CN1997754A

CN1997754A - 鉴定促进杂种优势和杂种无活力的基因的方法及其用途

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Publication number: CN1997754A
Application number: CNA2005800107440A
Authority: CN
Inventors: 彼特·H·凯
Original assignee: HYBRID BIOSCIENCES Pty Ltd
Current assignee: HYBRID BIOSCIENCES Pty Ltd
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2007-07-11
Also published as: KR20070004668A; CA2555965A1; EP1713931A1; ZA200606354B; JP2007519403A; IL177256A0; EP1713931A4; NZ549354A; US20110252488A1; WO2005075668A1

Abstract

本发明涉及鉴定在疾病的诊断治疗和/或杂种优势的诱导中潜在有用的候选基因的方法。具体地，本发明涉及鉴定能在动物或植物中产生杂种优势或杂种无活力的候选基因的方法，包括如下步骤：(i)比较候选基因的等位基因的核苷酸序列；(ii)鉴定来自所述动物或植物的等位基因中的核苷酸序列差异；和(iii)鉴定候选基因的等位基因之间的氨基酸序列变化位于候选基因内的两个或更多个不同外显子中。

Description

鉴定促进杂种优势和杂种无活力的基因的方法及其用途

发明领域

本发明涉及鉴定在疾病的诊断治疗和/或杂种优势的诱导中潜在有用的候选基因的方法。本发明更进一步地涉及利用体内产生的杂合mRNA分子战胜植物或者动物体内的疾病和/或利用该分子固定植物或动物中的杂种优势遗传率或其他有利或不利的表型。

发明背景

几百年前已经认识到一些具有影响植物，动物及其他生物体生长，成活或茁壮性的遗传因素在遗传上无关的生物学正常亲代的后代中更有影响力。这一生命现象被称为杂种优势(hybrid vigour)(HV)或杂种优势(heterosis)。遗传上不相同的亲代的子代被称为杂合生物体。

已经提出许多模型来解释HV。在近代已经提出了与电路类似的模型(Milborrow，J.Exp.Bot.49，1063(1998))和另一个以数学为基础的模型(Gordon，Heredity 83，757(1999))。但是，如Birchler，等，The Plant Cell，15，2236(2003)最近所述，其潜在机制仍然未知。在2003年，Birchler和同事也预言″杂种优势最后的分子解释将决定是否可以为了农业和生物工艺学的利益对它进行操作。″

虽然解释这一现象的许多理论已经发展，但是具有主要商业重要性的观点长期一直坚持HV是由新蛋白质(例如，激素、酶或生长因子)驱动的，其中与任何一个亲代相比，杂合体或者杂种生物体唯一地合成该新蛋白质(Schwartz，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46，1210(1960)；Gill，in Genetics andWheat Improvement，A.K.Gupta，Ed.(Oxford and IBH Publishing Co.New Delhi，1977)pp 204-207)Scandalios等Arch.Biochem.Biophys.153，695(1972))，例如在玉米杂种中已经发现这一点(Romagnoli等，Theor. Appl.Genet.80，769(1990)；Cheng等，Chinese Sci.Bull.41，40(1996))。

在更进一步公知的HV形式中，生物学缺陷亲代的子代中的几乎正常的生物学表型被恢复，其中每个缺陷亲代携带相同基因的不同突变形式，称为基因内或等位基因间互补(IC)。

与HV相反，在杂合体子代中形成的新蛋白质中的一些会使子代的茁壮性(robustness)，成活力(viability)或健康状况(well-being)与任何一个亲代相比降低或者会在子代中引起疾病。我们称这种生物学表型为杂种无活力(hybriddebility)(HD^)。

因为在杂合生物体中合成新蛋白质的能力不符合孟德尔遗传方式，因此可靠地预计HV的遗传率已经是不可能的。

依照中心法则可知，蛋白质是在遗传而得的基因的DNA序列的指导下，通过一系列众所周知的生物化学步骤合成的。这些步骤包括基因转录，其中从遗传自每个亲代的基因的DNA序列读出初级RNA分子(包括内含子衍生的结构)。被称为剪接体(spliceosome)的大核蛋白复合物拼接可除去初级RNA分子内的内含子衍生的结构，只留下外显子衍生的区域。然后融合剩余的外显子衍生的区域形成成熟的信使RNA(mRNA)分子。最后mRNA分子通过被称为翻译的过程指导初级多肽氨基酸序列的形成。中心法则也陈述在基因转录后，剪接体通过单分子穿线或线性扫描处理接合初级RNA分子，并除去内含子衍生的元件。因此，认为来自相同初级RNA分子的外显子衍生的元件在有序和明确界定的顺式反应系列中组装形成mRNA(Aebi等Trends Genet.3，102(1987)；Brown等，Antonie van Leeuwenhoek 62，35 (1992))。

本发明提供了反驳此中心法则的基础，因此也为人工创造杂种优势和/或杂种无活力提供了基础。

发明概述

为了合成新多肽或新蛋白质，发明人已经假定在剪接处理期间，可以通过允许将从一个亲代遗传下来的基因的外显子的3′端与来自另一个亲代的相同基因的下游紧邻外显子的5′端连接的初级RNA拼接机制在体内产生杂种mRNA分子。因此，发明人显示通过以前未被认识的生物化学途径产生可以合成新杂合蛋白的新mRNA分子或杂种mRNA分子，其中以前未被认识的生物化学途径将来自两个不同亲代等位基因中每一个的外显子或其部分合并到相同的成熟mRNA分子中。如下文详细描述的那样，发明人已经证明组装所述杂种mRNA构建体的生物学途径的存在。

因此，从最宽的方面来说，本发明描述了解释怎样在杂合子代中产生HV和HD生物学表型的分子遗传机制。在杂合子代中形成的产生HV和HD的新遗传结构参考亲代的可继承的遗传密码是不明显的。

因此，本发明提供了鉴定在疾病的诊断治疗和/或固定HV遗传率或其他有利或不利的生物表型中潜在有用的候选基因的方法。

第一方面提供了鉴定能在动物或植物中产生杂种优势的候选基因的方法，包括如下步骤：

(i)将分离自显示杂种优势的动物或植物的候选基因的等位基因的核苷酸序列与分离自所述动物或植物亲代的对应的等位基因的核苷酸序列进行比较；

(ii)鉴定来自显示杂种优势的所述动物或植物的等位基因中编码氨基酸序列变化的核苷酸序列差异；和

(iii)鉴定所述动物或植物中候选基因的等位基因之间的氨基酸序列变化由位于候选基因内的两个或更多个不同外显子中的核苷酸序列编码。

第二方面提供了鉴定能够在动物或植物中产生杂种无活力(HD)的候选基因的方法，包括如下步骤：

(i)将分离自显示所述杂种无活力(HD)的动物或植物的候选基因的等位基因的核苷酸序列与分离自所述动物或植物亲代的对应的等位基因的核苷酸序列进行比较；

(ii)鉴定来自显示出所述杂种无活力(HD)的所述动物或植物的等位基因中编码氨基酸序列变化的核苷酸序列差异；和

第三方面提供了能够在动物或植物中产生杂种优势或杂种无活力的方法，包括如下步骤：

(i)将分离自促进杂种优势或杂种无活力的动物或植物的基因的等位基因的核苷酸序列与分离自所述动物或植物亲代的对应的等位基因的核苷酸序列进行比较；

(ii)鉴定来自促进杂种优势或杂种无活力的所述动物或植物的等位基因中编码氨基酸序列变化的核苷酸序列差异；和

(iv)制备包含来自促进所述动物或植物体内的杂种优势或杂种无活力的等位基因的核苷酸序列的构建体；

(v)将所述构建体转化到受体植物或动物细胞中；

(vi)从所述细胞再生表达所述构建体的植物或动物。

第四方面提供了检测植物或动物中存在或缺少杂种mRNA的方法，该方法包括从植物或动物中分离mRNA和将所述mRNA的核苷酸序列与植物或动物的等位基因的对应编码序列比较的步骤。

第五方面提供了包含含有来自基因的不同等位基因的外显子的合成基因的构建体，其中所述等位基因编码在不同等位基因之间发生的氨基酸序列变化。

本发明更进一步地涉及利用体内产生的杂种mRNA分子战胜植物或者动物体内的疾病和/或在植物或者动物中诱导杂种优势的用途。

即使优选所有在农业方面重要的植物品种，但植物细胞可以分离自任何高等植物，包括裸子植物，单子叶植物和双子叶植物。优选地，植物细胞分离自从大麦、黑麦、高粱、玉蜀黍、大豆、小麦、玉米(corn)、马铃薯、棉花、稻、含油种子油菜(包括芸苔)、向日葵、苜蓿、甘蔗、香蕉、黑莓、越桔(blueberry)、草莓、和树莓(raspberry)、棱瓜(cantaloupe)、胡萝卜、花椰菜(cauliflower)、咖啡、黄瓜、茄子、葡萄、蜜露(honeydew)、莴苣、芒果(mango)、瓜(melon)、洋葱、番木瓜、豌豆、胡椒、菠萝、菠菜、南瓜(squash)、甜玉米(sweet corn)、烟草、番茄、西瓜、蔷薇科果实(rosaceous fruit)(例如，苹果、桃、梨、樱桃和李子(plum))和蔬菜芸苔(vegetable brassicas)(例如，花茎甘蓝(broccoli)、卷心菜、花椰菜、比京芽菜(brussel sprouts)和大头菜(kohlrabi))组成的群组中选择出来的植物。其他表型(phenotype)可以改变的农作物，果实和蔬菜包括大麦、葡萄干(currant)、鳄梨(avocado)、柑桔类(citrus)水果，例如橙、柠檬、葡萄柚(grapefruit)和红桔(tangerines)、朝鲜蓟(artichoke)、樱桃、坚果类例如胡桃(walnut)和花生、菊苣(endive)、韭(1eek)、根(roots)、例如竹芋(arrowroot)、甜菜(beet)、木薯(cassava)、芜菁(turnip)、萝卜(radish)、薯蓣(yam)、甘薯(sweet potato)和豆类(beans)。可以用于本发明的其他植物细胞包括分离自木质种类，例如松树、白杨和桉树的细胞。更优选地，植物细胞是稻细胞、小麦细胞、大麦细胞、黑麦细胞、高粱细胞或玉蜀黍细胞。

转化植物细胞的步骤包括本领域已知的任何能够稳定转化植物细胞的方法。可以获得适合豆科(Leguminosae)(紫花苜蓿(alfalfa)、大豆(soybean)、苜蓿(clover)等等)、伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、欧洲防风草(parsnip))、十字花科(Cruciferae)(卷心菜、萝卜、油菜籽、花茎甘蓝等等)、葫芦科(Curcurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)、禾本科(Gramineae)(小麦、玉米、稻、大麦、粟(millet)等等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、番茄、烟草、胡椒等等)和其他各种农作物的适当的操作规程。参见在Ammirato等(1984)Handbook of PlantCell Culture--Crop Species.Macmillan Publ.Co.Shimamoto等(1989)Nature338：274-276；Fromm等(1990)Bio/Technology 8：833-839和Vasil等(1990)Bio/Technology 8：429-434中描述的操作规程。

优选地，用选自由同源重组，微粒轰击，PEG介导的原生质体转化，电穿孔，碳化硅纤维介导的转化或农杆菌介导的转化组成的群组的方法转化植物细胞。在本发明的优选实施方案中，转化步骤包括微粒轰击，其中通过用含有构建体的DNA包被微粒并使受体细胞接触微粒来进行微粒轰击。

在另一方面，本发明提供了产生子代的方法，其包含如下步骤：(a)依照如上所述的方法制备植物；和(b)将该植物与第二种植物或它本身杂交(crossing)。

在另一方面，本发明提供了一种植物育种的方法，其包括如下步骤：(a)获取依照如上所述的方法制备的植物的任何一代的子代植物，其中子代植物包含所述构建体；和(b)将该植物与它本身或第二种植物杂交。

