EA031178B1

EA031178B1 - Гены резистентности

Info

Publication number: EA031178B1
Application number: EA201170372A
Authority: EA
Inventors: Эванс Лагуда; Вольфганг Шпильмейер; Беат Келлер; Симон Краттингер
Original assignee: Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн; Грейнз Рисерч Энд Дивелопмент Корпорейшн; Юниверсити Оф Цюрих
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2009-08-25
Publication date: 2018-11-30
Also published as: US20140101791A1; EA201170372A1; EP2328404B1; UA106729C2; CN102202496B; US20110223303A1; EP2328404A1; CA2740487A1; EP2328404A4; US9115370B2; CA2740487C; AU2009287411B2; ES2486665T3; WO2010022443A1; US8581038B2; CN102202496A; AU2009287411A1

Abstract

Изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим белки резистентности взрослых растений по отношению к патогенам. Также обеспечиваются трансгенные растения, экспрессирующие эти полинуклеотиды для усиления резистентности растений к патогенам.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим белки резистентности взрослых растений по отношению к патогенам. Также обеспечиваются трансгенные растения, экспрессирующие эти полинуклеотиды для повышения резистентности растений к патогенам.

Предпосылки создания изобретения

Многочисленные гены, придающие резистентность к патогенам, были идентифицированы и использованы при селекции растений. Однако обусловленная единственным геном резистентность к патогену у растений часто становится неэффективной вследствие появления новых вирулентных рас возбудителя болезни. В отличие от этого полагают, что стойкая резистентность к болезни у растений, как правило, контролируется множеством генов.

Локус полигенного признака у пшеницы (Triticum aestivum), Lr34, обеспечивает стойкую резистентность взрослых растений к биотрофным грибам, вызывающим болезни: листовую ржавчину, желтую ржавчину злаков, стеблевую ржавчину пшеницы и настоящую мучнистую росу (Dyck, 1977 и 1987; German and Kolmer, 1992; Bossolini et al., 2006; Spielmeyer et al., 2008). И это несмотря на ограничение, заключающееся в том, что он не эффективен на стадии всходов в нормальных полевых условиях. Сорта с локусом резистентности Lr34, такие как Frontana, имели эффективную стойкую резистентность к вызывающему листовую ржавчину грибу Puccinia triticina Eriks (Dyck et al., 1966; Singh and Rajaram, 1994). До настоящего времени не были выявлены изоляты Р. triticina с полной степенью способности заражать имеющие Lr34 растения (Kolmer et al., 2003).

Резистентность на основе Lr34 оставалась генетически неотделимой от Yr18, который придает резистентность к желтой ржавчине злаков (P. striiformis) (Singh, 1992a; McIntosh, 1992). Была подтверждена косегрегация Lr34/Yr18 с другими признаками, такими как некроз верхушки листа (Ltn1), настоящая мучнистая роса (недавно названная Pm38), устойчивость к вызывающему желтую карликовость ячменя вирусу (Bdv1) и гельминтоспориозу корней злаковых (Bipolaris sorokiniana) (Singh, 1992 a,b; McIntosh, 1992; Joshi et al., 2004; Spielmeyer et al., 2005; Liang et al., 2006). Эти признаки резистентности к множеству патогенов сделали локус Lr34/Yr18 одним из самых полезных участков генов для селекции резистентности к болезням у пшеницы.

Были выделены и клонированы немногочисленные гены резистентности к ржавчинным грибам из пшеницы (Feuillet et al., 2003; Huang et al., 2003; Cloutier et al., 2007) и других хлебных злаков (Collins et al., 1999; Brueggeman et al., 2002) и, главным образом, класса основных генов резистентности (R) нуклеотидсвязывающих богатых лейцином повторов (NB-LRR). Единственным известным исключением является ген резистентности к ржавчинным грибам Rpg1 у ячменя, который кодирует протеинкиназу. Эти гены кодируют обусловленную взаимоотношением ген-на-ген резистентность к единственным патогенам и обычно влекут за собой реакции гиперчувствительности после инфицирования в тканях растений. Напротив, Lr34 придает резистентность широкого спектра к облигатным биотрофным патогенам, включающим грибы из Ascomycetes и Basidiomycetes. Rubiales и Niks (1995) представили данные о том, что имеется связь Lr34 с уменьшением роста межклеточных гифов, но не с реакцией гиперчувствительности или образованием сосочков.

Следовательно, остается неизвестной молекулярная основа типа полигенной, не специфичной для расы резистентности к патогенам у взрослых растений или частичной резистентности, кодируемой генетическими системами, такими как, например, Lr34.

Краткое изложение сущности изобретения

Авторами настоящего изобретения идентифицированы гены и полипептиды, которые придают взрослым растениям повышенную резистентность к патогену растений.

Соответственно настоящим изобретением обеспечивается трансгенное растение, в геном которого был интегрирован экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид резистентности к патогену взрослых растений, и/или экзогенный полинуклеотид, который повышает транскрипцию эндогенного гена, кодирующего полипептид резистентности к патогену взрослых растений.

В предпочтительном варианте осуществления растение характеризуется ускоренным старением верхушек кроющих листьев по сравнению с изогенным растением, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид.

В другом предпочтительном варианте осуществления растение имеет повышенную резистентность к патогену растений по сравнению с изогенным растением, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид.

В еще другом предпочтительном варианте осуществления полипептид включает аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, его биологически активный фрагмент или аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 40%, более предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90% и еще более предпочтительно по крайней мере на 95%. Более предпочтительно полипептид включает аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.

В другом предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид включает нуклеотиды, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, последовательность, которая идентична SEQ

- 1 031178

ID NO: 2 по крайней мере на 40%, и/или последовательность, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления экзогенным полинуклеотидом, который повышает транскрипцию эндогенного гена, кодирующего полипептид резистентности к патогену взрослых растений, является генетический элемент, такой как промотор, который усиливает функционирование промотора эндогенного гена. Альтернативно, экзогенный полинуклеотид, который повышает транскрипцию эндогенного гена, кодирующего полипептид резистентности к патогену взрослых растений, кодирует транскрипционный фактор, который усиливает экспрессию эндогенного гена.

Предпочтительно растением является хлебный злак. Примеры трансгенных хлебных злаков по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, пшеницу, ячмень, кукурузу, рис, овес и тритикале. В особенно предпочтительном варианте осуществления растением является пшеница.

Примеры патогенов растений включают, но не ограничиваются ими, вирусы, бактерии и грибы.

В предпочтительном варианте осуществления патогеном является биотрофный гриб. Примеры биотрофных грибов включают, но не ограничиваются ими, Fusarium graminearum (который вызывает фузариоз колосьев), Erysiphe graminis f. sp. tritici (который вызывает настоящую мучнистую росу), Bipolaris sorokiniana (который вызывает гельминтоспориоз корней злаковых), Puccinia graminis f. sp. tritici (который вызывает стеблевую ржавчину пшеницы), Puccinia striifbrmis (который вызывает желтую ржавчину злаков) и Puccinia recondite f. sp. tritici (который вызывает листовую ржавчину).

В варианте осуществления патогеном является вирус, вызывающий желтую карликовость ячменя (BYDV).

В варианте осуществления растение включает один или более дополнительных экзогенных полинуклеотидов, кодирующих полипептид резистентности к патогену растений. Примеры таких генов включают, но не ограничиваются ими, Lr1, Lr3, Lr2a, Lr3ka, Lr11, Lr13, Lr16, Lr17, Lr18, Lr21 и LrB.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ идентификации полинуклеотида, кодирующего полипептид резистентности к патогену растений, включающий:

(i) получение функционально связанного с промотором полинуклеотида, кодирующего полипептид, включающий аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, его биологически активный фрагмент или аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 40%, (ii) введение полинуклеотида в растение, (iii) определение того, изменен ли уровень резистентности к патогену растений относительно такового у изогенного растения, у которого отсутствует полинуклеотид, и (iv) необязательно отбор полинуклеотида, который при его экспрессии усиливает резистентность к патогену растений.

Предпочтительно полинуклеотид включает нуклеотиды, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 2 по крайней мере на 40%, и/или последовательность, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 2.

Предпочтительно растением является хлебный злак.

Предпочтительно хлебным злаком является пшеница.

В предпочтительном варианте осуществления полипептидом является полипептид растения или его мутантная форма.

В другом варианте осуществления стадия (ii) дополнительно включает устойчивую интеграцию функционально связанного с промотором полинуклеотида в геном растения.

В еще одном аспекте настоящим изобретением обеспечивается, по существу, очищенный и/или рекомбинантный полипептид резистентности к патогену взрослых растений.

В предпочтительном варианте осуществления полипептид включает аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, его биологически активный фрагмент или аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 40%, более предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90% и еще более предпочтительно по крайней мере на 95%.

В предпочтительном варианте осуществления в полипептиде отсутствует остаток фенилаланина или любая аминокислота в положении, соответствующем номеру аминокислоты 546 в SEQ ID NO: 4.

В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид имеет аминокислоту, отличную от остатка тирозина в положении, соответствующем номеру аминокислоты 634 в SEQ ID NO: 4. Более предпочтительно полипептид включает остаток гистидина в положении, соответствующем номеру аминокислоты 634 в SEQ ID NO: 4.

Также обеспечивается слитый белок, дополнительно включающий последовательность по крайней мере одного отличного полипептида. По крайней мере одним отличным полипептидом может быть, например, полипептид, который повышает стабильность полипептида по настоящему изобретению, или полипептид, который содействует очистке или выявлению слитого белка.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается выделенный и/или экзогенный полинуклеотид, включающий нуклеотиды, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 2 по крайней мере на 40%, последовательность, ко

- 2 031178 дирующую полипептид по настоящему изобретению, и/или последовательность, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 2.

Предпочтительно полинуклеотид включает последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 2 в жестких условиях.

Предпочтительно полинуклеотид гибридизуется по всей длине полинуклеотида, состоящего из нуклеотидов, имеющих последовательность SEQ ID NO: 2.

Предпочтительно полинуклеотид кодирует полипептид резистентности к патогену взрослых растений.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается химерный вектор, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению.

Предпочтительно полинуклеотид функционально связан с промотором.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается рекомбинантная клетка, включающая экзогенный полинуклеотид по настоящему изобретению и/или вектор по настоящему изобретению.

Клеткой может быть любой тип клетки, такой как, но без ограничения, клетка растения, бактериальная клетка, клетка животного или дрожжевая клетка.

Предпочтительно клеткой является клетка растения. Более предпочтительно клеткой растения является клетка хлебного злака. Еще более предпочтительно клеткой хлебного злака является клетка пшеницы.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ получения полипептида по настоящему изобретению, включающий экспрессию в клетке или бесклеточной экспрессионной системе полинуклеотида по настоящему изобретению.

Предпочтительно способ дополнительно включает выделение полипептида.

В еще одном аспекте настоящим изобретением обеспечивается трансгенный не принадлежащий человеку организм, включающий экзогенный полинуклеотид по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению и/или рекомбинантную клетку по настоящему изобретению.

Предпочтительно трансгенным не принадлежащим человеку организмом является растение.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ получения клетки по настоящему изобретению, включающий стадию введения полинуклеотида по настоящему изобретению или вектора по настоящему изобретению в клетку.

Предпочтительно клеткой является клетка растения.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ получения трансгенного растения, включающий регенерацию трансгенного растения из клетки по настоящему изобретению.

Также обеспечивается применение полинуклеотида по настоящему изобретению или вектора по настоящему изобретению для получения рекомбинантной клетки.

Кроме того, обеспечивается применение полинуклеотида по настоящему изобретению или вектора по настоящему изобретению для получения трансгенного растения.

Предпочтительно трансгенное растение характеризуется ускоренным старением верхушек кроющих листьев по сравнению с изогенным растением, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид и/или вектор, и/или имеет повышенную резистентность к патогену растения по сравнению с изогенным растением, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид и/или вектор.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается трансгенное растение или его потомство, полученное с использованием способа по настоящему изобретению.

В дополнительном аспекте настоящим изобретением обеспечивается часть растения по настоящему изобретению.

Примеры таких частей включают, но не ограничиваются ими, листья, корни, стебли и/или семена. В предпочтительном варианте осуществления частью растения является семя, которое включает экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид резистентности к патогену взрослых растений.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ получения части растения, включающий:

a) выращивание растения по настоящему изобретению и

b) сбор части растения.

В еще одном аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ получения муки, непросеянной муки, крахмала или другого продукта, получаемого из семени, включающий:

a) получение семени по настоящему изобретению и

b) получение муки, непросеянной муки, крахмала или другого продукта.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается продукт, получаемый из растения по настоящему изобретению и/или части растения по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления продуктом является пищевой продукт. Примеры включают, но не ограничиваются ими, муку, крахмал, хлеб из теста на опаре или хлеб из теста, приготовленного безопарным способом, пасту, лапшу, зоокорма, блюда из зернового продукта для завтрака, закусочные пищевые продукты, торты, солод, пиво, кондитерские изделия и пищевые продукты, содержащие соусы на мучной основе.

- 3 031178

В другом варианте осуществления продуктом является непищевой продукт. Примеры включают, но не ограничиваются ими, пленки, покрытия, клеи, строительные материалы и упаковочные материалы.

В дополнительном аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ приготовления пищевого продукта по настоящему изобретению, включающий смешивание семени или муки, непросеянной муки или крахмала из указанного семени с другим ингредиентом.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ приготовления солода, включающий стадию проращивания семени по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается композиция, включающая полипептид по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению и/или рекомбинантную клетку по настоящему изобретению и один или более приемлемых носителей.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается, по существу, очищенное антитело или его фрагмент, которое специфически связывается с полипептидом по настоящему изобретению.

Также обеспечивается способ идентификации соединения, которое связывается с полипептидом, включающим аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, его биологически активный фрагмент или аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4 по крайней мере на 40%, включающий:

i) приведение полипептида в контакт с соединением-кандидатом и ii) определение того, связывается ли соединение с полипептидом.

Кроме того, обеспечивается способ идентификации соединения, которое переносится через клеточную мембрану полипептидом, включающим аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, его биологически активный фрагмент или аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4 по крайней мере на 40%, включающий:

i) приведение полипептида, присутствующего в клеточной мембране, в контакт с соединениемкандидатом, ii) определение того, переносит ли полипептид соединение через клеточную мембрану.

Предпочтительно полипептид экспрессируется в клетке.

В варианте осуществления способ дополнительно включает сравнение связывания, и/или переноса, соединения с первым полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, с таковым со вторым полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.

В дополнительном аспекте настоящим изобретением обеспечивается выделенный и/или экзогенный полинуклеотид, который в случае его присутствия в клетке растения снижает экспрессию по крайней мере одного гена, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, его биологически активный фрагмент или аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4 по крайней мере на 40%, при этом указанная экспрессия является пониженной относительно экспрессии в другой изогенной клетке растения, у которой отсутствует указанный полинуклеотид.

В варианте осуществления полинуклеотид кодирует полипептид резистентности к патогену взрослых растений.

Предпочтительно полинуклеотид по этому аспекту функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией полинуклеотида в клетке растения.

Предпочтительно полинуклеотид по этому аспекту является антисмысловым полинуклеотидом, смысловым полинуклеотидом, каталитическим полинуклеотидом, искусственной микроРНК или молекулой двуспиральной РНК.

В дополнительном аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ идентификации растения, включающего ген, кодирующий полипептид резистентности к патогену взрослых растений, включающий:

i) амплификацию и/или секвенирование на основе образца растения, по крайней мере части полинуклеотида, который кодирует полипептид, включающий аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, его биологически активный фрагмент или аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4 по крайней мере на 40%, ii) определение того, включает ли растение полинуклеотид, кодирующий полипептид резистентности к патогену взрослых растений.

Как это будет очевидно, предпочтительные признаки и характеристики одного аспекта настоящего изобретения применимы ко многим другим аспектам настоящего изобретения.

Подразумевается, что по всему описанию данного изобретения слово включать или его вариации, такие как включает или включающий, предполагает включение указанного элемента, целого числа

- 4 031178 или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, а не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.

Ниже настоящее изобретение описано посредством следующих не ограничивающих примеров и с использованием ссылки на прилагаемые фигуры.

Краткое описание прилагаемых чертежей

Фиг. 1. Консенсусная генетическая карта хромосомы 7D, включающей Lr34, основанная на трех популяциях для картирования с высокой разрешающей способностью, установила целевую зону, составляющую 0,15 сМ (сантиморганид), для Lr34 между XSWSNP3 и XcsLVE17. Относительные положения молекулярных маркеров показаны вместе с наблюдаемыми рекомбинационными расстояниями в сМ.

Фиг. 2. Схема в развернутом виде части хромосомы 7DS пшеницы между XSWSNP3 и XcsLVE17, демонстрирующая относительные положения открытых рамок считывания. Секвенированная в +Lr34 сорте Chinese Spring соответствующая физическая зона содержала десять генов-кандидатов, девять из которых представлены на этой фигуре стрелками. Числа относятся к соответствующим положениям нуклеотидов в подвергнутой секвенированию зоне размером 420 т.п.о. Сокращения: Gly - гликозилтрансфераза; Cyst - цистеинпротеиназа, Cyt - цитохром Р450; LecK - киназа рецепторов лектинов; ABC - ABCтранспортер; Hex - переносчик гексоз.

Фиг. 3. Структура гена Lr34. Незаполненные прямоугольники означают экзоны, тогда как интроны показаны как прилежащие линии. Маркировками отмечены положения сайтов мутаций в мутантах, обозначенных 2В, 2F, 2G, ЗЕ, 4С, 4D, m19 и m21. Указаны три различия в последовательности между чувствительным и резистентным аллелями Lr34: +Lr34 резистентный аллель из сорта Chinese Spring, -Lr34 чувствительный аллель из сорта Renan.

Фиг. 4. Последовательность белка Lr34 и полиморфизмы между резистентными и чувствительными сортами. Аминокислотная последовательность белка Lr34 (чувствительный аллель) из сорта Renan. Выделены две аминокислоты, измененные в резистентном аллеле. Другие прямоугольники указывают на положения высококонсервативных мотивов в нуклеотидсвязывающих доменах. Мотивы: мотив Уокера типа A GPPGCGKS (аминокислоты 168-175) (SEQ ID NO: 50) и GVSGAGKT (аминокислоты 847-854) (SEQ ID NO: 51); ABC-опознавательный мотив ISGGQKKRLTTA (аминокислоты 307-318) (SEQ ID NO: 52) и LSMEQRKRLTIA (аминокислоты 954-965) (SEQ ID NO: 53); мотив Уокера типа В AYFMD (аминокислоты 327-331) (SEQ ID NO: 54) и IILMD (аминокислоты 974-978) (SEQ ID NO: 55). Аминокислотными изменениями в резистентном аллеле Lr34 в озимом сорте пшеницы Chinese Spring является делеция аминокислоты в положении 546 (Phe (F)) и замена аминокислоты в положении 634 (тирозина (Y)) на гистидин. Подчеркнутыми частями являются два трансмембранных домена (аминокислоты 502-750 и 1152-1392).

Фиг. 5. Представление в схематическом виде белка Lr34, демонстрирующее два нуклеотидсвязывающих домена (NBD) и два трансмембранных домена. Два диагностических полиморфизма между резистентным и чувствительным аллелями в первом трансмембранном домене показаны звездочками.

Фиг. 6. Совмещение с аминокислотной последовательностью Lr34. Совмещение Lr34 сорта Renan с PDR23 риса (Os12g0512700) (SEQ ID NO: 47), PDR5 (At3g53480) (SEQ ID NO: 48) и PDR9 (At2g37280) (SEQ ID NO: 49) Arabidopsis. Отмечены остатки, идентичные во всех четырех транспортерах. PDR23 риса был недавно аннотирован в соответствии с кДНК Lr34 пшеницы.

Фиг. 7. Анализ экспрессии Lr34. Полуколичественная ОТ-ПЦР с использованием зонда из 5'-конца гена. Листья почти изогенных линий Thatcher и Thatcher Lr34 собирали на стадии всходов спустя 14 дней, а кроющие листья взрослых растений - на растениях возрастом 53 и 63 дня. Листья взрослых растений делили пополам для отдельного исследования уровней экспрессии в основании листа и верхушке листа. Обозначения: ТН - Thatcher; ТН Lr34 - Thatcher Lr34; GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

Фиг. 8. Lr34 регулирует старение кроющих листьев. Нозерн-блоттинг с использованием HvS40 на кроющих листьях растений возрастом 63 дня почти изогенных линий Thatcher и Thatcher Lr34 и индуцированных азидом мутантах Lr34: 2В, 2F, 2G, ЗЕ, 4С и 4Е. ТН - Thatcher; TH Lr34 - Thatcher Lr34.

Разъяснение к списку последовательностей

SEQ ID NO: 1 - аминокислотная последовательность белка Lr34 (резистентного аллеля) из Triticum aestivum (мягкой пшеницы) сорта Chinese spring.

SEQ ID NO: 2 - нуклеотидная кодирующая последовательность для Lr34 из Triticum aestivum сорта Chinese spring.

SEQ ID NO: 3 - нуклеотидная последовательность гена Lr34 (геномная последовательность) из Triticum aestivum сорта Chinese spring. Присутствуют 24 экзона, которые кодируют белок Lr34:

экзон 1 начинается за нуклеотидом 3042 и заканчивается на нуклеотиде 3316;

экзон 2 начинается за нуклеотидом 3416 и заканчивается на нуклеотиде 3539; экзон 3 начинается за нуклеотидом 3693 и заканчивается на нуклеотиде 3778; экзон 4 начинается за нуклеотидом 3934 и заканчивается на нуклеотиде 4018; экзон 5 начинается за нуклеотидом 6527 и заканчивается на нуклеотиде 6686; экзон 6 начинается за нуклеотидом 6784 и заканчивается на нуклеотиде 6860;

- 5 031178 экзон 7 начинается за нуклеотидом 7119 и заканчивается на нуклеотиде 7172;

экзон 8 начинается за нуклеотидом 7271 и заканчивается на нуклеотиде 7361;

экзон 9 начинается за нуклеотидом 7439 и заканчивается на нуклеотиде 7740;

экзон 10 начинается за нуклеотидом 7833 и заканчивается на нуклеотиде 8108;

экзон 11 начинается за нуклеотидом 8187 и заканчивается на нуклеотиде 8497;

экзон 12 начинается за нуклеотидом 8583 и заканчивается на нуклеотиде 8743;

экзон 13 начинается за нуклеотидом 8825 и заканчивается на нуклеотиде 8928;

экзон 14 начинается за нуклеотидом 9015 и заканчивается на нуклеотиде 9168;

экзон 15 начинается за нуклеотидом 9606 и заканчивается на нуклеотиде 9513;

экзон 16 начинается за нуклеотидом 9808 и заканчивается на нуклеотиде 9581;

экзон 17 начинается за нуклеотидом 9985 и заканчивается на нуклеотиде 10317;

экзон 18 начинается за нуклеотидом 10427 и заканчивается на нуклеотиде 10717;

экзон 19 начинается за нуклеотидом 12159 и заканчивается на нуклеотиде 12242;

экзон 20 начинается за нуклеотидом 12711 и заканчивается на нуклеотиде 12844;

экзон 21 начинается за нуклеотидом 12995 и заканчивается на нуклеотиде 13222;

экзон 22 начинается за нуклеотидом 13318 и заканчивается на нуклеотиде 13489;

экзон 23 начинается за нуклеотидом 13569 и заканчивается на нуклеотиде 13823; и экзон 24 начинается за нуклеотидом 14613 и заканчивается на нуклеотиде 14939.

SEQ ID NO: 4 - аминокислотная последовательность белка Lr34 (чувствительного аллеля) из Triticum aestivum Renan.

SEQ ID NO: 5 - нуклеотидная кодирующая последовательность для Lr34 (чувствительного аллеля) из Triticum aestivum Renan.

SEQ ID NO: 6 - геномная ДНК для эквивалента Lr34 из Aegilops tauschii. Кодирующая область начинается за нуклеотидом 2426 и заканчивается на нуклеотиде 14212.

SEQ ID NO: 7 - EST (маркерная экспрессируемая последовательность) Lr34 Triticum aestivum (№ доступа в GenBank - CJ669561).

SEQ ID NO: 8 - EST Lr34 Triticum aestivum (№ доступа в GenBank - DR733734).

SEQ ID NO: 9 - EST Lr34 Triticum aestivum (№ доступа в GenBank - CJ562397).

SEQ ID NO: 10 - EST Lr34 Triticum aestivum (№ доступа в GenBank - CV773074).

SEQ ID NO: 11 - EST Lr34 Triticum aestivum (№ доступа в GenBank - BU991506).

SEQ ID NO: 12-46 - олигонуклеотидные праймеры.

SEQ ID NO: 47 - ABC-транспортер PDR23 риса.

SEQ ID NO: 48 - ABC-транспортер PDR5 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 49 - ABC-транспортер PDR9 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 50 - последовательность N-концевого бокса Уокера типа A Lr34.

SEQ ID NO: 51 - последовательность С-концевого бокса Уокера типа A Lr34.

SEQ ID NO: 52 - последовательность N-концевого ABC-опознавательного мотива Lr34.

SEQ ID NO: 53 - последовательность С-концевого ABC-опознавательного мотива Lr34.

SEQ ID NO: 54 - последовательность N-концевого бокса Уокера типа В Lr34.

SEQ ID NO: 55 - последовательность С-концевого бокса Уокера типа В Lr34.

SEQ ID NO: 56 - консенсусная последовательность бокса Уокера типа А ABC-транспортеров.

SEQ ID NO: 57 - консенсусная последовательность бокса Уокера типа В ABC-транспортеров.

SEQ ID NO: 58 - консенсусная последовательность АВС-опознавательного мотива ABCтранспортеров.

SEQ ID NO: 59 - PDR-опознавательная последовательность 1.

SEQ ID NO: 60 - PDR-опознавательная последовательность 2.

SEQ ID NO: 61 - PDR-опознавательная последовательность 3.

SEQ ID NO: 62 - PDR-опознавательная последовательность 4.

SEQ ID NO: 63 - полипептид, кодируемый гомологом Lr34 на хромосоме 7В пшеницы.

SEQ ID NO: 64 - открытая рамка считывания, кодирующая гомолог Lr34 на хромосоме 7В пшеницы.

Подробное описание изобретения

Общие методы.

Если конкретно не определено иное, то следует считать, что все используемые в описании технические и научные термины имеют такое же значение, как и значение, в котором они понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, молекулярной биологии растений, химии белков и биохимии).

Если не указано иное, то получение рекомбинантного белка, культивирование клеток и иммунологические методы, используемые в настоящем изобретении, являются стандартными процедурами, хорошо известными специалистам в данной области. Такие методы описаны и объяснены по всей литературе в таких источниках, как

- 6 031178

J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), и F.M. Ausubel et al.

(editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все изменения в соответствии с новыми данными до настоящего времени),

Ed

Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), и J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все изменения в соответствии с новыми данными до настоящего времени). Полипептиды/пептиды.

Под выражением по существу, очищенный полипептид или очищенный полипептид в настоящем описании подразумевается полипептид, который обычно отделен от липидов, нуклеиновых кислот, других пептидов и других загрязняющих молекул, с которыми он связан в своем природном состоянии.

Предпочтительно, по существу, очищенный полипептид лишен по крайней мере на 90% других компонентов, с которыми он связан в природе.

Термин рекомбинантный в отношении полипептида относится к полипептиду, когда он продуцируется клеткой или в бесклеточной экспрессионной системе, в измененном количестве или в измененной степени по сравнению с его природным состоянием. В одном варианте осуществления клеткой является клетка, которая не продуцирует полипептид в природе. Однако клеткой может быть клетка, которая включает неэндогенный ген, который приводит к измененному количеству продуцируемого полипептида. Рекомбинантный полипептид по настоящему изобретению включает полипептиды, которые не были отделены от других компонентов трансгенной (рекомбинантной) клетки или бесклеточной экспрессионной системы, в которой он продуцируется, и продуцируемые в таких клетках или бесклеточных системах полипептиды, которые, по существу, очищены, по крайней мере, от некоторых других компонентов. В варианте осуществления рекомбинантным полипептидом является полипептид, полученный при экспрессии рекомбинантного полинуклеотида в клетке, предпочтительно в клетке растения и более предпочтительно в клетке хлебного злака.

Термины полипептид и белок обычно используются взаимозаменяемо.

Используемый в описании термин полипептид резистентности к патогену взрослых растений относится к белку, кодируемому геном, который обычно придает взрослому растению повышенную резистентность к патогену растений по сравнению с изогенным растением, в котором этот ген отсутствует, и который придает всходам того же растения значительно меньшую резистентность к тому же патогену или не придает такую резистентность, когда растение выращивают в нормальных полевых условиях. Этот термин также относится к продуцируемому в природе белку (или белку дикого типа, из которого происходит мутантный белок), кодируемому геном, придающим взрослому растению (например, сорту пшеницы Frontana), но не всходам, при выращивании в нормальных полевых условия, повышенную резистентность к патогену растений. Обычно полипептиды резистентности к патогену взрослых растений не обеспечивают реакцию гиперчувствительности у растений в присутствии патогена, и резистентность является стойкой в полевых условиях в течение продолжительного периода. Как используется в описании, взрослое растение относится к растению, которое вошло в репродуктивную фазу роста и развития. В варианте осуществления менее половины белка продуцируется на грамм сухого веса в листьях всходов по сравнению с листьями взрослого растения. Примеры патогенов растений, к которым повышается резистентность, включают, но не ограничиваются ими,

Fusarium	graminearum,	Erysiphe	graminis	f.	sp.	tritici,
Bipolaris	sorokiniana,	. Puccinia	graminis	f.	sp.	tritici,
Puccinia	striiformis и	Puccinia recondite f.	sp.	tritici .

Процент идентичности полипептида определяют посредством анализа GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (программы GCG) с использованием штрафа за включение пропуска=5 и штрафа за удлинение пропуска=0,3. Длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 150 аминокислот, и в анализе GAP совмещаются две последовательности по участку, составляющему по крайней мере 150 аминокислот. Более предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 500 аминокислот, и в анализе GAP совмещаются две последовательности по участку, составляющему по крайней мере 500 аминокислот. Более предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 1000 аминокислот, и в анализе GAP совмещаются две последовательно

- 7 031178 сти по участку, составляющему по крайней мере 1000 аминокислот. Еще более предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 1250 аминокислот, и в анализе GAP совмещаются две последовательности по участку, составляющему по крайней мере 1250 аминокислот. Еще более предпочтительно в анализе GAP совмещаются две последовательности по всей их длине.

Как используется в описании, биологически активный фрагмент представляет собой часть полипептида по настоящему изобретению, которая сохраняет определенную активность полноразмерного полипептида. Биологически активные фрагменты могут быть любого размера при условии, что они сохраняют определенную активность, но предпочтительно их размер составляет по крайней мере 1000 или по крайней мере 1200 аминокислотных остатков. Предпочтительно биологически активный фрагмент сохраняет по крайней мере 10% активности полноразмерного белка.

Выражение повышенная резистентность к патогену растений используется в описании как относительный термин, так что растение по настоящему изобретению имеет повышенный уровень резистентности к патогену растений по сравнению с генетически идентичным растением, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид. Повышенную резистентность можно определить с использованием ряда известных в данной области способов, таких как исследование растений в отношении степени патогена и/или исследование роста растений или степени повреждения, наносимого растению в присутствии патогена.

Используемый в описании термин характеризуется ускоренным старением верхушек кроющих листьев относится к старению с ранним началом края самого нижнего листа на стебле растения. В описании он используется как относительный термин, так что растение по настоящему изобретению характеризуется ускоренным старением верхушек кроющих листьев по сравнению с генетически идентичным кроющим листом, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид. Ускоренное старение верхушек кроющих листьев можно определить любым способом, известным в данной области, таким как способ, который описан в примере 5.

В отношении определенного полипептида будет понятно, что цифровые данные процента идентичности, превышающие приведенные выше цифровые данные, будут включены в предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, где применимо с учетом цифровых данных минимального процента идентичности предпочтительно, когда полипептид включает аминокислотную последовательность, которая идентична соответствующей SEQ ID NO с определенным названием по крайней мере на 60%, более предпочтительно по крайней мере на 65%, более предпочтительно по крайней мере на 70%, более предпочтительно по крайней мере на 75%, более предпочтительно по крайней мере на 76%, более предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, более предпочтительно по крайней мере на 91%, более предпочтительно по крайней мере на 92%, более предпочтительно по крайней мере на 93%, более предпочтительно по крайней мере на 94%, более предпочтительно по крайней мере на 95%, более предпочтительно по крайней мере на 96%, более предпочтительно по крайней мере на 97%, более предпочтительно по крайней мере на 98%, более предпочтительно по крайней мере на 99%, более предпочтительно по крайней мере на 99,1%, более предпочтительно по крайней мере на 99,2%, более предпочтительно по крайней мере на 99,3%, более предпочтительно по крайней мере на 99,4%, более предпочтительно по крайней мере на 99,5%, более предпочтительно по крайней мере на 99,6%, более предпочтительно по крайней мере на 99,7%, более предпочтительно по крайней мере на 99,8% и еще более предпочтительно по крайней мере на 99,9%.

Используемое в описании выражение в положении, соответствующем номеру аминокислоты или его вариации относится к положению аминокислоты относительно окружающих аминокислот. В этом отношении в некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению может иметь делеционные мутации или мутации с замещением, которые изменяют относительное положение аминокислоты при совмещении, например с SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4. Например, полипептид с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, имеет делецию одной аминокислоты по сравнению с полипептидом с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, а именно фенилаланин в положении 546 SEQ ID NO: 4 отсутствует в SEQ ID NO: 1 и не заменен другой аминокислотой. Вследствие этого квалифицированному специалисту будет понятно, что номер 634 аминокислоты в SEQ ID NO: 4 (Y) соответствует номеру 633 аминокислоты в SEQ ID NO: 4 (H).

Мутанты по аминокислотной последовательности полипептидов по настоящему изобретению можно получить путем введения подходящих изменений нуклеотидов в нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению или путем in vitro синтеза желаемого полипептида. Такие мутанты включают, например, делеции, инсерции или замены остатков внутри аминокислотной последовательности. Для достижения конечной конструкции можно выполнить комбинацию из делеции, инсерции и замены при условии, что конечный пептидный продукт обладает желаемыми характеристиками. Предпочтительные мутанты по аминокислотной последовательности имеют только одно, два, три, четыре или менее 10 изменений аминокислот относительно исходного полипептида дикого типа.

Мутантные (измененные) пептиды можно получить, используя любой метод, известный в данной области техники. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению можно подвергнуть in vitro му

- 8 031178 тагенезу. Методы такого in vitro мутагенеза включают субклонирование полинуклеотида в подходящий вектор, трансформацию вектора в штамм мутатора, такой как Е. coli XL-1 red (Stratagene), и размножение трансформированных бактерий, повторяемое в течение подходящего ряда поколений. В другом примере полинуклеотиды по настоящему изобретению подвергают методам перетасовки ДНК, широко описанным Harayama (1998). Продукты, полученные из мутированной/измененной ДНК, можно без труда подвергнуть скринингу, используя описанные в настоящем документе методы для определения того, обладают ли они резистентностью к патогену и/или активностью ABC-транспортера.

При создании мутантов по аминокислотной последовательности местонахождение точки мутации и природа мутации будут зависеть от подвергаемой изменению характеристики (характеристик). Точки мутации можно изменить по отдельности или одну за другой, например, посредством (1) замещения сначала консервативными аминокислотными вариантами, а затем более радикальными выбранными элементами, исходя из полученных результатов, (2) делеции целевого остатка или (3) инсерции других остатков рядом с определенным сайтом.

Делеции в аминокислотной последовательности обычно находятся в пределах от приблизительно 1 до 15 остатков, более предпочтительно от приблизительно 1 до 10 остатков и обычно от приблизительно 1 до 5 последовательных остатков.

Мутанты с замещением характеризуются удалением по крайней мере одного аминокислотного остатка в молекуле полипептида и вставкой на его место иного остатка. Представляющие наибольший интерес сайты для мутагенеза с замещением включают сайты, идентифицированные как активный(е) сайт(ы). Другими представляющими интерес сайтами являются сайты, в которых специфические остатки, существующие в различных штаммах или видах, являются идентичными. Эти положения могут быть важны для биологической активности. Эти сайты, особенно те, которые встречаются внутри последовательности по крайней мере трех отличных в равной степени консервативных сайтов, предпочтительно замещают относительно консервативным образом. Такие консервативные замены представлены в табл. 1 под заголовком приводимые в качестве примеров замены.

В предпочтительном варианте осуществления мутант/вариант полипептида имеет одну, или две, или три, или четыре консервативные аминокислотные замены по сравнению с природным полипептидом. Сведения о консервативных аминокислотных заменах приведены в табл. 1. В предпочтительном варианте осуществления замены не находятся в одном или более мотивах, которые являются высококонсервативными между различными полипептидами, обеспечиваемых этим изобретением. Как, возможно, известно квалифицированному специалисту, с достаточным основанием можно ожидать, что такие незначительные изменения не приведут к изменению активности полипептида при экспрессии в рекомбинантной клетке.

Таблица 1 Приводимые в качестве примеров замены

Исходный остаток	Приводимые в качестве примеров замены
Ala (А)	val; leu; ile; gly
Arg (R)	lys
Asn (N)	gin; his
Asp (D)	glu
Cys(C)	ser
Gin (Q)	asn; his
Glu (E)	asp
Gly(G)	pro, ala
His (H)	asn; gin
He (I)	leu; val; ala
Leu (L)	ile; val; met; ala; phe
Lys (K)	arg
Met (M)	leu; phe
Phe (F)	leu; val; ala
Pro (P)	gly
Ser (S)	thr
Thr (T)	ser
Trp (W)	tyr
Tyr(Y)	trp; phe
Vai (V)	ile; leu; met; phe, ala

В варианте осуществления белок по настоящему изобретению представляет собой ABCтранспортер - PDR (гомолог плейотропной лекарственной резистентности) и включает два нуклеотидсвязываюших домена (NBD) и два трансмембранных домена, скомпонованных, как продемонстрировано на фиг. 5.

Первичную аминокислотную последовательность Lr34 можно использовать для создания ее вари

- 9 031178 антов/мутантов на основе сравнений с близкородственными ABC-транспортерами. Как это будет понятно квалифицированному специалисту, высококонсервативные среди близкородственных АВСтранспортеров PDR остатки с меньшей вероятностью могут быть изменены, особенно с использованием неконсервативных замен, с сохранением активности, чем менее консервативные остатки. Такие консервативные участки и возможные замены описаны Rae (2007), van den Brule and Smart (2002) и Verrier et al. (2008). Полипептид обычно включает два бокса Уокера типа A (GX₄GK[ST]) (SEQ ID NO: 56) (которая соответствует SEQ ID NO: 50 и 51 Lr34), два бокса Уокера типа В ((гидрофобный участок)₄[DE]) (SEQ ID NO: 57) (которая соответствует SEQ ID NO: 54 и 55 Lr34) и два ABC-опознавательных мотива ( [LIVMFY]S[SGM] [GE]X₃[RKA] [LIVMYA]X[LIVFMT] [AG] ) (SEQ ID NO : 5 8 ) (которая соответствует SEQ ID NO: 52 и 53 Lr34), при этом каждый NBD включает по порядку от N-конца бокс Уокера типа А, АВС-опознавательный мотив и бокс Уокера типа В (см., например, фиг. 4). В вышеприведенных последовательностях X может быть любой аминокислотой и может быть независимо одинаковой или различной.

Кроме того, полипептид обычно включает PDR-опознавательный мотив 1 (lllgpp) (seq id N0:59), который является непосредственно N-концевым по отношению к Nконцевому боксу Уокера типа А и слегка перекрывается с ним; PDR-опознавательный мотив 2 (GLDSST) (SEQ ID N0:60), который начинается за четырьмя остатками, являющимися С-концевыми по отношению к N-концевому боксу Уокера типа В; PDR-опознавательный мотив 3 (gld [AT] r [AS] aaiv [mi ] R) (seq id N0:61), _КОторый начинается за четырьмя остатками, являющимися С-концевыми по отношению к С-концевому боксу Уокера типа В; и PDR-опознавательный мотив 4 (vctihqps) (seq id N0:62), который начинается за 86 остатками, являющимися С-концевыми по отношению к PDR-опознавательному мотиву 3.

В варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению включает один или более аминокислотных мотивов, представленных в SEQ ID NO: 56-58, предпочтительно две копии всех трех последовательностей. Более предпочтительно полипептид по настоящему изобретению включает один или более аминокислотных мотивов, представленных в SEQ ID NO: 50-55, предпочтительно все шесть последовательностей.

Кроме того, в еще другом варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению включает один или более аминокислотных мотивов, представленных в SEQ ID NO: 59-62, предпочтительно все четыре последовательности.

Источники природных вариантов SEQ ID NO: 1, которые придают описываемую в настоящем документе резистентность, перечислены в табл. 5. На основе предоставленной в описании информации квалифицированный специалист может легко определить аминокислотную последовательность этих природных вариантов, а также кодирующих их полинуклеотидов.

В объем настоящего изобретения также включены полипептиды по настоящему изобретению, которые дифференциально модифицированы во время или после синтеза, например, путем биотинилирования, бензилирования, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с использованием известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, соединения с молекулой антитела или другим клеточным лигандом и т.д. Полипептиды могут быть посттрансляционно модифицированы в клетке, например, путем фосфорилирования, которое может модулировать их активность. Эти модификации могут служить для увеличения стабильности и/или биоактивности полипептида по настоящему изобретению.

Полипептиды по настоящему изобретению можно получить различными способами, включающими продукцию и извлечение природных полипептидов, продукцию и извлечение рекомбинантных полипептидов и химический синтез полипептидов. В одном варианте осуществления выделенный полипептид по настоящему изобретению получают путем культивирования клетки, способной экспрессировать полипептид, в условиях, эффективных для продукции полипептида, и извлечения полипептида.

Предпочтительной для культивирования клеткой является рекомбинантная клетка по настоящему изобретению. Эффективные условия культивирования включают, но не ограничиваются ими, эффективные среды, биореактор, температурные условия, условия pH и насыщения кислородом, которые делают возможной продукцию полипептида. Эффективная среда относится к любой среде, в которой культивируют клетку для продуцирования полипептида по настоящему изобретению. Такая среда обычно включает водную среду, содержащую источники усвояемого углерода, азота и фосфата, и соответствующие соли, минеральные вещества, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. Клетки по настоящему изобретению можно культивировать в обычных ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, пробирках, микротитровальных планшетах и чашках Петри. Культивирование можно осуществлять при температуре, pH и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. Следование таким условиям культивирования находится в пределах компетентности обычного специалиста в данной области техники. Предпочтительным средством для продуцирования полипептидов является трансгенное растение, предпочтительно трансгенный хлебный злак.

Полинуклеотиды и гены.

- 10 031178

Настоящее изобретение относится к различным полинуклеотидам. Как используется в данном описании, полинуклеотид, или нуклеиновая кислота, или молекула нуклеиновой кислоты означает полимер из нуклеотидов, который может представлять собой ДНК или РНК, или их сочетание и включает мРНК, кРНК, кДНК, тРНК, миРНК (siRNA) (малую (короткую) интерферирующую РНК), мшРНК (shRNA) (малую (короткую) шпилечную РНК) и шРНК (hpRNA) (шпилечную РНК). Он может представлять собой ДНК или РНК клеточного, геномного или синтетического происхождения, например, может быть получен на автоматизированном синтезаторе, и может быть объединен с углеводом, липидами, белком или другими материалами, меченными флуоресцентными или другими группами, или прикреплен к твердой подложке для выполнения конкретного определенного в описании действия, или включать один или более модифицированных нуклеотидов, не встречающихся в природе, которые хорошо известны специалистам в данной области. Полимер может быть одноцепочечным, в основном двухцепочечным или частично двухцепочечным. Примером молекулы частично двухцепочечной РНК является шпилечная РНК (hpRNA), короткая шпилечная РНК (shRNA) или самокомплементарная РНК, которые включают двухцепочечную ножку, образованную в результате спаривания оснований между нуклеотидной последовательностью и ее комплементом, и последовательность петли, которая ковалентно соединяет нуклеотидную последовательность и ее комплемент. Как используется в данном описании, спаривание оснований относится к обычному спариванию оснований между нуклеотидами, включающему пары оснований G:U. Под комплементарными подразумеваются два полинуклеотида, способные к спариванию оснований (гибридизации) по части их длин или по всей длине одного или обоих полинуклеотидов. Под гибридизованным полинуклеотидом подразумевается полинуклеотид, который действительно подвергся спариванию оснований со своим комплементом. Термин полинуклеотид используется в описании взаимозаменяемо с термином нуклеиновая кислота.

