JP2007519403A - 雑種強勢と雑種衰弱を促進する遺伝子の同定法とその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は雑種強勢疾患及び／又は誘発の診断と治療に有用な可能性のある候補遺伝子の同定法に関する。特に本発明は動物又は植物の雑種強勢か雑種衰弱を産生できる候補遺伝子の同定法に関し、（i）候補遺伝子の対立遺伝子のヌクレオチド配列を比較し、（ii）該動物か植物でのヌクレオチド配列の違いを同定し、且つ（iii）候補遺伝子の対立遺伝子間のアミノ酸配列変化が候補遺伝子内の二つ以上の異種エキソン内に位置することを同定するステップからなる。
【選択図】なし

Description

本発明は疾病の診断治療及び／又は雑種強勢誘発に有用な可能性のある候補遺伝子の同定法に関する。本発明は更に植物又は動物の病気を克服し且つ／又は植物又は動物の雑種強勢遺伝力や他の生物学的に長短のある表現型を修復すために体内で生成した雑種伝令RNAを使用することに関する。

植物、動物又は他生物の成長、生存率や頑健性に影響する力があるいくつかの遺伝要素が遺伝的に無関係な生物的に正常な親からの子孫に対してより影響力が大きいことが数百年間知られている。この生物現象は雑種強勢（HV）やヘテロシスと呼ぶ。遺伝的に同一でない親の子孫を異種接合型生物という。

HVを説明するのに多くのモデルが提案された。最近電気回路類似モデル（ミルボウロウ（Milborrow）、ジャーナルオブエクスペリメンタルボタニー（J. Exp. Bot.）、４９巻、１０６３頁（１９９８年））や他の数学的モデル（ゴードン（Gordon）、へレジティ（Heredity）、８３巻、757頁（１９９９年）が提案された。しかしビルヒラー等（Birchler, et al.）、（プラントセル（The Plant Cell）、15巻、２２３６頁（２００３年））により最近述べられたように根底にある機構は不明のままである。又２００３年にビルヒラー（Birchler）と同僚は“最終的にはヘテロシスを分子的に説明することで農業及び生物工学の利益を操作ができるか否かが決まる”と予言した。

この現象を説明するために多くの理論で進歩があったが、主に商業的に重要なものは雑種メイズの例で見られるように（ロマグノリ等（Romagnoli et al.）、セオレティカルアプライドジェネティックス（Theor. Appl. Genet.）、８０巻、７６９頁（１９９０年）；チェン等（Cheng et al.）、チャイニーズサイエンスブレティン（Chinese Sci. Bull.）、４１巻、４０頁（１９９６年））、HVはいずれかの親に比較して異種接合生物又は雑種生物でのみ合成される新規タンパク質（ホルモン、酵素或いは成長因子のような）により進むという考えが長くもたれた。（シュワルツ（Schwartz）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、４６巻、１２１０頁（１９６０年）；ジル（Gill）、遺伝と小麦改良（Genetics and Wheat Improvement）、エイケイグプタ編（A.K. Gupta Ed.）（オックスフォードアンドアイビーエッチパブリッシングカンパニー、ニューデリー（Oxford and IBH Publishing Co., New Delhi）、１９７７年）、２０４−２０７頁）；スカンダリオス等（Scandalios et al.）、アーカイブバイオケミストリーアンドバイオフィジック（Arch. Biochem. Biophys.）、１５３巻、６９５頁（１９７２年））。

更に生物学的欠損のある親でそれぞれが同一遺伝子の異種変異形を保有する親の子孫にほぼ正常な生物的発現型が修復される既知型HVを遺伝子内相補性又は対立遺伝子間相補性（IC）と呼ぶ。

異種接合型子孫で形成される新規タンパク質のいくつかはHVとは対照的に、いずれかの親に比し子孫の頑強性、生存率或いは健康を劣化したり病気を患うことがある。これらの生物的発現型を雑種衰弱（HD）と呼ぶ。

異種接合型生物での新規タンパク質の合成能は遺伝に関するメンデルの様式とは一致しないため、HVの遺伝力を正確に予測するとはできなかった。

セントラルドグマによると、タンパク質は遺伝子の遺伝で受け継いだDNA配列の指令のもとに一連のよく知られた生化学的ステップにより合成される。これらのステップはそれぞれの親から遺伝した遺伝子のDNA配列から一次RNA（イントロン誘導構造を含む）を読み取る遺伝子転写を含む。一次RNA分子内のイントロン誘導構造はスプライソソームと云う大きな細胞核タンパク質複合体により切り出され、エキソン誘導領域のみが残る。残留エキソン誘導領域は次いで融合し、成熟伝令RNA（ｍRNA）分子を形成する。次いでこのｍRNAが最後に翻訳と云うプロセスにより一次ポリペプチドの形成とアミノ酸配列を指令する。

又セントラルドグマによれば、遺伝子転写に続いてスプライソソームが一次リボ核酸分子と結合して、単分子縫合プロセス又は直線走査プロセスによりイントロン誘導成分を除去する。従って同一の一次RNA分子のエキソン誘導成分が集まって秩序だち良く規定された一連のシス反応によりｍRNAを形成すると考えられる。（エービ等（Aebi et al.）、トレンドインジェネティックス（Trends Genet.）３巻、１０２頁（１９８７年）；ブラウン等（Brown et al.）、アントニーバンレーベンヘーク（Antonie van Leeuwehhoek）、６２巻、３５頁（１９９２年））。

本発明はこのセントラルドグマを反論する根拠を提供し、その結果雑種強勢及び／又は雑種衰弱を人工的に創生する根拠を提供する。

新規ポリペプチドやタンパク質を合成するために、本発明者はスプライシング工程時に一人の親から受け継いだ遺伝子のエキソン３’末端を他の親の同一遺伝子の次の下流エキソン５’末端と連結させる一次RNAスプライシング機構により体内でハイブリッドｍRNAが生成できると仮定した。従って本発明者は新規ハイブリッドタンパク質を合成できる新規又はハイブリッドｍRNAが親の二つの異種対立遺伝子それぞれのエキソンかその一部を同一の成熟ｍRNA分子に組み入れるいまだに未認識な生化学的経路で生成することを示す。以下に記述するように、本発明者は該ハイブリッドｍRNA作成物を集合構築する生物的経路を証明した。

その結果本発明の最も広い様態で、HV及びHDの生物的発現型が異種接合型子孫で如何に産生するかを説明する分子遺伝機構を記載する。異種接合型子孫で形成され且つHVとHDを産生する新規遺伝子構造は、その親の遺伝性遺伝子コードを参照することではでは明白でない。

従って本発明によりHVや他の生物的に長短のある発現型の病気の診断治療及び／又は修復に有用な可能性のある候補遺伝子の同定法が提供される。

第一様態では動物又は植物の雑種強勢を生成できる遺伝子候補の同定法を提供し、本法は
（i）雑種強勢を示す動植物から単離した遺伝子候補の対立遺伝子のヌクレオチド配列を該動物又は植物の親から単離した対応対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較し、
（ii）アミノ酸配列をコードする雑種強勢を示す該動物又は植物の対立遺伝子でのヌクレオチド配列の違いを同定し、且つ
（iii）該動物又は植物の遺伝子候補の対立遺伝子間でのアミノ酸配列の変化を遺伝子候補内の二つ以上の異種エキソン内に位置するヌクレオチド配列によりコード化されているか判断するステップを含む

第二様態では動物又は植物の雑種衰弱（HD）を産生できる遺伝子候補の同定法を提供し、本法は
（i）該雑種衰弱（HD）を示す動物又は植物から単離した遺伝子候補の対立遺伝子のヌクレオチド配列を該動物又は植物の親から単離した対応対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較し、
（ii）アミノ酸配列をコードする該雑種衰弱（HD）を示す該動物又は植物の対立遺伝子のヌクレオチド配列の違いを同定し、且つ
（iii）該動物又は植物の遺伝子候補の対立遺伝子間でのアミノ酸配列の変化を遺伝子候補内の二つ個以上の異種エキソン内に位置するヌクレオチド配列によりコード化されているか判断するステップを含む。

第三様態では動物又は植物の雑種強勢又は雑種衰弱の産生法を提供し、本法は
（i）雑種強勢か雑種衰弱を促進する動物又は植物の遺伝子から単離した対立遺伝子のヌクレオチド配列を該動物又は植物の親から単離した対応対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較し、
（ii）アミノ酸配列変化をコードする雑種強勢か雑種衰弱を促進する該動物又は植物の対立遺伝子でのヌクレオチド配列の違いを同定し、
（iii）該動物又は植物の遺伝子候補の対立遺伝子間のアミノ酸配列の変化を遺伝子候補内の二つ以上の異種エキソン内に位置するヌクレオチド配列によりコード化されているか判断し、
（iv）ヌクレオチド配列が該動物又は植物内の雑種強勢か雑種衰弱を促進する対立遺伝子からなる作成物を産生し、
（v）該作成物を受容体植物細胞又は動物細胞に形質転換し、
（vi）該細胞から該作成物を発現する植物又は動物を再生するステップを含む。

第四様態では植物又は動物からｍRNAを単離し、該ｍRNAのヌクレオチド配列を植物又は動物の対立遺伝子の対応コード配列と比較するステップからなる植物又は動物中のハイブリッドｍRNAの有無の検出法を提供する。

第五様態ではエキソンが遺伝子の異種対立遺伝子からなる合成遺伝子含有作成物が提供され、該対立遺伝子により異種対立遺伝子間で変化を起こすアミノ酸配列変化にコードする。

本発明は更に植物又は動物の病気を克服し且つ／又は植物又は動物の雑種強勢を誘発するため体内で産生したハイブリッドｍRNAを使用することに関する。

植物細胞は農業的に重要な全植物種が好ましいが、裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物を含むいずれの高等植物から単離できる。好ましくは植物細胞は大麦、ライ麦、サトウモロコシ、メイズ、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、木綿、米、菜種（カノーラを含む）、ひまわり、ムラサキウマゴヤシ、サトウキビ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、イチゴ及びラズベリー、カンタロープ、人参、カリフラワー、コーヒー、キュウリ、なすび、ブドウ、甘露、レタス、マンゴ、メロン、タマネギ、パパイヤ、エンドウ豆、コショウ、パイナップル、ほうれん草、スクアッシュ、スイートコーン、たばこ、トマト、スイカ、バラ科果物（リンゴ、桃、梨、チェリー及びスモモのような）及びアブラナ科野菜（ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、芽キャベツ及びカブカンランのような）からなる一群から選んだ植物から単離する。発現型が変化しても良い他の作物、果実及び野菜としては大麦、干しぶどう、アボカド、オレンジ、レモン、グレープフルーツ及びタンジェリンのような柑橘類果物、アーティチョーク、サクランボ、クルミやピーナッツのようなナッツ、エンダイブ、リーク、クズウコン、ビート、キャッサバ、カブ、ラディッシュ、ヤムイモ、サツマイモのような根及び豆がある。本発明に使用しても良い他の植物細胞としては松、ポプラ及びユーカリのような木質種がある。より好ましくい植物細胞は米細胞、小麦細胞、大麦細胞、ライ麦細胞、サトウモロコシ細胞又はメイズ細胞である。

植物細胞の形質転換法は安定に植物細胞を形質転換できる技術の既知法のいずれかを含む。適切な手順がマメ科（ムラサキウマゴヤシ、大豆、クローバー等）、セリ科（人参、セロリ、アメリカボウフウ）、アブラナ科（キャベツ、ラディッシュ、菜種、ブロッコリー等）、ウリ科（メロン及びキュウリ）、イネ科（小麦、トウモロコシ、米、大麦、キビ等）、ナス科（ジャガイモ、トマト、たばこ、トウガラシなど）及び種々の他作物に対して利用できる。アンミラト等（Ammirato et al.）、（１９８４年）、植物細胞培養ハンドブックー作物種（Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species）、マックミラン出版社（Macmillan Publ. Co.）；島本等（Shimamoto et al.）、（１９８９年）、ネイチャー（Nature）、３３８巻、２７４−２７６頁；フロム等（Fromm et al.）、（１９９０年）、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）、８巻、８３３−８３９頁及びバシル等（Vasil et al.）、（１９９０年）、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）、８巻、４２９−４３４頁に記載の手順を参照。

好ましくは相同的組み換え、微粒子銃、原形質体のポリエチレングリコール仲介による形質転換、電気窄孔、炭化ケイ素繊維仲介による形質転換又はアグロバクテリウム仲介による形質転換からなる一群から選んだ方法で植物細胞を形質転換する。本発明の好ましい実施形態では、形質転換法としては微粒子銃を作成物含有DNAで塗布し、受容体細胞を微粒子発射体と接触させる微粒子銃法からなる。

他様態では本発明は（a）上記法による植物作成ステップと（ｂ）その植物を第二の植物又は自身と交雑させるステップからなる子孫産生法を提供する。

更に他様態では本発明は（a）上記法により産生したずれかの世代の植物の子孫植物を得、子孫植物が該作成物を含有し、且つ（ｂ）植物をそれ自身か第二の植物と交雑するステップを含む植物繁殖法を提供する。

第六様態では本発明は体細胞又は細胞核に形質転換する前に合成遺伝子を体細胞又は細胞核に挿入して、遺伝子操作動物又は遺伝子導入動物作成法を提供し、該合成遺伝子は遺伝子の異種対立遺伝子のエキソンを含み、該対立遺伝子には同一対立遺伝子では起こらないアミノ酸配列変化がコード化されている。

本発明は更に第六様態の方法で得た遺伝子操作動物又は遺伝子導入動物を提供する。

動物細胞は哺乳類及び魚が特に有用であるが、いずれの動物からも単離できる。適切な哺乳類源としては霊長類目、げっ歯目、ウサギ目、クジラ目、食肉目、奇蹄目及び偶蹄目メンバーがある。奇蹄目及び偶蹄目メンバーがバイオロジーの類似性と経済的重要性から特に好ましい。

例えば偶蹄目は9種の科に分布した約１５０の生物種を含む。ブタ（イノシシ科）、ペッカリー（ベッカリー科）、カバ（カバ科）、らくだ（らくだ科）、ネズミジカ（マメジカ科）、キリンとオカピ（キリン科）、鹿（シカ科）、プロングホーン（プロングホーン科）及びウシ、ヒツジ、山羊及びアンテロープ（ウシ科）である。これら動物の多くは各国で食用動物として用いらる。本発明に関してより重要なのは山羊、ヒツジ、ウシやブタのような経済的に重要な動物の多くが非常に類似したバイオロジーと高度なゲノム相同性を有することである。