第六方面，本发明提供了通过在转移体细胞或细胞核之前将合成基因插入体细胞或细胞核来制备遗传修饰(genetically engineering)动物或转基因动物的方法，其中所述的合成基因包含来自基因的不同等位基因的外显子，所述等位基因编码氨基酸序列变化，而相同的等位基因上不发生这种变化。

本发明更进一步地提供了通过第六方面的方法获取的遗传修饰动物或转基因动物。

虽然该方法对哺乳动物和鱼特别有用，但动物细胞可以分离自任何动物。适当的哺乳动物来源包括灵长目、啮齿目、兔形目(Lagomorpha)、鲸目(Cetacea)、食肉目(Carnivora)、奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄目(Antilocapridae)成员。奇蹄目和偶蹄目成员是特别优选的，因为它们具有相似的生物学特性和经济重要性。

例如：偶蹄目包括通过九个科进行区分的大约150种活的动物：猪(猪科)(Suidae)、野猪(Tayassuidae)、河马(河马科)(Hippopotamidae)、骆驼(Camelidae)、麝香鹿(Tragulidae)、长颈鹿和霍加皮(okapi)(长颈鹿科)(Giraffidae)、鹿(鹿科)(Cervidae)、糜鹿(叉角羚科)(Antilocapridae)，牛、绵羊、山羊和羚羊(牛科)(Bovidae)。在许多国家，这些动物中的许多都被用作饲养动物。更重要地，就本发明而言，许多经济上重要的动物，例如山羊、绵羊、牛和猪具有非常相似的生物学特性，而且共有高度的基因组同源性。

奇蹄目包括马和驴子，两者对经济都很重要，而且紧密相关。实际上，已经公知马和驴子可以异种交配。

在一个实施方案中，动物细胞是从有蹄动物获得的。优选地，有蹄动物选自由牛科动物(bovids)，羊科动物(ovids)，鹿科动物(cervids)，猪科动物(suids)，马科动物(equids)和camelids的驯养或野生代表组成的群组。这种代表的实例有奶牛或公牛、野牛(bison)、水牛(buffalo)、绵羊、大角(big-horn)绵羊、马、矮种马(ponies)、驴子、骡、鹿、麋鹿(elk)、驯鹿(caribou)、山羊、水牛(water buffalo)、骆驼、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)和猪。在牛类动物中特别优选的是黄牛(Bos taurus)、瘤牛(Bos indicus)，Bos水牛奶牛(Bosbuffaloes cows)或公牛。在一个实施方案中，动物细胞分离自水生生物，例如脊椎海洋动物和无脊椎海洋动物。更优选地，水生生物选自由鱼、两栖动物和软体动物组成的群组。鱼包括，但不限于斑马鱼(zebrafish)，欧洲鲤鱼(European carp)、鲑鱼(salmon)、食蚊鱼(mosquito fish)、丁鱥(tench)、七鳃鳗(lamprey)、圆虾虎鱼(round gobies)、罗非鱼(tilapia)和鳟鱼(trout)。两栖动物包括，但不限于蟾蜍和青蛙。软体动物包括，但不限于太平洋牡蛎(Pacificoysters)、斑马贻贝(zebra mussels)、条纹贻贝(striped mussels)、新西兰螺旋贝壳(New Zealand screw shells)、番茄蜗牛(the Golden Apple Snail)、非洲巨人蜗牛(the Giant African Snail)和扁卷螺属(Biomphalaria)和泡螺属(Bulinus)的疾病媒介蜗牛。

优选通过同源重组将本发明的构建体转化到动物细胞中。优选通过添加经设计的构建体到细胞，例如生长在包含目标基因的组织培养物中的胚胎干细胞中来诱导同源重组(参见Molecular Genetics，U.Melcher(1998))。更优选地，将转化的干细胞注入到新胚泡中，使新构建体固定在成熟动物中。

发明详述

引用这里提到的所有出版物只是为了描述和公开该出版物中报道的可能与本发明有联系，能在本发明中使用的操作规程和试剂。在这里没有任何东西被认为是允许因为在先发明早于这些公开内容而使本发明不被授权的理由。

除非另有陈述，本发明实施中使用了本领域熟练技术人员掌握的常规的分子生物学，植物和动物生物学，以及重组DNA技术。本领域熟练技术人员已经公知这些方法，在文献中也进行了充分地解释。例如，参见Maniatis，Fritsch & Sambrook，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″(1982)；″DNACloning：A Practicai Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，Ed.，1985)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，Ed.，1984)；″Nucleic Acid Hybridization″(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1985)；″Transcription and Translation″(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)；B.Perbal，″A Practical Guide to MolecularCloning″(1984)和Sambrook，等，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″12thedition(1989)。

随后的描述利用了许多用于DNA重组技术的术语。除非另外定义，否则这里使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域的熟练技术人员通常理解的含义。下面的参考文献为熟练技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton，等，″Dictionary of Microbiology and MolecularBiology″(2nd ed.1994)；″The Cambridge Dictionary of Science and Technology″(Walker ed.，1988)；″The Glossary of Genetics″5th Ed.，Rieger，R.，等(eds.)，Springer Verlag(1991)和Hale & Marham，″The Harper Collins Dictionary ofBiology″(1991)。通常，这里描述的植物和动物维持，繁殖和DNA重组技术方面的术语和实验方法是众所周知的通常用于本领域的术语和实验方法。

可以理解，本发明并不局限于这里描述的具体材料和方法，他们可以发生变化。也应理解这里使用的术语只是为了描述本发明具体的实施方案，而不是意味限制只由所附权利要求限定的本发明的范围。必须指出在这里和所附权利要求中使用的单数形式″a″，″an″和″the″包括复数，除非上下文清楚地规定有其他不同含义。因此，例如：参考词″一种植物细胞″包括许多这样的植物细胞，参考词″一种动物细胞″指一种或多种动物细胞。虽然与这里描述的材料和方法类似或等效的任何材料和方法都可以用于实施或测试本发明，但这里描述的材料和方法是优选的。

定义

术语″多核苷酸″、″多核苷酸序列″、″核酸序列″和″核酸片段″/″分离的核酸片段″在这里可交换使用。这些术语包括核苷酸序列等等。多核苷酸可以是随意包含合成的，非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的多核苷酸可能由cDNA，基因组DNA，合成的DNA或他们的混合物中的一个或多个片段组成。

术语″分离的″多核苷酸指基本上没有其他核酸序列的多核苷酸，其他核酸序列包括，但不限于在天然存在环境中已发现的通常与分离的多核苷酸伴随或相互作用的其他染色体和染色体外DNA和RNA。分离的多核苷酸可以纯化自天然存在该多核苷酸的宿主细胞。可以用本领域熟练技术人员已知的常规核酸纯化方法获取分离的多核苷酸。该术语也包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

术语″重组体″指，例如：通过化学合成或遗传工程技术操纵分离的核酸将两个分离的不同序列片段进行人工组合制备得到的核酸序列。

这里使用的″基本上相似″指一个或多个核苷酸碱基发生变化的核酸分子，其中核苷酸碱基的变化不引起核苷酸序列编码的氨基酸序列发生变化，或者仅导致不影响核苷酸序列编码的多肽的功能特性的一个或多个氨基酸取代。

也可以用杂交能力来表征基本上相似的核酸分子。通过在本领域熟练技术人员透彻理解的严谨条件下的DNA-DNA或者DNA-RNA杂交来提供对这种同源性的估计(Hames and Higgins，Eds.(1985)Nucleic Acid Hybridisation，IRL Press，Oxford，U.K.)。杂种后洗涤决定严谨条件。一类优选条件利用了一系列的洗涤，其中用6 X SSC，0.5％SDS在室温下洗涤15分钟启动洗涤，然后用2 X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，接着用0.2 X SSC，0.5％SDS在50℃重复两次，每次洗涤30分钟。更优选的一组严谨条件使用了更高的温度，其中洗涤过程与上述过程相同，除最后在0.2 X SSC，0.5％SDS中的两个30分钟洗涤的温度增加到60℃外。另一组优选的高严谨条件用0.1 XSSC，0.1％SDS，在65℃进行两次后期洗涤。

″合成基因″或″合成的核酸片段″可以组装自利用本领域熟练技术人员所知的方法化学合成的寡核苷酸砌块(building block)。将这些砌块连接退火可形成更大的核酸分子，然后通过酶组装这些核酸分子可以构建出想要的完整的核酸分子。″化学合成的″核酸片段指组分核苷酸是在体外组装的。可以利用已建立的方法完成核酸片段的人工化学合成，或者可以利用许多市场上能买到的设备完成自动化的化学合成。因此，可以以反映宿主细胞密码子偏好(codon bias)的核苷酸序列优化为基础，剪裁(tailor)核酸片段以实现最佳的基因表达。如果使用的密码子偏向宿主喜好的那些密码子，熟练技术人员就能预测基因成功表达的可能。可以基于对来源于宿主细胞的基因的调查来确定优选密码子，其中从调查中可获得序列信息。

″候选基因的等位基因″指候选基因序列的正常等位基因，以及携带了使个体倾向于发展成杂种优势或者杂种无活力的变化的等位基因。因此这里使民用的术语″候选基因序列″和″候选基因的等位基因″指包含基因序列，等位基因或区域的双链DNA，以及包含基因序列，等位基因或区域的任何一条单链DNAs(即编码和非编码链中的任何一条链)。

″候选基因″或″基因″指表达具体蛋白质的核酸片段，它包括位于编码序列之前(5′非编码序列)，编码序列之间和编码序列之后(3′非编码序列)的调节序列。″天然基因″指在自然界中发现的具有自身调节序列的基因。″嵌合基因″或″外源基因″在这里可交换使用，并指不是天然基因的任何基因，它包含自然界中未发现在一起的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因或外源基因可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或者包含以不同于自然界中存在的方式排列的来源于相同来源的调节序列和编码序列。″内源基因″指在生物体基因组中位于天然位点的天然基因。″外来基因″指通常在宿主生物体中没有发现的通过基因转移被引入宿主生物体的基因。外来基因可以包含插入到非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。″转基因″是通过转化过程引入基因组的基因。

″编码序列″指编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。术语″氨基酸序列同源物″或″同一物″指具有相似氨基酸序列的蛋白质。本领域技术人员将认识到决定性的氨基酸序列在蛋白质的功能域内。因此，同源蛋白质相对与氨基酸序列全长具有小于40％的同源性，但在一个功能域具有大于90％的同源性是可能的。

在这里可以利用普遍公知的IUPAC-IUB生物化学术语委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的三个字母符号或一字母符号来表示氨基酸。

同样地，可以用一般接受的单字母代码来表示核苷酸。

″保守修饰的变体″既适用于氨基酸序列，又适用于核酸序列。对具体的核酸序列来说，保守修饰的变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当所述核酸不编码氨基酸序列时指基本相同的序列。

由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸可以编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在每个表示丙氨酸的密码子位点，可以将密码子变更为任何已描述的不改变编码多肽的对应密码子。这种核酸变化是″沉默变化″，是保守修饰变化的一种。这里的每个编码多肽的核酸序列也描述了每一种可能的核酸沉默变化。本领域技术人员将认识到可以修饰核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG外)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变化都隐含在描述的每个序列中。

至于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到″保守修饰变体″将由编码序列的变化产生，其中编码序列的变化导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表为本领域所熟知。

下列的六个组每个都包含可以互相保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

(例如，参见Creighton，Proteins(1984))。

术语″非保守修饰的变化″指不涉及保守取代的氨基酸变化。例如：将丙氨酸替换为苯丙氨酸将构成非保守修饰变化。

″调节序列″指位于编码序列上游(5′非编码序列)，编码序列内和编码序列下游(3′非编码序列)的影响转录，RNA加工处理或RNA稳定性，或者相关联的编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译引导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列和影响剪接位点选择的序列。

