JP5922094B2 - 生体分子の植物細胞中への送達のための植物ペプチドγ−ゼイン - Google Patents
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Description
本出願は、「PLANT PEPTIDE GAMMA−ZEIN FOR DELIVERY OF BIOMOLECULES INTO PLANT CELLS」に関する、2010年3月31日出願の米国仮特許出願第61/319,764号の出願日の利益を主張する。
[1]対象の分子を細胞壁を有する植物細胞中に導入する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を提供するステップと、
γ−ゼインペプチドを対象の分子と相互作用させて、γ−ゼイン連結構造体を形成するステップと、
細胞壁を有する細胞とγ−ゼイン連結構造体とを互いに接触させるステップと、
γ−ゼイン連結構造体の細胞壁を有する細胞中への取り込みを可能にするステップと
を含む方法。
[2]γ−ゼインペプチドを対象の分子と相互作用させるステップが、対象の分子をγ−ゼインペプチドと融合させることを含む、上記[1]に記載の方法。
[3]γ−ゼイン連結構造体の細胞壁を含む植物細胞の区画中への取り込みを可能にすることをさらに含む、上記[1]に記載の方法。
[4]区画が、サイトゾル、核、トノプラスト、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、エライオプラスト、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔から成る群から選択される、上記[3]に記載の方法。
[5]細胞壁を含む植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、ワタ、ヤシ、ピーナッツ、ダイズ、オリザ属種(Oryza sp.)、シロイヌナズナ属種(Arabidopsis sp.)、トウゴマ属種(Ricinus sp.)、およびサトウキビの細胞から成る群から選択される、上記[1]に記載の方法。
[6]植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さやおよび茎から成る群から選択される組織由来である、上記[1]に記載の方法。
[7]γ−ゼインペプチドが、配列番号1を含む、上記[1]に記載の方法。
[8]対象の分子が、核酸、DNA、RNA、RNAi分子、遺伝子、プラスミド、コスミド、YAC、BAC、ポリペプチド、酵素、ホルモン、グリコペプチド、糖、脂肪、シグナルペプチド、抗体、ビタミン、メッセンジャー、二次メッセンジャー、アミノ酸、cAMP、薬物、除草剤、殺菌剤、抗生物質、およびそれらの組合せから成る群から選択される成分を含む、上記[1]に記載の方法。
[9]対象の分子が、遺伝子を含む、上記[8]に記載の方法。
[10]遺伝子が、外来性タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、上記[9]に記載の方法。
[11]遺伝子を安定に組み込んだ細胞を選択することをさらに含む、上記[9]に記載の方法。
[12]選択された細胞が、再生可能な細胞である、上記[11]に記載の方法。
[13]再生可能な細胞から稔性植物を再生することをさらに含む、上記[12]に記載の方法。
[14]遺伝子を発現させる方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を提供するステップと、
γ−ゼインペプチドを遺伝子と相互作用させて、γ−ゼイン連結構造体を形成するステップと、
細胞壁を有する植物細胞とγ−ゼイン連結構造体とを互いに接触させるステップと、
γ−ゼインペプチドおよび遺伝子の細胞壁を含む植物細胞中への取り込みを可能にするステップと、
植物細胞を有する植物の子孫において、遺伝子を発現させるステップと
を含む方法。
[15]遺伝子を葉緑体において発現させる、上記[14]に記載の方法。
[16]遺伝子を安定に発現する細胞を選択することをさらに含む、上記[14]に記載の方法。
[17]γ−ゼインペプチドが、配列番号1を含む、上記[14]に記載の方法。
[18]分子性物質を植物細胞中に移入するための方法であって、
γ−ゼインペプチドをプラスミドDNAと相互作用させて、γ−ゼイン連結構造体を形成するステップと、
γ−ゼイン連結構造体を、γ−ゼインペプチドおよびプラスミドDNA由来の遺伝子の植物細胞中への取り込みを許容する条件下で、無傷の壁を有する植物細胞と接触させるステップと
を含む方法。
[19]植物細胞を有する植物の子孫において、遺伝子を安定に発現させることをさらに含む、上記[18]に記載の方法。
[20]γ−ゼインペプチドが、配列番号1を含む、上記[18]に記載の方法。
本発明の一実施形態は、対象の分子を細胞壁を有する植物細胞中に導入する方法に関する。この方法は、細胞壁を有する植物細胞を提供し、γ−ゼインペプチドを対象の分子と相互作用させて、γ−ゼイン連結構造体を形成することを含む。次いで、細胞壁を有する細胞とγ−ゼイン連結構造体とを互いに接触させ、γ−ゼインが連結した対象の分子の細胞壁を有する細胞中への取り込みを可能にする。