奇蹄目はウマとロバを含み、両者共に経済的に重要であり且つ密接に関連している。実際にウマとロバは交配することが良く知られている。

一実施形態では動物細胞は有蹄動物から単離される。好ましくは有蹄動物をウシ科、ヒツジ科、シカ科、イノシシ科、ウマ科及びラクダ科の家畜か野生種からなる一群から選ぶ。この代表例としては雌ウシか雄ウシ、バイソン、バファロー、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、エルク、カリブー、山羊、水牛、ラクダ、ラマ、アルパカ及びブタがある。ウシ科類で特に好ましいのは温帯ウシ、ゼブウシ、水牛の雌牛又は雄牛である。

一実施形態では動物細胞は脊椎動物及び無脊椎動物のような水生動物から単離する。より好ましくは水生生物は魚、両生動物及び軟体動物からなる一群から選ぶ。魚としては限定はされないが、ゼブラフィッシュ、ヨーロッパ鯉、鮭、カダヤシ、テンチ、ヤツメウナギ、丸ハゼ、ティラピア及びマスがある。両生動物としては限定はされないが、ヒキガエルとカエルがある。軟体動物としては限定はされないが、パシフィックオイスター、ゼブラ貝、縞付きムール貝、ニュージーランドキリガイダマシ、スクリミンゴカイ、アカリカマイマイ及びビオンファラリア属とブリヌス属の病原媒介型カタツムリがある。

本発明作成物の動物細胞への形質転換は好ましくは相同組換えによる。相同組換え（分子遺伝学（Molecular Genetics）、ユーメルヒャー（U. Melcher）（１９９８年）参照）を好ましくは標的遺伝子含有組織培養物中で増殖した胚幹細胞のような細胞に操作作成物を添加して誘発する。より好ましくは形質転換幹細胞を新規胚盤胞に注入し、成熟動物で新規作成物を修復する。

ここで記載の文献の全てを文献で報告され且つ本発明と共に使用しても良い手順と試薬を記載開示する目的で引用する。これらは本発明が先行発明によりこの開示が予測できることを認めるものと解釈してはならない。

本発明の実施に際し別に示していない限り、技法の範囲内で従来の分子生物学、動植物生物学及び組み替えDNA技術を用いる。この技法は熟練者には熟知であり文献に十分説明されている。例えばマニアティス、フリッシュ、サンブルック（Maniatis, Fritsch & Sambrook）、“分子クローニング、実験室マニュアル”、（Molecular Cloning: A Laboratory Manural）（１９８２年）；“DNAクローニング、実践的アプローチ”（DNA Cloning: A Practical Approach）、一巻及び二巻（ディエヌグローバー編）（D.N. Clover, Ed.）、（１９８５年）；“オリゴヌクレオチド合成”（Oligonucleotide Synthesis）、エムジェイゲイト編（M.J. Gait, Ed.）、（１９８４年）；“核酸ハイブリダイゼーション”（Nucleic Acid Hybridization）、（ビーディハメス、エスジェイヒギンス編（B. D. Hames & S. J. Higgins, Ed.）、（１９８５年）；”形質転換と翻訳“（Transcription and Translation）、（ビーディハメス、エスジェイヒギンス編（B.D. Hames & S.J. Higgins, eds.）、（１９８４年）；ビーパーバル（B. Perbal）、”分子クローニングの実践的ガイド“（A Practical Guide to Molecular Cloning）、（１９８４年）及びサンブルック等（Sambrook, et al.）、“分子クローニング、実験室マニュアル”（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）、１２版（１９８９年）を参照。

以下の記述では組み替えDNA技術で用いる多くの用語を利用する。別に定義してない限りここで用いた科学技術用語の全ては、本発明が属する技術の熟知者には通常理解できる意味を有する。以下の文献に本発明で用いる多くの用語の一般的定義が提供されている。シングルトン等（Singleton, et al.）、“微生物学と分子生物学辞典”（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）、第2版（１９９４年）”； ケンブリッジ科学技術辞典“（The Cambridge Dictionary of Science and Technology）、（ウオーカー編（Walker ed.）、１９８８年）；”遺伝学用語集“（The Glossary of Genetics）第5版、アールリーガー等編（R. Rieger, et al.）、スプリンガー出版（Springer Verlag）（１９９１年）及びヘール、マーハム（Hale & Marham）、”ハーパーコリンズ生物学辞典“（The Harper Collins Dictionary of Biology）、（１９９１年）である。通常ここに記載の動植物維持や繁殖更には組み替えDNA技術の命名法と実験法は技術的に既知で通常使用の物である。

本発明は記載の特定材料や方法に限られず変えても良い。又ここで用いた用語法は特定実施形態を記載する目的のためだけで、本発明の範囲を限定する意図はなく付記の請求項によってのみ制限される。ここと付記請求項で用いるような“一つ”（“a”と“an”）及び“それ”（“the”）という単数形は文脈が明確に別だと指示しない限り、複数の引例をも含むことを指摘する必要がある。従って例えば“一つの植物細胞”の引例ではこの植物細胞が複数であることも含まれ、“一つの動物細胞”の例では一つ以上の動物細胞の引例でもある。ここに記載されているものと類似か同等の材料や方法はいかなる物でも本発明の実施や試験に使用できるが、好ましい材料と方法を次に記載する。

定義
“ポリヌクレオチド”、“ポリヌクレオチド配列”、“核酸配列”及び“核酸断片”／“単離核酸断片”という用語はここでは互換可能に用いる。これらの用語はヌクレオチド配列及び類似物を含む。ポリヌクレオチドとは任意に合成、非天然、改変ヌクレオチド塩基を含む単鎖又は二重鎖RNAやDNAポリマーである。DNAポリマー型のポリヌクレオチドは相補DNA、ゲノムDNA、合成DNA或いはそれらの混合物の一つ以上のセグメントからなっても良い。

“単離”ポリヌクレオチド“という用語は限定はされないが、天然にある環境で見られるように単離ポリヌクレオチド”を通常付随するか相互作用する他染色体DNAとRNA及び染色体外DNAとRNAのような他核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離ポリヌクレオチド”は天然にある宿主細胞から精製しても良い。熟練者には既知の在来の核酸精製法を用いて単離ポリヌクレオチドを得ることができる。この用語は又組み替えポリヌクレオチドと化学合成ポリヌクレオチドも包括する。

“組み替え”という用語は例えば核酸配列を別に分離した二つの配列セグメントを人工的に組み合わす、例えば化学合成や遺伝子操作法により単離の核酸を操作して作成すること意味する。

ここで用いる“実質的に類似”とは一つ以上のヌクレオチド塩基の変化によりコード化アミノ酸配列に変化をもたらさないか、一つ以上のアミノ酸置換によりヌクレオチド配列でコード化したポリペプチドの機能特性に影響しない核酸分子を意味する。

実質的に類似な核酸分子は又ハイブリッド形成能によっても特徴づけられる。この相同性の評価は技術の熟練者には良く理解されるように、厳密な条件下でDNA―DNAハイブリッド形成かDNA―RNAハイブリッド形成のいずれかにより提供される。（ハメス、ヒギンス編（Hames and Higgins, Ed.）、（１９８５年）、核酸ハイブリッド形成（Nucleic Acid Hybridisation）、アイアールエルプレス（IRL Press）、オックスフォード（Oxford）、英国）。ハイブリッド形成後の洗浄により厳密な条件が決まる。一組の好ましい条件では室温で15分間標準食塩クエン酸ナトリウム溶液（SSC））ｘ６と０．５％ドデルシル硫酸ナリウム（SDS）に始まり、45℃で30分間SSC ｘ２と０．５％SDSを繰り返し、次いで50℃で30分間SSCｘ０．２で０．５％SDSを二回という一連の洗浄を用いる。より好ましい厳密条件の組み合わせではより高い温度を用い、その洗浄はSSCｘ０．２で０．５％SDSで最後の二回の30分間洗浄を60℃に昇温する以外は上記と同じである。他の好ましい高度に厳密な条件では65℃で０．１ｘSSCで０．１％SDSによる二回洗浄を用いる。

“合成遺伝子”や“合成核酸断片”は技術の熟知者に既知の方法を用いて化学合成したオリゴヌクレオチドビルディングブロックから構築できる。これらのビルディングブロックは連結とアニールにより、より大きい核酸分子を形成し、酵素により集合して所望の全核酸分子を構築できる。核酸断片に関連した“化学合成”とは成分ヌクレオチドを体内で構築することを意味する。核酸断片の手動による化学合成はよく確立された手法を用いて達成するか、自動的化学合成を多くの市販機械の一つを用いて実施できる。従って核酸断片は宿主細胞のコドンバイアスを反映するようヌクレオチド配列最適化に基づいて最適遺伝子発現に合わすことができる。熟練者にはもしコドン使用が宿主が好むコドンに偏るなら、遺伝子発現が成功する可能性がわかる。好ましいコドンの配列情報が利用できる宿主細胞由来遺伝子の調査をもとに決定できる。

“候補遺伝子の対立遺伝子”は候補遺伝子配列の正常対立遺伝子と同様に個体に雑種強勢か雑種衰弱の原因となる変化を保有する対立遺伝子を意味する。従ってここで用いた“候補遺伝子配列”及び“候補遺伝子の対立遺伝子”という用語は遺伝子配列、対立遺伝子或いは領域を含む二重鎖DNA及び遺伝子配列、対立遺伝子或いは領域を含む単鎖DNAのいずれか（即ち有意鎖か非有意鎖のいずれか）を意味する。

“候補遺伝子”又は“遺伝子”はコード配列に先行（５’非コード配列）、中間及び直後（３’非コード配列）の制御配列を含む特定タンパク質を発現する核酸断片を意味する。“自然遺伝子”は自然に見いだされる自身の制御配列をもつ遺伝子を意味する。“キメラ遺伝子”又は“外来性遺伝子”はここでは互換可能で用い、自然では一緒には見られない制御配列とコード配列からなる固有遺伝子ではないいずれかの遺伝子を意味する。従ってキメラ遺伝子か外来性遺伝子は異なる起源に由来する制御配列とコード配列、又は同じ起源に由来する制御配列とコード配列からなっても良いが、自然で見られるのとは異なる形で配列される。“外来性遺伝子”は生物ゲノムの自然部位にある固有遺伝子を意味する。“外来遺伝子”は宿主生物には通常見られないが、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は自然にない生物に挿入した固有遺伝子かキメラ遺伝子を含むことできる。“導入遺伝子”は形質転換法によりゲノムに導入した遺伝子である。

“コード配列”は特定アミノ酸配列をコードしたヌクレオチド配列を意味する。
アミノ酸配列相同体”又は“同一性”という用語は類似アミノ酸配列をもつタンパク質を意味する。技術者には重要なアミノ酸配列はタンパク質の機能領域内にあることがわかる。従って相同タンパク質で相同性がアミノ酸配列長さの４０％以下であるが、一つの機能領域では９０％以上であることが可能である。

アミノ酸はここでは一般的にしられた三文字記号か国際純正応用化学連合国際生化学連合（IUPAC-―IUB）生化学命名法委員会推薦の一文字記号のいずれかで表示する。

ヌクレオチドも同様に一般に認められた一文字記号で表示する。

“保存的修正変異体”はアミノ酸配列と核酸配列の両者に適応する。特定の核酸配列については、保守的修正変異体は同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコード化するこれら核酸か、核酸がアミノ酸配列をコード化しない場合には実質的に同一配列を意味する。

遺伝コードの縮重性のため多数の機能的に同一の核酸がいずれかの所定タンパク質をコード化する。例えばコドンGCA、GCC、GCG及びGCU全てがアミノ酸のアラニンをコード化する。従ってアラニンがコドンにより特定された位置全てで、そのコドンはコード化ポリペプチドを変化することなしに記載の対応コドンのいずれかに変化できる。この核酸変異体は“沈黙変異体”であり、保存的修正変異体の一種である。ここでポリペプチドをコード化する全核酸配列により核酸の全ての可能な沈黙変異体を記述する。技術者には核酸の各コドン（通常メチオニン用の唯一のコドンであるAUGを除いて）は修飾されて機能的に同一分子を生じることがわかる。従ってポリペプチドをコード化する核酸の各沈黙変異体それぞれは記述配列に潜在する。

アミノ酸配列に関しては技術者には“保守的修正変異体”はアミノ酸の化学的類似アミノ酸置換によるコード配列変化により生ずることがわかる。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表は技術的によく知られている。

以下の６グループのそれぞれは互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）；
アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
アルギニン（R）、リシン（K）；
イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）及び
フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）、
（例えばクレイトン（Creighton）、タンパク質（Proteins）、(１９８４年)参照）。

“非保存的修正変異体”という用語は保存的修正置換を含まないアミノ酸変化を意味する。例えばフェニルアラニンにタイするアラニン置換は非保存的修正変異体を構成する。

“制御配列”はコード配列の上流（５’非コード配列）、内部又は下流（３’非コード配列）に位置し、転写、RNAプロセシングか安定性又は付随コード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を意味する。制御配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列及びスプライス部位選択に影響する配列を含んでも良い。

“プロモーター”はコード配列か機能性RNAの発現を制御できるヌクレオチド配列を意味する。通常コード配列はプロモーター配列の３’に位置している。プロモーター配列は近位上流要素とより遠位の上流要素からなり、後者の要素はしばしばエンハンサーと呼ばれる。従って“エンハンサー”はプロモーター活性を刺激でき、プロモーターの先天的要素かプロモーターのレベルか組織特異性を増強するために挿入した非相同要素であるヌクレオチド配列である。プロモーターは全体が固有遺伝子誘導されるか、自然にある異種プロモーターから誘導の異種要素からなるか、合成ヌクレオチドセグメントでさえ構成できる。技術の熟知者には異種プロモーターは異なる組織や細胞型で、或いは発達の異なる段階で、或いは異なる環境条件に応えて遺伝子発現を指示できることがわかる。核酸断片を大部分の細胞型で大抵の場合発現するプロモーターは通常“構成プロモーター”と呼ばれる。