″启动子″指能控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般说来，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后者经常被称为增强子。因此，″增强子″是可以促进启动子活性的核苷酸序列，它可以是启动子的固有元件，或者是插入的增强启动子水平或者组织特异性的异源元件。启动子可以全部衍生自天然基因，或者可以由来源于自然界中存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至可以包含合成的核苷酸片段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导不同组织或细胞类型中的基因表达，可以指导不同发育阶段的基因表达，或者可以指导响应不同环境条件的基因表达。使核酸片段在大部分时间里在大多数细胞类型中表达的启动子一般被称为″组成型启动子(constitutive promoter)″。

″翻译引导序列″指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译引导序列存在于完全加工mRNA的翻译起始序列的上游。翻译引导序列可以影响初级转录物加工成mRNA、mRNA的稳定性或翻译效率。已经描述翻译引导序列的实例(Turner and Foster(1995) Mol.Biotechnol.3：225-236)。″3′非编码序列″指位于编码序列下游的核苷酸序列，并包括多腺苷酸化识别序列及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常以影响多聚腺苷酸域添加到mRNA前体的3′末端为特征。Ingelbrecht等(1989)Piant Cell 1：671-680举例说明了不同3′非编码序列的用途。

″RNA转录物″指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。当RNA转录物是DNA序列完全互补的拷贝时，它被称为初级转录物，或者它可能是来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列，并且被称为成熟RNA。″信使RNA(mRNA)″指没有内含子，可以由细胞翻译成多肽的RNA。″cDNA″指与来源于mRNA模板，且与mRNA模板互补的DNA。cDNA可以是单链的，或者可以使用例如，DNA聚合酶I的Klenow片段将其变成双链形式。″有义RNA″指包括mRNA，因此能被细胞翻译成多肽的RNA转录物。″功能RNA″指有义RNA，反义RNA，核酶RNA或者其他的可能不被翻译，但对细胞过程仍有影响的RNA。

术语″可操作连接″指使单个多核苷酸上的两个或更多个核酸片段相关联，以使一个片段的功能受另一个的影响。例如：当启动子能够影响编码序列的表达时，启动子被操作性地与编码序列连接(即编码序列位于启动子的转录控制下)。可以以有义或反义方向将编码序列可操作地与调节序列连接。

这里使用的术语″表达″指来源于本发明的核酸片段的有义(mRNA)的转录和稳定积累。表达也可以指将mRNA翻译成多肽。

″蛋白质″或″多肽″是按照编码多肽的多核苷酸中的编码序列确定的以特定顺序排列的氨基酸链。每个蛋白质或多肽都具有独特的功能。

″改变的水平″或者″改变的表达″指在转基因生物体中产生的基因产物的量或比例不同于正常或非转化生物体产生的量或比例。

″成熟蛋白质″或描述蛋白质时使用的术语″成熟″指经过翻译后加工的多肽；即存在于初级翻译产物中的任何前肽已经被除去的多肽。″前体蛋白质″或描述蛋白质时使用的术语″前体″指mRNA翻译的初级产物；即前肽仍然存在。前肽可以是胞内定位信号，但并不限于此。

″转化″指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中产生稳定遗传的过程。包含转化的核酸片段的宿主生物体被称为″转基因″生物体。植物转化方法的实例包括农杆菌介导的转化(De Blaere等(1987)Meth.Enzymol.143：277)，同源重组和颗粒加速或″基因枪″转化技术(Klein等(1987)Nature(London)327：70-73；美国专利No.4,945,050，在此引入作为参考)。因此，本发明的分离的多核苷酸可以整合到能导入宿主细胞并在宿主细胞中复制的重组构建体中，通常整合到DNA构建体中。这种构建体可以是包括复制系统并能在给定的宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列的载体。例如，在Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，supp.1987；Weissbachand Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989和Flevin等，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990中已经描述了许多适合于稳定转染植物细胞或建立转基因植物的载体。通常，植物表达载体包括，例如：在5′和3′调节序列转录控制下的一个或多个克隆的植物基因和显性可选标记。这种植物表达载体也可以包含启动子调节区域(例如，控制诱导型表达或组成型表达，环境表达或发育调节表达，细胞或组织特异表达的调节区域)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。

″PCR″或″聚合酶链式反应″是本领域技术人员所熟知用于扩增特异DNA片段的技术(美国专利号Nos.4,683,195和4,800,159)。

术语″子代″指任何后代，包括起源于特定亲本植物或亲本植物类的种子和从种子获得的植物。

″再生″是从植物细胞(例如，植物原生质体或外植块(explant))成长为植物的过程。

″选择的DNA″指被引入宿主基因组的DNA片段。优选的DNAs将包括一个或多个外源基因和在宿主细胞中表达外源基因的元件，例如，启动子和终止子。通过使选择的DNA包括一个或多个增强子元件可以实现一些益处。

″转化细胞″是指通过将外源DNA分子引入细胞中产生的DNA已改变的细胞。

″转基因植物″是转化的植物细胞或原生质体的植物或起源于该植物的任何后代中的子代，其中植物DNA包含插入的外源DNA分子，该外源DNA分子最初不存在于相同植株的天然非转基因植物中。转基因植物可以另外包含转化植物与生俱来的序列，但是为了改变原有产物或野生型基因产物的结构，或者基因表达的水平或模式，已经通过基因技术方法改变其中的″外源″基因。

″载体″是能够在宿主细胞中复制的DNA分子和/或是另一个DNA片段可以操作性地与其连接，并使连接的片段复制的DNA分子。质粒是示范的载体或者是用来携带新基因到细胞内的DNA分子。质粒这一示范载体是独立、稳定的自我复制DNA片段。

这里使用的术语″基因型″是指个体细胞，细胞培养物，植物或动物的遗传组成。

这里使用的术语″杂合子″是指在至少一个基因座(locus)具有不同等位基因(给定基因的形式)二倍体或多倍体个体细胞，植物或动物。

这里使用的术语″杂合的″是指在具体基因座存在不同等位基因(给定基因的形式)。

这里使用的术语″纯合子″是指在一个或一个以上基因座具有相同等位基因的个体细胞或植物。

这里使用的术语″纯合的″是指在同源染色体片段的一个或一个以上基因座中存在相同的等位基因。

试验操作规程

本发明一方面涉及鉴定候选基因的方法。术语″候选基因″指具有产生杂种优势或杂种无活力可能的一个基因或多个基因。术语″杂种优势(hybridvigour)″或″杂种优势(heterosis)″在这里可交换使用，指杂种的性能相对与纯种增加，像生长率，生育力和抗病力的特性增加最显著。特别地，候选基因是动物或植物中杂合的有功能的导致杂种优势的那些基因。在一个实施方案中，每个基因的等位基因将包含位于编码序列的不同外显子中的核苷酸序列变化，这些变化导致氨基酸序列变化。例如，如果植物或动物包含基因X的两个等位基因，即基因X的杂合子，那么它就满足了作为本发明候选基因的第一个必要条件。第二个标准是核苷酸序列的序列变化，该变化导致任何表达的蛋白质中的氨基酸序列变化。第三个标准是每个等位基因包含序列变化，其中在每个等位基因的相同位置没有发现该序列变化。例如：在上述的基因X中，每个等位基因可以包含序列变化，其中在等位基因1中，变化在位置1，而在等位基因2中，变化在位置20。如果变化导致氨基酸序列方面的变化，这将满足第二和第三个标准。第四个标准是变化出现不同的外显子中，而不是仅仅出现在相同外显子的不同位置中。

在一个实施方案中，候选基因可具有一个或多个编码氨基酸变化的核苷酸序列变化，其中这些变化在不同外显子的不同等位基因中被发现。

候选基因将优选产生至少三种RNA：与一个等位基因相同的mRNA分子，与第二个等位基因的编码序列相同的mRNA分子和包含来自两个等位基因的外显子组合的杂种mRNA分子。明显地，随外显子数目而定的不同种类的杂种mRNA分子的数目可能众多。

鉴定候选基因的方法相对简单，通过候选基因的PCR扩增片段的常规序列分析或Southern印迹分析就可以鉴定出来(例如，参见Gieselmann等1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：9436-9440)。本领域熟练技术人员也应理解利用本领域的许多方法可以在同质(homogenous)管和/或闭合管中进行扩增检测，例如，一旦出现充分的扩增，就可以在PCR反应中利用TaqMan杂交探针，通过测量目标核酸特异的荧光进行检测。但是，因为Roche Lightcycler的性能和速度，优选的方法是利用实时PCR和荧光标记的杂种寡核苷酸在Roche Lightcycler上进行熔融曲线分析。

本领域熟练技术人员将意识到存在其他类似的定量″实时″和同质核酸扩增/检测系统，例如，以TaqMan方法为基础的检测(美国专利Nos 5,538,848和5,691,146)，荧光偏振测定(例如，Gibson等，Clin Chem，1997；43：1336-1341)，和Invader测定(例如，Agarwal P等，Diagn Mol Pathol 2000Sep；9(3)：158-164；Ryan D等，Mol Diagn 1999 Jun；4(2)：135-144)。如果适当设计，这些系统也可适应于所描述的发明，使我们能实时监控核酸扩增和等位基因的差别以检测基因突变和多态性。

一旦已经鉴定候选基因，就能分离或合成制备该基因以用于本发明的其他方面。例如：怀疑能产生杂种优势的候选基因可以被转化到宿主细胞(植物和动物)和再生的转基因植物或动物中。

产生转基因动物细胞的方法通常包括如下步骤：(1)组装可用于将具体的DNA序列插入细胞的核基因组中的适当的DNA构建体；(2)将DNA构建体转染到细胞中；(3)允许随机插入和/或同源重组发生。源于这一步骤的修饰可在靶基因组中插入适当的DNA构建体；从靶基因组删除DNA和/或靶基因组的突变。

DNA构建体可以包含目的基因，例如：包含取自不同等位基因的外显子的合成基因和多种元件，其中不同外显子包含不同序列，多种元件包括调节启动子，绝缘子(insulator)，增强子，阻遏子(repressor)和供核糖体结合到从DNA构建体转录出的RNA上的元件。这些实例为本领域普通技术人员所熟知，而且也不意味是限制性的。

因为可以获得有效的重组DNA方法，而且从数据库和商业部门可以容易地获得调节元件和基因的DNA序列，因此，本领域普通技术人员利用这里描述的原料和方法可以很容易地产生适合于建立转基因动物细胞的DNA构建体。

例如：如果在单个cDNA，基因组DNA或其他DNA中不能获得通过DNA测序或限制性内切酶分析确定的候选基因的全部核苷酸编码序列，就可以从几个DNAs中回收适当的DNA片段(例如，限制性片段或PCR扩增产物)，并将这些片段彼此共价连接构建出全部的编码序列。共价连接DNA片段的优选方法是使用DNA连接酶，例如T4 DNA连接酶进行连接。然后可以将分离的候选基因整合到质粒或表达载体中。

动物细胞的转染方法本领域普通技术人员已经熟知，商业上可得到将DNA构建体转染到动物细胞中所需要的材料和方法。通常用于以DNA构建体转染动物细胞的材料是亲脂性化合物，例如，Lipofectin^TM。可以诱导具体的亲脂性化合物形成脂质体用于介导DNA构建体转染到细胞中。

通过DNA构建体的合理设计，可以将来自DNA构建体的靶序列插入到核基因组的具体区域中。这些设计技术和方法本领域普通技术人员已经熟知。例如：参见美国专利5,633,067；美国专利5,612,205和PCT出版物WO93/22432，在此将他们全部引入作为参考。一旦合乎需要的DNA序列被插入核基因组中，就可以利用本领域熟练技术人员熟知的方法鉴定插入区的位置，以及目的DNA序列被插入核基因组的频率。

一旦转基因被插入供体细胞的核基因组中，该细胞就可以像本发明的其他供体细胞一样在核移植方法中被用作核供体。将细胞核转移到卵母细胞(oocyte)中的方法优选包括细胞融合形成重组细胞。

