JP6418738B2 - 官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 - Google Patents
官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6418738B2 JP6418738B2 JP2013518832A JP2013518832A JP6418738B2 JP 6418738 B2 JP6418738 B2 JP 6418738B2 JP 2013518832 A JP2013518832 A JP 2013518832A JP 2013518832 A JP2013518832 A JP 2013518832A JP 6418738 B2 JP6418738 B2 JP 6418738B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- nucleic acid
- cell
- gene
- nanoparticles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
- C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本出願は、2010年7月7日に出願された「官能化(finctionalized)直鎖DNAカセットの生産及び植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達」についての米国仮特許出願シリアル番号61/362,222の出願日の利益を主張する。
本発明は、無傷の細胞壁を有する植物細胞に官能化直鎖核酸カセット分子を非侵襲的に送達するナノ粒子を用いた方法に関する。
[1]細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を提供する工程;
対象とする官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子を被覆する工程;
細胞壁を有する上記植物細胞と上記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;ならびに
細胞壁を含む上記植物細胞に上記ナノ粒子および上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程
を含む、方法。
[2]ナノ粒子が、上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用する官能基を含む、上記[1]に記載の方法。
[3]ナノ粒子が、ストレプトアビジンQD共役ナノ粒子である、上記[2]に記載の方法。
[4]さらに、細胞壁を含む上記植物細胞の区画に、上記ナノ粒子の取り込ませる工程を含む、上記[1]に記載の方法。
[5]さらに蛋白質を標的とする細胞内区画で上記ナノ粒子を被覆する工程を含む、上記[4]に記載の方法。
[6]上記区画が、細胞質ゾル、核、液胞膜、プラスチド、エチオプラスト、有色体、白色体、脂肪体、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔からなる群から選択される、上記[5]に記載の方法。
[7]細胞壁を有する上記植物細胞が、商業作物種からの植物細胞である、上記[1]に記載の方法。
[8]上記植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、菜種、菜種、綿、ヤシ、落花生、ダイズ、イネ属、シロイヌナズナ属、トウゴマ属、およびサトウキビの細胞からなる群から選択される、上記[7]に記載の方法。
[9]上記植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、および茎からなる群から選択された組織由来のものである、上記[7]に記載の方法。
[10]細胞壁を有する上記植物細胞が培養細胞である、上記[1]に記載の方法。
[11]上記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子、量子ドット、正に帯電したナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆されたナノ粒子、多孔質粒子、メソポーラスナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマーナノ粒子、タングステンナノ粒子、ゼラチンナノ粒子、ナノシェル、ナノコア(nanocores)、ナノスフェア、ナノロッド、および磁性ナノ粒子からなる群から選択される上記[1]に記載の方法。
[12]上記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、上記[11]に記載の方法。
[13]半導体ナノ粒子が、量子ドットである、上記[12]に記載の方法。
[14]上記ナノ粒子が、金ナノ粒子である、上記[11]に記載の方法。
[15]さらに、上記ナノ粒子の表面を誘導体化する工程を含む、上記[1]に記載の方法。
[16]上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、DNA、RNA、RNAi分子、および遺伝子からなる群から選択される核酸配列を含む、上記[1]に記載の方法。
[17]上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、遺伝子を含む、上記[16]に記載の方法。
[18]上記遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、上記[17]に記載の方法。
[19]上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、核酸配列のPCR増幅から得られる、上記[1]に記載の方法。
[20]核酸配列が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される核酸分子から得られる、上記[19]に記載の方法。
[21]さらに上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を安定的に組み込んだ細胞を選択する工程を含む、上記[16]に記載の方法。
[22]上記選択した細胞が、再生可能な細胞である、上記[21]に記載の方法。