“翻訳リーダー配列”は遺伝子プロモーター配列とコード配列間に位置するヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列上流の完全プロセス化伝令ｍRNAに存在する。翻訳リーダー配列は一次転写物の伝令RNAへのプロセシング、伝令RNAの安定性或いは翻訳効率に影響する。

翻訳リーダー配列の例は記載されている。（ターナー、フォスター（Turner and Foster）、（１９９５年）、モレキュラーバイオテクノロジー（Mol. Biotech.）、３巻、２２５−２３６頁）。“３’非コード配列”はコード配列下流に位置するヌクレオチド配列を意味し、ポリアデニル化認識配列と伝令RNAプロセシングや遺伝子発現に影響しうる制御信号をコード化する他配列も含む。ポリアデニル化信号は通常ポリアデニル酸領域の伝令RNA前駆体の３’末端への付加に影響する特性がある。異種３’非コード配列の使用についてはインゲルブレヒト等（Ingelbrecht et al.）、（１９８９年）、プラントセル（Plant Cell）、1巻、６７１−６８０頁に例示されている。

“RNA転写物”はDNA配列のRNAポリメラーゼ触媒転写で生じる産物を意味する。RNA転写がDNA配列の完全な相補的コピーの場合は、このものは一次転写物と呼ばれる。この一次転写物の転写後プロセシング由来のRNA配列の場合には成熟RNAと呼ばれる。“伝令RNA（ｍRNA）”はイントロンをもたず且つ細胞によりポリペプチドに翻訳できるRNAを意味する。“相補DNA”はｍRNAに相補的でｍRNA由来のDNAを意味する。相補DNAは単鎖でも良く、又例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて二重鎖型に変換できる。“センスRNA”はｍRNAを含有し、細胞によりポリペプチドに翻訳できるRNA転写物を意味する。“機能性RNA”はセンスRNA、アンチセンスRNA、リボザイムRNA或いは翻訳されないが細胞プロセスに影響する他RNAを意味する。

“操作可能に連結した”という用語は単一ポリヌクレオチド上の二つ以上の核酸断片の会合を意味し、その結果一つの機能が他により影響されることを意味する。例えばプロモーターがそのコード配列発現に影響できる場合（即ちコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、プロモーターはコード配列と操作可能に連結している。コード配列はセンス配向やアンチセンス配向の制御配列と操作可能に連結できる。

ここで用いた“発現”という用語は本発明の核酸断片由来のセンス（ｍRNA）の転写と安定な蓄積を意味する。発現は又ｍRNAのポリペプチドへの翻訳を意味する。

“タンパク質”や“ポリペプチド”はポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのコード配列により決まる特定順序に配列したアミノ酸鎖である。各タンパク質やポリペプチドは独特な機能を有する。

“変性レベル”や“変性発現”は遺伝子導入生物での一つ又は複数の遺伝子産物産生がその量や割合で正常生物や非形質転換生物の場合と異なることを意味する。

タンパク質の記述に用いた“成熟タンパク質”や“成熟”という用語は、翻訳後プロセスのポリペプチド、即ち一次翻訳産物に存在するプリペプチドかプロペプチドのいずれかを除去したものを意味する。タンパク質の記述に用いた“前駆体タンパク質”や“前駆体”という用語は、ｍRNA翻訳の一次産物、即ちプリペプチドとプロペプチドが今なお存在することを意味する。プリペプチドとプロペプチドは限定はされないが細胞間局在化信号でもよい。

“形質転換”は核酸断片の宿主生物のゲノムへの転移を意味し、その結果遺伝的に安定な遺伝をもたらす。転写核酸断片含有の宿主生物を“遺伝子導入”生物と呼ぶ。植物形質転換法の例としてはアグロバクテリウム仲介形質転換（ドゥブレール等（De Blaere et al.）、（１９８７年）、メソッドインエンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、１４３巻、２７７頁）、相同性組み替えと粒子加速形質転換技術か“遺伝子銃”形質転換技術がある。（クライン等（Klein et al.）、（１９８７年）、ネーチャー（Nature）（ロンドン）、３２７巻、７０−７３頁；米国特許４，９４５，０５０でここに文献として取り入れている）。従って本発明の単離ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入複製できる組み換え作成物、代表的にはDNA作成物に組み入れることができる。このような作成物としては複製システム及び所定宿主細胞にポリペブチドコード配列を転写翻訳できる配列を含むベクターがある。植物細胞の安定な形質移入に適するか、組み換え植物の確立に適した多くのベクターが。例えばポウエル等（Pouwels et al.）、クローン化ベクター、実験室マニュアル（Cloning Vectors: A Laboratory Manual）、１９８５年、補足１９８７年；バイスバッハ、バイスバッハ（Weissbach and Weissbach）、植物分子生物学のための方法（Methods for Plant Molecular Biology）、アカデミックプレス（Academic Press）、１９８９年；及びフレビン等（Flevin et al.）、植物分子生物学マニュアル（Plant Molecular Biology Manual）、クルワーアカデミック出版社（Kluwer Academic Publishers）、１９９０年に記載されている。典型的には植物発現ベクターとしては、例えば５’及び３’制御配列と優勢選択マーカーの転写制御のもとでの一つ以上のクローン化植物遺伝子がある。このような植物発現ベクターとしては又プロモーター制御領域（例えば誘導的発現か恒常的発現、環境的制御発現か発生的制御発現、細胞特異的発現か組織特異的発現を制御する制御領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、RNAプロセシング信号、転写終結部位及び／又はポリアデニル化信号がある。

“PCR”か“ポリメラーゼ連鎖反応”は特定DNAセグメントの増幅技術に用いる技法として技術の熟知者にはよく知られている。（米国特許４，６８３，１９５及び４，８００，１５９）。

“子孫”という用語は特定の親植物か親植物の組に由来した種や植物を含むいずれかの次世代を意味する。

“再生”とは植物細胞（例えば植物原形質体や外植片）から植物成長するプロセスである。

“選択DNA”とは宿主ゲノムに導入されたDNAセグメントである。好ましい選択DNAとしては一つ以上の外来性遺伝子と宿主細胞中の外来性遺伝子、例えばプロモーターとターミネーターを発現する要素がある。選択DNAをもつ一つ以上のエンハンサー要素を含有することによりその利益が達成される。

“形質転換細胞”とは外来性DNA分子をその細胞に導入することでDNAが変化した細胞である。

“遺伝子導入植物”とは形質転換植物細胞か原形質体誘導のいずれかの次世代植物か子孫で、植物DNAが同一株の生来の非遺伝子導入植物に本来存在しない導入外来性DNA分子含む。遺伝子導入植物は更に形質転換する植物に生まれつきの配列を含有するが、“外来性”遺伝子が最初か野生型遺伝子産物の構造かその遺伝子の発現レベルか発現様式を変えるために遺伝子技術法により変化した配列である。

“ベクター”とは宿主細胞で複製できるDNA分子及び／又は他のDNAセグメントを付着セグメントの複製が起こるように宿主細胞と操作可能で連結したDNA分子である。プラスミドは典型的ベクターであるが、新規遺伝子を細胞に運搬するのに用いるDNA分子である。プラスミドはDNAの独立安定な自己複製する典型的ベクターである。

ここで用いた“遺伝子型”という用語は個々の細胞、細胞培養物、植物又は動物の遺伝子構成を意味する。

ここで用いた“ヘテロ接合体”という用語は少なくとも一座で異種対立遺伝子（所定遺伝子形）をもつ各二倍体細胞、各倍数体細胞、植物又は動物を意味する。

ここでもちいた“ヘテロ接合性”という用語は特定遺伝子座に異種対立遺伝子（所定遺伝子形）が存在することを意味する。

ここで用いた“ホモ接合体”という用語は一つ以上の座で同一対立遺伝子をもつ各細胞か植物を意味する。

ここで用いた“ホモ接合性”という用語は相同性染色体セグメントの一つ以上の座で同一の対立遺伝子が存在することを意味する。

実験手順
本発明の一様態は候補遺伝子の同定法に関する。“候補遺伝子”という用語は雑種強勢か雑種衰弱を産生する可能性をもつ一つ又は複数の遺伝子を意味する。“雑種強勢”や“ヘテロシス”という用語はここでは互換的に用い、雑種の性能が純血種以上に成長率、受精率及び耐病性のような形質で顕著に増加することを意味する。特に遺伝子候補は一つの動物又は植物でヘテロ接合的で且つ機能的であり、雑種強勢をもたらす遺伝子である。一実施形態では各遺伝子の対立遺伝子はコード配列の異なるエキソンでヌクレオチド配列の変化を含み、その変化はアミノ酸配列の変化をもたらす。例えば植物又は動物が遺伝子Xの二つの対立遺伝子、即ち遺伝子Xのヘテロ接合体を含むと、本発明の候補遺伝子としての第一の必要要件を満たす。第二判定基準は変化がいずれかの発現タンパク質でアミノ酸配列の変化をもたらすヌクレオチド配列の配列変化であろう。第三判定基準は各対立遺伝子は配列変化を含むがその配列変化は各対立遺伝子の同一位置には見いだせないことである。例えば上記遺伝子Xにおいて対立遺伝子は対立遺伝子１の変化は位置１０の配列変化を含有できるが、対立遺伝子２では変化は位置２０で起こる。この変化がアミノ酸配列に変化をもたらすならば、これは第二と第三の判断基準を満たすであろう。第四判断基準は単に同一エキソン内の異なる位置に現れるよりはむしろ異種エキソンに現れる変化である。

一実施形態では候補遺伝子はアミノ酸変化をコードする一つ以上のヌクレオチド配列変化を有し、その変化は異種対立遺伝子上の異種エキソンで見いだされる。

候補遺伝子は好ましくは少なくとも三種のｍRNAを産生する。一つは一つの対立遺伝子と同一のｍRNA分子を、一つは第二対立遺伝子のコード配列と同一であったもので、両対立遺伝子エキソンの組み合わせからなるハイブリッドｍRNAである。明らかにエキソンの数により異種ハイブリッドｍRNA分子の数は多い。

候補遺伝子の同定法は比較的簡単で、これらは候補遺伝子のルーチンな配列分析、PCR増幅セグメントのサザンブロット分析により同定できる。（例えばギーゼルマン等（Gieselmann et al.）、（１９８９年）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８６巻、９４３６−９４４０頁を参照）。同種管及び／又は閉管での増幅検出は技術的に多くの方法を用いて、例えばPCR反応でのタグマン（TagMan（登録商標）） ハイブリッド形成プローブで一旦十分な増幅が起こると、標的核酸に特異な蛍光測定を用いて実施できることは技術の熟知者にはわかる。しかしローチェライトサイクラー（RocheLgihtcylcle（登録商標））の性質と速度のため、好ましい方法は蛍光標識化ハイブリッド形成オリゴヌクレオチドを用いてローチェライトサイクラー（RocheLgihtcylcle（登録商標））でリアルタイムPCRと融解曲線分析により行う。

技術の熟知者はタグマンのアプローチ（米国特許５，５３８，８４８及び５，６９１、１４６）、蛍光偏光法（例えばギブソン等（Gibson et al.）、クリニカルケミストリー（Clin. Chem.）、１９９７年、４３巻、１３３６−１３４１頁）及びインベーダー法（例えばアガルウオール、ピー等（Agarwal P. et al.）、ダイアグノウスティックモレキュラーパソロジー（Diagn. Mol. Pathol.）、２０００年、９月、９巻（３号）、１５８−１６４頁；ライアンディ等（Ryan D et al.）モレキュラーダイアグノシス（Mol. Diagn.）、１９９９年、６月、４巻（２号）、１３５−１４４頁）のような類似の定量“リアルタイム”で且つ同種核酸増幅／検出システムがあることを知っているが、このようなシステムは又記載の本発明での使用に適応でき、適切なデザインであれば核酸増幅や遺伝子変異や多型性検出に関して対立遺伝子識別をリアルタイムでモニターできる。

一旦候補遺伝子が同定されると、本発明の他様態に用いるように単離又は合成的に産生できる。例えば雑種強勢を産生すると疑われる候補遺伝子は、宿主細胞（植物又は動物）及び再生遺伝子導入植物か動物に形質転換できる。

遺伝子導入動物細胞の産生法は典型的には（１）特定DNA配列を細胞核ゲノムに挿入するのに用いる適切なDNA作成物を集合するステップ、（２）このDNA作成物を細胞に形質移入するステップ、及び（３）ランダムな挿入及び／又は相同的組み換えを発生させるステップを含む。このプロセスでの修飾は一つ又は複数の適切DNA作成物の標的ゲノムへの挿入、標的ゲノムからのDNAの欠失及び／又は標的ゲノムの変異である。

DNA作成物は対象の遺伝子、例えば異種エクソンは異なる配列からなる異種対立遺伝子から選んだエクソン含有合成遺伝子を含有できると同時に、制御プロモーター、インスレーター、エンハンサー及びリプレッサーを含む種々の要素と更にはDNA作成物を転写したRNAとのリボゾーム結合用要素を含むことができる。これらの例は技術の通常の技量者にはよく知られており限定を意味しない。

制御要素用DNA配列に関して利用できる有効な組み換え型DNA技術とデータベース的に商業部門から容易に入手できる遺伝子により、技術の通常の技量者はここに記載の材料と方法を用いて遺伝子導入型動物細胞の確立に適したDNA作成物を容易に産生できる。

例えば候補遺伝子用の全ヌクレオチドコード配列が、例えばDNA配列決定や制限酵素分析で決定した単一相補DNA、ゲノムDNA又は他のDNAで得られない場合には、適切なDNA断片（例えば制限断片やPCR増幅産物）をいくつかのDNAから回収し、互いに共有結合的に連結して全コード配列を構築しても良い。DNA断片との好ましい共有結合連結法はT4DNAリガーゼのようなDNA連結酵素を用いて連結する。次いで単離候補遺伝子をプラスミドか発現ベクターに組み入れることができる。

動物細胞用の形質移入法は技術の通常の技量者にはよく知られており、DNA作成物を動物細胞に形質移入を行う材料と方法は市販されている。動物細胞にDNA作成物を形質移入するのに通常用いる材料は、例えばリポフェクチン^TM（Lipofectin^TM）のような親油性化合物である。特定の親油性化合物によりDNA作成物の細胞への形質移入を仲介するリポソーム形成を誘発できる。