通常，通过横跨接触/融合平面施加DC电脉冲来诱导融合，但是也可以利用附加的AC电流来促使供体和受体细胞排列。电熔合产生足以导致质膜短暂击穿的电脉冲，该电脉冲时间短，足够膜快速重新形成。因此，如果两个相邻的膜被诱导击穿，在脂双分子层掺杂重新组成膜时，两个细胞之间的小通道是开放的。这种小孔隙由于热力学不稳定性会扩大，直至两个细胞成为一体。这一过程的更进一步的讨论可参考Prather等的美国专利No.4,997,384(在此全部引入作为参考)。可以使用多种电熔合媒介，例如包括蔗糖、甘露醇、山梨糖醇和磷酸盐缓冲溶液。

利用仙台病毒(Sendai virus)作为基因融合剂也可以完成融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。也可通过将细胞暴露到促进融合的化学制剂，例如聚乙二醇中来诱导融合。

优选地，将供体动物细胞和卵母细胞放置在500m的融合室中，并用4ml的26℃-27℃的融合介质(0.3M甘露醇，0.1mM MgSO₄，0.05mM CaCl₂)覆盖。然后施加两次70-100V的直流(DC)电脉冲大约15s电熔融细胞，每次间隔大约1s。在融合后，将得到的融合重组细胞放入适当的培养基，例如TCM-199培养基中直至活化。

在细胞融合优选方法中，首先将供体动物细胞附着于去核(enucleated)卵母细胞上。例如：可以选择化合物将动物细胞附着于去核卵细胞上，使动物细胞和去核卵母细胞膜融合。这种化合物可以是能粘合细胞的任何化合物。该化合物可以是能结合或粘合碳水化合物的蛋白质或糖蛋白。更优选地，这种化合物是凝集素(lectin)。凝集素可以选自包括刀豆素A(Concanavalin A)、刀豆抗菌素A(Concavalin A)、蓖麻毒(Ricin)、大豆凝集素、莲子外源凝集素和植物凝集素(PHA)的群组。优选的化合物是PHA。

在一个优选方案中，如上所述的电熔合方法也包括更进一步的融合步骤，或者如上所述的融合步骤包括一个供体动物细胞和两个或更多个去核卵母细胞。双重融合法具有增加重组细胞的细胞质体积的有益效果。

通常，在有核供体和受体卵母细胞融合之前，融合期间和/或融合之后，通过电学和/或非电学方法活化重组的动物细胞(例如：参见Susko-Parrish等，美国专利No.5,496,720)。活化方法包括：

1).电脉冲(Electric pulse)；

2).以化学方法诱导休克(Chemically induced shock)；

3).精子穿透(Penetration by sperm)；

4).以离子载体(ionophore)形式将二价阳离子，例如，镁、锶、钡或钙引入卵母细胞细胞质中增加卵母细胞中二价阳离子的水平。增加二阶阳离子水平的其他方法包括利用电休克、用乙醇处理和用笼蔽螯合剂(cagedchelator)处理；和

5).用已知的方法，例如添加激酶抑制剂，例如，丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如6-二甲基氨基嘌呤，十字孢碱(staurosporine)，2-氨基嘌呤和鞘氨醇(sphingosine)降低卵母细胞中细胞蛋白质的磷酸化作用。或者，可以将磷酸酶，例如磷酸酶2A和磷酸酶2B引入卵细胞中抑制细胞蛋白质的磷酸化作用。

通常，在本领域普通技术人员熟知的培养基中培养活化的重组动物细胞或胚胎，这类培养基包括，但不限于添加10％FSC的TCM-199、Tyrodes-白蛋白-乳酸酯-丙酮酸盐(Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate)(TALP)、添加10％FSC的Ham′s F-10、合成的输卵管液体(″SOF″)、B2、CRlaa培养基和高钾单一培养基(″KSOM″)。

也可以用已知的方法活化重组细胞。这种方法包括，例如在亚生理温度培养重组细胞，实质上是给重组细胞施加寒冷的，或实际上凉爽的温度刺激。在比胚胎正常暴露的生理温度条件寒冷的室温下培养重组动物细胞可以最方便地完成这一过程。适当的卵母细胞活化方法是Susko-Parrish等的美国专利No.5,496,720的主题，在这里将其全部引入作为参考。

然后可以在适当的体外培养基中培养活化的重组动物细胞直至细胞和细胞集落产生。适合于培养和使动物胚胎发育成熟的培养基本领域已经公知。可用于牛类动物胚胎培养和维持的已知培养基的实例包括添加了10％FSC的Ham′s F-10、添加了10％FCS的TCM-199、Tyredes-白蛋白-乳酸酯-丙酮酸盐(Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate)(TALP)、Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)，Eagle和Whitten培养基。用于收集和使卵母细胞发育成熟的一个最常见的培养基是TCM-199和1-20％的血清补充物，包括胎牛血清、新生幼畜血清、发情母牛的血清、羔羊血清或指导血清(steer serum)。优选的维持培养基包括含有Earl盐，10％FSC，0.2mM丙酮酸钠和50g/ml硫酸庆大霉素的TCM-199。上述的任何一种培养基也可以包括与许多类型的细胞共培养，例如颗粒细胞、输卵管细胞、BRL细胞，子宫细胞和STO细胞。

然后，优选洗涤培养的重组动物细胞或胚胎，接着将其放入适当的培养基中，例如，放入盛有包含10％FCS的TCM-199培养基的优选包含适当的愈合饲养层(confluent feeder layer)的孔板中。适当的饲养层包括，例如，成纤维细胞和上皮细胞，例如，来源于有蹄动物的成纤维细胞和子宫上皮细胞、小鸡成纤维细胞、鼠(例如，小鼠或大鼠)成纤维细胞、STO和SI-m220饲养细胞系(feeder cell line)和BRL细胞。

在一个实施方案中，饲养细胞包含鼠胚胎成纤维细胞。适当的成纤维细胞饲养层的制备本领域已经公知。

在饲养层上培养重组动物细胞直至重组细胞的大小达到适合于转移到雌性接受者中的大小，或者达到合适获取用于产生细胞或细胞集落的细胞的大小。优选地，培养这些重组细胞直至至少大约2-400个细胞、更优选大约4-128个细胞，最优选至少大约50个细胞。将在适宜条件下，即大约39℃和5％CO₂的条件下完成培养，为了优化生长，通常大约每隔2-5天更换一次培养基，优选大约每隔3天更换一次。

本发明中的胚胎转移和受体动物处理方法是用于胚胎转移产业的标准方法。同步转移(synchronous transfer)，即核转移胚胎的阶段与雌性受体的发情周期同步对本发明的成功很重要。在Siedel，G.E.，Jr(″Critical review ofembryo transfer procedures with cattle″in Fertilization and EmbryonicDevelopment in Vitro(1981)L. Mastroianni，Jr.and J.D.Biggers，ed.，PlenumPress，New York，N.Y.，page 323)中综述了同步的优点和如何保持受体同步，因此将其内容引入作为参考。

简而言之，可以通过非外科手术或外科手术方法将胚泡(blastocyst)转移到同步受体的子宫中。在运用本领域普通技术人员熟知的方法和培养基时，也可以利用其他的培养基。在一个方法中，用新鲜KSOM洗涤克隆胚胎三次，在39℃，5％CO₂，5％O₂和90％N₂的条件下，在含有0.1％BSA的KSOM培养4天，然后在含有1％BSA的KSOM再培养3天。用本领域已知的标准方法研究胚胎发育，并对其进行分级。在第2天记录卵裂速度(cleavage rate)，更进一步地培养已分裂的胚胎7天。在第7天记录胚泡发育，通过非外科手术方法将待定的可能发育成胚胎和/或动物的一个或两个胚胎转移到每个同步代孕母体(foster mother)的子宫内。

优选通过直肠触诊或定期的超声波检查，例如在妊娠40、60、90和120天时的超声波检查来检查代孕母体的怀孕状态。在整个怀孕期间，优选进行仔细观察和连续的超声监控(每月一次)，以评估妊娠各阶段的胚胎死亡。应收集任何流产胎儿，如果可能应进行DNA分型(DNA typing)和常规的病理检查以证实克隆状况。

本发明的实施方案也要求在这种方法的各步骤期间产生重组动物细胞、活化的重组动物细胞、胎儿和动物，以及从他们中收获的细胞、细胞核及其他细胞组分。特别优选的是产生的足月动物(term animal)是能存活的动物。

也可以用本发明来产生例如在细胞、组织和器官移植中使用的胚胎、胎儿或子代。从动物中取胎儿或成年细胞，并在克隆方法中使用这种细胞，当多种细胞、组织和可能的器官通过器官发生(organogenesis)发育时，从克隆的胎儿中可以获得多种细胞、组织和可能的器官。也可以从克隆的子代分离细胞、组织和器官。这一过程可以为包括细胞和基因治疗的许多医学和兽医治疗提供″原料″来源。如果细胞被转移回到获取该细胞的动物中，就可以避免免疫排斥(immunological rejection)。而且，因为可以从这些克隆中分离许多细胞类型，因此也可以利用其他的方法，例如造血嵌合现象(hematopoieticchimerism)来避免同种动物之间和不同物种之间的免疫排斥。

在一个实施方案中，候选基因可以是能产生上文所述的杂种优势的植物基因。

传统上一般通过将一个良种近亲交配植物与一个或多个其他的遗传上不同且变化多样的近亲交配植物杂交时出现的随机事件来制备杂种植物。杂交由从一个近亲交配优良植株取花粉和将花粉转移到另一个良种近亲交配植物组成。两个近亲交配植物杂交获得的种子是第一代杂种，被称作F1。有商业价值的近亲交配植物的F1具有较好的产量，稳定性，以及与任何一个亲代相比而言的其他重要特性的改进。

在本发明中，一旦已经鉴定候选基因，就可以分离或合成该基因，并将其亚克隆到表达载体中或直接转化到受体植物中。

有许多将DNA片段转化到细胞中的方法，但不是都适合于将DNA递送到植物细胞中。认为供本发明使用的适当方法事实上包括可以将DNA引入细胞的任何方法，例如DNA的直接递送，如PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993)，干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，1985)，电穿孔法(美国专利No.5,384,253，特别在此全部引入作为参考)、碳化硅纤维搅动(Kaeppler等，1990；美国专利No.5,302,523，特别在此全部引入作为参考；美国专利No.5,464,765，特别在此全部引入作为参考)，农杆菌介导的转化(美国专利No.5,591,616和美国专利No.5,563,055；特别在此将两者都全部引入作为参考)和DNA包被颗粒的加速作用(美国专利No.5,550,318；美国专利No.5,538,877和美国专利No.5,538,880；特别在此将每一篇都全部引入作为参考)等等。通过应用像这样的技术，可以稳定转化植物细胞，而且这些细胞能发育成转基因植物。在某些实施方案中，优选加速方法，它包括，例如：微粒轰击等等。

当希望通过电穿孔导入候选基因DNA时，会考虑到Krzyzek等的方法(美国专利No.5,384,253，特别在此全部引入作为参考)可能是特别有利的方法。在这一方法中，利用某些细胞壁降解酶，例如果胶降解酶使靶受体细胞对电穿孔转化比未处理细胞更敏感。或者，可以通过机械性创伤(mechanicalwounding)使受体细胞对转化更敏感。

为了影响电穿孔转化，可以使用脆弱的组织，例如细胞或胚胎发生的愈伤组织(callus)的浮培养物，或者可以直接转化不成熟的胚胎或其他形成组织的组织。在这一技术中，通过将所选择细胞的细胞壁暴露到果胶降解酶(果胶溶解酶)中，或者以可控方式将他们暴露到机械创伤中可以部分降解选择细胞的细胞壁。已经通过完整细胞的电穿孔转化的一些物种的实例包括玉蜀黍(美国专利No.5,384,253；D′Halluin等，1992；Rhodes等，1995)、小麦(Zhou等，1993)、番茄(Hou and Lin，1996)、大豆(Christou等，1987)和烟草(Lee等，1989)。