[23]さらに再生可能な細胞から植物を再生する工程を含む、上記[22]に記載の方法。
[24]植物材料に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、
植物細胞、植物組織、植物からなる群から選択される植物材料を提供する工程;
ナノ粒子を提供する工程;
対象とする官能化直鎖核酸カセット分子で上記ナノ粒子を被覆する工程;
細胞壁を有する上記細胞と上記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;
上記植物材料に上記ナノ粒子および上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程
を含む、方法。
[25]上記植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、および茎からなる群から選択される植物組織である、上記[24]に記載の方法。
[26]植物へ形質を移入するための方法であって、
植物細胞を提供する工程;
官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用し得るナノ粒子を提供する工程;
植物において形質を発現させるための手段でナノ粒子を被覆する工程;
上記植物細胞と上記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;
上記植物細胞に上記ナノ粒子および上記植物において上記形質を発現させるための手段を取り込ませる工程;
上記形質転換植物細胞から植物全体を再生させる工程、および
上記植物を繁殖させる工程
を含む、方法。
[27]上記形質が、対象とするタンパク質の発現、雄性不稔、除草剤耐性、害虫抵抗性、細菌性の病害に対する抵抗性、真菌性病害に対する抵抗性、およびウイルス性病害に対する抵抗性からなる群から選択される、上記[26]に記載の方法。
細胞壁を有する植物細胞に対象とする(of interest)分子を導入するための、ナノ粒子および直鎖化核酸分子の使用のための方法および組成物が、本明細書中に記載される。本開示の方法のいくつかの実施形態は、安定的に形質転換された遺伝的に改変された繁殖力のある植物を生産するために使用し得る。いくつかの実施形態では、官能化直鎖核酸カセット分子の特徴的な性質により、望ましくない核酸配列(例えば、限定はしないが、ベクターバックボーン配列)無しに、対象とする特定の遺伝子配列を送達することが可能になる。
配列番号:1は、プラスミドpDAB3831から4.6 kbpの完全な発現カセットを増幅するために使用されるフォワードプライマー配列:
/5Biosq/TGAAAGTGTACATCAACGAA
を示す。
/5Biosq/CCGCAACTATTTCAACAC
を示す。
非侵襲的な遺伝子導入を可能にする本発明の方法は、望ましい形質を有する遺伝子組み換え植物を生成するために非常に役立ち得る。非侵襲的な遺伝子導入は、このような栽培植物に、望ましいインプット、アウトプット、および農業的形質を組み込むなどの分野のために、細胞内の分子部位を特異的に標的化し、編集することを容易にし得る。記載されている方法はまた、現在技術が制限されている、植物の一過性形質転換、木もしくは野菜作物に形質移入し、病害抵抗性を付与するための技術の拡大のための非GMOの選択肢として有用であり得る。
A. 概要
本発明は、例えば、遺伝的形質転換および安定したトランスジェニック植物の開発のための官能化直鎖核酸カセット分子のナノ粒子媒介転送を使用して植物を形質転換するための新しい方法を記載する。特定の実施形態に係る方法は、他の形質転換法と比較した場合、トランスジェニック生物の急速な生成だけでなく、所望のゲノム改変のためのいくつかの可能性もまた提供する。本発明の実施形態は、ナノ粒子媒介直鎖化プラスミドDNAの送達を介して生成された最初に報告された安定した形質転換植物につながっている。開示される遺伝子組み換えの方法は、植物の遺伝的形質転換の伝統的な方法から逸脱し、微粒子銃送達に依存せず、そしてトランスジェニック作物を生成するために非常に役立ち得る。
特定のタンパク質またはRNA産物(例えば、干渉RNA(「RNAi」))をコードする遺伝子の単離および特徴付けを可能にした分子生物学的手法の出現により、植物生物学の分野で科学者たちは、例えば、特定の方法で細胞の形質を変えるために、外来遺伝子、またはネイティブもしくは内因性遺伝子の追加または改変されたバージョン(おそらく異なるプロモーターによって駆動される)を含めるために、細胞のゲノムを操作することに強い興味を抱いてきた。このような外来の追加の遺伝子および/または改変された遺伝子は、本明細書中で「導入遺伝子」と総称される。導入遺伝子は、例えば、対象とするタンパク質をコードし得、またはRNAiに転写され得る。過去15〜20年間で、トランスジェニック細胞を産生するためのいくつかの方法が開発されており、特定の実施形態では、本発明は、細胞の形質転換されたバージョン、および細胞壁を有する植物細胞に1以上の官能化直鎖核酸カセット分子を、細胞壁を横切るナノ粒子の取り込みを介して導入することによってそれらを製造する方法に関する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は合成直鎖状DNAカセットに含まれていてもよい。
直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクターは、マーカーを含む形質転換細胞がネガティブ選択(すなわち、選択可能なマーカー遺伝子を含まない細胞の増殖阻害)、またはポジティブ選択(すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物についてのスクリーニング)のいずれかによって回収されるようにする例えば調節エレメントに作動可能に連結された少なくとも1つの遺伝子マーカーを任意に含むことができる。形質転換のための多数の選択可能なマーカー遺伝子は、当該技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、抗生物質もしくは除草剤であり得る選択的化学物質を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害剤に非感受性であり得る変化した標的をコードする遺伝子を含む。また、特定のポジティブ選択方法は当該技術分野において知られている。しかしながら、いくつかの実施形態では、直鎖核酸カセット分子は、マーカー遺伝子を含まない。