発現ベクターは、マーカーを含有する形質転換細胞が、ネガティブ選択(すなわち、選択マーカー遺伝子を含有しない細胞の増殖を阻害すること)によってまたはポジティブ選択(すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物をスクリーニングすること)によって回収されることを可能にする、制御エレメント(例えば、プロモーター)に作動可能に連結している少なくとも1つの遺伝子マーカーを含むことができる。形質転換のための多くの選択マーカー遺伝子は、形質転換技術においてよく知られており、例えば、抗生物質もしくは除草剤、または阻害剤に対して非感受性であることができる改変標的をコードする遺伝子とすることができる、選択的な化学薬品を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかのポジティブ選択方法も、当技術分野で知られている。
発現ベクターに含まれる遺伝子は、制御エレメント、例えば、プロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。プロモーターのいくつかの型が、単独またはプロモーターと組み合わせて使用することができる他の制御エレメントのように、形質転換技術において現在よく知られている。
誘導性プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい。任意選択で、誘導性プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。誘導性プロモーターでは、誘導剤に応答して転写の速度が上昇する。
構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよいか、または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。
組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい。任意選択で、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。組織特異的プロモーターに作動可能に連結している対象の遺伝子で形質転換した植物は、排他的、または優先的に、特異的な組織において、導入遺伝子のタンパク質産物を産生することができる。
本発明によるトランスジェニック植物では、外来性タンパク質を、商業的量で産生することができる。したがって、当技術分野でよく理解されている、形質転換植物の選択および繁殖のための技法により、多数のトランスジェニック植物をもたらし、それらを従来の様式で回収し、次いで、外来性タンパク質を、対象の組織からまたは総バイオマスから抽出することができる。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、Heney and Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981)によって考察されている、既知の方法によって達成することができる。
A)植物病害抵抗性遺伝子。植物防御は、植物における病害抵抗性遺伝子(R)の産物と病原体における対応する非病原性(Avr)遺伝子の産物との間の特異的な相互作用によってしばしば活性化される。植物変種を、クローン化された抵抗性遺伝子で形質転換し、特異的な病原体株に対する抵抗性がある植物を遺伝子工学で作ることができる。例えば、Jones et al., Science 266:789 (1994)(クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum)に対する抵抗性に関するトマトCf−9遺伝子のクローニング);Martin et al., Science 262: 1432 (1993)(プロテインキナーゼをコードするトマト斑葉細菌病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato)に対する抵抗性のためのトマトPto遺伝子);Mindrinos et al, Cell 78: 1089 (1994)(シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)に対する抵抗性のためのシロイヌナズナRSP2遺伝子)を参照されたい。
B)ダイズシストセンチュウ(soybean cyst nematode)などの有害生物に対する抵抗性を付与する遺伝子。例えば、PCT出願WO96/30517;PCT出願WO93/19181を参照されたい。
C)バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)タンパク質、その誘導体またはそれをモデルとして作られた合成ポリペプチド。例えば、Btδ内毒素遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列を開示している、Geiser et al, Gene 48: 109 (1986)を参照されたい。さらに、δ内毒素遺伝子をコードするDNA分子は、例えば、ATCC受託番号40098、67136、31995および31998の下で、American Type Cultur Collection,Manassas,Va.から購入することができる。
D)レクチン。例えば、いくつかのクリビア・ミニアタ(Clivia miniata)マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示している、Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994)による開示を参照されたい。
E)アビジンなどの、ビタミン結合タンパク質。PCT出願US93/06487を参照されたい。その出願は、害虫に対する幼虫駆除剤としてのアビジンおよびアビジン相同体の使用を教示している。