也可以使用原生质体来进行植物的电穿孔转化(Bates，1994；Lazzeri，1995)。例如：Dhir和Widholm在Intl.专利申请公开号No.WO9217598(特别在此引入作为参考)中描述了通过电穿孔来源于子叶的原生质体产生转基因大豆植物的方法。已经描述的原生质体转化的其他物种的实例包括大麦(Lazerri，1995)、高粱(Battraw等，1991)、玉蜀黍(Bhattacharjee等，1997)、小麦(He等，1994)、番茄(Tsukada，1989)和大豆(Dhir等，1992)。

依照本发明，递送转化候选基因DNA片段到植物细胞中的优选方法是颗粒轰击(美国专利No.5,550,318；美国专利No.5,53 8,880；美国专利No.5,610,042；和PCT申请WO94/09699；在此特别将每一篇文献都全部引入作为参考)。在该方法中，可以用核酸包被颗粒，然后用推进力将颗粒递送到细胞中。示范的颗粒包括那些由钨、铂，优选金组成的颗粒。也考虑到在有些情况下，候选基因DNA沉淀到金属微粒上并不是利用微粒轰击将DNA递送到受体细胞所必需的。然而，应认为颗粒可以包含DNA，而不是用DNA包裹。因此，有人提出包裹DNA的颗粒可以增加粒子轰击递送的DNA的水平，但包裹DNA的颗粒本身并不是必需的。

通过加速作用将DNA递送到植物细胞的方法的例证实施方案是Biolistics Particle Delivery System，该系统可用于推动包覆DNA的颗粒或细胞通过筛子，例如不锈钢或Nytex筛子，到达覆盖了培养在悬浮液中的植物细胞的过滤器表面。筛子能分散颗粒，因此不会使颗粒以大规模集合体的形式被递送到受体细胞中。认为在抛射体仪器(projectilc apparatus)和细胞之间插进筛子降低了抛射体集合体的大小，而且可以通过降低由太大的抛射体引起的受体细胞损害而促进高频率的转化。

颗粒轰击方法广泛适用，而且实质上可以用来转化任何植物物种。已经通过微粒轰击转化的物种的实例包括单子叶植物物种，例如玉蜀黍(PCT申请WO95/06128)、大麦(Ritala等，1994；Hensgens等，1993)、小麦(美国专利No.5,563,055，特别在此全部引入作为参考)、稻(Hensgens等，1993)、燕麦(Torbet等，1995；Torbet等，1998)、黑麦(Hensgens等，1993)、甘蔗(Bower等，1992)和高梁(Casa等，1993；Hagio等，1991)、以及许多双子叶植物，包括烟草(Tomes等，1990；Buising and Benbow，1994)、大豆(美国专利No.5,322,783，特别在此全部引入作为参考)、向日葵(Knittel等1994)、花生(Singsit等，1997)、棉花(McCabe and Martinell，1993)、番茄(VanEck等1 995)和一般的豆科植物(美国专利No.5,563,055，特别在此全部引入作为参考)。

将悬浮液中的细胞浓缩到过滤器或固体培养基上进行轰击。或者，可以将不成熟的胚胎或其他靶细胞排列在固体培养基上。将被轰击的细胞放置在大抛射阻止盘(macroprojectile stopping plate)下适当距离处。如果需要，可以在加速装置和被轰击的细胞之间放置一个或多个筛子。

农杆菌介导的递送是将基因引入植物细胞的广泛适用系统，因为DNA可以被引入整个植物组织中，因此分流了(bypass)从原生质体再生完整植物的需要。利用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞在本领域已经公知。例如，参见，Fraley等，(1985)，Rogers等，(1987)和美国专利No.5,563,055中描述的方法，特别在此全部引入作为参考。

农杆菌介导的转化在双子叶植物中最有效，因此是转化双子叶植物，包括Arabidopsis、烟草、番茄和马铃薯的优选方法。实际上，虽然农杆菌介导的转化已经常规用于双子叶植物多年，只是最近才变得适用于单子叶植物。农杆菌介导的转化技术的发展已经使得该方法适用于几乎所有的单子叶植物。例如：农杆菌介导的转化技术现在已经被用于稻(Hiei等，1997；Zhang等，1997：美国专利No.5,591,616，特别在此全部引入作为参考)、小麦(McCormac等，1998)、大麦(Tingay等，1997；McCormac等，1998)和玉蜀黍(Ishidia等，1996)。

现代的农杆菌转化载体能在大肠杆菌和农杆菌中复制，可方便操作(Klee等，1985)。此外，用于农杆菌介导的基因转移的载体的最近的技术进步已经改善了载体中基因和限制性酶切位点的排列，有助于构建能表达各种多肽编码基因的载体。描述的载体(Rogers等，1987)具有在侧翼连接了启动子和多聚腺苷酸化位点的用于指导插入的多肽编码基因表达的方便的多接头区域，而且适合于本发明的目的。另外，包含分支(armed)和非分支(disarmed)Ti基因的农杆菌可用于转化。在农杆菌介导的转化效率高的植株中，基于容易和明确的基因转移特性其为优选的方法。

使用以磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理方法的组合为基础的方法可以完成植物原生质体的转化(例如，参见Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Omirulleh等，1993；Fromm等，1986；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。

将这些系统应用于不同的植株取决于从原生质体再生那些具体植株的能力。已经描述从原生质体再生谷类的例证方法(Fuiimara等，1985；Toriyama等，1986；Ymada等，1986；Abdullah等，1986；Omirulleh等，1993和美国专利No.5,508,184；特别在此将每一篇文献引入作为参考)。使用谷类原生质体的直接吸收转化的实例包括稻的转化(Ghosh-Biswas等，1994)、高粱的转化(Battraw and Hall，1991)、大麦的转化(Lazerri，1995)、燕麦的转化(Zhengand Edwards，1990)和玉蜀黍的转化(Omirulleh等，1993)。

为了转化不能从原生质体成功再生的植株，可以利用其他途径将DNA引入完整细胞或者组织。例如：已经描述可以实现从不成熟的胚胎或者外植块再生谷类(Vasil，1989)。同时，在有或者没有原生质体时都可以使用碳化硅纤维介导的转化(Kaeppler，1990；Kaeppler等，1992美国专利No.5,563,055，特别在此全部引入作为参考)。通过在DNA溶液中搅动碳化硅纤维和细胞可以完成用该方法进行的转化。当细胞被刺穿时，DNA会被动进入细胞。这项技术已经成功应用于，例如：谷类单子叶植物玉蜀黍(PCT申请WO95/06128，特别在此全部引入作为参考；Thompson，1995)和稻(Nagatani，1997)。

微粒轰击的优化

为了依照本发明进行微粒轰击转化，可以优化物理和生物参数。物理因素是那些涉及操纵DNA/微粒沉淀物或那些影响大微粒或小微粒的飞行和速度的因素。生物因素包括涉及轰击之前和轰击之后的瞬间操纵细胞的所有步骤，例如为了帮助减轻与轰击有关的损伤进行的靶细胞的渗透性调节，不成熟胚胎或其他靶组织相对于粒子轨道的定向，以及转化DNA的性质，例如是线性DNA或完整的超螺旋质粒。人们相信轰击前的操作对不成熟胚胎的成功转化特别重要。

因此，已经考虑想在小规模研究中调整不同的轰击参数使条件完全优化。可能特别希望调整物理参数，例如DNA浓度、间隙距离、飞行距离、组织距离和氦压力。更进一步地考虑到氦的等级可能影响转化效率。例如：可以证明利用工业级(纯度99.99％)或超高纯的氦(纯度99.999％)进行的轰击之间存在转化效率的差异，但现在还不清楚在轰击中使用时哪一种氦更有利。通过改变影响受体细胞生理状态并可能因此影响转化和整合效率的条件，也可以优化损伤减缩系数(TRFs)。例如：为了实现最优转化可以调整受体细胞的渗透性状态、组织水合(tissue hydration)，以及次培养阶段或细胞周期。

为了更进一步地优化冲击转化，可以寻找合适的进行轰击的物理和生物参数。物理因素是那些涉及操纵DNA/微粒沉淀物或那些影响大微粒或小微粒的飞行和速度的因素。生物因素包括涉及正好在轰击前后操纵细胞的所有步骤。已经调整轰击前培养条件，例如渗透性环境、轰击参数和质粒构型以产生最大量的稳定转化体。

(i)物理参数

1.间隙距离

可以调节可变的巢(大的固定器)以改变安全隔膜(rupture disk)和微粒之间的距离，即间隙距离。距离可以从0厘米变化为2厘米。较短的间隙的预计影响是大微粒和小微粒的速度都增加，冲击波增加(导致组织飞溅和增加的组织损伤)和微粒穿透加深。较长的间隙距离将具有相反的影响，但可以增加成活力，并因此能增加回收的稳定转化体的总数。

2.飞行距离

通过放置间隔圈(spacer ring)调整微粒穿过的飞行路径，可以以预先确定的0.5厘米的增量使固定的巢(包含在可变巢内部)在0.5和2.25厘米之间变化。短的飞行路径允许飞行微粒具有更大的稳定性，但会降低微粒的总速度。增加的飞行使稳定性增加，例如：中心的GUS聚集点(foci)的数目。更大的飞行距离(达到一些点)会增加速度，但也会增加飞行不稳定性。根据观测结果，推荐通常用大约1.0厘米到1.5厘米的飞行路径长度来完成轰击。

3.组织距离

组织在电子枪室(gun chamber)内的放置对微粒穿透具有明显的影响。增加微粒的飞行路径将降低与冲击波有关的速度和损伤。速度的下降也导致微粒穿透较浅。

4.氦压力

通过操纵安全隔膜的类型和数量，可以使供气加速测量管(gasacceleration tube)内的压力在400和2000psi之间变化。已经确定稳定转化的最适压力在1000和1200psi之间。

5.微粒的包被。

为了进行微粒轰击，可将DNA附着(即″包被″)到微粒上，这样使DNA能够以适合于转化的形式被递送到受体细胞。在这方面，为了发生转化，至少一部分转化DNA必须是靶细胞可以获得的，同时在递送期间DNA必须附于微粒上。因此，通过微粒进行DNA转化的有效性包括微粒递送到靶细胞之后，转化DNA和微粒之间的连接的物理逆转(physical reversal)。不必总是如此，靶细胞的可用性可能是DNA的非结合片段或包含附着到微粒上的物理附着物的其他分子断裂的结果。可用性可以更进一步地是转化DNA和其他分子之间的连接断裂的结果，其中其他分子直接或间接附着于微粒上。更进一步地考虑到可以通过转化DNA和受体细胞的基因组DNA之间的直接重组来进行靶细胞的转化。因此，这里使用的″包被的″微粒是能够用于转化靶细胞的微粒，因为转化DNA被递送给靶细胞，但当靶细胞能接近他们时才会发生转化。

可以使用允许将转化DNA递送至靶细胞的任何技术包被微粒。在这里具体公开了已经证明能很好地用于本发明的包被微粒的方法。但是，可以利用其他可选择的方法将DNA连接到微粒上。例如：可以用抗生蛋白链菌素(streptavidin)和末端用长链硫醇可切割生物素化的核苷酸链标记的DNA包被颗粒。通过抗生蛋白链菌素-生物素相互作用将DNA附着于颗粒上，但是通过存在于细胞中的还原剂还原硫醇键将DNA在细胞中释放。

或者，可以通过功能化氧化金颗粒的表面以提供游离胺基来制备颗粒。具有强负电荷的DNA结合到功能性颗粒上。而且，以可控制的排列可以将带电粒子沉积在PDS-1000 Biolistics装置使用的聚酯薄膜飞行器圆盘(mylarflyer disk)的表面上，因此能促进递送给靶组织的颗粒的可控分布。

如上所述，更进一步地提出包被微粒的DNA的浓度可以影响包含单个转基因拷贝的转化体的回收率。例如：较低的DNA浓度并不必然改变转化的效率，但可能改为增加单拷贝插入发生的比例。在这方面，每1.8mg起始微粒可以使用大约1ng-2000ng的转化DNA。在本发明的其他实施例中，每1.8mg起始微粒可以使用大约2.5ng-1000ng，2.5ng-750ng，2.5ng-500ng，2.5ng-250ng，2.5ng-100ng，或者2.5ng-50ng的转化DNA。