直鎖核酸カセット分子に含まれる遺伝子は、必要に応じて、調節エレメント、例えばプロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動してもよい。プロモーターのいくつかの種類は、単独またはプロモーターとの組み合わせで使用され得る他の調節エレメントと同様に、形質転換の技術分野において今や周知である。
誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る。場合により、誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。誘導可能なプロモーターにより、転写速度は誘導剤に反応して増加する。
構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る、または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る。場合により、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した対象とする遺伝子を用いて形質転換された植物は、特定の組織において導入遺伝子のタンパク質産物を排他的または優先的に産生され得る。
本発明の実施形態によるトランスジェニック植物は、商業的な量で外来タンパク質を生成し得る。したがって、形質転換された植物の選択および繁殖のための技術は、従来の方法で収穫される複数のトランスジェニック植物を生産する。次に、外来タンパク質は対象とする組織から、またはバイオマス全体から抽出され得る。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、HeneyおよびOrr, (1981) Anal. Biochem. 114: 92-6で検討されている既知の方法によって達成され得る。
A)植物の病害抵抗性遺伝子。植物の防御は、植物における病害抵抗性遺伝子(R)の産物と病原体中の対応する非病原性(Avr)遺伝子の産物との間の特定の相互作用によってしばしば活性化される。植物種は、特定の病原体株に抵抗性である植物を操作するためにクローン化された抵抗性遺伝子を用いて形質転換され得る。例えばJonesら, (1994) Science 266: 789(クラドスポリウム・フルバム(Cladosporium fulvum)への抵抗性のためのトマトCf−9遺伝子のクローニング);Martinら, (1993) Science 262: 1432(シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)病原型への抵抗性のためのトマトPto遺伝子。トマトはプロテインキナーゼをコードする);Mindrinosら, (1994) Cell 78: 1089(シュードモナス・シリンゲへの抵抗性のためのRSP2遺伝子)を参照されたい。
A)成長点または分裂組織を阻害する、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素などの除草剤。この分類の例示的な遺伝子は、例えば、Leeら, (1988) EMBO J. 7: 1241、 およびMikiら, (1990) Theor. Appl. Genet. 80: 449によってそれぞれ記載される突然変異体ALSおよびAHAS酵素をコードする。
A)例えば、植物のステアリン酸含有量を増加させるためにステアリルACP不飽和化酵素のアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによる、修飾された脂肪酸代謝。Knultzonら, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 2624を参照されたい。
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞壁を含む植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を用いて被覆させたナノ粒子を細胞と接触させて配置し、細胞壁を通したナノ粒子の取り込みを可能にすることを含んでもよい。特定の実施形態において、ナノ粒子は、可逆的にまたは不可逆的に、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を含み、それで被覆され、またはその他の方法でそれに結合および/または担持してもよい。これらおよびさらなる実施形態において、ナノ粒子は、対象となる官能化核酸カセット分子上の基と反応する基で官能化され、対象となる官能化直鎖核酸カセット分子に結合したナノ粒子を生成し得る。特定のの実施形態において、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、細胞壁を有する植物細胞との接触前にナノ粒子に導入され、または細胞壁を有する植物細胞にナノ粒子の導入と同時であってもよい。本発明の実施形態において使用され得るナノ粒子の例は、限定されないが、量子ドット;他の半導体ナノ粒子;正に帯電したナノ粒子;金ナノ粒子;金被覆ナノ粒子;多孔性ナノ粒子;メソ多孔性ナノ粒子;シリカナノ粒子;ポリマーナノ粒子(例えばデンドリマー);タングステンナノ粒子;ゼラチンナノ粒子;ナノシェル;ナノコア;ナノスフェア;ナノロッド;および磁気ナノ粒子含む。
本発明に係る安定に形質転換された植物細胞は、ナノ粒子を媒介した形質転換によって、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を用いて形質転換され得る任意の植物細胞であってもよい。したがって、植物細胞は、双子葉植物または単子葉植物から単離し、またはそこから培養してもよい。また、植物細胞は、植物組織または植物全体に存在してもよい。本発明に係る双子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、アルファルファ;豆類;ブロッコリ;キャベツ;ニンジン;カリフラワー;セロリ;白菜;綿;キュウリ;ナス;レタス;メロン;エンドウ;コショウ;ピーナッツ;ジャガイモ;カボチャ;ダイコン;ナタネ;ホウレンソウ;大豆;スカッシュ;サトウダイコン;ヒマワリ;タバコ;トマト;およびスイカを含む。本発明に係る単子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、コーン;タマネギ;イネ;ソルガム;小麦;ライ麦;キビ;サトウキビ;オートムギ;ライ小麦;スイッチグラスおよび芝草を含む。