F)酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。例えば、Abe et al, J. Biol. Chem. 262: 16793 (1987)(イネシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列)、Huub et al., Plant Molec. Biol. 21 :985 (1993)(タバコプロテイナーゼ阻害剤IをコードするcDNAのヌクレオチド配列)、Sumitani et al, Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243 (1993)(ストレプトマイセス・ニトロスポレウス(Streptomyces nitrosporeus)アルファ−アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列)および米国特許第5,494,813号(Hepher and Atkinson,1996年2月27日に発行された)を参照されたい。
G)エクジステロイドもしくは幼若ホルモンなどの昆虫特異的ホルモンもしくはフェロモン、それらの変異体、それに基づく模倣体、またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニスト。例えば、Hammock et al, Nature 344:458 (1990)による、幼若ホルモンの失活剤、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現の開示を参照されたい。
H)発現するとすぐに、影響される有害生物の生理機能を乱す、昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。例えば、Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994)(発現クローニングは、昆虫利尿ホルモン受容体をコードするDNAをもたらす)およびPratt et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (1989)(アロスタチン(allostatin)は、ジプロプテラ・プンタータ(Diploptera puntata)において同定することができる)の開示を参照されたい。昆虫特異的、麻痺性神経毒をコードする遺伝子を開示している、Tomalski et al.への米国特許第5,266,317号も参照されたい。
I)ヘビ、スズメバチ、または任意の他の生物によって天然において産生される昆虫特異的毒液。例えば、サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現の開示に関して、Pang et al, Gene 116: 165 (1992)を参照されたい。
J)モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積を司る酵素。
K)翻訳後修飾を含めた、生物学的に活性のある分子の修飾に関与する酵素:例えば、天然であろうと合成であろうと、糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。callase遺伝子のヌクレオチド配列を開示している、Scott et al.の名前でのPCT出願WO93/02197を参照されたい。キチナーゼコード配列を含有するDNA分子は、例えば、受託番号39637および67152の下で、ATCCから得ることができる。タバコスズメガのキチナーゼをコードするcDNAのヌクレオチド配列を教示している、Kramer et al, Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993)、およびパセリubi4−2ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を提供している、Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21 :673 (1993)も参照されたい。
L)シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994)による、リョクトウのカルモジュリンcDNAクローンに関するヌクレオチド配列の開示、およびトウモロコシのカルモジュリンcDNAクローンのヌクレオチド配列を提供している、Griess et al, Plant Physiol. 104: 1467 (1994)を参照されたい。
M)疎水性モーメントペプチド(moment peptide)。PCT出願WO95/16776(真菌植物病原体を阻害するTachyplesinのペプチド誘導体の開示)およびPCT出願WO95/18855(病害抵抗性を付与する合成抗菌性ペプチドを教示している)を参照されたい。
N)膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断薬。例えば、Jaynes et al, Plant Sci 89:43 (1993)の、遺伝子導入タバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム(Pseudomonas solanacearum)に対して抵抗性にするための、セクロピン−β溶解ペプチド類似体の異種発現の開示を参照されたい。