DNA作成物による標的配列をDNA作成物の合理的設計により細胞核ゲノムの特異領域に挿入できる。これらの設計技術と方法は技術の通常の技量者にはよく知られている。例えば米国特許５，６３３，０６７、米国特許５，６１２，２０５及びPCT公開WO９３／２２４３２を参照し、これら全てはここに文献として取り入れてある。一旦所望DNA配列が細胞核ゲノムに挿入されると、挿入領域の位置及び所望DNAを細胞核ゲノムに挿入する頻度は技術の熟知者にはよく知られた方法で同定できる。

一旦導入遺伝子がドナー細胞の細胞核ゲノムに挿入されると、本発明の他ドナー細胞のようにこの細胞を核転移法での細胞核ドナーとして使用できる。細胞核の卵母細胞への転移法は好ましくは再構成細胞を形成する細胞融合を含む。

融合は通常は直流電気パルスを接触／融合面全域に加えて誘発するが、追加の交流電流を用いてドナー細胞と受容体細胞の整列を助けることができる。電気融合により原形質膜の一過性分解を起こすに十分で、且つその膜を迅速に再編成するに十分なだけ短い電気パルスを発生する。従って二つの隣接膜で分解が誘発され再編成により脂質二重層が混ざると、この二つの細胞間にチャネルが開く。この小さな開口は熱力学的に不安定性なため二つの細胞が一つなるまで拡張する。このプロセスの更なる考察に関してはプラター等（Prather et al.）による米国特許４，９９７，３８４を文献とする。（ここにその全てを文献として取り入れてある）。例えば蔗糖、マニトール、ソルビトール及びリン酸塩緩衝溶液を含む種々の電気融合媒体を用いることができる。

融合は又融合誘導因子としてセンダイウイルスを用いてもできる。（グラハム、ウイスターイノトロピックシンポジウムモノグラフ（Wister Inot. Symp. Monogr.）、９巻、１９頁、１９６９年）。融合は又細胞をポリエチレングリコールのような融合促進薬に暴露しても誘導できる。

好ましくはドナー動物細胞と卵母細胞を500□ｍ融合チャンバーに置き、２６℃―２７℃の融合培地（０．３Mマニトール、０．１ｍM硫酸マグネシウム、０．０５ｍM塩化カルシウム）４ｍｌで覆う。次いで細胞を７０−１００Ｖの二重直流（DC）電気パルスを約１５□秒間おおよそ１秒間隔で印加して電気融合する。次いで融合後生成した融合再構成細胞を活性化するまで適切な培地、例えばTCM-199培地に置く。

細胞融合の好ましい方法ではドナー動物細胞を最初に除核した卵母細胞に付着する。例えば動物細胞と除核した卵母細胞膜を融合できるように動物細胞を除核した卵母細胞に付着するような化合物を選択する。この化合物は細胞を凝集できるいずれの化合物でも良い。この化合物は炭水化物を結合又は凝集できるタンパク質か糖タンパク質でも良い。より好ましくはこの化合物はレクチンである。レクチンはコンカナバリンA、カナバリンＡ，リシン、大豆レクチン、ハス種レクチン及びフィトヘムアグルチニン（PHA）の一群から選ぶことができる。好ましくはこの化合物はPHAである。

一つの好ましい実施形態では上記の電気融合法は又更なる融合ステップとなる上記の融合ステップで一つのドナー動物細胞と二つ以上の除核卵母細胞を含む。二重融合法は再構成細胞の細胞質体積を増加するという効果がある。

再構成動物細胞は通常細胞核ドナーとレシピアント卵母細胞の融合の前、間及び／又は後に電気的手段及び／又は非電気的手段により活性化する。（例えばサスコーパリッシュ等（Susko-Parrish et al.）、米国特許５，４９６，７２０を参照）。活性化法としては
電気パルス、化学的誘導衝撃、精子侵入、二価カチオン、例えばマグネシウム、ストロンチウム、バリウム又はカルシウムを、例えばイオノフォアの形で卵母細胞原形質へ導入し卵母細胞中の二価カチオンレベルを増加する。二価カチオン増加の他法としては電気衝撃、エタノール処理及びケージド配位子処理があり、且つ
卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化を既知法、例えばキナーゼ阻害剤、例えば６−ジメチルアミノプリン、スタウロスポリン、２―アミノプリン及びスフィンゴシンのようなセリンースレオニンキナーゼ阻害剤を添加して減少する。代わりに細胞タンパク質のリン酸化は脱リン酸化酵素、例えば脱リン酸化酵素２A及び脱リン酸化酵素２Bを卵母細胞に導入して減少しても良い。

活性化再構成動物細胞や胚は技術の通常技量者にはよく知られた培地で通常培養し、限定はされずにTCM-199プラス１０％ウシ胎仔血清、タイロードーアルブミンー乳酸ーピルビン酸（TALP）、ハムF-10プラス１０％ウシ胎子血清、合成卵管液（“SOF”）、B2、CR1aa、中乃至高カリウム単一性培地（“KSOM”）がある。

再構成細胞は又既知法で活性化しても良い。その一番好都合な方法としては、例えば生理的温度以下で、実質的には再構成細胞に寒冷ショックか実際に冷温ショックを加えて再構成細胞を培養する。この方法は胚を通常暴露する生理的温度条件に比し冷たい室温で再構成動物細胞を培養する。適切な卵母細胞活性化法はサスコーパッリッシュ等（Susko-Parrish et al.）の米国特許５，４９６，７２０の主題であり、ここにその全体を文献として取り入れてある。

次いで活性化再構成動物細胞を細胞か細胞コロニーが産生するまで適切な試験管内培地で培養できる。動物胚の培養成熟に適した培地は技術的に良く知られている。ウシ胚の培養維持に用いる既知培地の例としては、ハムF-10プラス１０％ウシ胎子血清、TCM-199プラス１０％FCS、タイロードーアルブミンー乳酸ーピルビン酸（TALP）、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（PBS）、イーグルーホウィットン培地がある。卵母細胞の収集と成熟に用いる最も一般的な培地はTCM-199及びウシ胎仔血清、新生仔血清、発情雌ウシ血清、子ヒツジ血清或いは去勢ウシ血清を含む１−２０％血清補充剤である。好ましい維持培地としてはアール塩、１０％ウシ胎仔血清、０．２ｍMピルビン酸ナトリウム及び５０□ｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを含むTCM-199である。上記のいずれも又顆粒膜細胞、卵管細胞、BRL細胞及び子宮細胞及びSTO細胞のような種々の細胞型をもつ共培養を含んでも良い。

その後培養再構成動物細胞や胚は好ましくは洗浄し適切な培地、例えば好ましくは集密的支持細胞層含有ウエルプレートに含まれる１０％ウシ胎仔血清含有TCM-199に置く。例目的での適切な集密的支持細胞としては、線維芽細胞と上皮細胞、例えば有蹄動物由来の線維芽細胞と子宮上皮細胞、ニワトリ線維芽細胞、ネズミ（例えばマウスやラット）線維芽細胞、STOとST-m220支持細胞系統及びBRL細胞がある。

一実施形態では支持細胞はマウス胚線維芽細胞からなる。適切な線維芽細胞支持細胞層は技術的に良く知られている。

再構成細胞が雌の受容体への移植に適した大きさになるか、細胞や細胞コロニーを産生に用いる細胞を得るために再構成動物細胞を支持細胞層上で培養する。好ましくはこれら再構成細胞を少なくとも細胞約２乃至４００個、より好ましくは細胞約４乃至１２８個、最も好ましくは少なくとも細胞約５０個になるまで培養する。この培養を適切な条件、即ち約39℃で５％炭酸ガス下に増殖最適化のために培地を通常約２−５日ごとに、好ましくは約3日ごとに変えて行う。

本発明における胚移植法と動物の受容体管理方法は胚移植産業で用いる標準的方法である。同調移植は本発明が成功するために重要で、即ち細胞核移植胚の段階が雌の受容体の発情周期と同期することが重要である。 この利点と如何に受容体を維持するかについては、シーデル、ジーイージュニアー（G.E. Seidel Jr.）（“ウシでの胚移植法に関する批判的レヴィウ（Critical review of embryo transfer procedure with cattle）（１９８１年）エルマストロニアーニジュニア、ジェイディービッガー編（L. Mastroianni, Jr. and J. K. Biggers, ed.）、試験管内受精と胚の発達（Fertilization and Embryonic Development in Vitro）、プレアム プレス（Pleum Press）、ニューヨーク、ニューヨーク州（N.Y.）の内容をここに文献として取り入れてある。

簡単には胚盤胞を同調受容体の子宮に非外科的か外科的に移植しても良い。技術の通常技量者には良く知られた技法と培地を用いて他の培地を用いても良い。一つの方法ではクローン胚を新鮮なKSOMで三回洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン（BSA）をもつKSOMで4日間、続いて１％BSAをもつKSOMで更に３日間５％炭酸ガス、５％酸素及び９０％窒素下、39℃で培養する。胚の発達を技術的に知られた標準法により調べ段階づけをする。切断率を２日目に記録し切断胚を更に7日間培養する。7日目に胚盤胞の発達を記録し、胚及び／又は動物入手の可能性により一つ又は二つの胚を非外科的にそれぞれの同調養母の胚に移植する。

養母は好ましくは直腸触診か超音波検査により妊娠４０日目、６０日目、９０日目及び１２０日目のように定期的に妊娠状態を調べる。好ましくは妊娠期間中注意深く観察し継続的に超音波モニター（毎月）を行い、種々の妊娠段階での胚の損失を評価する。流産した胎仔はもし可能ならDNA分類のために回収し、クローンの状態と同様にルーチンの病理検査で確認する。

この方法のステップ間で産生の再構成動物細胞、活性化再構成動物細胞、胎仔及び動物及びそれから回収した細胞、細胞核及び他の細胞成分も又本発明の実施形態であることを強調したい。産生動物という用語は生存可能な動物であることが特に好ましい。

本発明は又例えば細胞移植、組織移植及び臓器移植に使用可能な胚、胎仔又は子孫を産生するのに用いる。動物の胎仔細胞か成人細胞を採取しクローンニング法に用いて、種々の細胞組織及び多分臓器を器官形成により発達したクローン胚から得ることができる。細胞や組織や臓器は同様にクローン子孫から単離できる。このプロセスにより細胞療法や遺伝子療法を含む多くの医学療法と獣医学療法用“材料”のソースが提供できる。細胞をその細胞が由来した動物へ移植で戻すと、免疫拒絶は防がれる。又これらのクローンから多くの細胞型が単離できるので、造血的キメラ現象のような他の方法論を用いて同種属と同様に種族間での動物の免疫拒絶を避けることができる。

一実施形態では候補遺伝子は上で検討したように雑種強勢を産生できる植物遺伝子である。

もともとはハイブリッド植物は無作為現象により一つのエリート同系交配植物を一つ以上の他の遺伝的に異種の多様な同系交配植物とを交雑させて産生する。この交雑は一つの同系交配のエリート植物の花粉を採取し、他の同系交配エリート植物に移植することからなる。二つの同系交配物の交雑による種子は第一世代のハイブリッドでありF1と呼ぶ。商業的に価値ある同系交配物のF1はいずれの親より高収率、群落性及び他の重要特性の改善が得られる。

本発明で一旦候補遺伝子が同定されると、それを単離か合成して発現ベクターにサブクローンするか直接受容体植物に移植する。

DNAセグメントを細胞に移植するには多くの方法あるが、全てがDNAを植物細胞に送達するのに適しているわけではない。本発明での使用に適した方法はDNAを細胞に導入できる実質的にいかなる方法も含まれると考えられるが、それらは原形質体のポリエチレングリコール仲介による形質転換のようなDNAの直接送達（オミルレー等（Omirulleh et al.）、１９９３年）、乾燥／阻害仲介によるDNA取り込み（ポトリクス等（Potrykus et al.）、１９８５年）、電気窄孔（米国特許５，３８４，２５３、特にここにその全体を文献として取り入れてある）、炭化ケイ素繊維による攪拌（ケップラー等（Kaeppler et al.）、１９９０年、米国特許５，３０２、５２３で特にここにその全体を文献として取り入れてあり且つ米国特許５，４６４，７６５で、特にここにその全体を文献として取り入れてある）、アグロバクテリウム仲介による形質転換（米国特許５，５９１，６１６と米国特許５，５６３，０５５で両者を特にここにその全体を文献として取り入れてある）及びDNAを塗布した粒子の加速（米国特許５，５５０，３１８、米国特許５，５３８，８７７及び米国特許５，５３８，８８０でそれぞれをここにその全体を文献として取り入れてある）等がある。これら技法を利用して植物細胞を安定に移植でき、これら細胞は遺伝子導入植物に成長する。ある実施形態では促進法が好ましく、例えば微粒子銃やその類似法が含まれる。

候補遺伝子DNAを電気窄孔法で導入したい場合、クリジゼック等（Kryzek et al.）の方法（米国特許５，３８４，２５３で、ここにその全体を文献として取り入れてある）が特に有利であると考えられる。この方法ではペクチン分解酵素のようなある細胞壁分解酵素を用いて、標的の受容体細胞を未処理細胞よりも電気窄孔で形質転換されやすくする。代わりに受容体細胞を機械的外傷により形質転換されやすくする。

電気窄孔による形質転換を起こすには細胞の懸濁培養物か胚形成カルスのようなもろい組織を用いるか、未成熟胚か他の器質化組織を直接移植しても良い。この技法では選択細胞の細胞壁をペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）に暴露するか、制御しながら機械的に創傷して細胞壁の一部を分解する。無傷細胞を電気窄孔により形質転換したいくつかの種属の例としてはメイズ（米国特許５，３８４，２５３；デゥアルイン等（D'Halluin et al.）、１９９２年；ローデス等（Rhodes et al.）、１９９５年）、小麦（ゾウ等（Zhou et al.）、１９９３年）、トマト（ホウ、リン（Hou and Lin）、１９９６年）、大豆（クリストウ等、（Christou et al.）１９８７年）及びたばこ（リー等、Lee et al.１９８９年）がある。