Под выделенным полинуклеотидом понимается полинуклеотид, который обычно отделен от полинуклеотидных последовательностей, с которыми он связан в своем природном состоянии. Предпочтительно выделенный полинуклеотид лишен по крайней мере на 90% других компонентов, с которыми он связан в природе.

Настоящее изобретение включает модифицирование активности гена и конструирование и использование химерных генов. Используемый в описании термин ген включает любую дезоксирибонуклеотидную последовательность, которая включает кодирующую белок область или которая транскрибируется в клетке, но не подвергается трансляции, а также связанные некодирующие и регуляторные области. Такие связанные области обычно находятся вблизи кодирующей области или транскрибируемой области как на 5'-конце, так и на З'-конце на расстоянии, составляющем приблизительно 2 т.п.о., с обеих сторон. В этом отношении ген может включать регулирующие сигналы, такие как промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или полиаденилирования, которые в природе связаны с конкретным геном, или гетерологичные регулирующие сигналы, в случае присутствия которых ген называют химерным геном. Последовательности, которые расположены в направлении 5' от кодирующей области и которые присутствуют на мРНК, называют 5' нетранслируемыми последовательностями. Последовательности, которые расположены по ходу транскрипции кодирующей области или находятся в направлении 3' от него и которые присутствуют на мРНК, называются 3' нетранслируемыми последовательностями. Термин ген охватывает как кДНК, так и геномные формы гена.

Как используется в данном описании, ген Lr34 относится к нуклеотидной последовательности, которая гомологична выделенному гену Lr34 (SEQ ID NO: 3) или кДНК Lr34 (SEQ ID NO: 2), описываемой в данном документе, который(ая) кодирует белок, придающий резистентность к патогену, предпочтительно грибному патогену, растению, предпочтительно хлебному злаку и более предпочтительно пшенице. Предпочтительно белок придает резистентность к более чем одному грибному патогену. Гены Lr34 включают природные аллели или варианты, существующие в хлебных злаках, таких как пшеница, включая те, которые кодируются D-геномами гексаплоидной пшеницы и диплоидными прародителями Dгенома или его родственниками, а также не встречающиеся в природе варианты, которые могут быть получены специалистами в области генной модификации. Молекулы нуклеиновых кислот, имеющие нуклеотидную последовательность, представленную в описании как SEQ ID NO: 2 (кДНК) или SEQ ID NO: 3 (геномная последовательность), кодирующие белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, являются примерами гена Lr34. В предпочтительном варианте осуществления ген Lr34 относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды, имеющие последовательность, идентичную SEQ ID NO: 2 по крайней мере на 90%.

Геномная форма или клон гена, содержащая транскрибируемую область, может быть прервана некодирующими последовательностями, называемыми интронами или находящимися между экзонами участками или последовательностями. Как используется в данном описании, интрон представляет собой сегмент гена, который транскрибируется в виде части первичного РНК-транскрипта, но не присутствует в молекуле зрелой мРНК. Интроны удаляются или вырезаются из ядерного или первичного транскрипта; следовательно, интроны отсутствуют в информационной РНК (мРНК). Интроны могут содержать регуляторные элементы, такие как энхансеры. Как используется в данном описании, экзоны относятся к областям ДНК, соответствующим последовательностям РНК, которые присутствуют в зрелой

- 11 031178 мРНК или молекуле зрелой РНК в тех случаях, когда молекула РНК не подвергается трансляции. Во время трансляции мРНК функционирует для определения последовательности или порядка аминокислот в возникающем полипептиде. Термин ген включает синтетическую или слитую молекулу, кодирующую белки по настоящему изобретению, описываемые в данном документе, целиком или их часть, и нуклеотидную последовательность, комплементарную любой из указанных выше молекул. Ген можно встроить в соответствующий вектор для внехромосомного поддержания в клетке или для интеграции в геном хозяина.

Как используется в данном описании, химерный ген относится к любому гену, который не является нативным геном в своем природном местонахождении. Обычно химерный ген включает регуляторные и транскрибируемые или кодирующие белок последовательности, которые не встречаются вместе в природе. Соответственно химерный ген может включать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, происходящие из одного и того же источника, но с расположением, отличным от расположения, которое встречается в природе. Термин эндогенный используется в описании для ссылки на вещество, которое обычно присутствует или продуцируется в немодифицированном растении в той же стадии развития, что и исследуемое растение. Эндогенный ген относится к нативному гену в его природном местонахождении в геноме организма. Как используется в данном описании, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, рекомбинантный полинуклеотид или их вариации относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была сконструирована или модифицирована с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Термины чужеродный полинуклеотид, или экзогенный полинуклеотид, или гетерологичный полинуклеотид и т.п. относятся к любой нуклеиновой кислоте, которая введена в геном клетки с помощью экспериментальных манипуляций. Например, авторами настоящего изобретения идентифицирован гомолог Lr34 на хромосоме 7В пшеницы (см. SEQ ID NO: 63 и 64). Квалифицированный специалист может использовать эту информацию для мутирования гомолога гена Lr34 в твердой пшенице таким образом, чтобы он кодировал белок по настоящему изобретению, в котором отсутствует остаток фенилаланина или любая аминокислота в положении, соответствующем номеру аминокислоты 546 в SEQ ID NO: 4, и имеется аминокислота, отличная от остатка тирозина, в положении, соответствующем номеру аминокислоты 634 в SEQ ID NO: 4. Такой мутированный ген, а также кодируемую мРНК, можно было бы считать экзогенным полинуклеотидом по настоящему изобретению.

Чужеродными или экзогенными генами могут быть гены, которые введены в ненативный организм, нативные гены, введенные в новое место внутри нативного хозяина, или химерные гены. Трансген представляет собой ген, который был введен в геном с помощью процедуры трансформации. Термин генетически модифицированные включает введение генов в клетки посредством трансформации или трансдукции, мутирование генов в клетках и изменение или модулирование регуляции гена в клетке или организме, в отношении которой(ого) эти действия были осуществлены, или их потомстве.

Кроме того, термин экзогенный в отношении полинуклеотида (нуклеиновой кислоты) относится к полинуклеотиду, если он присутствует в клетке или в бесклеточной экспрессионной системе, в измененной степени по сравнению с его природным состоянием. В варианте осуществления клеткой является клетка, которая в природе не включает полинуклеотид. Однако клеткой может быть клетка, которая включает неэндогенный полинуклеотид, приводящий к измененной степени продукции кодируемого полипептида. Экзогенный полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотиды, которые были отделены от других компонентов трансгенной (рекомбинантной) клетки или бесклеточной экспрессионной системы, в которой он присутствует, и полинуклеотиды, продуцированные в таких клетках или бесклеточных системах, которые, по существу, очищены, по крайней мере, от некоторых других компонентов. Экзогенный полинуклеотид (нуклеиновая кислота) может быть непрерывным участком нуклеотидов, существующим в природе, или включать два или более непрерывных участков нуклеотидов из различных источников (природных и/или синтетических), соединенных с образованием одного полинуклеотида. Обычно такие химерные полинуклеотиды включают, по крайней мере, открытую рамку считывания, кодирующую полипептид по настоящему изобретению, функционально связанный с промотором, подходящим для управления транскрипцией открытой рамки считывания в представляющей интерес клетке.

Процент идентичности полинуклеотида определяют посредством анализа GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (программы GCG) с использованием штрафа за включение пропуска=5 и штрафа за удлинение пропуска=0,3. Длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 450 нуклеотидов, и в анализе GAP совмещаются две последовательности по участку, составляющему по крайней мере 450 нуклеотидов. Предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 1500 нуклеотидов, и в анализе GAP совмещаются две последовательности по участку, составляющему по крайней мере 1500 нуклеотидов. Еще более предпочтительно длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 3000 нуклеотидов, и в анализе GAP совмещаются две последовательности по участку, составляющему по крайней мере 3000 нуклеотидов. Еще более предпочтительно в анализе GAP совмещаются две последовательности по всей их длине.

- 12 031178

В отношении определенных полинуклеотидов будет понятно, что цифровые данные % идентичности, превышающие приведенные выше цифровые данные, будут включены в предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, где приемлемо с учетом цифровых данных минимального % идентичности предпочтительно, когда полинуклеотид включает полинуклеотидную последовательность, которая идентична соответствующей SEQ ID NO с определенным названием по крайней мере на 60%, более предпочтительно по крайней мере на 65%, более предпочтительно по крайней мере на 70%, более предпочтительно по крайней мере на 75%, более предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, более предпочтительно по крайней мере на 91%, более предпочтительно по крайней мере на 92%, более предпочтительно по крайней мере на 93%, более предпочтительно по крайней мере на 94%, более предпочтительно по крайней мере на 95%, более предпочтительно по крайней мере на 96%, более предпочтительно по крайней мере на 97%, более предпочтительно по крайней мере на 98%, более предпочтительно по крайней мере на 99%, более предпочтительно по крайней мере на 99,1%, более предпочтительно по крайней мере на 99,2%, более предпочтительно по крайней мере на 99,3%, более предпочтительно по крайней мере на 99,4%, более предпочтительно по крайней мере на 99,5%, более предпочтительно по крайней мере на 99,6%, более предпочтительно по крайней мере на 99,7%, более предпочтительно по крайней мере на 99,8% и еще более предпочтительно по крайней мере на 99,9%.

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению не является последовательностью нуклеотидов, представленной в любой из SEQ ID NO: 7-11.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, которые, по существу, идентичны полинуклеотидам, конкретно описанным в данном документе. Используемый в описании термин по существу, идентичный со ссылкой на полинуклеотид означает замещение одного или небольшого числа (например, 2, 3 или 4) нуклеотидов при сохранении по крайней мере одной активности нативного белка, кодируемого полинуклеотидом. Кроме того, этот термин включает добавление или делетирование нуклеотидов, которое приводит к увеличению или уменьшению размера кодируемого нативного белка на одну или небольшое число (например, 2, 3 или 4) аминокислот при сохранении по крайней мере одной активности нативного белка, кодируемого полинуклеотидом.

Настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотидов. Используемые в данном описании олигонуклеотиды представляют собой полинуклеотиды длиной вплоть до 50 нуклеотидов. Минимальным размером таких олигонуклеотидов является размер, требуемый для образования стабильного гибрида между олигонуклеотидом и комплементарной последовательностью в молекуле нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Они могут представлять собой РНК, ДНК, или их сочетания, или производные любой из них. Олигонуклеотиды обычно представляют собой относительно короткие одноцепочечные молекулы длиной 10-30 нуклеотидов, обычно 15-25 нуклеотидов. При использовании в качестве зонда или в качестве праймера в реакции амплификации минимальным размером такого олигонуклеотида является размер, требуемый для образования стабильного гибрида между олигонуклеотидом и комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты. Предпочтительно длина олигонуклеотидов составляет по крайней мере 15 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 18 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно по крайней мере 25 нуклеотидов. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению, используемые в качестве зонда, обычно конъюгированы с меткой, такой как радиоактивный изотоп, фермент, биотин, флуоресцентная молекула или хемилюминесцентная молекула.

Настоящее изобретение включает олигонуклеотиды, которые могут быть использованы в качестве, например, зондов для идентификации молекул нуклеиновых кислот или в качестве праймеров для продуцирования молекул нуклеиновых кислот. Зонды и/или праймеры можно использовать для клонирования гомологов полинуклеотидов по настоящему изобретению из других видов. Кроме того, известные в данной области методы гибридизации можно также использовать для скрининга библиотек геномной ДНК или кДНК для таких гомологов.

Полинуклеотиды и олигонуклеотиды по настоящему изобретению включают те, которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2 и/или 3. Используемыми в данном описании жесткими условиями являются такие условия, при которых (1) используется низкая ионная сила и высокая температура для промывки, например, 0,015М NaCl/0,0015M цитрат натрия/0,1% NaDOdSO₄ при 50°C; (2) во время гибридизации используется денатурирующий агент, такой как формамид, например 50%-ный (в объемном отношении) формамид с 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% фиколла, 0,1% поливинилпирролидона, 50 мМ натрий-фосфатным буфером при pH 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) используется 50%-ный формамид, 5xSSC (0,75М NaCl, 0,075М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% фосфата натрия, 5х раствор Денхардта, обработанная ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 г/мл), 0,1% SDS и 10% сульфата декстрана при 42°C в 0,2xSSC и 0,1% SDS.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут иметь по сравнению с природными молекула

- 13 031178 ми одну и несколько мутаций, которые представляют собой делеции, инсерции или замены нуклеотидных остатков. Мутанты могут быть либо природными (то есть выделенными из природного источника) или синтетическими (например, в результате осуществления сайт-направленного мутагенеза на нуклеиновой кислоте). Вариант полинуклеотида или олигонуклеотида по настоящему изобретению включает молекулы, которые имеют размеры, варьирующие вблизи размера исходных молекул полинуклеотидов или олигонуклеотидов, определяемых в описании, и/или способны к гибридизации с геномом пшеницы. Например, варианты могут включать дополнительные нуклеотиды (например, 1, 2, 3, 4 или более) или меньшее число нуклеотидов при условии, что они все еще гибридизуются с участком-мишенью. Кроме того, небольшое число нуклеотидов может быть замещено без оказания влияния на способность олигонуклеотида к гибридизации с участком-мишенью. Кроме того, могут быть легко созданы варианты, которые гибридизуются вблизи, например, в пределах 50 нуклеотидов, участка генома растений, с которым гибридизуются конкретные олигонуклеотиды, определенные в данном описании. В частности, они включают полинуклеотиды, которые кодируют тот же полипептид или аминокислотную последовательность, но которые отличаются по нуклеотидной последовательности благодаря избыточности генетического кода. Термины вариант полинуклеотида и вариант также включают природные аллельные варианты.

Конструкции нуклеиновых кислот.

Настоящее изобретение включает конструкции нуклеиновых кислот, содержащие полинуклеотиды по настоящему изобретению, и содержащие их векторы и клетки-хозяева, способы их получения и использования и области их применения. Настоящее изобретение относится к элементам, которые функционально соединены или связаны. Термины функционально соединенные или функционально связанные и т. п. относятся к соединению полинуклеотидных элементов в функциональном отношении. Обычно функционально соединенные последовательности нуклеиновых кислот являются связанными при соприкосновении и при необходимости соединения двух кодирующих белки областей, соприкасающимися и находящимися в рамке считывания. Кодирующая последовательность функционально соединена с другой кодирующей последовательностью, когда РНК-полимераза будет транскрибировать две кодирующие последовательности в единственную РНК, которая в случае ее трансляции затем транслируется в единственный полипептид, имеющий аминокислоты, происходящие из обеих кодирующих последовательностей. Не требуется, чтобы кодирующие последовательности были соприкасающимися друг с другом при условии, что экспрессируемые последовательности подвергаются в конечном счете процессингу с образованием желаемого белка.

Следует считать, что используемый в описании термин действующая в цис-положении последовательность, действующий в цис-положении элемент, или цис-регуляторная область, или регуляторная область, или аналогичный термин означает любую последовательность нуклеотидов, которая при ее соответствующем расположении и соединении относительно экспрессируемой генетической последовательности способна регулировать, по крайней мере отчасти, экспрессию генетической последовательности. Квалифицированные в данной области техники специалисты знают, что цис-регуляторная область может быть способна к активации, глушению, усилению, подавлению или иному изменению уровня экспрессии и/или специфичности в отношении типа клеток и/или специфичности в отношении стадии развития последовательности гена на транскрипционном или посттранскрипционном уровне. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения действующей в цис-положении последовательностью является последовательность активатора, которая усиливает или стимулирует экспрессию экспрессируемой генетической последовательности.

Функциональное соединение элемента промотора или энхансера с транскрибируемым полинуклеотидом означает помещение транскрибируемого полинуклеотида (например, кодирующего белок полинуклеотида или другого транскрипта) под регуляторный контроль промотора, который в таком случае контролирует транскрипцию этого полинуклеотида. При конструировании сочетаний гетерологичный промотор/структурный ген, как правило, предпочтительным является помещение промотора или его варианта на расстоянии от места начала транскрипции транскрибируемого полинуклеотида, которое является приблизительно одинаковым с расстоянием между этим промотором и кодирующей белок областью, которую он контролирует, в его природной установке; т. е. гене, от которого происходит промотор. Как это известно в данной области техники, некоторое изменение этого расстояния может быть обеспечено без потери функции. Аналогично, предпочтительное расположение элемента регуляторных последовательностей (например, оператора, энхансера и т.д.) относительно транскрибируемого полинуклеотида, помещаемого под его контроль, определяется расположением элемента в его природной установке; т.е. генах, от которых он происходит.

Как используется в данном описании, промотор или промоторная последовательность относится к области гена, обычно расположенной против хода транскрипции (5') РНК-кодирующей области, которая контролирует инициацию и уровень транскрипции в представляющей интерес клетке. Промотор включает регулирующие транскрипцию последовательности классического гена в геноме, такие как последовательности в виде TATA-бокса и CCAAT-бокса, а также дополнительные регуляторные элементы (т.е. расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию гена в ответ на связанные с развитием стимулы и/или стимулы ок

- 14 031178 ружающей среды, или тканеспецифическим или специфичным в отношении типа клеток образом. Промотор обычно, но не обязательно (например, в случае промоторов для полимеразы III) расположен в направлении 5' от структурного гена, экспрессию которого он регулирует. Кроме того, регуляторные элементы, включающие промотор, обычно располагаются в пределах 2 т.п.о. от места начала транскрипции гена. Промоторы могут содержать дополнительные специфические регуляторные элементы, расположенные дистальнее от места начала транскрипции, для дополнительного усиления экспрессии в клетке и/или изменения выбора времени или индуцибельности экспрессии структурного гена, с которым он функционально соединен.

Конститутивный промотор относится к промотору, который управляет экспрессией функционально связанной с ним транскрибируемой последовательности во многих или всех тканях организма, такого как растение. Используемый в описании термин конститутивный необязательно означает, что ген экспрессируется на одинаковом уровне во всех типах клеток, а означает, что ген экспрессируется в широком диапазоне типов клеток, хотя часто выявляется некоторая вариация в уровне экспрессии. Как используется в данном описании, избирательная экспрессия относится к экспрессии почти исключительно в специфических органах, например, растения, таких как, например, эндосперм, зародыш, листья, фрукт, пыльцевые трубки или корень. В предпочтительном варианте осуществления промотор регулирует экспрессию избирательно или предпочтительно в листьях и/или стеблях растения, предпочтительно хлебного злака.

Следовательно, избирательную экспрессию можно сравнить с конститутивной экспрессией, которая относится к экспрессии во многих или всех тканях растения в большей части или во всех условиях, переносимых растением.

Избирательная экспрессия может также приводить к компартментализации продуктов экспрессии генов в специфических тканях, органах растения или на стадиях развития растения. Достичь компартментализации в специфических субклеточных местах, таких как пластид, цитозоль, вакуоль или апопластическое пространство, можно посредством включения в структуру генного продукта соответствующих сигналов, например сигнального пептида, для переноса в требуемый клеточный компартмент, или в случае полуавтономных органелл (пластид и митохондрий) посредством интеграции трансгена с соответствующими регуляторными последовательностями непосредственно в геном органеллы.

Тканеспецифическим промотором или органоспецифическим промотором является промотор, который преимущественно регулирует экспрессию в одной ткани или органе относительно многих других тканей или органов, предпочтительно большей части, если не всех других тканей или органов, например, растения. Обычно экспрессия с промотора в специфической ткани или органе происходит на уровне, превышающем в 10 раз уровень в других тканях или органах.

Предусматриваемые настоящим изобретением промоторы могут быть нативными относительно трансформируемого растения-хозяина или могут происходить из альтернативного источника, причем промоторная область является функциональной в растении-хозяине. Другие источники включают гены T-ДНК Agrobacterium, такие как промоторы генов для биосинтеза нопалина, октапина, маннопина или другие промоторы опинов, тканеспецифические промоторы (см., например, патент США № 5459252 и WO 91/13992); промоторы из вирусов (включая специфичные для хозяина вирусы) или частично или полностью синтетические промоторы. Многочисленные промоторы, которые являются функциональными в однодольных и двудольных растениях, включая различные промоторы, выделенные из растений и вирусов, такие как промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S, 19S), широко известны в данной области техники (см., например, Greve, 1983; Salomon et al., 1984; Garfinkel et al., 1983; Barker et al., 1983). He ограничивающие способы оценки активности промоторов описаны Medberryet al. (1992, 1993), Sambrook et al. (1989, выше) и в патенте США № 5164316.

Альтернативно или дополнительно промотор может быть индуцибельным промотором или регулируемым в процессе развития промотором, который способен к управлению экспрессией введенного полинуклеотида на соответствующей стадии развития, например, растения. Другие действующие в цисположении последовательности, которые могут быть использованы, включают энхансеры транскрипции и/или трансляции. Энхансерные области хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам и могут включать кодон инициации трансляции - ATG и примыкающие к нему последовательности. При включении кодон инициации должен быть синфазным с рамкой считывания кодирующей последовательности, имеющей отношение к чужеродному или экзогенному полинуклеотиду, для обеспечения трансляции полной последовательности, если она должна быть транслирована. Области инициации трансляции могут быть предоставлены из источника области инициации транскрипции или из чужеродного или экзогенного полинуклеотида. Последовательность может также происходить из источника промотора, выбранного для управления транскрипцией, и может быть специфическим образом модифицирована для увеличения трансляции мРНК.

В варианте осуществления промотор, по крайней мере, способен к экспрессии полипептида в листьях растения, предпочтительно листьях взрослого растения. Примеры специфичных для листьев промоторов, которые могут быть использованы, включают промоторы, которые описаны Yamamoto et al. (1994 and 1997), Kwon et al. (1994), Gotor et al. (1993), Orozco et al. (1993), Matsuoka et al. (1993) и Stock

- 15 031178 haus et al. (1987 and 1989).

Конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может включать 3' нетранслируемую последовательность из приблизительно 50-1000 пар нуклеотидных оснований, которая может включать последовательность терминации транскрипции. 3' нетранслируемая последовательность может содержать сигнал терминации транскрипции, который может включать или может не включать сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы, способные к воздействию на процессирование мРНК. Сигнал полиаденилирования функционирует с целью добавления участков из полиадениловой кислоты к 3'-концу предшественника мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно распознаются по наличию гомологии с канонической формой 5'-AATAAA-3', хотя не редкими являются вариации. Последовательности терминации транскрипции, которые не включают сигнал полиаденилирования, включают терминаторы для РНК-полимеразы I или III, которые содержат отрезок из четырех или более тимидинов. Примерами подходящих 3' нетранслируемых последовательностей являются 3' транскрибируемые, нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования, из гена октопинсинтазы (ocs) или гена нопалинсинтазы (nos) Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983). Подходящие 3' нетранслируемые последовательности могут также происходить из генов растений, таких как ген рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазы (ssRUBISCO), хотя также могут быть использованы другие 3' элементы, известные квалифицированным в данной области техники специалистам.

Так как последовательность ДНК, встроенная между сайтом инициации транскрипции и началом кодирующей последовательности, т.е. нетранслируемая 5' лидерная последовательность (5'UTR), может оказывать влияние на экспрессию гена, если он транслируется, а также транскрибируется, может также использоваться конкретная лидерная последовательность.

Подходящие лидерные последовательности включают те, которые содержат последовательности, выбираемые для приведения в действие оптимальной экспрессии чужеродной или эндогенной последовательности ДНК. Например, такие лидерные последовательности включают предпочтительную консенсусную последовательность, которая может увеличивать или поддерживать стабильность мРНК и предотвращать неприемлемую инициацию трансляции, как, например, описано Joshi (1987).

Векторы.

Настоящее изобретение включает использование векторов для манипуляции с генетическими конструкциями или их переноса. Под химерным вектором подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекула ДНК, происходящая, например, из плазмиды, бактериофага или вируса растений, в которую была встроена или клонирована последовательность нуклеиновой кислоты. Вектор предпочтительно является двухцепочечной ДНК и содержит один или более уникальных сайтов рестрикции и может быть способным к автономной репликации в заданной клетке-хозяине, включая целевую клетку или ткань, или клетку или ткань, являющуюся ее предшественником, или способным к интеграции в геном заданного хозяина, так что клонированная последовательность репродуцируется. Соответственно вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. вектором, который существует в виде внехромосомной молекулы, репликация которой не зависит от репликации хромосом(ы), например, линейной или замкнутой кольцевой плазмидой, внехромосомным элементом, минихромосомой или искусственной хромосомой. Вектор может содержать любое средство для обеспечения саморепликации. Альтернативно вектором может быть вектор, который после введения в клетку интегрируется в геном реципиентной клетки и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он был интегрирован. Векторная система может включать один вектор или плазмиду, два или более векторов или плазмид, которые вместе содержат суммарную ДНК, которую необходимо ввести в геном клетки-хозяина, или транспозон. Выбор вектора будет, как правило, зависеть от совместимости вектора с клеткой, в которую должен быть введен вектор. Вектор может также включать селектируемый маркер, такой как ген резистентности к антибиотику, ген резистентности к гербициду или другие гены, которые можно использовать для отбора подходящих трансформантов. Примеры таких генов хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам.

Конструкцию нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно встроить в такой вектор, как плазмида. Плазмидные векторы обычно включают дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, которые обеспечивают легкость отбора, амплификации и трансформации экспрессионной кассеты в прокариотические и эукариотические клетки, например pUC-происходящие векторы, pSKпроисходящие векторы, pGEM-происходящие векторы, pSP-происходящие векторы, pBS-происходящие векторы или бинарные векторы, содержащие одну или более областей Т-ДНК. Дополнительные последовательности нуклеиновых кислот включают ориджины репликации для обеспечения автономной репликации вектора, гены селектируемых маркеров, предпочтительно кодирующие резистентность к антибиотикам или гербицидам, уникальные множественные сайты для клонирования, предусматривающие множество сайтов для встраивания последовательностей нуклеиновых кислот или генов, кодируемых в конструкции нуклеиновой кислоты, и последовательности, которые способствуют трансформации прокариотических и эукариотических клеток (особенно клеток растений).

Под маркерным геном подразумевается ген, который придает экспрессирующим маркерный ген клеткам отличающийся фенотип и, следовательно, позволяет отличить такие трансформированные клет

- 16 031178 ки от клеток, которые не имеют такой маркер. Селектируемый маркерный ген придает характерное свойство, по причине наличия которого можно провести отбор, основываясь на резистентности к селективному агенту (например, гербициду, антибиотику, облучению, нагреву или другой обработке, вредной для ^трансформированных клеток). Селектируемый маркерный ген (или репортерный ген) придает характерное свойство, которое можно идентифицировать посредством наблюдения или исследования, т.е. посредством скрининга (например, β-глюкуронидазную, люциферазную, GFP- или другую ферментативную активность, не присутствующую в ^трансформированных клетках). Маркерный ген и представляющая интерес нуклеотидная последовательность не должны быть связанными.

Для облегчения идентификации трансформантов желательно, чтобы конструкция нуклеиновой кислоты включала селектируемый или поддающийся скринингу маркерный ген в виде, или помимо, чужеродного или экзогенного полинуклеотида. Фактический выбор маркера не является решающим при условии, что он является функциональным (т.е. селектируемым) в сочетании с предпочтительными клетками растения. Маркерный ген и представляющий интерес чужеродный или экзогенный полинуклеотид не должны быть связанными, поскольку котрансформация несвязанных генов, описанная, например, в патенте США № 4399216, также является эффективным способом при трансформации растений.

Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются маркеры, которые придают резистентность к антибиотикам, такую как резистентность к ампициллину, эритромицину, хлорамфениколу или тетрациклину, предпочтительно резистентность к канамицину. Приводимые в качестве примеров селектируемые маркеры для отбора трансформантов растений включают, но не ограничиваются ими, ген hyg, который кодирует резистентность к гигромицину В; ген неомицинфосфотрансферазы (nptII), придающий резистентность к канамицину, паромомицину, G418; ген глутатион^-трансферазы из печени крысы, придающий резистентность к гербицидам - производным глутатиона, описанный, например, в EP 256223; ген глутаминсинтетазы, придающий при сверхэкспрессии резистентность к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, описанный, например, в WO 87/05327, ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, придающий резистентность к селективному агенту - фосфинотрицину, описанный, например, в ЕР 275957, ген, кодирующий 5-энолшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), придающий устойчивость к N-фосфонометилглицину, описанный, например, Hincheeet al. (1988), ген bar, придающий резистентность к биалафосу, описанный, например, в WO 91/02071; ген нитрилазы, такой как bxn из Klebsiella ozaenae, который придает резистентность к бромоксинилу (Stalker et al., 1988); ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), придающий резистентность к метотрексату (Thillet et al., 1988); мутантный ген ацетолактатсинтазы (ALS), который придает резистентность к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ALS-ингибирующим химическим веществам (EP 154204); мутированный ген антранилатсинтазы, который придает резистентность к 5-метилтриптофану; или ген далапондегалогеназы, который придает резистентность к гербициду.

Предпочтительные поддающиеся отбору маркеры включают, но не ограничиваются ими, ген uidA, кодирующий фермент β-глюкуронидазу (GUS), для которого известны различные хромогенные субстраты, ген β-галактозидазы, кодирующий фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты, ген экворина (Prasher et al., 1985), который может использоваться при кальцийчувствительном биолюминесцентном выявлении; ген зеленого флуоресцентного белка (Niedz et al., 1995) или его производные; ген люциферазы (luc) (Ow et al., 1986), который делает возможным биолюминесцентное выявление, и другие, известные в данной области техники. Под репортерной молекулой, как используется в описании настоящего изобретения, подразумевается молекула, которая благодаря своей химической природе обеспечивает аналитически идентифицируемый сигнал, который способствует определению активности промотора на основе белкового продукта.

Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты устойчиво включена в геном, например, растения. Соответственно нуклеиновая кислота включает соответствующие элементы, которые делают возможным включение молекулы в геном, или конструкцию помещают в подходящий вектор, который может быть включен в хромосому клетки растения.

Один вариант осуществления настоящего изобретения включает рекомбинантный вектор, который включает по крайней мере одну молекулу полинуклеотида по настоящему изобретению, встроенную в любой вектор, способный доставлять молекулу нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Такой вектор содержит гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, которые являются последовательностями нуклеиновых кислот, которые не встречаются в природе вблизи молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению и которые предпочтительно происходят от видов, отличных от вида, от которого происходит молекула(ы) нуклеиновой кислоты. Вектором может быть либо РНК, либо ДНК, или прокариотическая, или эукариотическая, и обычно он представляет собой вирус или плазмиду.

Ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток растений или для создания трансгенных растений, описан, например, в Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; и Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Как правило, векторы для экспрессии в клетках растений включают, например, один или более клонированных генов растений под транскрип

- 17 031178 ционным контролем 5' и 3' регуляторных последовательностей и доминантный селектируемый маркер. Такие векторы для экспрессии в клетках растений также могут содержать регулирующую промотор область (например, регуляторную область, контролирующую индуцибельную или конститутивную, регулируемую факторами окружающей среды или в процессе развития, или клеточно- или тканеспецифическую экспрессию), сайт начала инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы, сигнал для процессирования РНК, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.

Уровень белка, например белка Lr34, можно модулировать посредством увеличения уровня экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей белок в клетке растения, или снижения уровня экспрессии гена, кодирующего белок в растении, что приводит к изменению резистентности к патогену. Уровень экспрессии гена можно модулировать путем изменения числа копий в каждой клетке, например, путем введения синтетической генетической конструкции, включающей кодирующую последовательность и контролирующий транскрипцию элемент, который функционально соединен с ней и который является функционирующим в клетке. Множество трансформантов можно выбрать и подвергнуть скринингу для трансформантов с подходящим уровнем и/или специфичностью экспрессии трансгена, которые обусловлены эффектами эндогенных последовательностей вблизи сайта интеграции трансгена. Подходящим уровнем и картиной экспрессии трансгена являются те, которые приводят к значительному изменению резистентности к патогену или другому фенотипу. Альтернативно совокупность подвергнутых мутагенезу семян или популяцию растений из селекционной программы можно подвергнуть скринингу для отдельных линий с измененной резистентностью к патогену или другим фенотипом, связанным с резистентностью к патогену.

Рекомбинантные клетки.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает рекомбинантную клетку, содержащую клетку-хозяина, трансформированную одной или более рекомбинантными молекулами по настоящему изобретению, или являющиеся их потомками клетки. Трансформацию молекулы нуклеиновой кислоты в клетку можно выполнить любым способом, с помощью которого молекула нуклеиновой кислоты может быть вставлена в клетку. Методы трансформации включают, но не ограничиваются ими, трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, абсорбцию и слияние протопластов. Рекомбинантная клетка может оставаться одноклеточной или может разрастаться в ткань, орган или многоклеточный организм. Трансформированные молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут оставаться внехромосомными или могут интегрироваться в один или более сайтов внутри хромосомы трансформированной (т. е. рекомбинантной) клетки таким образом, что их способность быть экспрессированными сохраняется. Предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки растения, более предпочтительно клетки хлебного злака, более предпочтительно клетки ячменя или пшеницы и еще более предпочтительно клетка пшеницы.

Трансгенные растения.

Термин растение, используемый в описании как имя существительное, относится к цельным растениям и относится к любому члену царства растений, но при использовании в качестве прилагательного относится к любому веществу, которое присутствует в растении, получено из него, происходит от него или относится к нему, такому как, например, органы растения (например, листья, стебли, корни, цветы), одиночные клетки (например, пыльца), семена, клетки растения и т.п. Проростки и проросшие семена, из которых вышли корешки и ростки, также включены в значение растение. Используемый в описании термин части растения относится к одной или более тканям или органам растения, которые получены из растения и которые содержат геномную ДНК растения. Части растения включают вегетативные структуры (например, листья, стебли), корни, цветковые органы/структуры, семя (включая зародыш, семядоли и семенную оболочку), ткань растения (например, сосудистую ткань, основную паренхиму и т.п.), клетки и их потомство. Используемый в описании термин клетка растения относится к клетке, полученной из растения или находящейся в растении, и включает протопласты или другие клетки, происходящие от растений, продуцирующие гаметы клетки и клетки, которые регенерируются в цельные растения. Клетками растений могут быть клетки в культуре. Под тканью растения подразумевается дифференцированная ткань, присутствующая в растении или полученная из растения (эксплант), или недифференцированная ткань, происходящая от незрелых или зрелых зародышей, семян, корней, проростков, фруктов, пыльцевых трубок, пыльцы, опухолевой ткани, такой как корневая опухоль, и различные формы агрегации клеток растения в культуре, такие как каллюсы. Приводимыми в качестве примеров тканями растений в семенах или из них являются семядоля, зародыш и рубчик. Соответственно настоящее изобретение включает растения и части растений и содержащие их продукты, в частности семя, содержащее модифицированную масляную композицию.

Используемый в описании термин семя относится к зрелому семени растения, которое либо готово для сбора, либо было собрано с растения, например семя, которое обычно собирают с коммерческой целью в поле, или развивающееся семя, которое встречается у растения после опыления и до установления покоя семени, а также после его сбора.

Как используется в данном описании, трансгенное растение относится к растению, которое содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, не встречающуюся у растения дикого типа того же вида,

- 18 031178 разновидности или сорта. То есть трансгенные растения (трансформированные растения) содержат генетический материал (трансген), который они не содержали до трансформации. Трансген может включать генетические последовательности, полученные из клетки растения или происходящие от него или другой клетки растения, или нерастительного источника, или синтетическую последовательность. Как правило, трансген введен в растение с помощью производимой человеком манипуляции, такой как, например, трансформация, но может быть использован любой способ, как это понятно квалифицированному в данной области техники специалисту. Генетический материал предпочтительно устойчиво интегрирован в геном растения. Вводимый генетический материал может включать последовательности, которые встречаются в природе у того же вида, но в порядке с перестановками или в различном расположении элементов, например антисмысловую последовательность. Содержащие такие последовательности растения включены в описании в термин трансгенные растения. Нетрансгенное растение представляет собой растение, которое не было генетически модифицировано посредством введения генетического материала с использованием методов рекомбинантных ДНК. В предпочтительном варианте осуществления трансгенные растения являются гомозиготными по каждому и всякому гену, который был введен (трансгену), так что их потомство не расщепляется в отношении желаемого фенотипа.

Как используется в данном описании, термин по сравнению с изогенным растением относится к растению, которое является изогенным относительно трансгенного растения, но без представляющего интерес трансгена. Предпочтительно соответствующее нетрансгенное растение является растением того же сорта или разновидности, что и прародитель представляющего интерес трансгенного растения, или родственной линией растений, в которой отсутствует конструкция, часто называемой сегрегантом, или растением того же сорта или разновидности, трансформированным конструкцией - пустым вектором, и может быть нетрансгенным растением. Как используется в данном описании, дикий тип относится к клетке, ткани или растению, которые не были модифицированы в соответствии с настоящим изобретением. Клетки, ткань или растения дикого типа могут быть использованы в качестве контролей для сравнения уровней экспрессии экзогенной нуклеиновой кислоты или степени и природы модификации признака с клетками, тканью или растениями, модифицированными, как описывается в данном документе.

Трансгенные растения, определяемые в связи с настоящим изобретением, включают потомство растений, которые были генетически модифицированы с использованием рекомбинантных методов, причем потомство включает представляющий интерес трансген. Такое потомство может быть получено посредством самоопыления первичного трансгенного растения или посредством скрещивания таких растений с другим растением того же вида. Обычно это должно было бы приводить к модуляции продукции по крайней мере одного описываемого здесь белка в желаемом растении или органе растения. Части трансгенных растений включают все части и клетки указанных растений, содержащие трансген, такие как, например, подвергнутые культивированию ткани, каллюс и протопласты.

Растения, предназначенные для применения на практике настоящего изобретения, включают как однодольные, так и двудольные растения. Целевые растения включают, но не ограничиваются ими, следующие растения: хлебные злаки (например, пшеницу, ячмень, рожь, овес, рис, кукурузу, сорго и родственные зерновые культуры); свеклу (сахарную свеклу и кормовую свеклу); плод семечковых, косточковый плод и ягоду (яблоки, груши, сливы, персики, миндаль, вишню, клубнику, малину и ежевику); растения семейства бобовых (бобы, чечевицу, горох, сою); масличные культуры (рапс или другие Brassicas, горчицу, мак, маслину, подсолнечник, сафлор, лен, кокосовую пальму, растения, из которых получают касторовое масло, бобы какао, арахис); растения семейства тыквенных (кабачок, огурец, дыню); волокнистые растения (хлопок, лен, коноплю, джут); цитрусовые (апельсины, лимоны, грейпфрут, мандарины); овощи (шпинат, салат-латук, спаржу, капусту, морковь, лук, помидоры, картофель, паприку); лавровые (авокадо, корицу, камфорный лавр); или такие растения, как кукуруза, табак, орех, кофейное дерево, сахарный тростник, чай, виноград, хмель обыкновенный, дерн, банан и каучуконосные растения, а также декоративные растения (цветы, кустарники, широколистые деревья и вечнозеленые растения, такие как хвойные деревья).

Предпочтительно растение представляет собой хлебный злак, более предпочтительно пшеницу, рис, кукурузу, тритикале, овес или ячмень, еще более предпочтительно пшеницу.

Используемый в описании термин пшеница относится к любым видам рода Triticum, включая их прародителей, а также к их потомству, полученному при скрещиваниях с другими видами. Пшеница включает гексаплоидную пшеницу, которая характеризуется геномной организацией AABBDD, составленной из 42 хромосом, и тетраплоидную пшеницу, которая характеризуется геномной организацией ААВВ, составленной из 28 хромосом. Гексаплоидная пшеница включает T. aestivum, T. spelta, T. macha, T. compactum, T. sphaerococcum, T. vavilovii и их межвидовые гибриды. Предпочтительным видом гексаплоидной пшеницы является T. aestivum ssp aestivum (также называемый пшеницей обыкновенной). Тетраплоидная пшеница включает T. durum (также упоминаемый в описании как твердая пшеница или Triticum turgidum ssp. durum), T. dicoccoides, T. dicoccum, T. polonicum и их межвидовые гибриды. Кроме того, термин пшеница включает возможных прародителей гексаплоидного или тетраплоидного Triticum sp., таких как Т. uartu, Т. топососсит или Т. boeoticum, в отношении А-генома, Aegilops speltoides в отношении B-генома и Т. tauschii (также известного как Aegilops squarrosa или Aegilops tauschii) в от

- 19 031178 ношении D-генома. Особенно предпочтительными прародителями являются источники A-генома, еще более предпочтительно источником A-генома является Т. топососсит. Сорт пшеницы для применения в настоящем изобретении может относиться, но этим не ограничиваясь, к любому из вышеперечисленных видов. Также охватываются растения, которые получают общепринятыми методами с использованием Triticum sp. в качестве родителя при половом скрещивании с не являющимся Triticum видом (таким как рожь [Secale cereale]), включая, но этим не ограничиваясь, Triticale.

Используемый в описании термин ячмень относится к любым видам рода Hordeum, в том числе их прародителям, а также их потомству, полученному при скрещиваниях с другими видами. Предпочтительно, когда растением является растение вида Hordeum, которое возделывают с коммерческой целью, такое как, например, линия или сорт, или разновидность Hordeum vulgare, или подходящее для промышленного производства зерна.

Трансгенные растения, определяемые в связи с настоящим изобретением, включают растения (а также части и клетки указанных растений) и потомство растений, которые были генетически модифицированы с использованием рекомбинантных методов, что вызывает продукцию по крайней мере одного полипептида по настоящему изобретению в желаемом растении или органе растения. Трансгенные растения можно получить, используя известные в данной области методы, такие как те, которые в общем описаны в публикации A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), и Р. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

В предпочтительном варианте осуществления трансгенные растения являются гомозиготными по каждому и всякому гену, который был введен (трансгену), так что их потомство не расщепляется в отношении желаемого фенотипа. Трансгенные растения могут также быть гетерозиготными по введенному трансгену(ам), такими как, например, в потомстве F1, которое было выращено из гибридного семени. Такие растения могут дать преимущества, такие как гибридная сила, что хорошо известно в данной области техники.

Были описаны четыре основных способа непосредственной доставки гена в клетки: (1) химические способы (Graham et al., 1973); (2) физические способы, такие как микроинъекция (Capecchi, 1980); электропорация (см., например, WO 87/06614, патент США № 5472869, патент США № 5384253, WO 92/09696 и WO 93/21335) и генная пушка (см., например, патент США № 4945050 и патент США № 5141131); (3) вирусные векторы (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis et al., 1988) и (4) рецепторопосредованные механизмы (Curiel et al., 1992; Wagner et al., 1992).

Способы увеличения скорости, которые могут быть использованы, включают, например, бомбардировку микрочастицами и т.п. Одним из примеров способа доставки трансформирующих молекул нуклеиновых кислот в клетки растения является бомбардировка микрочастицами. Обзор этого способа был представлен Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Небиологические частицы (микрочастицы) могут быть покрыты нуклеиновыми кислотами и доставлены в клетки посредством реактивной силы. Приводимые в качестве примеров частицы включают частицы, составленные из вольфрама, золота, платины и т. п. Особым преимуществом бомбардировки микрочастицами, помимо того, что она является эффективным способом воспроизводимой трансформации однодольных растений, является то, что не требуется ни выделения протопластов, ни чувствительности к инфицированию Agrobacterium. Системой доставки частиц, подходящей для применения в настоящем изобретении, является гелевая пушка для увеличения скорости PDS-1000/He, доступная от Bio-Rad Laboratories. Для бомбардировки незрелые зародыши или производные клетки-мишени, такие как щиток зародыша или каллюс из незрелых зародышей, можно разместить на твердой культуральной среде.

В другом альтернативном варианте осуществления можно стабильно трансформировать пластиды. Описанные способы трансформации пластид у высших растений включают доставку с использованием пушки для частиц ДНК, содержащей селектируемый маркер, и направление ДНК в геном пластиды посредством гомологичной рекомбинации (патенты США №№ 5451513, 5545818, 5877402, 5932479 и WO 99/05265).

Agrobacterium-опосредованный перенос является широко применимой системой для введения генов в клетки растений, поскольку ДНК можно ввести в ткани цельных растений, обходя тем самым необходимость в регенерации интактного растения из протопласта. Использование Agrobacteriumопосредованной интеграции в растения векторов для введения ДНК в клетки растений хорошо известно в данной области техники (см., например, патенты США №№ 5177010, 5104310, 5004863, 5159135). Кроме того, интеграция Т-ДНК является относительно точным способом, приводящим к небольшому числу перестановок. Область ДНК, подвергаемая переносу, определяется пограничными последовательностями, и находящаяся между ними ДНК обычно встраивается в геном растения.