O)ウイルス侵入型タンパク質またはそこ由来の複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、コートタンパク質遺伝子が由来してもよいウイルスによって、および関連するウイルスによってもたらされる、ウイルス感染および/または病害の発症に対する抵抗性を与える。Beachy et al., Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (1990)を参照されたい。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスX、ジャガイモウイルスY、タバコエッチ病ウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対するコートタンパク質媒介抵抗性は、形質転換植物に付与されてきた。同文献。
P)昆虫特異的抗体またはそこ由来の免疫毒素。したがって、昆虫の腸における重大な代謝機能を標的とする抗体は、影響される酵素を失活させ、昆虫を殺すであろう。Taylor et al, Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)(単鎖抗体断片の作製を通しての遺伝子導入タバコにおける酵素失活)を参照されたい。
Q)ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、ウイルス攻撃から保護されることを示す、Tavladoraki et al, Nature 366:469 (1993)を参照されたい。
R)病原体または寄生虫によって天然に産生される、発育停止タンパク質。例えば、真菌エンドα−l,4−D−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−l,4−D−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌のコロニー形成および植物栄養分放出を促進する。Lamb et al., Bio/Technology 10: 1436 (1992)を参照されたい。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴づけは、Toubart et al., Plant J. 2:367 (1992)によって報告され得る。
S)植物によって天然に産生される、発育停止タンパク質。例えば、Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992)は、オオムギリボソーム失活遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、真菌病害に対する抵抗性の増加を有することを示した。
A)イミダゾリノンまたはスルホニル尿素などの、成長点または分裂組織を阻害する除草剤。このカテゴリーの典型的な遺伝子は、例えば、それぞれ、Lee et al, EMBO J. 7: 1241 (1988)、Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)によって報告されているような、変異ALSおよびAHAS酵素をコードする。
B)グリフォセート(例えば、それぞれ、変異5−エノイルピルビニルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSP)遺伝子(組換え核酸の導入および/または天然のEPSP遺伝子のin vivoでの突然変異誘発の様々な形を通して)、aroA遺伝子およびグリフォセートアセチルトランスフェラーゼ(GAT)遺伝子によって付与される抵抗性)、グルホシネート(ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)およびストレプトマイセス・ビリジクロモゲネス(Streptomyces viridichromogenes)を含めた、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子)などの他のホスホノ化合物、ならびにピリジノキシ(pyridinoxy)またはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサノン(ACCase阻害剤コード遺伝子)。例えば、植物にグリフォセート抵抗性を付与することができる、EPSPの形のヌクレオチド配列を開示している、Shah et al.への米国特許第4,940,835号、およびBarry et alへの米国特許第6,248,876号を参照されたい。変異aroA遺伝子をコードするDNA分子は、ATCC受託番号39256の下で得ることができ、変異遺伝子のヌクレオチド配列は、Comaiへの米国特許第4,769,061号において開示され得る。Kumada et al.への欧州特許出願第0333033号、およびGoodman et al.への米国特許第4,975,374号は、L−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与する、グルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。PAT遺伝子のヌクレオチド配列は、Leemans et al.への欧州出願第0242246号において提供されることができ、DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)は、PAT活性をコードするキメラbar遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製を報告している。