也可以使用各种其他方法增加转化效率和/或增加低拷贝转化发生的相对比例。例如：本发明人考虑用碱性磷酸酶或在转化之前使DNA末端变钝的试剂末端修饰转化DNA。更进一步，转化DNA可以包括惰性载体DNA，因此在不降低使用的DNA总量的情形下，可降低有效的转化DNA的浓度。在1997年1 2月22日提交的美国专利申请系列编号No.08/995,451中更进一步地描述了这些方法，在此特别将其公开内容全部引入作为参考。

(ii)生物参数

培养条件及其他因素可以影响靶细胞的生理状态，而且对转化和整合效率可能也具有深刻的影响。首先，轰击作用可以刺激产生能导致组织衰老(senescence)的乙烯。添加抗乙烯化合物能增加转化效率。第二，提出细胞周期中的某些点可能更适合于导入DNA的整合。因此，细胞培养的同步化可以增强产生转化体的频率。例如：利用冷处理、氨基酸饥饿或其他细胞周期延滞剂(arresting agent)可以实现同步化。第三，组织水合程度也可以促进与轰击有关的损伤的量以及微粒穿透细胞壁的能力。

胚胎或其他靶组织相对于粒子轨道的定位与定向也可能很重要。例如：PDS-1000 biolistics装置在靶培养皿的表面上方不产生均一的颗粒散布。在平皿中心的粒子速度比离培养皿中心更远距离处的粒子速度高。因此，使位于培养皿上的靶组织避开被一些人称为″死亡区″的培养皿中心是有利的。而且，与靶轨道有关的靶组织的定向也可能很重要。已经想到使最可能再生植物的组织朝着粒子流定向是合乎需要的。例如：不成熟胚胎的盾片(scutellum)包含胚胎发生潜力最大的细胞，因此应该朝着粒子流定向。

也已经报道说轻微质壁分离的酵母细胞使转化效率增加(Armaleo等1990)。已经假设改变的细胞渗透状态有助于降低与微粒穿透有关的损伤。另外，生长和细胞周期阶段对转化可能很重要。

1.渗透性调节

已经建议渗透性预处理可以通过降低质壁分离细胞的膨压(turgorpressure)潜在地降低轰击相关损伤。在以前的研究中，在新鲜培养基和渗透性调整培养基中进行次培养后，瞬时表达GUS的细胞数目增加了(PCT申请WO95/06128，特别在此引入作为参考)。90分钟的预处理时间比更短的时间显示出更高数量的表达GUS的聚集区。在500mOSM/kg的培养基中孵育90分钟的细胞的瞬时GUS聚集区与对照相比显示出大约3.5倍的增加。优选地，在轰击之前，在包含12％蔗糖的培养基上预培养不成熟的胚胎4-5小时。轰击后，在12％的蔗糖上完成16-24小时的第二次培养。或者，在轰击之前，在0.2M甘露醇上预处理II型细胞3-4小时。已经考虑到用其他的渗透活性溶质预处理细胞1-6小时的时间也可能是合乎需要的。

2.质粒构型

在有些情况下，将候选基因DNA递送到那些不包含维持细菌宿主，例如大肠杆菌中的质粒载体所必需的DNA序列，例如，抗生素抗性基因，包括但不限于氨苄青霉素、卡那霉素和四环素抗性基因，以及原核生物的DNA复制起点的细胞中可能是合乎需要的。在这种情况下，可以在转化之前纯化包含转化DNA的DNA片段。一个代表性的纯化方法是在1.2％的低熔化温度琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳，然后通过在6-10倍过量的Tris-EDTA缓冲液(10mMTrfis-HCl pH 8.0，1mM EDTA，70-72℃)中融化凝胶条而从琼脂糖凝胶进行回收；冷冻并融化(37℃)；通过离心将琼脂糖压成丸。然后可以用Qiagen Q-100柱纯化DNA。为了有效回收DNA，柱的流速可以调节为40ml/hr。

利用多种电洗脱方法，琼脂糖的酶消化或将DNA结合到玻璃珠(例如Gene Clean)上，可以从琼脂糖凝胶中回收分离的DNA片段。另外，可以用HPLC和/或磁颗粒来分离DNA片段。作为DNA片段分离的替代方法，可以用限制性内切酶消化质粒载体，然后不进行表达盒片段的预先纯化而将该DNA递送给玉蜀黍细胞。

组织培养需要培养基和可控的环境。″培养基″指用来在体外，即在完整活体生物外生长细胞的许多营养素混合物。培养基通常是大多数细胞类型生长所需要的各类成分(盐、氨基酸、生长调节剂、糖、缓冲液)的悬浮液。但是，每个具体的细胞类型为了生长需要特定范围内的成分比例，为了最佳生长需要更特定范围内的配方。用允许细胞类型生长的培养基阵列启动的培养中，细胞生长的速度也会改变。

可以以液体形式制备营养培养基，但是将液体添加到能够提供固相支持的原料里可以使其凝固。为了这一目的，大多数情形下一般使用琼脂。Bactoagar、Hazelton琼脂、Gelritc和Gelgro是适合于组织培养中的植物细胞生长的特定种类的固体载体。

一些细胞类型在液体悬浮液或者固体培养基上生长和分裂。就象这里公开的一样，玉蜀黍细胞在液体悬浮液或者固体培养基上生长，但是从悬浮液培养物再生植物需要在发育的某些点从液体培养基转移到固体培养基上。细胞在培养物中分化的类型和程度不仅受使用的培养基的种类，环境，例如pH的影响，而且也受培养基是固体还是液体的影响。

目的受体细胞包括，但不限于分生组织(meristem)细胞，包括苗端(shootapex)(美国专利No.5,736,369)、I类、II类和III类愈伤组织、不成熟的胚胎和配子细胞(gametic cell)，例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。已经考虑到用来自可以再生可增殖植物的任何细胞作为受体细胞可能是有用的。可以从包括但不限于不成熟胚胎，苗顶端分生组织，小孢子等的组织来源来启动I类、II类和III类愈伤组织。能够如愈伤组织一样增殖的细胞也是用于遗传转化的受体细胞。本发明提供了转化不成熟胚胎和随后再生可增殖转基因植物的方法。不成熟胚胎的转化排除了受体细胞培养物长期发育的需要。花粉及其前体细胞、小孢子能作为遗传转化的受体细胞或者受精期间携带外来DNA进行整合的载体。直接的花粉转化排除了细胞培养的必要。分生组织细胞(即，能够进行持续不断的细胞分裂，并以未分化的细胞学形态为特征的植物细胞，通常在植物的生长点或者组织，例如根尖、茎尖、侧生的芽等等中被发现)可以代表另一种植物受体细胞。因为分生细胞具有未分化生长，器官分化能力和全能性(totipotency)，因此可以将单个转化的分生细胞作为整体转化的植物来回收。实际上，有人指出胚胎发生悬浮培养物可能是受培养基环境控制的体外分生细胞系统，它保留了以未分化状态继续进行细胞分裂的能力。

可以作为转化目的DNA片段的受体细胞的培养的植物细胞可以是任何植物细胞，包括玉米细胞，更具体地，来自Zea mays L的细胞。体细胞具有多种类型。胚胎发生细胞是通过胚胎形成可以诱导再生植物的体细胞实例。非胚胎发生细胞是那些通常不会以这种方式应答的细胞。非胚胎发生细胞的实例是某些黑色墨西哥甜(Black Mexican Sweet)(BMS)玉米细胞。

在美国专利No.5,134,074和美国专利No.5,489,520中已经描述在本发明的上下文中有用的，例如作为转化受体细胞的胚胎发生愈伤组织和悬浮培养物的发育，在此将上述每一篇文献全部引入作为参考。

可以利用某些方法在细胞群体中富集受体细胞。例如：跟随有人工选择和脆弱的胚胎发生组织培养的II类愈伤组织发育通常会使供微粒转化用的受体细胞富集。悬浮培养，尤其是使用这里公开的培养基进行的培养可以改进任何给定群体中受体细胞与非受体细胞的比率。可以用来选择受体细胞的人工选择方法可包括，例如，评价细胞形态和分化，或者可以使用各种物理或者生物学选择方法。深低温保藏也是选择受体细胞的可能方法。

受体细胞的人工选择，例如，从II类愈伤组织的表面选择胚胎发生细胞是可用于在培养之前(不论在固体培养基上还是悬浮液中)尝试富集受体细胞的方法。优选的细胞可以是那些位于细胞群(cell cluster)表面的细胞，而且通过缺少分化，大小和稠密的细胞质可以更进一步地识别这些细胞。优选的细胞通常是那些较少分化，或者根本不分化的细胞。因此，可能希望鉴定和选择那些细胞质稠密，相对未空泡化(unvacuolated)，有高的核质比例(nucleusto cytoplasm ratio)(例如，通过细胞学观察确定)，尺寸小(例如10-20m)，能够持续分裂和形成躯体原胚的细胞。

有人提出也可以使用鉴定这种细胞的其他方法。例如：通过使用被具有相对不可渗透的膜的细胞，例如胚胎发生细胞排斥，并被相对分化的细胞，例如根样细胞和蛇形细胞(因为外观像蛇而得名)吸收的染料，例如Evan′s蓝。

鉴定受体细胞的其他可能的方法包括利用胚胎发生细胞的同工酶标记，例如，通过细胞化学染色可以检测的谷氨酸脱氢酶(Fransz等，1989)。但是，应注意利用包括谷氨酸脱氢酶的同工酶标记可以由于非胚胎发生细胞，例如仍具有比较高的代谢活性的似根细胞而导致一定程度的假阳性。

在一个实施例中，候选基因不产生杂种优势，而是克服，治疗疾病或者至少减轻疾病的症状。本领域熟练技术人员应理解可以用上面概括的试验性操作规程来产生这一结果。

通常，这里使用的术语″进行治疗″，″治疗″等等意味着影响个体或受试者，他们的组织或细胞以获得想要的药理学和/或生理效果。效果可能是完全或部分地防止疾病或它们的症状和体征的预防性效果，和/或可能是完全地部分地治愈疾病的治疗性效果。这里使用的″治疗″覆盖了植物或动物中的疾病的任何治疗或预防，并包括：(a)防止在易患某些疾病，但诊断还没发现患有这些疾病的植物或动物中发生这些疾病；(b)抑制疾病，即延滞疾病的发展；或(c)减轻或改善疾病的症状，即引起疾病的症状衰退。

一旦已经诊断植物或动物被一种疾病所烦扰，并且已经鉴定候选基因或基因的组合，就可以利用如上所述的关于杂种优势的方法或标准的医学或者农业技术将这些基因或基因产物施用给植物或动物。

术语″施用″，″施用给″，″已施用的″在这里可交换使用。例如，可以以包含常规无毒的药学上可接受的载体，佐剂(adjuvant)和赋形剂(vehicle)的单位剂量制剂形式口服施用，局部施用或肠胃外施用候选基因产物，其中口服施用包括舌下施用。这里使用的术语肠胃外施用包括皮下注射，气雾剂(aerosol)，静脉内，肌肉内，鞘内、颅内施用、注射或输注(infusion)方法，经直肠或阴道施用。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则单词″comprise″或者其变异体，如″comprises″或者″comprising″将被理解为暗指包含一种状态整体或者整体群，而不是排除任何其他的整体或者整体群。

在杂合子代中形成杂种mRNA分子的新生物化学路径的鉴定

已经描述DNMT2基因的两个等位基因形式(Franchina等，Hum.Hered.52，210(2001))。DNMT2编码与DNA甲基化过程有关的酶。等位基因DNMT2I在外显子2的104位包括核苷酸G，而且在外显子4的50位包括核苷酸C。另一种等位基因DNMT2II在这些位点分别包括核苷酸A和T。因此，DNMT2的两个等位基因形式之间在外显子2和4内的DNA序列差异允许最后待确定的mRNA分子中的外显子2和4的等位基因起源。已经利用这些发现来测试是否可以通过将来自每个等位基因的外显子整合到相同的成熟mRNA分子中而在杂合子代中形成杂种形式的mRNA，从而产生只有杂合子代才有的新多肽或蛋白质分子。