DNA;プラスミドDNAの調製
pDAB3831プラスミドDNA(図1)を単離し、直鎖DNA/ストレプトアビジン被覆量子ドットによる植物の形質転換のために調製した。このプラスミドは、シロイヌナズナユビキチン10プロモーター(AtUbi10)によって駆動されるPAT選択マーカー遺伝子およびキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター(CsVMV)によって駆動されるフィラジウム黄色蛍光タンパク質遺伝子(PhiYFP)を含む。形質転換実験を、直鎖化DNAを用いて試験した。
ストレプトアビジン被覆量子ドットは、Evident Technology(トロイ、ニューヨーク州)から入手した。1 mLのストレプトアビジン被覆量子ドット(4 nmol)を0.5mgのビオチン化した直鎖化プラスミドDNAとともに30分間室温でインキュベートし、直鎖状DNA/QD複合体を形成した。
植物体形質転換のための植物材料
種子の同期された発芽は、T0植物における花発生の均質性を確実するために重要である。シロイヌナズナ(A. thaliana)cv.コロンビア種子は、0.1%(w/v)寒天溶液中に懸濁され、4℃にて48時間インキュベートし、層別化を完了した。60mgの種子を計量し、15mLチューブに移した。13mLの0.1%(w/v)寒天溶液を添加し、種子が均一に分散するまでボルテックスを行った。これは、4.6mg種子/1mLの0.1%(w/v)寒天溶液(または約230種子/mL)の種子溶液濃度を作製する。6本のチューブ(72mL溶液)を調製し、各トレイに18(31/2インチ)ポットを含む4平面に植え付けた。種子溶液を4℃にて48時間インキュベートし、層別化を完了した。各ポットは、個別に、ポットあたり1.0mLの層状化種子溶液で植え付けられた。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持した。ドームを植え付け日後の5日に除いた。種子を発芽させ、植物を長日条件下(16時間明/8時間暗)、120〜150μmol/m2秒の光度にて、一定の温度(22℃)および湿度(40〜50%)下でConviron(登録商標)(モデルCMP4030およびCMP3244、Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)において生育した。植物は、植物を植え付けた後の10〜14日間、Hoagland溶液、続いてDI水で水を与え、湿らせてはないが、土壌水分を保持した。植え付けの日から4週間後、花を摘み、二番花のより均等な生育を生じさせた。植え付け後の第5週で、形質転換プロセスのために植物を調製した。
シロイヌナズナ(A. thaliana)cv.コロンビアの直鎖DNA/QDを媒介した形質転換は、CloughおよびBentの変更したプロトコルを用いて完了した。CloughおよびBent (1998) Plant J. 16:735-43。20mLの懸濁液は、0.5mgの直鎖DNAおよび4nMのPQDの濃度で直鎖DNA/QD複合体溶液を用いて作製され、シロイヌナズナ植物(大部分は、いくつかの受精した長角果(fertilized silique)を有する未成熟な花房)の処置に使用された。植物を浸漬する前に、0.05%(v/v)(250μL/500mL)〜0.005%の濃度にしたSilwet L−77を直鎖DNA/PQD溶液に添加し、十分に混合した。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌しながら、直鎖DNA/PQD溶液に30秒間浸漬された。処理された植物は、それらの側に30分間、暗くして22〜24℃にて置かれた。植物は、上述される条件下、Convironに移され、成熟するまで生育させ、種子を回収した。
形質転換された植物の選択
新たに回収されたT1種子は、室温にて7日間乾燥させた。T1種子は26.5×51cmの発芽トレイに植え付けられ、各々は、予め40mLの0.1%(w/v)アガロース溶液に懸濁され、4℃にて2日間保存され、休眠要件を完了し、同期された種子発芽を確認された、層状化されたT1種子の200mgアリコート(約10,000個の種子)を受け入れた。
シロイヌナズナ(A. thaliana)トランスジェニック植物由来のゲノムDNAは、製造業者の指示書に従って、植物DNAZOL(商標)(Invitrogen)を用いて、6週齢の植物の葉材料から抽出された。PCRプライマーは、YFPおよびPAT導入遺伝子を検出するために設計された。YFPプライマーは配列番号1および配列番号2として示される。PATプライマーは配列番号5および配列番号6として示される。
PATおよびYFPについてのPCR増幅反応は、TaKaRa ExTaq(商標)キット(Takara,Otsu,Shiga,Japan)を用いて完了された。遺伝子産物は、50μLの全反応体積において増幅された。PCR反応は、100ngゲノムDNA鋳型、1×ExTaq反応緩衝液、0.2mMのdNTP、10pMolの各プライマー、および0.025単位/μLのExTaqを含んだ。以下のPCR条件を用いた:96℃で5分間の1サイクル、および以下の条件:94℃で15秒間、65℃で30秒間、72℃で1分間、および最終伸長72℃で7分間の31サイクル。PCR増幅産物は、0.8%TAEアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色によって視覚化された。DNA断片は、QIAEX(商標)IIゲル精製キット(Qiagen,Valencia,CA)を用いて、アガロースゲルから精製された。
単一細胞植物材料を調製する。
例えば、BY2細胞およびNT1細胞の両方を用いる。BY2細胞は、緑色でない、増殖が速いタバコ細胞株である。NT1細胞は、タバコから単離された光独立栄養細胞である。形質転換の3から4日前、1週齢の懸濁培養は、250mLフラスコに50nMのDAS−PMTI−1(微小管阻害剤)および0.5〜0.1%(v/v)のDMSOを含む40mlのNT1BまたはLSBY2培地に、2mlのNT1またはBY2培養物を移すことによって、新鮮な培地に継代培養される。単一細胞は、微小管阻害剤処理後の4日または7日のいずれかで回収される。使用されるBY2単一細胞は、生存細胞をカウントするために、Beckmanフローサイトメータにより処理される。細胞は、単一細胞が細胞の細胞質を通じて分布した大多数の色素体(アミロプラスト)を含むことを決定するために、共焦点画像システムに接続された微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いて調べられる。細胞は、3.0OD600の懸濁液1mLを移すことによって、14日ごとに一度継代培養される。形質転換の標的細胞として培養細胞が用いられる。