セトキシジムおよびハロキシホップなどの、フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサノンに対する抵抗性を付与する典型的な遺伝子は、Marshall et al, Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)によって報告されているAcc1−S1、Acc1−S2およびAcc1−S3遺伝子を含む。グリフォセート抵抗性を付与する能力があるGAT遺伝子は、Castle et al.へのWO2005012515において報告されている。2,4−D,フェノキシプロピオン酸およびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子は、Dow AgroSciences LLCに付与されたWO2005107437において報告されている。
C)トリアジン(psbAおよびgs+遺伝子)またはベンゾニトリル(ニトリラーゼ遺伝子)などの、光合成を阻害する除草剤。Przibila et al, Plant Cell 3: 169 (1991)は、変異psbA遺伝子をコードするプラスミドを用いたクラミドモナスの形質転換を報告している。ニトリラーゼ遺伝子に関するヌクレオチド配列は、Stalkerへの米国特許第4,810,648号において開示されており、これらの遺伝子を含有するDNA分子は、ATCC受託番号53435、67441、および67442の下で入手可能である。グルタチオンS−トランスフェラーゼをコードするDNAのクローニングおよび発現は、Hayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992)によって報告され得る。
A)例えば、植物をステアリル−ACPデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で形質転換し、その植物のステアリン酸含量を増加させることによる、修飾脂肪酸代謝。Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (1992)を参照されたい。
B)減少したフィチン酸含量1)フィターゼコード遺伝子の導入は、フィチン酸の分解を強化し、形質転換植物に遊離のリン酸をさらに追加するであろう。クロコウジカビ(Aspergillus niger)フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示に関して、例えば、Van Hartingsveldt et al., Gene 127:87 (1993)を参照されたい。2)遺伝子は、減少したフィチン酸含量を達成するために導入することができよう。例えばトウモロコシにおいて、これを、フィチン酸の低いレベルによって特徴付けられるトウモロコシ変異体を司ることができる、単一の対立遺伝子と関連するDNAをクローニングし、次いでこれを再導入することによって、達成することができよう。Raboy et al., Maydica 35:383 (1990)を参照されたい。
C)例えば、植物を、デンプンの分枝パターンを修飾する酵素をコードする遺伝子で形質転換することによってもたらされる、修飾炭水化物組成物。Shiroza et al., J. Bacteol. 170:810 (1988)(連鎖球菌変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列)、Steinmetz et al, Mol. Gen. Genet. 20:220 (1985)(レバンスクラーゼ遺伝子とすることができる、枯草菌(Bacillus subtilis)のヌクレオチド配列)、Pen et al., Bio/Technology 10:292 (1992)(αアミラーゼとすることができる、バチルス・リケニフォン(Bacillus lichenifonn)を発現するトランスジェニック植物の作製)、Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21 :515 (1993)(トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列)、Sogaard et al, J. Biol. Chem.268:22480 (1993)(オオムギαアミラーゼ遺伝子のものとすることができる、部位特異的突然変異誘発)、およびFisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993)(トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素II)を参照されたい。
γ−ゼインタンパク質の改変トウモロコシ(Zea mays)N末端領域をコードするDNA配列(GenBank Accession#AAL16977.1,GI:16305109)を、Philadium Yellow Fluorescence Protein(YFP)(Evrogen,Moscow,Russia)のN末端に融合した。6つのアミノ酸のγ−ゼインモチーフを改変した。ここで、第2の残基を、ヒスチジンからアルギニンに変えた。この改変を、融合配列を核に向けるために行った。アルギニンは、細胞のサイトゾルおよび核中へのタンパク質移行の効率を改善することが示された(Mitchell, et al, (2000), The Journal of Peptide Research, 56 (5): 318-325)。γ−ゼインのN末端領域の改変された6つのアミノ酸(VRLPPP)の三量体を、YFPに融合した。さらに、6x−Hisタグを、γ−ゼイン三量体とYFPコード配列との間に配置した。6x−Hisモチーフを追加し、タンパク質精製を促進した。この融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1として提示する。