又植物の電気窄孔による形質転換に原形質体を使用できる。（ベーツ（Bates）、１９９４年；ラゼッリ（Lazzeri）、１９９５年）。例えば子葉由来原形質体の電気窄孔による遺伝子導入大豆植物の産生についでは、ディールとウイデゥホルム（Dhir and Widholm）により国際特許申請WO９２１７５９８に記載されている。（具体的にここに文献として取り入れてある。）原形質体の形質転換を記載した種族の他例としては大麦（ラゼッリ（Lazerri）、１９９５年）、サトウモロコシ（バットロウ等（Battraw et al.）、１９９１年）、メイズ（バッタチャジー等（Bhattacharjee et al.）、１９９７年）、小麦（ヘー等（He et al.）、１９９４年）、トマト（塚田（Tsukada）、１９８９年）及び大豆（ディール等（Dhir et al.）、１９９２年）がある。

本発明による候補遺伝子DNAセグメントの植物細胞への移植の好ましい送達法は
微粒子銃法である。（米国特許５，５５０，３１８；米国特許５，５３８，８８０；
米国特許５，６１０，０４２及びPCT出願WO９４／０９６９９；それぞれの全体が具体的にここに文献として取り入れてある）。この方法では粒子を核酸で塗布し推進力により細胞に送達する。典型的な粒子としてはタングステン、白金及び好ましくは金からなる粒子である。ある場合には候補遺伝子DNAの金属粒子上への沈殿は、微粒子銃を用いるDNAの受容体細胞への送達に不必要であると考えられる。しかし粒子はDNAで塗布されているよりむしろDNAを含有すると考えられる。それ故DNA塗布粒子は粒子衝突によりDNA送達レベルを増加するがそれ自体必要でないことを提案する。

加速によるDNAの植物細胞への送達法の具体的実施形態は、遺伝子銃粒子送達システムで、このシステムはステンレススチールかナイテックス（Nytex）スクリーンのような網を通してDNA塗布粒子か細胞を懸濁培養の植物細胞で覆ったフィルター表面上に発射する。網は粒子を分散しその結果大凝集体として受容体細胞に送達されない。発射体装置と衝突を受ける細胞間で妨害する網により、発射体凝集物の大きさを小さくし、大きすぎる発射体により受容体細胞が受ける損傷を小さくすることで高頻度の形質転換に寄与すると考えられる。

微粒子銃法は広範囲に利用でき、実質的にいずれの植物種の形質転換に使用できる。微粒子銃により形質転換した種族の例としてはメイズ（PCT出願WO９５／０６１２８）、大麦（リタラ等（Ritala et al.）１９９４年；ヘンスゲン等（Hensgens et al.）、１９９３年）、小麦（米国特許５，５６３，０５５、具体的にここに全体を文献として取り入れてある）、米（ヘンスゲンス等、（Hensgens et al.）１９９３年）、オート麦（トルベット等（Torbet et al.）、１９９５年トルベット等（Torbet et al.）、１９９８年）、ライ麦（ヘンスゲンス等、（Hensgens et al.）、１９９３年）、サトウキビ（バウワー等（Bower et al.）、１９９２年）及びサトウモロコシ（カサ等（Casa et al.）、１９９３年；ハジオ等（Hagio et al.）、１９９１年）、更にはたばこ（トームス等（Tomes et al）、１９９０年；ビュージング、ベンボウ（Buising and Benbow）、１９９４年）、大豆（米国特許５，３２２，７８３、具体的にここに全体を文献として取り入れてある）、ひまわり（ニッテル等（Knittel et al.）、１９９４年）、ピーナッツ（シングシット等（Singsit et al.）、１９９７年）、木綿（マッカベー、マーティネル（McCabe and Martinell）、１９９３年）、トマト（バンエック等（VanEck et al.）、１９９５年）及び一般のマメ科植物（米国特許５，５６３，０５５、具体的にここに全体を文献として取り入れてある）のような単子葉植物類がある。

衝突には懸濁細胞をフィルターか固体培地上に濃縮する。代わりに未成熟胚か他の目標細胞を固体培地に配列しても良い。衝突を受ける細胞を微粒子銃停止板下の適当距離に位置する。もし必要なら一つ以上の網を加速装置と衝突を受ける細胞間に置いても良い。

アグロバクテリウム仲介形質転換はDNAを全植物組織に導入できるので遺伝子の植物細胞への導入に広く利用できるシステムであり、その結果原形質体から無傷植物を再生する必要を迂回できる。DNAの植物細胞への導入にアグロバクテリウム仲介の植物組み込みベクターを使用することは技術的によく知られている。例えばフレーリー等（Fraley et al.）、（１９８５年）、ロジャーズ等、（Rogers et al.）（１９８７年）及び米国特許５，５６３、０５５に記載の保法を参照し、具体的にここに全体を文献として取り入れてある。

アグロバクテリウム仲介の形質転換は双子葉植物に最も有効でシロイヌナズナ、たばこ、トマト及びジャガイモを含む双子葉植物の好ましい形質転換法である。実際アグロバクテリウム仲介の形質転換は多年にわたり双子葉植物に日常的に用いられてきたが、単子葉植物への利用は最近のみである。今ではアグロバクテリウム仲介の形質転換法の進歩によりほぼ全ての単子葉植物に利用できる。例えばアグロバクテリウム仲介形質転換法は今まで米（ヒエイ等（Hiei et al.）、１９９７年；ザン等（Zhang et al.）、１９９７年；米国特許５，５９１，６１６で、具体的にここに全体を文献として取り入れてある）、小麦（マッコーマック等、（McCormac et al.）１９９８年）、大麦（ティンゲイ等（Tingay et al.）、１９９７年；マッコーマック等（McCormac）、１９９８年）及びメイズ（イシディア等（Ishidia et al.）、１９９６年）に適応された。

最新のアグロバクテリウム仲介の形質転換ベクターは大腸菌と同様にアグロバクテリウムで複製でき、記載のように便利な操作が可能になる。（クリー等、１９８５年）。更にアグロバクテリウム仲介の遺伝子移植用のベクターに関する最近の技術的進歩により、ベクターでの遺伝子と制限部位の配列を改良し、種々のポリペブチドコード化遺伝子の発現が可能なベクター作成を促進する。記載のベクター（ロジャーズ等（Rogers et al.）、１９８７年）は挿入ポリペプチドコード化遺伝子の直接発現に関するプロモーターとポリアデニル化部位を側面にもつ便利なマルチリンカー領域を有し現在の目的に適する。更に武装腫瘍誘導（Ｔｉ）遺伝子と武装解除Ｔｉ遺伝子の両者含有のアグロバクテリウムを形質転換に使用できる。アグロバクテリウム仲介の形質転換が有効なこれら植物株では、この遺伝子移植が容易で且つ規定の性質のためこれが選択すべき方法となる。

植物原形質体の形質転換はリン酸カルシウム沈殿生成、ポリエチレングリコール処理、電気窄孔及びこれら処理の組み合わせに基づく方法を用いで達成できる。（例えばポトリクス等（Potrykus et al.）、１９８５年；ロルツ（Lorz et al.）等、１９８５年；オミルレー等（Omirulleh et al.）、１９９３年、フロム等（Fromm et al.）、１９８６年；ウチミヤ等（Uchimiya et al.）、１９８６年；カリス等（Callis et al.）、１９８７年；マルコッテ等（Marcotte et al.）、１９８８年を参照）。

これらシステムの異種植物株への利用は原形質体から特定植物株を再生する能力に依存する。原形質体からの穀類再生に関する具体的方法が記載された。（フジマラ等（Fujimara et al.）、１９８５年；鳥山等（Toriyama et al.）、１９８６年；山田等（Yamada et al.）、１９８６年；アブデゥラー等（Abdullah et al.）、１９８６年；オミルレー等（Omirulleh et al.）、１９９３年及び米国特許５，５０８、１８４でそれぞれが具体的にここに全体を文献として取り入れてある。）

穀類原形質体の直接採取による形質転換への使用例としては、米（ゴーシュービスワズ等（Ghosh-Biswas et al.）、1９９４年）、サトウモロコシ（バットロウ、ホール（Battraw and Hall）、１９９１年）、大麦（ラゼッリ（Laerri）、１９９５年）、オート麦（ゼン、エドワード（Zheng and Edwards）、１９９０年）及びメイズ（オミルレー等（Omirulleh et al.）、１９９３年）の形質転換がある。

原形質体からうまく再生できない植物株を形質転換するには、DNAを無傷細胞や無傷組織に導入する別の方法を利用できる。例えば未成熟胚や外植片からの穀類再生は記載のように達成できる。（バジル（Vasil）、１９８９年）。又炭化ケイ素繊維仲介の形質転換もプロトプラスト化と一緒に又はなしで使用できる。（ケップラー（Kaeppler）、１９９０年；ケップラー等（Kaeppler）、１９９２年；米国特許５，５６３，０５５で、具体的にここに全体を文献として取り入れてある。）この方法による形質転換はDNA溶液中の細胞と一緒に炭化ケイ素繊維を攪拌して達成する。細胞に穴が開くとDNAが受動的に入る。この方法は例えば単子葉植物の穀類メイズ（PCT出願WO９５／０１６２８で、具体的にここに全体を文献として取り入れてある；トンプソン（Thompson）、１９９５年）及び米（永谷、１９９７年）でうまく使用された。

微粒子銃の最適化
本発明による微粒子銃形質転換に関しては物理的生物的パラメータが最適化できる。物理的因子はDNA／微粒子発射体沈殿物又はマクロ発射体で操作するものか、微粒子発射体の飛行速度に影響するものである。生物的因子としては衝撃関連の外傷の緩和を助ける標的細胞の浸透圧調整、粒子軌道に対する未成熟胚や他標的組織の配向及び直線化DNAや無傷高次コイルプラスミドのような形質転換DNAの性質のような衝突前と直後での細胞操作を含む全ステップがある。衝突前操作は未成熟胚の形質転換の成功には特に重要であると考えられる。

従って条件を十分に最適化するために小スケールの研究で種々の衝突パラメーターの調整をはかろうとする。特にDNA濃度、ギャップ距離、飛行距離、組織距離及びヘリウム圧のような物理的パラメータを調整しようとする。更にヘリウムの等級も形質転換効率に影響すると考えられる。例えば形質転換効率の差が工業用グレード（純度９９．９９％）と超純粋ヘリウム（純度９９．９９９％）を用いた衝突で経験されているが、現在では衝突での使用にどちらがより有利であるかは明白ではない。受容体細胞の生理状態に影響し、それ故形質転換と組み込む効率に影響する条件を修正して、外傷減少因子（TRF）を最適化しても良い。例えば浸透圧状態、組織の水和作用及び受容体細胞の継代培養段階か細胞周期を形質転換に最適なように調整しても良い。

衝突に関する物理的パラメーターと生物的パラメーター両者を更に弾道的形質転換の最適化に当てても良い。物理的因子はDNA／微粒子発射体沈殿物又はマクロ発射体か微粒子発射体のいずれかの飛行速度に影響するものの操作を含むものである。生物的因子としては衝突直前と直後での細胞操作を含む全ステップがある。浸透圧環境、衝突パラメーター及びプラスミドの配置のような衝突前の培養条件を最大数の安定形質転換体を生成するように調節する。

（i）物理的パラメーター
ギャップ距離
可変ネスト（マクロホルダー）は破裂板とマクロ発射体間距離、即ちギャップ距離を変えて調整できる。この距離は０から２ｃｍまで変えられる。短いギャップによる予測効果としてはマクロ発射体と微粒子発射体両者の速度増加、衝撃波の増加（組織の飛散と組織外傷の増加をもたらす）及びより深い微粒子発射体侵入である。より長いギャップ距離では反対の効果があるであろうが、生存率が増加し、それ故回収される安定な全形質転換物数が増加できる。
２．飛行距離
固定ネスト（可変ネスト内に含まれる）をマクロ発射体が横切る飛行経路の調節のために、スペーサーリング配置を０．５乃至２．５ｃｍの間で前もって決めた０．５ｃｍずつ変えることができる。短い飛行経路ではマクロ発射体は安定な飛行が可能であるが、微粒子発射体の全体の速度が減少する。飛行安定性の増加は、例えば中心にあるグルクニダーゼ（GUS）焦点数を増加する。より長い飛行距離（ある点まで）により速度は増加するが、飛行の不安定性を増加する。観察に基づくと衝突は通常飛行経路長約１．０ｃｍ乃至１．５ｃｍで行われる。
３．組織距離
銃薬室内の組織配置は微粒子発射体の侵入に大きく影響する。微粒子発射体の飛行経路を増加すると速度と衝撃波関連の外傷を減少する。速度の減少は又微粒子発射体の侵入を浅くする。
４．ヘリウム圧
破裂板の形や数を操作してガス加速管内圧を４００乃至２０００psiの間で変化できる。安定な形質転換用の最適圧は１０００乃至１２００psiの間で決める。
５．微粒子発射体の塗布
微粒子銃においてはDNAが形質転換に適した形で受容体細胞に送達されるように微粒子発射体にDNAを付着（塗布）する。この点で少なくともいくつかの形質転換するDNAが形質転換物を起こす標的細胞に利用できる必要があり、同時に送達時にDNAは微粒子発射体に付着する必要がある。それ故微粒子発射体から形質転換DNAが利用できるのは、微粒子発射体を標的細胞に送達後、形質転換DNAと微粒子発射体間の結合を物理的に逆転することを含む。しかしＤＮＡや微粒子発射体に物理的に付着する他分子の非結合セグメントの切断の結果、標的細胞が利用できるようになるのでその必要性は無い。更に形質転換ＤＮＡと微粒子発射体に直接又は間接的のいずれかで付着した他分子間結合の切断の結果利用可能となる。更に標的細胞の形質転換は形質転換ＤＮＡと受容体細胞のゲノムＤＮＡ間の直接組み換え法で起こると考えられる。それ故ここで用いたように“塗付”微粒子発射体は標的細胞を形質転換するのに使用可能なものであり、形質転換ＤＮＡは標的細胞に送達され、しかも形質転換が起こるように標的細胞に到達できる。

形質転換するＤＮＡを標的細胞に送達できる微粒子発射体のいずれの塗布技術でも使用できる。本発明でうまく働くことが示された微粒子発射体の塗布法を具体的にここに開示する。しかしＤＮＡは代替え技術を用いて微粒子発射体粒子に結合できる。例えば粒子をストレプトアビジンと長鎖チオールの切断可能なビオチン化ヌクレオチド鎖標識化ＤＮＡ末端で塗布しても良い。このＤＮＡはストレプトアビジンービオチンの相互作用により粒子に接着するが、細胞に存在する還元剤によりチオール結合が還元され細胞から放徐される。