プラスミドDNAは、直鎖DNA/量子ドット(QD)を媒介した植物形質転換のために単離および調製される。プラスミドは、シロイヌナズナユビキチン10プロモーター(AtUbi10)によって駆動されるPAT選択可能なマーカー遺伝子、およびカッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター(CsVMV)によって駆動されるフィラジウム黄色蛍光タンパク質遺伝子(PhiYFP)を含む。プラスミドを含む大腸菌(Escherichia coli)株は植菌され、37℃にてアンピシリンを含むLuria−Bertaniブロス中で濁るまで増殖される。DNAは、Qiagen Plasmid Midi−Prepキット(Qiagen,Valencia,CA)を用いて単離される。
ストレプトアビジン被覆量子ドットは、Evident Technology(トロイ、ニューヨーク州)から取得される。1 mLのストレプトアビジン被覆量子ドット(4 nmol)を0.5 mgのビオチン化直鎖化プラスミドDNA共に30分間室温でインキュベートして、直鎖DNA/QD複合体を形成する。
シロイヌナズナについての植物体形質転換は、CloughおよびBent(1998)から修飾されたものを用いて行うことができる。多官能化されたナノ粒子上のDNA、ならびにホーミングタンパク質形質導入ドメイン(PTD)およびNLS単位の分子の濃度は、形質転換効率の増加を達成するために最適化される。
Claims (18)
- 細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を提供する工程;
対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子で
量子ドットナノ粒子を被覆する工程であって、前記量子ドットナノ粒子が、前記対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子と相互作用するストレプトアビジンを含む、工程;
細胞壁を有する前記植物細胞と前記被覆された量子ドットナノ粒子とを互いに接触させる工程;
細胞壁を含む前記植物細胞に前記量子ドットナノ粒子および前記対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程、ならびに
前記対象とする直鎖核酸カセット分子を安定に組み込んだ細胞を選択する工程を含む、方法。 - さらに、細胞壁を含む前記植物細胞の区画に、前記量子ドットナノ粒子を取り込ませる工程を含む、請求項1に記載の方法。
- さらに細胞内区画を標的とする蛋白質で前記量子ドットナノ粒子を被覆する工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記区画が、細胞質ゾル、核、液胞膜、プラスチド、エチオプラスト、有色体、白色体、脂肪体、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 細胞壁を有する前記植物細胞が、商業作物種からの植物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、菜種、菜種、綿、ヤシ、落花生、ダイズ、イネ属、トウゴマ属、およびサトウキビの細胞からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、および茎からなる群から選択された組織由来のものである、請求項5に記載の方法。
- 細胞壁を有する前記植物細胞が培養細胞である、請求項1に記載の方法。
- さらに、前記量子ドットナノ粒子の表面を誘導体化する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子が、DNA、RNA、RNAi分子、および遺伝子からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子が、遺伝子を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求項11に記載の方法。
- 前記対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子が、核酸配列のPCR増幅から得られる、請求項1に記載の方法。
- 核酸配列が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される核酸分子から得られる、請求項13に記載の方法。
- 前記選択した細胞が、再生可能な細胞である、請求項1に記載の方法。
- さらに再生可能な細胞から植物を再生する工程を含む、請求項15に記載の方法。
- 植物材料に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、
植物細胞、植物組織、植物からなる群から選択される植物材料を提供する工程;
量子ドットナノ粒子を提供する工程;
対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子で前記量子ドットナノ粒子を被覆する工程であって、前記量子ドットナノ粒子が、前記対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子と相互作用するストレプトアビジンを含む、工程;
細胞壁を有する前記細胞と前記被覆された量子ドットナノ粒子とを互いに接触させる工程;
前記植物材料に前記量子ドットナノ粒子および前記対象とするビオチン化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる非侵襲的遺伝子移入工程、ならびに
前記対象とする直鎖核酸カセット分子を安定に組み込んだ細胞を選択する工程を含む、方法。 - 前記植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、および茎からなる群から選択される植物組織である、請求項17に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36222210P | 2010-07-07 | 2010-07-07 | |