γ−ゼイン/YFP融合配列を、標準的なクローニング技法を通して、大腸菌(Escherichia coli)発現ベクターpET280中にクローニングした。pET280は、pET28プラスミド(Novagen,Gibbstown,NJ)の改変バージョンである。複数のクローニング部位およびリボソーム結合部位を、pET28から除去し、それによってpET280を作った。γ−ゼイン/YFPコード配列を含有するSpeI−XhoI断片を、pJ201:18056ベクターから切り出し、pET280発現ベクターの対応する制限部位中に連結した。得られたプラスミドは、制限酵素消化および配列決定を通して確認した。プラスミドは、BL21(DE3)大腸菌(Escherichia coli)コンピテント細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)に形質転換した。単一のコロニーを単離し、さらなる使用までグリセロールストックとして保管した。
γ−ゼイン/YFP融合タンパク質を、以下の条件を使用して誘発した:25℃で、2リットル(L)のLuria−Bertaniブロスおよび50μg/mlのカナマイシン中で、0.6のO.D.600まで増殖したpET280/γ−ゼイン/YFP発現構築物を含有する培養物。所望のO.D.600に到達した後、培養物を、0.1mMのIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を用いて、25℃で16時間、誘発した。
タンパク質ゲルを移動させ、分画したタンパク質を可視化した。10〜20μlの各試料を、XCell SureLock(商標) Mini−Cell (Invitrogen,cat#EI0001)を使用しての電気泳動のために、プレキャスト10%Bis−Tris SDS−PAGEゲル(Invitrogen、cat#NP0302BOX)上に導入した。試料を、MES−SDSランニング緩衝液(Invitrogen、cat#NP0002)において、200Vで35分間、移動させた。ゲルを、図3において例示するように、クマシーブルーR−250(Bio−Rad、cat#161−0436)で染色した。γ−ゼイン/YFP試料を含有する画分を、プールし、10kDa MWCOを有するMillipore Spinカラム中に移動し、ベンチトップエッペンドルフ遠心機(モデル5810R)を使用して、4,000rpm、4℃で20分間、遠心分離した。遠心分離後、緩衝液交換のために、無菌のPBS溶液を最大15mlまで追加した。このスピンおよびダイアフィルトレーションプロセスは、3回繰り返した。プールしたγ−ゼイン/YFP試料を、10kDa MWCOを有するSnakeSkin(商標)ひだ状の透析管(Thermo Scientific、cat#68100)中に移動し、2LのPBSに対して4℃で終夜透析し、イミダゾール残基を除去した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン(BSA)標準を用いたBradfordアッセイ(Bio−Rad、cat#500−0006)を使用して、決定した(図3)。
SDS−PAGEゲル(約1μg)からの1μgのタンパク質バンドを切り出し、Speed−Vacにおける12.5mMの炭酸水素アンモニウムを有する25%アセトニトリルにおいて乾燥させた。タンパク質を、終夜のインキュベーション中、トリプシン(12.5ng/μl)によって、37℃で消化した。ペプチドを、製造業者の指示に従って、C18 Zip Tip(Millipore、cat#2TC18S096)を使用して精製した。質量スペクトル解析を、Voyager Biospectrometry(PerSeptive Biosystems,モデルDE STR)を使用して行い、陽イオン反射モード(positive ion reflector mode)において質量スペクトルを収集した(図4)。データを、解析プログラムPAWS(Proteometrics Inc.)に入力し、ペプチド同一性を探索した。
2.1 JTNT1細胞
JTNT1細胞は、タバコから単離される光独立栄養細胞である。形質転換の3から4日前に、2mlのJTN1細胞を、250mlフラスコ中の50nMのDAS−PMTI−1(微小管阻害剤)および0.5〜0.1%(v/v)DMSOを含有する40mlのNT1BまたはLSBY2培地中に移動することによって、懸濁培養物を新鮮培地に継代した。単細胞を、微小管阻害剤の処理の4日後または7日後に回収した(例えば、WO2008/083233において報告されているように)。細胞を、最少培地および5%二酸化炭素中で維持した。細胞を、14日に1回、O.D.6003.0にある1mlの懸濁液を移動することによって継代した。これらの細胞型を、γ−ゼイン/YFP融合ペプチドの送達および局在性のための標的細胞として使用した。