Векторы для трансформации Agrobacterium способны к репликации в Е. coli, а также Agrobacterium, что позволяет производить подходящие манипуляции, как описано (Klee et al., Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, (editors), Springer-Verlag, New York, (1985): 179-203). Кроме того, технологические преимущества в векторах для Agrobacterium-опосредованного переноса генов улучшили расположение генов и сайтов рестрикции в векторах, облегчая конструирование векторов, способных экспрессировать различные гены, кодирующие полипептиды. Описанные векторы имеют удобные многолинкер

- 20 031178 ные области, фланкированные промотором и сайтом полиаденилирования для управления экспрессией встроенных генов, кодирующих полипептиды, и подходят для целей настоящего изобретения. Кроме того, для трансформаций можно использовать Agrobacterium, содержащую как готовые к действию, так и не готовые к действию гены Ti-плазмид. Для сортов растений, в отношении которых Agrobacteriumопосредованный способ трансформации является эффективным, он является предпочтительным способом вследствие легкости выполнения и заданного характера переноса генов.

Трансгенное растение, созданное способами трансформации с использованием Agrobacterium, обычно содержит единственный генетический локус на одной хромосоме. Такие трансгенные растения можно назвать гемизиготными по добавленному гену. Более предпочтительным является трансгенное растение, которое является гомозиготным по добавленному структурному гену; т. е. трансгенное растение, которое содержит два добавленных гена, один ген в одном и том же локусе на каждой хромосоме хромосомной пары. Гомозиготное трансгенное растение можно получить посредством полового скрещивания (самоопыления) представляющего собой независимый сегрегант трансгенного растения, которое содержит единственный добавленный ген, проращивания некоторых из полученных семян и анализа полученных растений на наличие представляющего интерес гена.

Также должно быть понятно, что два различных трансгенных растения можно также скрестить с получением потомства, которое содержит два независимо сегрегирующих экзогенных гена. Самоопыление соответствующего потомства может дать растения, которые являются гомозиготными по обоим экзогенным генам. Также предусматривается возвратное скрещивание с родительской формой растения и ауткроссинг с нетрансгенным растением, как и вегетативное размножение. Описания других способов селекции, которые обычно используются для различных признаков и зерновых культур, можно найти в публикации Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, J. Wilcox (editor) American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

Трансформации растительных протопластов можно добиться, используя способы, основанные на преципитации фосфатом кальция, обработке полиэтиленгликолем, электропорации и комбинациях этих обработок. Применение этих систем для различных сортов растений зависит от способности к регенерации этой конкретной линии растений из протопластов. Иллюстративные способы регенерации хлебных злаков из протопластов описаны (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

Другие способы трансформации клеток могут также использоваться и включают, но не ограничиваются ими, введение ДНК в растения прямым переносом ДНК в пыльцу, прямой инъекцией ДНК в репродуктивные органы растения или прямой инъекцией ДНК в клетки незрелых зародышей с последующей регидратацией обезвоженных зародышей.

Регенерация, развитие и выращивание растений из трансформантов в виде единичных растительных протопластов или из различных трансформированных эксплантов хорошо известно в данной области техники (Weissbach et al., Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, (1988)). Этот процесс регенерации и выращивания обычно включает стадии отбора трансформированных клеток, культивирования этих отдельных клеток с прохождением обычных стадий эмбрионального развития через стадии проростка с корнями. Трансгенные зародыши и семена регенерируют аналогично. Впоследствии полученные трансгенные проростки с корнями высаживают в подходящую среду для роста растений, такую как земля.

Развитие или регенерация растений, содержащих чужеродный экзогенный ген, хорошо известны в данной области техники. Предпочтительно регенерированные растения самоопыляются для обеспечения гомозиготных трансгенных растений. В противном случае пыльцу, полученную от регенерированных растений, переправляют в выращенные из семян растения агрономически важных линий. И наоборот, пыльцу от растений этих важных линий используют для опыления регенерированных растений. Трансгенное растение по настоящему изобретению, содержащее желаемую экзогенную нуклеиновую кислоту, выращивают, используя способы, хорошо известные квалифицированному в данной области техники специалисту.

Способы трансформации двудольных растений, главным образом, посредством использования Agrobacterium tumefaciens и получения трансгенных растений были опубликованы для хлопка (патенты США №№ 5004863, 5159135, 5518908); сои (патент США №№ 5569834 и 5416011); Brassica (патент США № 5463174); арахиса (Cheng et al., 1996) и гороха (Grant et al., 1995).

Способы трансформации хлебных злаков, таких как пшеница и ячмень, для внесения генетической вариации в растение посредством введения экзогенной нуклеиновой кислоты и регенерации растений из протопластов или незрелых зародышей растений хорошо известны в данной области техники (см., например, СА 2092588, AU 61781/94, AU 667939, патент США № 6100447, WO 97/048814, патент США № 5589617, патент США № 6541257, а другие способы изложены в WO 99/14314. Предпочтительно трансгенную пшеницу или ячмень получают посредством способов трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens. Векторы, несущие желаемую конструкцию нуклеиновой кислоты, можно вводить в клетки регенерируемой пшеницы - выращиваемых из тканей растений или эксплантов, или в подходящие растительные системы, такие как протопласты. Клетки регенерируемой пшеницы являются предпочтительно клетками из щитка незрелых зародышей, зрелых зародышей, происходящего из них каллю

- 21 031178 са или меристемы.

Для подтверждения присутствия трансгенов в трансгенных клетках и растениях можно выполнить амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) или анализ с использованием блоттинга по Саузерну, используя способы, известные квалифицированным в данной области техники специалистам. Продукты экспрессии трансгенов можно выявить любым из множества способов в зависимости от природы продукта, и они включают Вестерн-блоттинг или ферментный анализ. Одним особенно пригодным способом количественного анализа экспрессии белков и обнаружения репликации в различных тканях растений является использование репортерного гена, такого как GUS. После получения трансгенных растений их можно выращивать для получения тканей или частей растений, имеющих желаемый фенотип. Можно собрать ткань растения или части растения и/или собрать семя. Семя может служить в качестве ресурса для выращивания дополнительных растений с тканями или частями, имеющими желаемые характеристики.

Отбор с помощью маркера.

Отбор с помощью маркера является общепризнанным способом отбора гетерозиготных растений, необходимым при возвратном скрещивании с рекуррентным родителем в классической селекционной программе. Популяция растений в каждом поколении беккроссов будет гетерозиготной по представляющему интерес гену, обычно присутствующему в соотношении 1:1 в популяции беккроссов, и молекулярный маркер можно использовать для проведения различий двух аллелей гена. Посредством экстракции ДНК, например, из молодых проростков, и проверки с использованием специфического маркера на интрогрессированный желаемый признак осуществляют ранний отбор растений для дальнейшего возвратного скрещивания при концентрировании энергии и ресурсов на меньшем числе растений. Для дополнительного ускорения выполнения программы возвратного скрещивания зародыши из незрелых семян (через 25 дней после цветения) можно удалить и выращивать на питательной среде в стерильных условиях, вместо того, чтобы дать возможность полного созревания семени. Этот способ, называемый зародышевым спасением, используемый в сочетании с экстракцией ДНК на стадии трех листьев и анализом по крайней мере одного гена или аллеля Lr34, который придает растению повышенную резистентность к патогенам, делает возможным быстрый отбор несущих желаемый признак растений, которые можно выращивать до полного развития в теплице или поле для последующего дополнительного возвратного скрещивания с рекуррентным родителем.

В способах по настоящему изобретению может быть использован любой молекулярнобиологический метод, известный в данной области техники. Такие методы включают, но не ограничиваются ими, использование амплификации нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, гибридизацию нуклеиновых кислот с подходящим образом меченными зондами, анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCA), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE), гетеродуплексный анализ (НЕТ), анализ химического расщепления (ССМ), каталитическое расщепление нуклеиновых кислот или их комбинации (см., например, Lemieux, 2000; Langridge et al., 2001). Настоящее изобретение также включает применение методов с использованием молекулярного маркера для выявления полиморфизмов, сцепленных с аллелями (например) гена Lr34, который придает повышенную резистентность к патогенам растений. Такие способы включают выявление или анализ полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (RFLP), RAPD, полиморфизмов длин амплифицированных фрагментов (AFLP) и полиморфизмов микросателлита (простого повтора последовательности, SSR). Прочно сцепленные маркеры можно без труда получить способами, хорошо известными в данной области техники, такими как анализ сегрегантов повышенной объемности, обзор которого приведен Langridge et al. (2001).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является реакцией, в которой на основе полинуклеотидамишени создаются идентичные копии с использованием пары праймеров или совокупности праймеров, состоящей из прямого и обратного праймеров, и катализатора полимеризации, такого как ДНКполимераза, и, как правило, фермента термостабильной полимеразы. Способы ПЦР известны в данной области техники и сообщаются, например, в PCR (M.J. McPherson and S.G Moller (editors), BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, (2000)). ПЦР можно выполнить на кДНК, полученной на основе подвергнутой обратной транскрипции мРНК, выделенной из клеток растений, экспрессирующих ген или аллель Lr34, который придает повышенную резистентность к патогенам растений. Однако, как правило, легче выполнить ПЦР на геномной ДНК, выделенной из растения.

Праймером является последовательность олигонуклеотида, которая способна к гибридизации специфичным в отношении последовательности образом с последовательностью-мишенью и удлинению во время ПЦР. Ампликоны, или продукты ПЦР, или фрагменты ПЦР, или продукты амплификации представляют собой продукты удлинения, которые включают праймер и вновь синтезированные копии последовательностей-мишеней. Системы множественных ПЦР содержат множество наборов праймеров, что приводит к одновременной продукции более одного ампликона. Праймеры могут полностью соответствовать последовательности-мишени или они могут содержать внутренние несовпадающие основания, которые могут привести к введению сайтов распознавания/расщепления рестрикционным ферментом или каталитической нуклеиновой кислотой в специфические последовательности-мишени. Праймеры могут также содержать дополнительные последовательности и/или содержать модифицированные

- 22 031178 или меченые нуклеотиды для облегчения сбора или обнаружения ампликонов. Повторяющиеся циклы термической денатурации ДНК, отжига праймеров к комплементарным им последовательностям и удлинения подвергнутых отжигу праймеров с помощью полимеразы приводят к экспоненциальной амплификации последовательности-мишени. Термины мишень, или последовательность-мишень, или матрица относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, подвергаемым амплификации.

Способы прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам и их можно найти, например, в публикации Ausubel et al. (выше) и Sambrook et al. (выше). Секвенирование можно выполнить любым подходящим способом, например дидезоксисеквенированием, химическим секвенированием или их вариантами. Прямое секвенирование обладает преимуществом определения вариации в любой паре оснований конкретной последовательности.

TILLING.

Растения по настоящему изобретению можно получить, используя способ, известный как TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes - выявление индуцированных локальных повреждений в геномах). На первой стадии в популяции растений индуцируют вводимые мутации, такие как новые изменения единственной пары оснований, посредством обработки семян (или пыльцы) химическим мутагеном, а затем развития растений до поколения, у которого мутации будут стабильно наследоваться. ДНК экстрагируют, а семена сохраняют от всех членов популяции для создания ресурса, повторный доступ к которому может быть в течение продолжительного периода.

В случае анализа с использованием TILLING конструируют ПЦР-праймеры для специфической амплификации представляющего интерес одного гена-мишени. Специфичность особенно важна, если мишенью является член семейства генов или часть полиплоидного генома. Еще можно использовать меченные красителем праймеры для амплификации продуктов ПЦР на основе объединенной ДНК от множества индивидуумов. Эти продукты ПЦР подвергают денатурации и повторному отжигу для того, чтобы обеспечить возможность образования несовпадающих пар оснований. Ошибочные спаривания, или гетеродуплексы, представляют как природные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) (т.е. несколько растений из популяции, по-видимому, несут один и тот же полиморфизм), так и индуцированные SNP (т.е. лишь редкие отдельные растения, по-видимому, демонстрируют мутацию). После образования гетеродуплекса использование эндонуклеазы, такой как Cel I, распознающей и расщепляющей ошибочно спаренную ДНК, является ключом к обнаружению новых SNP в подвергнутой TILLING популяции.

Используя этот подход, можно скринировать многие тысячи растений для идентификации любого индивидуума с изменением одного основания, а также небольшими инсерциями или делециями (1-30 п.о.) в любом гене или конкретной области генома. Размер исследуемых геномных фрагментов может находиться в диапазоне где-нибудь от 0,3 до 1,6 т.п.о. При использовании 8-кратного объединения, фрагментов размеров 1,4 т.п.о. (без учета концов фрагментов, на которых выявление однонуклеотидного полиморфизма является проблематичным вследствие шума) и 96 дорожек в каждом исследовании, это сочетание делает возможным скринирование вплоть до миллиона пар оснований геномной ДНК в одном анализе, что делает TILLING способом с высокой пропускной способностью.

TILLING дополнительно описан у Slade и Knauf (2005) и Henikoff et al. (2004).

В дополнение к возможности эффективного выявления мутаций технология TILLING с высокой пропускной способностью является идеальной для обнаружения природных полиморфизмов.

Следовательно, детальное исследование неизвестной гомологичной ДНК по образованию гетеродуплекса с известной последовательностью выявляет число и расположение полиморфных сайтов. Идентифицируют как изменения нуклеотидов, так и небольшие инсерции и делеции, включая, по крайней мере, некоторые полиморфизмы числа повторов. Этот способ был назван Ecotilling (Comai et al., 2004).

Каждый SNP регистрируют в соответствии с его приблизительным расположением внутри небольшого числа нуклеотидов. Таким образом, каждый гаплотип можно заархивировать на основе его изменчивости. Данные о последовательностях можно получить с помощью относительно небольшого пошагового усилия, используя аликвоты той же самой амплифицированной ДНК, что и ДНК, которую используют для анализа расщепления ошибочных спариваний. Прямой или обратный секвенирующий праймер для единственной реакции выбирают в соответствии с его близостью к полиморфизму. Программное обеспечение Sequencher выполняет множественное совмещение и обнаруживает изменение основания, которое в каждом случае подтверждает полоса в геле.

Ecotilling можно выполнить легче, чем полное секвенирование, способ, в настоящее время используемый для обнаружения наибольшей части SNP. Можно скринировать пластинки, содержащие ранжированную экотипическую ДНК, а не пулы ДНК из подвергнутых мутагенезу растений. Поскольку выявление проводят на гелях с разрешением почти на уровне пары оснований, а фоновые картины являются однородными по всем дорожкам, можно сопоставить полосы одинакового размера, выявляя и генотипируя, таким образом, SNP в одну стадию. В этом способе простым и эффективным является окончательное секвенирование SNP, сделанное еще в большей степени таковым тем обстоятельством, что аликвоты тех же самых продуктов ПЦР, которые использовались для скринирования, можно подвергнуть ДНКсеквенированию.

- 23 031178

Антитела.

Используемый в данном изобретении термин антитело включает поликлональные антитела, моноклональные антитела, биспецифические антитела, диатела, триатела, антитела-гетероконъюгаты, химерные антитела, включающие интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны к связыванию антигенной детерминанты, и другие антителоподобные молекулы.

Термин специфически связывается относится к способности антитела к связыванию по крайней мере с одним полипептидом по настоящему изобретению, но не в значительной степени с известными белками в исследуемом образце/организме.

Используемый в описании термин эпитоп относится к области полипептида по настоящему изобретению, которая связывается антителом. Эпитоп можно ввести животному для выработки антител против эпитопа, однако предпочтительно, когда антитела по настоящему изобретению специфически связываются с областью эпитопа в рамках полного полипептида.

Если требуются поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее (например, мышь, кролика, козу, лошадь и т.д.) иммунизируют иммуногенным полипептидом по настоящему изобретению. Сыворотку от иммунизированного животного собирают и обрабатывают в соответствии с известными процедурами. Если содержащая поликлональные антитела сыворотка содержит антитела к другим антигенам, то поликлональные антитела можно очистить методом иммуноаффинной хроматографии. Методы получения и обработки поликлональной антисыворотки известны в данной области техники. Для создания таких антител настоящим изобретением также обеспечиваются полипептиды по настоящему изобретению или их фрагменты, гаптенизированные другим полипептидом, для применения в качестве иммуногенов у животных.

Моноклональные антитела, направленные против полипептидов по настоящему изобретению, могут также быть легко получены квалифицированным в данной области специалистом. Общая методология получения моноклональных антител с помощью гибридом хорошо известна. Иммортализованные антителопродуцирующие линии клеток можно создать путем слияния клеток, а также с помощью других методов, таких как непосредственная трансформация В-лимфоцитов онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эпштейн-Барра. Полученные панели моноклональных антител можно скринировать на различные свойства; т. е. на изотип и сродство к эпитопу.

Альтернативный метод включает скрининг библиотек фагового дисплея, в которых, например, фаги экспрессируют на поверхности своих оболочек scFv-фрагменты с большим множеством гипервариабельных участков (CDR). Этот метод хорошо известен в данной области техники.

В данной области техники известны другие методы продуцирования антител по настоящему изобретению.

Антитела по настоящему изобретению можно связать с твердой подложкой и/или упаковать внутрь наборов в подходящем контейнере вместе с подходящими реагентами, контролями, инструкциями и т. п.

В варианте осуществления антитела по настоящему изобретению являются различимо мечеными. Приводимые в качестве примеров различимые метки, которые позволяют напрямую определить связывание антител, включают радиоактивные метки, флуорофоры, красители, магнитные шарики, хемилюминесцентные вещества, коллоидные частицы и т. п. Примеры меток, которые позволяют напрямую определить связывание антител, включают ферменты, субстраты для которых могут предусматривать окрашенный или флуоресцентный продукт. Дополнительные приводимые в качестве примеров различимые метки включают ковалентно связанные ферменты, способные обеспечить различимый сигнал - продукт после добавления подходящего субстрата. Примеры ферментов, подходящих для использования в конъюгатах, включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, малатдегидрогеназу и т.п. Если конъюгаты антитело-фермент не являются коммерчески доступными, то их легко получить с использованием методик, известных квалифицированным в данной области специалистам. Кроме того, приводимые в качестве примеров различимые метки включают биотин, который связывается с высоким сродством с авидином или стрептавидином; флуорохромы (например, фикобилипротеины, фикоэритрин и аллофикоцианины; флуоресцеин и техасский красный), которые могут быть использованы в клеточном сортере с активацией флуоресценции; гаптены и т. п. Предпочтительно различимая метка, например биотин, дает возможность прямого измерения в люминометре для планшетов. Такие меченые антитела можно использовать в методах, известных в данной области, для выявления полипептидов по настоящему изобретению.

Примеры

Пример 1. Материалы и методы.

Микроскопический анализ инфицирования всходов ржавчинным грибом.

Растения выращивали в камере искусственного климата, поддерживаемого при 4-8°C, в 12-часовом режиме света и темноты. Всходы заражали на стадии двух листьев, используя культуру 467 возбудителя листовой ржавчины, переносили во влажную камеру (с температурным диапазоном, составляющим 1620°C) на 24 ч и возвращали в камеру искусственного климата, поддерживаемого при 4-8°C. Для визуализации под микроскопом внутренних инфицированных структур ткань первого листа подвергали автоклавированию в 1М KOH, промывали в 50 мМ KPO₄ и окрашивали 50 мМ раствором KPO₄ (pH 7,8), содержащим 20 мкг/мл агглютинина зародыша пшеницы (WGA), конъюгированного с флуорофором alexa 488

- 24 031178 (Invitrogen, USA). Всю окрашенную WGA-alexa ткань исследовали при возбуждении синим квантом света.

Выделение РНК для полуколичественной ПЦР и Нозерн-блоттинга.

Общую РНК экстрагировали из листьев, используя раствор тризола (38% фенола, 0,8М тиоцианат гуанидина, 0,4М тиоцианат аммония, 0,1М ацетат натрия, pH 5, и 10% глицерина). Первую цепь кДНК для ОТ-ПЦР синтезировали, используя обратную транскриптазу Superscript II (Invitrogen). Специфический фрагмент в случае полуколичественной ОТ-ПЦР 5'-конца PDR амплифицировали, используя праймеры

Lr34_RT_fl: 5'catcaagatttcaccgcctgtgc-3' (SEQ ID N0:12) и Lr34_RT_r1: 5'gaagcctagcaacttcacgaggc-3' (SEQ ID N0:13) при температуре отжига, составляющей 70°C.

Для гибридизационного анализа с использованием Нозерн-блоттинга 15 мкг общей РНК в каждом образце блоттировали на мембрану (Hybond-XL, Amersham Biosiences). Зонд HvS40 (Spielmeyer et al., 2002) помечали ³²P при 65°C, используя набор NEBlot® (New England BioLabs). Мембраны промывали раствором, содержащим 0,5xSSC, 0,1% SDS, при 65°C и экспонировали на гиперчувствительные рентгеновские пленки (BioMax MS film, Kodak).

Быстрая амплификация концов кДНК (RACE).

Для точного определения начала кДНК использовали подход с 5' RACE. Поли-А⁺ РНК очищали из 300 мкг общей РНК, используя мининабор для мРНК Oligotex® (Qiagen). Обратную транскрипцию проводили, используя набор для амплификации кДНК в случае RACE SMART™ (Clonetech Laboratories), причем адаптер был лигирован к 5'-концу кДНК. Амплификацию 5'-конца проводили, используя специфичный для адаптера праймер и специфичный для гена праймер ABC_5RACE_r2: 5'-gcggggcccacaatcatctcggc-3' (SEQ ID N0:14).

Пример 2. Генетическое картирование Lr34.

Растительные материалы.

Три популяции беккроссов были получены и использованы для генетического картирования Lr34. В табл. 2 суммированы данные, касающиеся родительских форм растений для возвратного скрещивания, оцененных фенотипов, размера популяций и маркеров, каптированных в случае каждой популяции.

Таблица 2 Три популяции беккроссов, которые были использованы для генетического картирования Lr34 с высокой разрешающей способностью

+1.г14 родитель	-Lr34 родитель	+Ll‘34 линия беккроссов	происхождение	фенотипическая оценка	число растений	картированные маркеры
Forno	Arina	Arina Lr34 (Arina *3/Fomo)	Швейцарский озимый сорт пшеницы	Некроз верхушки листа, инфицирование возбудителем листовой ржавчины	1728	ВЕ493812, SWSNP1, SWSNP2, SWSNP3, SWDEL1, SWDEL2, SWDEL3, SWM10, csLVMS
PI58548	Thatcher	RL6058 (Thatcher*6/PI58548)	Китайский местный сорт	Листовая, желтая и стеблевая ржавчина; настоящая мучнистая роса	1152	Gwml220,BJ280740, csLVD13,csLVD2, csLVMS, BF473324, csLV34
Parula	Avocet	Avocet Lr34 (Avocet*5/Parula)	CIMMYT	Листовая и желтая ржавчина; некроз верхушки листа	1152	Gwml220, csLVDB, csLVD2, csLVEl 7, csLVMS, csLV34

Популяция ArinaxForno с точным картированием была создана посредством скрещивания в высокой степени резистентного швейцарского озимого сорта пшеницы Forno с чувствительным швейцарским озимым сортом пшеницы Arina. Последующее возвратное скрещивание с Arina и несколько поколений, полученных путем самоопыления, дали в результате 103 растения, которые были F4 при использовании двух возвратных скрещиваний (BC2F4), содержащих Lr34 и в среднем 12,5% генома Forno в остальном генетическом фоне Arina. Эти растения анализировали на наличие хромосомного сегмента Lr34 из Forno, используя два фланкирующих RFLP маркера BE493812 и BF473324. Одно из этих растений, содержащее область Lr34, снова скрещивали с Arina, и потомство самоопылялось с получением 1728 растений BC3F2, имеющих в среднем 6,25% генома Forno. Рекомбинанты отбирали, используя два фланкирующих маркера BE493812 и SWM10. Фенотипирование популяции ArinaxForno проводили в Agroscope Reckenholz, Zurich, Швейцария, на протяжении 2006 (BC3F3) и 2007 (BC3F4). Заражение сериями инфекций, содержащими смесь чувствительных сортов, осуществляли с использованием урединиоспор швейцарских изолятов возбудителей листовой ржавчины с № 90035, 91047, 93003, 93012, 94015, 95001, 95012, 95028, 95037, 95039, 95219, 95251, 96002, 96004, 96209 и 96257. Оценку болезни проводили в двух повторах.

Ряд картирований ThatcherxRL6058 (Thatcher Lr34) и AvocetxAvocet Lr34 с высокой разрешающей

- 25 031178 способностью, оценка болезни в Австралии и в CIMMYT, Мексика, были описаны Lagudah и др. (2006) и Spielmeyer и др. (2002). Другие генетические линии, использованные в этой работе, были почти изогенными линиями Thatcher, Thatcher Lr34 (=RL6058, Thatcherx6/PI5848), Arina, Arina Lr34 (Arinax3/Forno).

Разработка маркеров для генетического картирования.

Были созданы новые молекулярные маркеры для картирования посредством использования информации о синтении у риса, модельного дерна Brachypodium sylvaticum и диплоидного источника D-генома Aegilops tauschii, как описано Bossolini и др. (2006).

Для получения физической информации о целевой зоне для Lr34 скринировали подвергнутую частичному фингерпринтингу библиотеку бактериальных искусственных хромосом (ВАС) Aegilops tauschii (J. Dvorak, UC Davis), используя EST (маркерные экспрессируемые последовательности) пшеницы, относящиеся к генам из синтенного участка риса и Brachypodium sylvaticum. Тринадцать клонов ВАС из трех различных контигов (HI 057C6/HD036L7/HDl02К14/Н1056G21/HDO62G18/Н1031F14/HI135В2/RI

004115/RI04214/HI148С23/ВВО45В13/НВО67N4/ВВО62G18) были секвенированы посредством низкопроходного секвенирования, используя секвенатор ABI® 3730 (Applied Biosystems). Последовательности составляли, используя PHRAP, и исследовали на простые повторы последовательностей (SSR). SSR амплифицировали с помощью конструируемых праймеров во фланкирующих областях (табл. 3).

Продукты ПЦР анализировали, используя ДНК-секвенатор 4200 LiCOR®. Полиморфные SSR были идентифицированы и обозначены префиксами SWM или cs. ДНК-маркирующие сайты были созданы посредством конструирования праймеров на низкокопийных последовательностях. Специфичные для локуса зонды были секвенированы и исследованы на однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и инсерции/делеции (InDel). Маркеры на основе полиморфных SNP и InDel были обозначены как Swiss Wheat SNP (SWSNP) (SNP, относящийся к швейцарской пшенице) и Swiss Wheat Deletion (SWDEL) (делеция, относящаяся к швейцарской пшенице) соответственно. В табл. 3 суммирована информация, касающаяся последовательностей праймеров для выявления маркеров на основе ПЦР, картированных в популяциях. Дополнительные низкокопийные зонды, csLVD2, csLVD13, csLVE17, для анализа RFLP были выделены из общих плазмидных библиотек из контигов ВАС Ae tauschii посредством скрининга общей геномной ДНК из Ae tauschii. В качестве возможных низкокопийных зондов были выбраны рекомбинантные плазмиды, в случае, если не были выявлены ДНК-гибридизационные сигналы после экспонирования в течение ночи.

Используя эти генетические маркеры и популяции для картирования Lr34, картирование с высокой разрешающей способностью выявило целевую зону, составляющую 0,15 сМ (сантиморганид), для Lr34, фланкированную генетическими маркерами XSWSNP3 и XcsLVE17 (фиг. 1). Была установлена косегрегация нескольких маркеров (фиг. 1) с Lr34.

Пример 3. Мутагенез и выделение мутантов Lr34.

Семена изолинии Lr34, Lalbahadur Lr34, облучали, используя источник ⁶⁰Со в дозе, составляющей 20 килорад, и последующие поколения М1-М5 оценивали в CIMMYT, Мексика, и в Австралии, как опубликовано у Spielmeyer et al. (2002). В гамма-облученной популяции было идентифицировано восемь мутантов. Их анализировали, используя некоторые из новых генетических маркеров (пример 2). Из восьми мутантов шесть были интерстициальными делециями, охватывающими локус Lr34/Yr18/Pm38/Ltn1, тогда как два мутанта, обозначенные m19 и m21, не продемонстрировали утрату маркеров в упомянутом выше генетическом локусе. Поэтому мутанты m19 и m21 были подвергнуты дополнительному анализу с использованием вновь идентифицированных маркеров и косегрегирующихся генов.

В случае применения азида натрия были созданы мутанты с использованием семени от одного колоса растения RL6058, выращенного в оранжерее для размножения чистых линий семенных растений для мутагенеза. Семена предварительно замачивали в течение 12 ч при 4°C до обработки зерен в насыщенном кислородом растворе 7 мМ азида натрия, при pH 3,0, в течение 2 ч. Зерна промывали и высаживали в поле. Потомков М2 высаживали в виде рядов отдельных колосьев и оценивали на инфицирование возбудителем желтой, листовой и стеблевой ржавчины в поле в присутствии патогенов.

- 26 031178

Таблица 3

Последовательности праймеров из молекулярных маркеров, используемых в этом исследовании

название маркера	прямой праймер	обратный праймер	тип маркера	Tm [°C]
SWSNP1	5'-catctttcgtatacatga gaaac-3' (SEQ ID N0:15)	5'-gtgtcgattcatgtgag atgc-3' (SEQ ID N0:16)	SNP c->t	60
SWSNP2	5'-cattatgttagcagct tagcg-3' (SEQ ID N0:17)	5'-ccaaccatcattttggag catg-3' (SEQ ID N0:18)	SNP c->t	60
SWSNP3	5'-gta gat cgt gtc gtg ttc aac-3' (SEQ ID N0:19)	5'-ctg eta ate eta agt aac get c-3' (SEQ ID N0:20)	SNP t->a	65
SWDEL1	5'-cgt gag caa gac atg ggc g-3' (SEQ ID N0:21)	5'-gct аса get etg aaa eta cac-3' (SEQ ID N0:22)	6 bp InDei	66.2
SWDEL2	5'gat ttg cac gtt gat gaa acc ag-3' (SEQ ID N0:23)	5'-cag aat gaa gtt taa cct ggc ctg-3’ (SEQ ID N0:24)	1 bp InDei	60
SWDEL3	5'- ggc tgg eta eta ega ega cg-3' (SEQ ID N0:25)	5’-atg gtc ttt ttt cct tea gcc-3' (SEQ ID N0:26)	180 bp InDei	65
SWM10	5'-gcc tac ttt gac ggc ata tgg-3' (SEQ ID N0:27)	5'-cca tet tga cat act ttg gcc ttc c-3' (SEQ ID N0:28)	SSR (ca)25	60
csLVMS	5’-etc cct ccc gtg agt ata ttc-3’ (SEQ ID N0:29)	5’-ate aaa ate cca ttg cct gac-3’ (SEQ ID N0:30)	SSR (at)6tt(at)6	62
csLV34	5'-gtt ggt taa gac tgg tga tgg-3' (SEQ ID N0:31)	5’-tgc ttg eta ttg etg aat agt-3' (SEQ ID N0:32)	STS	60
название маркера	прямой праймер	обратный праймер	тип маркера	Tm [°C]
SWSNPl_f	5'-cat ett teg tat аса tga gaa ac-3' (SEQ ID N0:33)	5'-gtg teg att cat gtg aga tgc-3' (SEQ ID N0:34)	SNP c->t	60
SWSNP2_f	5'-cat tat gtt age age tta gcg-3' (SEQ ID N0:35)	5'-cca acc ate att ttg gag cat g-3' (SEQ ID N0:36)	SNP c->t	60
SWSNP3_f	5'-gta gat cgt gtc gtg ttc aac-3' (SEQ ID N0:37)	5'-ctg eta ate eta agt aac get c-3' (SEQ ID N0:38)	SNP t->a	65
SWDELlf	5'-cgt gag caa gac atg ggc g-3' (SEQ ID N0:39)	5'-gct аса get etg aaa eta cac-3' (SEQ ID N0:40)	6 bp InDei	66.2
SWDEL2_f	5'gat ttg cac gtt gat gaa acc ag-3' (SEQ ID N0:41)	5'-cag aat gaa gtt taa cct ggc ctg-3’ (SEQ ID N0:42)	1 bp InDei	60
SWDEL3_f	5'- ggc tgg eta eta ega ega cg-3' (SEQ ID N0:43)	5'-atg gtc ttt ttt cct tea gcc-3' (SEQ ID N0:44)	180 bp InDei	65
SWMIOf	5'-gcc tac ttt gac ggc ata tgg-3' (SEQ ID N0:45)	5'-cca tet tga cat act ttg gcc ttc c-3' (SEQ ID N0:46)	SSR (ca)₂₅	60

Было выделено шесть чувствительных мутантов, и для них определены степени инфицирования, составляющие от 70 до 90MS, в случае возбудителя желтой ржавчины злаков, от 50 до 80MS - в случае возбудителя листовой ржавчины и 50MS - в случае возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы в полевых условиях. Два мутанта 4С (глицин на глутаминовую кислоту в положении 1030 аминокислоты SEQ ID NO: 1) и 2G (глицин на аспарагиновую кислоту в положении 889 аминокислоты SEQ ID NO: 1) были

- 27 031178 результатом транзиций одиночных нуклеотидов с изменением одной аминокислоты в пределах второго предсказанного нуклеотидсвязывающего домена (фиг. 3 и 5). Эти мутанты продемонстрировали лишь частичную утрату резистентности к возбудителю листовой ржавчины при микроскопическом исследовании (пример 1). Мутант 2В включал транзицию одного нуклеотида в экзоне 11 (фиг. 3), которая имела следствием ранний стоп-кодон. Три мутанта 3Е, 4Е и 2F были результатом транзиций одиночных нуклеотидов на границах сплайсинга, имеющих следствием транскрипты без сплайсинга. Сохранение интронов в мутантах 3Е и 4Е вводило ранние стоп-кодоны вблизи 5'-конца, которые в соответствии с предсказаниями приводят к нефункциональному белку. На микроскопическом уровне мутанты 3Е и 4Е были в полной мере чувствительны к возбудителю листовой ржавчины и неотличимы от чувствительной почти изогенной линии Thatcher. Транскрипт мутанта 2F утратил второй последний экзон (фиг. 3), что в соответствии с предсказаниями приводит к делеции 85 аминокислот из второго трансмембранного домена. Мутант 2F был более чувствительным к возбудителю листовой ржавчины, чем чувствительный контрольный сорт Thatcher во время раннего инфекционного процесса.

Отсутствие резистентности, являющейся следствием утраты функционального белка Lr34, наблюдаемое при исследовании мутаций, согласуется с анализом гена Lr34 из сорта Jagger. Jagger имеет Lr34сцепленные аллели маркера csLV34, но является чувствительным к возбудителям листовой ржавчины и желтой ржавчины злаков. С помощью секвенирования гена Lr34 в Jagger была идентифицирована точковая мутация G/T, которая имела следствием преждевременный стоп-кодон. Следовательно, в предсказываемом белке сорта Jagger отсутствуют 185 аминокислот С-конца, и эта аллель, наиболее вероятно, не является функциональной. Эта точковая мутация, вероятно, возникла в резистентном сорте, который нес аллель +Lr34.

Пример 4. Физическая информация о целевой зоне и идентификация гена Lr34.

Две библиотеки ВАС +Lr34 (резистентного) сорта Chinese Spring и -Lr34 (чувствительного) сорта Renan (INRA, Toulouse, Франция) скринировали, используя зонды для ПЦР, охватывающие целевую зону между двумя фланкирующими маркерами SWSNP3 и csLVE17. Простирающаяся на расстоянии 420 т.п.о. физическая зона, содержащая оба фланкирующих маркера, была полностью секвенирована в резистентном гексаплоидном сорте пшеницы Chinese Spring. Для этого четыре клона ВАС Chinese Spring, а именно 345С22, 93N17, 1964С18 и 413N16, и клон 656106 ВАС Renan были отобраны и полностью секвенированы в Genome Sequencing Center, St.Louis, МО, США.

Анализ последовательностей выявил присутствие богатого генами участка, содержащего десять открытых рамок считывания (фиг. 2), кодирующих белки, гомологичные двум гликозилтрансферазам, двум цистеинпротеиназам, двум киназам рецепторов лектинов, двум белкам - цитохромам Р450, переносчику гексоз и транспортеру АТФ-связывающих кассет (АВС-транспортеру). Ни один из этих генов не присутствовал в синтенной области в Brachypodium sylvaticum, и установлено, что лишь переносчик гексоз является консервативным в гомологичной области на хромосоме 6 риса (ген риса Os06g0141000). Существенно и неожиданно, что ни один из генов, по-видимому, не был геном типа LRR-NBS класса, обычно ассоциируемого с резистентностью к патогенам у растений. Соответственно ни одна из кодирующих областей не была очевидным кандидатом на кодирование Lr34.

Для определения того, соответствует ли один из этих генов-кандидатов Lr34, были секвенированы специфичные для локуса амплифицированнные с помощью ПЦР области, соответствующие десяти генам-кандидатам в каждом из восьми мутантов Lr34. Гены-кандидаты были амплифицированы с помощью разработки специфичных для локуса ПЦР-зондов на основе резистентных и чувствительных сортов, а также на основе восьми мутантов Lr34, и секвенированы. Мутантами были индуцированные азидом шесть мутантов в генетическом фоне Thatcher Lr34 и два индуцированных гамма-облучением мутанта в фоне Lalbahadur Lr34 (пример 3).

Все мутантные линии продемонстрировали изменение последовательности в открытой рамке считывания, кодирующей АВС-транспортер (фиг. 3). Все три индуцированных азидом мутанта 2F, 3Е и 4Е имели транзицию G на А на границе интрон - экзон, приводящей к мутациям в сайте сплайсинга (фиг. 7, демонстрирующая оставшиеся интроны). Транзиции в двух индуцированных азидом мутантах 2G и 4С приводили к заменам аминокислот, и линия 2В несла преждевременный стоп-кодон в экзоне 11. Каждый из двух индуцированных гамма-облучением мутантов m19 и m21 продемонстрировал делецию размером 1 п.о. в экзоне 10 и 23 соответственно, ведущую к сдвигам рамки и преждевременным стоп-кодонам (фиг. 3).

Для исключения возможности дополнительных сайтов мутаций в других косегрегирующихся генах были секвенированы ДНК-фрагменты, охватывающие 12,7 т.п.о., других девяти генов-кандидатов и межгенные области в четырех индуцированных азидом мутантах 2В, 3Е, 4С и 4Е, причем какие-либо дополнительные изменения в последовательностях не обнаружены. Аналогично, с помощью секвенирования установлено, что созданные в результате гамма-облучения мутанты m19 и m21 не несут каких-либо изменений в последовательностях кодирующих областей остальных девяти генов-кандидатов. Следовательно, возможность того, что восемь мутаций, обнаруженных в ABC-транспортере, обусловлены очень высокой частотой мутаций в этих линиях, можно было исключить, и авторы настоящего изобретения сделали вывод, что АВС-транспортер является ответственным за придание стойкой резистентности на

- 28 031178 основе Lr34 к болезням.

Была установлена косегрегация Lr34 с частичной резистентностью взрослых растений к желтой ржавчине злаков (Yr18), настоящей мучнистой росе (Pm38), а также некрозу верхушки листа (Ltn1). Все мутанты в виде взрослых растений были более чувствительными к желтой ржавчине злаков и настоящей мучнистой росе, что приписывалось утрате Yr18 и Pm38, а также демонстрировали полную или частичную утрату Ltn1. Эти наблюдения представляли важное открытие, заключающееся в том, что восемь независимых мутаций в пределах единственного гена ABC-транспортера, кодирующего резистентность на основе Lr34, также являются причиной Yr18/Pm38/Ltn1, и показали, что один ген придает резистентность к множеству патогенов.

Кодирующая белок последовательность Lr34 охватывала 11,7 т.п.о. в геноме пшеницы. Секвенирование всей кДНК и сравнение нуклеотидной последовательности с геномной последовательностью (SEQ ID NO: 3) выявили, что Lr34 имеет 24 экзона. Ген содержал 23 интрона, включая большой интрон размером 2,5 т.п.о. между экзонами 4 и 5 (фиг. 3). Белок, кодируемый Lr34 из резистентного сорта Chinese Spring, содержал 1401 аминокислоту (SEQ ID NO: 1), тогда как белок из чувствительного сорта Renan содержал 1402 аминокислоты (SEQ ID NO: 4, фиг. 4). Сравнение аминокислотной последовательности с другими ABC-транспортерами показало, что белки Lr34 относятся к подсемейству ABC-транспортеров белков PDR (плейотропной лекарственной резистентности). Белки PDR имеют общую основную структуру, содержащую два различных домена: цитозольный нуклеотидсвязывающий домен (NBD), который содержит консервативные мотивы Уокера типа А и Уокера типа В, вовлеченные в связывание АТФ и гидролиз, и гидрофобный трансмембранный домен (TMD), вовлеченный в перемещение субстрата. Оба домена присутствуют в двух повторах, поэтому структуру PDR обозначают [NBD-TMD]2 (фиг. 5).

Семейство PDR обнаружено лишь у грибов и растений. Пятнадцать PDR-подобных генов были идентифицированы в геноме Arabidopsis и 23 члена были описаны для риса (Crouzet et al., 2006). Известно, что PDR придают резистентность к различным лекарственным средствам, но мало известно о субстратной специфичности этого класса белков (Rogers et al., 2001). Ранее приводились данные о том, что PEN3/PDR8, PDR из Arabidopsis вносит вклад в резистентность к патогенам у растений, не пораженных микроорганизмами (Stein et al., 2006). Ближайшим гомологом Lr34 в рисе является PDR23, демонстрирующий 88% идентичность на аминокислотном уровне (табл. 4). У Arabidopsis Lr34 демонстрирует наибольшую гомологию с двумя транспортерами PDR5 и PDR9, с 56% идентичностью. Совмещение этих аминокислотных последовательностей представлено на фиг. 6.

Таблица 4

Процент идентичности аминокислот Lr34 пшеницы с гомологами Lr34 из других видов растений

Вид	№ доступа в GenBank	% идентичности
Рис	EAZ20654	78
	EAY83289	76
	CAD59575	55

Табак	САН39853 (NtPDR3)	56

Виноград	CAN65735	56

Arabidopsis	NP 181265 (PDR5)	56
	NP 190916 (PDR9)	55
	DAA00881 (PDR13)	54
	DAA00869 (PDR2)	52
	NP 176196 (PDR8/PEN3)	50

Авторы настоящего изобретения затем определили различия в последовательности между аллелями Lr34 в сортах с резистентностью на основе Lr34 или без такой резистентности. Сравнение геномных последовательностей PDR в +Lr34 сорта Chinese Spring и в -Lr34 французского озимого сорта пшеницы Renan выявило, что ген присутствует в обоих сортах пшеницы. Существовало только три полиморфизма в кодирующих последовательностях между этими двумя сортами (фиг. 3). Один SNP локализован в большом интроне 4. Два других изменения в последовательности были локализованы в экзонах 11 и 12. Делеция трех пар оснований TTC, обнаруженная в экзоне 11 в Chinese Spring, приводила к делеции остатка фенилаланина, тогда как второй SNP в экзоне 12 заменял тирозин на гистидин в резистентном сорте. Оба различия в последовательности, локализованные в экзонах, оказывают влияние на первый трансмембранный домен, соединяющий два нуклеотидсвязывающих домена, и они могут изменять структуру и специфичность связывания транспортера (фиг. 4). Сравнение последовательностей размером 2 т. п.о. областей предполагаемых промоторов не выявило каких-либо различий межу аллелями резистентного и чувствительного сортов.

Для выяснения, какое из этих трех различий в последовательности было необходимо для определе

- 29 031178 ния резистентности, было определено диагностическое значение на совокупности из +/-Lr34 генотипов, поставляемых из различных Lr34 селекционных линий (табл. 5). Все +Lr34 линии продемонстрировали такой же гаплотип, как и Chinese Spring, а гаплотипы всех -Lr34 линий были идентичны гаплотипу Renan. Следовательно, все три описанные различия в последовательности могут быть важны для определения резистентности, придаваемой Lr34, хотя нет данных, что SNP в интроне 4 оказывает влияние на эффективность сплайсинга любого из аллелей. Учитывая, что один и тот же гаплотип был установлен в гене PDR-ABC-транспортера Lr34 в случае яровых пшениц из Южно/Североамериканских селекционных программ, озимых пшениц из Европы и азиатских Lr34 генотипов (табл. 5), авторы настоящего изобретения делают вывод, что единственный случай, по-видимому, является ответственным за возникновение Lr34 в местном сорте пшеницы. Доказательство связи американских и европейских пшениц, содержащих Lr34, прослеживается в основополагающих родственных сортах, Mentana и Ardito, созданных в начале прошлого столетия (Kolmer et al., 2008).