US61/362,222 | 2010-07-07 | ||
PCT/US2011/043217 WO2012006439A2 (en) | 2010-07-07 | 2011-07-07 | Production of functionalized linear dna cassette and quantum dot/nanoparticle mediated delivery in plants |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017056687A Division JP2017140036A (ja) | 2010-07-07 | 2017-03-22 | 官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013529933A JP2013529933A (ja) | 2013-07-25 |
JP6418738B2 true JP6418738B2 (ja) | 2018-11-07 |
Family
ID=45441803
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013518832A Active JP6418738B2 (ja) | 2010-07-07 | 2011-07-07 | 官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 |
JP2017056687A Pending JP2017140036A (ja) | 2010-07-07 | 2017-03-22 | 官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 |
JP2019084037A Active JP6891215B2 (ja) | 2010-07-07 | 2019-04-25 | 官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017056687A Pending JP2017140036A (ja) | 2010-07-07 | 2017-03-22 | 官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 |
JP2019084037A Active JP6891215B2 (ja) | 2010-07-07 | 2019-04-25 | 官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8575424B2 (ja) |
EP (1) | EP2591115B1 (ja) |
JP (3) | JP6418738B2 (ja) |
KR (1) | KR20130124296A (ja) |
CN (1) | CN103052713A (ja) |
AU (1) | AU2011274807B2 (ja) |
BR (1) | BR112013000267B8 (ja) |
CA (1) | CA2804164C (ja) |
IL (1) | IL223980B (ja) |
UA (1) | UA112758C2 (ja) |
WO (1) | WO2012006439A2 (ja) |
ZA (1) | ZA201300167B (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20130124296A (ko) * | 2010-07-07 | 2013-11-13 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 기능성화된 선형 dna 카세트의 생산 및 식물 내에서 양자점/나노입자 매개된 전달 |
US20130145488A1 (en) * | 2011-12-06 | 2013-06-06 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Mesoporous silica nanoparticles suitable for co-delivery |
CN102750333B (zh) * | 2012-05-31 | 2014-05-07 | 华中科技大学 | 一种用于提取半导体纳米结构特征尺寸的方法 |
IN2015DN03218A (ja) | 2012-10-05 | 2015-10-02 | Dow Agrosciences Llc | |
WO2014172160A2 (en) * | 2013-04-16 | 2014-10-23 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | A method for improving spectrum sensing and efficiency in cognitive wireless systems |
BR112016003591A8 (pt) | 2013-08-22 | 2018-01-30 | Du Pont | promotor u6 de polimerase iii de soja e métodos de uso |
EP3191595B1 (en) | 2014-09-12 | 2019-12-25 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use |
EP3274460A1 (en) | 2015-03-27 | 2018-01-31 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Soybean u6 small nuclear rna gene promoters and their use in constitutive expression of small rna genes in plants |
US9904508B1 (en) * | 2016-09-27 | 2018-02-27 | Bose Corporation | Method for changing type of streamed content for an audio system |
US11180770B2 (en) | 2017-03-07 | 2021-11-23 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | HPPD variants and methods of use |