代わりに粒子を金酸化物粒子表面を機能化し、遊離アミン基を備えるように調整しても良い。強力な陰電荷をもつＤＮＡは機能化粒子と結合する。更に荷電粒子をＰＤＳ―１０００微粒子銃装置で用いるマイラーフライヤーディスク表面に制御した配列で蒸着し、その結果標的組織に送達される粒子分布の制御を促進する。

上に開示したように更に微粒子発射体の塗布に用いるＤＮＡ濃度が導入遺伝子の単一コピー含有形質転換物の回収に影響することを提案する。例えば低濃度のＤＮＡは必ずしもこの形質転換効率を変えないが、その代わりに単一コピーの挿入事象の割合を増加できる。この点では出発微粒子発射体各１．８ｍｇ当たり約１ng乃至２０００ngの形質転換するＤＮＡを使用できる。本発明の他実施形態では、出発微粒子発射体各１．８ｍｇ当たり約２．５ng乃至１０００ng、２．５ng乃至７５０ng、２．５ng乃至５００ng、２．５ng乃至２５０ng、２．５ng乃至１００ng又は２．５ng乃至５０ngの形質転換ＤＮＡを使用できる。

種々の他の方法を形質転換効率の増加及び／又は低コピーでの形質転換事象の相対的比率を増加するのに用いても良い。例えば本発明者はアルカリホスファターゼをもつ末端修飾形質転換ＤＮＡや、形質転換前にＤＮＡ末端を揃える試薬について熟慮した。更に不活性キャリアーＤＮＡを形質転換するＤＮＡと一緒に含有し、その結果用いたＤＮＡの全量を低下することなしに形質転換するＤＮＡの有効濃度を低下する。これらの技法は更に１９９７年１２月２２日に申請の米国特許出願番号０８／９９５，４５１に記載され、その開示を具体的にここに全体を文献として取り入れてある。

（ii）生物的パラメーター
培養条件や他の因子は目標細胞の生理的状態に影響し、形質転換と組み込み効率に計り知れない影響をもつ。第一に衝撃活動によりエチレン産生を刺激し、組織の老化をもたらすかもしれない。反エチレン化合物の添加により形質転換効率が増加できるであろう。第二に細胞周期のある点で導入ＤＮＡの組み込みにより適することを提案する。それ故細胞培養物の同期化により形質転換物の産生頻度が強まる。例えば冷却処理、アミノ酸欠乏又は他の細胞周期停止薬を用いて同期化される。第三に組織の水和度は又衝撃関連の外傷量と同様に細胞壁に侵入する微粒子発射体の能力に寄与できる。

粒子軌道に対する胚や他の標的組織の位置と配向も又重要である。例えばＰＤＳ―１０００微粒子銃装置は標的ペトリ皿表面全体に均一に粒子を展開しない。プレート中心での粒子速度はペトリ皿中心から遠い距離の粒子速度より速い。それ故ある人には“死の地帯”と呼ばれる皿中心を避けるようにペトリ皿上に標的組織を置くのが好都合である。更に標的軌道に関する標的組織の配向も又重要である。植物を粒子流に向かって最も再生し易いように組織を配向するのが好ましいと考えられる。例えば未成熟胚の小板は胚形成の可能性が最大の細胞を含み、それ故粒子流に沿って配向すべきである。

わずかに原形質分離した酵母菌細胞は形質転換効率を増加させることが報告されている。（アルマレオ等（Armaleo et al.）、１９９０年）。細胞の浸透圧状態の変化が微粒子発射体の侵入に関連した外傷の減少を助けると仮定された。更には増殖と細胞周期段階も形質転換に関して重要である。

１．浸透圧調整
浸透圧前処理により原形質分離した細胞膨圧が減少する結果、衝撃関連の外傷が減少する可能性が示唆された。以前の研究では、グルクロニダーゼを一時的に発現する細胞数は継代培養を新鮮な培地と浸透圧を調整した培地へと継続して増加した。（ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８で、具体的にここに全体を文献として取り入れてある。）前処理時間９０分ではグルクロニダーゼ発現焦点数は短時間より多かった。５００ｍＯＳＭ／ｋｇ培地で90分間温置した細胞では、対照に比べ一時的グルクロニダーゼ焦点が約3．5倍に増加した。好ましくは未成熟胚を１２％蔗糖含有培地で衝撃する前に４−５時間前培養する。衝撃に次いで１２％蔗糖で第二の培養を16-24時間実施する。代わりにＩＩ型細胞を衝撃前に０．２Ｍマニトールで３−４時間前処理する。他の浸透圧的に活性な溶質で1-6時間の間細胞前処理するのは又好ましいと考えられる。

２．プラスミド配置
いくつかの場合には限定はされないが、アンピシリン、カナマイシンやテトラサイクリン耐性で且つＤＮＡ複製の原核生物起源を含む抗生物質耐性のような細菌宿主、例えば大腸菌中のプラスミドベクターを維持するに必要なＤＮＡ配列を含有しない細胞に候補遺伝子ＤＮＡを送達するのが好ましい。この場合形質転換ＤＮＡ含有のＤＮＡ断片は形質転換前に精製しても良い。典型的精製法は１．２％低融点温度アガロースゲル上でのゲル電気泳動であり、次いでゲル切片を６−１０倍過剰のトリスーエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）緩衝液（１０ｍＭトリスー塩酸 ｐＨ8．0，１ｍＭ ＥＤＴＡ、70℃―72℃）中で融解してアガロースゲルから回収し、凍結融解（37℃）、遠心分離でペレット状アガロースにする。次いでギアジェン（Qiagen）Q―１００カラムを用いてＤＮＡを精製する。効率の良いＤＮＡ回収にはカラムの流速は４０ｍｌ／ｈｒに調節する。

単離ＤＮＡ断片を種々の電気溶出法、アガロースの酵素消化やガラス玉（例えばジーンクリーン（Gene Clean））へのＤＮＡ結合を用いてアガロースゲルから回収できる。更に高速液体クロマトグラフィ（HPLC）及び／又は磁性粒子を用いてＤＮＡ断片を単離できる。ＤＮＡ断片単離の代替え法としてはプラスミドベクターを制限酵素と発現カセット断片の事前精製なしにこのメイズ細胞に送達したこのDNAで消化できる。

組織の培養には培地と制御環境が必要である。“培地”は試験管内で、即ち無傷生物の外で細胞を増殖するのに用いる多数の栄養剤混合物を意味する。培地は通常大部分の細胞型増殖に必要な多種類の材料（塩、アミノ酸、増殖制御剤、砂糖、緩衝液）の懸濁物である。しかし特定の各細胞型は増殖に特定範囲の材料比を必要とし、最適な増殖にはより特定範囲の処方が必要になる。細胞増殖速度も又その細胞型の増殖が可能な数々の培地で始まる培養物により変わる。

栄養物培地は液体として調整するが、液体を固体サポートとなりうる材料に添加して固化しても良い。この目的に寒天が最も普通に使われる。バクトアガー、ヘイゼルトン寒天、ゲルライト及びゲルグロは組織培養物中での植物細胞増殖に適した特定型の固体サポートである。

ある細胞型は液体懸濁液か固体培地のいずれかで増殖分裂する。ここで検討するようにメイズ細胞は懸濁液か固体培地で増殖するが、懸濁液培養物から植物を再生するには発達のある時点で液体から固体培地への移植が必要になる。培養物中の細胞分化の形と程度は使用培地の形と環境、例えばｐＨだけでなく、培地が固体か液体のいずれであるかにも影響される。

受容体細胞標的物としては限定はされないが、芽頂（米国特許５，７３６，３６９）、I型カルス、II型カルス及びIII型カルス、小胞子、花粉、精子及び卵子のような未成熟胚や配偶子細胞を含む分裂組織細胞がある。胞子植物を再生できるいずれの細胞も受容体細胞として有用であると考えられる。I型カルス、II型カルス及びIII型カルスは限定はされないが未成熟胚、苗頂端分裂組織、小胞子や類似物を含む組織源から開始できる。カルスとして増殖できるこれらの細胞は又遺伝子形質転換用の受容体細胞である。本発明は未成熟胚の形質転換法とそれに続く遺伝子導入胞子植物の再生法を提供する。未成熟胚の形質変換は受容体細胞の培養物の長期的な発達の必要性を取り除く。花粉と同様にその前駆体細胞の胞子も遺伝子形質転換用の受容体細胞として、或いは受精中に取り込む外来DNAを運搬するベクターとして働くことができる。花粉の直接形質転換により細胞培養の必要性を取り除けるであろう。分裂組織細胞（即ち連続的細胞分裂が可能で、根先端、茎頂部、側芽などのような植物の成長点や組織に通常見られる未分化細胞形の特徴を持つ植物細胞）は他の形の受容体植物細胞を表す。これらの未分化増殖と臓器分化との全能性に関する能力により単一の形質転換分裂組織細胞を全体的形質転換植物として回収できるかもしれない。実際胚形成懸濁液培養物は培地環境により制御される未分化状態で連続的細胞分裂能を保持し、試験管内分裂組織細胞系であり得ることを提案する。

所望DNAセグメントで形質転換した受容体細胞として働く培養植物細胞はトウモロコシ細胞、より具体的にはズィメイスLの細胞を含むいずれの植物細胞でも良い。体細胞には種々のタイプがある。胚形成細胞は胚形成により植物再生を誘発する体細胞の一例である。胚不形成細胞は通常このような形で応答しない細胞である。胚不形成細胞の一例はある黒メキシコスイート（BMS）コーン細胞である。

本発明の状況で有用な胚形成カルスと懸濁液培養物の開発は、例えば形質転換用の受容体細胞として、米国特許５，１３４，０７４と米国特許５，４８９，５２０に記載されており、それぞれの全体を文献としてここに取り入れてある。

ある技法を用いて細胞集団内で受容体細胞を濃縮できる。例えばII型カルスの発達、次いでもろい胚形成組織の手動選択と培養により、微粒子発射体形質転換で用いる受容体細胞の濃縮をもたらす。懸濁液培養は、特にここに開示の培地を用いていずれの所定集団の非受容体細胞に対する受容体細胞の比を向上できる。受容体細胞の選択に用いる手動選択法としては例えば、細胞形態と細胞分化の評価や種々の物理的か生物的選択法を用いても良い。凍結保存は又受容体細胞選択法の可能な方法である。

例えばＩＩ型カルス表面から胚形成細胞を選択する受容体細胞の手動選択は、培養前（固体培地か懸濁液のいずれかで培養する）に受容体細胞を濃縮する試みに用いられる一つの手段である。好ましい細胞は細胞クラスター表面にあるものであり、その分化の欠如、大きさ及び濃厚な細胞質により更に同定可能である。好ましい細胞は通常分化がより少ないものか未だに分化していない細胞である。従って細胞質的に濃厚で、細胞質に対する細胞核比（例えば細胞学的観察により決定する）が比較的空胞化されず、大きさが小さく（例えば１０−２０□ｍ）且つ持続的分裂と体細胞前胚形成が可能な細胞を同定し、選択する。

このような細胞の同定に他法を用いることを提案する。例えばエバンスブルーのような染料の使用であり、胚形成細胞のような比較的非透過性膜をもつ細胞により排除し、根様細胞や蛇形細胞（蛇のような外見により呼ばれる）のような比較的分化した細胞による方法である。

受容体細胞同定の可能な他法としては細胞化学染色物（フランツ等（Fransz et al.）、１９８９年）で検出できるグルタミン酸脱水素酵素のような胚形成細胞のアイソザイムマーカーの使用がある。しかし注意することは、グルタミン酸脱水素酵素を含むアイソザイムマーカーの使用により、なお比較的高い代謝活性をもつ根細胞のような胚不形成細胞がある程度の偽陽性となり得ることである。

一実施形態では雑種強勢を産生するよりむしろ候補遺伝子により病気症状を克服、治療又は少なくとも緩和する。この分野の熟知者には上記の実験手順の概略を用いてこのような結果がもたらされることがわかる。

一般に“処理する”、“処理”や類似体という用語はここでは所望の薬理効果及び／又は生理学的効果を得るための個体か対象、その組織か細胞への影響を意味するのに用いる。その効果は病気やその徴候や症状を完全又は一部防ぐという点では予防的であり、且つ／又は病気の部分的か完全治癒という点で治療的であっても良い。ここで用いた“処理する”では植物か動物の病気のいずれの処理か予防も対象とし、（a）病気がその病気の素因になるがまだその病気をもつと診断されていない植物や動物で起こるのを予防し、（ｂ）その病気を阻害し、即ちその発達を抑止し或いは（ｃ）その病気症状を軽減又は回復、即ちその病気症状の退行させることを含む。

一旦植物や動物が病気に苦しむと診断され、候補遺伝子や遺伝子の組み合わせが同定されると、これら遺伝子や遺伝子産物を雑種強勢に関して上述の技法を用いるか、標準的医療技術か農業技術を用いるかのいずれかで植物か動物に投与できる。

“投与”、“投与する”及び“投与された”という用語はここでは互換性があるように用いる。例えば候補遺伝子の産物は舌下を含む経口的、局所的又は非経口的に在来の無毒性の医薬承認担体、補助剤及び媒体含有の投薬単位処方で投与できる。ここで用いた非経口的という用語は皮下注射、エアロゾル、静脈、筋肉内、くも膜下腔内、頭蓋内注射技術か注入技術や直腸又は膣経由を含む。

明細書を通じて別に文脈が必要としない限り、“構成する”か“一つで構成する”（comprises）や“構成している”のように変形した言葉は記載の一整数か複数の整数群を含み、いかなる他の整数か複数の整数群を排除しないことを意味すると考える。

［ヘテロ接合体子孫でハイブリッドｍRNA分子を形成する新規生化学経路の同定］
二形式の対立遺伝子のDNMT２遺伝子が記載されている。（フランキーナ等（Franchina et al.）、ヒューマンへレディティ（Hum. Hered.）、５２巻、２１０頁（２００１年）。DNMT２はDNAのメチル化プロセスに関与する酵素をコード化する。対立遺伝子の一つのDNMT２Iはエキソン２の１０４位にヌクレオチドGを、エキソン４の５０位にヌクレオチドCを有する。代わりの対立遺伝子のDNMT２IIはこれらの位置にそれぞれヌクレオチドAとヌクレオチドTを含む。従って二形式の対立遺伝子であるDNMT２それぞれの間のエキソン２とエキソン４でのDNA配列の違いにより、最終ｍRNA分子でのエキソン２とエキソン４の対立遺伝子起源を決定できる。これらの知見を用いてｍRNAのハイブリッド型が各対立遺伝子のエキソンを同一成熟ｍRNA分子に組み込むことで、ヘテロ接合体の子孫で形成でき、その結果ヘテロ接合の子孫に特有な新規ポリペプチドかタンパク質分子を産生するかどうかを試験した。