При оценке диагностического потенциала SNP, локализованного в интроне 4, был идентифицирован третий аллель. Озимые сорта пшеницы Zinal, Allalin и Galaxie, а также сорта пшеницы спельты (Triticum spelta) Ostro и Rouquin продемонстрировали +Lr34 гаплотип в интроне 4, но имели -Lr34 гаплотип для двух маркеров в экзонах 11 и 12. Следовательно, эти линии образуют третий гаплотип. Интересно, что реципрокный аллель (T, в случае SNP в интроне 4 и +Lr34 в случае обоих экзонных маркеров) никогда не наблюдался. Этот факт говорит о том, что этот гаплотип возник благодаря мутации, а не рекомбинации, и, вероятно, представляет собой источник функционального +Lr34 гаплотипа.

Таблица 5

Полиморфизмы в аллелях Lr34 пшеничных генотипо в

Генотип	Происхождение	+/Lr34	А/Т SNP	TTC/DEL	C/T SNP
Chinese Spring	Китай	+	А	DEL	c
RL6058*	Китай	+	А	DEL	c
Fukuho	Япония	+	А	DEL	c
Mentana	Италия	+		DEL	c
Frontana	Бразилия	+	А	DEL	c
Frontierra	Бразилия	-	Т	TTC	T
Ardito	Италия	+	А	DEL	c
JupatecoR	CIMMYT	+	А	DEL	c
JupatecoS	CIMMYT	-	Т	TTC	T
Glenlea	Канада	+	А	DEL	c
Thatcher	Канада	-	Т	TTC	T
Anza	США	+	А	DEL	c
Chris	США	+	А	DEL	c
Condor	Австралия	+	А	DEL	c
Penjamo 62	CIMMYT	+
Inia66	CIMMYT	-
LalbahadurLr34	CIMMYT	+	А	DEL	c
Lalbahadur	Индия	-	Т	TTC	T
Fomo	Швейцария	+
Arina	Швейцария	-
Pegaso	Италия	+	А	DEL	c
Bezostaja	Россия	+	А	DEL	c
Kavkaz	Россия	+	А	DEL	c
Roazon	Франция
Capelle Desprez	Великобритания	-	Т	TTC	T
Maris Huntsman	Великобритания		Т	TTC	T
Renan	Франция		Т	TTC	T
Synthetic taus			Т	TTC	T
AL8/78 taus	Армения		Т	TTC	T
AUS 18913 taus	Иран		Т	TTC	T

Пример 5. Экспрессия Lr34.

Lr34 является образцом резистентности у взрослых растений, которая является неэффективной на стадии всходов в нормальных полевых условиях. Для определения того, связано ли это с более низкой экспрессией Lr34 на стадии всходов, использовали полуколичественную ОТ-ПЦР для измерения уровней экспрессии на различных стадиях развития растения, используя почти изогенные линии Thatcher и Thatcher Lr34. PDR экспрессировался на очень низких уровнях у всходов возрастом 14 дней, выращенных при 20°C, в то время как уровень экспрессии был значительно выше в кроющих листьях взрослых растений спустя 53 и 63 дня (фиг. 7). Не было существенного различия в экспрессии между резистентными и чувствительными растениями, что согласовалось с обнаружением отсутствия различий в после

- 30 031178 довательностях промоторных областей резистентного и чувствительного аллелей. Интересно, что по наблюдениям у взрослых растений спустя 63 дня накапливался несплайсированный продукт. Также измененный транскрипт у Thatcher Lr34 имел недостаток 92 нуклеотидов из экзона 10, который в соответствии с предсказаниями нарушает рамку считывания и приводит к усеченному белку.

Было установлено, что Lr34 придает резистентность на стадии всходов к культурам возбудителя листовой ржавчины при низких температурах (Dyck and Samborski, 1982). Анализ мутантов и родительских линий Lr34, выращенных в виде всходов при низких температурах (4-8°C) и инфицированных возбудителем листовой ржавчины, выявил эффект сопротивления в виде медленного поражения ржавчиной с помощью интактного гена Lr34. В первые 2-3 недели после инфицирования различия в колонизированных мезофильных клетках между мутантами m19, m21 и Lalbahadur Lr34 были незначительными. Однако к пятой неделе размер колонизированной области увеличился по крайней мере в четыре раза при использовании мутантов m19 и m21 по сравнению с активным геном Lr34. Внешние признаки образования спор у всходов были очевидны в случае мутантов к пятой неделе, тогда как присутствие активного гена Lr34 отсрочивало видимые признаки, которые появлялись только через шесть недель после инфицирования. Это наблюдение сходно с более длительным латентным периодом, который был характеристикой механизма резистентности на основе Lr34 в виде медленного поражения ржавчиной.

Lr34 придавал резистентность широкого спектра к нескольким облигатным биотрофным патогенам, включающим грибы из Ascomycetes и Basidiomycetes. Rubiales и Nicks (1995) представили данные о том, что имеется связь Lr34 с уменьшением роста межклеточных гифов, но не с реакцией гиперчувствительности или образованием сосочков. У восьми мутантов Lr34 была нарушена резистентность к листовой ржавчине, желтой ржавчине злаков и настоящей мучнистой росе, и они не демонстрировали некроз верхушки листа, как описано выше. Эксперименты по инфицированию выявили, что уровень резистентности связан с развитием некроза верхушки листа, и что искусственное заражение возбудителем листовой ржавчины до возникновения некроза верхушки листа приводит к более тяжелым симптомам болезни, чем инфицирования в более поздних моментах времени. Эти наблюдения наводили на мысль, что механизм резистентности на основе Lr34 обусловлен общим физиологическим эффектом, а не классическими механизмами резистентности, включающими распознавание веществ патогенов, которые вызывают образование защитных фенольных соединений, отсутствующих у здоровых растений и образующихся как ответная реакция на поражение возбудителем, или секрецию противогрибковых соединений.

На основе этого была выдвинута гипотеза, что стойкая резистентность, придаваемая Lr34, была связана с преждевременным старением кроющих листьев, особенно верхушек листьев, и, по крайней мере отчасти, обусловлена им. В противоположность некрозу старение является в высокой степени контролируемым процессом, включающим ремобилизацию питательных веществ и деструкцию хлорофилла. Полагали, что преждевременное старение листьев, начинающееся с верхушки листа, могло бы препятствовать поглощению патогеном питательных веществ из клеток-хозяев и могло бы задерживать его рост и размножение. Поэтому связанные со старением гены были проанализированы у растений пшеницы с или без Lr34.

Было известно, что экспрессия гена HvS40 значительно снижена во время старения в ячмене (Krupinska et al., 2007). На основе кДНК был приготовлен зонд, соответствующий этому гену. Используя этот зонд в гибридизационном анализе посредством Нозерн-блоттинга, было выявлено, что HvS40 пшеницы в высокой степени экспрессировался в верхушках кроющих листьев Thatcher Lr34, но не Thatcher в растениях возрастом 63 дня. Кроме того, экспрессия гена была снижена или он не экспрессировался у шести индуцированных азидом мутантов Lr34 (фиг. 8). Это служило убедительным доказательством того, что Lr34 регулирует старение кроющих листьев у взрослых растений пшеницы. С другой стороны, микроскопические наблюдения показали нарастание сопротивлений клеточных стенок после инфицирования возбудителем листовой ржавчины генотипов Lr34. Поэтому, по-видимому, Lr34опосредованная резистентность мешала развитию патогена более сложным образом.

Клонирование Lr34 является первым опубликованным клонированием резистентности к множеству патогенов QTL из пшеницы, которое включает Lr34, Yr18, Pm38, Ltn1, и продемонстрировало, что она контролируется единственным геном. ABC-транспортер подсемейства PDR был идентифицирован в качестве гена, ответственного за придание этой стойкой резистентности взрослым растениям. Резистентные и чувствительные аллели отличались лишь тремя незначительными изменениями в кодирующей последовательности. Полагали, что резистентный аллель ускоряет старение верхушек кроющих листьев и, следовательно, мешает поглощению питательных веществ облигатными биотрофными патогенами.

Пример 6. Родственные гены из пшеницы и других видов.

Гомологичные гены из А- и В-геномов пшеницы и гены, кодирующие гомологи из других видов, были выделены посредством использования зондов, происходящих из гена Lr34 пшеницы, для исследования библиотек кДНК и геномной ДНК. Были выделены гомологичные гены из А- и В-геномов. Гомологичный ген был выделен из Aegilops tauschii, диплоидного хлебного злака (с D-геномом), относящегося к пшенице (SEQ ID NO: 6). Были идентифицированы другие родственные последовательности из баз данных EST, содержащих частичные последовательности (табл. 6).

- 31 031178

Таблица 6

EST, которые гомологичны Lr34. Представлен процент идентичности последовательности по участку сопоставления

Член родственных генов был также выявлен в ячмене, когда кДНК-зонд, происходящий из 3'половины гена, был подвергнут гибридизации с геномной ДНК ячменя в стандартных условиях.

Авторами настоящего изобретения также определен гомолог Lr34, присутствующий на хромосоме 7В пшеницы. Белковая последовательность этого гомолога представлена в SEQ ID NO: 63, а последовательность кДНК - в SEQ ID NO: 64.

Пример 7. Получение трансгенной пшеницы, экспрессирующей экзогенный ген резистентности взрослых растений к патогенам.

Для получения трансгенной пшеницы полинуклеотид, включающий последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO: 2, субклонировали в вектор pPlex (Schunmann et al., 2003) так, чтобы промотор вируса, вызывающего задержку в росте клевера подземного, был способен к управлению транскрипцией в клетке пшеницы.

Трансформацию зародышей пшеницы сорта Bobwhite 26 выполняли в соответствии со способом Pellegrineschi и др. (2002). Для подтверждения того, что полученные растения содержат конструкцию, проводили анализ с помощью ПЦР на геномной ДНК, экстрагированной из листьев, используя набор FastDNA® (BIO 101 Inc., Vista, California, США) в соответствии с инструкциями поставщика. ДНК элюировали в 100 мкл стерильной деионизированной воды и 1 мкл использовали в ПЦР.

Растения проверяли на повышенную резистентность к патогенам растений, таким как Puccinia graminis f. sp. tritici (который вызывает стеблевую ржавчину пшеницы), Puccinia striiformis (который вызывает желтую ржавчину злаков) и/или Puccinia recondite f. sp. tritici (который вызывает листовую ржавчину).

Квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что в настоящее изобретение могут быть внесены многочисленные изменения и/или модификации, как продемонстрировано в конкретных вариантах осуществления, не выходя за пределы существа или объема настоящего изобретения, описанного приблизительно. Поэтому варианты осуществления настоящего изобретения должны считаться во всех отношениях иллюстративными, а не ограничивающими.

Настоящая заявка притязает на приоритет заявки AU 2008904364, поданной 25 августа 2008, полное содержание которой включено в описание посредством ссылки.

Все публикации, обсуждаемые и/или цитируемые в описании, полностью включены в данный документ.

Любое обсуждение документов, действий, материалов, устройств, изделий или т.п., которое включено в описание настоящего изобретения, представлено исключительно с целью обеспечения фона для настоящего изобретения. Оно не должно считаться признанием того, что любой или все из этих предметов обсуждения составляют часть базиса уровня техники или обычные известные знания в области, относящейся к настоящему изобретению, поскольку они существовали до даты приоритета каждого притязания этой заявки.

- 32 031178

Список литературы

Abdullah et al. (1986) Biotechnology 4:1087.

Barker et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2: 235-350.

Bevan et al. (1983) Nucl. Acid Res. 11: 369-385.

Bossolini et al. (2006) Theor. Appl. Genet. 113:1049-1062.

Brueggeman et al. (2002) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 99:9328-9333. Capecchi (1980) Cell 22:479-488

Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657.

Clapp (1993) Clin. Perinatal. 20:155-168.

Cloutier et al. (2007) Plant Mol. Biol. 65:93-106.

Collins et al. (1999) Plant Cell 11:1365-1376.

Comai et al. (2004) Plant J 37: 778-786.

Crouzet et al. (2006) FEBS Letters 580: 1123-1130.

Curiel et al. (1992) Hum. Gen. Ther. 3:147-154.

Dyck (1977) Can. J. Genet. Cytol. 19:711-716.

Dyck et al. (1987) Genome 29:467-469.

Dyck and Samborski (1982) Can. J. Genet. Cytol. 24: 273-283.

Dyck et al. (1966) Can. J. Genet.Cytol. 8: 665-671.

Eglitis et al. (1988) Biotechniques 6:608-614.

Feuillet et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100:15253-15258.

Fujimura et al. (1985) Plant Tissue Cultural Letters 2:74.

Garfinkel et al. (1983) Cell 27: 143-153.

German and Kolmer (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 97-105.

Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-518.

Graham et al. (1973) Virology 54:536-539.

Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258.

Greve (1983) J. Mol. Appl. Genet. 1: 499-511.

Harayama (1998) Trends Biotechnol. 16:76-82.

Henikoff et al. (2004) Plant Physiol 135: 630-636.

Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915.

Huang et al. (2003) Genetics 164:655-664.

Joshi et al. (2004) Crop Science 44:792-796.

Joshi (1987) Nucl. Acid Res. 15: 6643-6653.

Kolmer et al. (2003) Plant Disease 87: 859-866.

Kolmer et al. (2008) Crop Science 48:1037-1047.

Krupinska et al. (2002) Plant Physiol. 130: 1172-1180.

Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105: 357-367.

Lagudah et al. (2006) Theor. and Appl. Genet. 114: 21 - 30.

Langridge et al. (2001) Aust. J. Agric. Res. 52: 1043-1077.

Lemieux (2000) Current Genomics 1: 301-311.

Liang et al. (2006) Phytopathology 96:784-789.

Lu et al. (1993) J. Exp. Med. 178:2089-2096.

Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590.

McIntosh (1992) Plant Pathol. 41:523-527.

Medberry et al. (1992) Plant Cell 4: 185-192.

Medberry et al. (1993) Plant J. 3: 619-626.

Needleman and Wunsch (1970) J. Mol Biol. 45:443-453.

Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14: 403-406.

Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23:1129-1138.

Ow et al. (1986) Science 234: 856-859.

Pellegrineschi et al. (2002) Genome 45:421-430.

Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126: 1259-68.

Rae (2007) Annu. Rev. Plant Biol. 58:347-375.

Rogers et al (2001) J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 207-214.

Rubiales and Niks (1995) Plant Dis. 79:1208-1212.

Salomon et al. (1984) EMBO J. 3: 141-146.

Schunmann et al. (2003) Functional Plant Biology 30:453-460.

Singh (1992a) Phytopathology 82: 835-838.

Singh (1992b) Crop Science 32: 874-878.

Singh and Rajaram (1994) Euphytica 72: 1-7.

Slade and Knauf (2005) Transgenic Res. 14: 109-115.

Spielmeyer et al. (2002) Theor. Appl. Genet. 116, 481-490.

Spielmeyer et al. (2005) Theor. Appl. Genet. 111: 731-735.

Spielmeyer et al. (2008) Theor Appl Genetics 116: 481-490. Stalker et al. (1988) Science 242:419-423.

Stein et al. (2006) The Plant Cell 18: 731-746.

Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7943-7947.

Stockhaus et al. (1989) EMBO J. 8:2445-2451.

Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500.

Toriyama et al. (1986) Theor. Appl. Genet. 205:34.

van den Brule and Smart (2002) Planta 216:95-106.

- 33 031178

Verrier et al. (2007) Trends Plant Sei. 13:151-159.

Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6099-6103. Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35: 73-778.

Yamamoto et al. (1997) Plant J. 1:255-265.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation

Grains Research and Development Corporation University of Zurich <120> Гены резистентности <130> 508378 <150> AU 2008904364 <151> 2008-08-25 <160>64 <170> Патент в версии 3.5 <210> 1 <211>1401 <212> PRT <213> Triticum aestivum cv Chinese Spring <400>1

Met 1

Glu

Gly

Leu

Ala Arg 5

Glu

Thr

Asn

Pro 10

Ser

His

Gln 15

Asp

Phe

Thr

Ala

Cys

Ala

Ser

Asp

Glu

Arg

Pro

Asp

Glu

Ser

Glu

Leu

Glu

20

25

30

Leu

Ala

Ser

Arg

Gln

Arg

Gln

Asn

Gly

Ala

Asn

Thr

Glu

His

Val

35

40

45

Ser

Glu

Asn

Met

Leu

Asp

Ser

Lys

Leu

Gly

Ala

Leu

Lys

Arg

50

55

60

Arg

Glu

Phe

Asp

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu

Glu

Asp

His

Leu

65

70

75

80

Arg

Phe

Leu

Arg

Gly

Gln

Lys

Glu

Arg

Ile

Asp

Arg

Val

Asp

Val

Lys

85

90

95

Leu

Pro

Ala

Ile

Glu

Val

Arg

Tyr

Asn

Leu

Phe

Val

Glu

Ala

Glu

100

105

110

Cys

Arg

Val

Thr

Lys

Gly

Asn

His

Leu

Pro

Ser

Leu

Trp

Asn

Ser

Thr

115

120

125

Lys

Gly

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

Val

Lys

Leu

Gly

Phe

Glu

Thr

Glu

- 34 031178

130

135

140

Arg Ala 145

Lys

Thr

Asn

Val 150

Leu

Glu

Asp

Val

Ser 155

Gly

Ile

Lys

Pro 160

Cys

Arg

Leu

Thr

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

Gly

Lys

Ser

Thr

165

170

175

Leu

Arg

Ala

Leu

Ala

Gly

Lys

Leu

Asp

Lys

Ser

Leu

Lys

Val

Thr

180

185

190

Gly

Asp

Ile

Ser

Tyr

Asn

Gly

Tyr

Glu

Leu

His

Glu

Phe

Val

Pro

Glu

195

200

205

Lys

Thr

Ala

Val

Tyr

Ile

Asn

Gln

His

Asp

Leu

His

Ile

Ala

Glu

Met

210

215

220

Thr

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Asp

Phe

Ser

Ala

Gln

Cys

Gln

Gly

Val

Gly

225

230

235

240

Arg

Pro

Lys

Ile

Leu

Lys

Glu

Val

Asn

Thr

Arg

Glu

Ser

Val

Ala

245

250

255

Gly

Ile

Pro

Asp

Ala

Asp

Ile

Asp

Leu

Tyr

Met

Lys

Val

Ala

260

265

270

Val

Glu

Ala

Ser

Glu

Arg

Ser

Leu

Gln

Thr

Asp

Tyr

Ile

Leu

Lys

Ile

275

280

285

Met

Gly

Leu

Glu

Ile

Cys

Ala

Asp

Thr

Met

Val

Gly

Asp

Ala

Met

Arg

290

295

300

Arg

Gly

Ile

Ser

Gly

Gln

Lys

Arg

Leu

Thr

Ala

Glu

Met

305

310

315

320

Ile

Val

Gly

Pro

Ala

Ser

Ala

Tyr

Phe

Met

Asp

Glu

Ile

Ser

Asn

Gly

325

330

335

Leu

Asp

Ser

Thr

Phe

Gln

Ile

Asn

Cys

Phe

Gln

Leu

340

345

350

Thr

Asn

Ile

Ser

Glu

Tyr

Thr

Met

Val

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

Thr

355

360

365

Pro

Glu

Val

Phe

Asp

Leu

Phe

Asp

Leu

Ile

Leu

Met

Ala

Glu

Gly

370

375

380

- 35 031178

Lys 385

Ile

Tyr

His

Gly 390

Pro

Arg Asn

Glu

Ala 395

Leu

Asn

Phe

Glu 400

Glu

Cys

Gly

Phe

Ile

Cys

Pro

Glu

Arg

Lys

Ala

Asp

Phe

Leu

405

410

415

Gln

Glu

Ile

Leu

Ser

Trp

Lys

Asp

Gln

Tyr

Trp

Leu

Gly

Pro

420

425

430

His

Glu

Ser

Tyr

Arg

Tyr

Ile

Ser

Pro

His

Glu

Leu

Ser

Met

Phe

435

440

445

Arg

Glu

Asn

His

Arg

Gly

Arg

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Ser

Val

Pro

450

455

460

Lys

Ser

Gln

Leu

Gly

Lys

Glu

Ala

Leu

Ala

Phe

Asn

Lys

Tyr

Ser

Leu

465

470

475

480

Gln

Lys

Leu

Glu

Met

Phe

Lys

Ala

Cys

Gly

Ala

Arg

Glu

Ala

Leu

485

490

495

Met

Lys

Arg

Asn

Met

Phe

Val

Tyr

Val

Phe

Lys

Thr

Gly

Gln

Leu

Ala

500

505

510

Ile

Ala

Leu

Val

Thr

Met

Ser

Val

Phe

Leu

Arg

Thr

Arg

Met

Thr

515

520

525

Ile

Ser

Phe

Thr

His

Ala

Asn

Tyr

Met

Gly

Ala

Leu

Phe

Ser

530

535

540

Ile

Met

Ile

Met

Leu

Asn

Gly

Ile

Pro

Glu

Met

Ser

Met

Gln

Ile

Gly

545

550

555

560

Arg

Leu

Pro

Ser

Phe

Tyr

Lys

Gln

Lys

Ser

Tyr

Phe

Tyr

Ser

565

570

575

Trp

Ala

Tyr

Ala

Ile

Pro

Ala

Ser

Val

Leu

Lys

Val

Pro

Ile

Ser

Ile

580

585

590

Leu

Asp

Ser

Leu

Val

Trp

Ile

Ser

Ile

Thr

Tyr

Gly

Ile

Gly

Tyr

595

600

605

Thr

Pro

Thr

Val

Ser

Arg

Phe

Cys

Gln

Phe

Leu

Ile

Leu

Cys

Leu

610

615

620

Leu

His

Ser

Val

Thr

Ser

Gln

His

Arg

Phe

Ile

Ala

Ser

Tyr

Phe

625

630

635

640

- 36 031178

Gln

Thr

Pro

Ile

Val 645

Ser

Phe

Tyr

Leu 650

Phe

Leu

Ala

Leu

Thr 655

Val

Phe

Leu

Thr

Phe

Gly

Phe

Ile

Leu

Pro

Lys

Thr

Ser

Met

Pro

Gly

660

665

670

Trp

Leu

Asn

Trp

Gly

Phe

Trp

Ile

Ser

Pro

Met

Thr

Tyr

Ala

Glu

Ile

675

680

685

Ser

Ile

Val

Ile

Asn

Glu

Phe

Leu

Ala

Pro

Arg

Trp

Gln

Lys

Glu

Ser

690

695

700

Ile

Gln

Asn

Ile

Thr

Ile

Gly

Asn

Gln

Ile

Leu

Val

Asn

His

Gly

Leu

705

710

715

720

Tyr

Ser

Trp

His

Tyr

Trp

Ile

Ser

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

725

730

735

Ser

Ile

Leu

Phe

Tyr

Ile

Ala

Phe

Gly

Leu

Ala

Leu

Asp

Tyr

Arg

740

745

750

Thr

Pro

Thr

Glu

Tyr

His

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu

Cys

755

760

765

Gln

Glu

Lys

Asp

Tyr

Thr

Ile

Gln

Asn

Glu

Ser

Asp

Gln

770

775

780

Ser

Asn

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Val

Thr

Ile

Pro

Val

Met

His

Leu

Pro

785

790

795

800

Ile

Thr

Phe

His

Asn

Leu

Asn

Tyr

Ile

Asp

Thr

Pro

Glu

Met

805

810

815

Leu

Lys

Gln

Gly

Tyr

Pro

Thr

Arg

Leu

Arg

Leu

Asn

Ile

820

825

830

Thr

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

Leu

Met

Gly

Val

Ser

835

840

845

Gly

Ala

Gly

Lys

Thr

Leu

Asp

Val

Leu

Ala

Gly

Arg

Lys

Thr

850

855

860

Gly

Tyr

Ile

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Ile

Gly

Tyr

Pro

Lys

Val

865

870

875

880

Gln

Glu

Thr

Phe

Val

Arg

Ile

Leu

Gly

Tyr

Cys

Glu

Gln

Val

Asp

Ile

885 890 895

- 37 031178

His

Ser

Pro

Gln 900

Leu

Thr Val

Glu

Glu 905

Ser

Val

Thr

Tyr

Ser 910

Ala

Trp

Leu

Arg

Leu

Pro

Ser

His

Val

Asp

Glu

Gln

Thr

Arg

Ser

Lys

Phe

Val

915

920

925

Ala

Glu

Val

Leu

Glu

Thr

Val

Glu

Leu

Asp

Gln

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

930

935

940

Val

Gly

Ser

Pro

Gln

Lys

Asn

Gly

Leu

Ser

Met

Glu

Gln

Arg

Lys

Arg

945

950

955

960

Leu

Thr

Ile

Ala

Val

Glu

Leu

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Ile

Leu

Met

965

970

975

Asp

Glu

Pro

Thr

Gly

Leu

Asp

Thr

Arg

Ser

Ala

Ile

Val

Ile

980

985

990

Arg Ala Val Lys Asn Ile Cys

995

Glu Thr Gly Arg Thr Val Val Cys Thr 1000 1005

Ile

His 1010

Gln

Pro

Ser

Thr

Glu 1015

Ile

Phe

Glu

Ala

Phe 1020

Asp

Glu

Leu

Ile

Leu

Met

Lys

Ser

Gly

Lys

Thr

Ile

Tyr

Ser

Gly

Pro

Ile

1025

1030

1035

Gly

Glu

Arg

Ser

Cys

Lys

Val

Ile

Glu

Tyr

Phe

Glu

Lys

Ile

Ser

1040

1045

1050

Gly

Val

Pro

Lys

Ile

Lys

Ser

Asn

Cys

Asn

Pro

Ala

Thr

Trp

Met

1055

1060

1065

Met

Asp

Val

Thr

Ser

Thr

Ser

Met

Glu

Val

Gln

His

Asn

Met

Asp

1070

1075

1080

Phe

Ala

Ile

Leu

Tyr

Glu

Ser

Leu

His

Arg

Glu

Ala

Glu

1085

1090

1095

Asp

Leu

Val

Glu

Gln

Leu

Ser

Ile

Pro

Leu

Pro

Asn

Ser

Glu

Asn

1100

1105

1110

Leu

Cys

Phe

Ser

His

Ser

Phe

Ala

Gln

Asn

Gly

Trp

Ile

Gln

Leu

1115

1120

1125

Lys

Ala

Cys

Leu

Trp

Lys

Gln

Asn

Ile

Thr

Tyr

Trp

Arg

Ser

Pro

- 38 031178

1130

1135

1140

Gln

Tyr 1145

Asn Leu Arg

Arg

Ile 1150

Met

Thr

Val

Ile 1155

Ser

Ala

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ile

Leu

Phe

Trp

Lys

His

Ala

Lys

Val

Leu

Asn

1160

1165

1170

Glu

Gln

Asp

Met

Leu

Ser

Val

Phe

Gly

Ala

Met

Tyr

Leu

Gly

Phe

1175

1180

1185

Thr

Ile

Gly

Ala

Tyr

Asn

Asp

Gln

Thr

Ile

Pro

Phe

Ser

1190

1195

1200

Thr

Glu

Arg

Ile

Val

Met

Tyr

Arg

Glu

Arg

Phe

Ala

Gly

Met

1205

1210

1215

Tyr

Ser

Trp

Ser

Tyr

Ser

Phe

Ala

Gln

Ala

Phe

Ile

Glu

Ile

1220

1225

1230

Pro

Tyr

Val

Phe

Ile

Gln

Val

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ile

Val

Tyr

1235

1240

1245

Pro

Ser

Thr

Gly

Tyr

Trp

Thr

Ala

His

Lys

Phe

Leu

Trp

Phe

1250

1255

1260

Phe

Tyr

Thr

Phe

Cys

Ser

Ile

Leu

Ser

Tyr

Val

Tyr

Val

Gly

1265

1270

1275

Leu

Val

Ser

Ile

Thr

Pro

Asn

Val

Gln

Val

Ala

Thr

Ile

1280

1285

1290

Leu

Ala

Ser

Phe

Asn

Thr

Met

Gln

Thr

Leu

Phe

Ser

Gly

Phe

1295

1300

1305

Ile

Leu

Pro

Ala

Pro

Gln

Ile

Pro

Lys

Trp

Thr

Trp

Leu

Tyr

1310

1315

1320

Tyr

Leu

Thr

Pro

Thr

Ser

Trp

Ala

Leu

Asn

Ala

Leu

Thr

Ser

1325

1330

1335

Gln

Tyr

Gly

Asn

Ile

Glu

Lys

Glu

Val

Lys

Ala

Phe

Gly

Glu

Thr

1340

1345

1350

Lys

Ser

Val

Ser

Ile

Phe

Leu

Asn

Asp

Tyr

Phe

Gly

Phe

His

Gln

1355

1360

1365

- 39 031178

Asp Lys Leu Ser Val Val Ala Ala Val Leu Val 1370 1375

Ala

1380

Phe Pro Phe

Val Leu Ile Ile Leu Phe Ser

1385

1390

Leu Ser Ile Glu Lys Leu Asn Phe 1395

Gln Lys Arg

1400 <210> 2 <211> 4206 <212> ДНК <213> Triticum aestivumn cv Chinese Spring

<400> 2
atggagggcc	tcgcaagaga	gaccaaccca	tcatcccacc	atcaagattt	caccgcctgt	60
gcgagtgacg	agcgcccgga	tgagtccgag	ttagaattgg	catcgcgaca	gcgccagaat	120
ggtgctgcaa	acaccgagca	tgtgagtgag	aacatgctgc	ttgacagcag	caagttggga	180
gctctcaaga	ggcgcgagtt	cttcgacaac	ctgctaaaga	acctcgaaga	cgaccacctc	240
cgctttctgc	gcggacaaaa	ggaaagaatt	gacagggttg	atgtcaagtt	gccagcaata	300
gaggtgaggt	ataataatct	gtttgtggag	gcagagtgca	gagttactaa	aggaaatcac	360
ctgccatctc	tatggaatag	taccaaaggt	gccttctcgg	gcctcgtgaa	gttgctaggc	420
ttcgaaacgg	aaagagcaaa	aaccaacgtt	cttgaagatg	tcagtggaat	catcaaaccc	480
tgcagattga	ctcttctact	gggacctcct	ggatgtggca	aaagcactct	gttgcgagct	540
cttgccggga	aactagataa	atctctaaag	gtaacagggg	atatctctta	taatggttat	600
gaacttcatg	aatttgtacc	tgagaaaaca	gctgtgtata	tcaaccaaca	tgatctgcac	660
atagctgaga	tgactgtgag	ggaaacttta	gacttctcag	cccagtgcca	aggtgttgga	720
agaagaccaa	aaatactcaa	ggaggtgaac	acaagggaga	gtgtggctgg	gatcatacct	780
gatgcggaca	tcgatctata	catgaaggta	gtagcagttg	aagcttcaga	gcgaagccta	840
cagacagatt	atattttgaa	gatcatgggg	ctagagatat	gcgcagacac	gatggttggg	900
gatgcaatga	gaagaggaat	atcagggggg	cagaagaaaa	gattaaccac	agccgagatg	960
attgtgggcc	ccgcaagtgc	atactttatg	gatgaaatat	caaatggtct	ggatagctct	1020
accacttttc	aaataatcaa	ttgtttccag	caactgacaa	acatcagcga	gtacacgatg	1080
gttatttcac	ttcttcaacc	aacacctgag	gtatttgatc	tttttgatga	cctcatacta	1140
atggcagaag	ggaagattat	ctaccatggc	cctcgaaatg	aagctctcaa	tttttttgag	1200
gagtgtgggt	tcatatgccc	agaaagaaaa	gcggcagctg	actttcttca	agagatcttg	1260
tcctggaagg	accaacaaca	gtactggttg	ggtccacatg	aatcatacag	atatatctca	1320
cctcatgaat	tatcaagcat	gttcagggag	aatcacaggg	ggagaaaact	acatgaacaa	1380

- 40 031178

agtgtacctc	ccaaaagcca	gttgggcaag	gaagctttag	cattcaataa	gtattcgcta	1440
caaaaactgg	aaatgttcaa	agcctgtgga	gcaagggaag	cactcctaat	gaaaaggaat	1500
atgtttgttt	atgtcttcaa	aacaggccag	cttgccatta	ttgcactcgt	aacaatgtct	1560
gtattccttc	gaactcgcat	gacaataagt	ttcactcatg	caaattacta	tatgggagca	1620
ttattttttt	ccatcatgat	tatgttaaat	ggcataccag	agatgagcat	gcagattggg	1680
agactcccaa	gtttttacaa	gcaaaagagc	tactatttct	attcatcatg	ggcatatgca	1740
ataccagctt	cagtcctaaa	ggtccctatt	tccatactgg	attcgcttgt	atggatatct	1800
atcacatatt	atggtattgg	ttatacacct	actgtttcaa	ggttcttctg	ccagtttctg	1860
atactttgtc	ttctccatca	ttcagtcacc	tcgcagcatc	gatttattgc	ttcatacttc	1920
caaacaccta	ttgtgtcttt	cttctacctt	tttcttgctc	taacagtatt	ccttacattc	1980
ggaggcttca	ttcttcccaa	gacctccatg	ccaggatggt	taaactgggg	attttggata	2040
tctccaatga	catatgcaga	aatcagcata	gttattaacg	aattcttggc	accaagatgg	2100
cagaaggaaa	gtattcaaaa	cataacaatt	gggaaccaaa	tcctggttaa	tcatggccta	2160
tattacagtt	ggcattatta	ttggatatcc	tttggagcct	tgcttggatc	tattctctta	2220
ttttatatcg	cttttggatt	ggcactagat	tacagaacac	ctacagaaga	atatcatgga	2280
agcaggccta	caaagagctt	atgtcaacag	caggaaaaag	attacactat	tcaaaatgaa	2340
tctgatgatc	aatcaaatat	ttccaaagca	aaggtgacta	taccagttat	gcatcttcca	2400
attacattcc	acaatctgaa	ctactacatt	gataccccac	cggaaatgct	gaaacaaggc	2460
tatccaacaa	gaagacttcg	actgcttaat	aacataactg	gtgctttacg	tcccggtgtt	2520
ctttctgcac	taatgggtgt	tagtggagct	gggaagacaa	ctctactaga	tgtattagca	2580
ggaaggaaaa	caggaggtta	tattgaaggg	gacataagaa	taggtggata	tcccaaggtg	2640
caggaaacat	ttgtcagaat	cttgggttac	tgcgaacaag	tcgacataca	ttccccacag	2700
cttacagttg	aagagtctgt	aacttattct	gcgtggcttc	gtctgccttc	tcatgtcgac	2760
gaacaaacaa	gatctaaatt	tgttgctgaa	gtccttgaaa	ctgttgaact	agatcaaata	2820
aaagatgtct	tagtggggtc	accacagaaa	aatggattgt	ccatggagca	gagaaagagg	2880
ctaacgattg	cagtcgagct	tgtttcaaac	ccatcaatca	tactaatgga	tgaaccaaca	2940
acaggtttag	atacaaggtc	agcagccatt	gttattcgtg	cagtcaaaaa	tatttgtgaa	3000
acaggaagga	cagtagtctg	tacaatccat	cagccgagca	ctgaaatttt	tgaggcattt	3060
gatgagctca	tattaatgaa	aagcggtggg	aaaacaatct	acagtggacc	aataggagag	3120
cgctcctgca	aagtgatcga	gtactttgag	aaaatttctg	gagtcccaaa	aataaagagt	3180
aactgcaatc	cagctacttg	gatgatggat	gtaacatcga	catcaatgga	ggttcaacac	3240

- 41 031178

aatatggact	ttgcaatttt	gtatgaagag	tcgtcactgc	atagagaagc	tgaagatcta	3300
gtggagcagc	taagtatccc	attaccaaat	tcagaaaatc	tatgtttctc	ccatagtttt	3360
gcacagaatg	gctggattca	acttaaagct	tgcttgtgga	aacaaaacat	aacttactgg	3420
agaagtcctc	agtataactt	gaggcgcatt	atgatgactg	tcatatctgc	cctgatctac	3480
ggaatattgt	tctggaagca	tgcaaaagta	ttaaacaacg	agcaggacat	gctcagtgtt	3540
tttggtgcaa	tgtatttggg	tttcaccacc	ataggcgctt	ataatgatca	gacaatcata	3600
ccattcagta	caactgagcg	tattgtaatg	tatcgtgaga	gatttgcagg	aatgtattca	3660
tcttggtcat	attcattcgc	acaggctttc	attgagatac	cctatgtatt	tatccaagtg	3720
gtactgtata	cgttaattgt	ctatccgtca	actggttatt	attggacagc	acacaaattc	3780
ctatggttct	tctacaccac	attttgttca	attctctcct	atgtttatgt	tgggttgctt	3840
cttgtttcca	taacccccaa	tgttcaagta	gctaccatac	tggcttcatt	tttcaacacc	3900
atgcaaacac	tattctcagg	atttatttta	cctgcacctc	aaatcccgaa	gtggtggact	3960
tggctctact	atctcactcc	tacatcttgg	gcactcaatg	ccctcttgac	atcacaatac	4020
ggaaacatag	aaaaagaggt	gaaagcattt	ggagaaacta	aatcagtttc	aatcttcttg	4080
aatgactatt	ttgggtttca	tcaagataag	ttgagcgtag	tagcagctgt	cctcgttgcc	4140
tttccttttg	tgttgataat	cttgttttcg	ttgtccattg	agaaacttaa	tttccagaag	4200
aggtaa						4206

<210> 3 <211> 18859 <212> ДНК <213> Triticum aestivum cv Chinese Spring <220>

<221> misc_feature <222> (11016)..(11069) <223> n = неизвестное число нуклеотидов <400> 3

agccggcggg	gtcggcgagg	ttgagaagca	gaggccggtc	atgtcgctac	ggatcagaga	60
ggaggagcgg	tgacgcgttc	cagatgggtt	tgggcaggcc	gcggtggcta	agggagaggc	120
agcaagactt	ggcggcggcg	gtttggattg	gaacggaaaa	caaggaaggt	ctatggtggc	180
ggttgcggct	ggatcaggga	gcatcttgat	ggaggaaatg	ggtaggggaa	gtggcggtgg	240
tgggatgact	ttcaggggta	tatctagggt	tggtccaaaa	tagggctagg	gggctatata	300
tagggaaata	ggtctagatt	cgaagccttc	gattagatcg	gacggtcgag	ataaaatgat	360
aagggaggcc	aaataagaaa	ccaaagatgt	ttggggttga	tccggaccca	ccggtcacga	420
ccgggcggtt	cgggttcggg	gaagttttcg	agctaggatg	caagggggtc	tatgcaatgt	480

- 42 031178

gcagagagac	aaggaagtcg	tgcgcaagtg	cggttggtct	cgaaaccgtc	aacgacaaca	540
acagggagaa	cggcaactat	gaacggatgc	aagttttgga	aaatgcaatg	atgaatgcaa	600
caaacaaata	attaacgcgg	ccaactcgag	atataactag	aaggcatctg	gagcgtcggt	660
ctcgagttgt	tacacactcg	ctcaccgggc	ccctcccagc	gccctcaaca	acctttgacc	720
tcccccccaa	cggtggtacc	agacgccccg	gaactagccg	cactcccccc	ccccctccga	780
atgggggcaa	cgaaaacaag	gggcacccag	gcgccaagaa	taagaagaga	gggccggtgc	840
gctccgctag	gtaccaacag	gctcaccctc	cctccgcggc	cgttgttgcc	tccatcgagc	900
cagccgccga	ctccgaccac	gatggccggc	cttgcttcaa	ctgtgtgatc	cccggttact	960
tccaagtcgc	atgccccaat	cgtccgatgt	gctacttgtg	taaggatccc	gggcatcccg	1020
ctctgttgtg	cttgaaccgg	tcggtttcgg	aggagttgat	gatgtacggg	cacggcccag	1080
ggggcatgcg	cttcttccac	atcaaggtcc	cggatgcccc	accccctgcg	aaaagatcag	1140
atctattata	aagattcacc	agaagtacaa	aacacctcaa	aacataataa	aatttacatc	1200
aaggtccatg	gaggaatgga	ccaccgaacg	gccattgcct	cagccagaac	cgagccgccg	1260
acacgccgct	atcgacgctc	ccataccgga	gccggtctga	ccttgtcgat	gatagccgaa	1320
aagtcttcgt	gtgcgtgccc	ttaaggatca	gcgtcccaga	gccgcagtcg	tcaccgttga	1380
atccttgaat	cagtctaaag	aatttgacac	caaatatcgc	cgttgcgtac	gcacggcgag	1440
aaactctaac	ctctccgccc	tgaggagctg	gcagaaatct	acgccgaagc	tccgtctaat	1500
ccgtcctaga	ggacgaactt	gaggaggatc	ggaacccgaa	agactgactc	gaagaagaag	1560
cgccgccatc	cgtccaaacg	ccgcccctgc	gagaactaaa	actctacctg	tctactagcc	1620
ggagacaagg	caccagaaat	cccctccctg	ccaccagccg	ccggaacggc	aggcggaggg	1680
aaggggaatc	cacgggctcg	ccgatgaaga	tcaaggggag	gaaggctttt	cacgacaggg	1740
gaaagaaaag	caatcttaat	cttttatatc	tttacaacca	aaattccaaa	ttgagttttg	1800
gttccatatt	catgtttcta	ttacaagggc	ttttaaataa	tatccatttt	taatacgatt	1860
tgatgagttt	ttaaaacttc	attaagttgc	agctgctgaa	acttggtacc	agcaagcgac	1920
aaaatcatga	aacttgatgc	gagcgaatgg	caaaatcgta	agtttcaaaa	actgaaactt	1980
aaaacttgat	gtgccgtcgt	gcggaaccat	cgagcagccg	ggcaggtgcg	tgccacgcgc	2040
ctgcgtgccc	ctgcgagttt	tccgcgcaag	agcgcgaaca	aacggtactg	cacatattgc	2100
agtttcaagt	tgccgagtgc	gactctgtgg	tcaatgtcgt	cgaaggctct	ttcatcaagt	2160
aattacaata	ccatttcaac	tttcatgggt	ccgtgcctgc	caggttcaaa	gttccaagat	2220
ggttatgtgc	aaccgactgt	gtgtcccaca	tccacacatc	gaagcagagg	tctcgtgaag	2280
tctttccaaa	cgagcaagag	caacatcaag	gacgaccagc	tgagggggtc	tttccaaacg	2340
agtggtttct	atcctcccgt	agaatgggtg	atccacgaca	agtctatgag	tcgttctgag	2400

- 43 031178

gttgagacta	ataaattaat	tgtggctaat	cgacactagt	cgacaccgaa	gttgctactc	2460
acagactagt	cgacactgaa	gtgtagtcgg	ccccggagtt	gtgacttcta	gactagtcta	2520
tagacttgtc	cttcgactca	taatccatgc	tcgtcatcca	gcccccatta	accccatcca	2580
tgtgactccc	tgcgtaacat	aacctgttcg	gttactcccc	ttctaatcca	tgactaaaat	2640
tgcacttcaa	tctttttccg	aagtcccgtt	ttgcggtggc	atatatccaa	tttacaagct	2700
aaaaaaaagt	gcggtggggt	tctttcccgt	cacaaagaaa	acccaaaata	aggcaaatca	2760
ggtctccgaa	tcaggagtac	tgtgaagtct	tcaccagtac	cgtataatac	atgacttatg	2820
gctgtcatct	tccagaatgt	gcgtttccat	gctaatagtt	agtttgaagt	caacacatga	2880
ctggtctttc	caactcttct	gactgatgat	gtccgtatgg	gaaaaagcgt	gcgtacatgc	2940
tcgccaaaac	cttatatatg	tactctaaag	agaaggaaat	gactgcttag	agtacggcta	3000
ggcaatagca	aagggcgtcg	atttaactca	cccatcttga	gatggagggc	ctcgcaagag	3060
agaccaaccc	atcatcccac	catcaagatt	tcaccgcctg	tgcgagtgac	gagcgcccgg	3120
atgagtccga	gttagaattg	gcatcgcgac	agcgccagaa	tggtgctgca	aacaccgagc	3180
atgtgagtga	gaacatgctg	cttgacagca	gcaagttggg	agctctcaag	aggcgcgagt	3240
tcttcgacaa	cctgctaaag	aacctcgaag	acgaccacct	ccgctttctg	cgcggacaaa	3300
aggaaagaat	tgacaggcat	gttttctttt	tcagaacact	gttctaagta	actggatgaa	3360
gattagactc	tgtttatgca	actgtttatt	tttcccctgt	gatccatttc	cacagggttg	3420
atgtcaagtt	gccagcaata	gaggtgaggt	ataataatct	gtttgtggag	gcagagtgca	3480
gagttactaa	aggaaatcac	ctgccatctc	tatggaatag	taccaaaggt	gccttctcgg	3540
taagaaacct	ctgaaatgat	tgatttttat	tatgcaccaa	atagcagcat	ctgaagcaac	3600
tgttttttcg	acgaatcata	aatggaactg	ataagacaca	gatatatgtt	ggatggtatt	3660
gactaactta	cccgttttca	tttgagttac	agggcctcgt	gaagttgcta	ggcttcgaaa	3720
cggaaagagc	aaaaaccaac	gttcttgaag	atgtcagtgg	aatcatcaaa	ccctgcaggt	3780
atgtgccatg	tttcatgagt	gtttagtata	aaaatggaaa	agaaaccata	aacatacaaa	3840
agaaaacgtg	cgaaatttag	tgcatcaagt	gtctgtagtt	cttgctttag	agattaaggt	3900
tagttctgat	tccatatgtt	cccatctttg	tagattgact	cttctactgg	gacctcctgg	3960
atgtggcaaa	agcactctgt	tgcgagctct	tgccgggaaa	ctagataaat	ctctaaaggt	4020
acaaatactg	tcttcctttc	ataattaaag	aaaaaagcat	gtccttgttt	tcactgattg	4080
catctgctcc	tataaagatc	tcaagattac	tcaatacttg	gccaaatgaa	agaacaaaaa	4140
aattaagatc	tcaaccagct	gcacaccgca	gtaaactgct	ctctgtcctc	tggccgctac	4200
ataatagacc	acatatgaag	ccagtacaca	aataaatgta	taacctacaa	tcttttctca	4260