再生可能なニンジン凍結保存株(D2−40−018)を、解凍し、Linsmeier−Skoog(LS)培地(Nagata, T., Nemoto, Y., and Hasezawa, S. (1992) Int. Rev. Cyto 132, 1-30において報告されている)中で培養した。培地用の塩を、PhytoTechnology Laboratories,Catalog#L689から購入した。活発に増殖している懸濁株を、一週間以内に樹立し、維持株を、2mlのPCV(パック細胞容積)を、散光下、125rpm、7日培養サイクルで、オービタルシェーカー(Innova−3300)上の28℃で58mlのLSBY2懸濁20培地に移動することによって継代した。単細胞作製のために、定常期にあるニンジン懸濁液の1mlのPCVを、1mMのコルヒチンを有する30mlのLS懸濁培地(Sigma,Catalog#C3915)中に追加し、7日間培養した。単細胞を、3〜7日間の培養物から作製し、形質転換実験の準備が整った。ニンジンの単細胞は、14日で60mlの新鮮なLS BY2液体培地を加えることによって培養物を希釈することによって、定常期で最大28日維持できるであろう。
細胞を、15μgのHoechstで、37℃で10分間、前もって染色した。インキュベーション期間後、過度の染料を除去した。細胞を、4000rpmで5分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を、3%スクロースを含有するPBSの1mlの溶液で、3回洗浄した。
100μlの融合タンパク質/細胞混合物のアリコートを、イメージングのために、10分、30分、および60分で取り出した。細胞を、5,000rpmで5分間遠心分離し、PBSで3回洗浄した。最後に、細胞を100μlのPBSに再懸濁した。
精製したγ−ゼインペプチドを、図6において例示するプラスミドDNApDAB3831と混合した。0.25mgのγ−ゼインペプチドを、.5mgのプラスミドDNAに加え、水中で30分間インキュベートし、ペプチド/DNA複合体を形成した。pDAB3831は、シロイヌナズナUbiquitin 10 Promoter(AtUbil0)によって駆動される、PAT選択マーカー遺伝子およびCassava Vein Mosaic Virus Promoter(CsVMV)によって駆動される、Philadium Yellow Fluorescence Protein遺伝子(PhiYFP)を含有する。γ−ゼインペプチド/pDAB3831複合体およびpDAB3831プラスミドDNAのみの別々の対照実験を、シロイヌナズナ(Arabidopsis thatiana)cv Columbiaの4週齢の花芽に行った。20mLのペプチド/DNA複合体および20mlのDNA対照を、ガラストロフ中の湿潤培地(5%スクロースおよび0.04%Silwet−77)で、30秒間混合した。ペプチド/DNA溶液を含有する湿潤培地を使用し、改変Clough and Bentプロトコール(Clough SJ and Bent AF, 1998. Plant J 16:735-43)を使用して、シロイヌナズナ植物を形質転換した。浸漬後、湿潤複合体を4℃で保管し、その後、2日後に同じプロトコールを使用して、同じ植物を浸漬するために使用した。形質転換ステップを繰り返して行い、形質転換の出現率を増加させた。
シロイヌナズナトランスジェニック植物由来のgDNAおよびシロイヌナズナ生態型Columbia野生型対照由来のgDNAを、Plant DNAZOLキット(Invitrogen Inc)を使用して、6週齢植物の葉物質から抽出した。PATおよびYFP遺伝子断片を、トランスジェニック植物のみからPCRで増幅した。50μLのPCR反応混合物は、100ngの鋳型DNA、1×ExTaq反応緩衝液(TaKaRa Bio)、0.2mMのdNTP、各プライマー10pmol、および0.025ユニット/μL ExTaqを含有した。YFPプライマーを、配列番号3および配列番号4として示す。PATプライマーを、配列番号5および配列番号6として示す。以下のPCRサイクリング条件を使用した。96℃で5分間を1サイクル、以下のPCRプログラム:94℃で15秒;65℃で30秒;72℃で1分を31サイクル、最終伸長を72℃で7分間実施して産物合成を完了した。QIAquick(商標)ゲル抽出キット(Qiagen Inc)を使用して、増幅断片をゲル精製した。PCR断片を、高度なSanger配列決定テクノロジー(MWG Biotechnologies,Inc)を使用し、PAT順方向プライマー(配列番号5)およびYFP順方向プライマー(配列番号3)を使用して、配列決定し、配列をSequencher(商標)ソフトウェアを使用して分析した。
γ−ゼインドメインと相同である追加のモチーフを同定し、細胞内タンパク質移行に関して試験した。これらの配列は、NCBI(National Center for Biotechnology Information)などの現在の公開データベースから同定した。γ−ゼイン配列を、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul et al,1997)アルゴリズムに関するインプットとして使用した。初期設定を使用して、配列を、寄託されたNCBIタンパク質配列に対して比較した。探索は、いくつかの相同なタンパク質配列を返した。同定されたγ−ゼインモチーフを改変して、細胞内タンパク質移行の効率を強化した。VRLPPP配列の様々な残基を、部位特異的突然変異誘発プロトコールを通して変える。改変γ−ゼイン配列を、上述のプロトコールを使用して、タンパク質およびDNAの植物細胞中への送達に使用した。
