房室的转运，从而诱导细胞重编程，在绒毡层细胞的时空定位内启动小孢子胚发生，导致在小配子发生期间蛋白质加工以及将胚发生调节因子和基因编辑组分分泌到子房室中。在另一个选择中，所述指导RNA不必从表达盒表达，而可以例如在培养基中外源递送。类似地，包含指导RNA和Cas内切核酸酶的核糖核蛋白(“RNP”)复合物可以通过外源应用递送至胚发生的小孢子。将RNP直接递送到胚发生的小孢子的这种递送不需要涉及转化步骤。

在一方面，将构建体掺入农杆菌属转化载体中。使用本领域已知的标准方案进行农杆菌属转化。可替代地，可以通过生物射弹转化方法(也是本领域已知的)将转化载体引入植物细胞中。

转化后，将小孢子活化-编辑半合T₀植物再生、自花授粉，并且对基因型进行分选。选择单拷贝纯合T₁小孢子活化-编辑事件。在单拷贝事件纯合T₁小孢子活化-编辑株和亲本2野生型近交株之间进行遗传杂交，以产生半合F₁杂交体(参见图7)并且最终在玉米中产生父本配子衍生的(产雄性特征的)经基因编辑的双单倍体的群体。可替代地，将单拷贝半合T₀小孢子活化-编辑事件与亲本2野生型近交株杂交以产生半合F₁杂交体。类似地，将单拷贝半合T₁小孢子活化-编辑事件与亲本2野生型近交株杂交以产生半合F₁杂交体。

在半合F₁杂交体生长后，在生殖组织中发生小配子发生，并且以孟德尔方式分离转基因插入位点。与配子发生无关，用单拷贝的异源表达盒转化的二倍体孢子体绒毡层细胞以半合状态在一个或多个绒毡层细胞中表达和分泌胚发生诱导形态发育多肽以及基因编辑组分，所述异源表达盒编码胚发生诱导形态发育基因多肽和基因组编辑组分(例如，Cas9核酸酶、指导RNA和任选的用于修复或用于插入的供体DNA模板)。在小孢子囊发育期间，将胚发生诱导形态发育多肽和基因编辑组分递送/分泌/转运到小孢子群体进行发育的子房室中，这允许可以在体内用胚发生诱导形态发育多肽和基因编辑组分处理所有的小孢子，这在分离小孢子后，在体外提供了基因编辑的小孢子并且改善了小孢子胚发生响应。因此，诱导小孢子的胚发生以及进行基因组编辑反应提高了出于育种目的而产生几种经基因组编辑的双单倍体植物的总体效率和有效性。

从半合F₁杂交体的雄穗中分离的小孢子(在小配子发生期间已经在子房室中经历原位基因编辑、细胞重编程和开始小孢子胚发生)可以经受组织培养方法，所述组织培养方法包括但不限于如本文所述的进一步的细胞重编程和胚发生诱导方法。

使用本领域已知的方法，可以对来自半合F₁杂交体的野生型小孢子衍生的胚进行基因分型并且进行选择，以产生父本配子(产雄性特征的)双单倍体群体。

可以通过进一步繁殖所选择的稳定转基因个体(包括使纯合转基因系自体受精的方法，或通过使半合系自体受精随后选择纯合后代)来维持所需的单拷贝纯合T₁小孢子活化-编辑事件，以用作小孢子活化-编辑亲本。

出于一些育种目的，可能特别感兴趣的是产生来自以下的分离材料：杂交(包括但不限于衍生自半合F₁杂交体的F₂或更靠后的子代)，第一代或更靠后的代之后的回交材料和/或回交衍生材料的更靠后的自体受精代，和/或使用在远缘物种之间的远缘杂交(如通过使通常不会彼此有性繁殖的物种或属进行杂交(玉米x小麦，玉米x高粱，玉米x水稻等)而产生的种间和属间杂交体)。本文公开的方法可特别用于此类育种目的。

虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述公开进行了详细描述，但是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。

Claims (8)

1.一种产生单倍体植物胚的方法，所述方法包括：

(a)向植物小孢子提供胚发生调节因子以促进所述植物小孢子中的胚发生，其中所述胚发生调节因子选自由以下组成的组：

(i)胚发生诱导多肽，其中所述胚发生诱导多肽选自WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、WOX9、LEC1、ODP2或其组合；或

(ii)胚发生诱导化合物，其中所述胚发生诱导化合物是氯化血红素或选自N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘代苯胺基)苯甲酰胺、蒽(1,9-cd)吡唑-6(2H)-酮:4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑或N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)-1,3-噻唑-4-甲酰胺的激酶抑制剂；或

(iii)(i)和(ii)的组合；

(b)从所述植物小孢子获得胚发生的小孢子；以及

(c)从所述胚发生的小孢子产生所述单倍体植物胚。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述胚发生诱导多肽不是由所述植物小孢子中稳定整合的重组DNA构建体产生的。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述胚发生诱导多肽还包含细胞穿透肽(CPP)。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述胚发生诱导多肽和/或胚发生诱导化合物存在于组织培养基中。

5.如权利要求1所述的方法，所述方法包括将所述植物小孢子与胚发生诱导悬浮饲养细胞培养物共培养，其中所述胚发生诱导悬浮饲养细胞培养物表达胚发生诱导多肽，或在所述培养基中将所述植物小孢子与所述胚发生诱导多肽和/或胚发生诱导化合物共培养。

6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括培养所述单倍体植物胚。

7.如权利要求6所述的方法，所述方法包括使所述单倍体植物胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体植物胚的时间段。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述植物小孢子获自玉米、水稻、高粱、芸苔属(brassica)、大豆、小麦和棉花。

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