- 44 031178

aagtctacat	cattcatgaa	tagccaaaga	gccaaactta	agtttttatc	aataccccac	4320
aaacaataaa	ctcgcgcctc	ttgagagctc	cgaacttgct	gctgtcaagc	agcaagttct	4380
cacgcacatg	ctcaaatgtt	tgcagcacca	ttctggcgcc	gtcgcactga	caattctaac	4440
tcggactcgt	cgggaccctc	gtggtcatac	gccagcgctc	ccaaatcctg	ataccagaac	4500
agataatgac	gctgacgctg	ccagaggaga	cggcgcaatt	gccttaatcc	tcggcacata	4560
gtgtcgcaac	acatacatgt	gcccaactac	tcctcggcac	cacgcccgcc	ggaggacaag	4620
ccggcgctcc	tgtcccctaa	ccatgacacc	gacatcaaga	acctccgcct	agaactcttg	4680
cacaacctcc	tccgacttct	ggtgacagaa	acgcgccacc	ggtgacacaa	agccaccgtc	4740
atccgcatat	gacccaacct	ccagcagcat	cctgagattc	aacacatgac	acctccgctg	4800
ccctctcctc	catggcatcc	tcggcagcca	ggaaagataa	tctcaatccg	ctggatcccc	4860
ctaaagtagg	cgtctaggcg	atcactgtgg	cggcagggtg	agtcaccttc	agggcagcgc	4920
tctcatccaa	ttcctatgta	ggtttgctac	tactgcacgg	ggacctatca	gatgtatctc	4980
acagaccaat	tagataaatc	gatggtcgaa	tttggaagtt	ataatgagat	acactgttgt	5040
gattaaattt	gatcacgcta	tattgtagag	gaaagtgtaa	ttcccttgaa	atgaacaaca	5100
tgcaacatag	tagtatagaa	tcgccgcaaa	ttttccttgc	gtttggatat	aaaactcagg	5160
cccatgttcc	atctttttaa	ctgtgtatat	gccctagcag	cgtgaacata	ctactggtcc	5220
tgctagaaca	agcggcgggt	aaagatgggc	gcctgcttca	tacttgccag	taaattagga	5280
tgattgcctt	gcagaaaata	tggccaatat	taccattaag	cctatttacc	gaaatctaac	5340
acaaactttt	gactgtagga	aacaaagaat	caattctact	aacagatttt	tcttttgttc	5400
gagaaaatgc	ttatgcgtgt	gtcgatgcat	taaaaggaaa	gagaataaca	gccattcagg	5460
attacaagcc	ctaagaagga	ccatggaact	cctgaaccaa	ggttacacgc	caggcaggag	5520
gagctggagt	tttgccgcac	gggcgaaacc	cagcaagtcg	cctccgtgct	acgctaggtc	5580
tagccatact	gaaggataca	tcattgtgat	gagcaccagg	ccgtcatctg	aatgagtgtc	5640
agacaactga	cagaataaca	ttactcacat	caaaagcaaa	agttgtccat	cacctcagag	5700
tctatggttt	tcattagttg	cacatggtta	acgacctctg	acaaaggcag	aaattcaaga	5760
atgccttgca	ctgaacgacg	gatatcagta	tacttaagtt	gcttttttac	agcaccaact	5820
gatgctggag	ttatcaaatt	gaaatgtccc	aactccccag	caaagccacc	tatattgtct	5880
ccaaaacata	taattgttgg	catggtttcc	acctgtatga	aaccggcact	atttactggc	5940
tcaaatgagt	agttcgtcat	gaagctagta	cttatactga	ctgctgaata	ctaataaata	6000
acagctttta	attattttca	gaccaagtac	tttcagagaa	aactattttc	agatcagctt	6060
ctaattaata	ctccctcagt	tccaaaatat	aaggtgtatt	agttttttca	agaggcattc	6120
atgtttgacc	aagtttttag	aaaaaaaata	tcaatatcta	caataccaaa	tttgtatgat	6180

- 45 031178

tagatttatc	acgaaaagta	tttttcatat	tttatttatt	ttatattgca	gaatgttaat	6240
attttattct	ataatcttgg	tcaaacatac	ataagtttga	cttgcacgaa	cactgatgca	6300
ccttatattc	tggaacggag	ggagcaaata	atagcacaca	atagattatg	ggtacctgct	6360
gggtattcct	gcttagagat	acaaccacag	aaaagcagag	cagaacagca	caaatgccct	6420
ttagccattg	acactacaat	tagtttcaaa	gctacaattt	tgcaaaatca	tgaacaaaag	6480
aagaaaaaaa	atggcaaact	gaatgtaacg	atgcaagctt	ttacaggtaa	caggggatat	6540
ctcttataat	ggttatgaac	ttcatgaatt	tgtacctgag	aaaacagctg	tgtatatcaa	6600
ccaacatgat	ctgcacatag	ctgagatgac	tgtgagggaa	actttagact	tctcagccca	6660
gtgccaaggt	gttggaagaa	gaccaagtaa	gtctattgga	cagtcctcac	aagaattcat	6720
gatcaaaaat	aagttcttaa	ataatcacaa	catttgttgc	tcactaaatt	tgtttgccca	6780
aagaaatact	caaggaggtg	aacacaaggg	agagtgtggc	tgggatcata	cctgatgcgg	6840
acatcgatct	atacatgaag	gtaaaaaatc	gtgtctccta	tgtactggct	ggcattatcc	6900
tttctcactt	tacaattaaa	aaaaaaacag	acctgcttat	ctgagttaca	aagaaaaggt	6960
aattcaacgt	cgaatgaata	ttggaactgc	tctagcagaa	taatatttgg	ttgtattaaa	7020
gctaagctag	cttttcaatt	tttcattagt	caacacttct	gtttctgttt	ctacaaatta	7080
aacgtaactg	tttttcaaaa	gtaaagcggc	taatgcaggt	agtagcagtt	gaagcttcag	7140
agcgaagcct	acagacagat	tatattttga	aggtacccct	tgccaaaaca	tctaagttta	7200
tgcataactt	ggtgctgaag	gcagatagga	acaagatact	aacagaatca	caatactgat	7260
ttatttgtag	atcatggggc	tagagatatg	cgcagacacg	atggttgggg	atgcaatgag	7320
aagaggaata	tcaggggggc	agaagaaaag	attaaccaca	ggtatagtaa	acccaatggg	7380
aaatacatta	accaacaagg	gatcaccttg	tatataatct	ttcacctact	tgtaccagcc	7440
gagatgattg	tgggccccgc	aagtgcatac	tttatggatg	aaatatcaaa	tggtctggat	7500
agctctacca	cttttcaaat	aatcaattgt	ttccagcaac	tgacaaacat	cagcgagtac	7560
acgatggtta	tttcacttct	tcaaccaaca	cctgaggtat	ttgatctttt	tgatgacctc	7620
atactaatgg	cagaagggaa	gattatctac	catggccctc	gaaatgaagc	tctcaatttt	7680
tttgaggagt	gtgggttcat	atgcccagaa	agaaaagcgg	cagctgactt	tcttcaagag	7740
gtaattgttc	tcaatcacaa	aaataactgc	agcaactgag	atgatttgca	cgttgatgaa	7800
accagttttt	tttctaattt	tgaaatcatt	agatcttgtc	ctggaaggac	caacaacagt	7860
actggttggg	tccacatgaa	tcatacagat	atatctcacc	tcatgaatta	tcaagcatgt	7920
tcagggagaa	tcacaggggg	agaaaactac	atgaacaaag	tgtacctccc	aaaagccagt	7980
tgggcaagga	agctttagca	ttcaataagt	attcgctaca	aaaactggaa	atgttcaaag	8040

- 46 031178

cctgtggagc	aagggaagca	ctcctaatga	aaaggaatat	gtttgtttat	gtcttcaaaa	8100
caggccaggt	taaacttcat	tctgaggcac	tctttcctgt	acaaagtaaa	ttatgagtcc	8160
aaactgagat	ttactccttg	atgcagcttg	ccattattgc	actcgtaaca	atgtctgtat	8220
tccttcgaac	tcgcatgaca	ataagtttca	ctcatgcaaa	ttactatatg	ggagcattat	8280
ttttttccat	catgattatg	ttaaatggca	taccagagat	gagcatgcag	attgggagac	8340
tcccaagttt	ttacaagcaa	aagagctact	atttctattc	atcatgggca	tatgcaatac	8400
cagcttcagt	cctaaaggtc	cctatttcca	tactggattc	gcttgtatgg	atatctatca	8460
catattatgg	tattggttat	acacctactg	tttcaaggta	aatatggaaa	tttctcaacc	8520
ttacaatgat	aagaacaaac	attgagaaac	tcttaacata	ttttatttat	attcatttct	8580
aggttcttct	gccagtttct	gatactttgt	cttctccatc	attcagtcac	ctcgcagcat	8640
cgatttattg	cttcatactt	ccaaacacct	attgtgtctt	tcttctacct	ttttcttgct	8700
ctaacagtat	tccttacatt	cggaggcttc	attcttccca	agagtaagat	aaccattgct	8760
cattgaatgc	atataactta	taagcctagc	aaatctgaac	aaatttgtta	ctttattgtc	8820
ccagcctcca	tgccaggatg	gttaaactgg	ggattttgga	tatctccaat	gacatatgca	8880
gaaatcagca	tagttattaa	cgaattcttg	gcaccaagat	ggcagaaggt	gaaatgattt	8940
ttttttcaaa	taaaatattg	agtgataagc	tgatgtcaag	catctaacat	cattgctgct	9000
tgtattattt	tcaggaaagt	attcaaaaca	taacaattgg	gaaccaaatc	ctggttaatc	9060
atggcctata	ttacagttgg	cattattatt	ggatatcctt	tggagccttg	cttggatcta	9120
ttctcttatt	ttatatcgct	tttggattgg	cactagatta	cagaacacgt	aagtttgcta	9180
ctaatgaaca	aagtgcatat	atattgggct	tgggctccat	ggtgcccagg	caacatgatt	9240
tgaaatacag	caaatttggg	taatgcattt	aggaaattcc	tattttggat	gatataactg	9300
gttgtcattg	ctgggtataa	tttcgaaata	cctactcgat	cccaaatatt	tttggtaaac	9360
tcatccatat	agcagtttta	tatacataca	ggtacctaga	attcaagcaa	taacaaaaca	9420
aagtacagac	tgaaaagatc	aaacttgttt	ggaataaatt	agacttcaca	aattttcatg	9480
caatatatct	agatggatct	ggatatagga	atatagtgct	gaggcactat	ggagcaccag	9540
ttaattagac	tttatacacg	aatgttactt	actttagaat	cctactataa	ttttgccaat	9600
ttcagctaca	gaagaatatc	atggaagcag	gcctacaaag	agcttatgtc	aacagcagga	9660
aaaagattac	actattcaaa	atgaatctga	tgatcaatca	aatatttcca	aaggtaaaga	9720
cataaacatc	tcaatacgaa	ttaatagtaa	aaaatatgaa	ggtcccataa	aagtgcatgc	9780
ttcttcaatg	cattcatctt	attgcagcaa	aggtgactat	accagttatg	catcttccaa	9840
ttacattcca	caatctgaac	tactacattg	ataccccacc	ggtaattaag	caagccccct	9900
atgcatttgt	tttgtagttt	tttatatttc	ttgcctggtt	cgtatttgat	gatgaaggta	9960

- 47 031178

tgtaagaaat	gtactctctt	gtaggaaatg	ctgaaacaag	gctatccaac	aagaagactt	10020
cgactgctta	ataacataac	tggtgcttta	cgtcccggtg	ttctttctgc	actaatgggt	10080
gttagtggag	ctgggaagac	aactctacta	gatgtattag	caggaaggaa	aacaggaggt	10140
tatattgaag	gggacataag	aataggtgga	tatcccaagg	tgcaggaaac	atttgtcaga	10200
atcttgggtt	actgcgaaca	agtcgacata	cattccccac	agcttacagt	tgaagagtct	10260
gtaacttatt	ctgcgtggct	tcgtctgcct	tctcatgtcg	acgaacaaac	aagatctgta	10320
tgtcatcagt	ctcagagata	tatcgaattt	aataagcata	gcactagatg	gataaataag	10380
aggcttacct	aagaaactaa	caatattctt	cttgttcctc	tcgtagaaat	ttgttgctga	10440
agtccttgaa	actgttgaac	tagatcaaat	aaaagatgtc	ttagtggggt	caccacagaa	10500
aaatggattg	tccatggagc	agagaaagag	gctaacgatt	gcagtcgagc	ttgtttcaaa	10560
cccatcaatc	atactaatgg	atgaaccaac	aacaggttta	gatacaaggt	cagcagccat	10620
tgttattcgt	gcagtcaaaa	atatttgtga	aacaggaagg	acagtagtct	gtacaatcca	10680
tcagccgagc	actgaaattt	ttgaggcatt	tgatgaggta	atttaacttt	ctaaatatat	10740
tagtatatta	aacacaatca	acacaaatac	atttttatta	tatatatcaa	gcacgatcaa	10800
cacaattttt	tttctggaaa	aatcaatatg	tttagtttca	aaactattag	gattaattaa	10860
agcccttgcc	ttcaacagag	cagggctaat	cttaatatgc	actacctctg	taactaaata	10920
taagacgttt	ttgcagttca	cctgcaaaaa	cgtcttatat	taagttacag	aggtacctcc	10980
gtcccataat	gtaagacgtt	ttttgacact	agtgtnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	11040
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnntt	atgggacgga	gggagtagta	cattattagt	11100
tatttaaaat	ttaaaacatg	tcctttgtgt	ttgcctttct	agtaaataat	aatgatagga	11160
aataatagta	tggaaatttg	caatataagc	gtgtcaacca	tttcactttg	cgcaacctag	11220
acctcaaatt	gcacttttgt	cccctcaaat	gatcaattat	gtgcaacaaa	acccttcaac	11280
ttaaactttg	cttatctgaa	accttctatt	atttggtttg	ttagatcaag	cattttctac	11340
tgaagatacc	tgatcagacc	cctttgaata	atatatctat	gaataaacat	tgatttgagc	11400
taagtaggat	tggcatctaa	attatagtaa	gacgcttaac	aactatttac	tactccctgt	11460
ctcaaaatgt	aagacatttt	ttgacccttt	gaataatata	tctatgatat	aaacattggt	11520
ttgagctaag	taggattggt	atctaaatta	tagtaagatg	cttaacaact	atttactact	11580
ccctctgtct	caaaatgtaa	gacatttttt	gacacatgta	agacgttttt	tgacattatc	11640
agtgtcaaaa	aatgtcttac	attttgagat	agagggagca	tctagcatcc	tttttctgtt	11700
tcgggagaac	atttcttacc	ttaaatattt	ggcatatact	ttttgtacaa	aaacaacccc	11760
attatatcag	tccgcatgaa	gaataaagta	taaacatgca	atgacatgtt	ttgatctctt	11820

- 48 031178

aattatttga	acatctatgt	gttcgatgtc	agttaatttt	tatctcttat	ttgaactaag	11880
tgtccacact	gacacaaatt	tgtcatcgca	caaaatttgg	actttctggg	cttgattaca	11940
aaattaaaac	aattttgagg	gcttatactg	gaaagtcacc	gaatagaata	ttttttggtt	12000
ttctgaacta	tatgtttatc	acaaatcgac	gtgactacgg	acagtttata	tttgctactt	12060
ctctgtttat	aataacaaaa	agggtataga	ttttctttat	tacagggcta	gttgtagtcg	12120
aaagttgcct	ataatgcatg	tagtaaattt	tgttgcagct	catattaatg	aaaagcggtg	12180
ggaaaacaat	ctacagtgga	ccaataggag	agcgctcctg	caaagtgatc	gagtactttg	12240
aggcaagttt	cttgaacata	tttccacaaa	tgtatttgcc	tttttcttga	ttattcgttt	12300
tcactgtttt	tttctggaat	tggaacaata	aacgtgagag	ttccaaagga	acgaacccca	12360
aaaccagtgc	tcaaatgttc	aacatgccat	agcaaaaaca	cttaagtcaa	ctctagcagt	12420
catttgtgtt	caatatgtaa	cttggctaac	aattcacatg	aaatatatag	gttaatcaaa	12480
attttgatgt	gatcatatgt	attttacatg	ttgaacttaa	aagcaaatgt	gacaataaac	12540
gtacagattg	gcaatggaaa	ctaaaaacat	actgaagaac	tttgtttgca	tatctatgta	12600
tgtgtttcgg	tgttttcaga	gaggaagcac	ggttgtggca	tggcactgcc	atatttgtga	12660
catgtgtcct	ttggttctaa	tagattgaat	ttttcttgtc	cacttgatag	aaaatttctg	12720
gagtcccaaa	aataaagagt	aactgcaatc	cagctacttg	gatgatggat	gtaacatcga	12780
catcaatgga	ggttcaacac	aatatggact	ttgcaatttt	gtatgaagag	tcgtcactgc	12840
ataggtacat	atcttgtgga	tttagttagg	atatcgagca	aaaggcaaca	tatatgaata	12900
gcttaagcaa	aataaaattc	atctagcaaa	aaaatttagc	caaacaaaat	acctccattt	12960
gaagtttgga	agaattaaag	ttacttttct	gcagagaagc	tgaagatcta	gtggagcagc	13020
taagtatccc	attaccaaat	tcagaaaatc	tatgtttctc	ccatagtttt	gcacagaatg	13080
gctggattca	acttaaagct	tgcttgtgga	aacaaaacat	aacttactgg	aggagtcctc	13140
agtataactt	gaggcgcatt	atgatgactg	tcatatctgc	cctgatctac	ggaatattgt	13200
tctggaagca	tgcaaaagta	ttgtaagttc	actcctttgt	tatccacaac	attgcacatc	13260
agttgacttc	acagactcat	tgcaaaatta	ttctaacttt	ctcttatctc	ttctaagaaa	13320
caacgagcag	gacatgctca	gtgtttttgg	tgcaatgtat	ttgggtttca	ccaccatagg	13380
cgcttataat	gatcagacaa	tcataccatt	cagtacaact	gagcgtattg	taatgtatcg	13440
tgagagattt	gcaggaatgt	attcatcttg	gtcatattca	ttcgcacagg	tcagataatg	13500
atcacaagct	tgtaagagaa	gtaaaatata	cattgacact	gatgctcata	tttattcacc	13560
ttctacaggc	tttcattgag	ataccctatg	tatttatcca	agtggtactg	tatacgttaa	13620
ttgtctatcc	gtcaactggt	tattattgga	cagcacacaa	attcctatgg	ttcttctaca	13680
ccacattttg	ttcaattctc	tcctatgttt	atgttgggtt	gcttcttgtt	tccataaccc	13740

- 49 031178

ccaatgttca	agtagctacc	atactggctt	catttttcaa	caccatgcaa	acactattct	13800
caggatttat	tttacctgca	cctgtaagtc	tttatctcct	cccaatatcg	taaactttag	13860
ctctccaaga	tgtaactggc	acttcttttt	gttagcaaaa	atatggctgc	ccaccttgaa	13920
tatataccaa	ctaagaaaat	aacaacctac	atgagaaatt	gtaattgacg	agattttgta	13980
gtgtaattat	gtaataatat	tatggaacta	ataaaggtct	aatagggcat	tatgggcttt	14040
actttattcc	agagttcatg	ttcgtgcaga	agtctcctat	tgtactacat	ctaggttacc	14100
cttataggca	tcctattaat	gcattctgcc	ttacaaaggt	atcaaattag	gttttagggt	14160
ttttatcctg	gtaaactttt	ctttatcttt	ttttgtcaat	attcaccttt	gcaacttccc	14220
caccatgaca	cctttttttt	ccttctgccc	cagatcctca	attttactga	ttgcttaatt	14280
tttgtgatcg	atcaactgat	ctatcctcct	gatagatctt	agttttggga	atatttaagt	14340
agtaatatgt	caacaataca	aggaccaacc	gcaactataa	ggcatcactg	gatgacgata	14400
cacagaacca	ctccaatgtt	agtttaacat	cataatagtt	atagacatac	catcttcagt	14460
ttcatcatta	atacttccat	ttctattttc	taggttggaa	attgataatt	attccagcgt	14520
tgctcaatag	aataatcatg	ttctgttcaa	ttgttaggga	agaatcatga	atagaggaaa	14580
gcactaatat	gcattttcaa	ttcacgttgc	agcaaatccc	gaagtggtgg	acttggctct	14640
actatctcac	tcctacatct	tgggcactca	atgccctctt	gacatcacaa	tacggaaaca	14700
tagaaaaaga	ggtgaaagca	tttggagaaa	ctaaatcagt	ttcaatcttc	ttgaatgact	14760
attttgggtt	tcatcaagat	aagttgagcg	tagtagcagc	tgtcctcgtt	gcctttcctt	14820
ttgtgttgat	aatcttgttt	tcgttgtcca	ttgagaaact	taatttccag	aagaggtaag	14880
caagttctga	cattccaaca	gacatgaatc	tgtacatgtt	acagatatag	ctacttgcct	14940
tttttccaac	tgcgaaatgc	agaatcagag	ctgattgggt	ggctattttt	ctcaaatctg	15000
atgggtaaac	ctcatgaata	agtaattgtg	tacaataact	tgattgtgct	aagtacgatt	15060
gtgagttgta	atctttttgt	ttcaccgttc	agaagaattt	gatggttaca	aatcatgtaa	15120
cctgctttga	agaggatttt	gcaattgtgt	tatgccttag	attactgaat	gcatcaagag	15180
gaaaatgagc	acctaactga	atgaacctac	gatttaaagc	gagcttaagc	acagataaca	15240
aaaagctaac	ttggattccc	gcaccgtcat	catcatgcct	taatatccgt	gcaaggtgtg	15300
tgagtggtgg	gtggtttctg	aagagaaacg	tggccacacg	tcacggcatg	cggggcgccg	15360
tttggatttc	ctttgagcta	tataaaacgg	gaacggcagc	atggaatggt	acacttctct	15420
cactttcacc	catcttcatc	ttgctcatgt	gctcactccg	ccgttgcaaa	caaagcttct	15480
cgcatcaagc	ttttctcccc	ttcctctatt	agacaagttg	aagccagaca	cacccgatga	15540
gcgcagaggt	gcaagccgaa	ggagaggatg	cagcgcaacc	actaggggtg	ctaccagcaa	15600

- 50 031178

gaagggtgcc	actagcaagg	gtgccgccaa	cgacacaaaa	gggaaatggg	tcacttcgtc	15660
ggcgacacaa	catcgtcgac	acaagatcaa	ctgacaaagc	tcgccaactg	ttgcttcttc	15720
cccaatattg	ttcttcccga	agcaaatgga	agttcactgg	cgcgcaccgc	cgcgggagca	15780
gatcgtgcca	gcgccatgcc	cggacgaacg	ggtattccta	gcccctttct	tgatgtgagg	15840
cttctctttg	cctctccatg	agtttcttcg	tgggtagctt	ttcttgtacg	aggccaataa	15900
tatgtcacat	cacgtgagac	tggtcgcaaa	tcaaactagc	gagaggagtc	gataccacga	15960
aaatcccatg	taggagacgc	tccagcaatc	ccatgccttc	gatgcaagtg	attgccatta	16020
gtaaatctgg	gaatggctaa	tggcccccac	aagacactag	ttgtcactac	acagccaggg	16080
ccgcaataag	ccgccacaaa	ctccggtgaa	catgatccgc	aacctagcat	cgtcggcact	16140
gcaaccgtgc	accaccaccg	ccatgccgca	atgtagcgat	gatcaccgct	acccgccagc	16200
acgcaagcaa	ccagcgaaat	cacaaccaac	cacggactcg	ccaaccaggc	caagctccaa	16260
tataatgccc	cgaaggagga	acacagacgc	cgagcaccgc	catcattcga	tctgggcaaa	16320
ccggaaccta	gggtttccgc	taaagcatta	tgagagaata	gtcaaggact	gcatctagac	16380
accttaagca	agggaacgac	atccgcaggc	gccaccgtca	ttggcttcga	ccgagcgaag	16440
cctagctttc	accgacagtc	ccatccctcc	ttccccaaat	cgaacctagc	cactctacca	16500
tgcccaccac	cgccgccaac	atgaccacta	gtgaaggaga	ccaccaagtc	cacagaccct	16560
aggccaagat	tcatggctaa	ggtgccgcat	gccttgttgc	aagagaagag	catgccatgc	16620
ccccacatcg	tcgggatccg	ctatcgagga	agagtcatcg	ttccactaat	ccacaacaat	16680
ctactgcacc	gcaaagaagg	tggtcgcgac	cacgacgatg	tgtcacatgg	acctctgtac	16740
cgagaggtgc	cgtcattgtc	gggagaaaag	gtcgtcctgc	caatggacct	gatggaaaaa	16800
cgtcatgcga	ggagccctgt	cggtgcctcc	gacaacggtg	agaaggtatg	ggacgtggag	16860
ggctgctggc	ggcgagtcta	ggtggtttcg	cccatgacgc	ctggaagatc	atgcgagggt	16920
tagggatggc	tggaaggcaa	tgcaggggac	aatacaatta	taacacatta	gttcgaagaa	16980
tcggctatga	gttgattggc	acaaaagaga	tggttcttgg	catcgagtct	catggtggat	17040
gtgttgttag	gcatatcagc	atgagttgtc	gatagtacgt	cagtacgtcc	cctagagctt	17100
tgtgcactac	taggtggagc	catgctaaga	gcatctccaa	cagatgacat	ataatagggc	17160
actaaagagt	aggttttaag	gcaccaaaaa	agattctgcc	atagcagacg	atgtaaaata	17220
ggtcaccgga	aaaatttctg	ccgtagtagg	gcaatattat	tgcatatttc	gacattttca	17280
aacttctaat	tgttcaaagt	taaactaaca	gtactaagat	agatacacta	ctcatcatca	17340
ctactacgat	agaggtctca	agtcaatatc	gtcggctttg	tcatcgtcca	actcaagctt	17400
gatcacctgt	gaggggccag	cctcatcctc	ctccttgaga	accttcttgt	gttgcacgtc	17460
cctactggca	aagaattcgt	attccacctg	cacaaggtaa	ggactttccg	ctgcgaacct	17520

- 51 031178

tgccatagcc	accgcatcgc	tctcatgggc	ggtgtgttgc	tccacgatga	ggcaaccatc	17580
ttctcctcgt	gaaacacaat	ccccaattca	ggagcgagga	actccgccac	ctctcgctca	17640
tgacgtcagg	aaagtgtgct	ctgacttggg	ccagcggcca	cggcatcata	cgcgcatgta	17700
gcgagctctg	ttgtcttgaa	ggtcctgagc	cagacttgca	tcccatcgca	caagatatcg	17760
acagcatagc	cgtgggacta	caatgccaaa	cacagtggaa	gaccgtgctc	ctcctcgcct	17820
tagcgttgtg	gcgcaacatc	ttcagctcgg	cgatggcggt	ggtcgacggc	tgagacgaat	17880
gagagcggtg	gatctggcgg	cagtggcggc	caaatggcgt	ggtgtggcag	acaatttggt	17940
caacgtggtg	gtgcagaggc	cgattcgaca	aaaggggcgg	ctgttccgat	ggcggtggtg	18000
gccgtattgg	gcatcgtcgt	cggcaaggca	gaggaagcga	ctaggggggt	tcacgcggcg	18060
gtcgagcaaa	gcgcggctga	ggtttttgtt	ttgcggcaac	tacgcggctg	ttgtatattt	18120
ggagaacaaa	agggctgccc	caaaaatatt	ctagcacgat	atagggatag	ggcatctgct	18180
ggagcaccat	tttgggtcca	aatgccataa	aacggttttt	taggcagctg	cccattttgc	18240
atcatctggt	agagatgctc	taagagtttt	tagcctttta	tgggcttctc	ttgttctatg	18300
ttttacgaac	atgcttttta	cctatgttta	tgttcataac	gtggttaggt	ctatttaagc	18360
cccctaaact	atacagtaat	aaatattttt	tcccgaatct	tttgttcgga	caatcaacac	18420
ccctacaggc	ttatacgtga	aacggtttgg	ttgagtccct	aactacgcca	catgggcttg	18480
ttttgttgat	gtagaaatga	ttaaagacaa	gactcaaatt	gtacatctct	ccttttcttt	18540
catgatgttg	cccaatgatt	taatatacgg	tcacacgatg	ataagcgacc	gcctatacta	18600
aaaagaaatg	gattgtgcta	tttctcccaa	tcgcccaaac	cctcgatgaa	aggttttcct	18660
tctccaaatc	atcaacttgg	ccatagtaaa	cacaaactca	agctctttcg	ctagggatat	18720
aaatggccca	aataatgtgt	ccctttctac	actagataat	ggcctaatgc	cccatttatc	18780
aatgcaagtg	ttattcataa	catggtatca	acaacatctt	ttgagttttt	ctaaggtttc	18840
tttttggatc	atcaaacat					18859

<210>	4
<211>	1402
<212>	PRT
<213>	Triticum	aestivum cv	Renan
<400>	4
Met Glu Gly Leu	Ala Arg Glu	Thr Asn	Pro	Ser Ser His His Gln Asp
1		5		10	15

Phe Thr Ala Cys Ala Ser Asp Glu Arg Pro Asp Glu Ser Glu Leu Glu
20	25	30

- 52 031178

Leu Ala

Ser 35

Arg

Gln

Arg

Gln

Asn Gly Ala Ala Asn Thr

Glu

His

Val

40

45

Ser

Glu

Asn

Met

Leu

Asp

Ser

Lys

Leu

Gly

Ala

Leu

Lys

Arg

50

55

60

Arg

Glu

Phe

Asp

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu

Glu

Asp

His

Leu

65

70

75

80

Arg

Phe

Leu

Arg

Gly

Gln

Lys

Glu

Arg

Ile

Asp

Arg

Val

Asp

Val

Lys

85

90

95

Leu

Pro

Ala

Ile

Glu

Val

Arg

Tyr

Asn

Leu

Phe

Val

Glu

Ala

Glu

100

105

110

Cys

Arg

Val

Thr

Lys

Gly

Asn

His

Leu

Pro

Ser

Leu

Trp

Asn

Ser

Thr

115

120

125

Lys

Gly

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

Val

Lys

Leu

Gly

Phe

Glu

Thr

Glu

130

135

140

Arg

Ala

Lys

Thr

Asn

Val

Leu

Glu

Asp

Val

Ser

Gly

Ile

Lys

Pro

145

150

155

160

Cys

Arg

Leu

Thr

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

Gly

Lys

Ser

Thr

165

170

175

Leu

Arg

Ala

Leu

Ala

Gly

Lys

Leu

Asp

Lys

Ser

Leu

Lys

Val

Thr

180

185

190

Gly

Asp

Ile

Ser

Tyr

Asn

Gly

Tyr

Glu

Leu

His

Glu

Phe

Val

Pro

Glu

195

200

205

Lys

Thr

Ala

Val

Tyr

Ile

Asn

Gln

His

Asp

Leu

His

Ile

Ala

Glu

Met

210

215

220

Thr

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Asp

Phe

Ser

Ala

Gln

Cys

Gln

Gly

Val

Gly

225

230

235

240

Arg

Pro

Lys

Ile

Leu

Lys

Glu

Val

Asn

Thr

Arg

Glu

Ser

Val

Ala

245

250

255

Gly

Ile

Pro

Asp

Ala

Asp

Ile

Asp

Leu

Tyr

Met

Lys

Val

Ala

260

265

270

Val

Glu

Ala

Ser

Glu

Arg

Ser

Leu

Gln

Thr

Asp

Tyr

Ile

Leu

Lys

Ile

275

280

285

- 53 031178

Met

Gly 290

Leu Glu

Ile

Cys

Ala 295

Asp

Thr

Met

Val

Gly 300

Asp

Ala

Met

Arg

Gly

Ile

Ser

Gly

Gln

Lys

Arg

Leu

Thr

Ala

Glu

Met

305

310

315

320

Ile

Val

Gly

Pro

Ala

Ser

Ala

Tyr

Phe

Met

Asp

Glu

Ile

Ser

Asn

Gly

325

330

335

Leu

Asp

Ser

Thr

Phe

Gln

Ile

Asn

Cys

Phe

Gln

Leu

340

345

350

Thr

Asn

Ile

Ser

Glu

Tyr

Thr

Met

Val

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

Thr

355

360

365

Pro

Glu

Val

Phe

Asp

Leu

Phe

Asp

Leu

Ile

Leu

Met

Ala

Glu

Gly

370

375

380

Lys

Ile

Tyr

His

Gly

Pro

Arg

Asn

Glu

Ala

Leu

Asn

Phe

Glu

385

390

395

400

Glu

Cys

Gly

Phe

Ile

Cys

Pro

Glu

Arg

Lys

Ala

Asp

Phe

Leu

405

410

415

Gln

Glu

Ile

Leu

Ser

Trp

Lys

Asp

Gln

Tyr

Trp

Leu

Gly

Pro

420

425

430

His

Glu

Ser

Tyr

Arg

Tyr

Ile

Ser

Pro

His

Glu

Leu

Ser

Met

Phe

435

440

445

Arg

Glu

Asn

His

Arg

Gly

Arg

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Ser

Val

Pro

450

455

460

Lys

Ser

Gln

Leu

Gly

Lys

Glu

Ala

Leu

Ala

Phe

Asn

Lys

Tyr

Ser

Leu

465

470

475

480

Gln

Lys

Leu

Glu

Met

Phe

Lys

Ala

Cys

Gly

Ala

Arg

Glu

Ala

Leu

485

490

495

Met

Lys

Arg

Asn

Met

Phe

Val

Tyr

Val

Phe

Lys

Thr

Gly

Gln

Leu

Ala

500

505

510

Ile

Ala

Leu

Val

Thr

Met

Ser

Val

Phe

Leu

Arg

Thr

Arg

Met

Thr

515

520

525

Ile

Ser

Phe

Thr

His

Ala

Asn

Tyr

Met

Gly

Ala

Leu

Phe

Ser

530 535 540

- 54 031178

Ile 545

Phe

Met

Ile

Met

Leu 550

Asn

Gly

Ile

Pro

Glu 555

Met

Ser

Met

Gln

Ile 560

Gly

Arg

Leu

Pro

Ser

Phe

Tyr

Lys

Gln

Lys

Ser

Tyr

Phe

Tyr

Ser

565

570

575

Ser

Trp

Ala

Tyr

Ala

Ile

Pro

Ala

Ser

Val

Leu

Lys

Val

Pro

Ile

Ser

580

585

590

Ile

Leu

Asp

Ser

Leu

Val

Trp

Ile

Ser

Ile

Thr

Tyr

Gly

Ile

Gly

595

600

605

Tyr

Thr

Pro

Thr

Val

Ser

Arg

Phe

Cys

Gln

Phe

Leu

Ile

Leu

Cys

610

615

620

Leu

His

Ser

Val

Thr

Ser

Gln

Tyr

Arg

Phe

Ile

Ala

Ser

Tyr

625

630

635

640

Phe

Gln

Thr

Pro

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Leu

Phe

Leu

Ala

Leu

Thr

645

650

655

Val

Phe

Leu

Thr

Phe

Gly

Phe

Ile

Leu

Pro

Lys

Thr

Ser

Met

Pro

660

665

670

Gly

Trp

Leu

Asn

Trp

Gly

Phe

Trp

Ile

Ser

Pro

Met

Thr

Tyr

Ala

Glu

675

680

685

Ile

Ser

Ile

Val

Ile

Asn

Glu

Phe

Leu

Ala

Pro

Arg

Trp

Gln

Lys

Glu

690

695

700

Ser

Ile

Gln

Asn

Ile

Thr

Ile

Gly

Asn

Gln

Ile

Leu

Val

Asn

His

Gly

705

710

715

720

Leu

Tyr

Ser

Trp

His

Tyr

Trp

Ile

Ser

Phe

Gly

Ala

Leu

725

730

735

Gly

Ser

Ile

Leu

Phe

Tyr

Ile

Ala

Phe

Gly

Leu

Ala

Leu

Asp

Tyr

740

745

750

Arg

Thr

Pro

Thr

Glu

Tyr

His

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu

755

760

765

Cys

Gln

Glu

Lys

Asp

Tyr

Thr

Ile

Gln

Asn

Glu

Ser

Asp

770

775

780

Gln

Ser

Asn

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Val

Thr

Ile

Pro

Val

Met

His

Leu

- 55 031178

785

790

795

800

Pro

Ile

Thr

Phe

His

Asn

Leu

Asn

Tyr

Ile

Asp

Thr

Pro

Glu

805

810

815

Met

Leu

Lys

Gln

Gly

Tyr

Pro

Thr

Arg

Leu

Arg

Leu

Asn

820

825

830

Ile

Thr

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

Leu

Met

Gly

Val

835

840

845

Ser

Gly

Ala

Gly

Lys

Thr

Leu

Asp

Val

Leu

Ala

Gly

Arg

Lys

850

855

860

Thr

Gly

Tyr

Ile

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Ile

Gly

Tyr

Pro

Lys

865

870

875

880

Val

Gln

Glu

Thr

Phe

Val

Arg

Ile

Leu

Gly

Tyr

Cys

Glu

Gln

Val

Asp

885

890

895

Ile

His

Ser

Pro

Gln

Leu

Thr

Val

Glu

Ser

Val

Thr

Tyr

Ser

Ala

900

905

910

Trp

Leu

Arg

Leu

Pro

Ser

His

Val

Asp

Glu

Gln

Thr

Arg

Ser

Lys

Phe

915

920

925

Val

Ala

Glu

Val

Leu

Glu

Thr

Val

Glu

Leu

Asp

Gln

Ile

Lys

Asp

Val

930

935

940

Leu

Val

Gly

Ser

Pro

Gln

Lys

Asn

Gly

Leu

Ser

Met

Glu

Gln

Arg

Lys

945

950

955

960

Arg

Leu

Thr

Ile

Ala

Val

Glu

Leu

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Ile

Leu

965

970

975

Met

Asp

Glu

Pro

Thr

Gly

Leu

Asp

Thr

Arg

Ser

Ala

Ile

Val

980

985

990

Ile Arg Ala Val Lys Asn Ile

995

Cys Glu Thr Gly Arg Thr Val Val Cys 10001005

Thr Ile His Gln Pro Ser Thr Glu

10101015

Ile Phe Glu Ala Phe Asp Glu

1020

Leu Ile Leu Met Lys Ser Gly Gly Lys Thr

10251030

Ile Tyr Ser Gly Pro

1035

- 56 031178

Ile

Gly 1040

Glu

Arg

Ser

Cys

Lys 1045

Val

Ile

Glu

Tyr

Phe 1050

Glu

Lys

Ile

Ser

Gly

Val

Pro

Lys

Ile

Lys

Ser

Asn

Cys

Asn

Pro

Ala

Thr

Trp

1055

1060

1065

Met

Asp

Val

Thr

Ser

Thr

Ser

Met

Glu

Val

Gln

His

Asn

Met

1070

1075

1080

Asp

Phe

Ala

Ile

Leu

Tyr

Glu

Ser

Leu

His

Arg

Glu

Ala

1085

1090

1095

Glu

Asp

Leu

Val

Glu

Gln

Leu

Ser

Ile

Pro

Leu

Pro

Asn

Ser

Glu

1100

1105

1110

Asn

Leu

Cys

Phe

Ser

His

Ser

Phe

Ala

Gln

Asn

Gly

Trp

Ile

Gln

1115

1120

1125

Leu

Lys

Ala

Cys

Leu

Trp

Lys

Gln

Asn

Ile

Thr

Tyr

Trp

Arg

Ser

1130

1135

1140

Pro

Gln

Tyr

Asn

Leu

Arg

Ile

Met

Thr

Val

Ile

Ser

Ala

1145

1150

1155

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ile

Leu

Phe

Trp

Lys

His

Ala

Lys

Val

Leu

Asn

1160

1165

1170

Asn

Glu

Gln

Asp

Met

Leu

Ser

Val

Phe

Gly

Ala

Met

Tyr

Leu

Gly

1175

1180

1185

Phe

Thr

Ile

Gly

Ala

Tyr

Asn

Asp

Gln

Thr

Ile

Pro

Phe

1190

1195

1200

Ser

Thr

Glu

Arg

Ile

Val

Met

Tyr

Arg

Glu

Arg

Phe

Ala

Gly

1205

1210

1215

Met

Tyr

Ser

Trp

Ser

Tyr

Ser

Phe

Ala

Gln

Ala

Phe

Ile

Glu

1220

1225

1230

Ile

Pro

Tyr

Val

Phe

Ile

Gln

Val

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ile

Val

1235

1240

1245

Tyr

Pro

Ser

Thr

Gly

Tyr

Trp

Thr

Ala

His

Lys

Phe

Leu

Trp

1250

1255

1260

Phe

Tyr

Thr

Phe

Cys

Ser

Ile

Leu

Ser

Tyr

Val

Tyr

Val

1265

1270

1275

- 57 031178

Gly

Leu 1280

Leu

Leu Val

Ser

Ile 1285

Thr

Pro

Asn

Val

Gln 1290

Val

Ala

Thr

Ile

Leu

Ala

Ser

Phe

Asn

Thr

Met

Gln

Thr

Leu

Phe

Ser

Gly

1295

1300

1305

Phe

Ile

Leu

Pro

Ala

Pro

Gln

Ile

Pro

Lys

Trp

Thr

Trp

Leu

1310

1315

1320

Tyr

Leu

Thr

Pro

Thr

Ser

Trp

Ala

Leu

Asn

Ala

Leu

Thr

1325

1330

1335

Ser

Gln

Tyr

Gly

Asn

Ile

Glu

Lys

Glu

Val

Lys

Ala

Phe

Gly

Glu

1340

1345

1350

Thr

Lys

Ser

Val

Ser

Ile

Phe

Leu

Asn

Asp

Tyr

Phe

Gly

Phe

His

1355

1360

1365

Gln

Asp

Lys

Leu

Ser

Val

Ala

Val

Leu

Val

Ala

Phe

Pro

1370

1375

1380

Phe

Val

Leu

Ile

Leu

Phe

Ser

Leu

Ser

Ile

Glu

Lys

Leu

Asn

1385

1390

1395

Phe Gln Lys Arg

1400 <210> 5 <211> 4209 <212> ДНК <213> Triticum aestivum cv Renan <400> 5

atggagggcc	tcgcaagaga	gaccaaccca	tcatcccacc	atcaagattt	caccgcctgt	60
gcgagtgacg	agcgcccgga	tgagtccgag	ttagaattgg	catcgcgaca	gcgccagaat	120
ggtgctgcaa	acaccgagca	tgtgagtgag	aacatgctgc	ttgacagcag	caagttggga	180
gctctcaaga	ggcgcgagtt	cttcgacaac	ctgctaaaga	acctcgaaga	cgaccacctc	240
cgctttctgc	gcggacaaaa	ggaaagaatt	gacagggttg	atgtcaagtt	gccagcaata	300
gaggtgaggt	ataataatct	gtttgtggag	gcagagtgca	gagttactaa	aggaaatcac	360
ctgccatctc	tatggaatag	taccaaaggt	gccttctcgg	gcctcgtgaa	gttgctaggc	420
ttcgaaacgg	aaagagcaaa	aaccaacgtt	cttgaagatg	tcagtggaat	catcaaaccc	480
tgcagattga	ctcttctact	gggacctcct	ggatgtggca	aaagcactct	gttgcgagct	540
cttgccggga	aactagataa	atctctaaag	gtaacagggg	atatctctta	taatggttat	600