追加の実験を行い、キメラγ−ゼイン/細胞オルガネラターゲティングモチーフを通しての細胞オルガネラのペプチドターゲティングを試験する。特定の実施例において、γ−ゼインおよび葉緑体ターゲティング配列を、YFPなどの蛍光タンパク質のN末端に融合した。YFPタンパク質の葉緑体へのターゲティングを、蛍光顕微鏡を通してイメージングする。当技術分野で知られている、様々な他の細胞オルガネラ(例えばミトコンドリア、小胞体、核等)への追加のターゲティング配列を、γ−ゼイン配列と組み合わせて融合し、特異的な細胞オルガネラを標的とするために使用する。タンパク質またはDNAのどちらかが、同定された細胞オルガネラを標的として送り込まれる。
[配列表]
Claims (16)
- 対象の核酸を無傷の細胞壁を有する植物細胞中に導入する方法であって、
無傷の細胞壁を有する前記植物細胞を提供するステップと、
γ−ゼインペプチドを対象の核酸と相互作用させて、γ−ゼイン/核酸複合体を形成するステップと、
無傷の細胞壁を有する前記植物細胞と前記γ−ゼイン/核酸複合体とを互いに接触させるステップと、
前記γ−ゼイン/核酸複合体を、前記植物細胞の前記無傷の細胞壁を通過して移行させ、前記無傷の細胞壁を有し前記対象の核酸を含有する植物細胞を生じるステップと
を含む方法。 - γ−ゼインペプチドを前記対象の核酸と相互作用させるステップが、前記対象の核酸を前記γ−ゼインペプチドと融合させ、前記γ−ゼイン/核酸複合体を形成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記γ−ゼイン/核酸複合体を前記植物細胞の前記無傷の細胞壁を通過して移行させるステップが、前記γ−ゼイン/核酸複合体を、前記無傷の細胞壁を有する前記植物細胞の区画中へ前記植物細胞の前記無傷の細胞壁を通過して移行させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記区画が、サイトゾル、核、トノプラスト、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、エライオプラスト、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔から成る群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 無傷の細胞壁を有する前記植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、ワタ、ヤシ、ピーナッツ、ダイズ、オリザ属種(Oryza sp.)、シロイヌナズナ属種(Arabidopsis sp.)、トウゴマ属種(Ricinus sp.)、およびサトウキビの細胞から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さやおよび茎から成る群から選択される組織由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の核酸が、DNA、RNA、RNAi分子、遺伝子、プラスミド、コスミド、YAC、BAC、およびそれらの組合せから成る群から選択される化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の核酸が、遺伝子を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記遺伝子が、外来性タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求項8に記載の方法。
- 前記遺伝子を安定に組み込んだ細胞を選択することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記選択された細胞が、再生可能な細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記再生可能な細胞から稔性植物を再生することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 対象の遺伝子を発現させる方法であって、
無傷の細胞壁を有する植物細胞を提供するステップと、
γ−ゼインペプチドを対象の遺伝子と相互作用させて、γ−ゼイン/遺伝子複合体を形成するステップと、
無傷の細胞壁を有する前記植物細胞と前記γ−ゼイン/遺伝子複合体とを互いに接触させるステップと、
前記γ−ゼインペプチド/遺伝子複合体を、前記植物細胞の前記無傷の細胞壁を通過して移行させ、前記無傷の細胞壁を有し、前記対象の遺伝子を発現する植物細胞を生じる、ステップと、
を含む方法。 - 前記無傷の細胞壁を有し、前記対象の遺伝子を発現する前記植物細胞が、前記対象の遺伝子を葉緑体において発現する前記無傷の細胞壁を有する植物細胞である、請求項13に記載の方法。
- 前記遺伝子を安定に発現する細胞を選択することをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- プラスミドDNAを無傷の細胞壁を有する植物細胞中に移入するための方法であって、
前記γ−ゼインペプチドをプラスミドDNAと相互作用させて、γ−ゼイン/ペプチド/プラスミドDNA複合体を形成するステップと、
前記γ−ゼイン/ペプチド/プラスミドDNA複合体を、前記γ−ゼインペプチド/プラスミドDNA複合体が前記植物細胞の前記無傷の細胞壁を通過して移動することを許容する条件下で、無傷の壁を有する植物細胞と接触させ、プラスミドDNAを含有する、無傷の細胞壁を有する植物細胞を生じるステップと
を含む方法。
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