US11371056B2 (en) | 2017-03-07 | 2022-06-28 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | HPPD variants and methods of use |
KR20200124702A (ko) | 2018-02-23 | 2020-11-03 | 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 | 신규한 cas9 오르소로그 |
WO2020123887A2 (en) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel crispr-cas systems for genome editing |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE68913555T2 (de) * | 1988-11-21 | 1994-07-07 | Dynal As | Sonden aus nukleinsäuren. |
US5302523A (en) | 1989-06-21 | 1994-04-12 | Zeneca Limited | Transformation of plant cells |
EP0737748A1 (en) | 1995-03-17 | 1996-10-16 | Hoechst NOR-AM AgrEvo Inc. | Efficient production of transgenic fertile homozygous plants from fresh microspores |
US6153811A (en) * | 1997-12-22 | 2000-11-28 | Dekalb Genetics Corporation | Method for reduction of transgene copy number |
US6475994B2 (en) * | 1998-01-07 | 2002-11-05 | Donald A. Tomalia | Method and articles for transfection of genetic material |
US6635806B1 (en) * | 1998-05-14 | 2003-10-21 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for expression of transgenes in plants |
DE10203346A1 (de) | 2002-01-29 | 2003-07-31 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von Zymosterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in transgenen Organismen |
US20040181821A1 (en) | 2003-03-14 | 2004-09-16 | Jiadong Zhou | siRNA research tool kit |
US20050123974A1 (en) * | 2003-11-17 | 2005-06-09 | U.S. Genomics, Inc. | Methods and compositions relating to single reactive center reagents |
JP2007519403A (ja) * | 2004-02-03 | 2007-07-19 | ハイブリッド バイオサイエンシーズ ピーティーワイ リミテッド | 雑種強勢と雑種衰弱を促進する遺伝子の同定法とその使用 |
US20060223125A1 (en) | 2004-12-01 | 2006-10-05 | Lelkes Peter I | Methods and kits for staining cell membranes |
WO2008045288A2 (en) | 2006-10-06 | 2008-04-17 | Vandalia Research, Inc. | Method for a continuous rapid thermo cycle system |
BRPI0817911B8 (pt) * | 2007-10-05 | 2022-06-28 | Dow Agrosciences Llc | Processos para transferência de substâncias moleculares para dentro de células vegetais e processo para expressão de um gene |
SG182803A1 (en) * | 2010-02-05 | 2012-09-27 | Merck Patent Gmbh | Hetaryl-[1,8]naphthyridine derivatives |
KR20130124296A (ko) * | 2010-07-07 | 2013-11-13 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 기능성화된 선형 dna 카세트의 생산 및 식물 내에서 양자점/나노입자 매개된 전달 |
-
2011
- 2011-07-07 KR KR1020137003114A patent/KR20130124296A/ko active IP Right Grant
- 2011-07-07 BR BR112013000267A patent/BR112013000267B8/pt active IP Right Grant
- 2011-07-07 EP EP11804352.0A patent/EP2591115B1/en active Active
- 2011-07-07 JP JP2013518832A patent/JP6418738B2/ja active Active
- 2011-07-07 AU AU2011274807A patent/AU2011274807B2/en active Active
- 2011-07-07 UA UAA201301427A patent/UA112758C2/uk unknown