- 58 031178

gaacttcatg	aatttgtacc	tgagaaaaca	gctgtgtata	tcaaccaaca	tgatctgcac	660
atagctgaga	tgactgtgag	ggaaacttta	gacttctcag	cccagtgcca	aggtgttgga	720
agaagaccaa	aaatactcaa	ggaggtgaac	acaagggaga	gtgtggctgg	gatcatacct	780
gatgcggaca	tcgatctata	catgaaggta	gtagcagttg	aagcttcaga	gcgaagccta	840
cagacagatt	atattttgaa	gatcatgggg	ctagagatat	gcgcagacac	gatggttggg	900
gatgcaatga	gaagaggaat	atcagggggg	cagaagaaaa	gattaaccac	agccgagatg	960
attgtgggcc	ccgcaagtgc	atactttatg	gatgaaatat	caaatggtct	ggatagctct	1020
accacttttc	aaataatcaa	ttgtttccag	caactgacaa	acatcagcga	gtacacgatg	1080
gttatttcac	ttcttcaacc	aacacctgag	gtatttgatc	tttttgatga	cctcatacta	1140
atggcagaag	ggaagattat	ctaccatggc	cctcgaaatg	aagctctcaa	tttttttgag	1200
gagtgtgggt	tcatatgccc	agaaagaaaa	gcggcagctg	actttcttca	agagatcttg	1260
tcctggaagg	accaacaaca	gtactggttg	ggtccacatg	aatcatacag	atatatctca	1320
cctcatgaat	tatcaagcat	gttcagggag	aatcacaggg	ggagaaaact	acatgaacaa	1380
agtgtacctc	ccaaaagcca	gttgggcaag	gaagctttag	cattcaataa	gtattcgcta	1440
caaaaactgg	aaatgttcaa	agcctgtgga	gcaagggaag	cactcctaat	gaaaaggaat	1500
atgtttgttt	atgtcttcaa	aacaggccag	cttgccatta	ttgcactcgt	aacaatgtct	1560
gtattccttc	gaactcgcat	gacaataagt	ttcactcatg	caaattacta	tatgggagca	1620
ttattttttt	ccatcttcat	gattatgtta	aatggcatac	cagagatgag	catgcagatt	1680
gggagactcc	caagttttta	caagcaaaag	agctactatt	tctattcatc	atgggcatat	1740
gcaataccag	cttcagtcct	aaaggtccct	atttccatac	tggattcgct	tgtatggata	1800
tctatcacat	attatggtat	tggttataca	cctactgttt	caaggttctt	ctgccagttt	1860
ctgatacttt	gtcttctcca	tcattcagtc	acctcgcagt	atcgatttat	tgcttcatac	1920
ttccaaacac	ctattgtgtc	tttcttctac	ctttttcttg	ctctaacagt	attccttaca	1980
ttcggaggct	tcattcttcc	caagacctcc	atgccaggat	ggttaaactg	gggattttgg	2040
atatctccaa	tgacatatgc	agaaatcagc	atagttatta	acgaattctt	ggcaccaaga	2100
tggcagaagg	aaagtattca	aaacataaca	attgggaacc	aaatcctggt	taatcatggc	2160
ctatattaca	gttggcatta	ttattggata	tcctttggag	ccttgcttgg	atctattctc	2220
ttattttata	tcgcttttgg	attggcacta	gattacagaa	cacctacaga	agaatatcat	2280
ggaagcaggc	ctacaaagag	cttatgtcaa	cagcaggaaa	aagattacac	tattcaaaat	2340
gaatctgatg	atcaatcaaa	tatttccaaa	gcaaaggtga	ctataccagt	tatgcatctt	2400
ccaattacat	tccacaatct	gaactactac	attgataccc	caccggaaat	gctgaaacaa	2460
ggctatccaa	caagaagact	tcgactgctt	aataacataa	ctggtgcttt	acgtcccggt	2520

- 59 031178

gttctttctg	cactaatggg	tgttagtgga	gctgggaaga	caactctact	agatgtatta	2580
gcaggaagga	aaacaggagg	ttatattgaa	ggggacataa	gaataggtgg	atatcccaag	2640
gtgcaggaaa	catttgtcag	aatcttgggt	tactgcgaac	aagtcgacat	acattcccca	2700
cagcttacag	ttgaagagtc	tgtaacttat	tctgcgtggc	ttcgtctgcc	ttctcatgtc	2760
gacgaacaaa	caagatctaa	atttgttgct	gaagtccttg	aaactgttga	actagatcaa	2820
ataaaagatg	tcttagtggg	gtcaccacag	aaaaatggat	tgtccatgga	gcagagaaag	2880
aggctaacga	ttgcagtcga	gcttgtttca	aacccatcaa	tcatactaat	ggatgaacca	2940
acaacaggtt	tagatacaag	gtcagcagcc	attgttattc	gtgcagtcaa	aaatatttgt	3000
gaaacaggaa	ggacagtagt	ctgtacaatc	catcagccga	gcactgaaat	ttttgaggca	3060
tttgatgagc	tcatattaat	gaaaagcggt	gggaaaacaa	tctacagtgg	accaatagga	3120
gagcgctcct	gcaaagtgat	cgagtacttt	gagaaaattt	ctggagtccc	aaaaataaag	3180
agtaactgca	atccagctac	ttggatgatg	gatgtaacat	cgacatcaat	ggaggttcaa	3240
cacaatatgg	actttgcaat	tttgtatgaa	gagtcgtcac	tgcatagaga	agctgaagat	3300
ctagtggagc	agctaagtat	cccattacca	aattcagaaa	atctatgttt	ctcccatagt	3360
tttgcacaga	atggctggat	tcaacttaaa	gcttgcttgt	ggaaacaaaa	cataacttac	3420
tggagaagtc	ctcagtataa	cttgaggcgc	attatgatga	ctgtcatatc	tgccctgatc	3480
tacggaatat	tgttctggaa	gcatgcaaaa	gtattaaaca	acgagcagga	catgctcagt	3540
gtttttggtg	caatgtattt	gggtttcacc	accataggcg	cttataatga	tcagacaatc	3600
ataccattca	gtacaactga	gcgtattgta	atgtatcgtg	agagatttgc	aggaatgtat	3660
tcatcttggt	catattcatt	cgcacaggct	ttcattgaga	taccctatgt	atttatccaa	3720
gtggtactgt	atacgttaat	tgtctatccg	tcaactggtt	attattggac	agcacacaaa	3780
ttcctatggt	tcttctacac	cacattttgt	tcaattctct	cctatgttta	tgttgggttg	3840
cttcttgttt	ccataacccc	caatgttcaa	gtagctacca	tactggcttc	atttttcaac	3900
accatgcaaa	cactattctc	aggatttatt	ttacctgcac	ctcaaatccc	gaagtggtgg	3960
acttggctct	actatctcac	tcctacatct	tgggcactca	atgccctctt	gacatcacaa	4020
tacggaaaca	tagaaaaaga	ggtgaaagca	tttggagaaa	ctaaatcagt	ttcaatcttc	4080
ttgaatgact	attttgggtt	tcatcaagat	aagttgagcg	tagtagcagc	tgtcctcgtt	4140
gcctttcctt	ttgtgttgat	aatcttgttt	tcgttgtcca	ttgagaaact	taatttccag	4200

aagaggtaa 4209 <210> 6 <211> 15120 <212> ДНК

- 60 031178 <213> Aegilops tauschii

<400> 6 gcagccaact	cgagatataa	ctagaaggca	tctggagcgt	cggtctcgag	ctgttacaca	60
ctcgctcacc	gggcccctcc	tagcgccctc	aacaaccttt	gacctccccc	ccaacggtgg	120
taccagacgc	cccggaacta	gccgcactcc	cccccccccc	tccgaatggg	ggcaacgaaa	180
acaaggggca	cccaggcgcc	aagaataaga	agagagggcc	ggtgcgctcc	gctaggtacc	240
aacaggctca	ccctccctcc	gcggccgttg	ttgcctccat	cgagccagcc	gccgactccg	300
accacgatgg	ccggccttgc	ttcaactgtg	tgatccccgg	ttacttccaa	gtcgcatgcc	360
ccaatcgtcc	gatgtgctac	ttgtgtaagg	atcccgggca	tcccgctctg	ttgtgcttga	420
accggtcggt	ttcggaggag	ttgatgatgt	acgggcacgg	cccagggggc	atgcgcttct	480
tccacatcaa	ggtcccggat	gccccacccc	ctgcgaaaag	atcagatcta	ttataaagat	540
tcaccagaag	tacaaaacac	ctcaaaacat	aataaaattt	acatcaaggt	ccatggagga	600
atggaccacc	gaacggccat	tgcctcagcc	agaaccgagc	cgccgacacg	ccgctatcga	660
cgctcccata	ccggagccgg	tctgaccttg	tcgatgatag	ccgaaaagtc	ttcgtgtgcg	720
tgcccttaag	gatcagcgtc	ccagagccgc	agtcgtcacc	gttgaatcct	tgaatcagtc	780
taaagaattt	gacaccaaat	atcgccgttg	cgtacgcacg	gcgagaaact	ctaacctctc	840
cgccccgagg	agctggcaga	aatctacgcc	gaagctccgt	ctaatccgtc	ctagaggacg	900
aacttgagga	ggatcggaac	ccgaaagact	gactcgaaga	agaagcgccg	ccatccgtcc	960
aaacgccgcc	cctgcgagaa	ctaaaactct	acctgtctac	tagccggaga	caaggcacca	1020
gaaatcccct	ccctgccacc	agccgccgga	acggcaggcg	gagggaaggg	gaatccacgg	1080
gctcgccgat	gaagatcaag	gggaggaagg	cttttcacga	caggggaaag	aaaagcaatc	1140
ttaatctttt	atatctttac	aaccaaaatt	ccaaattgag	ttttggttcc	atattcatgt	1200
ttctattaca	agggctttaa	ataatatcca	tttttaatac	gatttgatga	gtttttaaaa	1260
cttcattaag	ttgcagctgc	tgaaacttgg	taccagcaag	cgacaaaatc	atgaaacttg	1320
atgcgagcga	atggcaaaat	cgtaagtttc	aaaaactgaa	acttaaaact	tgatgtgccg	1380
tcgtgcggaa	ccatcgagca	gccgggcagg	tgcgtgccac	gcgcctgcgt	gcccctgcga	1440
gttttccgcg	caagagcgcg	aacaaacggt	actgcacata	ttgcagtttc	aagttgccga	1500
gtgcgactct	gtggtcaatg	tcgtcgaagg	ctctttcatc	aagtaattac	aataccattt	1560
caactttcat	gggtccgtgc	ctgccaggtt	caaagttcca	agatggttat	gtgcaaccga	1620
ctgtgtgtcc	cacatccaca	catcgaagca	gaggtctcgt	gaagtctttc	caaacgagca	1680
agagcaacat	caaggacgac	cagcggaggg	ggtctttcca	aacgagtggt	ttctatcctc	1740
ccgtagaatg	ggtgatccac	gacaagtcta	tgagtcgttc	tgaggttgag	actaataaat	1800

- 61 031178

taattgtggc	taatcgacac	tagtcgacac	cgaagttgct	actcacagac	tagtcgacac	1860
tgaagtgtag	tcggccccgg	agttgtgact	tctagactag	tctatagact	tgtccttcga	1920
ctcataatcc	atgctcgtca	tccagccccc	attaacccca	tccatgtgac	tccctgcgta	1980
acataacctg	ttcggttact	ccccttctaa	tccatgacta	aaattgcact	tcaatctttt	2040
tccgaagtcc	cgttttgcgg	tggcatatat	ccaatttaca	agctaaaaaa	aagtgcggtg	2100
gggttctttc	ccgtcacaaa	gaaaacccaa	aataaggcaa	atcaggtctc	cgaatcagga	2160
gtactgtgaa	gtcttcacca	gtaccatata	atacatgact	tatggctgtc	atcttccaga	2220
atgtgcgttt	ccatgctaat	agttagtttg	aagtcaacac	atgactggtc	tttccaactc	2280
ttctgactga	tgatgtccgt	atgggaaaaa	gcgtgcgtac	atgctcgcca	aaaccttata	2340
tatgtactct	aaagagaagg	aaatgactgc	ttagagtacg	gctaggcaat	agcaaagggc	2400
gtcgatttaa	ctcacccatc	ttgagatgga	gggcctcgca	agagagacca	acccatcatc	2460
ccaccatcaa	gatttcaccg	cctgtgcgag	tgacgagcgc	ccggatgagt	ccgagttaga	2520
attggcatcg	cgacagcgcc	agaatggtgc	tgcaaacacc	gagcatgtga	gtgagaacat	2580
gctgcttgac	agcagcaagt	tgggagctct	caagaggcgc	gagttcttcg	acaacctgct	2640
aaagaacctc	gaagacgacc	acctccgctt	tctgcgcgga	caaaaggaaa	gaattgacag	2700
gcatgttttc	tttttcagaa	cactgttcta	agtaactgga	tgaagattag	actctgttta	2760
tgcaactgtt	tatttttccc	ctgtgatcca	tttccacagg	gttgatgtca	agttgccagc	2820
aatagaggtg	aggtataata	atctgtttgt	ggaggcagag	tgcagagtta	ctaaaggaaa	2880
tcacctgcca	tctctatgga	atagtaccaa	aggtgccttc	tcggtaagaa	acctctgaaa	2940
tgattgattt	ttattatgca	ccaaatagca	gcatctgaag	caactgtttt	ttcgacgaat	3000
cataaatgga	actgataaga	cacagatata	tgttggatgg	tattgactaa	cttacccgtt	3060
ttcatttgag	ttacagggcc	tcgtgaagtt	gctaggcttc	gaaacggaaa	gagcaaaaac	3120
caacgttctt	gaagatgtca	gtggaatcat	caaaccctgc	aggtatgtgc	catgtttcat	3180
gagtgtttag	tataaaaatg	gaaaagaaac	cataaacata	caaaagaaaa	cgtgcgaaat	3240
ttagtgcatc	aagtgtctgt	agttcttgct	ttagagatta	aggttagttc	tgattccata	3300
tgttcccatc	tttgtagatt	gactcttcta	ctgggacctc	ctggatgtgg	caaaagcact	3360
ctgttgcgag	ctcttgccgg	gaaactagat	aaatctctaa	aggtacaaat	actgtcttcc	3420
tttcataatt	aaagaaaaaa	gcatgtcctt	gttttcactg	attgcatctg	ctcctataaa	3480
gatctcaaga	ttactcaata	cttggccaaa	tgaaagaaca	aaaaaattaa	gatctcaacc	3540
agctgcacac	cgcagtaaac	tgctctctgt	cctctggccg	ctacataata	gaccacatat	3600
gaagccagta	cacaaataaa	tgtataacct	acaatctttt	ctcaaagtct	acatcattca	3660
tgaatagcca	aagagccaaa	cttaagtttt	tatcaatacc	ccacaaacaa	taaactcgcg	3720

- 62 031178

cctcttgaga	gctccgaact	tgctgctgtc	aagcagcaag	ttctcacgca	catgctcaaa	3780
tgtttgcagc	accattctgg	cgccgtcgca	ctgacaattc	taactcggac	tcgtcgggac	3840
cctcgtggtc	atacgccagc	gctcccaaat	cctgatacca	gaacagataa	tgacgctgac	3900
gctgccagag	gagacggcgc	aattgcctta	atcctcggca	catagtgtcg	caacacatac	3960
atgtgcccaa	ctactcctcg	gcaccacgcc	cgccggagga	caagccggcg	ctcctgtccc	4020
ctaaccatga	caccgacatc	aagaacctcc	gcctagaact	cttgcacaac	ctcctccgtc	4080
ttctggtgac	agaaacgcgc	caccggtgac	acaaagccac	cgtcatccgc	atatgaccca	4140
acctccagca	gcatcctgag	attcaacaca	tgacacctcc	gctgccctct	cctccatggc	4200
atcctcggca	gccaggaaag	ataatctcaa	tccgctggat	ccccctaaag	taggcgtcta	4260
ggcgatcact	gtggcggcag	ggtgagtcac	cttcagggca	gcgctctcat	ccaattccta	4320
tgtaggtttg	ctactactgc	acggggacct	atcagatgta	tctcacagac	caattagata	4380
aatcgatggt	cgaatttgga	agttataatg	agatacactg	ttgtgattaa	atttgatcac	4440
gctatattgt	agaggaaagt	gtaattccct	tgaaatgaac	aacatgcaac	atagtagtat	4500
agaatcgccg	caaattttcc	ttgcgtttgg	atataaaact	caggcccatg	ttccatcttt	4560
ttaactgtgt	atatgcccta	gcagcgtgaa	catactactg	gtcctgctag	aacaagcggc	4620
gggtaaagat	gggcgcctgc	ttcatacttg	ccagtaaatt	aggatgattg	ccttgcagaa	4680
aatatggcca	atattaccat	taagcctatt	taccgaaatc	taacacaaac	ttttgactgt	4740
aggaaacaaa	gaatcaattc	tactaacaga	tttttctttt	gttcgagaaa	atgcttatgc	4800
gtgtgtcgat	gcattaaaag	gaaagagaat	aacagccatt	caggattaca	agccctaaga	4860
aggaccatgg	aactcctgaa	ccaaggttac	acgccaggca	ggaggagctg	gagttttgcc	4920
gcacgggcga	aacccagcaa	gtcgcctccg	tgctacgcta	ggtctagcca	tactgaagga	4980
tacatcattg	tgatgagcac	caggccgtca	tctgaatgag	tgtcagacaa	ctgacagaat	5040
aacattactc	acatcaaaag	caaaagttgt	ccatcacctc	agagtctatg	gttttcatta	5100
gttgcacatg	gttaacgacc	tctgacaaag	gcagaaattc	aagaatgcct	tgcactgaac	5160
gacggatatc	agtatactta	agttgctttt	ttacagcacc	aactgatgct	ggagttatca	5220
aattgaaatg	tcccaactcc	ccagcaaagc	cacctatatt	gtctccaaaa	catataattg	5280
ttggcatggt	ttccacctgt	atgaaaccgg	cactatttac	tggctcaaat	gagtagttcg	5340
tcatgaagct	agtacttata	ctgactgctg	aatactaata	aataacagct	tttaattatt	5400
ttcagaccaa	gtactttcag	agaaaactat	tttcagatca	gcttctaatt	aatactccct	5460
cagttccaaa	atataaggtg	tattagtttt	ttcaagaggc	attcatgttt	gaccaagttt	5520
ttagaaaaaa	aatatcaata	tctacaatac	caaatttgta	tgattagatt	tatcacgaaa	5580

- 63 031178

agtatttttc	atattttatt	tattttatat	tgcagaatgt	taatatttta	ttctataatc	5640
ttggtcaaac	atacataagt	ttgacttgca	cgaacactga	tgcaccttat	attctggaac	5700
ggagggagca	aataacagca	cacaatagat	tatgggtacc	tgctgggtat	tcctgcttag	5760
agatacaacc	acagaaaagc	agagcagaac	agcacaaatg	ccctttagcc	attgacacta	5820
caattagttt	caaagctaca	attttgcaaa	atcatgaaca	aaagaagaaa	aaaaatggca	5880
aactgaatgt	aacgatgcaa	gcttttacag	gtaacagggg	atatctctta	taatggttat	5940
gaacttcatg	aatttgtacc	tgagaaaaca	gctgtgtata	tcaaccaaca	tgatctgcac	6000
atagctgaga	tgactgtgag	ggaaacttta	gacttctcag	cccagtgcca	aggtgttgga	6060
agaagaccaa	gtaagtctat	tggacagtcc	tcacaagaat	tcatgatcaa	aaataagttc	6120
ttaaataatc	acaacatttg	ttgctcacta	aatttgtttg	cccaaagaaa	tactcaagga	6180
ggtgaacaca	agggagagtg	tggctgggat	catacctgat	gcggacatcg	atctatacat	6240
gaaggtaaaa	aatcgtgtct	cctatgtact	ggctggcatt	atcctttctc	actttacaat	6300
taaaaaaaaa	acagacctgc	ttatctgagt	tacaaagaaa	aggtaattca	acgtcgaatg	6360
aatattggaa	ctgctctagc	agaataatat	ttggttgtat	taaagctaag	ctagcttttc	6420
aatttttcat	tagtcaacac	ttctgtttct	gtttctacaa	attaaacgta	actgtttttc	6480
aaaagtaaag	cggctaatgc	aggtagtagc	agttgaagct	tcagagcgaa	gcctacagac	6540
agattatatt	ttgaaggtac	cccttgccaa	aacatctaag	tttatgcata	acttggtgct	6600
gaaggcagat	aggaacaaga	tactaacaga	atcacaatac	tgatttattt	gtagatcatg	6660
gggctagaga	tatgcgcaga	cacgatggtt	ggggatgcaa	tgagaagagg	aatatcaggg	6720
gggcagaaga	aaagattaac	cacaggtata	gtaaacccaa	tgggaaatac	attaaccaac	6780
aagggatcac	cttgtatata	atctttcacc	tacttgtacc	agccgagatg	attgtgggcc	6840
ccgcaagtgc	atactttatg	gatgaaatat	caaatggtct	ggatagctct	accacttttc	6900
aaataatcaa	ttgtttccag	caactgacaa	acatcagcga	gtacacgatg	gttatttcac	6960
ttcttcaacc	aacacctgag	gtatttgatc	tttttgatga	cctcatacta	atggcagaag	7020
ggaagattat	ctaccatggc	cctcgaaatg	aagctctcaa	tttttttgag	gagtgtgggt	7080
tcatatgccc	agaaagaaaa	gcggcagctg	actttcttca	agaggtaatt	gttctcaatc	7140
acaaaaataa	ctgcagcaac	tgagatgatt	tgcacgttga	tgaaaccagt	ttttttttct	7200
aattttgaaa	tcattagatc	ttgtcctgga	aggaccaaca	acagtactgg	ttgggtccac	7260
atgaatcata	cagatatatc	tcacctcatg	aattatcaag	catgttcagg	gagaatcaca	7320
gggggagaaa	actacatgaa	caaagtgtac	ctcccaaaag	ccagttgggc	aaggaagctt	7380
tagcattcaa	taagtattcg	ctacaaaaac	tggaaatgtt	caaagcctgt	ggagcaaggg	7440
aagcactcct	aatgaaaagg	aatatgtttg	tttatgtctt	caaaacaggc	caggttaaac	7500

- 64 031178

ttcattctga	ggcactcttt	cctgtacaaa	gtaaattatg	agtccaaact	gagatttact	7560
ccttgatgca	gcttgccatt	attgcactcg	taacaatgtc	tgtattcctt	cgaactcgca	7620
tgacaataag	tttcactcat	gcaaattact	atatgggagc	attatttttt	tccatcttca	7680
tgattatgtt	aaatggcata	ccagagatga	gcatgcagat	tgggagactc	ccaagttttt	7740
acaagcaaaa	gagctactat	ttctattcat	catgggcata	tgcaatacca	gcttcagtcc	7800
taaaggtccc	tatttccata	ctggattcgc	ttgtatggat	atctatcaca	tattatggta	7860
ttggttatac	acctactgtt	tcaaggtaaa	tatggaaatt	tctcaacctt	acaatgataa	7920
gaacaaacat	tgagaaactc	ttaacatatt	ttatttatat	tcatttctag	gttcttctgc	7980
cagtttctga	tactttgtct	tctccatcat	tcagtcacct	cgcagtatcg	atttattgct	8040
tcatacttcc	aaacacctat	tgtgtctttc	ttctaccttt	ttcttgctct	aacagtattc	8100
cttacattcg	gaggcttcat	tcttcccaag	agtaagataa	ccattgctca	ttgaatgcat	8160
ataacttata	agcctagcaa	atctgaacaa	atttgttact	ttattgtccc	agcctccatg	8220
ccaggatggt	taaactgggg	attttggata	tctccaatga	catatgcaga	aatcagcata	8280
gttattaacg	aattcttggc	accaagatgg	cagaaggtga	aatgattttt	ttttcaaata	8340
aaatattgag	tgataagctg	atgtcaagca	tctaacatca	ttgctgcttg	tattattttc	8400
aggaaagtat	tcaaaacata	acaattggga	accaaatcct	ggttaatcat	ggcctatatt	8460
acagttggca	ttattattgg	atatcctttg	gagccttgct	tggatctatt	ctcttatttt	8520
atatcgcttt	tggattggca	ctagattaca	gaacacgtaa	gtttgctact	aatgaacaaa	8580
gtgcatatat	attgggcttg	ggctccatgg	tgcccaggca	acatgatttg	aaatacagca	8640
aatttgggta	atgcatttag	gaaattccta	ttttggatga	tataactggt	tgtcattgct	8700
gggtataatt	tcgaaatacc	tactcgatcc	caaatatttt	tggtaaactc	atccatatag	8760
cagttttata	tacatacagg	tacctagaat	tcaagcaata	acaaaacaaa	gtacagactg	8820
aaaagatcaa	acttgtttgg	aataaattag	acttcacaaa	ttttcatgca	atatatctag	8880
atggatctgg	atataggaat	atagtgctga	ggcactatgg	agcaccagtt	aattagactt	8940
tatacacgaa	tgttacttac	tttagaatcc	tactataatt	ttgccaattt	cagctacaga	9000
agaatatcat	ggaagcaggc	ctacaaagag	cttatgtcaa	cagcaggaaa	aagattacac	9060
tattcaaaat	gaatctgatg	atcaatcaaa	tatttccaaa	ggtaaagaca	taaacatctc	9120
aatacgaatt	aatagtaaaa	aatatgaagg	tcccataaaa	gtgcatgctt	cttcaatgca	9180
ttcatcttat	tgcagcaaag	gtgactatac	cagttatgca	tcttccaatt	acattccaca	9240
atctgaacta	ctacattgat	accccaccgg	taattaagca	agccccctat	gcatttgttt	9300
tgtagttttt	tatatttctt	gcctggttcg	tatttgatga	tgaaggtatg	taagaaatgt	9360

- 65 031178

actctcttgt	aggaaatgct	gaaacaaggc	tatccaacaa	gaagacttcg	actgcttaat	9420
aacataactg	gtgctttacg	tcccggtgtt	ctttctgcac	taatgggtgt	tagtggagct	9480
gggaagacaa	ctctactaga	tgtattagca	ggaaggaaaa	caggaggtta	tattgaaggg	9540
gacataagaa	taggtggata	tcccaaggtg	caggaaacat	ttgtcagaat	cttgggttac	9600
tgcgaacaag	tcgacataca	ttccccacag	cttacagttg	aagagtctgt	aacttattct	9660
gcgtggcttc	gtctgccttc	tcatgtcgac	gaacaaacaa	gatctgtatg	tcatcagtct	9720
cagagatata	tcgaatttaa	taagcatagc	actagatgga	taaataagag	gcttacctaa	9780
gaaactaaca	atattcttct	tgttcctctc	gtagaaattt	gttgctgaag	tccttgaaac	9840
tgttgaacta	gatcaaataa	aagatgtctt	agtggggtca	ccacagaaaa	atggattgtc	9900
catggagcag	agaaagaggc	taacgattgc	agtcgagctt	gtttcaaacc	catcaatcat	9960
actaatggat	gaaccaacaa	caggtttaga	tacaaggtca	gcagccattg	ttattcgtgc	10020
agtcaaaaat	atttgtgaaa	caggaaggac	agtagtctgt	acaatccatc	agccgagcac	10080
tgaaattttt	gaggcatttg	atgaggtaat	ttaactttct	aaatatatta	gtatattaaa	10140
cacaatcaac	acaaatacat	ttttattata	tatatcaagc	acgatcaaca	caattttttt	10200
tctggaaaaa	tcaatatgtt	tagtttcaaa	actattagga	ttaattaaag	cccttgcctt	10260
caacagagca	gggctaatct	taatatgcac	tacctctgta	actaactccc	accgtcccat	10320
aacactcgcg	tccaaaaacg	tcttatatta	agttacagag	gtacctccgt	cccataatgt	10380
aagacgtttt	ttgacactag	tgttatggga	cggagggagt	agtacattat	tagttattta	10440
aaatttaaaa	catgtccttt	gtgtttgcct	ttctagtaaa	taataatgat	aggaaataat	10500
agtatggaaa	tttgcaatat	aagcgtgtca	accatttcac	tttgcgcaac	ctagacctca	10560
aattgcactt	ttgtcccctc	aaatgatcaa	ttatgtgcaa	caaaaccctt	caacttaaac	10620
tttgcttatc	tgaaaccttc	tattatttgg	tttgttagat	caagcatttt	ctactgaaga	10680
tacctgatca	gacccctttg	aataatatat	ctatgaataa	acattgattt	gagctaagta	10740
ggattggcat	ctaaattata	gtaagacgct	taacaactat	ttactactcc	ctgtctcaaa	10800
atgtaagaca	ttttttgacc	ctttgaataa	tatatctatg	atataaacat	tggtttgagc	10860
taagtaggat	tggtatctaa	attatagtaa	gatgcttaac	aactatttac	tactccctct	10920
gtctcaaaat	gtaagacatt	ttttgacaca	tgtaagacgt	tttttgacat	tatcagtgtc	10980
aaaaaatgtc	ttacattttg	agatagaggg	agcatctagc	atcctttttc	tgtttcggga	11040
gaacatttct	taccttaaat	atttggcata	tactttttgt	acaaaaacaa	ccccattata	11100
tcagtccgca	tgaagaataa	agtataaaca	tgcaatgaca	tgttttgatc	tcttaattat	11160
ttgaacatct	atgtgttcga	tgtcagttaa	tttttatctc	ttatttgaac	taagtgtcca	11220
cactgacaca	aatttgtcat	cgcacaaaat	ttggactttc	tgggcttgat	tacaaaatta	11280

- 66 031178

aaacaatttt	gagggcttat	actggaaagt	caccgaatag	aatatttttt	ggttttctga	11340
actatatgtt	tatcacaaat	cgacgtgact	acggacagtt	tatatttgct	acttctctgt	11400
ttataataac	aaaaagggta	tagattttct	ttattacagg	gctagttgta	gtcgaaagtt	11460
gcctataatg	catgtagtaa	attttgttgc	agctcatatt	aatgaaaagc	ggtgggaaaa	11520
caatctacag	tggaccaata	ggagagcgct	cctgcaaagt	gatcgagtac	tttgaggcaa	11580
gtttcttgaa	catatttcca	caaatgtatt	tgcctttttc	ttgattattc	gttttcactg	11640
tttttttctg	gaattggaac	aataaacgtg	agagttccaa	aggaacgaac	cccaaaacca	11700
gtgctcaaat	gttcaacatg	ccatagcaaa	aacacttaag	tcaactctag	cagtcatttg	11760
tgttcaatat	gtaacttggc	taacaattca	catgaaatat	ataggttaat	caaaattttg	11820
atgtgatcat	atgtatttta	catgttgaac	ttaaaagcaa	atgtgacaat	aaacgtacag	11880
attggcaatg	gaaactaaaa	acatactgaa	gaactttgtt	tgcatatcta	tgtatgtgtt	11940
tcggtgtttt	cagagaggaa	gcacggttgt	ggcatggcac	tgccatattt	gtgacatgtg	12000
tcctttggtt	ctaatagatt	gaatttttct	tgtccacttg	atagaaaatt	tctggagtcc	12060
caaaaataaa	gagtaactgc	aatccagcta	cttggatgat	ggatgtaaca	tcgacatcaa	12120
tggaggttca	acacaatatg	gactttgcaa	ttttgtatga	agagtcgtca	ctgcataggt	12180
acatatcttg	tggatttagt	taggatatcg	agcaaaaggc	aacatatatg	aatagcttaa	12240
gcaaaataaa	attcatctag	caaaaaaatt	tagccaaaca	aaatacctcc	atttgaagtt	12300
tggaagaatt	aaagttactt	ttctgcagag	aagctgaaga	tctagtggag	cagctaagta	12360
tcccattacc	aaattcagaa	aatctatgtt	tctcccatag	ttttgcacag	aatggctgga	12420
ttcaacttaa	agcttgcttg	tggaaacaaa	acataactta	ctggagaagt	cctcagtata	12480
acttgaggcg	cattatgatg	actgtcatat	ctgccctgat	ctacggaata	ttgttctgga	12540
agcatgcaaa	agtattgtaa	gttcactcct	ttgttatcca	caacattgca	catcagttga	12600
cttcacagac	tcattgcaaa	attattctaa	ctttctctta	tctcttctaa	gaaacaacga	12660
gcaggacatg	ctcagtgttt	ttggtgcaat	gtatttgggt	ttcaccacca	taggcgctta	12720
taatgatcag	acaatcatac	cattcagtac	aactgagcgt	attgtaatgt	atcgtgagag	12780
atttgcagga	atgtattcat	cttggtcata	ttcattcgca	caggtcagat	aatgatcaca	12840
agcttgtaag	agaagtaaaa	tatacattga	cactgatgct	catatttatt	caccttctac	12900
aggctttcat	tgagataccc	tatgtattta	tccaagtggt	actgtatacg	ttaattgtct	12960
atccgtcaac	tggttattat	tggacagcac	acaaattcct	atggttcttc	tacaccacat	13020
tttgttcaat	tctctcctat	gtttatgttg	ggttgcttct	tgtttccata	acccccaatg	13080
ttcaagtagc	taccatactg	gcttcatttt	tcaacaccat	gcaaacacta	ttctcaggat	13140

- 67 031178

ttattttacc	tgcacctgta	agtctttatc	tcctcccaat	atcgtaaact	ttagctctcc	13200
aagatgtaac	tggcacttct	ttttgttagc	aaaaatatgg	ctgcccacct	tgaatatata	13260
ccaactaaga	aaataacaac	ctacatgaga	aattgtaatt	gacgagattt	tgtagtgtaa	13320
ttatgtaata	atattatgga	actaataaag	gtctaatagg	gcattatggg	ctttacttta	13380
ttccagagtt	catgttcgtg	cagaagtctc	ctattgtact	acatctaggt	tacccttata	13440
ggcatcctat	taatgcattc	tgccttacaa	aggtatcaaa	ttaggtttta	gggtttttat	13500
cctggtaaac	ttttctttat	ctttttttgt	caatattcac	ctttgcaact	tccccaccat	13560
gacacctttt	tttccttctg	ccccagatcc	tcaattttac	tgattgctta	atttttgtga	13620
tcgatcaact	gatctatcct	cctgatagat	cttagttttg	ggaatattta	agtagtaata	13680
tgtcaacaat	acaaggacca	accgcaacta	taaggcatca	ctggatgacg	atacacagaa	13740
ccactccaat	gttagtttaa	catcataata	gttatagaca	taccatcttc	agtttcatca	13800
ttaatacttc	catttctatt	ttctaggttg	gaaattgata	attattccag	cgttgctcaa	13860
tagaataatc	atgttctgtt	caattgttag	ggaagaatca	tgaatagagg	aaagcactaa	13920
tatgcatttt	caattcacgt	tgcagcaaat	cccgaagtgg	tggacttggc	tctactatct	13980
cactcctaca	tcttgggcac	tcaatgccct	cttgacatca	caatacggaa	acatagaaaa	14040
agaggtgaaa	gcatttggag	aaactaaatc	agtttcaatc	ttcttgaatg	actattttgg	14100
gtttcatcaa	gataagttga	gcgtagtagc	agctgtcctc	gttgcctttc	cttttgtgtt	14160
gataatcttg	ttttcgttgt	ccattgagaa	acttaatttc	cagaagaggt	aagcaagttc	14220
tgacattcca	acagacatga	atctgtacat	gttacagata	tagctacttg	ccttttttcc	14280
aactgcgaaa	tgcagaatca	gagctgattg	ggtggctatt	tttctcaaat	ctgatgggta	14340
aacctcatga	ataagtaatt	gtgtacaata	acttgattgt	gctaagtacg	attgtgagtt	14400
gtaatctttt	tgtttcaccg	ttcagaagaa	tttgatggtt	acaaatcatg	taacctgctt	14460
tgaagaggat	tttgcaattg	tgttatgcct	tagattactg	aatgcatcaa	gaggaaaatg	14520
agcacctaac	tgaatgaacc	tacgatttaa	agcgagctta	agcacagata	acaaaaagct	14580
aacttggatt	cccgcaccgt	catcatcatg	ccttaatatc	cgtgcaaggt	gtgtgagtgg	14640
tgggtggttt	ctgaagagaa	acgtggccac	acgtcacggc	atgcggggcg	ccgtttggat	14700
ttcctttgag	ctatataaaa	cgggaacggc	agcatggaat	ggtacacttc	tctcactttc	14760
acccatcttc	atcttgctca	tgtgctcact	ccgccgttgc	aaacaaagct	tctcgcatca	14820
agcttttctc	cccttcctct	attagacaag	ttgaagccag	acacacccga	tgagcgcaga	14880
ggtgcaagcc	gaaggagagg	atgcagcgca	accactaggg	gtgctaccag	caagaagggt	14940
gccactagca	agggtgccgc	caacgacaca	aaagggaaat	gggtcacttc	gtcggcgaca	15000
caacatcgtc	gacacaagat	caactgacaa	agctcgccaa	ctgttgcttc	ttccccaata	15060

- 68 031178 ttgttcttcc cgaagcaaat ggaagttcac tggcgcgcac cgccgcggga gcagatcgtg

15120 <210> 7 <211> 841 <212> ДНК <213> Triticum aestivum <400> 7

ggaatatgtt	tgtttatgtc	ttcaaaacag	gccagcttgc	cattattgca	ctcgtaacaa	60
tgtctgtatt	ccttcgaact	cgcatgacaa	taagtttcac	tcatgcaaat	tactatatgg	120
gagcattatt	tttttccatc	ttcatgatta	tgttaaatgg	cataccagag	atgagcatgc	180
agattgggag	actcccaagt	ttttacaagc	aaaagagcta	ctatttctat	tcatcatggg	240
catatgcaat	accagcttca	gtcctaaagg	tccctatttc	catactggat	tcgcttgtat	300
ggatatctat	cacatattat	ggtattggtt	atacacctac	tgtttcaagg	ttcttctgcc	360
agtttctgat	actttgtctt	ctccatcatt	cagtcacctc	gcagtatcga	tttattgctt	420
catacttcca	aacacctatt	gtgtctttct	tctacctttt	tcttgctcta	acagtattcc	480
ttacattcgg	aggcttcatt	cttcccaaga	cctccatgcc	aggatggtta	aactggggat	540
tttggatatc	tccaatgaca	tatgcagaaa	tcagcatagt	tattaacgaa	ttcttggcac	600
caagatggca	gaaggaaagt	attcaaaaca	taacaattgg	gaaccaaatc	ctggttaatc	660
atggcctata	ttacagttgg	cattattatt	ggatatcctt	tggagccttg	cttggatcta	720
ttctcttatt	ttatatcgct	tttggattgg	cactagatta	cagaacacct	acagaagaat	780
atcatggaag	caggcctaca	aagagcttat	gtcaacagca	ggaaaaagat	tacactattc	840
a						841

<210> 8 <211> 821 <212> ДНК <213> Triticum aestivum <400> 8

acgctatgac	cttaggccta	tttaggtgac	actccagaac	aagtttgtac	aaaaaagcag	60
gctcgtaccg	gtccggaatt	cccgggatat	cgtcgaccca	cgcgtccgga	gaacaatcta	120
ccgcggacca	ataagagagc	gctcctgcaa	agtgatccag	tactttgaga	gaattgcggg	180
agtcccaaaa	ataaagagta	actgcaatcc	acctacttgg	atgatggatg	taacatccac	240
atcaatggag	gttcaacaca	atatggactt	tgcaattttg	tatgaagagt	cgtcactgca	300
tatagaagct	gaagatctag	tggagcagct	aagtatccca	ttaccaaatt	cagaaaatct	360
atgtttctcc	cataatgtta	cacagaatgg	ctggattcaa	cttaaagctt	gcttgtggaa	420
acaagacata	acttactgga	ggagtcctca	gtataacttg	aggcgcatta	tgatgactgt	480

- 69 031178

catatctgcc	ctgatctacg	gaatattggt	ctggaagcat	gcaaaagtat	taaacaacga	540
gcacgacatg	ctcagtgttt	ttggcgcaat	gtatttggga	ttcaccacca	taggcgctta	600
taatgatcag	acaatcatac	cattcagtac	aactgatcgt	attgtaatgt	atcgtgagag	660
atttgcagga	atgtattcat	cttggtcata	ttcattcgca	caggctttgg	ttgacatacc	720
ctatgtattt	atccaagtgg	tactgtatac	gttaattgtc	tatcggtcaa	ctggttatta	780
ttggacagca	cccaaattcc	tatggttctt	ctacaccaca	t		821

<210> 9 <211> 865 <212> ДНК <213> Triticum aestivum <400> 9

attcttctga	acggtgaaac	aaaaagatta	caactcacaa	tcgtacttag	cacaatcaag	60
ttattgtaca	caattactta	ttcatgaggt	ttacccatca	gatttgagaa	aaatagccac	120
ccaatcagct	ctgattctgc	atttcgcagt	tggaaaaaag	gcaagtagct	atatctgtaa	180
catgtacaga	ttcatgtctg	ttggaatgtc	agaacttgct	tacctcttct	ggaaattaag	240
tttctcaatg	gacaacgaaa	acaagattat	caacacaaaa	ggaaaggcaa	cgaggacagc	300
tgctactacg	ctcaacttat	cttgatgaaa	cccaaaatag	tcattcaaga	agattgaaac	360
tgatttagtt	tctccaaatg	ctttcacctc	tttttctatg	tttccgtatt	gtgatgtcaa	420
gagggcattg	agtgcccaag	atgtaggagt	gagatagtag	agccaagtcc	accacttcgg	480
gatttgaggt	gcaggtaaaa	taaatcctga	gaatagtgtt	tgcatggtgt	tgaaaaatga	540
agccagtatg	gtagctactt	gaacattggg	ggttatggaa	acaagaagca	acccaacata	600
aacataggag	agaattgaac	aaaatgtggt	gtagaagaac	cataggaatt	tgtgtgctgt	660
ccaataataa	ccagttgacg	gatagacaat	taacgtatac	agtaccactt	ggataaatac	720
atagggtatc	tcaatgaaag	cctgtgcgaa	tgaatatgac	caagatgaat	acattcctgc	780
aaatctctca	cgatacatta	caatacgctc	agttgtactg	aatggtatga	ttgtctgatc	840
attataagcg	cctatggggg	tgaaa				865

<210> 10 <211> 810 <212> ДНК <213> Triticum aestivum <400> 10

gacattaggc	ctatttaggt	gatctataga	acaagtttgt	acaaaaaagc	aggctggtac	60
cggtccggaa	ttcccgggat	atcgtcgacc	cacgcgtccg	gttaattgtc	tatccgtcaa	120
ctggttatta	ttggacagca	cacaaattcc	tatggttctt	ctacaccaca	ttttgttcaa	180
ttctctccta	tgtttatgtt	gggttgcttc	ttgtttccat	aacccccaat	gttcaagtag	240

- 70 031178

ctaccatact	ggcttcattt	ttcaacacca	tgcaaacact	attctcagga	tttattttac	300
ctgcacctca	aatcccgaag	tggtggactt	ggctctacta	tctcactcct	acatcttggg	360
cactcaatgc	cctcttgaca	tcacaatacg	gaaacataga	aaaagaggtg	aaagcatttg	420
gagaaactaa	atcagtttca	atcttcttga	atgactattt	tgggtttcat	caagataagt	480
tgagcgtagt	agcagctgtc	ctcgttgcct	ttccttttgt	gttgataatc	ttgttttcgt	540
tgtccattga	gaaacttaat	ttccagaaga	ggtaagcaag	ttctgacatt	ccaacagaca	600
tgaatctgta	catgttacag	atatagctac	ttgccttttt	tcaactgcga	aatgcagaat	660
cagagctgat	tgggtggcta	tttttctcaa	atctgatggg	taaacctcat	gaataagtaa	720
ttgtgtacaa	taacttgatt	gtgctaagta	cgattgtgag	ttgtaatctt	tttgtttcac	780
cgttcagaag	aatttgatgg	ttacaaatca				810