各DNMT２対立遺伝子のエキソンやその一部が一次転写物をスプライスした後に、同一成熟RNA分子への組み込みの可否と効率性を決めるために、ｍRNAを分離研究により二形式のDNMT２に関してヘテロ接合性であることが確認した二対象III１とIII２の末梢血白血球（PBL）から単離した。（フランキーナ等（Franchina et al.）、ヒューマンへレディティ（Hum. Hered.）、５２巻、２１０頁（２００１年）参照）。

ｍRNAをDNMT２のエキソン２とエキソン４を含有する約４８０ｂｐの相補DNA領域を増幅するプライマーを用いて、逆転写PCR法（RT-PCR）に供した。対象III１と対象III２からの長さ約４８０ｂｐのRT-PCR産物をクローンし、各RT-PCR産物の一連のクローンの配列を決定した。

表１に示すように対象III１から配列決定した１５のクローンの内１３の挿入断片はDNMT2の複対立遺伝子の発現を示し、予期されるように成熟ｍRNA分子のエキソン２とエキソン４のシスーアッセンブリーを示した。しかしクローンの内の一つはDNMT２I対立遺伝子のエキソン２とDNMT２II対立遺伝子のエキソン４を含むスプライス産物を含有した。更なるクローンはDNMT２II対立遺伝子のエキソン２と同様DNMT２I対立遺伝子のエキソン４を含有した。これら知見の再現性を評価し、対象III１で見られた二つの見かけハイブリッドｍRNA分子が、ある形式の有糸分裂組み換え現象の結果起こった可能性を排除するため、対象III２のPBLのｍRNA種を同様に調べた。

表１に示すように１４のクローンの内１１はDNMT2の複対立遺伝子の発現とシスーエキソンアッセンブリーを示すインサートを含有した。しかしさらに３つのクローンの構造はハイブリッドｍRNA分子が集合していることを示した。これらの内２つはDNMT2II対立遺伝子のエキソン２とDNMT2I対立遺伝子のエキソン４を含む。更なるクローン配列はスプライスしたｍRNA分子がDNMT2I対立遺伝子のエキソン２とDNMT2II対立遺伝子のエキソン４の組み込みで集合することを明らかにした。

次いでDNMI2の二つの代替え対立遺伝子形式のそれぞれでヘテロ接合であることが確認された更なる二つの対象II3およびII4のPBLからｍRNAを単離した。（フランキーナ等（Franchina et al.）、ヒューマンへレディティ（Hum. Hered.）、５２巻、２１０頁（２００１年））。対象II3と対象II4のｍRNAを等量試験管内で調合した混合物をIII1と対象III２のPBLに見らるハイブリッドｍRNAのDNMT2分子が、切断型逆転写物形成による逆転写PCRのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）段階で鋳型転換を起し、試験管内で産生した可能性を排除するのに用いた対象III1と対象III２のｍRNAと同様の方法で処理した。表１に示すように１３のクローンのインサート配列の例ではハイブリッドｍRNA分子は見いだされなかった。総合的にはこれら知見によりスプライスした全DNMT２RNA分子のほぼ２０％がハイブリッド型を含むことが確立された。

［表１］
エキソン２とエキソン４内の多形位置に存在するヌクレオチドによる末梢血白血球中のスプライスDNMT２のｍRNA分子の分布

注：系図分析により遺伝子型DNMT２I/IIは対象III1と対象III2で、DNMT2I/IとDNMT2II/IIは対象II3と対象II4でそれぞれ確認した。

対象III1、III2（II3及びII4）のホモ接合DNMT2IとDNMT2II親のｍRNA混合物を又逆転写PCRに供し、産物をクローンし配列決定した。G-T又はA-CスプライスのDNMT２のｍRNA分子を特定するインサートは得られなかった。これらの結果により我々の知見がスプライスｍRNAの複トランスーエキソン対立遺伝子のアッセンブリーが関与する体内一次転写物のスプライスシステムの存在を示すことが確認される。

［雑種強勢か雑種衰弱を促進する遺伝子同定のための構造判定基準使用の確認］
本発明は更に参考の目的だけで以下に限定されない実施例を記載する。しかし以下の実施例は説明のためだけで、上記の本発明の一般性を何ら制限するものと考えてはならない。特に本発明はDNMT2対立遺伝子を用いて候補遺伝子同定に関して詳細に上に記載したが、ここでの知見はこの遺伝子や対立遺伝子に限定はされないことが明らかにわかる。

子孫がその親のどちらかの同一の生物表現型発現に比べいずれかの特定の生物発現型を増強した形で示したときに雑種強勢（HV）が起こる。子孫がその両親に比べいずれかの特定の生物発現型か病気を減少した形で示すときに雑種衰弱（HD）が起こる。
HDの生物発現型は酵素のようなハイブリッドタンパク質活性が直接減少することにより起こる。一方あるハイブリッドタンパク質は免疫学的に異質と認識し、自己免疫システムを誘発してある形のHDを発生させる。ここに開示の本発明により増強した生物発現型か、減少した生物発現型が新規タンパク質形成により如何に雑種の子孫が産生するかが説明される。雑種の子孫は上に規定した構造的判定基準により異なる必要のある対立遺伝子型関連遺伝子を受け継ぐ必要がある。

ヒトのHVモデルとしての骨粗鬆症
骨粗鬆症はほぼ４０％の閉経後の女性が被る骨障害である。この障害は破骨細胞による骨再吸収の増加により起こり、その結果骨密度が減少し骨折し易くなる。カルシトニンが破骨細胞上のカルシトニン受容体と結合し、骨の崩壊を起こすその力を減少するため、カルシトニンを骨粗鬆症治療に用いる。

タボウレー等（Taboulet et al.）、（ヒューマンモレキュラージェネティック（Hum. Mol. Genet.）、７巻、２１２９頁（１９９８年））は野生型カルシトニン受容体の対立遺伝子に関してヘテロ接合の被験者は、表２に示すように同じ野生型対立遺伝子に関してホモ接合の被験者にくらべより高い骨密度を有し骨折のおそれを減少することを示した。

表２に異種対立遺伝子型のカルシトニン受容体の異種アミノ酸をコード化するヌクレオチド変化のエキソン位置を示す。これらのコード配列の変異はNCBIのデータベースで検索した。表２に示すようにエキソン１はアミノ酸位置１２６のロイシンかアルギニンのいずれかをコード化する一方、アミノ酸位置４４７のエキソン９内のヌクレオチドでの差によりプロリンかロイシンをコード化する。カルシトニン受容体の１２６位置と４４７位置の別のアミノ酸をコード化するヌクレオチド配列の違いの分布は、異種対立遺伝子型のカルシトニン受容体遺伝子に関してヘテロ接合な被験者の新規又はハイブリッド型のカルシトニン受容体形成に必要な構造的判定基準を満たす。

ここに記載の本発明によるカルシトニン受容体内の１２６位置と４４７位置アミノ酸の許される組み合わせは（a）ロイシン／プロリン、（ｂ）ロイシン／ロイシン、（ｃ）アルギニン／プロリン／及び（ｄ）アルギニン／ロイシンを含み、これらの内二つは野生型対立遺伝子を含む一方、他の二つは骨密度と骨折し易すさに影響するハイブリッド型のカルシトニン受容体を含む。

［表２］
代替えカルシトニン受容体の対立遺伝子におけるアミノ酸の違いをコード化するヌクレオチド変化のエキソン位置

新規生化学的経路に関する哺乳類モデルとしてのアルギニノコハク酸尿症
ヒトではアルギノコハク酸分解酵素（ASL）をコード化する少なくとも５つの異種対立遺伝子型の遺伝子が同定された。それらの内のいくつかは、例えばASL（D87G）、ASL（Q286R）及びASL（A398D）は突然変異型のASLをコード化する。これら突然変異型ASLのそれぞれに関してホモ接合な被験者は不活性型の酵素を産生し、アルギニノコハク酸尿症として知られる疾患の開始をもたらす。

ASL（Q286）やASL（D87G）の様な変異対立遺伝子型ASLの影響を受けた親のそれぞれからヘテロ接合型で受け継いだ子孫ではHV型が観察され、それによりASL活性を回復することは良く認められている。（例えばウオーカー等（Walker et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７２巻、６７７７頁（１９９７年）で、ここに文献として取り入れてあるる。）ASL(D87G)とASL（Q286R）をコード化する対立遺伝子は異種ASLエキソン内に位置するヌクレオチドの違いにより特徴づけられる。アミノ酸位置８７のアスパラギン酸かグリシンを産生するヌクレオチド変化はエキソン３に位置している一方、グルタミンかアルギニンをコード化するヌクレオチド変化はエキソン１１内に位置している。エキソン３とエキソン１１のそれぞれの８７位置と２８６位置の代替えアミノ酸をコード化するヌクレオチド配列の違いを局在化して、二つの異種突然変異型ASL遺伝子に関してヘテロ接合な被験者の正常なASL酵素合成を可能にするのに必要な構造的判定基準を満たす。

新規生化学的経路に関するモデルとしてのシスチン尿症
シスチン尿症はシスチンと他アミノ酸の腎臓吸収の損傷に特徴づけられるヒトの障害である。一つの形のシスチン尿症（非１型シスチン尿症と呼ばれる）はSLC7A9と命名された遺伝子の変異により起こることが示された。G105R、V170M及びA354Tの様な突然変異型のSLC7A9のホモ接合性によりシスチン再吸収を著しく減少する。フォント等（Font et al.）（ヒューマンモレキュラージェネティック（Hum. Mol. Genet.）、１０巻、３０５頁（２００１年））が示したように、これらの突然変異型SLC７A9のそれぞれのヘテロ接合性により、シスチン再吸収が目覚ましく回復する。モデルに従うと変異対立遺伝子G105R,V170M及びA354Tの産生をもたらすSLC7A9内でのヌクレオチドの変化はそれぞれエキソン４、エキソン５及びエキソン１０に属する。三つの突然変異型SLC7A9のそれぞれをコード化するヌクレオチドの変化を局在化して、上に示した三つの変異型SLC7A9の内のいずれか二つに関して、ヘテロ接合な被験者に正常な活性SLC7A9を合成するのに必要な構造的必要性を満たす。

新規生化学的経路に関する哺乳類HDモデルとしての糖尿病
糖尿病はインシュリン分泌の障害か分泌作用に対する妨害により血糖値が適切に制御できない一般的な重病である。糖尿病には多くの異なる形の機構がある。1型糖尿病（若者の糖尿病）ではインシュリンを分泌する膵臓内細胞の島細胞が免疫攻撃されるためインシュリンの放出が弱まる。グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD65）は1型糖尿病の免疫系が標的にする主要な島細胞の自己抗原をコード化する。

表３に代替え対立遺伝子型酵素のグルタミン酸脱炭酸酵素の異種アミノ酸をコード化するヌクレオチド変化のエキソン位置を列挙する。コード化領域の変異はNCBIで検索した。表３に示すようにエキソン１はアミノ酸１２位置のアルギニンかグリシンをコード化するヌクレオチド変化を含む。一方エキソン４はアミノ酸位置１２４のアスパラギンかリシンのいずれかを、更には位置153でのグルタミンかプロリンをコード化するヌクレオチド変化を含む。表３に又位置２３２の代替えアミノ酸であるグルタミン酸かグリシンがエキソン６内のヌクレオチド変化により、位置２８６位のアルギニンかリシンがエキソン８内のヌクレオチド変化により、且つ位置３２６のアラニンかグリシンのいずれかがエキソン１０内のヌクレオチド変化によりコード化されることを示す。

代替えアミノ酸をコード化しエキソン１、エキソン４、エキソン６、エキソン８又はエキソン１０を含むヌクレオチド配列の違いの分布は、表３に述べた異種対立遺伝子型のうちいずれか二つがヘテロ接合な被験者にハイブリッド型グルタミン酸脱炭酸酵素の産生を実現するに必要な構造的判定基準を満足する。例えばエキソン６とエキソン８に位置するヌクレオチドの違いだけでコード化できる代替えアミノ酸を参照すると、アミノ酸位置２３２と位置２８６の（a）グルタミン酸／アルギニン、（ｂ）グルタミン酸／リシン。（ｃ）グリシン／アルギニン及び（ｄ）グリシン／リシンの組み合わせが新規生化学的経路に従って形成される。これらの組み合わせの内二つが野生型酵素を含む一方、他の二つは雑種型を含む。

［表３］
代替えグルタミン酸脱炭酸酵素（GAD65）対立遺伝子のアミノ酸の違いをコード化するヌクレオチド変化のエキソン位置

［自己抗体誘導におけるGAD65ヘテロ接合性の役割］
GAD自己抗体は低レベルではあるが、発症前の1型糖尿病を患う患者の血清と、更には無症候性の同胞の血清で検出できる。

構造的判定基準を満たすGAD65対立遺伝子のヘテロ接合性により、GAD65に対する免疫応答を強めるハイブリッド型GAD６５が産生できるという本発明者の知見と仮説に従うと、自己抗体レベルは非1型糖尿病性被験者でさえGAD65遺伝子型により変化する必要がある。ボウチン等（Boutin et al.）（パブリックライブラリーオブバイオロジー（PloS Biol.）、1巻、６８頁（２００３年）による最近の総合的研究結果により、GAD65自己抗体レベルは正常非糖尿性被験者と同様にGAD65対立遺伝子に関してヘテロ接合性の肥満被験者では、同一GAD65対立遺伝子に関してホモ接合性の同一グループの被験者と患者にくらべて著しく高いことが確認された。これらの知見は異なる形の対立遺伝子に関してヘテロ接合な被験者で新規な生化学的経路により形成され、本発明者の構造的判定基準を満たす新規ポリペプチド又はタンパク質により、同一GAD65対立遺伝子に関してホモ接合な被験者に比べより容易に自己抗体を合成できるという本発明者の主張を強く支持する。