为了确定在剪接初级转录物之后，是否能够将来自每个DNMT2等位基因的外显子或其部分整合到相同的成熟RNA分子中和怎样高效地进行，从两个受试者III1和III2的外周血白细胞(PBL)中分离mRNA，其中已经通过分离研究确认这两个受试者是两个DNMT2等位基因形式的杂合体(参见Franchina et al，.Hum.Hered.52，210(2001))。

利用引物对mRNA进行RT-PCR，RT-PCR扩增包括来自DNMT2外显子2和4的大约480bp的cDNA区域。克隆来自受试者III1和III2的长度大约为480bp的RT-PCR产物，对来自每个RT-PCR产物的一系列克隆进行测序。

如表1所示，来自受试者III1的已测序的15个克隆中的13个的插入物反映出DNMT2的双等位基因表达(bi-allclic expression)，而且正如所料，成熟mRNA分子中外显子2和4是顺式装配的。但是其中一个克隆包括包含来自DNMT2 I等位基因的外显子2和来自DNMT2 II等位基因的外显子4的剪接产物。另外的克隆包含来自DNMT2 II等位基因的外显子2，以及来自DNMT2I等位基因的外显子4。为了评价这些发现的重现性，并排除在受试者III 1中发现的两个显性杂种mRNA分子是有丝分裂重组事件的某种形式的结果的可能性，对来自受试者III 2的PBL的mRNA种类进行了类似研究。

如表1所示，14个克隆中的11个包含反映DNMT2双等位基因表达和顺式装配的插入物。但是，另外3个克隆的结构表明杂种mRNA分子已经组装。他们中的两个包含来自DNMT2 II等位基因的外显子2和来自DNMT2 I等位基因的外显子4。而另外的克隆的序列揭示剪接的mRNA分子已经对来自DNMT2 I等位基因的外显子2和来自DNMT2 II等位基因的外显子4进行了组装。

然后更进一步地从两个已经证实分别是DNMT2的两个等位基因形式的纯合子受试者II 3和II 4(Franchina等，Hum.Hered.52，210(2001))的PBL分离mRNA。用和处理来自受试者III 1和III 2的mRNA相同的方法处理体外制备的来自受试者II3和II4的等量mRNA混合物，用来排除在受试者III1和III 2中发现的杂种mRNA DNMT2分子是由于截短的反向转录物形成导致RT-PCR的PCR阶段模板开关(template switching)而在体外产生的可能性。如表1所示，参考来自13个克隆的插入物的序列没有发现杂种mRNA分子。总之，这些发现已经确定所有的剪接DN MT2 RNA分子中几乎20％包含杂种形式。

表1

依据存在于外显子2和4内的多态位点的核苷酸得到的外周血白细胞中剪接的DNMT2 mRNA分子的分布。

DNMT2转录物		受试者
		受试者			III 1	III 2	混合^*
		外显子2的nt104	外显子4的nt50	132	III 1	III 2	混合^*	113	130
G或AG或A	C))T)T))C)	外显子2的nt104	外显子4的nt50

注意：通过系谱分析(pedigree analysis)已经在受试者III1、III2中确定了基因型DNMT2 I/II，而且分别在受试者II3和II4中确定了基因型DNMT2 I/I和DNMT2 II/II。

^*从受试者III1、III2的纯合子DNMT2 I和DNMT2 II亲代(II3和II4)的mRNA混合物也进行了RT-PCR，并将产物也进行了克隆和测序。没有获得说明是G-T或A-C剪接的DNMT2 mRNA分子的插入物。这些结果证实我们的发现能反映参与剪接mRNA分子的反式外显子双等位基因装配的体内初级转录剪接系统的存在。

利用结构标准鉴定促进HV或HD^的基因的验证

将只参考下列的非限制性例子更进一步地描述本发明。但是应理解，下面的例子只是作例证，无论如何不应将其作为对上述发明通用性的限制。具体地，本发明在上面已经详细描写涉及利用DNMT2等位基因来鉴定候选基因，显而易见地应理解这里的发现并不局限于这些基因或等位基因。

当子代与任何一个亲代中同样的生物学表型的表达相比，表现出任何具体生物学表型的增强形式时，就会发生HV。当子代与其亲代相比表现出任何具体生物学表型或疾病的减少形式时，就会发生HD^。

可以通过杂化蛋白，例如酶的活性的降低直接引起HD的生物学表型。另一方面，某些杂化蛋白可能被识别为免疫外来蛋白，并通过诱导自身免疫过程导致某些HD形式的发生。这里公开的本发明解释了怎样在杂种子代中通过新蛋白质的形成产生增强的或降低的生物学表型。杂种子代必须遗传相关基因的等位基因形式，依照上文已经定义的结构标准，这些等位基因形式必须不同。

实施例1 骨质疏松症(OSTEOPOROSIS)作为人HV的模型

骨质疏松症是几乎40％的绝经后妇女罹患的骨病。它由破骨细胞的骨吸收增加引起，所述破骨细胞导致骨密度降低和骨折易感性增加。用降钙素(calcitonin)来治疗骨质疏松症，因为它能结合破骨细胞上的降钙素受体，降低破骨细胞使骨衰退的能力。

Taboulet等，Hum.Mol.Genct.7，2129(1998)已经显示，如表2所示的野生型降钙素受体等位基因杂合子受试者，与相同野生型等位基因的纯合子受试者相比，具有更高的骨密度和降低的骨折风险。

表2显示外显子位置的核苷酸改变导致在降钙素受体的不同等位基因形式中编码不同的氨基酸。从NCBI数据库能找回这些编码序列变化。如表2所示，外显子1在氨基酸位点126可以编码亮氨酸或精氨酸，而通过外显子9中的核苷酸差异可以在氨基酸位点447处编码脯氨酸或亮氨酸。编码降钙素受体的位点126和447的可替换氨基酸的核苷酸序列差异的分布满足结构标准，该结构标准是使降钙素受体的新形式或杂种形式能够在具有降钙素受体基因的不同等位基因形式的杂合子受试者中形成所需要的标准。

依照这里描述的发明，在降钙素受体的位点126和447的许可的氨基酸组合包括(a)亮氨酸/脯氨酸、(b)亮氨酸/亮氨酸、(c)精氨酸/脯氨酸和(d)精氨酸/亮氨酸，其中两个包含野生型等位基因，而另两个包含影响骨密度和对骨折易感性的降钙素受体的杂种形式。

表2

在可选择的降钙素受体等位基因中编码氨基酸差异的核苷酸变化的外显子位置

氨基酸位置	外显子	氨基酸变化
氨基酸位置	外显子	氨基酸变化	126126447447	1199	(L)亮氨酸(R)精氨酸(P)脯氨酸(L)亮氨酸

实施例2 精氨琥珀酸尿作为新生物化学途径的哺乳动物模型

在人类已经鉴定了编码精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)的基因的至少5种不同的等位基因形式。例如，他们中的一些，ASL(D87G)、ASL(Q286R)和ASL(A398D)编码突变体形式的ASL。分别是每个突变体形式的ASL的纯合子的受试者产生无活性的酶，导致发生被称为精氨琥珀酸尿的疾病。

在来自任何受影响的亲代的杂合体形式中遗传了突变体等位基因形式的ASL，例如ASL(Q286R)和ASL(D87G)的子代很容易识别，凭借ASL活性的恢复可以观察到一种形式的HV(例如，参见Walker等，J.Biol.Chem.272，6777(1997)，在此引入作为参考)。编码ASL(D87G)和ASL(Q286R)的等位基因表现出在不同的ASL外显子内存在核苷酸差异的特性。在氨基酸位点87产生天冬氨酸或甘氨酸的核苷酸变化位于外显子3内，而编码谷氨酰胺或精氨酸的核苷酸变化位于外显子11内。分别在外显子3和11的位点87和286编码可替换的氨基酸的核苷酸序列差异的定位满足允许正常ASL酶在受试者中合成所需的结构标准，其中受试者是ASL基因的两个不同突变体形式的杂合体。

实施例3 胱氨酸尿作为新生物化学途径的模型

胱氨酸尿是特征在于肾对胱氨酸及其他氨基酸的吸收受损的人类疾病。已经显示一种形式的胱氨酸尿(称为非1型胱氨酸尿)由命名为SLC7A9的基因的突变引起。SLC7A9的突变体形式，例如G105R、V170M和A354T的纯合性导致胱氨酸的重吸收(reabsorption))显著减少。如Font等，Hum.Mol.Genet.10 305(2001)所示，这些SLC7A9突变体形式的每一个的杂合性导致胱氨酸重吸收显著恢复。与模型一致，SLC7A9内导致产生突变体等位基因G105R、V170M和A354T的核苷酸变化分别存在于外显子4，5和10中。编码SLC7A9三个突变体形式中的每一个的核苷酸变化的定位满足在受试者体内合成正常有活性的SLC7A9所需要的结构要求，其中受试者是上面显示的SLC7A9的三个突变体形式中的任何两个的杂合体。

实施例4 糖尿病作为新生物化学途径的哺乳动物HD^模型

糖尿病是一种常见的重病，其中因为胰岛素分泌受损或对胰岛素作用的抗性不能合理控制血糖水平。有许多机理形式不同的糖尿病。在1型糖尿病(青年糖尿病)中，因为对胰腺内分泌胰岛素的细胞--胰岛细胞的免疫攻击导致胰岛素释放受损。谷氨酸脱羧酶(GAD65)编码1型糖尿病中被免疫系统靶向的主要的胰岛细胞自体抗原。

表3详述了在谷氨酸脱羧酶的可选择的等位基因形式中编码不同氨基酸的核苷酸变化的外显子位置。从NCBI数据库能找回编码区域序列的变化。如表3所示，外显子1包括在氨基酸位点12编码精氨酸或甘氨酸的核苷酸差异。另一方面，外显子4包括在氨基酸位点124编码天冬酰胺或赖氨酸的核苷酸变化，以及在位点153编码谷氨酰胺或脯氨酸的核苷酸变化。表3也显示位点232的可替换氨基酸谷氨酸或甘氨酸由外显子6内的核苷酸差异编码，位点286的精氨酸或赖氨酸由外显子8内的核苷酸变化编码，以及位点326的丙氨酸或甘氨酸由外显子10内的核苷酸变化编码。

编码可替换氨基酸且包括在外显子1、4、6、8或10中的核苷酸序列差异的分布，满足在受试者中产生谷氨酸脱羧酶的杂种形式需要实现的结构标准，其中受试者是表3中的酶的不同等位基因形式中的任何两个的杂合体。例如：参考由仅仅位于外显子6和8的核苷酸差异编码的可替换氨基酸在氨基酸位点232和286形成的组合(a)谷氨酸/精氨酸，(b)谷氨酸/赖氨酸，(c)甘氨酸/精氨酸和(d)甘氨酸/赖氨酸与新生物化学路径一致。这些组合中的两个包括野生型酶，而另两个包括杂种形式的酶。

表3

在可替换的谷氨酸脱羧酶(GAD65)等位基因中编码氨基酸差异的核苷酸变化的外显子位置

氨基酸位置	外显子	氨基酸变化
氨基酸位置	外显子	氨基酸变化	1212124124153153232232286286326326	11444466881010	(R)精氨酸(G)甘氨酸(N)天冬酰胺(K)赖氨酸(Q)谷氨酰胺(P)脯氨酸(E)谷氨酸(G)甘氨酸(R)精氨酸(K)赖氨酸(A)丙氨酸(G)甘氨酸