<210> 11 <211> 571 <212> ДНК <213> Hordeum vulgare <400> 11 cccctgcgga aatgagggag cacggttaca tggaaaagaa actcagctac tcccaatatc 60 acgggagcat tccagccagg ggttctctcg gcactcatgg gggttactgg agcggaaaaa 120 caacactcct tgatgttctt gctggaagga aaactggcgg tgttattgaa ggggatataa 180 gaataggagg gtatcctaaa attcagcaga cttttgctag gatatcaggc tactgtgaac 240 aaactgatgt ccattcccca caaatcacag tgggtgaatc ggttgcatat tcagcctggt 300 tacgccttcc accagaagtt gatgcaaaaa taagaaccga atttgtcaac gaagttcttg 360 aaacaattga gttggacgaa attagagatt ctttggtcgg aatacctggg gtaaatgggc 420 tatcaacaga gcaaaggaaa cggctcacga ttgcagtcga gctcgtgtct aacccctcaa 480 tcatatttat ggacgagcca acgtcaggct tggatgcaag ggccgctgct attgtcatgc 540 gtgcagtgaa gaatgttgca gacacaggcc g 571

<210>	12
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	12
catcaagatt tcaccgcctg tgc	23

<210> 13 <211> 23

- 71 031178 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 13 gaagcctagc aacttcacga ggc 23

<210>	14
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	14
gcggggccca caatcatctc ggc	23

<210>	15
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	15
catctttcgt atacatgaga aac	23

<210>	16
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	16
gtgtcgattc atgtgagatg c	21

<210>	17
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	17
cattatgtta gcagcttagc g	21

<210> <211> <212> <213>

18 22 ДНК Искусственная последовательность

- 72 031178 <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400>18 ccaaccatca ttttggagca tg22

<210>	19
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	19
gtagatcgtg tcgtgttcaa c	21

<210>	20
<211>	22
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	20
ctgctaatcc taagtaacgc tc	22

<210>	21
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	21
cgtgagcaag acatgggcg	19

<210>	22
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	22
gctacagctc tgaaactaca c	21

<210>23 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер

- 73 031178 <400> 23 gatttgcacg ttgatgaaac cag

<210>	24
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	24
cagaatgaag tttaacctgg cctg	24

<210>	25
<211>	20
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	25
ggctggctac tacgacgacg	20

<210>	26
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	26
atggtctttt ttccttcagc c	21

<210>	27
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	27
gcctactttg acggcatatg g	21

<210> 28 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 28 ccatcttgac atactttggc cttcc 25

- 74 031178 <210> 29 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400>29 ctccctcccg tgagtatatt c21

<210>	30
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	30
atcaaaatcc cattgcctga c	21

<210>	31
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	31
gttggttaag actggtgatg g	21

<210>	32
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	32
tgcttgctat tgctgaatag t	21

<210>	33
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	33
catctttcgt atacatgaga aac	23

<210>34 <211> 21

- 75 031178 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 34 gtgtcgattc atgtgagatg c 21

<210>	35
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	35
cattatgtta gcagcttagc g	21

<210>	36
<211>	22
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	36
ccaaccatca ttttggagca tg	22

<210>	37
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	37
gtagatcgtg tcgtgttcaa c	21

<210>	38
<211>	22
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	38
ctgctaatcc taagtaacgc tc	22

<210> <211> <212> <213>

39 19 ДНК Искусственная последовательность

- 76 031178 <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 39 cgtgagcaag acatgggcg

<210>	40
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	40
gctacagctc tgaaactaca c	21

<210>	41
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	41
gatttgcacg ttgatgaaac cag	23

<210>	42
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	42
cagaatgaag tttaacctgg cctg	24

<210>	43
<211>	20
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	43
ggctggctac tacgacgacg	20

<210> 44 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер

- 77 031178 <400>44 atggtctttt ttccttcagc c

<210>	45
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	45
gcctactttg acggcatatg g	21

<210>	46
<211>	25
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	46
ccatcttgac atactttggc cttcc	25

<210>47 <211>1406 <212> PRT <213> Oryza sativa <400>47

Met 1

Ser

Ser 5

Ser

His

Pro

Glu 10

Phe

Ala

Ser

Cys

Thr 15

Ala

Asn

Asp

Glu

His

Leu

Asp

Glu

Phe

Glu

Leu

Glu

Leu

Val

20

25

30

Gln

Asp

Val

Gln

Arg

Gln

Asn

Gly

Ser

Ala

Asn

Thr

Asp

Gln

35

40

45

His

Glu

Arg

Glu

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ser

Gly

50

55

60

Ala

Leu

Lys

Glu

Arg

Leu

Phe

Asp

Asn

Leu

Lys

Asn

Val

Gln

65

70

75

80

Asp

His

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Arg

Gln

Lys

Glu

Arg

Ile

Asp

Arg

85

90

95

Val

Asp

Val

Lys

Leu

Pro

Ala

Ile

Glu

Val

Arg

Tyr

Asn

Leu

Ser

100

105

110

- 78 031178

Val

Glu Ala 115

Glu

Cys

Arg

Thr

Ala 120

Asn

Gly

Asp

His

Leu 125

Pro

Ser

Leu

Trp

Asn

Ser

Thr

Lys

Gly

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

Val

Lys

Leu

Gly

130

135

140

Leu

Glu

Thr

Glu

Arg

Ala

Lys

Ile

Asn

Val

Leu

Glu

Asp

Val

Ser

Gly

145

150

155

160

Ile

Lys

Pro

Cys

Arg

Leu

Thr

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

165

170

175

Gly

Lys

Ser

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

Ser

Gly

Lys

Leu

Asp

Lys

Ser

180

185

190

Leu

Lys

Val

Thr

Gly

Asp

Ile

Ser

Tyr

Asn

Gly

Tyr

Gln

Leu

Asp

Glu

195

200

205

Phe

Val

Pro

Glu

Lys

Thr

Ala

Tyr

Ile

Ser

Gln

Tyr

Asp

Leu

His

210

215

220

Ile

Pro

Glu

Met

Thr

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Asp

Phe

Ser

Arg

Cys

225

230

235

240

Gln

Gly

Val

Gly

Arg

Pro

Lys

Ile

Leu

Lys

Glu

Val

Ser

Ala

Arg

245

250

255

Glu

Ser

Ala

Gly

Ile

Pro

Asp

Ala

Asp

Ile

Asp

Ile

Tyr

Met

260

265

270

Lys

Ala

Ile

Ser

Val

Glu

Ala

Ser

Lys

Arg

Ser

Leu

Gln

Thr

Asp

Tyr

275

280

285

Ile

Leu

Lys

Ile

Met

Gly

Leu

Glu

Ile

Cys

Ala

Asp

Thr

Met

Val

Gly

290

295

300

Asp

Ala

Met

Ile

Arg

Gly

Leu

Ser

Gly

Gln

Lys

Arg

Leu

Thr

305

310

315

320

Thr

Ala

Glu

Met

Ile

Val

Gly

Pro

Ala

Arg

Ala

Tyr

Phe

Met

Asp

Glu

325

330

335

Ile

Ser

Asn

Gly

Leu

Asp

Ser

Thr

Phe

Gln

Ile

Ser

Cys

340

345

350

Phe

Gln

Leu

Thr

Asn

Ile

Ser

Glu

Tyr

Thr

Met

Val

Ile

Ser

Leu

355

360

365

- 79 031178

Leu

Gln 370

Pro

Thr

Pro

Glu Val 375

Phe

Asp

Leu

Phe

Asp 380

Asp

Leu

Ile

Leu

Met

Ala

Glu

Gly

Lys

Ile

Tyr

His

Gly

Pro

Arg

Asn

Glu

Ala

Leu

385

390

395

400

Asn

Phe

Glu

Cys

Gly

Phe

Ile

Cys

Pro

Glu

Arg

Lys

Glu

Val

405

410

415

Ala

Asp

Phe

Leu

Gln

Glu

Ile

Leu

Ser

Cys

Lys

Asp

Gln

Tyr

420

425

430

Trp

Ser

Gly

Pro

Asn

Glu

Ser

Tyr

Arg

Tyr

Ile

Ser

Pro

His

Glu

Leu

435

440

445

Ser

Met

Phe

Lys

Glu

Asn

His

Arg

Gly

Arg

Lys

Leu

Glu

Pro

450

455

460

Ile

Val

Ser

Pro

Lys

Ser

Glu

Leu

Gly

Lys

Glu

Ala

Leu

Ala

Phe

Asn

465

470

475

480

Lys

Tyr

Ser

Leu

Gln

Lys

Leu

Glu

Met

Phe

Lys

Ala

Cys

Gly

Ala

Arg

485

490

495

Glu

Ala

Leu

Met

Lys

Arg

Ser

Met

Phe

Val

Tyr

Val

Phe

Lys

Thr

500

505

510

Gly

Gln

Leu

Ala

Ile

Ala

Leu

Val

Thr

Met

Ser

Val

Phe

Leu

Arg

515

520

525

Thr

Arg

Met

Thr

Asp

Phe

Thr

His

Ala

Thr

Tyr

Met

Gly

Ala

530

535

540

Leu

Phe

Ser

Ile

Leu

Met

Ile

Met

Leu

Asn

Gly

Thr

Pro

Glu

Ile

545

550

555

560

Ser

Met

Gln

Ile

Arg

Leu

Pro

Ser

Phe

Tyr

Lys

Gln

Lys

Ser

Tyr

565

570

575

Tyr

Phe

Tyr

Ser

Trp

Ala

Tyr

Ala

Ile

Pro

Ala

Ser

Val

Leu

Lys

580

585

590

Val

Pro

Val

Ser

Ile

Leu

Asp

Ser

Leu

Val

Trp

Ile

Cys

Ile

Thr

Tyr

595

600

605

Tyr

Gly

Ile

Gly

Tyr

Thr

Ala

Ser

Val

Ser

Arg

Phe

Cys

Gln

Phe

610 615 620

- 80 031178

Leu 625

Met

Leu

Cys

Phe

Val 630

His

Gln

Ser

Val

Thr 635

Ser

Leu

Tyr

Arg

Phe 640

Ile

Ala

Ser

Tyr

Phe

Gln

Thr

Pro

Thr

Ala

Ser

Phe

Tyr

Leu

Phe

645

650

655

Leu

Ala

Leu

Thr

Phe

Leu

Met

Phe

Gly

Phe

Thr

Leu

Pro

Lys

660

665

670

Pro

Ser

Met

Pro

Gly

Trp

Leu

Asn

Trp

Gly

Phe

Trp

Ile

Ser

Pro

Met

675

680

685

Thr

Tyr

Ala

Glu

Ile

Gly

Thr

Val

Ile

Asn

Glu

Phe

Gln

Ala

Pro

Arg

690

695

700

Trp

Gln

Lys

Glu

Thr

Ile

Gln

Asn

Ile

Thr

Ile

Gly

Asn

Arg

Ile

Leu

705

710

715

720

Ile

Asn

His

Gly

Leu

Tyr

Ser

Trp

His

Phe

Tyr

Trp

Ile

Ser

Ile

725

730

735

Gly

Ala

Leu

Phe

Gly

Ser

Ile

Leu

Phe

Tyr

Ile

Ala

Phe

Gly

Leu

740

745

750

Ala

Leu

Asp

Tyr

Ile

Thr

Ser

Ile

Glu

Tyr

His

Gly

Ser

Arg

Pro

755

760

765

Ile

Lys

Arg

Leu

Cys

Gln

Glu

Gln

Glu

Lys

Asp

Ser

Asn

Ile

Arg

Lys

770

775

780

Glu

Ser

Asp

Gly

His

Ser

Asn

Ile

Ser

Arg

Ala

Lys

Met

Thr

Ile

Pro

785

790

795

800

Val

Met

Glu

Leu

Pro

Ile

Thr

Phe

His

Asn

Leu

Asn

Tyr

Ile

Asp

805

810

815

Thr

Pro

Glu

Met

Leu

Lys

Gln

Gly

Tyr

Pro

Thr

Lys

Arg

Leu

Gln

820

825

830

Leu

Asn

Ile

Thr

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

835

840

845

Leu

Met

Gly

Val

Ser

Gly

Ala

Gly

Lys

Thr

Leu

Asp

Val

Leu

850

855

860

Ala

Gly

Arg

Lys

Thr

Gly

Tyr

Ile

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Ile

Gly

- 81 031178

865

870

875

880

Gly

Tyr

Pro

Lys

Val

Gln

Glu

Thr

Phe

Val

Arg

Ile

Leu

Gly

Tyr

Cys

885

890

895

Glu

Gln

Ala

Asp

Ile

His

Ser

Pro

Gln

Leu

Thr

Val

Glu

Ser

Val

900

905

910

Thr

Tyr

Ser

Ala

Trp

Leu

Arg

Leu

Pro

Ser

His

Val

Asp

Lys

Thr

915

920

925

Arg

Ser

Glu

Phe

Val

Ala

Glu

Val

Leu

Glu

Thr

Val

Glu

Leu

Asp

Gln

930

935

940

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Pro

Gln

Lys

Asn

Gly

Leu

Ser

Met

945

950

955

960

Glu

Gln

Arg

Lys

Arg

Leu

Thr

Ile

Ala

Val

Glu

Leu

Val

Ser

Asn

Pro

965

970

975

Ser

Val

Ile

Leu

Met

Asp

Glu

Pro

Thr

Gly

Leu

Asp

Thr

Arg

Ser

980

985

990

Ala

Ile

Val

Ile

Arg

Ala

Val

Lys

Asn Ile Cys Lys

Thr Gly Arg

995

1000

1005

Thr

Val 1010

Val

Cys

Thr

Ile

His 1015

Gln

Pro

Ser

Thr

Lys 1020

Ile

Phe

Glu

Ala

Phe

Asp

Glu

Leu

Ile

Leu

Met

Lys

Asn

Gly

Lys

Ile

1025

1030

1035

Tyr

Asn

Gly

Pro

Ile

Gly

Glu

Arg

Ser

Lys

Val

Ile

Glu

Tyr

1040

1045

1050

Phe

Glu

Lys

Ile

Ser

Gly

Val

Leu

Lys

Val

Lys

Ser

Asn

Cys

Asn

1055

1060

1065

Pro

Ala

Trp

Met

Asp

Val

Thr

Ser

Thr

Ser

Met

Glu

Val

1070

1075

1080

Gln

His

Asn

Met

Asp

Phe

Ala

Ile

Leu

Tyr

Asp

Glu

Ser

Gln

1085

1090

1095

His

Arg

Asp

Ile

Val

Glu

Leu

Val

Glu

Lys

Leu

Ser

Ile

Pro

Ile

1100

1105

1110

- 82 031178

Pro

Asn 1115

Ser

Glu

Ile

Leu

Ser 1120

Phe

Ser

His

Arg

Phe 1125

Pro

Arg

Asn

Gly

Trp

Ile

Gln

Leu

Lys

Ala

Cys

Leu

Trp

Lys

Gln

Asn

Leu

Thr

1130

1135

1140

Tyr

Trp

Arg

Ser

Pro

Glu

Tyr

Asn

Leu

Arg

Ile

Met

Leu

Thr

1145

1150

1155

Val

Ile

Ser

Ala

Leu

Val

Tyr

Gly

Val

Leu

Phe

Trp

Lys

Arg

Ala

1160

1165

1170

Lys

Ile

Leu

Asn

Asp

Glu

Gln

Asp

Leu

Phe

Asn

Val

Phe

Gly

Ala

1175

1180

1185

Met

Tyr

Leu

Gly

Ser

Thr

Ile

Gly

Ser

Tyr

Asn

His

Gln

Ser

1190

1195

1200

Ile

Pro

Phe

Ser

Thr

Glu

Arg

Ile

Val

Met

Tyr

Arg

Glu

1205

1210

1215

Lys

Phe

Ala

Gly

Met

Tyr

Ser

Trp

Ser

Tyr

Ser

Phe

Ala

Gln

1220

1225

1230

Ala

Ile

Glu

Ile

Pro

Tyr

Val

Phe

Ile

Gln

Val

Leu

Tyr

1235

1240

1245

Thr

Leu

Ile

Tyr

Pro

Ser

Ile

Gly

Tyr

Trp

Thr

His

1250

1255

1260

Lys

Phe

Ile

Trp

Phe

Tyr

Thr

Phe

Cys

Ser

Leu

Ser

1265

1270

1275

Tyr

Ile

Tyr

Val

Gly

Leu

Val

Ser

Leu

Thr

Pro

Asn

Val

1280

1285

1290

Gln

Val

Ala

Thr

Ile

Leu

Ala

Ser

Phe

Asn

Thr

Met

Gln

Thr

1295

1300

1305

Leu

Phe

Ser

Gly

Phe

Ile

Leu

Pro

Ala

Pro

Gln

Ile

Pro

Lys

Trp

1310

1315

1320

Trp

Val

Trp

Leu

Tyr

Leu

Thr

Pro

Thr

Ser

Trp

Thr

Leu

Asp

1325

1330

1335

Ala

Leu

Thr

Ser

Gln

Tyr

Gly

Asn

Ile

Glu

Lys

Glu

Val

Arg

1340

1345

1350

- 83 031178

Ala

Phe 1355

Gly

Glu

Thr

Lys

Ser 1360

Val

Ser

Ile

Phe

Leu 1365

Asn

Asp

Tyr

Phe

Gly

Phe

His

Lys

Asp

Lys

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

Val

Leu

1370

1375

1380

Ile

Ala

Phe

Pro

Phe

Val

Leu

Ile

Leu

Phe

Ser

Phe

Ser

Ile

1385

1390

1395

Glu Lys Phe Asn Phe Gln Lys Arg

1400 1405

<210> <211> <212> <213>	48 1413 PRT Arabidopsis thaliana
<400>	48

Met 1

Gly

Ser

Phe Arg 5

Ser

Ser 10

Arg Asn

Glu

His

Glu 15

Asp

Gly

Asp

Glu

Ala

Glu

His

Ala

Leu

Gln

Trp

Ala

Glu

Ile

Gln

Arg

20

25

30

Leu

Pro

Thr

Phe

Lys

Arg

Leu

Arg

Ser

Leu

Val

Asp

Lys

Tyr

Gly

35

40

45

Glu

Gly

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Val

Asp

Val

Thr

Lys

Leu

Gly

50

55

60

Ala

Met

Glu

Arg

His

Leu

Met

Ile

Glu

Lys

Leu

Ile

Lys

His

Ile

Glu

65

70

75

80

Asn

Asp

Asn

Leu

Lys

Leu

Lys

Ile

Arg

Met

Glu

Arg

85

90

95

Val

Gly

Val

Glu

Phe

Pro

Ser

Ile

Glu

Val

Arg

Tyr

Glu

His

Leu

Gly

100

105

110

Val

Glu

Ala

Cys

Glu

Val

Glu

Gly

Lys

Ala

Leu

Pro

Thr

Leu

115

120

125

Trp

Asn

Ser

Leu

Lys

His

Val

Phe

Leu

Asp

Leu

Lys

Leu

Ser

Gly

130

135

140

Val

Arg

Thr

Asn

Glu

Ala

Asn

Ile

Lys

Ile

Leu

Thr

Asp

Val

Ser

Gly

145

150

155

160

- 84 031178

Ile

Ser

Pro

Gly 165

Arg

Leu

Thr

Leu

Leu 170

Leu

Gly

Pro

Gly 175

Cys

Gly

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Gly

Asn

Leu

Glu

Asn

180

185

190

Leu

Lys

Cys

Tyr

Gly

Glu

Ile

Ser

Tyr

Asn

Gly

His

Gly

Leu

Asn

Glu

195

200

205

Val

Pro

Gln

Lys

Thr

Ser

Ala

Tyr

Ile

Ser

Gln

His

Asp

Leu

His

210

215

220

Ile

Ala

Glu

Met

Thr

Arg

Glu

Thr

Ile

Asp

Phe

Ser

Ala

Arg

Cys

225

230

235

240

Gln

Gly

Val

Gly

Ser

Arg

Thr

Asp

Ile

Met

Glu

Val

Ser

Lys

Arg

245

250

255

Glu

Lys

Asp

Gly

Ile

Pro

Asp

Pro

Glu

Ile

Asp

Ala

Tyr

Met

260

265

270

Lys

Ala

Ile

Ser

Val

Lys

Gly

Leu

Lys

Arg

Ser

Leu

Gln

Thr

Asp

Tyr

275

280

285

Ile

Leu

Lys

Ile

Leu

Gly

Leu

Asp

Ile

Cys

Ala

Glu

Thr

Leu

Val

Gly

290

295

300

Asn

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Ile

Ser

Gly

Gln

Lys

Arg

Leu

Thr

305

310

315

320

Thr

Ala

Glu

Met

Ile

Val

Gly

Pro

Thr

Lys

Ala

Leu

Phe

Met

Asp

Glu

325

330

335

Ile

Thr

Asn

Gly

Leu

Asp

Ser

Thr

Ala

Phe

Gln

Ile

Lys

Ser

340

345

350

Leu

Gln

Val

Ala

His

Ile

Thr

Asn

Ala

Thr

Val

Phe

Val

Ser

Leu

355

360

365

Leu

Gln

Pro

Ala

Pro

Glu

Ser

Tyr

Asp

Leu

Phe

Asp

Ile

Val

Leu

370

375

380

Met

Ala

Glu

Gly

Lys

Ile

Val

Tyr

His

Gly

Pro

Arg

Asp

Val

Leu

385

390

395

400

Lys

Phe

Glu

Cys

Gly

Phe

Gln

Cys

Pro

Glu

Arg

Lys

Gly

Val

405 410 415

- 85 031178

Ala Asp

Phe

Leu 420

Gln

Glu Val

Ile

Ser 425

Lys

Asp

Gln

Gly 430

Gln

Tyr

Trp

Leu

His

Gln

Asn

Leu

Pro

His

Ser

Phe

Val

Ser

Val

Asp

Thr

Leu

435

440

445

Ser

Lys

Arg

Phe

Lys

Asp

Leu

Glu

Ile

Gly

Arg

Lys

Ile

Glu

Ala

450

455

460

Leu

Ser

Lys

Pro

Tyr

Asp

Ile

Ser

Lys

Thr

His

Lys

Asp

Ala

Leu

Ser

465

470

475

480

Phe

Asn

Val

Tyr

Ser

Leu

Pro

Lys

Trp

Glu

Leu

Phe

Arg

Ala

Cys

Ile

485

490

495

Ser

Arg

Glu

Phe

Leu

Met

Lys

Arg

Asn

Tyr

Phe

Val

Tyr

Leu

Phe

500

505

510

Lys

Thr

Phe

Gln

Leu

Val

Leu

Ala

Ile

Thr

Met

Thr

Val

Phe

515

520

525

Ile

Arg

Thr

Arg

Met

Asp

Ile

Asp

Ile

His

Gly

Asn

Ser

Tyr

Met

530

535

540

Ser

Cys

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Leu

Val

Asp

Gly

Ile

Pro

545

550

555

560

Glu

Leu

Ser

Met

Thr

Val

Gln

Arg

Leu

Ser

Val

Phe

Tyr

Lys

Gln

Lys

565

570

575

Gln

Leu

Cys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Trp

Ala

Tyr

Ala

Ile

Pro

Ala

Thr

Val

580

585

590

Leu

Lys

Ile

Pro

Leu

Ser

Phe

Glu

Ser

Leu

Val

Trp

Thr

Cys

Leu

595

600

605

Thr

Tyr

Val

Ile

Gly

Tyr

Thr

Pro

Glu

Pro

Tyr

Arg

Phe

Arg

610

615

620

Gln

Phe

Met

Ile

Leu

Phe

Ala

Val

His

Phe

Thr

Ser

Ile

Ser

Met

Phe

625

630

635

640

Arg

Cys

Ile

Ala

Ile

Phe

Gln

Thr

Gly

Val

Ala

Met

Thr

Ala

645

650

655

Gly

Ser

Phe

Val

Met

Leu

Ile

Thr

Phe

Val

Phe

Ala

Gly

Phe

Ala

Ile

- 86 031178

660

665

670

Pro

Tyr

Thr 675

Asp

Met

Pro

Gly

Trp 680

Leu

Lys

Trp

Gly

Phe 685

Trp

Val

Asn

Pro

Ile

Ser

Tyr

Ala

Glu

Ile

Gly

Leu

Ser

Val

Asn

Glu

Phe

Leu

Ala

690

695

700

Pro

Arg

Trp

Gln

Lys

Met

Gln

Pro

Thr

Asn

Val

Thr

Leu

Gly

Arg

Thr

705

710

715

720

Ile

Leu

Glu

Ser

Arg

Gly

Leu

Asn

Tyr

Asp

Tyr

Met

Tyr

Trp

Val

725

730

735

Ser

Leu

Ser

Ala

Leu

Gly

Leu

Thr

Ile

Phe

Asn

Thr

Ile

Phe

740

745

750

Thr

Leu

Ala

Leu

Ser

Phe

Leu

Lys

Ser

Pro

Thr

Ser

Arg

Pro

Met

755

760

765

Ile

Ser

Gln

Asp

Lys

Leu

Ser

Glu

Leu

Gln

Gly

Thr

Lys

Asp

Ser

770

775

780

Val

Lys

Asn

Lys

Pro

Leu

Asp

Ser

Ile

Lys

Thr

Asn

Glu

Asp

785

790

795

800

Pro

Gly

Lys

Met

Ile

Leu

Pro

Phe

Lys

Pro

Leu

Thr

Ile

Thr

Phe

Gln

805

810

815

Asp

Leu

Asn

Tyr

Val

Asp

Val

Pro

Val

Glu

Met

Lys

Gly

Gln

Gly

820

825

830

Tyr

Asn

Glu

Lys

Leu

Gln

Leu

Ser

Glu

Ile

Thr

Gly

Ala

Phe

835

840

845

Arg

Pro

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Leu

Met

Gly

Ile

Ser

Gly

Ala

Gly

Lys

850

855

860

Thr

Leu

Asp

Val

Leu

Ala

Gly

Arg

Lys

Thr

Ser

Gly

Tyr

Ile

865

870

875

880

Glu

Gly

Glu

Ile

Arg

Ile

Ser

Gly

Phe

Leu

Lys

Val

Gln

Glu

Thr

Phe

885

890

895

Ala

Arg

Val

Ser

Gly

Tyr

Cys

Glu

Gln

Thr

Asp

Ile

His

Ser

Pro

Ser

900

905

910

- 87 031178

Ile

Thr

Val 915

Glu

Ser

Leu

Ile 920

Tyr

Ser

Ala

Trp

Leu 925

Arg

Leu

Val

Pro

Glu

Ile

Asn

Pro

Gln

Thr

Lys

Ile

Arg

Phe

Val

Lys

Gln

Val

Leu

930

935

940

Glu

Thr

Ile

Glu

Leu

Glu

Ile

Lys

Asp

Ala

Leu

Val

Gly

Val

Ala

945

950

955

960

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Thr

Glu

Gln

Arg

Lys

Arg

Leu

Thr

Val

Ala

965

970

975

Val

Glu

Leu

Val

Ala

Asn

Pro

Ser

Ile

Phe

Met

Asp

Glu

Pro

Thr

980

985

990

Thr Gly Leu Asp Ala Arg Ala Ala Ala Ile Val Met Arg Ala Val

995 1000 1005

Lys

Asn Val 1010

Ala

Glu

Thr

Gly

Arg 1015

Thr

Ile

Val

Cys

Thr 1020

Ile

His

Gln

Pro

Ser

Ile

His

Ile

Phe

Glu

Ala

Phe

Asp

Glu

Leu

Val

Leu

1025

1030

1035

Lys

Arg

Gly

Arg

Met

Ile

Tyr

Ser

Gly

Pro

Leu

Gly

Gln

His

1040

1045

1050

Ser

Cys

Val

Ile

Glu

Tyr

Phe

Gln

Asn

Ile

Pro

Gly

Val

Ala

1055

1060

1065

Lys

Ile

Arg

Asp

Lys

Tyr

Asn

Pro

Ala

Thr

Trp

Met

Leu

Glu

Val

1070

1075

1080

Thr

Ser

Glu

Ser

Val

Glu

Thr

Glu

Leu

Asp

Met

Asp

Phe

Ala

Lys

1085

1090

1095

Ile

Tyr

Asn

Glu

Ser

Asp

Leu

Tyr

Lys

Asn

Ser

Glu

Leu

Val

1100

1105

1110

Lys

Glu

Leu

Ser

Lys

Pro

Asp

His

Gly

Ser

Asp

Leu

His

Phe

1115

1120

1125

Lys

Arg

Thr

Phe

Ala

Gln

Asn

Trp

Glu

Gln

Phe

Lys

Ser

Cys

1130

1135

1140

Leu

Trp

Lys

Met

Ser

Leu

Ser

Tyr

Trp

Arg

Ser

Pro

Ser

Tyr

Asn

1145

1150

1155

- 88 031178

Leu

Met 1160

Arg

Ile

Gly

His

Thr 1165

Phe

Ile

Ser

Phe 1170

Ile

Phe

Gly

Leu

Phe

Trp

Asn

Gln

Gly

Lys

Ile

Asp

Thr

Gln

Asn

1175

1180

1185

Leu

Phe

Thr

Val

Leu

Gly

Ala

Ile

Tyr

Gly

Leu

Val

Leu

Phe

Val

1190

1195

1200

Gly

Ile

Asn

Cys

Thr

Ser

Ala

Leu

Gln

Tyr

Phe

Glu

Thr

Glu

1205

1210

1215

Arg

Asn

Val

Met

Tyr

Arg

Glu

Arg

Phe

Ala

Gly

Met

Tyr

Ser

Ala

1220

1225

1230

Phe

Ala

Tyr

Ala

Leu

Ala

Gln

Val

Thr

Glu

Ile

Pro

Tyr

Ile

1235

1240

1245

Phe

Ile

Gln

Ser

Ala

Glu

Phe

Val

Ile

Val

Ile

Tyr

Pro

Met

Ile

1250

1255

1260

Gly

Phe

Tyr

Ala

Ser

Phe

Ser

Lys

Val

Phe

Trp

Ser

Leu

Tyr

Ala

1265

1270

1275

Met

Phe

Cys

Asn

Leu

Cys

Phe

Asn

Tyr

Leu

Ala

Met

Phe

Leu

1280

1285

1290

Ile

Ser

Ile

Thr

Pro

Asn

Phe

Met

Val

Ala

Ile

Leu

Gln

Ser

1295

1300

1305

Leu

Phe

Thr

Phe

Asn

Ile

Phe

Ala

Gly

Phe

Leu

Ile

Pro

1310

1315

1320

Lys

Pro

Gln

Ile

Pro

Lys

Trp

Val

Trp

Phe

Tyr

Ile

Thr

1325

1330

1335

Pro

Thr

Ser

Trp

Thr

Leu

Asn

Leu

Phe

Ser

Gln

Tyr

Gly

1340

1345

1350

Asp

Ile

His

Gln

Lys

Ile

Asn

Ala

Phe

Gly

Glu

Thr

Lys

Thr

Val

1355

1360

1365

Ala

Ser

Phe

Leu

Glu

Asp

Tyr

Phe

Gly

Phe

His

Asp

Arg

Leu

1370

1375

1380

Met

Ile

Thr

Ala

Ile

Leu

Ile

Ala

Phe

Pro

Ile

Ala

Leu

Ala

1385

1390

1395

- 89 031178

Thr Met Tyr Ala Phe Phe Val Ala Lys Leu Asn Phe Gln Lys Arg 1400 14051410 <210>49 <211>1450 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400>49

Met 1

Ala

His

Met

Val 5

Gly Ala

Asp

Ile 10

Glu

Ser

Leu

Arg

Val 15

Glu

Leu

Ala

Glu

Ile

Gly

Arg

Ser

Ile

Arg

Ser

Phe

Arg

His

Thr

20

25

30

Ser

Phe

Arg

Ser

Ile

Tyr

Glu

Val

Glu

Asn

Asp

Gly

35

40

45

Asp

Val

Asn

Asp

His

Asp

Ala

Glu

Tyr

Ala

Leu

Gln

Trp

Ala

Glu

Ile

50

55

60

Glu

Arg

Leu

Pro

Thr

Val

Lys

Arg

Met

Arg

Ser

Thr

Leu

Asp

65

70

75

80

Gly

Asp

Glu

Ser

Met

Thr

Glu

Lys

Gly

Arg

Val

Asp

Val

Thr

85

90

95

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Arg

His

Leu

Met

Ile

Glu

Lys

Leu

Ile

Lys

100

105

110

His

Ile

Glu

Asn

Asp

Asn

Leu

Lys

Leu

Lys

Ile

Arg

115

120

125

Ile

Asp

Arg

Val

Gly

Met

Glu

Leu

Pro

Thr

Ile

Glu

Val

Arg

Tyr

Glu

130

135

140

Ser

Leu

Lys

Val

Ala

Glu

Cys

Glu

Val

Glu

Gly

Lys

Ala

Leu

145

150

155

160

Pro

Thr

Leu

Trp

Asn

Thr

Ala

Lys

Arg

Val

Leu

Ser

Glu

Leu

Val

Lys

165

170

175

Leu

Thr

Gly

Ala

Lys

Thr

His

Glu

Ala

Lys

Ile

Asn

Ile

Asn

Asp

180

185

190

Val

Asn

Gly

Ile

Lys

Pro

Gly

Arg

Leu

Thr

Leu

Gly

Pro

195

200

205

- 90 031178

Pro

Ser 210

Cys

Gly

Lys

Thr

Thr 215

Leu

Lys

Ala

Leu 220

Ser

Gly

Asn

Leu

Glu

Asn

Leu

Lys

Cys

Ser

Gly

Glu

Ile

Ser

Tyr

Asn

Gly

His

Arg

225

230

235

240

Leu

Asp

Glu

Phe

Val

Pro

Gln

Lys

Thr

Ser

Ala

Tyr

Ile

Ser

Gln

Tyr

245

250

255

Asp

Leu

His

Ile

Ala

Glu

Met

Thr

Val

Arg

Glu

Thr

Val

Asp

Phe

Ser

260

265

270

Ala

Arg

Cys

Gln

Gly

Val

Gly

Ser

Arg

Thr

Asp

Ile

Met

Glu

Val

275

280

285

Ser

Lys

Arg

Glu

Lys

Glu

Lys

Gly

Ile

Pro

Asp

Thr

Glu

Val

Asp

290

295

300

Ala

Tyr

Met

Lys

Ala

Ile

Ser

Val

Glu

Gly

Leu

Gln

Arg

Ser

Leu

Gln

305

310

315

320

Thr

Asp

Tyr

Ile

Leu

Lys

Ile

Leu

Gly

Leu

Asp

Ile

Cys

Ala

Glu

Ile

325

330

335

Leu

Ile

Gly

Asp

Val

Met

Arg

Gly

Ile

Ser

Gly

Gln

Lys

340

345

350

Arg

Leu

Thr

Ala

Glu

Met

Ile

Val

Gly

Pro

Thr

Lys

Ala

Leu

Phe

355

360

365

Met

Asp

Glu

Ile

Thr

Asn

Gly

Leu

Asp

Ser

Thr

Ala

Phe

Gln

Ile

370

375

380

Val

Lys

Ser

Leu

Gln

Phe

Ala

His

Ile

Ser

Ala

Thr

Val

Leu

385

390

395

400

Val

Ser

Leu

Gln

Pro

Ala

Pro

Glu

Ser

Tyr

Asp

Leu

Phe

Asp

405

410

415

Ile

Met

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Ile

Val

Tyr

His

Gly

Pro

Arg

Gly

420

425

430

Glu

Val

Leu

Asn

Phe

Glu

Asp

Cys

Gly

Phe

Arg

Cys

Pro

Glu

Arg

435

440

445

Lys

Gly

Val

Ala

Asp

Phe

Leu

Gln

Glu

Val

Ile

Ser

Lys

Asp

Gln

- 91 031178

450

455

460

Ala 465

Gln Tyr

Trp

His 470

Glu

Asp

Leu

Pro

Tyr 475

Ser

Phe

Val

Ser

Val 480

Glu

Met

Leu

Ser

Lys

Phe

Lys

Asp

Leu

Ser

Ile

Gly

Lys

Ile

485

490

495

Glu

Asp

Thr

Leu

Ser

Lys

Pro

Tyr

Asp

Arg

Ser

Lys

Ser

His

Lys

Asp

500

505

510

Ala

Leu

Ser

Phe

Ser

Val

Tyr

Ser

Leu

Pro

Asn

Trp

Glu

Leu

Phe

Ile

515

520

525

Ala

Cys

Ile

Ser

Arg

Glu

Tyr

Leu

Met

Lys

Arg

Asn

Tyr

Phe

Val

530

535

540

Tyr

Ile

Phe

Lys

Thr

Ala

Gln

Leu

Val

Met

Ala

Phe

Ile

Thr

Met

545

550

555

560

Thr

Val

Phe

Ile

Arg

Thr

Arg

Met

Gly

Ile

Asp

Ile

His

Gly

Asn

565

570

575

Ser

Tyr

Met

Ser

Ala

Leu

Phe

Ala

Leu

Ile

Leu

Val

Asp

580

585

590

Gly

Phe

Pro

Glu

Leu

Ser

Met

Thr

Ala

Gln

Arg

Leu

Ala

Val

Phe

Tyr

595

600

605

Lys

Gln

Lys

Gln

Leu

Cys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Trp

Ala

Tyr

Ala

Ile

Pro

610

615

620

Ala

Thr

Val

Leu

Lys

Val

Pro

Leu

Ser

Phe

Glu

Ser

Leu

Val

Trp

625

630

635

640

Thr

Cys

Leu

Ser

Tyr

Val

Ile

Gly

Tyr

Thr

Pro

Glu

Ala

Ser

Arg

645

650

655

Phe

Lys

Gln

Phe

Ile

Leu

Phe

Ala

Val

His

Phe

Thr

Ser

Ile

660

665

670

Ser

Met

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Ile

Phe

Gln

Thr

Val

Ala

Ser

675

680

685

Ile

Thr

Ala

Gly

Ser

Phe

Gly

Ile

Leu

Phe

Thr

Phe

Val

Phe

Ala

Gly

690

695

700

- 92 031178

Phe 705

Val

Ile

Pro

Pro 710

Ser

Met

Pro

Ala

Trp 715

Leu

Lys

Trp

Gly

Phe 720

Trp

Ala

Asn

Pro

Leu

Ser

Tyr

Gly

Glu

Ile

Gly

Leu

Ser

Val

Asn

Glu

725

730

735

Phe

Leu

Ala

Pro

Arg

Trp

Asn

Gln

Met

Gln

Pro

Asn

Phe

Thr

Leu

740

745

750

Gly

Arg

Thr

Ile

Leu

Gln

Thr

Arg

Gly

Met

Asp

Tyr

Asn

Gly

Tyr

Met

755

760

765

Tyr

Trp

Val

Ser

Leu

Cys

Ala

Leu

Gly

Phe

Thr

Val

Leu

Phe

Asn

770

775

780

Ile

Phe

Thr

Leu

Ala

Leu

Thr

Phe

Leu

Lys

Ser

Pro

Thr

Ser

785

790

795

800

Arg

Ala

Met

Ile

Ser

Gln

Asp

Lys

Leu

Ser

Glu

Leu

Gln

Gly

Thr

Glu

805

810

815

Lys

Ser

Thr

Glu

Asp

Ser

Val

Arg

Lys

Thr

Asp

Ser

Pro

820

825

830

Val

Lys

Thr

Glu

Asp

Lys

Met

Val

Leu

Pro

Phe

Lys

Pro

Leu

835

840

845

Thr

Val

Thr

Phe

Gln

Asp

Leu

Asn

Tyr

Phe

Val

Asp

Met

Pro

Val

Glu

850

855

860

Met

Arg

Asp

Gln

Gly

Tyr

Asp

Gln

Lys

Leu

Gln

Leu

Ser

Asp

865

870

875

880

Ile

Thr

Gly

Ala

Phe

Arg

Pro

Gly

Ile

Leu

Thr

Ala

Leu

Met

Gly

Val

885

890

895

Ser

Gly

Ala

Gly

Lys

Thr

Leu

Asp

Val

Leu

Ala

Gly

Arg

Lys

900

905

910

Thr

Ser

Gly

Tyr

Ile

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Ile

Ser

Gly

Phe

Pro

Lys

915

920

925

Val

Gln

Glu

Thr

Phe

Ala

Arg

Val

Ser

Gly

Tyr

Cys

Glu

Gln

Thr

Asp

930

935

940

Ile

His

Ser

Pro

Asn

Ile

Thr

Val

Glu

Ser

Val

Ile

Tyr

Ser

Ala

945

950

955

960

- 93 031178

Trp Leu Arg Leu Ala Pro Glu

965

Ile Asp Ala Thr Thr Lys Thr Lys

970 975

Phe

Val Lys Gln Val

Leu Glu Thr

980

Ile Glu Leu Asp Glu Ile Lys

985 990

Asp Ser

Leu Val Gly Val Thr Gly Val

995

Ser Gly Leu Ser Thr Glu Gln Arg Lys

1000 1005

Arg

Leu 1010

Thr

Ile

Ala

Val

Glu 1015

Leu

Val

Ala

Asn

Pro 1020

Ser

Ile

Phe

Met

Asp

Glu

Pro

Thr

Gly

Leu

Asp

Ala

Arg

Ala

1025

1030

1035

Ile

Val

Met

Arg

Ala

Val

Lys

Asn

Val

Ala

Asp

Thr

Gly

Arg

Thr

1040

1045

1050

Ile

Val

Cys

Thr

Ile

His

Gln

Pro

Ser

Ile

Asp

Ile

Phe

Glu

Ala

1055

1060

1065

Phe

Asp

Glu

Leu

Val

Leu

Lys

Arg

Gly

Arg

Met

Ile

Tyr

1070

1075

1080

Thr

Gly

Pro

Leu

Gly

Gln

His

Ser

Arg

His

Ile

Glu

Tyr

Phe

1085

1090

1095

Glu

Ser

Val

Pro

Glu

Ile

Pro

Lys

Ile

Lys

Asp

Asn

His

Asn

Pro

1100

1105

1110

Ala

Thr

Trp

Met

Leu

Asp

Val

Ser

Gln

Ser

Val

Glu

Ile

Glu

1115

1120

1125

Leu

Gly

Val

Asp

Phe

Ala

Lys

Ile

Tyr

His

Asp

Ser

Ala

Leu

Tyr

1130

1135

1140

Lys

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Val

Lys

Gln

Leu

Ser

Gln

Pro

Asp

Ser

1145

1150

1155

Gly

Ser

Asp

Ile

Gln

Phe

Lys

Arg

Thr

Phe

Ala

Gln

Ser

Trp

1160

1165

1170

Trp

Gly

Gln

Phe

Lys

Ser

Ile

Leu

Trp

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Tyr

1175

1180

1185

Trp

Arg

Ser

Pro

Ser

Tyr

Asn

Leu

Met

Arg

Met

His

Thr

Leu

1190 1195 1200

- 94 031178

Val

Ser 1205

Ser

Leu

Ile

Phe

Gly 1210

Ala

Leu

Phe

Trp

Lys 1215

Gln

Gly

Gln

Asn

Leu

Asp

Thr

Gln

Ser

Met

Phe

Thr

Val

Phe

Gly

Ala

Ile

1220

1225

1230

Tyr

Gly

Leu

Val

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Asn

Cys

Ala

Ser

Ala

1235

1240

1245

Leu

Gln

Tyr

Phe

Glu

Thr

Glu

Arg

Asn

Val

Met

Tyr

Arg

Glu

Arg

1250

1255

1260

Phe

Ala

Gly

Met

Tyr

Ser

Ala

Thr

Ala

Tyr

Ala

Leu

Gly

Gln

Val

1265

1270

1275

Val

Thr

Glu

Ile

Pro

Tyr

Ile

Phe

Ile

Gln

Ala

Glu

Phe

Val

1280

1285

1290

Ile

Val

Thr

Tyr

Pro

Met

Ile

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Ala

Tyr

Lys

1295

1300

1305

Val

Phe

Trp

Ser

Leu

Tyr

Ser

Met

Phe

Cys

Ser

Leu

Thr

Phe

1310

1315

1320

Asn

Tyr

Leu

Ala

Met

Phe

Leu

Val

Ser

Ile

Thr

Pro

Asn

Phe

Met

1325

1330

1335

Val

Ala

Ile

Leu

Gln

Ser

Leu

Phe

Tyr

Val

Gly

Phe

Asn

Leu

1340

1345

1350

Phe

Ser

Gly

Phe

Leu

Ile

Pro

Gln

Thr

Gln

Val

Pro

Gly

Trp

1355

1360

1365

Ile

Trp

Leu

Tyr

Leu

Thr

Pro

Thr

Ser

Trp

Thr

Leu

Asn

Gly

1370

1375

1380

Phe

Ile

Ser

Gln

Tyr

Gly

Asp

Ile

His

Glu

Ile

Asn

Val

1385

1390

1395

Phe

Gly

Gln

Ser

Thr

Val

Ala

Arg

Phe

Leu

Lys

Asp

Tyr

Phe

1400

1405

1410

Gly

Phe

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

Ala

Val

Gln

Ile

1415

1420

1425

Ala

Phe

Pro

Ile

Ala

Leu

Ala

Ser

Met

Phe

Ala

Phe

Val

Gly

- 95 031178

1430

1435

1440

Lys Leu Asn Phe Gln Arg Arg

1445 1450 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223>	Консервативный домен	PDR-ABC-траспортеров ,	присутствующий	в	Lr34
<400>	50
Gly Pro	Pro Gly Cys Gly Lys	Ser
1	5
<210>	51
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Консервативный домен	PDR-ABC-траспортеров,	присутствующий	в	Lr34
<400>	51
Gly Val	Ser Gly Ala Gly Lys	Thr
1	5
<210>	52
<211>	12
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Консервативный домен	PDR-ABC-траспортеров ,	присутствующий	в	Lr34
<400>	52
Ile Ser	Gly Gly Gln Lys Lys	Arg Leu Thr Thr Ala
1	5	10