一方人生の後ほどで起こる糖尿病型はその一部は肥満と関連するが、自己抗体プロセスによっては起こらない。この型の糖尿病は2型糖尿病と呼ばれる。第二染色体に位置する最も一貫性をもって認知されている2型糖尿病候補遺伝子はカルパイン１０（カルプ１０（CALP-10）である。カルパイン１０は2型糖尿病の進行で最も高い危険性と結びつくが、この遺伝子と2型糖尿病の進行との間の関係を説明する突然変異型のカルパイン１０は見いだされていない。カルパイン１０と2型糖尿病進行し易さとの関連に関するHDモデルは、ヘテロ接合性子孫での新規生化学的経路によるハイブリッド酵素形成を必要な構造的判定基準を満足するL34V、T504A、R555C及びV661Iのような多くの異種対立遺伝子型のカルパイン１０が同定されたという知見により強く支持される。このモデルに従うと2型糖尿病進行の感受性が増加するのは、異なる対立遺伝子型のカルプ１０でのヘテロ接合性と関連することが示された。（コックス等（Cox et al.）、ダイアベテス（Diabetes）、５３巻、１９頁（２００４年）内を参照）。

インシュリン分解酵素（IDE）はゲノム走査で第10染色体に位置することが見いだされた別の強力な2型糖尿病感受性候補遺伝子である。インシュリン酵素（IDE）は多分インシュリン応答終結の一部としてインシュリンのタンパク分解に関与する。カルパイン１０と同様に突然変異型のIDEを生ずる病気は発見されていない。

表４にインシュリン分解酵素内の異種アミノ酸をコード化するヌクレオチド変化のエキソン位置を示す。コード配列変異はNCBIのデータベースで検索した。表に示したようにエキソン３は位置２９８の代替えアミノ酸のフェニルアラニンかロイシンをコード化するヌクレオチド変化を含有する。更にアミノ酸のロイシン又はフェニルアラニンをエキソン５内に位置するヌクレオチド変化によりアミノ酸位置５８２でコード化するか、アミノ酸位置８５４のセリンかグリシンがエキソン１１内のヌクレオチド変化によりコード化しても良い。アスパラギンかアスパラギン酸をエキソン２０に含まれる配列の変化によりアミノ酸位置９４７でコード化しても良い。

位置２９８、５８２、８４５及び９４７の代替えアミノ酸をコード化し、それぞれエキソン３，エキソン５、エキソン１１及びエキソン２０に位置するヌクレオチド配列の違いの分布は、表４に示した代替え対立遺伝子型のいずれか二つに関してヘテロ接合な被験者でハイブリッド型インシュリン分解酵素を合成するに必要な構造的判定基準を満足する。例えばエキソン１１とエキソン２０だけでコード化した対立遺伝子に関しては、位置８４５及び位置９４７のアミノ酸の組み合わせとしては（a）セリン／アスパラギン、（ｂ）セリン／アスパラギン酸、（ｃ）グリシン／アスパラギン及び（ｄ）グリシン／アスパラギン酸がある。これら組み合わせの内の二つは野生型酵素を示す一方、他の二つは雑種型の酵素を含む。

［表４］
代替えインシュリン分解酵素対立遺伝子におけるアミノ酸の違いをコード化するヌクレオチド変化エキソン位置

HVでの新規生化学的経路の役割を支持する植物モデル
カタラーゼ１（キャット１（Cat-1）は植物中の過酸化水素分解に重要な役割を果たす酸化還元酵素型酵素である。メイズでは少なくとも６つの異種対立遺伝子型カタラーゼ１が同定され、その大部分はアミノ酸組成が異なる。

１９７２年に雑種型のカタラーゼ１（スキャンダリオス等（Scandalios et al.）、アーカイブバイオケミストリーアンドバイオフィジック（Arch. Biochem. Biophys.）、１５３巻、６９５頁（１９７２年））が二つの異種対立遺伝子型のカタラーゼ１に関してヘテロ接合な植物において同定された。雑種型カタラーゼ１酵素はホモ接合性親型のいずれに比べて一連の生化学的物性が増強していることが示された。

カタラーゼ1遺伝子内の異種エキソンに位置するヌクレオチドの違いにより、代替え対立遺伝子型のカタラーゼ１を規定するアミノ酸変化を指示する。新規生化学的経路により重合型酵素の形成によらない野生型に比し、生化学的物性が増強された雑種型カタラーゼ１分子の形成に関し説得力のある説明が与えられる。

ハイブリッド型ASL分子の同定
以下に概説するように、活性アルギニンコハク酸分解酵素（ASL）は新規に同定の生化学的経路により野生型コード化エキソンを異種変異対立遺伝子のそれぞれから同一ｍRNA分子に包含することにより影響を受けた親の子孫に産生できる。

以前の研究によりASL（D87G）とASL（Q286R）のような不活性ASL変異体の組み合わせがヘテロ接合型で受け継がれた場合には、活性が一部回復されること示された。それ故ｍRNAは二つの不活性対立遺伝子の突然変異型ASLのそれぞれを受け継いでいることが立証された被験者の線維芽細胞や肝臓から単離できる。次いで全ｍRNAを個々のエキソンにまたがるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写PCRに供する。次いでこれら領域含有の逆転写PCR産物をクローンし配列決定する。

ASL（D87G）／（Q286R）遺伝子型と同定した被験者の逆転写PRC産物で産生したクローンの約８５％により、先ずASLの複対立遺伝子発現とエキソンのシスーアッセンブリーを確認する。しかしクローンの約１５％の挿入断片の配列は同一クローンの二つの親対立遺伝子のそれぞれによる配列を含み、その結果約１５％の野生型酵素を産生し、酵素活性の回復が説明される。

ハイブリッドGAD65分子とGAD65自己抗体産生との関連性
全ｍRNAを1型糖尿病を罹った患者から得た膵臓組織の島細胞から抽出できる。患者が非同義語アミノ酸（表３参照）をコード化する異種エキソンでヌクレオチド変化をもつGAD65に関してヘテロ接合の場合、この患者は彼又は彼女の血液に高力価のGAD６５自己抗体を有するであろう。

全膵臓ｍRNAを患者のGAD65遺伝子型に従いエキソン１、エキソン４、エキソン６、エキソン８又はエキソン１０にまたがるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写PCRに供することができる。

クローンの約８５％の挿入断片配列により二つの対立遺伝子のそれぞれからの複対立遺伝子発現とエキソンのシスーアッセンブリーが確認できるであろう。クローンの別の１５％の配列はハイブリッド型GAD65が上に定義した異種対立遺伝子型GAD65に関してヘテロ接合な1型糖尿病を患う患者の島細胞で合成され、その血液中でのGAD65自己抗体の循環を確認する挿入断片が含まれていることが期待されるであろう。

治験中の子孫が上に定義の対立遺伝子を受け継いだ遺伝子を持ち、且つ遺伝子を発現した組織や細胞が同定されたことがわかる場合には、同一の実験的論理的根拠が全種に適応できる。

上記に含まれる手順は実施例であることを意味するにすぎず、技術のいずれの熟知者にとって詳しい他の技術や実験手順の使用を排除するものではない。

Claims (29)

1. 動物又は植物で雑種強勢を産生できる候補遺伝子の同定法で、
   （i）雑種強勢を示す動物か植物から単離した候補遺伝子の対立遺伝子のヌクレオチド配列を該動物又は植物の親から単離した対応対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較し、
   （ii）アミノ酸配列の変化をコード化する雑種強勢を示す該動物か植物の対立遺伝子中のヌクレオチド配列の違いを同定し、且つ
   （iii）該動物か植物の候補遺伝子の対立遺伝子間でのアミノ酸配列の変化を候補遺伝子内の2つ以上の異種エキソン内に位置するヌクレオチド配列によりコード化されているか同定する
   ステップからなる同定法。
2. 前記アミノ酸配列変化が保存修正変化である請求項１による方法。
3. 前記アミノ酸配列変化が非保存修正変化である請求項１による方法。
4. ヌクレオチド配列の違いを同定するステップが該植物か動物で単離したヌクレオチド配列を配列決定するステップからなる請求項１による方法。
5. 植物を大麦、ライ麦、サトウモロコシ、メイズ、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、木綿、米、菜種（カノーラを含む）、ひまわり、ムラサキウマゴヤシ、サトウキビ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、イチゴ及びラズベリー、カンタロープ、人参、カリフラワー、コーヒー、キュウリ、なすび、ブドウ、甘露、レタス、マンゴ、メロン、タマネギ、パパイヤ、エンドウ豆、トウガラシ、パイナップル、ほうれん草、スクアッシュ、スイートコーン、たばこ、トマト、スイカ、バラ科果物（リンゴ、桃、梨、チェリー及びスモモのような）及びアブラナ科野菜（ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、芽キャベツ及びカブカンランのような）からなる一群から選び、発現型が変化しても良い他の作物、果実及び野菜としては大麦、干しぶどう、アボカド、オレンジ、レモン、グレープフルーツ及びタンジェリンのような柑橘類果物、アーティチョーク、サクランボ、クルミやピーナッツのようなナッツ、エンダイブ、リーク、クズウコン、ビート、キャッサバ、カブ、ラディッシュ、ヤムイモ、サツマイモのような根及び豆を含み請求項１による方法。
6. 前記動物が哺乳類か魚である請求項１による方法。
7. 前記哺乳類が霊長類目、げっ歯目、ウサギ目、クジラ目、食肉目、奇蹄目及び偶蹄目から選んだ請求項６による方法。
8. 前記偶蹄目がイノシシ科、ベッカリー科、カバ科、らくだ科、マメジカ科、キリン科、シカ科、プロングホーン科及びウシ科の９科の一つから選んだ請求項７による方法。
9. 前記ウシ科から選んだ動物が有蹄動物である請求項８による方法。
10. 前記有蹄動物が雌ウシ又は雄ウシ、バイソン、バファロー、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、エルク、カリブー、山羊、水牛、ラクダ、ラマ、アルパカ及びブタからなる一群から選んだ請求項９による方法。
11. 前記動物が魚である請求項６による方法。
12. 前記魚がゼブラフィッシュ、ヨーロッパ鯉、鮭、カダヤシ、テンチ、ヤツメウナギ、丸ハゼ、ティラピア及びマスからなる一群から選んだ請求項１１による方法。
13. 前記動物がヒトである請求項８による方法。
14. 動物又は植物で雑種衰弱（HD）を産生できる候補遺伝子の同定法で、
    （i）該雑種衰弱（HD）を示す動物か植物から単離の候補遺伝子の対立遺伝子のヌクレオチド配列を該動物か植物の親から単離した対応対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較し、
    （ii）アミノ酸配列の変化をコード化する該雑種衰弱（HD）を示す該動物か植物の対立遺伝子中のヌクレオチド配列の違いを同定し、且つ
    （iii）該動物か植物の候補遺伝子の対立遺伝子間でのアミノ酸配列の変化を候補遺伝子内の2つ以上の異種エキソン内に位置するヌクレオチド配列によりコード化されているか同定する
    ステップからなる同定法。
15. 前記アミノ酸配列変化が保存修正変化である請求項１４による方法。
16. 前記アミノ酸配列変化が非保存修正変化である請求項１４による方法。
17. ヌクレオチド配列の違いを同定するステップが該植物か動物で単離したヌクレオチド配列を配列決定するステップからなる請求項１４による方法。
18. 前記植物が雑草か他の有害な植物である請求項１４による方法。
19. 前記動物が有害小動物である請求項１４による方法。
20. 前記有害小動物がげっ歯動物、ウサギか魚である請求項１９による方法、
21. 動物又は植物での雑種強勢か雑種衰弱の産生法で、
    （i）雑種強勢か該雑種衰弱を促進する動物か植物の遺伝子から単離した対立遺伝子のヌクレオチド配列を該動物か植物の親から単離した対応対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較し、
    （ii）アミノ酸配列の変化にコードする雑種強勢か雑種衰弱を促進する該動物か植物の対立遺伝子中のヌクレオチド配列の違いを同定し、
    （iii）該動物か植物の候補遺伝子の対立遺伝子間でのアミノ酸配列の変化を候補遺伝子内の2つ以上の異種エキソン内に位置するヌクレオチド配列によりコード化されているか同定し、
    （iv）該動物か植物内で雑種強勢か雑種衰弱を促進する対立遺伝子のヌクレオチド配列からなる作成物を産生し、
    （v）該作成物を受容体植物細胞か受容体動物細胞に形質転換し、
    （vi）該作成物を発現する植物か動物を該細胞から再生する
    ステップからなる産生法。
22. 植物又は動物中でのハイブリッドｍRNAの有無の検出法で、植物か動物からｍRNAを単離し該ｍRNAのヌクレオチド配列を植物対立遺伝子か動物対立遺伝子の対応コード配列と比較するステップからなる検出法。
23. 異種対立遺伝子からのエキソンからなる合成遺伝子を含む作成物で、該対立遺伝子がアミノ酸配列をコードし、その変化が異種対立遺伝子間で起こる作成物。
24. 植物又は動物中の雑種衰弱を克服し且つ／又は植物か動物に雑種強勢を誘発するために試験管内又は体内産生のハイブリッドｍRNA分子を使用し、該ハイブリッドｍRNAを該動物又は植物に導入するステップからなるハイブリッドｍRNA分子の使用。
25. 該ハイブリッドｍRNAの該動物又は植物への導入するステップが形質転換による請求項２４による使用。
26. 前記植物への形質転換ステップが相同的組み換え、微粒子銃、ポリエチレングリコール仲介の形質転換、電気窄恆、炭化ケイ素繊維仲介の形質転換又はアグロバクテリウム仲介の形質転換からなる一群から選んだ請求項２５による使用。
27. 合成遺伝子を体細胞か細胞核の形質転換前にヒトでない体細胞か細胞核に挿入して、遺伝子工学的又は遺伝子導入的なヒトでない動物の産生法で、該合成遺伝子が遺伝子の異種対立遺伝子のエキソンからなり、該対立遺伝子がアミノ酸配列の変化をコーディングし、その変化が同一対立遺伝子では起こらない産生法。
28. 請求項２７による方法で得る遺伝子工学的動物又は遺伝子導入動物。
29. 前記動物細胞を哺乳類と魚から単離する請求項２７による方法。