GAD65杂合性在自身抗体诱导中的作用

在I型糖尿病发病前，在病人以及他们的无症状亲属(asymptomatic sib)的血清中检测到水平较低的GAD65自身抗体。

与发明人的发现和假设一致，满足结构标准的GAD65等位基因的杂合性允许产生增强针对GAD65的免疫反应的GAD65杂种形式，自身抗体水平将随GAD65基因型而变化，即使在非I型糖尿病受试者中也如此。Boutin等，PLoS Biol.1 68(2003)最近的综合研究结果证实，在GAD65等位基因的杂合体的正常非糖尿病受试者和肥胖病人中，GAD65自身抗体水平与相同GAD65等位基因的纯合体的受试者和病人的同一组相比显著增高。这些发现强烈支持发明人声称在满足发明人结构标准的等位基因的各种形式的杂合体受试者中，通过新生物化学途径形成的新多肽或蛋白质比相同的GAD65等位基因的纯合体受试者更容易合成自身抗体。

另一方面，在一生中更迟的时间发生的糖尿病类型中的一些与肥胖有关，而不是由自身免疫过程引起的。糖尿病的这些形式被称为2型糖尿病。位于染色体2上的最连贯识别的2型糖尿病候选基因是钙激活中性蛋白酶10(CALP-10)。即使CALP-10与2型糖尿病发展的最高风险有关，但没有发现可以解释基因和2型糖尿病发展之间的关系的CALP-10突变体形式。已经鉴定的许多不同的CALP-10等位基因形式，例如满足在杂合体子代中通过新生物化学途径形成杂化酶所需要的结构标准的L34V、T504A、R555C和V661I的发现强烈支持CALP-10与2型糖尿病发展的易感性关联的HD模型。与模型一致，已经显示2型糖尿病发展的易感性增加与CALP-10的不同的等位基因形式的杂合性有关(参见Cox等，Diabetcs 53，19(2004))。

胰岛素降解酶(IDE)是通过基因组扫描发现的位于染色体10上的另一个强有力的2型糖尿病易感性候选基因。IDE与很可能是胰岛素反应终止的一部分的蛋白水解引起的胰岛素降解有关。就象CALP-10一样，没有发现引起疾病的IDE突变形式。

在表4中显示了胰岛素降解酶内编码不同氨基酸的核苷酸变化的外显子位置。从NCBI数据库可以找回编码序列的变化。如表所示，外显子3包含在位点298编码可替换的氨基酸苯丙氨酸或亮氨酸的核苷酸序列差异。而且，通过位于外显子5内的核苷酸变化可以编码氨基酸位点582的亮氨酸或苯丙氨酸，而通过外显子11内的核苷酸差异可以编码氨基酸位点854的丝氨酸或甘氨酸。通过包括在外显子20内的序列变化可以编码氨基酸位点947的天冬酰胺或天冬氨酸。

在位点298、582、845和947编码可替换的氨基酸且分别位于外显子3、5、11和20的核苷酸序列差异的分布满足在受试者中合成胰岛素降解酶的杂种形式所需要的结构标准，其中受试者是表4显示的可选择等位基因中的任何两个的杂合体。例如，仅仅参考外显子11和20编码的等位基因，在位点845和947的氨基酸组合包括(a)丝氨酸/天冬酰胺，(b)丝氨酸/天冬氨酸，(c)甘氨酸/天冬酰胺和(d)甘氨酸/天冬氨酸。这些组合中的两个反映野生型酶，而另两个包括杂种形式的酶。

表4

在可选择的胰岛素降解酶等位基因中编码氨基酸差异的核苷酸变化的外显子位置

氨基酸位置

外显子

氨基酸变化

298298582582845845947947

335511112020

(F)苯丙氨酸(L)亮氨酸(L)亮氨酸(F)苯丙氨酸(S)丝氨酸(G)甘氨酸(N)天冬酰胺(D)天冬氨酸

实施例5 支持HV中新生物化学途径作用的植物模型

过氧化氢酶1(Cat-1)是在植物的过氧化氢分解中起重要作用的一种氧化还原酶。在玉蜀黍中，已经鉴定Cat-1的至少6种不同的等位基因形式，其中的大部分在氨基酸组成方面不同。

在1972年，在Cat-1的两个不同等位基因形式的杂合体植物中鉴定出了Cat-1的杂种形式(Scandalios等，Arch.Biochem.Biophys.153，695(1972))。显示杂种Cat-1酶与纯合子亲本形式中的任何一个相比具有一定范围的增强的生物化学特性。

位于Cat-1基因内的不同外显子中的核苷酸差异指导限定Cat-1可替换的等位基因形式的氨基酸变化。新的生物化学途径为与野生型相比具有增强的生物化学特性的杂种Cat-1分子的形成提供了貌似合理的解释，其中野生型不依靠形成多聚体形式的酶。

实施例6 鉴定杂种ASL分子

如下所述，证明通过新鉴定的生物化学途径将来自不同突变体等位基因中的每一个的野生型编码外显子包含在相同的mRNA分子中，在受影响亲代的子代中产生活性精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)是可能的。

以前的研究已经表明，当以杂合体形式遗传非活性ΛSL突变体的组合，例如ASL(D87G)和ΛSL(Q286R)时，可以部分恢复活性。因此，可以从证明已经遗传ASL两个非活性等位基因突变体形式中每一个的受试者的成纤维细胞或肝中分离mRNA。然后利用跨越单个外显子的寡核苷酸引物对总mRNA进行RT-PCR。然后克隆包含这些区域的RT-PCR产物，并对其进行测序。

从基因型如ΛSL(D87G)/(Q286R)的受试者的RT-PCR产物产生的克隆的大约85％首先证实ΛSL的双等位基因表达和外显子的顺式装配。但是来自大约15％的克隆的插入物的序列包括来自相同克隆中的两个亲代等位基因中的每一个的序列，并因此产生大约15％的导致酶活性恢复的野生型酶。

实施例7 杂种GAD65分子与GAD65自身抗体产生的联系

可以从获自患有1型糖尿病的病人的胰腺组织的胰岛细胞提取总mRNA。如果病人是在不同外显子中具有编码非同义氨基酸(参见表3)的核苷酸变化的GAD65等位基因杂合体，那么在该病人的血中将具有高滴度的GAD65自身抗体。

然后依照病人的GΛD65基因型，利用跨越外显子1、4、6、8或10的寡核苷酸引物对总胰腺mRNA进行RT-PCR。

人们预期大约35％的克隆的插入物序列将证实来自两个等位基因中的每一个的外显子的双等位基因表达和顺式装配。期待更进一步的15％的克隆的序列包含证实杂种形式的GAD65是在来自患1型糖尿病病人的胰岛细胞中合成的插入物，其中病人是上文限定的GAD65的不同等位基因形式的杂合体，而且在他们的血中具有循环的GAD65自身抗体。

当已经知道研究的子代遗传而得的基因具有上文限定的等位基因时，相同的试验原理适用于所有物种，并对表达基因的组织或细胞进行了鉴定。

上面包括的方法学仅仅是例子，并不排除利用本领域技术人员所熟知的任何其他技术或试验操作规程。

Claims

1.一种鉴定能够在动物或植物中产生杂种优势的候选基因的方法，其包括如下步骤：

2.权利要求1所述的方法，其中氨基酸序列变化是保守修饰变化。

3.权利要求1所述的方法，其中氨基酸序列变化是非保守修饰变化。

4.权利要求1所述的方法，其中鉴定核苷酸序列差异的步骤包括对分离自所述植物或动物的核苷酸序列进行测序的步骤。

5.权利要求1所述的方法，其中植物选自由大麦、黑麦、高梁、玉蜀黍、大豆、小麦、玉米、马铃薯、棉花、稻、含油种子油菜(包括芸苔)、向日葵、苜蓿、甘蔗、香蕉、黑莓、越桔、草莓、和树莓、棱瓜、胡萝卜、菜花、咖啡豆、黄瓜、茄子、葡萄、蜜露、莴苣、芒果、瓜、洋葱、木瓜、豌豆、胡椒、菠萝、菠菜、南瓜、甜玉米、烟草、番茄、西瓜、蔷薇科果实(如苹果、桃、梨、樱桃和李子)和蔬菜芸苔(如花茎甘蓝、卷心菜、菜花、比京芽菜和大头菜)组成的群组；其他表型可以改变的农作物，果实和蔬菜，包括大麦、葡萄干、鳄梨、柑桔类水果，例如橙、柠檬、葡萄柚和红桔、朝鲜蓟、樱桃、坚果类如胡桃和花生、菊苣、韭、根、例如竹芋、甜菜、木薯、芜菁、萝卜、薯蓣、甘薯和豆类。

6.权利要求1所述的方法，其中动物是哺乳动物或鱼。

7.权利要求6所述的方法，其中哺乳动物选自灵长目、啮齿目、兔形目、鲸目、食肉目、奇蹄目和偶蹄目哺乳动物。

8.权利要求7所述的方法，其中偶蹄目选自猪科、Tayassuidae、河马科、骆驼科(Camelidae)、鼷鹿科(Tragulidae)、长颈鹿科、鹿科、叉角羚科和牛科这九个科中的一个。

9.权利要求8所述的方法，其中选自牛科的动物是有蹄动物。

10.权利要求9所述的方法，其中有蹄动物选自由奶牛或公牛、野牛、水牛、绵羊、大角绵羊、马、矮种马、驴子、骡、鹿、麋鹿、驯鹿、山羊、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼和猪组成的群组。

11.权利要求6所述的方法，其中动物是鱼。

12.权利要求11所述的方法，其中鱼选自由斑马鱼，欧洲鲤鱼、鲑鱼、食蚊鱼(mosquito fish)、丁鱥(tench)、七鳃鳗、圆虾虎鱼、罗非鱼和鳟鱼组成的群组。

13.权利要求8所述的方法，其中动物是人。

14.一种鉴定能够在动物或植物中产生杂种无活力(HD)的候选基因的方法，其包括如下步骤：

15.权利要求14所述的方法，其中氨基酸序列变化是保守修饰变化。

16.权利要求14所述的方法，其中氨基酸序列变化是非保守修饰变化。

17.权利要求14所述的方法，其中鉴定核苷酸序列差异的步骤包括对分离自所述植物或动物的核苷酸序列进行测序的步骤。

18.权利要求14所述的方法，其中植物是杂草或其他有害植物。

19.权利要求14所述的方法，其中动物是有害动物。

20.权利要求19所述的方法，其中有害动物是啮齿类动物、兔子或鱼。

21.一种在动物或植物中产生杂种优势或杂种无活力的方法，其包括如下步骤：

(ii)鉴定来自促进杂种优势或杂种无活力的所述动物或植物的等位基因中的编码氨基酸序列变化的核苷酸序列差异；和

(v)将所述构建体转化到受体植物或动物细胞中；

(vi)从所述细胞再生表达所述构建体的植物或动物。

22.一种检测植物或动物中存在或缺少杂种mRNA的方法，该方法包括从植物或动物中分离mRNA和将所述mRNA的核苷酸序列与植物或动物的等位基因的对应编码序列比较的步骤。

23.一种包含合成基因的构建体，该合成基因含有来自基因的不同等位基因的外显子，其中所述等位基因编码不同等位基因之间发生的氨基酸序列变化。

24.利用体外或体内产生的杂种mRNA分子在植物或动物中克服杂种无活力和/或在植物或动物中诱导杂种优势的用途，其包括将所述杂种mRNA引入所述动物或植物的步骤。

25.权利要求24所述的用途，其中将所述杂种mRNA引入所述动物或植物的步骤是转化。

26.权利要求25所述的用途，其中转化到植物中的步骤选自由同源重组，微粒轰击，PEG介导的转化，电穿孔，碳化硅纤维介导的转化或农杆菌属介导的转化组成的组。

27.一种在转移体细胞或细胞核之前通过将合成基因插入非人体细胞或细胞核来制备遗传修饰的或转基因的非人动物的方法，其中所述的合成基因包含来自基因的不同等位基因的外显子，所述等位基因编码氨基酸序列变化，其中所述变化不发生在相同的等位基因中。

28.由权利要求27的方法获得的遗传修饰动物或转基因动物。

29.权利要求27所述的方法，其中动物细胞分离自哺乳动物和鱼。