<210>	53
<211>	12
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Консервативный домен	PDR-ABC-траспортеров, присутствующий в Lr34
<400>	53
Leu Ser Met Glu Gln Arg Lys	Arg Leu Thr Ile Ala
1	5	10

- 96 031178

<210> <211> <212> <213>

54 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	Консервативный домен PDR-ABC-траспортеров, присутствующий в Lr34
<400>	54

Ala Tyr Phe Met Asp

1	5
<210> <211> <212> <213>	55 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	Консервативный домен PDR-ABC-траспортеров, присутствующий в Lr34
<400>	55

Ile Ile Leu Met Asp

1	5
<210> <211> <212> <213>	56 8 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>

Консенсусная последовательность бокса Уокера типа А

<220> <221> <222> <223>

MISC_FEATURE (2)..(2) Хаа = любая аминокислота

<220> <221> <222> <223>

MISC_FEATURE (3)..(3) Хаа = любая аминокислота

<220> <221> <222> <223>

MISC_FEATURE (4)..(4) Хаа = любая аминокислота

<220> <221> <222> <223>

MISC_FEATURE (5)..(5) Хаа = любая аминокислота

<220> <221> <222> <223>	MISC_FEATURE (8)..(8) Xaa = Ser или Thr
<400>	56

- 97 031178

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Lys Xaa <210>57 <211>5 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Консенсусная последовательность бокса Уокера типа В <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1)

<223>	Xaa = Phe, Ile,	Trp,	Leu,	Val,	Met,	Tyr или Ala
<220>
<221>	MISC_FEATURE
<222>	(2)..(2)
<223>	Xaa = Phe, Ile,	Trp,	Leu,	Val,	Met,	Tyr	или	Ala
<220>
<221>	MISC_FEATURE
<222>	(3)..(3)
<223>	Xaa = Phe, Ile,	Trp,	Leu,	Val,	Met,	Tyr	или	Ala
<220>
<221>	MISC_FEATURE
<222>	(4)..(4)
<223>	Xaa = Phe, Ile,	Trp,	Leu,	Val,	Met,	Tyr	или	Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Asp или Glu <400>57

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa <210>58 <211> 12 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Консенсусная последовательность ABC-опознавательного мотива <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Leu, Ile, Val, Met, Phe или Tyr <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Ser, Gly или Met

- 98 031178 <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Gly или Glu <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Хаа = любая аминокислота <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Хаа = любая аминокислота <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Хаа = любая аминокислота <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = Arg, Lys или Ala <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = Leu, Ile, Val, Met, Tyr или Ala <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Хаа = любая аминокислота <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa = Leu, Ile, Val, Met, Phe или Thr <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa = Ala или Gly <400>58

Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

510 <210>59 <211> 6 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PDR-опознавательная последовательность 1 <400> 59

Leu Leu Leu Gly Pro Pro

- 99 031178

1	5
<210> <211> <212> <213>	60 6 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	PDR-опознавательная последовательность 2
<400>	60

Gly Leu Asp Ser Ser Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	61 12 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>

PDR-опознавательная последовательность 3

<220> <221> <222> <223>

MISC_FEATURE (4)..(4) Xaa = Ala или Thr

<220> <221> <222> <223>

MISC_FEATURE (6)..(6) Xaa = Ala или Ser

<220> <221> <222> <223>	MISC_FEATURE (11)..(11) Xaa = Met или Ile
<400>	61

Gly Leu Asp Xaa Arg Xaa Ala Ala Ile Val Xaa Arg

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	62 8 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	PDR-опознавательная последовательность 4
<400>	62

Val Cys Thr Ile His Gln Pro Ser

1	5
<210> <211>	63 1405

- 100 031178 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 63

Met 1

Glu Gly

Leu

Ala 5

Arg Glu

Thr

Asn

Pro 10

Ser

His

Gln 15

Asp

Phe

Ala

Ser

Cys

Ala

Ser

Asp

Glu

Arg

Pro

Asp

Glu

Pro

Glu

Leu

Glu

20

25

30

Leu

Ala

Ser

Arg

Gln

Asn

Gly

Ala

Gly

Asn

Glu

His

Val

35

40

45

Ser

Glu

Asn

Met

Leu

Asp

Ser

Lys

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Arg

50

55

60

Arg

Glu

Phe

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu

Glu

Asp

His

Pro

65

70

75

80

Arg

Phe

Leu

Arg

Gln

Lys

Glu

Arg

Ile

Asp

Arg

Val

Asp

Val

Lys

85

90

95

Leu

Pro

Ala

Ile

Glu

Val

Arg

Tyr

Asn

Leu

Phe

Val

Glu

Ala

Glu

100

105

110

Cys

Arg

Val

Thr

Lys

Gly

Asn

His

Leu

Pro

Ser

Leu

Trp

Asn

Ser

Thr

115

120

125

Lys

Gly

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

Val

Lys

Leu

Gly

Phe

Glu

Thr

Glu

130

135

140

Arg

Ala

Lys

Thr

Asn

Val

Leu

Glu

Asp

Val

Ser

Gly

Ile

Lys

Pro

145

150

155

160

Cys

Arg

Leu

Thr

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

Gly

Lys

Ser

Thr

165

170

175

Leu

Arg

Ala

Leu

Ala

Gly

Lys

Leu

Asp

Lys

Ser

Leu

Lys

Val

Thr

180

185

190

Gly

Asp

Ile

Ser

Tyr

Asn

Cys

Tyr

Glu

Leu

His

Glu

Phe

Val

Pro

Glu

195

200

205

Lys

Thr

Ala

Val

Tyr

Ile

Asn

Gln

His

Asp

Leu

His

Ile

Ala

Glu

Met

210

215

220

Thr

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Asp

Phe

Ser

Ala

Gln

Cys

Gln

Gly

Val

Gly

225

230

235

240

- 101 031178

Arg Arg

Pro

Lys

Ile 245

Leu

Lys

Glu

Val

Asn 250

Thr Arg

Glu

Ser

Val 255

Ala

Gly

Ile

Pro

Asp

Ala

Asp

Ile

Asp

Leu

Tyr

Met

Lys

Val

Ala

260

265

270

Val

Glu

Ala

Ser

Glu

Arg

Ser

Leu

Gln

Thr

Asp

Tyr

Ile

Leu

Lys

Ile

275

280

285

Met

Gly

Leu

Glu

Thr

Cys

Ala

Asp

Thr

Met

Val

Gly

Asp

Ala

Met

Arg

290

295

300

Arg

Gly

Ile

Ser

Gly

Gln

Lys

Arg

Leu

Thr

Ala

Glu

Met

305

310

315

320

Ile

Val

Gly

Pro

Ala

Lys

Ala

Tyr

Phe

Met

Asp

Glu

Ile

Ser

Asn

Gly

325

330

335

Leu

Asp

Ser

Thr

Phe

Gln

Ile

Asn

Cys

Phe

Gln

Leu

340

345

350

Thr

Asn

Ile

Ser

Glu

Tyr

Thr

Met

Val

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

Thr

355

360

365

Pro

Glu

Val

Phe

Asp

Leu

Phe

Asp

Leu

Ile

Leu

Met

Ala

Glu

Gly

370

375

380

Lys

Ile

Tyr

His

Gly

Pro

Arg

Asn

Glu

Ala

Leu

Asn

Phe

Glu

385

390

395

400

Glu

Cys

Gly

Phe

Lys

Cys

Pro

Glu

Arg

Lys

Ala

Asp

Phe

Leu

405

410

415

Gln

Glu

Ile

Leu

Ser

Arg

Lys

Asp

Gln

Glu

Gln

Tyr

Trp

Leu

Gly

Pro

420

425

430

His

Glu

Ser

Tyr

Arg

Tyr

Ile

Ser

Pro

His

Glu

Leu

Ser

Met

Phe

435

440

445

Lys

Glu

Asn

His

Arg

Gly

Arg

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Ser

Val

Pro

450

455

460

Lys

Ser

Gln

Phe

Gly

Lys

Glu

Ala

Leu

Ala

Phe

Asn

Lys

Tyr

Ser

Leu

465

470

475

480

Arg

Lys

Leu

Glu

Met

Phe

Lys

Ala

Cys

Gly

Ala

Arg

Glu

Ala

Leu

- 102 031178

485

490

495

Met

Lys

Arg Asn Met 500

Phe Val

Tyr Val 505

Phe

Lys

Thr

Gly

Gln 510

Leu

Ala

Ile

Ala

Leu

Val

Thr

Met

Ser

Val

Phe

Leu

Arg

Thr

Arg

Met

Thr

515

520

525

Ile

Ser

Phe

Thr

His

Ala

Asn

Tyr

Met

Gly

Ala

Leu

Phe

Ser

530

535

540

Ile

Phe

Met

Ile

Met

Leu

Asn

Gly

Ile

Pro

Glu

Met

Ser

Met

Gln

Ile

545

550

555

560

Gly

Arg

Leu

Pro

Ser

Phe

Tyr

Lys

Gln

Lys

Ser

Tyr

Phe

Tyr

Ser

565

570

575

Ser

Trp

Ala

Tyr

Ala

Ile

Pro

Ala

Ser

Val

Leu

Lys

Val

Pro

Val

Ser

580

585

590

Ile

Leu

Asp

Ser

Leu

Val

Trp

Ile

Ser

Ile

Thr

Tyr

Gly

Ile

Gly

595

600

605

Tyr

Thr

Pro

Thr

Val

Ser

Arg

Phe

Cys

Gln

Phe

Leu

Ile

Leu

Cys

610

615

620

Leu

His

Ser

Val

Thr

Ser

Gln

Tyr

Arg

Phe

Ile

Ala

Ser

Tyr

625

630

635

640

Phe

Gln

Thr

Pro

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Leu

Phe

Leu

Ala

Leu

Thr

645

650

655

Val

Phe

Leu

Thr

Phe

Gly

Phe

Ile

Leu

Pro

Lys

Thr

Ser

Met

Pro

660

665

670

Glu

Trp

Leu

Asn

Trp

Gly

Phe

Trp

Ile

Ser

Pro

Met

Ala

Tyr

Ala

Glu

675

680

685

Ile

Ser

Ile

Val

Ile

Asn

Glu

Phe

Leu

Ala

Pro

Arg

Trp

Gln

Lys

Glu

690

695

700

Ser

Ile

Gln

Asn

Ile

Thr

Ile

Gly

Asn

Gln

Ile

Leu

Val

Asn

His

Gly

705

710

715

720

Leu

Tyr

Ser

Trp

His

Phe

Tyr

Trp

Ile

Ser

Phe

Gly

Ala

Leu

725

730

735

- 103 031178

Gly

Ser

Ile

Leu 740

Leu

Phe

Tyr

Ile

Ala 745

Phe

Gly

Leu

Ala

Leu 750

Asp

Tyr

Arg

Thr

Pro

Thr

Glu

Tyr

His

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Lys

Ser

Leu

755

760

765

Cys

Gln

Glu

Lys

Asp

Ser

Thr

Ile

Gln

Asn

Glu

Ser

Asp

770

775

780

Gln

Ser

Asn

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Met

Thr

Ile

Pro

Thr

Met

His

Leu

785

790

795

800

Pro

Ile

Thr

Phe

His

Asn

Leu

Asn

Tyr

Ile

Asp

Thr

Pro

Glu

805

810

815

Met

Leu

Lys

Gln

Gly

Tyr

Pro

Thr

Arg

Leu

Arg

Leu

Asn

820

825

830

Ile

Thr

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

Leu

Met

Gly

Val

835

840

845

Ser

Gly

Ala

Gly

Lys

Thr

Leu

Asp

Val

Leu

Ala

Gly

Arg

Lys

850

855

860

Thr

Gly

Tyr

Ile

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Ile

Gly

Tyr

Pro

Lys

865

870

875

880

Val

Gln

Glu

Thr

Phe

Val

Arg

Ile

Leu

Gly

Tyr

Cys

Glu

Gln

Val

Asp

885

890

895

Ile

His

Ser

Pro

Gln

Leu

Thr

Val

Glu

Ser

Val

Thr

Tyr

Ser

Ala

900

905

910

Trp

Leu

Arg

Leu

Pro

Ser

His

Val

Asp

Lys

Gln

Thr

Arg

Ser

Lys

Phe

915

920

925

Val

Ala

Glu

Val

Leu

Glu

Thr

Val

Glu

Leu

Asp

Gln

Ile

Lys

Asp

Val

930

935

940

Leu

Val

Gly

Ser

Pro

Gln

Lys

Asn

Gly

Leu

Ser

Met

Glu

Gln

Arg

Lys

945

950

955

960

Arg

Leu

Thr

Ile

Ala

Val

Glu

Leu

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Ile

Leu

965

970

975

Met

Asp

Glu

Pro

Thr

Gly

Leu

Asp

Thr

Arg

Ser

Ala

Ile

Val

980

985

990

- 104 031178

Ile Arg Ala Val Lys Asn Ile Cys Glu Thr Gly Arg Thr Val Val Cys

995 1000 1005

Thr

Ile 1010

His

Gln

Pro

Ser

Thr 1015

Glu

Ile

Phe

Glu

Ala 1020

Phe

Asp

Glu

Leu

Ile

Leu

Met

Lys

Thr

Gly

Lys

Thr

Ile

Tyr

Asn

Gly

Pro

1025

1030

1035

Ile

Gly

Glu

Arg

Ser

Cys

Lys

Val

Ile

Glu

Tyr

Phe

Glu

Lys

Ile

1040

1045

1050

Ser

Gly

Val

Pro

Lys

Ile

Lys

Ser

Asn

Cys

Asn

Pro

Ala

Thr

Trp

1055

1060

1065

Met

Asp

Val

Thr

Ser

Thr

Ser

Met

Glu

Val

Gln

His

Asn

Met

1070

1075

1080

Asp

Phe

Ala

Ile

Leu

Tyr

Glu

Ser

Leu

His

Arg

Glu

Ala

1085

1090

1095

Glu

Asp

Leu

Val

Glu

Gln

Leu

Ser

Ile

Pro

Leu

Pro

Asn

Ser

Glu

1100

1105

1110

Asn

Leu

Arg

Phe

Ser

His

Ser

Phe

Ala

Gln

Asn

Gly

Trp

Ile

Gln

1115

1120

1125

Leu

Lys

Ala

Cys

Leu

Trp

Lys

Gln

Asn

Ile

Thr

Tyr

Trp

Arg

Ser

1130

1135

1140

Pro

Gln

Tyr

Asn

Leu

Arg

Ile

Met

Thr

Val

Ile

Ser

Ala

1145

1150

1155

Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Leu

Phe

Trp

Lys

His

Ala

Lys

Val

Leu

Asn

1160

1165

1170

Asn

Glu

Gln

Asp

Met

Leu

Ser

Val

Phe

Gly

Ala

Met

Tyr

Leu

Gly

1175

1180

1185

Phe

Thr

Ile

Gly

Ala

Tyr

Asn

Asp

Gln

Thr

Ile

Pro

Phe

1190

1195

1200

Ser

Thr

Glu

Arg

Ile

Val

Met

Tyr

Arg

Glu

Lys

Phe

Ala

Gly

1205

1210

1215

Met

Tyr

Ser

Trp

Ser

Tyr

Ser

Phe

Ala

Gln

Ala

Phe

Ile

Glu

1220 1225 1230

- 105 031178

Ile

Pro 1235

Tyr

Val

Phe

Ile

Gln 1240

Val

Leu

Tyr

Thr 1245

Leu

Ile

Val

Tyr

Pro

Ser

Thr

Gly

Tyr

Trp

Thr

Ala

His

Lys

Phe

Leu

Trp

1250

1255

1260

Phe

Tyr

Thr

Phe

Cys

Ser

Ile

Leu

Ser

Tyr

Val

Tyr

Val

1265

1270

1275

Gly

Leu

Val

Ser

Ile

Thr

Pro

Asn

Val

Gln

Val

Ala

Thr

1280

1285

1290

Ile

Leu

Ala

Ser

Phe

Asn

Thr

Met

Gln

Thr

Leu

Phe

Ser

Gly

1295

1300

1305

Phe

Ile

Leu

Pro

Ala

Pro

Thr

Leu

Gln

Ile

Pro

Lys

Trp

1310

1315

1320

Thr

Trp

Leu

Tyr

Leu

Thr

Pro

Thr

Ser

Trp

Ala

Leu

Asn

Ala

1325

1330

1335

Leu

Thr

Ser

Gln

Tyr

Gly

Asn

Ile

Glu

Lys

Glu

Val

Lys

Ala

1340

1345

1350

Phe

Gly

Glu

Thr

Lys

Ser

Val

Ser

Ile

Phe

Leu

Asn

Asp

Tyr

Phe

1355

1360

1365

Gly

Phe

His

Gln

Asp

Lys

Leu

Ser

Ile

Val

Ala

Thr

Val

Leu

Val

1370

1375

1380

Ala

Phe

Pro

Phe

Val

Leu

Ile

Leu

Phe

Ser

Leu

Ser

Ile

Glu

1385

1390

1395

Lys

Leu

Asn

Phe

Gln

Lys

Arg

1400 1405 <210> 64 <211> 4218 <212> ДНК <213> Triticum aestivum <400> 64

atggagggcc	tcgcgagaga	gaccaaccca	tcatcccacc	atcaagattt	cgcctcctgc	60
gcgagtgacg	agcgcccgga	tgagcccgag	ttggaattgg	catcgcgacg	gcgccagaat	120
ggtgctggaa	acaacgagca	tgtgagtgag	aacatgctgc	ttgacagcag	caagtttgga	180
gctctcaaga	ggcgtgagtt	cttcaacaac	ctgctaaaga	acctcgaaga	cgaccacccc	240

- 106 031178

cgctttctgc	gcagacaaaa	ggaaagaatt	gacagggttg	atgtcaagtt	gccagcaata	300
gaggtgaggt	ataataatct	gtttgtggaa	gcagagtgca	gagttactaa	aggaaatcac	360
ctgccgtctc	tatggaatag	taccaaaggt	gccttctcgg	gcctcgtgaa	gttgctaggc	420
ttcgaaacgg	aaagagcaaa	aaccaacgtt	ctagaagatg	tcagtggaat	catcaaaccc	480
tgcagattga	ctcttctact	gggacctcct	ggatgtggca	aaagcactct	gttgcgagct	540
cttgccggga	aactagataa	atctctaaag	gtaacagggg	atatctctta	taattgttat	600
gaacttcatg	aatttgtacc	tgagaaaaca	gctgtgtata	tcaaccaaca	tgatctgcac	660
atagctgaga	tgactgtgag	ggaaacttta	gacttctcag	cccagtgcca	aggtgttgga	720
agaagaccaa	aaatactcaa	ggaggtgaac	acaagggaga	gtgtggctgg	gatcatacct	780
gatgcggaca	tcgatctata	catgaaggta	gtagcagttg	aagcttcaga	gcgaagccta	840
cagacagatt	atattttgaa	gatcatgggg	ctagagacat	gcgcagacac	gatggttggg	900
gatgcaatga	gaagaggaat	atcagggggg	cagaagaaaa	gattaaccac	agccgagatg	960
attgtgggac	ccgcaaaagc	atactttatg	gatgaaatat	caaatggtct	ggatagctct	1020
accacttttc	aaataatcaa	ttgtttccag	caactgacaa	acatcagcga	gtacacgatg	1080
gttatttcac	ttcttcaacc	aacacctgag	gtatttgatc	ttttcgatga	cctcatacta	1140
atggcagaag	ggaagattat	ctaccatggc	cctcgaaatg	aagccctcaa	tttttttgag	1200
gagtgtgggt	tcaaatgccc	agaaagaaaa	gcggcagctg	actttctcca	agagatcttg	1260
tccaggaagg	accaagaaca	gtactggttg	ggtccacatg	aatcatacag	atatatctca	1320
cctcatgaat	tatcaagcat	gttcaaggag	aatcacaggg	ggagaaaact	acatgaacaa	1380
agtgtacctc	ccaaaagcca	gttcggcaag	gaagctttag	cattcaataa	gtattcgcta	1440
cgaaaactgg	aaatgttcaa	agcctgtgga	gcaagggaag	cactcctaat	gaaaaggaat	1500
atgtttgttt	atgtcttcaa	aacaggccag	cttgccatta	ttgcactcgt	aacaatgtct	1560
gtattccttc	gaactcgcat	gacaataagt	ttcactcatg	caaattacta	tatgggagca	1620
ttattttttt	ccatcttcat	gattatgcta	aatggcatac	cagagatgag	catgcagatt	1680
gggagactcc	caagttttta	caaacaaaag	agctactatt	tctattcatc	atgggcatat	1740
gcaataccag	cttcagtcct	aaaggtccct	gtttccatac	tggattcgct	tgtatggata	1800
tctatcacat	attatggtat	tggttataca	cctactgttt	caaggttctt	ctgccagttt	1860
ctgatacttt	gtcttctcca	tcattcagtc	acctcgcagt	atcgatttat	tgcttcatac	1920
ttccaaacac	ctattgtgtc	tttcttctac	ctttttcttg	ctctaacagt	attccttaca	1980
ttcggaggct	tcattcttcc	caagacctcc	atgccagaat	ggctaaactg	gggattttgg	2040
atatctccaa	tggcatatgc	agaaatcagc	atagttatta	acgagttctt	ggcaccaaga	2100

- 107 031178

tggcagaagg	aaagtattca	aaacataaca	attgggaacc	aaatcctggt	taatcacggc	2160
ctatattaca	gttggcattt	ttattggata	tcctttggag	ccttgcttgg	atctattctt	2220
ttattttata	tcgcttttgg	attggcacta	gattacagaa	cacctacaga	agaatatcat	2280
ggaagcaggc	ctacaaagag	cttatgtcaa	cagcaggaaa	aagattccac	tattcaaaat	2340
gaatctgatg	atcaatcaaa	tatttccaaa	gcaaagatga	ctataccaac	tatgcatctt	2400
ccaattacat	tccacaatct	gaactactac	attgataccc	caccggaaat	gctgaaacaa	2460
ggctatccaa	caagaagact	tcgactgctt	aataacataa	ctggagcttt	acgtcccggt	2520
gttctttctg	cactaatggg	tgttagtgga	gctgggaaga	caactctact	agatgtatta	2580
gcaggaagga	aaacaggagg	ttatattgaa	ggggacataa	gaataggtgg	atatcccaag	2640
gtgcaggaaa	catttgtcag	aatcttgggt	tactgcgaac	aagtcgacat	acattcccca	2700
cagcttacag	ttgaagagtc	tgtaacttat	tctgcgtggc	ttcgtctgcc	ttctcatgtc	2760
gacaaacaaa	caagatctaa	atttgttgct	gaagtccttg	aaactgttga	actagatcaa	2820
ataaaagatg	tcttagtggg	gtcaccacag	aaaaatggat	tgtccatgga	gcagagaaag	2880
aggctaacga	ttgcagtcga	gcttgtttca	aacccatcaa	tcatactaat	ggatgaacca	2940
acaacaggtt	tagatacaag	gtcagcagcc	attgttattc	gtgcagtcaa	aaatatttgt	3000
gaaacaggaa	ggacggtagt	ctgtacaatc	catcagccga	gcactgaaat	ttttgaggca	3060
tttgatgagc	tcatattaat	gaaaaccggt	gggaaaacaa	tctacaatgg	accaatagga	3120
gagcgctcct	gcaaagtgat	tgagtacttt	gagaaaattt	ctggagtccc	aaaaataaag	3180
agtaactgca	atccagctac	ctggatgatg	gatgtaacat	cgacatcaat	ggaggttcaa	3240
cacaacatgg	actttgcaat	tttgtatgaa	gagtcgtcac	tgcatagaga	agctgaagat	3300
ctagtggagc	agctaagtat	cccattacca	aattcagaaa	atctacgctt	ctcccatagt	3360
tttgcacaga	atggctggat	tcaacttaaa	gcttgcttgt	ggaaacaaaa	cataacttac	3420
tggagaagtc	ctcagtataa	cttgaggcgc	attatgatga	ctgtcatatc	tgccctgatc	3480
tacggagtat	tgttctggaa	gcatgcaaaa	gtattaaaca	acgagcagga	catgctcagt	3540
gtttttggtg	caatgtattt	gggtttcaca	accataggcg	cttataatga	tcagacaatc	3600
ataccattca	gtacgactga	gcgtattgta	atgtatcgtg	agaaatttgc	aggaatgtat	3660
tcatcttggt	catattcatt	cgcacaggct	ttcattgaga	taccctatgt	atttatccaa	3720
gtggtactgt	atacgttaat	tgtctatccg	tcaactggtt	attattggac	agcacacaaa	3780
ttcctatggt	tcttctacac	tacattttgt	tcaattctct	cctatgttta	tgttgggttg	3840
cttcttgttt	caataacccc	caatgttcaa	gtagctacca	tactggcttc	atttttcaac	3900
accatgcaaa	cactattctc	aggatttatt	ttacctgcac	ctacgttgca	gcaaatccca	3960
aagtggtgga	cttggctcta	ctatctcact	cctacatctt	gggcactcaa	tgccctcttg	4020

- 108 031178

acatcacaat	acggaaacat	agaaaaagag	gtgaaagcat	ttggagaaac	taaatcagtt	4080
tcaatcttct	tgaatgacta	ttttgggttt	catcaagaca	agttgagcat	agtagcaact	4140
gtcctcgttg	cctttccttt	tgtgttgata	atcttgtttt	cgttgtccat	tgagaaactt	4200
aatttccaga	agaggtaa					4218

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Трансгенное растение, в геном которого был интегрирован экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид резистентности к патогену взрослых растений, где:

i) полипептид включает аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 60%; и/или ii) полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 2 по крайней мере на 60%, или последовательность, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 2 в жестких условиях, и где патоген представляет собой Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia striiformis или Puccinia recondite f. sp. tritici, причем указанное трансгенное растение имеет повышенную резистентность к указанному патогену растений по сравнению с изогенным растением, в геноме которого отсутствует экзогенный полинуклеотид.
2. Растение по п.1, которое характеризуется ускоренным старением верхушек кроющих листьев по сравнению с изогенным растением, в геноме которого отсутствует экзогенный полинуклеотид.
3. Растение по п.1 или 2, в котором:

i) полипептид включает аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 80%, и/или ii) полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 2 по крайней мере на 80%.
4. Растение по п.1 или 2, в котором:

i) полипептид включает аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 90%, и/или ii) полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 2 по крайней мере на 90%.
5. Растение по любому из пп.1-4, которое является хлебным злаком, таким как пшеница.
6. Очищенный и/или рекомбинантный полипептид резистентности к патогену взрослых растений, который включает аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 60%, где патоген представляет собой Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia striiformis или Puccinia recondite f. sp. tritici.
7. Полипептид по п.6, который включает аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 80%.
8. Полипептид по п.6, который включает аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 1 по крайней мере на 90%.
9. Полипептид по любому из пп.6-8:

i) в котором отсутствует остаток фенилаланина в положении, соответствующем номеру аминокислоты 546 в SEQ ID NO: 4, ii) который имеет делецию остатка фенилаланина, соответствующего номеру аминокислоты 546 SEQ ID NO: 4, и/или iii) который содержит аминокислоту, отличную от остатка тирозина в положении, соответствующем номеру аминокислоты 634 в SEQ ID NO: 4.
10. Полипептид по п.9, который включает остаток гистидина в положении, соответствующем номеру аминокислоты 634 в SEQ ID NO: 4.
11. Выделенный и/или экзогенный полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 2 по крайней мере на 60%, последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп.6-10, или последовательность, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 2 в жестких условиях, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид резистентности к патогену взрослых растений и где патоген представляет собой Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia striiformis или Puccinia recondite f. sp. tritici.
12. Химерный вектор, включающий полинуклеотид по п.11.
13. Вектор по п.12, в котором полинуклеотид функционально связан с промотором.
14. Рекомбинантная клетка, включающая экзогенный полинуклеотид по п.11 и/или вектор по п.12

- 109 031178 или 13.
15. Клетка по п.14, которая является клеткой растения.
16. Клетка по п.15, которая является клеткой хлебного злака, такой как клетка пшеницы.
17. Способ получения полипептида по любому из пп.6-10, включающий экспрессию в клетке или бесклеточной экспрессионной системе полинуклеотида по п.11.
18. Трансгенное растение, включающее экзогенный полинуклеотид по п.11, вектор по п.12 или 13 или рекомбинантную клетку по любому из пп.14-16, где указанное трансгенное растение имеет повышенную резистентность к патогену растений по сравнению с изогенным растением, в геноме которого отсутствует указанный экзогенный полинуклеотид, вектор или клетка, и где патоген представляет собой Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia striiformis или Puccinia recondite f. sp. tritici.
19. Способ получения клетки по любому из пп.14-16, включающий стадию введения полинуклеотида по п.11 или вектора по п.12 или 13 в клетку.
20. Способ получения трансгенного растения, которое имеет повышенную резистентность к патогену взрослых по сравнению с изогенным растением, в геноме которого отсутствует экзогенный полинуклеотид по п.11, где указанный патоген представляет собой Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia striiformis или Puccinia recondite f. sp. tritici, где указанный способ включает регенерацию трансгенного растения из клетки по п.19.
21. Применение полинуклеотида по п.11 для получения трансгенного растения, которое имеет повышенную резистентность к патогену растений по сравнению с изогенным растением, в геноме которого отсутствует указанный полинуклеотид, где патоген представляет собой Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia striiformis или Puccinia recondite f. sp. tritici.
22. Трансгенное растение или его потомство, полученные способом по п.20.
23. Часть растения по любому из пп.1-5, 18 и 22.
24. Часть растения по п.23, которая является семенем, включающим указанный экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид резистентности к патогену взрослых растений.
25. Способ получения части растения по любому из пп.1-5, 18 и 22, включающий:

a) выращивание растения по любому из пп.1-5, 18 и 22 и

b) сбор части растения.
26. Способ по п.25, где часть растения представляет собой семя.
27. Способ получения муки, непросеянной муки, крахмала или другого продукта из семени, где способ включает:

a) получение трансгенного семени, содержащего экзогенный полинуклеотид по п.11, и

b) получение муки, непросеянной муки, крахмала или другого продукта из указанного семени.

Lr34

Ops I

7DL

XcsLVD2i

XSWDEL1ί

XSWDEL2i

XSWDEL3i

XSWSNP2 XSWM10

Lr34 XcsLVE17 XcsLVMS

Xsfr.BE493812

Фиг. 1

XSWSNP1 Xgwm1220

XcsLVAI XSWSNP3 +Lr34:5-TCGCAGCATCGA-3

- Lr34:5’-TCG CAGTAT CGA-3’ +Lr34:5-TCCATC

- Lr34:5’-TCCATCTTCATG-3’ +Lr34:5-CCGACTT-3

-Lr34:5’-CCGTCTT-3'

Фиг. 2

Фиг. 3

- 110 031178

MEGLARETNPSSHHQDFTACASDERPDESELELASRQRQNGAANTEHVSENMLLDSSKLGALKRREFFD NLLKNLEDDHLRFLRGQKERIDRVDVKLPAIEVRYNNLFVEAECRVTKGNHLPSLWNSTKGAFSGLVKL· LGFETERAKTNVLEDVSGIIKPCRLTLLLGPPGCGKSTLLRALAGKLDKSLKVTGDISYNGYELHEFVP EKTAVYINQHDLHIAEMTVRETLDFSAQCQGVGRRPKILKEVNTRESVAGIIPDADIDLYMKVVAVEAS erslqtdyilkimgleicadtmvgdamrrg||^^HH||Hemivgpasayfmdeisngldssttfqi INCFQQLTNISEYTMVISLLQPTPEVFDLFDDLILMAEGKIIYHGPRNEALNFFEECGFICPERKAAAD FLQEILSWKDQQQYWLGPHESYRYISPHELSSMFRENHRGRKLHEQSVPPKSQLGKEALAFNKYSLQKL emfkacgareallmkrnmfvyvfktgqlaiialvtmsvflrtrmtisfthanyymgalffsi|mimlwg IPEMSMQIGRLPSFYKQKSYYFYSSWAYAIPASVLKVPISILDSLVWISITYYGIGYTPTVSRFFCQFL TLCLLffiSvfSQ^FIASYFQTPIVSF^LF^LTVFLTFGGFILPKTSMPGWLWGTOSPMTraEIS IVINEFLAPRWQKESIQNITIGNQILVNHGLYYSWHYYWISFGALLGSILLFYIAFGLALDYRTPTEEY Ησ3ΡΡΤΚ5Εθς22ΕΚ0ΥΤΙΏΝΕ5ϋ0Ώ5ΝΙ3ΚΑΚνΊΊΡνΜΗΕΡΙΤΕΗΝΕΝΥΥΙ0ΤΡΡΕΜΙ,Κι26ΥΡΤΡΡΕΡ LLNNITGALRPGVLSALMGVSGAGKTTLLDVLAGRKTGGYIEGDIRIGGYPKVQETFVRILGYCEQVDI HSPOLTVEESVTYSAWLRLPSHVDEOTRSKFVAEVLETVELDOIKDVLVGSPOKNGlMMIHlWMtv ELVSNPSIILMDEPTTGLDTRSAAIVIRAVKNICETGRTWCTIHQPSTEIFEAFDELILMKSGGKTIY SGPIGERSCKVIEYFEKISGVPKIKSNCNPATWMMDVTSTSMEVQHNMDFAILYEESSLHREAEDLVEQ LSIP LPNSENLCFSHSFAQNGtflQLKACLWKQNITYtfRSPQYNLRRIMMTVISALIYGILFtfKHAKVLN NEQDMLSVFGAMYLGFTTIGAY1WQTIIPFSTTERIVMYRERFAGMYSSWSYSFAQAFIEIPYVFIQVV ΕΥΤΕΐνΎΡ3ΤΰΥΥ¥ΤΑΗΚΕΕ¥ΕΕΥΤΤΕΟ3Ιί3ΥνΥν6ΕίΕν5ΙΤΡ^νΑΤΙΙΑ5ΕΕ·ΝΤΜςΤίΕ3ΰΕΙί PAPQIPKimWLYYL7^TSWALNAEETSQYGmEKEVXAFGETKSvSIFL№YFGFEQDKLSVVAAVLV AFPFVLIILFSLSIEKLNFQKRH

Фиг. 4

Фиг. 5

Мембрана

Lr34 Renan

Os_PDR23 At_₽DR5

At_PDR9

...............—.......... -MEGLARETNPSSHHaDPTAOASDE - - -RP1 _ _

.......................-............МЗЗбЗЗНЙРЕРАЗСТАКВПЕННЬВЕВвЬЕЬТУОР^СЙСЮКМаЗА

...................MG...........SSFRSSSSRNBHEDGGDE- - - -AEHALOW^iaRLP-TPSLRSSLVD

MAHWGADDIESLRVEIAEIGRSIRSSFRRHTSSFRSSSSIYEVmX3DVNDBDAEYALQWAjlERLP-TVK||MRSTLLD

5LELAS----gQRQNGAA

Lr34_Renan

Os_PDR2 3

At_PDR5

At_PDR9 . : *: NT-EHVSSNMLLD--S! NTDQHS^LLLLDDS! KYGBG-TSKGKKVVDV' DGDBSMT^KGRRVVDV'

!.j*j ._«..**_;..*.«****, « ίίΚ№ΕΡΡΕ1βΐΑΝ1ΕΙ*Ι>Ε№θΟΚΕ$ΙΐΜηνΚΙ>ΡΑΙΕνΕΥΝΝΕΙ &KSRLFPDl®liNVQBiHIRPiaReKaiieDVKLPAIEVRYNNI.i м™Ш1ЕШ1|Н1Е1«1ЫСШКК1НИМЕадвЧЕЙЙЗЯ«ЙЕ1Л iVEfHIJ4IEaiKHIEN|NLKliKKIRRSXDJgGHSiaTalSiYES|l ?AN|DH

120

124

124

159

Lr34_Renan Oe_PDR23 At_PDR5 At_PDR9 ®SEifflST?GAFSG|V5®Li@PEJ!ERSKTNVLSaSl ьгзы®|дтЗкалрз<Ллп№1^ЬЕЖЕвХк11геь»!

icj

200

204

204

239

Lr34_Renan Os_PDR23 At_PDR5 At_PDR9 ял

SSI apgibMtvvamsi

IADUHMBaIS^EASI (ряЗЫИлхйкси

280

284

284

319

Lr34_Renan

Os_PDR23 At_PDR5 At_PDR9

QTDYCLKCVg: B~CA?TMVG'AMRRGISGGQKKRLTTAF’MrVGPA'5A¥FMDEISNGLDSST7FQZ TS.'-QO! Tti^T~EY7M ςτυν: LXIMGL-H CADTEVGI5AMI RGLSUGORKRTiTTAEMI VGPARAYPMDEI.-.NG1 USSlTb'QX I S<-_rQ3r.TNT=EYTK CTDYXLKILGLjICAinUVGNAMXRGlSGGOKKRtTTAERIVGPlKAr.PMDEITNGLDSSTAPOIlKELQOVAIIITKATV 05®Х1да1хзыжз(Е1ы®счик®в1Й«адййтШ11У«Рт1а1ьий?:1т»аьрЕСТА5а1УК5ь§9₽АИ1д5А9’7

360

364

364

399

Dr34_Renan Os__PDR23 At_PDR5 At PDR9

VI^I^TWPm^LItOB^IjntePm^bl^RtB^XTPBRrAAASJ^IiewROCQiMLGPHESYRYll

V-4T.tQ?prVFDLFT3· TI,MAEG'<IT''HGP4N^AI_IKFPBn:GP^TrPFRKEVADPLCETT,?'K3C00YRG7PNFSYRYIi

PV<JLrOPAP--’Y:>LF3D.vrj«Ab^<:VYrfGPR I'VLKPFE-JCGrCCPRRY ;,’ADFLQEV1SKKDQGQYWI.HQNL₽HSE^ -VgLLCPApiGYDLFGD_IMLMAKGRIVYRCI>R'’LVLKPVEs:GPRCi?ERK JVADPLQEV.SbXDCAC’WHEDLFYSFvj

440

444

444

479

Lr34_Renan P] ~ ----- ₽]

V)

Os_₽DR23 At_₽DR5 At PDR9 kENHI

IKDLSI |kdls^

ILHEQSVF»- -IQIX leepivsIk- -fcix lEEALSCTYDliKTl gEDTLSKPYDRgxSl |p] hi hi

5X8

522

524

559

Lr34_Renan Os_₽DR23 At_PDR5 At_PBR9

M'-VP'.RTRI

RSVTUMSB Ктуупи® «ТУРТЕЗД isinmaM hltMIMLW IMVVLLVa lALIILLVq pi pi

598

602

604

639

Lr34_Renan

Os_PDR23

At_PDR5

At_PDR9

IISITI hciti ItcltI iTCLSl pTV! μ svs ΡΕΡΊ |PEAJ >IVSFFYL?LALTVFIZ >TASFFYLFLALTFPM iVAAMTAGSPVMLITFI rVASITAGSFGILFTF

678

682

684

719

I»r34_Renan

Os_₽DR23 At PDR5 AtPHR9 |ISf№ tista Iraiis isiv:

(gtv:

GLSi

ИМДИодгап g||Q|M|QKETII g|W»QKMQP:

11Л pYRTPTES IDYITSIEE SFLKSPTS Itflkspts

758

762

764

799

Lr34 JRenan O«_₽DR23 At_PDR5 At_PDR9

YHGSRPTKS|CQ«Eyhgsr£>ikr|cqe|e· srpmisqdeJseiIg· sramisqdk|sei||gi iTEKSTl sisNiRK----e|dghsnisrmmti|vme|p :

'1®88УК1ИКРЬ1»81КТМЕОР<ЖМ11|РКМТ: EI?SSVRK-KTTDgPVKTEEE-I^MVI^FKP|T’ s l“*i :

рки₽:

k<

|ptki |DQK1

829

833

840

877

Lr34_Renan

Os_PDR23

At _jDR5

At__PDR9

ΕΝΝΙΤβΑίΛοσν'Ι,ΗΛΙΙΚνδβΑσΚΙΤωηνίΑαΗΚΤ^υΐΙΕσηίΒΙιΚνρκνοΕΤΡνΚΙΜΎαΕςνΒΙΗδΡς^ΤνΕΕδνΤ

LNN 1ТСаЫЖКиЬЛИ1в*8в*<ЯгеТЫДЯПАаКИСОТ1ВС HRI-JGY PKVQETPVRIIaCYaKCADXHSPV^TVEESVT ь^с Е1^,галркра71.т*тв’:зсй8кттььэ71АвкктЕОТ1Еоп1В1£-а?ыгеоЕТРАн\'сетгсЕотохнбРЕ1ТУгЕзь: LiDITGArRPGTLTAIiMGVSGAGKTTbLDVLAGRKT'GYIEGDZRI'⁷G^77,>KVQETPARVoGYCECTDXHSPKITVEESV3

909

913

920

957

- 111 031178

Lr34_Renan Os__PER23 At_PDR5 At PDR9

ЬгЗ 4_Renan Os_m₽DR23 At_PDR5 At_PDR9

Lr3 4_Renan Os PDR23

989

993

1000

1037

1069

1073

1080

1117

1229

1233

1240

1277

1149

1153

1160

1197 , ***♦,**» , i,tt ** *i* : *.;* i*» **. * s *!,ii*s*i***, *»)** *j* ,

Lr3 4_Renan АУ1ДЖУ»УУЬУТЫ^«дДШП!АМР11Р^ТТ.№5Ш5¥ШУаЫ1^1ШУ(ЖТМЖРШЯТИОТ1ЖзШ1309

Os_PCR23 AAlij^vmWL¥TLII»SlMWTTilpJgpiTl»3SisyTfvqLlMl»V«TMjl»OQTllJ1313

At PDR5 VVT^MI»SAEFVIV3^li9tASgSlVPisllAMMNlicg«bAMPili3Mpi«yMcirlFTTFNliAg1320

AODR9 WTg|Bl№AAEFVIVTMMligiPSAWVFisifsJsiiTPyiLAMmi]»Ft«JM^llYVGFiTrM1357 _SJ* ,*·* ** *{**.**#**:*{ j::****:».iti. J · . :*» **{******(* * ·.* . [***:.* s

Lr34_Renan ХШАР^ХРКЖДьО^Ш^^АЬЬТЖГ^ЕКЕУКАЖЕТКЗУВГОК^^РИОВКЬеУУААУЬУАЖРЙхТЬ1389

Os_PDR23 11|АР|ДК!|ЙЬ™1ЛШ»ИЖАЬЬ'1такфЯ1ЕКЕУКАЖЕТК^51ЯадЖ^^К^ЗЬ5ШУЬ1ИКУ|11Ь1393

At_PDR5 ьДкр1т|вШШРУ¥1ТРТВЯСЬКЬРР£^@(5РХаОК1КАИЁ'ГкА5№Ё1>ДЙ№1>к£м1Т1111,ДМ1ЛАТМ1400

AtPDR$ Ll|QT|v><^I^I^l41^T^NGFIS^^aEEINVgQSTrfAR|§K^O^|H^lXAVTlVVQlKilA|ASM1437

Lr34_Renan FSLSXEKMjKR-1402

Os_PDR23 FSPSlEKntF^KR-1406

At PDR5 ТАРРУАЮЖдеЙ-1413

At>I>R9 FAPPVGtliM-1450

Фиг. 6

Всход

Кроющий лист спустя 53 дня Кроющий лист спустя 63 дня

JC со δ s q (D s I (ϋ ώ О X о о л:

х:

не сплайсированный сплайсированный не сплайсированный сплайсированный не сплайсированный сплайсированный

Ши |||||||

Фиг. 7 <D

X

X (ϋ m

о

I о о циклов циклов циклов

GAPDH

Фиг. 8