- 2011-07-07 US US13/178,235 patent/US8575424B2/en active Active
- 2011-07-07 CN CN201180038795XA patent/CN103052713A/zh active Pending
- 2011-07-07 CA CA2804164A patent/CA2804164C/en active Active
- 2011-07-07 WO PCT/US2011/043217 patent/WO2012006439A2/en active Application Filing
-
2012
- 2012-12-27 IL IL223980A patent/IL223980B/en active IP Right Grant
-
2013
- 2013-01-08 ZA ZA2013/00167A patent/ZA201300167B/en unknown
-
2017
- 2017-03-22 JP JP2017056687A patent/JP2017140036A/ja active Pending
-
2019
- 2019-04-25 JP JP2019084037A patent/JP6891215B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20120023620A1 (en) | 2012-01-26 |
EP2591115A2 (en) | 2013-05-15 |
US8575424B2 (en) | 2013-11-05 |
CA2804164C (en) | 2019-10-22 |
JP2013529933A (ja) | 2013-07-25 |
KR20130124296A (ko) | 2013-11-13 |
BR112013000267B1 (pt) | 2020-10-13 |
JP2019146580A (ja) | 2019-09-05 |
JP2017140036A (ja) | 2017-08-17 |
EP2591115B1 (en) | 2018-12-05 |
IL223980B (en) | 2018-02-28 |
ZA201300167B (en) | 2014-03-26 |
BR112013000267A2 (pt) | 2016-05-24 |
WO2012006439A2 (en) | 2012-01-12 |
UA112758C2 (uk) | 2016-10-25 |
AU2011274807A1 (en) | 2013-01-31 |
CN103052713A (zh) | 2013-04-17 |
RU2013104997A (ru) | 2014-08-20 |
WO2012006439A3 (en) | 2012-03-29 |
BR112013000267B8 (pt) | 2022-06-28 |
AU2011274807B2 (en) | 2015-04-30 |
CA2804164A1 (en) | 2012-01-12 |
JP6891215B2 (ja) | 2021-06-18 |
EP2591115A4 (en) | 2014-01-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6891215B2 (ja) | 官能化直鎖dnaカセットの製造および植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達 | |
JP2021180667A (ja) | 植物における安定な形質転換のためのpeg化量子ドットを用いた直鎖dna分子送達 | |
JP6820225B2 (ja) | 植物細胞に生体分子を送達するためのデンドリマーナノテクノロジーの使用 | |
RU2574785C2 (ru) | Получение функционализированной линейной днк-кассеты и опосредованная квантовыми точками/наночастицами доставка в растения | |
RU2575097C2 (ru) | Доставка линейной молекулы днк в растения для стабильной трансформации с помощью пегилированных квантовых точек |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140630 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150728 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151005 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160126 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160329 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160629 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20161122 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170322 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20170329 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20170602 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180420 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180625 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181009 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6418738 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |