CN102202496B

CN102202496B - 抗性基因

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Publication number: CN102202496B
Application number: CN200980141964.5A
Authority: CN
Inventors: E·拉古德; W·施皮尔迈耶; B·凯勒; S·克拉廷格
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Grains Research and Development Corp; Universitaet Zuerich
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Universitaet Zuerich
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2009-08-25
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2029-08-25
Also published as: US20140101791A1; EA201170372A1; EP2328404B1; UA106729C2; US20110223303A1; EP2328404A1; CA2740487A1; EP2328404A4; US9115370B2; CA2740487C; AU2009287411B2; ES2486665T3; WO2010022443A1; US8581038B2; CN102202496A; EA031178B1; AU2009287411A1

Abstract

本发明涉及编码成株病原体抗性蛋白的多核苷酸。还提供了表达这些多核苷酸以增强植物对病原体的抗性的转基因植物。

Description

抗性基因

技术领域

本发明涉及编码成株病原体抗性蛋白的多核苷酸。还提供了表达这些增强植物对病原体抗性的多核苷酸的转基因植物。

背景技术

已经鉴定出多种给予病原体抗性的基因，并用于植物育种中。然而，由于新的病原体有毒种属的出现，植物中的单基因病原体抗性常常变得无效。相反，通常认为植物中持久的疾病抗性是通过多基因来控制的。

小麦(Triticumaestivum)数量性状基因座Lr34提供了成株对引起叶锈病、条锈病、茎锈病和白粉病的活体营养性真菌的持久抗性(Dyck，1977和1987；German和Kolmer，1992；Bossolini等人，2006；Spielmeyer等人，2008)。尽管这是有局限性的：在正常田地条件下的苗期这是无效的。具有抗性基因座Lr34的栽培品种，如Frontana，对叶锈病真菌小麦隐匿柄锈菌(PucciniatriticinaEriks)具有有效的持久抗性(Dyck等人，1966；Singh和Rajaram，1994)。迄今为止，尚未检测到对Lr34具有完全毒力的小麦叶锈菌(P.triticina)的分离物(Kolmer等人，2003)。

Lr34抗性在遗传上仍然与Yr18不可分离，Yr18给予了条锈病(条锈菌(P.striiformis))抗性(Singh，1992a；McIntosh，1992)。已经证明了Lr34/Yr18与其他性状(如，叶尖坏死(Ltn1)、白粉病(最近命名为Pm38)、大麦黄矮病病毒耐受性(Bdv1)和斑枯(叶斑病菌(Bipolarissorokiniana))的共分离(Singh，1992a；McIntosh，1992；Joshi等人，2004；Spielmeyer等人，2005；Liang等人，2006)。这些多病原体抗性性状已经使Lr34/Yr18基因座成为用于小麦抗病育种的最有价值的基因区之一。

已经从小麦(Feuillet等人，2003；Huang等人，2003；Cloutier等人，2007)和其他谷物(Collins等人，1999；Brueggeman等人，2002)分离和克隆出一些锈病抗性基因，并且主要来自大部分抗性(R)基因的核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复(NB-LRR)类。唯一知道的例外是大麦Rpg1锈病抗性基因，其编码蛋白激酶。这些基因编码对抗单病原体的基因对基因抗性，并且通常引起植物组织在感染时的超敏反应。相反，Lr34给予了对抗几种专性活体营养性病原体(包括来自子囊菌和担子菌的真菌)的广谱抗性。Rubiales和Niks(1995)报道了Lr34与降低的胞间菌丝生长相关，但与超敏反应或乳突形成无关。

因此，由遗传系统(如，例如Lr34)编码的数量非种属特异性、成株病原体抗性型或部分抗性的分子基础仍然是未知的。

发明内容

本发明人鉴定出给予成株增强的植物病原体抗性的基因和多肽。

因此，本发明提供了一种转基因植物，其已经将编码成株病原体抗性多肽的外源性多核苷酸和/或提高编码成株病原体抗性多肽的内源性基因转录的外源性多核苷酸整合至其基因组中。

在优选的具体实施方案中，与缺失外源性多核苷酸的等基因植物相比时，植物加速了旗叶尖的衰老。

在另一个优选的具体实施方案中，与缺失外源性多核苷酸的等基因植物相比时，植物增强了对植物病原体的抗性。

在进一步优选的具体实施方案中，多肽包含具有SEQIDNO：1中所提供序列的氨基酸，其生物活性片段，或与SEQIDNO：1至少40％相同，更优选至少80％相同，更优选至少90％相同，乃至更优选至少95％相同的氨基酸序列。更优选，多肽包含具有SEQIDNO：1中所提供序列的氨基酸。

在另一个优选的具体实施方案中，多核苷酸包含具有SEQIDNO：2中所提供序列的核苷酸，与SEQIDNO：2至少40％相同的序列和/或与SEQIDNO：2杂交的序列。

在另一个具体实施方案中，提高编码成株病原体抗性多肽的内源性基因转录的外源性多核苷酸是遗传元件，如启动子，其增强内源性基因启动子的功能。或者，增强编码成株病原体抗性多肽的内源性基因转录的外源性多核苷酸编码增强内源性基因表达的转录因子。

优选，植物是谷类植物。本发明的转基因谷类植物的实例包括但不限于小麦、大麦、玉米、水稻、燕麦和黑小麦。在特别优选的具体实施方案中，植物是小麦。

植物病原体的实例包括但不限于病毒、细菌和真菌。

在优选的具体实施方案中，病原体是活体营养性真菌。活体营养性真菌的实例包括但不限于禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)(其引起赤霉病)，小麦白粉病菌(Erysiphegraminisf.sp.Tritici)(其引起白粉病)，叶斑病菌(Bipolarissorokiniana)(其引起斑枯)，小麦秆锈菌(Pucciniagraminisf.sp.Tritici)(其引起茎锈病)，条锈菌(Pucciniastriiformis)(其引起条锈病)和小麦叶锈菌(Pucciniareconditaf.sp.Tritici)(其引起叶锈病)。

在一个具体实施方案中，病原体是大麦黄矮病病毒(BYDV)。

在一个具体实施方案中，植物包含一个或多个更多的编码植物病原体抗性多肽的外源性多核苷酸。这样的基因的实例包括但不限于Lr1，Lr3，Lr2a，Lr3ka，Lr11，Lr13，Lr16，Lr17，Lr18，Lr21和LrB。

在另一个方面中，本发明提供了鉴定编码植物病原体抗性多肽的多核苷酸的方法，其包括：

(i)获得可操作连接启动子的多核苷酸，该多核苷酸编码多肽，该多肽包含具有SEQIDNO：1中所提供序列的氨基酸，其生物活性片段，或与SEQIDNO：1至少40％相同的氨基酸序列，

(ii)将该多核苷酸引入植物中，

(iii)测定相对于缺失多核苷酸的等基因植物，对植物病原体的抗性水平是否得到了改变，和

(iv)任选，选择表达时增强了植物病原体抗性的多核苷酸。

优选，多核苷酸包含具有SEQIDNO：2中所提供的序列，与SEQIDNO：2至少40％相同的序列和/或与SEQIDNO：2杂交的序列的核苷酸。

优选，植物是谷类植物。

优选，谷类植物是小麦植物。

在优选的具体实施方案中，多肽是植物多肽或其突变体。

在进一步的具体实施方案中，步骤(ii)进一步包括将可操作连接启动子的多核苷酸稳定地整合至植物的基因组中。

在另一个方面中，本发明提供了基本上纯化的和/或重组的成株病原体抗性多肽。

在优选的具体实施方案中，多肽包含具有SEQIDNO：1中所提供序列的氨基酸，其生物活性片段，或与SEQIDNO：1至少40％相同，更优选至少80％相同，更优选至少90％相同，乃至更优选至少95％相同的氨基酸序列。

在优选的具体实施方案中，多肽在对应于SEQIDNO：4的氨基酸编号546的位置上没有苯丙氨酸残基或任何氨基酸。

在另一个优选的具体实施方案中，多肽在对应于SEQIDNO：4的氨基酸编号634的位置上具有酪氨酸残基以外的氨基酸。更优选，多肽在对应于SEQIDNO：4的氨基酸编号634的位置上包含组氨酸残基。

还提供了融合蛋白，其进一步包含至少一个其他的多肽序列。该至少一个其他的多肽可以是例如，增强本发明多肽稳定性的多肽，或有助于融合蛋白纯化或检测的多肽。

在进一步的方面中，本发明提供了一种分离的和/或外源性的多核苷酸，其包含具有SEQIDNO：2中所提供的序列，与SEQIDNO：2至少40％相同的序列，编码本发明多肽的序列和/或与SEQIDNO：2杂交的序列的核苷酸。

优选，多核苷酸包含在严谨条件下与SEQIDNO：2杂交的核苷酸序列。

优选，多核苷酸沿着由具有SEQIDNO：2序列的核苷酸组成的多核苷酸的全长杂交。

优选，多核苷酸编码成株病原体抗性多肽。

在进一步的方面中，本发明提供了嵌合载体，其包含本发明的多核苷酸。

优选，多核苷酸可操作地连接启动子。

在进一步的方面中，本发明提供了重组细胞，其包含本发明的外源性多核苷酸和/或本发明的载体。

细胞可以是任何细胞类型，如但不限于，植物细胞、细菌细胞、动物细胞或酵母细胞。

优选，细胞是植物细胞。更优选，植物细胞是谷类植物细胞。再更优选，谷类植物细胞是小麦细胞。

在进一步的方面中，本发明提供了生产本发明多肽的方法，该方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达本发明的多核苷酸。

优选，该方法进一步包括分离多肽。

在另一个方面中，本发明提供了转基因非人生物体，其包含本发明的外源性多核苷酸，本发明的载体和/或本发明的重组细胞。

优选，转基因非人生物体是植物。

在另一个方面中，本发明提供生产本发明细胞的方法，该方法包括将本发明的多核苷酸或本发明的载体引入细胞中的步骤。

优选，细胞是植物细胞。

在进一步的方面中，本发明提供了生产转基因植物的方法，该方法包括从本发明的细胞再生转基因植物。

还提供了本发明的多核苷酸或本发明的载体产生重组细胞的用途。

此外，提供了本发明的多核苷酸或本发明的载体产生转基因植物的用途。

优选，与缺失外源性多核苷酸和/或载体的等基因植物相比时，转基因植物加速了旗叶尖的衰老，和/或与缺失外源性多核苷酸和/或载体的等基因植物相比时，转基因植物增强了对植物病原体的抗性。

在另一个方面中，本发明提供了使用本发明的方法产生的转基因植物，或其后代。

在进一步的方面中，本发明提供了本发明植物的植物部分。

这些植物部分的实例包括但不限于叶、根、茎和/或种子。在优选的具体实施方案中，植物部分是包含编码成株病原体抗性多肽的外源性多核苷酸的种子。

在另一个方面中，本发明提供了生产植物部分的方法，该方法包括，

a)使本发明的植物生长，和

b)收集植物部分。

在进一步的方面中，本发明提供了从种子生产面粉、全麦粉、淀粉或其他获得的产品的方法，该方法包括：

a)获得本发明的种子，和

b)提取面粉、全麦粉、淀粉或其他产品。

在另一个方面中，本发明提供了从本发明的植物和/或本发明的植物部分生产的产品。

在一个具体实施方案中，产品是食物产品。实例包括但不限于面粉、淀粉、发酵或未发酵的面包、意大利面、面条、动物饲料、早餐谷物、点心食物、蛋糕、麦芽、啤酒、糕饼和含有基于面粉的酱的食物。

在另一个具体实施方案中，产品是非食物产品。实例包括但不限于薄膜、涂层、粘合剂、建筑材料和包装材料。

在进一步的方面中，本发明提供了制备本发明的食物产品的方法，该方法包括将种子，或来自所述种子的面粉、全麦粉或淀粉与另一种成分混合。

在进一步的方面中，本发明提供了制备麦芽的方法，该方法包括使本发明的种子发芽的步骤。

在另一个具体实施方案中，本发明提供了包含本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的重组细胞和一种或多种可接受载体的组合物。

在另一个方面中，本发明提供了基本上纯化的特异性地结合本发明多肽的抗体或其片段。

还提供了鉴定结合多肽的化合物的方法，该多肽包含具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：4中所提供序列的氨基酸，其生物活性片段，或与SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：4至少40％相同的氨基酸序列，该方法包括：

i)使多肽接触候选化合物，和

ii)确定化合物是否结合多肽。

此外，提供了鉴定通过多肽跨细胞膜转运的化合物的方法，该多肽包含具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：4中所提供序列的氨基酸，其生物活性片段，或与SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：4至少40％相同的氨基酸序列，该方法包括：

i)使存在于细胞膜中的多肽接触候选化合物，

ii)确定多肽是否跨细胞膜转运化合物。

优选，多肽在细胞中表达。

优选，细胞是植物细胞。

在一个具体实施方案中，该方法进一步包括将化合物与包含SEQIDNO：1所提供的氨基酸序列的第一种多肽的结合和/或转运与包含SEQIDNO：4所提供的氨基酸序列的第二种多肽的结合和/或转运相比较。

在进一步的方面中，本发明提供了分离的和/或外源性的多核苷酸，其存在于植物的细胞中时，降低了至少一种基因的表达，所述至少一种基因在严谨条件下与编码多肽的核酸分子杂交，该多肽包含具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：4中所提供序列的氨基酸，其生物活性片段，或与SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：4至少40％相同的氨基酸序列，所述降低的表达是相对于缺失所述多核苷酸的其他等基因植物细胞。

在一个具体实施方案中，多核苷酸编码成株病原体抗性多肽。

优选，该方面的多核苷酸可操作地连接能够指导多核苷酸在植物细胞中表达的启动子。

优选，该方面的多核苷酸是反义多核苷酸、正义多核苷酸、催化多核苷酸、人工微RNA或双链RNA分子。

在进一步的方面中，本发明提供了鉴定植物的方法，该植物包含编码成株病原体抗性多肽的基因，该方法包括：

i)从植物样品扩增和/或测序编码多肽的多核苷酸的至少一部分，该多肽包含具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：4中所提供序列的氨基酸，其生物活性片段，或与SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：4至少40％相同的氨基酸，

ii)确定植物是否包含编码成株病原体抗性多肽的多核苷酸。

将清楚的是，本发明一个方面的优选特点和特征适用于本发明的许多其他方面。

在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或变形如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，将理解为表示包含所述的要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组，但不排除其他要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。

下文将通过以下的非限制性实施例并参照附图来描述本发明。

附图说明

图1.基于三个高分辨率图谱群的包括Lr34的小麦染色体7D的共有遗传图谱限定了XSWSNP3和XcsLVE17之间Lr34的0.15cM目标间隔。与所观察到的以cM计的重组距离一起，显示了分子标记的相对位置。

图2.显示了开放阅读框相对位置的XSWSNP3和XcsLVE17之间的小麦染色体7DS一部分的展开图图示。+Lr34栽培品种“中国春(ChineseSpring)”上测序的相应物理目标间隔含有十个候选基因，其中九个在图中通过箭头来表示。编号指的是420kb测序间隔内的各自核苷酸位置。缩写：Gly，糖基转移酶；Cyst，半胱氨酸蛋白酶；Cyt，细胞色素P450；LecK，凝集素激酶；ABC，ABC转运子；Hex，己糖载体。

图3.Lr34的基因结构。空心框表示外显子，而内含子表示为邻接的线。标记表示标注为2B、2F、2G、3E、4C、4D、m19和m21的突变体的突变位点的位置。显示了Lr34的易感和抗性等位基因之间的三个序列差异：来自中国春的+Lr34抗性等位基因，来自Renan的-Lr34易感等位基因。

图4.抗性和易感栽培品种之间的Lr34蛋白序列和多态性。来自栽培品种“Renan”的Lr34蛋白(易感等位基因)的氨基酸序列。将抗性等位基因中改变的两个氨基酸突出显示。其他框表示核苷酸结合结构域内的高保守基序的位置。基序：“WalkerA”GPPGCGKS(氨基酸168-175)(SEQIDNO：50)和GVSGAGKT(氨基酸847-854)(SEQIDNO：51)；“ABC标志”ISGGQKKRLTTA(氨基酸307-318)(SEQIDNO：52)和LSMEQRKRLTIA(氨基酸954-965)(SEQIDNO：53)；“WalkerB”AYFMD(氨基酸327-331)(SEQIDNO：54)和IILMD(氨基酸974-978)(SEQIDNO：55)。小麦栽培品种中国春中Lr34的抗性等位基因中的氨基酸变化是氨基酸546(Phe(F))的删除和氨基酸634(酪氨酸(Y))置换成组氨酸。下划线的部分是两个跨膜结构域(氨基酸502-750和1152-1392)。

图5.显示了两个核苷酸结合结构域(NBD)和两个跨膜结构域的Lr34蛋白的图示。通过星号表示第一个跨膜结构域中抗性和易感等位基因之间的两个诊断多态性。

图6.Lr34氨基酸序列比对。栽培品种Renan与水稻PDR23(Os12g0512700)(SEQIDNO：47)和拟南芥属(Arabidopsis)PDR5(At3g53480)(SEQIDNO：48)和PDR9(At2g37280)(SEQIDNO：49)的Lr34的比对。指出了所有四个转运子中相同的残基。根据小麦Lr34cDNA，对水稻PDR23进行了最新注解。

图7.Lr34的表达分析。使用来自基因5’端探针的半定量RT-PCR。在苗期14天后收集近等基因系“Thatcher”和“ThatcherLr34”的叶子以及53和63天大的植株的成年旗叶。将成年叶子分成两半，以各自研究叶基和叶尖的表达水平。缩写：TH＝“Thatcher”；THLr34＝“ThatcherLr34”；GAPDH＝甘油醛3-磷酸脱氢酶。

图8.Lr34调节旗叶的衰老。使用近等基因系“Thatcher”和“ThatcherLr34”以及叠氮化物诱导的Lr34突变体2B、2F、2G、3E、4C和4E的63天大的旗叶上HvS40的Northern印迹。TH＝“Thatcher”；THLr34＝“ThatcherLr34”。

序列表索引

SEQIDNO：1-来自小麦(Triticumasetivum)cv中国春的Lr34蛋白(抗性等位基因)的氨基酸序列。

SEQIDNO：2-来自小麦cv中国春的Lr34的核苷酸编码序列。

SEQIDNO：3-来自小麦cv中国春的Lr34基因的核苷酸序列(基因组序列)。存在24个编码Lr34蛋白的外显子：

外显子1开始于核苷酸3042，结束于核苷酸3316；

外显子2开始于核苷酸3416，结束于核苷酸3539；

外显子3开始于核苷酸3693，结束于核苷酸3778；

外显子4开始于核苷酸3934，结束于核苷酸4018；

外显子5开始于核苷酸6527，结束于核苷酸6686；

外显子6开始于核苷酸6784，结束于核苷酸6860；

外显子7开始于核苷酸7119，结束于核苷酸7172；

外显子8开始于核苷酸7271，结束于核苷酸7361；

外显子9开始于核苷酸7439，结束于核苷酸7740；

外显子10开始于核苷酸7833，结束于核苷酸8108；

外显子11开始于核苷酸8187，结束于核苷酸8497；

外显子12开始于核苷酸8583，结束于核苷酸8743；

外显子13开始于核苷酸8825，结束于核苷酸8928；

外显子14开始于核苷酸9015，结束于核苷酸9168；

外显子15开始于核苷酸9606，结束于核苷酸9513；

外显子16开始于核苷酸9808，结束于核苷酸9581；

外显子17开始于核苷酸9985，结束于核苷酸10317；

外显子18开始于核苷酸10427，结束于核苷酸10717；

外显子19开始于核苷酸12159，结束于核苷酸12242；

外显子20开始于核苷酸12711，结束于核苷酸12844；

外显子21开始于核苷酸12995，结束于核苷酸13222；

外显子22开始于核苷酸13318，结束于核苷酸13489；

外显子23开始于核苷酸13569，结束于核苷酸13823；和

外显子24开始于核苷酸14613，结束于核苷酸14939。

SEQIDNO：4-来自小麦“Renan”的Lr34蛋白的氨基酸序列(易感等位基因)。

SEQIDNO：5-来自小麦“Renan”的Lr34的核苷酸编码序列(易感等位基因)。

SEQIDNO：6-来自节节麦(Aegilopstauschii)Lr34等价物的基因组DNA。编码区开始于核苷酸2426，结束于核苷酸14212。

SEQIDNO：7-小麦Lr34的EST(GenBank登录号CJ669561)。

SEQIDNO：8-小麦Lr34的EST(GenBank登录号DR733734)。

SEQIDNO：9-小麦Lr34的EST(GenBank登录号CJ562397)。

SEQIDNO：10-小麦Lr34的EST(GenBank登录号CV773074)。

SEQIDNO：11-大麦(Hordeumvulgare)Lr34的EST(GenBank登录号BU991506)。

SEQIDNO：12-46-寡核苷酸引物。

SEQIDNO：47-水稻ABC转运子PDR23。

SEQIDNO：48-拟南芥(Arabidopsisthaliana)ABC转运子PDR5。

SEQIDNO：49-拟南芥ABC转运子PDR9。

SEQIDNO：50-Lr34的N端WalkerA序列。

SEQIDNO：51-Lr34的C端WalkerA序列。

SEQIDNO：52-Lr34的N端ABC标志序列。

SEQIDNO：53-Lr34的C端ABC标志序列。

SEQIDNO：54-Lr34的N端WalkerB序列。

SEQIDNO：55-Lr34的C端WalkerB序列。

SEQIDNO：56-ABC转运子的共有WalkerA序列。

SEQIDNO：57-ABC转运子的共有WalkerB序列。

SEQIDNO：58-ABC转运子的共有ABC标志序列。

SEQIDNO：59-PDR标志序列1。

SEQIDNO：60-PDR标志序列2。

SEQIDNO：61-PDR标志序列3。

SEQIDNO：62-PDR标志序列4。

SEQIDNO：63-由小麦染色体7B上的Lr34同源物(homeolog)编码的多肽。

SEQIDNO：64-小麦染色体7B上编码Lr34同源物的开放阅读框。

具体实施方式

一般技术

除非特意限定，否则本文所用的所有技术和科学术语应当具有本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、植物分子生物学、蛋白质化学和生物化学领域中)普通技术人员通常理解的相同意思。

除非另外指出，本发明中所用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这些技术在以下来源的文献中有描述和解释，如J.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning，JohnWileyandSons(1984)，J.Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989)，T.A.Brown(编辑)，EssentialMolecularBiology：APracticalApproach，卷1和2，IRLPress(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNACloning：APracticalApproach，卷1-4，IRLPress(1995和1996，和F.M.Ausubel等人(编辑)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新)，EdHarlow和DavidLane(编辑)Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarbourLaboratory(1988)，和J.E.Coligan等人(编辑)，CurrentProtocolsinImmunology，JohnWiley&Sons(包括迄今为止的所有更新)。

多肽/肽

“基本上纯化的多肽”或“纯化的多肽”意思是通常已经与其天然状态中其结合的脂质、核酸、其他肽和其他杂质分子分离的多肽。优选，基本上纯化的多肽为至少90％没有与其天然结合的其他成分。

多肽范围中的术语“重组”指的是通过细胞或在无细胞表达系统中，以相对于其天然状态的改变的量或改变的速率产生的多肽。在一个具体实施方案中，细胞是不天然产生该多肽的细胞。然而，细胞可以是包含非内源性基因的细胞，该非内源性基因引起改变量的待生产的多肽。本发明的重组多肽包括尚未与其中生产该多肽的转基因(重组)细胞的其他成分或无细胞表达系统中分离的多肽，和在该细胞或无细胞系统中生产的从至少一些其他成分中基本上纯化的多肽。在一个具体实施方案中，“重组多肽”是通过细胞中的重组多核苷酸表达制成的多肽，该细胞优选植物细胞，更优选是谷类植物细胞。

术语“多肽”和“蛋白质”通常可以互换使用。

如本文所用的，术语“成株病原体抗性多肽”指的是通过如下的基因编码的蛋白质：与缺失所述基因的等基因植物相比时，该基因通常给予成株增强的植物病原体抗性，并且植物生长于正常田地条件下时，该基因使得相同植物的秧苗对相同的病原体有基本上很少的抗性或没有抗性。该术语还指生长于正常田地条件下时，给予成株(例如，小麦栽培品种Frontana)而不是秧苗增强的植物病原体抗性的基因编码的天然产生的蛋白质(或从其中衍生突变蛋白的野生型蛋白)。通常，成株病原体抗性多肽在病原体存在的情况下不给予植物超敏反应，并且抗性在田地中随着时间是持续性的。如本文所用的，“成株”指的是已经进入生长和发育的生殖期的植物。在一个具体实施方案中，与成株的叶子相比时，秧苗叶子中每克干重产生少于一半的蛋白质。对其增强抗性的植物病原体的实例包括但不限于禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，小麦白粉病菌(Erysiphegraminisf.sp.tritici)，叶斑病菌(Bipolarissorokiniana)，小麦秆锈菌(Pucciniagraminisf.sp.tritici)，条锈菌(Pucciniastriiformis)和小麦叶锈菌(Pucciniareconditaf.sp.tritici)。

通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)测定多肽的％同一性，使用缺口产生罚分＝5，缺口延伸罚分＝0.3。查询序列至少150个氨基酸长，并且GAP分析在至少150个氨基酸区域中比对两个序列。更优选，查询序列为至少500个氨基酸长，并且GAP分析在至少500个氨基酸区域中比对两个序列。更优选，查询序列为至少1,000个氨基酸长，并且GAP分析在至少1,000个氨基酸区域中比对两个序列。再更优选，查询序列为至少1,250个氨基酸长，并且GAP分析在至少1,250个氨基酸区域中比对两个序列。再更优选，GAP分析在其全长上比对两个序列。

如本文所用的，“生物活性”片段是本发明多肽的一部分，其保持全长多肽的限定活性。生物活性片段可以是任何大小的，只要它们保持了限定的活性，但优选至少1000或至少1200个氨基酸残基长。优选，生物活性片段保持了至少10％的全长蛋白活性。

短语“增强的植物病原体抗性”在本文用作相对的术语，使得与缺失外源性多核苷酸的遗传上相同物相比较时，本发明的植物具有提高水平的植物病原体抗性。可以通过本领域已知的许多方法来测定增强的抗性，如分析植物的病原体量和/或分析病原体存在情况下的植物生长或植物损伤的量。

如本文所用的，术语“具有加速的旗叶尖衰老”指的是植物茎上最低叶末端老化的早期发生。本文将该术语用作相对术语，使得与缺失外源性多核苷酸的遗传上相同的旗叶相比较时，本发明的植物具有提高的旗叶尖衰老。可以通过本领域已知的任何方式来测量旗叶尖的加速衰老，如实施例5中所述的。

关于限定的多肽，将理解的是高于以上所提供那些的％同一性数字将包括优选的具体实施方案。因此，在合适的情况下，根据最小％同一性数字，优选多肽包含与相关命名的SEQIDNO至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，再更优选至少99.9％相同的氨基酸序列。

如本文所用的，短语“在对应于氨基酸编号的位置上”或其变形指的是氨基酸与周围氨基酸相比的相对位置。在这点上，在一些具体实施方案中，本发明的多肽可以具有删除或置换的突变，与例如SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：4比对时，这种突变改变了氨基酸的相对位置。例如，与SEQIDNO：4中所提供序列的多肽相比较时，具有SEQIDNO：1中所提供序列的多肽具有单个氨基酸删除，即SEQIDNO：4位置编号546的苯丙氨酸在SEQIDNO：1中丢失，并且没有被另一个氨基酸置换。因此，本领域技术人员将知道SEQIDNO：4的氨基酸编号634(Y)对应于SEQIDNO：4的氨基酸编号633(H)。

可以通过将合适的核苷酸变化引入本发明的核酸中，或通过所需多肽的体外合成，来制备本发明多肽的氨基酸序列突变体。这些突变包括例如，氨基酸序列内的残基删除、插入或置换。在最终的构建体中，可以进行删除、插入和置换的组合，只要最终的肽产物具有所需的特征。相对于参照野生型多肽，优选的氨基酸序列突变体只具有一个、两个、三个、四个或10以下的氨基酸变化。

可以使用本领域已知的任何技术来制备突变的(改变的)肽。例如，本发明的多核苷酸可以进行体外诱变。这些体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆至合适的载体中，将载体转化至“突变子”菌株中(如，大肠杆菌XL-1red(Stratagene))，并将转化的细菌繁殖合适数量的世代。在另一个实例中，将本发明的多核苷酸进行DNA改组(shuffling)技术，如Harayama(1998)概述的。使用本文所述的技术，可以容易地筛选源自突变的/改变的DNA的产物，以确定它们是否具有病原体抗性和/或ABC转运子活性。

在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质将取决于待改变的特征。可以单独或连续地改变突变位点，例如，通过(1)首先用保守性氨基酸选择置换，然后根据所获得的结果用更彻底的选择，(2)删除目标残基，或(3)邻近定位的位点插入其他残基。

氨基酸序列删除通常为约1至15个残基的范围，更优选约1至10个残基，通常约1至5个邻接的残基。

置换突变体在多肽分子中除去至少一个氨基酸残基，并在其位置插入不同的残基。对于置换诱变，最感兴趣的位点包括鉴定为活性位点的位点。其他目标位点是其中获自各种菌株或物种的特定残基为相同的那些。这些位置对于生物活性是重要的。优选以相对保守的方式来置换这些位点，尤其是落入至少三个其他相同保守位点的序列内的那些。这些保守性置换显示于标题为“示例性置换”的表1中。

在优选的具体实施方案中，与天然产生的多肽相比较时，突变/变体多肽具有一个或两个或三个或四个保守性氨基酸变化。表1中提供了保守性氨基酸变化的详细内容。在优选的具体实施方案中，变化不在本文所提供的不同多肽之间高度保守的一个或多个基序内。如本领域技术人员所知的，可以合理地预测在重组细胞中表达时，这些小的变化不会改变多肽的活性。

表1.示例性置换

原始残基	示例性置换
		Ala(A)	val；leu；ile；gly
Arg(R)	lys
		Asn(N)	gln；his
Asp(D)	glu
		Cys(C)	ser
Gln(Q)	asn；his
		Glu(E)	asp
Gly(G)	pro，ala
		His(H)	asn；gln
Ile(I)	leu；val；ala
		Leu(L)	ile；val；met；ala；phe
Lys(K)	arg
		Met(M)	leu；phe
Phe(F)	leu；val；ala
		Pro(P)	gly
Ser(S)	thr
		Thr(T)	ser
Trp(W)	tyr
		Tyr(Y)	trp；phe
Val(V)	ile；leu；met；phe；ala

在一个具体实施方案中，本发明的蛋白是PDR(多效抗药性同源物)ABC转运子，并包含两个核苷酸结合结构域(NBD)和两个跨膜结构域，如图5中所示构造的。

基于与密切相关的ABC转运子的比较，Lr34的一级氨基酸序列可以用于设计其变体/突变体。如本领域技术人员所知的，与较不保守的残基相比，密切相关的PDRABC转运子中高度保守的残基不太可能被改变，尤其是用非保守性置换，活性可以得以保持。Rae(2007)，vandenBrule和Smart(2002)和Verrier等人(2008)描述了这样的保守区和可能的置换。多肽一般包含两个WalkerA盒(GX4GK[ST])(SEQIDNO：56)(对应于Lr34的SEQIDNO：50和51)和两个WalkerB盒((疏水)4[DE])(SEQIDNO：57)(对应于Lr34的SEQIDNO：54和55)，和两个ABC标志基序([LIVMFY]S[SGM][GE]X3[RKA][LIVMYA]X[LIVFMT][AG])(SEQIDNO：58)(对应于Lr34的SEQIDNO：52和53)，每个NBD以自N端的顺序包含WalkerA，ABC标志和WalkerB基序(见例如图4)。在上面的序列中，X可以是任意氨基酸，且可以独立地是相同的或不同的。

此外，多肽通常包含PDR标志1(LLLGPP)(SEQIDNO：59)，其紧接着N-端WalkerA盒的N-端并且与N-端WalkerA盒略有重叠；PDR标志2(GLDSST)(SEQIDNO：60)，其从N-端WalkerB盒的C-端约四个残基开始；PDR标志3(GLD[AT]R[AS]AAIV[MI]R)(SEQIDNO：61)，其从C-端WalkerB盒的C端约四个残基开始；和PDR标志4(VCTIHQPS)(SEQIDNO：62)，其从PDR标志3的C端约86个残基开始。

在一个具体实施方案中，本发明的多肽包含一个或多个如SEQIDNO：56至58所提供的氨基酸基序，优选全部三个的两个拷贝。更优选，本发明的多肽包含一个或多个如SEQIDNO：50至55所提供的氨基酸基序，优选全部六个。

此外，在进一步的具体实施方案中，本发明的多肽包含一个或多个如SEQIDNO：59至62所提供的氨基酸基序，优选全部四个。

表5中列出了天然产生的SEQIDNO：1变体的来源，这些变体给予了本文所述的抗性。基于本文提供的信息，技术人员将易于测定这些天然产生变体的氨基酸序列，以及用于编码这些氨基酸序列的多核苷酸。

本发明的范围内还包括在合成之中或之后经过不同修饰的本发明的多肽，例如通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基团封闭基团衍生、蛋白水解分裂、连接抗体分子或其他细胞配体等来进行修饰。多肽可以在细胞中得到翻译后修饰，例如，通过磷酸化来修饰，这可以调节其活性。这些修饰可以用于提高本发明多肽的稳定性和/或生物活性。

可以以多种方式来生产本发明的多肽，包括天然多肽的生产和回收，重组多肽的生产和回收，以及多肽的化学合成。在一个具体实施方案中，通过在有效生产多肽的条件下培养能够表达多肽的细胞并收集多肽来生产本发明的分离的多肽。用于培养的优选细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括但不限于允许多肽生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基指的是其中培养细胞来产生本发明多肽的任何培养基。这样的培养基通常包括具有可吸收碳、氮和磷酸盐来源以及合适的盐、矿物质、金属和其他营养素(如维生素)的含水培养基。本发明的细胞可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定盘和皮氏平板中培养。培养可以在适于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。这些培养条件在本领域普通技术人员的专业技能范围内。优选的多肽生产方式是在转基因植物中，优选在转基因谷类植物中。

多核苷酸和基因

本发明涉及各种多核苷酸。如本文所用的，“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”意思是核苷酸聚合物，其可以是DNA或RNA或其组合，并且包括mRNA、cRNA、cDNA、tRNA、siRNA、shRNA和hpRNA。其可以是细胞来源、基因组来源或合成来源的DNA或RNA，所述合成来源例如在自动化合成仪上形成的，且可以结合碳水化合物、脂质、蛋白质或其他物质，用荧光素或其他基团标记，或粘附于固体支持物以执行本文限定的特定活性，或包含一种或多种自然界中未发现的修饰的核苷酸，这些都是本领域技术人员公知的。聚合物可以是单链的，尤其是双链或部分双链的。部分双链RNA分子的实例是发夹RNA(hpRNA)、短发夹RNA(shRNA)或自体互补RNA，其包括通过核苷酸序列及其互补物之间的碱基配对形成的双链茎和共价结合核苷酸序列及其互补物的环序列。本文所用的碱基配对指的是核苷酸之间的标准碱基配对，包括G：U碱基对。“互补”意思是两个多核苷酸能够沿着它们的一部分长度或沿着一个或两者的全长进行碱基配对(杂交)。“杂交的多核苷酸”意思是多核苷酸与其互补物确实碱基配对。术语“多核苷酸”在本文可以与术语“核酸”互换使用。

“分离的多核苷酸”意思是通常已经从与其天然状态下结合或相连的多核苷酸序列分离的多核苷酸。优选，分离的多核苷酸是至少90％没有其天然结合的其他成分。

本发明涉及基因活性的改变以及嵌合基因的构建和使用。如本文所用的，术语“基因”包括任何脱氧核糖核苷酸序列，其包括蛋白编码区，或其在细胞中转录但未翻译，以及相关的非编码和调控区。这些相关的区域通常位于邻近5’和3’端的编码区或转录区任一侧大约2kb的距离。在这点上，基因可以包括与给定基因天然相关的控制信号，如启动子、增强剂、终止和/或聚腺苷酸化信号，或异源控制信号，在这种情况下，基因称为“嵌合基因”。位于编码区5’并且存在于mRNA上的序列称为5’非翻译序列。位于编码区3’或下游并且存在于mRNA上的序列称为3’非翻译序列。术语“基因”包括cDNA和基因组形式的基因。

本文所用的“Lr34基因”指的是与本文所述的分离的Lr34基因(SEQIDNO：3)或Lr34cDNA(SEQIDNO：2)同源的核苷酸序列，其编码给予植物病原体抗性的蛋白，病原体优选真菌病原体，植物优选谷类植物，更优选小麦植物。优选，蛋白给予超过一种的真菌病原体的抗性。Lr34基因包括谷类(如小麦)中存在的天然产生的等位基因或变体，包括由六倍体小麦的D基因组及其D基因组二倍体祖先或亲系编码的那些，以及可以通过基因修饰领域中的技术人员生产的非天然产生的变体。具有如SEQIDNO：2(cDNA)或SEQIDNO：3(基因组序列)所示的核苷酸序列，编码具有SEQIDNO：1氨基酸序列的蛋白的核酸分子，是Lr34基因的实例。在优选的具体实施方案中，Lr34基因指的是包含与SEQIDNO：2具有至少90％同一性的序列的核苷酸的核酸分子。

可以用称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码序列中断含有转录区的基因的基因组形式或克隆。本文所用的“内含子”是作为初级RNA转录产物一部分转录的但不存在于成熟mRNA分子中的基因片段。从核或初级转录产物中除去或“剪除”内含子，因此在信使RNA(mRNA)中不存在内含子。内含子可以含有调控元件，如增强子。本文所用的“外显子”指的是在RNA分子未得到翻译的情况中对应于成熟mRNA或成熟RNA分子中存在的RNA序列的DNA区。mRNA在翻译过程中用来指定新生多肽中的氨基酸的序列或次序。术语“基因”包括编码本文所述的本发明蛋白的全部或一部分和以上所述任一种的互补核苷酸序列的合成或融合分子。可以将基因引入合适的载体中，用于细胞中的染色体外维持或用于整合至宿主基因组中。

如本文所用的，“嵌合基因”指不是在其天然位置的天然基因的任何基因。通常，嵌合基因包含未在天然状态下一起发现的调控序列和转录序列或蛋白编码序列。因此，嵌合基因可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或源自相同来源的调控序列和编码序列，但以不同于天然下发现的方式排列。术语“内源性的”在本文用来表示正常存在或在与所研究的植物相同发育阶段下的未改变植物中产生的物质。“内源性基因”指的是在生物体基因组中的天然位置的天然基因。如本文所用的，“重组核酸分子”、“重组多核苷酸”或其变形指的是通过重组DNA技术构建或修饰的核酸分子。术语“外源多核苷酸”或“外源性多核苷酸”或“异源多核苷酸”等指的是通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸。例如，本发明人鉴定出小麦染色体7B上的Lr34同源物(参见SEQIDNO：63和64)。本领域技术人员可以利用该信息来突变硬质小麦中的Lr34基因同源物，使其编码如下的本发明蛋白：在对应于SEQIDNO：4的氨基酸编号546的位置上缺失苯丙氨酸残基或任何氨基酸，并且在对应于SEQIDNO：4的氨基酸编号634的位置上具有酪氨酸残基以外的氨基酸。这样的突变基因和编码的mRNA，将被认为是本发明的“外源性”多核苷酸。

外源或外源性基因可以是插入非天然生物体中的基因，引入天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化程序引入基因组中的基因。术语“遗传修饰的”包括通过转化或转导将基因引入细胞中，使细胞中的基因发生突变，以及改变或调节已经进行了这些作用的细胞或生物体或其后代中的基因的调控。

此外，多核苷酸(核酸)范围中的术语“外源性的”指的是存在于细胞或无细胞表达系统中时，与其天然状态相比，以改变的量存在的多核苷酸。在一个具体实施方案中，细胞是不天然包含该多核苷酸的细胞。然而，细胞可以是包含引起改变量的所编码多肽产生的非内源性多核苷酸的细胞。本发明的外源性多核苷酸包括尚未与其存在的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统的其他成分分离的多核苷酸，和这些细胞或无细胞系统中产生的多核苷酸，其随后从至少一些其他成分中纯化出来。外源性多核苷酸(核酸)可以是天然存在的核苷酸的连续链，或包含两个或两个以上来自不同来源(天然产生和/或合成)的核苷酸的连续链，连接形成单个多核苷酸。通常，这样的嵌合多核苷酸包含至少一个编码本发明多肽的开放阅读框，其可操作地连接适于驱动开放阅读框在目标细胞中转录的启动子。

通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定多核苷酸的％同一性，使用缺口产生罚分＝5，和缺口延伸罚分＝0.3。查询序列为至少450个核苷酸长，并且GAP分析在至少450个核苷酸区域中比对两个序列。优选，查询序列为至少1,500个核苷酸长，并且GAP分析在至少1,500个核苷酸区域中比对两个序列。再更优选，查询序列为至少3,000个核苷酸长，并且GAP分析在至少3,000个核苷酸区域中比对两个序列。再更优选，GAP分析在其全长中比对两个序列。

关于限定的多核苷酸，将认识到高于以上所提供那些的％同一性数字将包括优选的具体实施方案。因此，在合适的情况下，根据最小％同一性数字，优选多核苷酸包含与相关命名的SEQIDNO至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，再更优选至少99.9％相同的多核苷酸序列。

在优选的具体实施方案中，本发明的多核苷酸不是SEQIDNO：7至11任一个中所提供的核苷酸序列。

在进一步的具体实施方案中，本发明涉及与本文特意描述的那些基本上相同的多核苷酸。如本文所用的，关于多核苷酸，术语“基本上相同的”表示一个或少数(例如2、3或4个)核苷酸的置换，同时保持由多核苷酸编码的天然蛋白的至少一种活性。此外，该术语包括引起所编码天然蛋白的大小增加或减少一个或少数(例如2、3或4个)氨基酸，同时保持由多核苷酸编码的天然蛋白的至少一种活性的核苷酸的添加或删除。

本发明涉及寡核苷酸的用途。如本文所用的，“寡核苷酸”是最高达50个核苷酸长的多核苷酸。这些寡核苷酸的最小尺寸是本发明核酸分子上的寡核苷酸和互补序列之间形成稳定杂交体所需的尺寸。它们可以是RNA、DNA或组合或任一个的衍生物。寡核苷酸通常是相对短的10至30个核苷酸的单链分子，通常为15-25个核苷酸长。用作扩增反应中的探针或引物时，这些寡核苷酸的最小尺寸是目标核酸分子上的寡核苷酸和互补序列之间形成稳定杂交体所需的尺寸。优选，寡核苷酸至少为15个核苷酸，更优选至少18个核苷酸，更优选至少19个核苷酸，更优选至少20个核苷酸，再更优选至少25个核苷酸长。用作探针的本发明的寡核苷酸通常与标记偶联，该标记如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子。

本发明包括可以用作例如探针或引物的寡核苷酸，所述探针用以鉴定核酸分子，所述引物用以产生核酸分子。探针和/或引物可以用于从其他物种克隆本发明多核苷酸的同源物。此外，本领域已知的杂交技术还可以用于筛选这些同源物的基因组或cDNA文库。

本发明的多核苷酸和寡核苷酸包括在严谨条件下与SEQIDNO：2和/或3所提供序列杂交的那些。如本文所用的，严谨条件是以下的那些：(1)对于洗涤，使用低离子强度和高温，例如，0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO₄，50℃；(2)在杂交过程中，使用变性剂，如甲酰胺，例如，50％(vol/vol)甲酰胺，含有0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，含有750mMNaCl，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt氏溶液，超声波处理的鲑鱼精子DNA(50g/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃，在0.2×SSC和0.1％SDS中。

与天然产生的分子相比较时，本发明的多核苷酸可以具有一个或多个突变，其是核苷酸残基的删除、插入或置换。突变体可以是天然产生的(就是说，从天然来源分离的)或合成的(例如，通过进行核酸上的定点诱变)。本发明的多核苷酸或寡核苷酸的变体包括不同大小的分子，和/或能够与接近本文限定的参照多核苷酸或寡核苷酸的小麦基因组杂交。例如，变体可以包含其他核苷酸(如1、2、3、4或更多)，或较少的核苷酸，只要它们仍然与目标区域杂交。此外，可以置换少数核苷酸，而不影响寡核苷酸与目标区域杂交的能力。此外，可以容易地设计变体，其接近植物基因组的区域杂交，例如，50个核苷酸内，在该区域中，与本文限定的特异性寡核苷酸杂交。特别地，这包括编码相同多肽或氨基酸序列的多核苷酸，但通过遗传密码的冗余，其核苷酸序列不同。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然产生的等位基因变体。

核酸构建体

本发明包括包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，和载体和含有这些的宿主细胞，其生产和使用方法，及其用途。本发明涉及可操作地相连或连接的元件。“可操作地相连”或“可操作地连接”等指的是以功能性关系连接多核苷酸元件。通常，可操作相连的核酸序列连续连接，并且，在需要连接两个蛋白编码区域的情况中，是连续的并且在阅读框内。当RNA聚合酶将两个编码序列转录成单个RNA，编码序列与另一个编码序列“可操作地相连”，如果所述单个RNA得到翻译，则翻译成具有源自两个编码序列的氨基酸的单个多肽。编码序列不需要彼此相邻，只要表达的序列最终加工产生所需的蛋白。

如本文所用的，术语“顺式作用序列”、“顺式作用元件”或“顺式调控区域”或“调控区域”或相似术语，用来表示核苷酸的任何序列，将其适当放置并且相对于可表达遗传序列相连时，其能够调控(至少部分)遗传序列的表达。本领域技术人员将知道顺式调控区域能够在转录或转录后水平上激活、沉默、增强、抑制或另外改变基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明优选的具体实施方案中，顺式作用序列是激活子序列，其增强或刺激可表达遗传序列的表达。

将启动子或增强子元件与可转录多核苷酸“可操作相连”表示将可转录多核苷酸(例如，编码蛋白的多核苷酸或其他转录产物)置于启动子的调控控制下，其随后控制多核苷酸的转录。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选将启动子或其变体放置在离开可转录多核苷酸的转录起始位点一定的距离上，所述距离大约与启动子和其天然背景下(即，衍生启动子的基因)控制的蛋白编码区域之间的距离相同。如本领域已知的，可以提供该距离的一些变化，而不失去功能。相似地，关于处于其控制下放置的可转录多核苷酸，优选的调控序列元件(例如，操纵子、增强子等)的放置通过其天然背景中(即，衍生其的基因)元件的放置来限定。

如本文所用的“启动子”或“启动子序列”指的是基因的区域，通常是RNA编码区域的上游(5’)，其控制目标细胞中的转录起始和水平。“启动子”包括经典基因组基因的转录调控序列，如TATA盒和CCAAT盒序列，以及应答发育和/或环境刺激或以组织特异性或细胞类型特异性方式改变基因表达的其他调控元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)。启动子通常但不必(例如，一些PolIII启动子)位于结构基因的上游，启动子调节该结构基因的表达。此外，包含启动子的调控元件通常位于基因转录起始位点的2kb内。启动子可以含有其他特异性调控元件，位于起始位点的更远端，以进一步增强细胞中的表达，和/或改变与其可操作相连的结构基因表达的时间选择或可诱导性。

“组成型启动子”指的是指导生物体(如植物)的许多或全部组织中可操作连接的转录序列表达的启动子。本文所用的术语组成型不必表示在所有细胞类型中以相同水平表达的基因，但该基因在广泛的细胞类型中表达，尽管通常可检测到一些水平的变化。本文所用的“选择性表达”指的是在例如植物的特定器官(如例如，胚乳、胚、叶子、果实、块茎或根)中几乎专门性的表达。在优选的具体实施方案中，启动子在植物优选在谷类植物的叶子和/或茎中选择性地或优先地表达。因此，选择性表达可以与组成型表达相反，组成型表达指的是在植物经历的大部分或全部条件下在植物的许多或全部组织中的表达。

选择性表达还可以引起特定的植物组织、器官或发育阶段中基因表达产物的区域化。可以通过在基因产物的结构中包含适当信号(例如，信号肽)来实现特定亚细胞位置(如质体、细胞溶质、液泡或质外体空间)中的区域化，用于转运至所需的细胞隔室，或在半自主性细胞器(质体和线粒体)的情况中，通过将带有合适调控序列的转基因直接整合至细胞器基因组中来实现区域化。

“组织特异性启动子”或“器官特异性启动子”是在相对于许多其他组织或器官的一个组织或器官中优先表达的启动子，优选如果不是全部就是大部分其他组织或器官，例如植物中的组织或器官。通常，启动子在特定的组织或器官中以高于其他组织或器官10-倍的水平得到表达。

本发明所考虑的启动子对于待转化的宿主植物可以是天然的或可以源自另外的来源，其中该区域在宿主植物中是功能性的。其他来源包括农杆菌(Agrobacterium)T-DNA基因，如用于胭脂碱、章鱼碱、甘露碱或其他冠瘿碱启动子的生物合成的基因的启动子、组织特异性启动子(参见，例如，US5,459,252和WO91/13992)；来自病毒的启动子(包括宿主特异性病毒)，或部分或全部合成的启动子。在单子叶和双子叶植物中功能性的各种启动子是本领域公知的(参见例如，Greve，1983；Salomon等人，1984；Garfinkel等人，1983；Barker等人，1983)；包括各种从植物和病毒分离的启动子，如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S，19S)。Medberry等人(1992，1993)、Sambrook等人(1989，上文)和US5,164,316公开了用于评价启动子活性的非限制性方法。

替换地或另外地，启动子可以是诱导型启动子或发育调控的启动子，其能够在例如植物的合适发育阶段驱动所诱导的多核苷酸的表达。可以使用的其他顺式作用序列包括转录和/或翻译增强子。增强子区域是本领域技术人员公知的，并且可以包括ATG翻译起始密码子和邻近的序列。包括起始密码子时，其应当与涉及外源或外源性多核苷酸的编码序列的阅读框同相，以确保完整序列的翻译，如果其需要翻译的话。可以从转录起始区的来源或从外源或外源性的多核苷酸提供翻译起始区。该序列还可以源自选择用于驱动转录的启动子的来源，并可以特异性地修饰，以便提高mRNA的翻译。

在一个具体实施方案中，启动子至少能够在植物的叶子(特别是成熟叶子)中表达多肽。可以使用的叶子特异性启动子的实例包括Yamamoto等人(1994和1997)、Kwon等人(1994)、Gotor等人(1993)、Orozco等人(1993)、Matsuoka等人(1993)和Stockhous等人(1987和1989)中所述的那些。

本发明的核酸构建体可以包含约50至1,000个核苷酸碱基对的3’非翻译序列，其可以包括转录终止序列。3’非翻译序列可以含有转录终止信号，其可以包括或不包括聚腺苷酸化信号和任何其他能够影响mRNA加工的调控信号。聚腺苷酸化信号用于将聚腺苷酸段添加至mRNA前体的3’端。通常通过规范形式5’AATAAA-3’的同源性的存在来识别聚腺苷酸化信号，尽管变化并不是罕见的。不包括聚腺苷酸化信号的转录终止序列包括用于PolI或PolIIIRNA聚合酶的终止子，其包含一串四个或更多的胸腺嘧啶脱氧核苷。合适的3’非翻译序列的实例是含有来自根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的章鱼碱合酶(ocs)基因或胭脂碱合酶(nos)基因的聚腺苷酸化信号的3’转录非翻译区(Bevan等人，1983)。合适的3’非翻译序列也可以源自植物基因，如核酮糖-1，5-二磷酸盐羧化酶(ssRUBISCO)基因，尽管也可以使用本领域技术人员已知的其他3’元件。

因为在转录启动位点和编码序列起始之间插入的DNA序列，即非翻译5’前导序列(5’UTR)，如果得到翻译以及转录，可以影响基因表达，因此还可以使用特定的前导序列。合适的前导序列包括包含选择用来指导外源或外源性DNA序列的最佳表达的序列的那些。例如，这些前导序列包括优选的共有序列，其可以提高或维持mRNA稳定性并防止翻译的不恰当起始，如例如Joshi(1987)所述的。

载体

本发明包括使用载体，用于操纵或转移遗传构建体。“嵌合载体”意思是源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的核酸分子，优选DNA分子，其中可以插入或克隆核酸序列。载体优选是双链DNA，并且含有一个或多个独特的限制性位点，并能够在限定的宿主细胞(包括目标细胞或组织，或其祖先细胞或组织)中自主复制，或能够整合至限定的宿主的基因组中，使得克隆的序列可以再生。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如，线性或闭合的环状质粒，染色体外元件，微型染色体，或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何工具。或者，载体可以是引入细胞中时，整合至受体细胞基因组中并与其整合进去的染色体一起复制的载体。载体系统可以包含单个载体或质粒，两个或两个以上载体或质粒，其一起含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA，或转座子。载体的选择通常将取决于载体与待引入载体的细胞的相容性。载体还可以包括选择标记，如抗生素抗性基因，除草剂抗性基因或其他可以用于选择合适的转化体的基因。这些基因的实例是本领域技术人员公知的。

本发明的核酸构建体可以引入载体中，如质粒中。质粒载体通常包括其他核酸序列，为在原核和真核细胞中表达盒的易于选择、扩增和转化做准备，例如，pUC衍生的载体、pSK衍生的载体、pGEM衍生的载体、pSP衍生的载体、pBS衍生的载体，或含有一个或多个T-DNA区域的二元载体。其他核酸序列包括为载体的自主复制做准备的复制起点，选择标记基因，优选编码抗生素或除草剂抗性，为插入核酸构建体中编码的核酸序列或基因的多个位点做准备的独特多克隆位点，和增强原核和真核(尤其是植物)细胞转化的序列。

“标记基因”意思是给予表达标记基因的细胞明显不同的表型并使这些转化细胞与不具有标记的细胞区分开来的基因。选择标记基因给予了一种可以基于对选择试剂(例如，杀虫剂、抗生素、辐射、热或其他对未转化细胞的损伤处理)的抗性来“选择”的性状。筛选标记基因(或报告基因)给予了一种可以通过观察或测试来鉴定的性状，即，通过“筛选”(例如，未转化细胞中不存在的β-葡糖苷酸酶、荧光素酶、GFP或其他酶活性)。标记基因和目标核苷酸序列不必相连。

为了促进转化体的鉴定，核酸构建体理想地包含选择或筛选标记基因，作为外源或外源性多核苷酸，或除了外源或外源性多核苷酸以外，理想地包含选择或筛选标记基因。标记的实际选择不是关键，只要其与选择的植物细胞结合是功能性的(即，选择性的)。标记基因和目标外源或外源性多核苷酸不必相连，因为例如US4,399,216中所述的未连接基因的共同转化也是植物转化中的有效方法。

细菌选择标记的实例是给予抗生素抗性的标记，如氨苄青霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性，优选卡那霉素抗性。用于植物转化体选择的示例性选择标记包括但不限于hyg基因，其编码潮霉素B抗性；新霉素磷酸转移酶(nptII)基因，其给予对卡那霉素、巴龙霉素、G418的抗性；来自大鼠肝脏的谷胱甘肽-S-转移酶基因，其给予对谷胱甘肽衍生的除草剂的抗性，如例如EP256223中所述；谷氨酰胺合酶基因，其在过表达时，给予对谷氨酰胺合酶抑制剂(如，草胺膦)的抗性，如例如WO87/05327中所述的，来自绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的乙酰转移酶基因，其给予对选择剂草胺膦的抗性，如例如EP295957中所述，编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolshikimate-3-phosphatesynthase)(EPSPS)的基因，其给予对N-膦酰基甲基甘氨酸的耐受性，如例如Hichee等人(1988)所述的，给予抗双丙氨磷抗性的bar基因，如例如WO91/02071中所述的；腈水解酶基因，如来自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiellaozaenae)的bxn，其给予对溴苯腈的抗性(Stalker等人，1988)；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，其给予对甲氨蝶呤的抗性(Thillet等人，1988)；突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其给予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他抑制ALS的化学物质的抗性(EP154,204)；突变的邻氨基苯甲酸盐合酶基因，其给予对5-甲基色氨酸的抗性；或茅草枯脱卤素酶基因，其给予对除草剂的抗性。

优选的筛选标记包括但不限于，编码其各种发色底物已知的β-葡糖苷酸酶(GUS)的uidA基因，编码其发色底物已知的酶的β-半乳糖苷酶基因，水母发光蛋白基因(Prasher等人，1985)，其可以用于钙敏感性生物发光检测中；绿色荧光蛋白基因(Niedz等人，1995)或其衍生物；荧光素酶(luc)基因(Ow等人，1986)，其使得可以进行生物发光检测，和本领域已知的其他基因。用于本说明书中的“报告分子”意思是通过其化学性质提供分析上可鉴定信号的分子，该信号通过参照蛋白产物促进启动子活性的测定。

优选，将核酸构建体稳定地整合至例如植物的基因组中。因此，核酸包含合适的元件，其使得分子整合至基因组中，或将构建体置于合适的载体中，该载体可以整合至植物细胞的染色体中。

本发明的一个具体实施方案包括重组载体，其包括至少一个本发明的多核苷酸分子，插入任何能够将核酸分子递送至宿主细胞中的载体。这样的载体含有异源核酸序列，即邻近本发明的核酸分子不能天然发现的核酸序列，并且优选源自衍生核酸分子的物种以外的物种。载体可以是RNA或DNA，原核或真核，并且通常是病毒或质粒。

适用于植物细胞的稳定转染或用于转基因植物建立的许多载体已经得到了描述，例如，Pouwels等人，CloningVectors：ALaboratoryManual，1985，supp.1987；Weissbach和Weissbach，MethodsforPlantMolecularBiology，AcademicPress，1989；和Gelvin等人，PlantMolecularBiologyManual，KluwerAcademicPublishers，1990。通常，植物表达载体包括，例如一个或多个在5’和3’调控序列的转录控制下的克隆的植物基因和显性选择标记。这样的植物表达载体还可以含有启动子调控区(例如，控制诱导型或组成型、环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区)，转录起始开始位点，核糖体结合位点，RNA加工信号，转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。

可以通过提高植物细胞中编码蛋白的核苷酸序列的表达水平，或降低植物中编码蛋白的基因的表达水平，来调节蛋白的水平，例如Lr34蛋白的水平，引起改变的病原体抗性。可以通过改变每个细胞的拷贝数来调节基因的表达水平，例如，通过引入合成的遗传构建体，该构建体包含编码序列和与其可操作连接并且在细胞中是功能性的转录控制元件。可以选择和筛选多个转化体中具有由转基因整合位点附近的内源性序列影响引起的有利的转基因表达水平和/或特异性的那些。有利的转基因表达水平和模式是引起病原体抗性或其他表型的实质性改变的那种。或者，可以筛选诱变种子群或来自育种计划的植物群中具有改变的病原体抗性或其他与病原体抗性相关的表型的单独种系。

重组细胞

本发明的另一个具体实施方案包括重组细胞，其包含用一个或多个本发明的重组分子转化的宿主细胞，或其后代细胞。可以通过将核酸分子插入细胞中的任何方法来完成核酸分子至细胞中的转化。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、微注射、脂转染、吸附和原生质体融合。重组细胞可以保持单细胞，或可以生长成组织、器官或多细胞生物体。转化的本发明的核酸分子可以保留在染色体外或可以以保留其被表达能力的方式整合至转化(即重组)细胞的染色体内的一个或多个位点中。优选的宿主细胞是植物细胞，更优选谷类植物的细胞，更优选大麦或小麦细胞，再更优选是小麦细胞。

转基因植物

本文作为名词使用的术语“植物”指的是完整的植物，并且指植物界的任何成员，但用作形容词指的是存在于、获自、源自或涉及植物的任何物质，如例如，植物器官(例如叶、茎、根、花)、单细胞(例如，花粉)、种子、植物细胞等。已经出现根和芽的幼苗和发芽的种子也包括在“植物”的意思范围内。本文所用的术语“植物部分”指的是获自植物并且包含植物的基因组DNA的一个或多个植物组织或器官。植物部分包括营养性结构(例如叶、茎)、根、花器官/结构、种子(包括胚、子叶和种皮)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)、以上各种的细胞和后代。本文所用的术语“植物细胞”指的是获自植物或在植物中的细胞，并且包括原生质体或源自植物的其他细胞，产生配子的细胞和再生成完整植物的细胞。植物细胞可以是培养物中的细胞。“植物组织”意思是植物中或获自植物(“外植体”)的分化组织，或源自不成熟或成熟胚、种子、根、芽、果实、块茎、花粉、肿瘤(如，冠瘿病)组织的未分化组织，和培养物中各种聚集形式的植物细胞，如愈伤组织。种子中或来自种子的示例性植物组织是子叶、胚和胚轴。因此，本发明包括植物和植物部分，以及包含这些的产物，特别是包含改变的油组成的种子。

如本文所用的，术语“种子”指的是植物的“成熟种子”，其是准备采收或已经从植物采收的，如通常在田地中商业采收的，或作为“发育的种子”，其在受精后并在建立种子休眠之前以及在采收之前在植物中出现。

本文所用的“转基因植物”指的是含有相同物种、变种或栽培品种的野生型植物中未发现的核酸构建体的植物。即，转基因植物(转化的植物)含有在转化之前未含有的遗传材料(转基因)。转基因可以包括获自或源自植物细胞或另一种植物细胞或非植物来源或合成序列的遗传序列。通常，通过人为操纵将转基因引入植物中，例如，通过转化，也可以使用本领域技术人员已知的任何方法。优选将遗传材料稳定地整合至植物的基因组中。引入的遗传材料可以包含在相同物种中天然产生的序列，但以重排的顺序或不同的元件排列，例如，反义序列。含有这些序列的植物在本文包括在“转基因植物”中。“非转基因植物”是没有通过重组DNA技术引入遗传材料来进行遗传改变的植物。在优选的具体实施方案中，转基因植物对于已经引入的每个基因(转基因)是纯合的，使得它们的后代对于所需的表型不分离。

本文所用的术语“与等基因植物相比”指的是相对于转基因植物为等基因的植物，但不含目标转基因。优选，相应的非转基因植物是与目标转基因植物的祖先是相同的栽培品种或变种，或缺失构建体的同胞植物种系，通常称为“分离种”，或用“空载体”构建体转化的相同栽培品种或变种的植物，并且可以是非转基因植物。本文所用的“野生型”指的是没有根据本发明进行改变的细胞、组织或植物。野生型细胞、组织或植物可以用作对照，与本文所述的改变的细胞、组织或植物来比较外源性核酸的表达水平或性状改变的程度或性质。

本发明内容中限定的转基因植物包括已经使用重组技术进行遗传改变的植物的后代，其中该后代包含目标转基因。通过初始转基因植物的自体受精或通过这些植物与相同物种的另一株植物的杂交来获得这些后代。这通常将调节所需植物或植物器官中本文限定的至少一种蛋白的产生。转基因植物部分包括含有转基因的所述植物的所有部分和细胞，如例如，培养的组织、愈伤组织和原生质体。

打算用于本发明实践中的植物包括单子叶植物和双子叶植物。目标植物包括但不限于以下的植物：谷类(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米、高粱和相关作物)；甜菜(糖用甜菜和饲料甜菜)；梨果，核果和无核水果(苹果、梨、李子、桃子、杏、樱桃、草莓、树莓和黑莓)；豆科植物(豆、小扁豆、豌豆、大豆)；含油植物(油菜或其他芸苔、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、红花、亚麻、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生)；黄瓜植物(葫芦、黄瓜、甜瓜)；纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)；柑桔类水果(橙子、柠檬、葡萄柚、桔子)；蔬菜(菠菜、生菜、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、西红柿、马铃薯、红辣椒)；樟科(鳄梨、肉桂、樟脑)；或如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄、啤酒花、草皮、香蕉这些植物，天然橡胶植物，以及观赏植物(花、灌木、阔叶树和常绿植物，如针叶树)。优选，植物是谷类植物，更优选小麦、水稻、玉米、黑小麦、燕麦或大麦，再更优选小麦。

本文所用的术语“小麦”指的是小麦(Triticum)属的任何物种，包括其祖先，以及通过与其他物种杂交产生的其后代。小麦包括“六倍体小麦”，其具有AABBDD的基因组构成，由42条染色体组成，“四倍体小麦”，其具有AABB的基因组构成，由28条染色体组成。六倍体小麦包括小麦(T.aestivum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、莫迦小麦(T.macha)、密穗小麦(T.compactum)、印度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)，及其种间杂种。优选的六倍体小麦的物种是T.aestivumsspaestivum(也称为“面包小麦”)。四倍体小麦包括T.durum(本文也称为硬质小麦或Triticumturgidumssp.durum)、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、二粒小麦(T.dicoccum)、波兰小麦(T.polonicum)，及其种间杂种。此外，术语“小麦”包括六倍体或四倍体小麦属(Triticumsp.)的潜在祖先，如对于A基因组，为乌拉尔图小麦(T.uartu)、一粒小麦(T.monococcum)或野生一粒小麦(T.boeoticum)，对于B基因组，为拟斯卑尔脱山羊草(Aegilopsspeltoides)，对于D基因组，为节节麦(T.tauschii)(也称为粗山羊草(Aegilopssquarrosa)或节节麦(Aegilopstauschii))。特别优选的祖先是A基因组的那些，再更优选，A基因组祖先为一粒小麦(T.monococcum)。用于本发明的小麦栽培品种可以属于，但不限于以上所列物种的任何一种。还包括使用小麦属作为有性杂交中的亲本与非小麦物种(如黑麦[Secalecereale])通过常规技术产生的植物，非小麦物种包括但不限于黑小麦(Triticale)。

本文所用的术语“大麦”指的是大麦(Hordeum)属的任一物种，包括其祖先，以及通过与其他物种杂交产生的其后代。优选植物是商业栽培的大麦属物种，如例如，大麦(Hordeumvulgare)的或适于谷物商业生产的株系或栽培品种或变种。

本发明内容中限定的转基因植物包括已经使用重组技术在遗传上改变的植物(以及所述植物的部分和细胞)及其后代，重组技术使得在所需的植物或植物器官中产生至少一种本发明的多肽。可以使用本领域已知的技术来生产转基因植物，如通常在A.Slater等人，PlantBiotechnology-TheGeneticManipulationofPlants，OxfordUniversityPress(2003)，P.Christou和H.Klee，HandbookofPlantBiotechnology，JohnWileyandSons(2004)中所述的那些。

在优选的具体实施方案中，转基因植物对于已经引入的每个基因(转基因)是纯合的，使得它们的后代对于所需的表型不分离。转基因植物对于引入的转基因也可以是杂合的，如例如，在F1后代中，其是从杂种种子生长得到的。这样的植物可以提供本领域公知的如杂种优势的优点。

已经描述了四种将基因直接递送至细胞中的一般方法：(1)化学方法(Graham等人，1973)；(2)物理方法，如微注射(Capeccni，1980)；电穿孔(参见例如，WO87/06614，US5,472,869，5,384,253，WO92/09696和WO93/21335)；和基因枪(参见例如，US4,945,050和US5,141,131)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等人，1993；Eglitis等人，1988)；和(4)受体介导的机制(Curiel等人，1992；Wagner等人，1992)。

可以使用的加速方法包括例如微弹轰击法等。用于将转化核酸分子递送至植物细胞中的方法的一个实例是微弹轰击法。Yang等人ParticleBombardmentTechnologyforGeneTransfer，OxfordPress，牛津，英国(1994)综述了该方法。非生物颗粒(微弹)可以用核酸包被，并通过推进力递送至细胞中。示例性颗粒包括由钨、金、铂等组成的那些。除了是可重复转化单子叶植物的有效方法以外，微弹轰击的特别优点是不需要分离原生质体，也不需要农杆菌感染的易感性。适用于本发明的颗粒递送系统是获自Bio-RadLabrotories的氦加速PDS-1000/He枪。为了轰击，可以将不成熟的胚或源自不成熟胚的递送目标细胞如胚盘或愈伤组织排列在固体培养基上。

在另一个可替换的具体实施方案中，可以稳定地转化质体。公开的用于高等植物中质体转化的方法包括含有选择标记的DNA的颗粒枪递送和通过同源重组将DNA靶向质体基因组(US5,451,513，US5,545,818，US5,877,402，US5,932,479和WO99/05265)。

农杆菌介导的转移是广泛应用的系统，用于将基因引入植物细胞中，因为可以将DNA引入完整的植物组织中，由此避免了从原生质体再生完整植物的需要。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞中是本领域公知的(参见例如，US5,177,010，US5,104,310，US5,004,863，US5,159,135)。此外，T-DNA的整合是相对精确的方法，引起很少的重排。待转移的DNA区域通过边界序列来限定，并且通常将干扰DNA插入植物基因组中。

如所述的，农杆菌转化载体能够在大肠杆菌(E.coli)以及农杆菌中复制，使得可以方便地操纵(Klee等人，PlantDNAInfectiousAgents，Hohn和Schell(编辑)，Springer-Verlag，NewYork，(1985)：179-203)。此外，用于农杆菌介导的基因转移的载体中的技术进步提高了载体中基因和限制性位点的排列，有助于能够表达各种多肽编码基因的载体的构建。所述的载体具有方便的多连接子区域，两侧为启动子和聚核苷酸化位点，用于插入的多肽编码基因的直接表达，并且所述的载体适于本发明的目的。此外，含有装配了Ti基因和无装配Ti基因的农杆菌可以用于转化。在农杆菌介导的转化有效的那些植物变种中，由于基因转移的容易性和限定的性质，这是一种选择的方法。

使用农杆菌转化方法形成的转基因植物通常在一个染色体上含有单个遗传基因座。可以将这样的转基因植物称为对于添加的基因是半合的。更优选对于添加的结构基因是纯合的转基因植物；即，含有两个添加的基因的转基因植物，一个基因在染色体对的每个染色体上的相同基因座上。通过有性杂交(自体受精)含有单个添加基因的独自分离的转基因植物来获得纯合的转基因植物，使所产生的一些种子发芽并分析所得到植物中的目标基因。

还可以理解两个不同的转基因植物也可以交配来产生含有两个独自分离的外源性基因的后代。合适的后代的自体受精可以产生对于两个外源性基因是纯合的植物。还考虑了与亲本植物的回交和与非转基因植物的远交，还考虑了营养性繁殖。通常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述可以在Fehr，BreedingMethodsforCultivarDevelopment，J.Wilcon(编辑)，AmericanSocietyofAgronomy，MadisonWis.(1987)中找到。

可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔以及这些处理的组合的方法来实现植物原生质体的转化。将这些系统应用于不同的植物变种将取决于从原生质体再生特定植株的能力。描述了用于从原生质体再生谷类的说明性方法(Fujimura等人，1985；Toriyama等人，1986；Abdullah等人，1986)。

也可以使用细胞转化的其他方法，并且包括但不限于，通过将DNA直接转移至花粉中，通过将DNA直接注入植物的生殖器官中或通过将DNA直接注入未成熟胚的细胞中接着将脱水的胚再水合，将DNA引入植物中。

从单个植物原生质体转化体或从各种转化的外植体再生、发育和栽培植物是本领域公知的(Weissbach等人，MethodsforPlantMolecularBiology，AcademicPress，SanDiego，(1988))。这种再生和生长过程通常包括以下步骤：选择转化的细胞，通过胚发育至有根的幼苗阶段的常规阶段来培养那些个别化的细胞。相似地再生转基因的胚和种子。将所得到的转基因的有根嫩芽此后种植在合适的植物生长介质中，如土壤中。

含有外源、外源性基因的植物的发育或再生是本领域公知的。优选，再生的植物是自体授粉的，以提供纯合的转基因植物。否则，将从再生的植物获得的花粉与农艺上重要种系的种子生长植物杂交。相反，将来自这些重要植物种系的花粉用于使再生的植物授粉。使用本领域技术人员公知的方法，将含有所需外源性核酸的本发明的转基因植物进行栽培。

公开了主要通过使用根瘤农杆菌的转化双子叶植物的方法和获得转基因植物的方法，用于棉花(US5,004,863，US5,159,135，US5,518,908)；大豆(US5,569,834，US5,416,011)；芸苔(US5,463,174)；花生(Cheng等人，1996)；和豌豆(Grant等人，1995)。

通过引入外源性核酸将遗传变化引入植物中的谷类植物(如小麦和大麦)的转化方法，和用于从原生质体或未成熟植物胚再生植物的方法，是本领域公知的，参见例如，CA2,092,588，AU61781/94，AU667939，US6,100,447，WO97/048814，US5,589,617，US6,541,257和WO99/14314中列出的其他方法。优选，通过根瘤农杆菌介导的转化程序来生产转基因小麦或大麦植物。可以将携带所需核酸构建体的载体引入组织培养的植物或外植体的可再生小麦细胞中，或合适的植物系统中，如原生质体中。可再生的小麦细胞优选来自未成熟胚的胚盘，成熟胚，源自这些的愈伤组织，或分生组织。

为了证实转基因细胞和植物中转基因的存在，可以使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。根据产物的性质，可以以多种方式中的任一种来检测转基因的表达产物，包括Western印迹和酶分析。一种特别有用的定量蛋白表达和检测不同植物组织中复制的方法是使用报告基因，如GUS。一旦获得转基因植物，可以使它们生长，以产生具有所需表型的植物组织或部分。植物组织或植物部分可以采收和/或收集种子。种子可用作生长带有具有所需特征的组织或部分的其他植物的来源。

标记辅助选择

标记辅助选择是选择经典育种程序中与轮回亲本回交时需要的杂合植物的公认方法。在每个回交世代中的植物群对于回交群中以1∶1比例正常存在的目标基因将是杂合的，并且分子标记可以用于区分基因的两个等位基因。通过从例如幼芽中提取DNA并用特异性标记测试渗入的所需性状，进行了用于进一步回交的植物的早期选择，同时将精力和资源集中在少数植物上。为了进一步加速回交程序，可以切除来自未成熟种子(开花期后25天)的胚，并在无菌条件下使其在营养介质上生长，而不是使种子完全成熟。这种方法，称为“胚拯救”，在三叶阶段时与DNA提取结合使用，并分析给予植物增强的病原体抗性的至少一种Lr34基因或等位基因，这使得可以快速选择携带所需性状的植物，在温室或田地中培养至成熟，用于随后的与轮回亲本的进一步回交。

本领域已知的任何分子生物技术可以用于本发明的方法中。这样的方法包括但不限于，使用核酸扩增、核酸测序、与适当标记的探针的核酸杂交、单链构象分析(SSCA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链分析(HET)、化学分裂分析(CCM)、催化核酸分裂或其组合(参见例如，Lemieux，2000；Langridge等人，2001)。本发明还包括使用分子标记技术来检测与(例如)Lr34基因的等位基因相关的多态性，Lr34基因给予了增强的植物病原体抗性。这些方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、RAPD、扩增片段长度多态性(AFLP)和卫星(单序列重复，SSR)多态性的检测或分析。通过本领域公知的方法，如Langridge等人(2001)综述的群体分离分析(BulkedSegregantAnalysis)，可以容易地获得密切相连的标记。

“聚合酶链式反应”(“PCR”)是其中复制拷贝由目标多核苷酸形成的反应，该反应使用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或“引物组”，和聚合的催化剂，如DNA聚合酶，并且通常是热稳定性聚合酶。用于PCR的方法是本领域已知的，并且例如在“PCR”(M.J.McPherson和S.G.Moller(编辑)，BIOSScientificPublishersLtd，Oxford，(2000))中有教导。可以在获自逆转录mRNA的cDNA上进行PCR，逆转录mRNA从表达Lr34基因或等位基因的植物细胞分离得到，Lr34基因或等位基因给予增强的植物病原体抗性。然而，如果在分离自植物的基因组DNA上进行PCR，通常将更容易。

引物是在PCR过程中能够以序列特异性方式与目标序列杂交并得到延伸的寡核苷酸序列。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是包含引物和新合成的目标序列拷贝的延伸产物。多重PCR系统含有多组引物，引起超过一个的扩增子的同时产生。引物优选可以与目标序列配对或它们可以含有内部错配碱基，这可以引起特定目标序列中限制性酶或催化核酸识别/分裂位点的引入。引物还可以含有其他序列和/或含有改变的或标记的核苷酸，以促进扩增子的捕获或检测。DNA的热变性、引物与其互补序列的退火和退火的引物与聚合酶的延伸的重复循环引起目标序列的指数扩增。术语目标或目标序列或模板指的是得到扩增的核酸序列。

用于核苷酸序列直接测序的方法是本领域技术人员公知的，并且可以在例如Ausubel等人(上文)和Sambrook等人(上文)中找到。可以通过任何合适的方法来进行测序，例如，双脱氧测序、化学测序或其变化形式。直接测序具有测定特定序列中任何碱基对变化的优势。

TILLING

可以使用称为TILLING(定向诱导基因组局部突变(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes))的方法产生本发明的植物。在第一步中，通过用化学诱变剂处理种子(或花粉)在植物群中诱导引入的突变，如新的单碱基对变化，然后将植物发展至其中突变稳定遗传的世代。从该群的所有成员中提取DNA，并保存种子，以产生可以随着时间重复获取的资源。

对于TILLING分析，将PCR引物设计成特异性地扩增单个感兴趣的基因目标。如果目标是基因家族的成员或多倍体基因组的一部分，特异性尤为重要。接着，可以将染料标记的引物用于从多个个体的集合DNA扩增PCR产物。将这些PCR产物变性并再次退火，使得形成错配的碱基对。错配，或异源双链体，都表示天然产生的单核苷酸多态性(SNP)(即，来自群的几个植物很可能携带相同的多态性)和诱导的SNP(即，只有极少的个体植物可能展示出突变)。异源双链体形成后，使用识别并分裂错配的DNA的核酸内切酶如CelI，是发现TILLING群内新的SNP的关键。

使用这种方法，可以筛选上千的植物，以鉴定基因组的任何基因或特定区域中具有单个碱基变化以及小插入或删除(1-30bp)的任何个体。待分析的基因组片段大小可以为0.3至1.6kb范围的任何地方。在8倍集合下，每个分析1.4kb片段(在由于噪音引起的SNP检测有问题的情况中，减去片段的端点)和96个泳道，这种组合使得每个单次分析可以筛选高达百万个基因组DNA的碱基对，使得TILLING成为高通量技术。

Slade和Knauf(2005)，以及Henikoff等人(2004)中进一步描述了TILLING。

除了可以有效检测突变，高通重IILLING技术对于天然多态性的检测也是理想的。因此，通过与已知序列的异源双链体化来查询未知的同源DNA揭示了多态性位点的数目和位置。鉴定了核苷酸变化以及小的插入和删除，包括至少一些重复数量的多态性。将这称为Ecotilling(Comai等人，2004)。

通过每个SNP在少数几个核苷酸内的大约位置来记录每个SNP。因此，基于其迁移率，可以获得每个单体型。使用等份的相同扩增的用于错配分裂分析的DNA，使用相对小的增量作用，获得了序列数据。通过其对多态性的接近度来选择用于单个反应的左或右测序引物。测序仪软件执行了多重比对，并发现了碱基变化，这在每个情况中，证实了凝胶条带。

Ecotilling可以比全测序更廉价地进行，全测序是目前使用的用于大部分SNP发现的方法。可以筛选含有排列的生态型DNA的平板，而不是来自诱变植物的DNA集合。因为检测是在具有差不多的碱基对分辨率的凝胶上进行的，所有泳道的背景模式是一致的，可以匹配具有相同大小的条带，由此在单个步骤中发现SNP并对其测定基因型。这样，SNP的最终测序是简单并且有效的，通过用于筛选的等份的相同PCR产物可以进行DNA测序的事实更是表明如此。

抗体

如本发明中所用的术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、双链抗体(diabodies)、三链抗体(tribodies)、异源偶联(heteroconjugate)抗体、嵌合抗体，其包括完整的分子及其片段，如Fab、F(ab’)2和Fv，其能够结合表位决定簇，以及其他抗体样分子。

术语“特异性结合”指的是抗体结合待分析样品/生物体中的至少一种本发明的多肽但不明显结合已知蛋白的能力。

本文所用的术语“表位”指的是由抗体结合的本发明的多肽的区域。可以将表位给予动物，以产生抗表位的抗体，然而，本发明的抗体优选结合完整多肽范围中的表位区域。

如果需要多克隆抗体，用本发明的致免疫多肽来免疫选定的哺乳动物(例如，小鼠、兔子、山羊、马等)。根据已知的程序来收集并处理来自免疫动物的血清。如果含有多克隆抗体的血清含有其他抗原的抗体，可以通过免疫亲和性色谱来纯化多克隆抗体。用于生产和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了可以制得这些抗体，本发明还提供了对另一种多肽进行半抗原化(haptenised)的本发明多肽及其片段，用作动物中的免疫原。

通过本领域技术人员也可以容易地产生针对本发明多肽的单克隆抗体。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是公知的。可以通过细胞融合，也可以通过其他技术，如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒转染，来形成永生化的产生抗体的细胞系。可以筛选所产生的单克隆抗体组的不同特性；即，同种型和表位亲和性。

可替换的技术包括筛选噬菌体展示文库，其中例如，噬菌体在含有多种互补决定区(CDR)的衣壳表面上表达scFv片段。该技术是本领域公知的。

用于生产本发明抗体的其他技术是本领域已知的。

可以将本发明的抗体结合固体支持物和/或包装至在合适的容器中的试剂盒中，该容器还含有合适的试剂、对照、说明书等。

在一个具体实施方案中，将本发明的抗体进行可检测地标记。使得可以直接测量抗体结合的示例性检测标记包括放射性标记、荧光团、染料、磁珠、化学发光剂、胶质颗粒等。允许间接测量结合的标记实例包括酶，其中底物可以提供有色的或荧光的产物。其他的示例性检测标记包括在加入合适的底物后能够提供可检测产物信号的共价结合的酶。用于偶联物中的合适的酶实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等。在不可从商业上获得的情况中，通过本领域技术人员已知的技术可以容易地产生这些抗体-酶偶联物。此外，示例性检测标记包括生物素，其以高亲和性结合抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素；荧光色素(例如，藻胆蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素和德克萨斯红)，其可以和荧光激活细胞分选仪一起使用；半抗原等。优选，检测标记使得可以在平板光度计中直接测量例如生物素。这样的标记抗体可以用于本领域已知的技术中，以检测本发明的多肽。

实施例

实施例1.材料和方法

秧苗锈病感染的显微镜分析

将植物在12小时光照和黑暗体制下生长于维持在4-8℃的生长箱中。在两叶阶段时使用叶锈病培养物467接种秧苗，并转移至潮湿箱中(16-20℃的温度范围)，持续24小时，并返回至4-8℃生长箱。为了内部感染结构的显微镜观察，将第一个叶组织在1MKOH中高压灭菌，在50mMKPO₄中洗涤，用50mMKPO₄(pH7.8)溶液染色，该溶液含有20ug/ml偶联了荧光团alexa488(Invitrogen，USA)染色溶液的麦芽凝集素(WGA)。在蓝光激发下检测所有WGA-alexa染色的组织。

用于半定量PCR和Northern印迹的RNA分离

使用TRIzol溶液(38％苯酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫氰酸铵、0.1MpH5的醋酸钠和10％甘油)从叶子提取总RNA。使用SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)合成用于RT-PCR的第一链cDNA。在70℃的退火温度下，使用引物Lr34_RT_f1：5′-catcaagatttcaccgcctgtgc-3′(SEQIDNO：12)和Lr34_RT_r1：5′-gaagcctagcaacttcacgaggc-3′(SEQIDNO：13)扩增用于PDR5’端的半定量RT-PCR的特定片段。

对于Northern印迹杂交分析，将每个样品15μg的总RNA点在膜上(Hybond-XL，AmershamBiosiences)。在65℃下使用试剂盒(NewEnglandBioLabs)将探针HvS40(Spielmeyer等人，2002)进行³²p标记。用0.5×SSC，0.1％SDS溶液，在65℃下洗涤膜，并暴露了超敏性A射线胶片(DIoMaxMSmm，Kodak)。

cDNA末端的快速扩增(RACE)

为了确定cDNA的准确开始，使用了5’RACE方法。使用mRNAMini试剂盒(Qiagen)从300μg的总RNA纯化了多A⁺RNA。使用SMART^TMRACEcDNA扩增试剂盒(ClonetechLaboratories)进行了逆转录，其中将接头连接cDNA的5’端。使用接头特异性引物和基因特异性引物ABC_5RACE_r2：5′-gcggggcccacaatcatctcggc-3′(SEQIDNO：14)进行了5’端的扩增。

实施例2.Lr34的遗传作图

植物材料

产生了三个回交群，并用于Lr34的遗传作图。用于回交的亲代亲本、评分的表型、群大小和每个群上作图的标记概括于表2中。

表2.用于Lr34的高分辨率遗传作图的三个回交群

通过将高度抗性的瑞士冬小麦栽培品种“Forno”与易感瑞士冬小麦栽培品种“Arina”杂交来产生“Arina×Forno”精细作图群。随后与Arina回交和通过自体受精产生的几个世代形成了103株植物，其是在其他Arina遗传背景中含有Lr34和平均12.5％“Forno”基因组的“回交二F4”(BC2F4)。使用两个侧翼RFLP标记BE493812和BF4/3324来分析这些植物中来自Forno的Lr34染色体片段的存在。将这些含有Lr34区域的植物之一再次与“Arina”杂交，后代自交以产生1728株BC3F2植物，具有平均6.25％的“Forno”基因组。使用两个侧翼标记BE493812和SWM10来选择重组体。在AgroscopeReckenholz，苏黎世，瑞士，在2006年(BC3F3)和2007年(BC3F4)期间，进行了“Arina×Forno”群的表型测定。用瑞士叶锈病分离物Nr.90035、91047、93003、93012、94015、95001、95012、95028、95037、95039、95219、95251、96002、96004、96209和96257的夏孢子接种含有易感变种混合物的感染排。重复两次进行了疾病评级。

Lagudah等人(2006)和Spielmeyer等人(2002)中描述了在澳大利亚和CIMMYT，墨西哥进行的Thatcher×RL6058(ThatcherLr34)和Avocet×AvocetLr34高分辨率作图家族，疾病评价。该工作中使用的其他遗传储备是近等基因系“Thatcher”、“ThathcerLr34”(＝RL6058，Thatcher*6/PI5848)、“Arina”、“ArinaLr34”(Arina*3/Forno)。

用于遗传作图的标记研发

如Bossolini等人(2006)所述的，通过利用水稻、模式草短柄草(Brachypodiumsylvaticum)和二倍体D基因组祖先节节麦(Aegilopstauschii)的同线信息来产生用于作图的新分子标记。

为了获得Lr34目标间隔的物理信息，使用与来自水稻和短柄草同线区的基因相关的小麦EST筛选节节麦的部分指纹打印的细菌人工染色体(BAC)文库(J.Dvorak，UCDavis)。使用3730测序仪(AppliedBiosystems)通过低通(low-pass)测序，将来自三个不同重叠群(contigs)的十三个BAC克隆(HI057C6/HD036L7/HD102K14/HI056G21/HD062G18/HI031F14/HI135B2/RI004I15/RI042I4/HI148C23/BB045B13/HB067N4/BB062G18)进行了测序。使用PHRAP装配序列，并开采了简单序列重复(SSR)。通过在侧翼区设计引物来扩增SSR(表3)。

使用DNA测序仪4200分析了PCR产物。鉴定多态性SSR，并用前缀“SWM”或“cs”来命名。通过在低拷贝序列上设计引物来产生序列加标签的位点。将基因座特异性探针测序，并开采单核苷酸多态性(SNP)和插入/删除(InDel)。将基于多态性SNP的标记和InDel分别命名为瑞士小麦SNP(SWSNP)和瑞士小麦删除(SWDEL)。群上作图的用于基于PCR的标记的引物序列概括在表3中。通过用来自节节麦(Aetauschii)的总基因组DNA进行筛选，从来自节节麦BAC重叠群的鸟枪质粒文库分离用于RFLP分析的其他低拷贝探针csLVD2，csLVD13，csLVE17。过夜曝光后未检测到DNA杂交信号的重组质粒被选择作为潜在的低拷贝探针。

使用这些用于Lr34的遗传标记和作图群，高分辨率作图揭示了两侧为遗传标记XSWSNP3和XcsLVE17的Lr34的0.15cM的目标间隔(图1)。几个标记(图1)与Lr34共同分离。

实施例3.Lr34突变体的诱变和分离

按照Spielmeyer等人(2002)中报道的，使用20千拉德剂量的60Co源照射Lr34等值线(isoline)、“LalbahdurLr34”的种子，在CIMMYT、墨西哥和澳大利亚评价随后的M1-M5世代。从γ照射群中鉴定出八个突变体。使用新遗传标记中的一些来分析它们(实施例2)。在八个突变体中，六个是横跨Lr34/Yr18/Pm38/Ltn1基因座的中间缺失(interstitialdeletion)，而命名为m19和m21的两个突变体未显示上述遗传基因座中标记的丢失。因此利用新鉴定的标记和共同分离基因，将突变体m19和m21进行进一步的分析。

使用来自生长于温室的RL6058植物单头的种子以增加用于诱变的纯种子储备，产生了叠氮化钠突变体。将种子在4℃下预先浸泡12hr后，在7mM叠氮化钠的氧合溶液中处理谷粒，在pH3.0下持续2hr。将谷粒冲洗并种植在田地中。作为单穗行(singleearrow)种植M2后代并对病原体存在下的田地中的条、叶和茎锈病感染进行评分。

表3.该研究中所用分子标记的引物序列

分离六个易感突变体并在田地条件下对条锈病分级为70MS至90MS，对叶锈病分级为50MS至80MS，茎锈病分级为50MS。两个突变体4C(在SEQIDNO：1的氨基酸位置1030，甘氨酸至谷氨酸)和2G(在SEQIDNO：1的氨基酸位置889，甘氨酸至天冬氨酸)是引起第二个预测的核苷酸结合结构域内单个氨基酸变化的单个核苷酸转换的结果(图3和5)。在显微镜下检测时，这些突变体只显示出对叶锈病抗性的部分丢失(实施例1)。突变体2B在外显子11中引入了单个核苷酸转换(图3)，这形成了早期终止密码子。三个突变体3E、4E和2F是在剪接点的羊个核苷酸转换的结果，这形成了错误剪接的转录产物。在突变体3E和4E中内含子的保留在接近5’端引入了早期终止密码子，预测其形成非功能性蛋白质。在显微镜水平下，突变体3E和4E对叶锈病完全易感，并且与易感的近等基因系“Thatcher”不能区分开。突变体2F的转录产物丢失了倒数第二个外显子(图3)，预测这从第二个跨膜结构域中删除了85个氨基酸。在早期感染过程中，2F突变体比易感对照“Thatcher”对叶锈病更易感。

在突变研究中观察到的由功能性Lr34蛋白丢失引起的抗性缺失与来自Jagger的Lr34基因的分析一致。Jagger具有csLV34标记的Lr34相关的等位基因，但对叶锈病和条锈病易感。对Jagger中Lr34基因进行测序鉴定出G/T点突变，该G/T点突变引起早熟的终止密码子。因此，预测的栽培品种Jagger的蛋白缺失C-端的185个氨基酸，并且该等位基因很可能不是功能性的。这种点突变可能发生在携带+Lr34等位基因的抗性栽培品种中。

实施例4.目标间隔的物理信息和Lr34基因的鉴定

使用覆盖两个侧翼标记SWSNP3和csLVE17之间的目标间隔的PCR探针来筛选+Lr34(抗性)栽培品种“中国春”和-Lr34(易感)栽培品种“Renan”(INRA，Toulouse，法国)的两个BAC文库。在抗性六倍体小麦栽培品种“中国春”中对420kb含有两个侧翼标记的物理间隔进行了完全测序。为此，选择了四个“中国春”BAC克隆，即345C22，93N17，1964C18和413N16和“Renan”克隆656I06，并在基因组测序中心，St.Louis，MO，USA进行了完全测序。

序列分析揭示了含有十个开放阅读框的富含基因的岛的存在(图2)，这十个开放阅读框编码与两个糖基转移酶、两个半胱氨酸蛋白酶、两个受体凝集素激酶、两个细胞色素P450蛋白、己糖载体和ATP结合盒(ABC)转运子同源的蛋白。这些基因中没有一个存在于短柄草的同线区域中，并且发现只有己糖载体在水稻染色体6上的同源区中是保守的(水稻基因Os06g0141000)。显然并且令人惊讶地，没有一个基因显示出是通常与植物中病原体抗性相关类别的典型LRR-NBS型基因。因此，没有一个编码区是用于编码Lr34的明显候选者。

为了确定这些候选基因之一是否对应于Lr34，将对应于八个Lr34突变体中每个上的十个候选基因的基因座特异性PCR扩增的区域进行了测序。通过产生基因座特异性PCR探针扩增了候选基因，从抗性和易感栽培品种以及在八个Lr34突变体上进行扩增，并测序。突变体是“ThatcherLr34”遗传背景中的六个叠氮化物突变体，和“LalbahadurLr34”背景中的两个γ照射突变体(实施例3)。

所有突变体系显示出编码ABC转运子的开放阅读框中的序列改变(图3)。三个叠氮化物突变体2F、3E和4E全部在内含子-外显子边界处具有G至A转换，这引起剪接位点突变(图7，显示保留的内含子)。两个叠氮化物诱导的突变体2G和4C中的转换引起氨基酸置换，并且种系2B在外显子11中携带早熟终止密码子。两个γ照射突变体m19和m21分别显示出外显子10和23中各自1bp的删除，引起框架迁移和早熟终止密码子(图3)。

为了除去其他共同分离基因中的其他突变位点的可能性，将四个叠氮化物突变体2B、3E、4C和4E上覆盖12.7kb的其他九个候选基因和基因间区域的DNA片段测序，没有发现任何其他的序列改变。相似地，测序显示γ照射产生的突变体m19和m21在剩余九个候选基因的编码区域中不带有任何序列变化。因此，ABC转运子中发现的八个突变是由于这些系中非常高的突变频率引起的可能性可以被排除，并且我们得出结论：ABC转运子负责给予持久的Lr34抗病性。

Lr34与对成株条锈病(Yr18)、白粉病(Pm38)以及叶尖坏死(Ltn1)的部分抗性共同分离。作为成株，所有突变体对归因于Yr18和Pm38丢失的条锈病和白粉病更易感，并且也呈现出Ltn1的完全或部分丢失。这些观察表示了重要的发现，因为编码Lr34抗性的单个ABC转运子基因内的八个独立突变也解释了Yr18/Pm38/Ltn1，并且证明了单个基因给予了对多个病原体的抗性。

Lr34的蛋白编码序列横跨小麦基因组中的11.7kb。完整cDNA的测序和核苷酸序列与基因组序列(SEQIDNO：3)的比较揭示了Lr34具有24个外显子。基因含有23个内含子，其包括外显子4和5之间的2.5kb的大内含子(图3)。由来自抗性栽培品种中国春的Lr34编码的蛋白具有1401个氨基酸(SEQIDNO：1)，而来自易感栽培品种Renan的蛋白具有1402个氨基酸(SEQIDNO：4，图4)。氨基酸序列与其他ABC转运子的比较显示出Lr34蛋白属于ABC转运子的多向性抗药性(PDR)亚家族。PDR共享含有两个不同结构域的共同基础结构，这两个结构域为：含有参与ATP结合和水解的保守基序“WalkerA”和“WalkerB”的细胞质核苷酸结合结构域(NBD)，和参与转运底物的疏水性跨膜结构域(TMD)。两个结构域都成双存在，因此将PDR的结构称为[NBD-TMD]₂(图5)。

PDR家族只在真菌和植物中找到。已经在拟南芥属的基因组中鉴定出十五个PDR样基因，并且在水稻中描述了23个成员(Crouzet等人，2006)。已知PDR给予对各种药物的抗性，但关于这个蛋白类别的底物特异性知道得很少(Rogers等人，2001)。之前已经报道了PEN3/PDR8(来自拟南芥属的PDR)有助于对病原体的非宿主抗性(Stein等人，2006)。水稻中最接近的Lr34同源物是PDR23，在氨基酸水平上显示出88％同一性(表4)。在拟南芥属中，Lr34显示出与两个转运子PDR5和PDR9最接近的同源性，具有56％同一性。这些氨基酸序列的比对显示于图6中。

表4.小麦Lr34与来自其他植物物种的Lr34的百分比氨基酸同一性

物种	GenBank登录号	％同一性
			水稻	EAZ20654	78
	EAY83289	76
				CAD59575	55

			烟草	CAH39853(NtPDR3)	56

			葡萄	CAN65735	56

			拟南芥属	NP_181265(PDR5)	56
	NP_190916(PDR9)	55
				DAA00881(PDR13)	54
	DAA00869(PDR2)	52
				NP_176196(PDR8/PEN3)	50

本发明人接着测定了具有或不具有基于Lr34的抗性的栽培品种中Lr34等位基因之间的序列差异。+Lr34栽培品种“中国春”和-Lr34法国冬小麦栽培品种“Renan”中PDR的基因组序列的比较揭示了两个小麦品种中都存在该基因。在这两个系之间的编码序列中只存在三个多态性(图3)。一个SNP位于大的内含子4中。其他两个序列变化位于外显子11和12中。在“中国春”的外显子11中发现的三个碱基对“TTC”的删除引起了苯丙氨酸残基的删除，而外显子12中的第二个SNP将抗性栽培品种中的酪氨酸转变成组氨酸。位于外显子中的两个序列差异影响了连接两个核苷酸结合结构域的第一个跨膜结构域，并且它们可以改变转运子的结构和结合特异性(图4)。2kb推定启动子区域的序列比较没有揭示出抗性和易感等位基因之间的任何差异。

为了发现这三个序列差异中的哪一个是决定抗性所需的，在源自不同Lr34育种世系的一组+/-Lr34基因型上测定了它们的判断值(表5)。所有+Lr34系显示出与“中国春”相同的单体型，并且所有-Lr34系与“Renan”的相同。因此，所有三个报告的序列差异对于确定由Lr34给予的抗性是重要的，尽管我们没有内含子4中的SNP影响任一个等位基因的剪接效率的证据。考虑到在来自南美/北美育种程序的春小麦、来自欧洲的冬小麦和东方的Lr34基因型的Lr34PDR-ABC转运子基因中发现了相同单体型(表5)，我们推断单个事件很可能说明了小麦地方品种中Lr34的来源。将连接含有Lr34的美洲和欧洲小麦的证据追溯到上一世纪开始时产生的建立者(founder)亲缘栽培品种“Mentana”和“Ardito”(Kolmer等人，2008)。

测试位于内含子4中的SNP的判断潜力(diagnosticpotential)时，鉴定了第三个等位基因。冬小麦栽培品种Zinal、Allalin和Galaxie，以及斯卑尔脱小麦(Iriticumspelta)品种Ostro和Roqum显示出内含子4中的+Lr34单体型，但对于外显子11和12中的两个标记具有-Lr34单体型。因此，这些系形成了第三个单体型。令人感兴趣地，从未观察到互惠(reciprocal)的等位基因(T，对于内含子4中的SNP，对于两个外显子标记的+Lr34)。这种发现表明通过突变而不是重组产生了这种单体型，并且其可能代表了功能性+Lr34单体型的祖先。

表5.小麦基因型的Lr34等位基因中的多态性

基因型	来源	+/-Lr34	A/T SNP	TTC/DEL	C/T SNP
						中国春	中国	+	A	DEL	C
RL6058^*	中国	+	A	DEL	C
						Fukuho	日本	+	A	DEL	C
Mentana	意大利	+		DEL	C
						Frontana	巴西	+	A	DEL	C
Frontierra	巴西	-	T	TTC	T
						Ardito	意大利	+	A	DEL	C
JupatecoR	CIMMYT	+	A	DEL	C
						JupatecoS	CIMMYT	-	T	TTC	T
Glenlea	加拿大	+	A	DEL	C
						Thatcher	加拿大	-	T	TTC	T
Anza	USA	+	A	DEL	C
						Chris	USA	+	A	DEL	C
Condor	澳大利亚	+	A	DEL	C

Penjamo 62	CIMMYT	+
						Inia 66	CIMMYT	-
LalbahadurLr34	CIMMYT	+	A	DEL	C
						Lalbahadur	印度	-	T	TTC	T
Forno	瑞士	+
						Arina	瑞士	-
Pegaso	意大利	+	A	DEL	C
						Bezostaja	俄罗斯	+	A	DEL	C
Kavkaz	俄罗斯	+	A	DEL	C
						Roazon	法国	-
Capelle Desprez	UK	-	T	TTC	T
						Maris Huntsman	UK	-	T	TTC	T
Renan	法国	-	T	TTC	T
						“合成的”_taus		-	T	TTC	T
AL8/78_taus	亚美尼亚	-	T	TTC	T
						AUS18913_taus	伊朗	-	T	TTC	T

实施例5.Lr34的表达

Lr34是用于成株抗性的模型，其在正常田地条件下的秧苗阶段是无效的。为了确定这是否与秧苗阶段较低的Lr34表达相关，使用近等基因系“Thatcher”和“ThatcherLr34”，使用半定量RT-PCR来测定植物发育各个阶段的表达水平。在生长于20℃的14天大的秧苗中，PDR以非常低的水平表达，而在53和63天后的成株的旗叶中，表达水平明显较高(图7)。在抗性和易感植物之间的表达中，不存在实质性的差异，这与抗性和易感等位基因的启动子区域中不存在序列差异的发现相一致。令人感兴趣地，在63天后，观察到未剪接的产物在成株中累积。此外，“ThatcherLr34”中改变的转录产物具有来自外显子10的92个核苷酸缺失，预测这将破坏阅读框并且形成截短的蛋白。

已经显示出Lr34在低温下在秧苗阶段给予叶锈病培养物的抗性(Dyck和Samborski，1982)。在低温(4-8℃)下生长成秧苗并且感染叶锈病的突变体和亲本Lr34系的分析揭示了具有完整Lr34基因的“缓慢生锈”抗性应答。在感染后的最初2-3周，突变体m19、m21和“LalbahadurLr34”之间的定殖叶肉细胞的差异是不显著的。然而，在第五周，与活性的Lr34基因比较时，突变体m19和m21的定殖面积大小扩大了至少四倍。在第五周，秧苗中孢子形成的外部症状在突变体中是明显的，而活性Lr34基因的存在延迟了可见的症状，直至感染后第六周后。这种观察类似于Lr34抗性的缓慢生锈机制特征性的较长潜伏期。

Lr34给予了抗几种专性活体营养病原体的宽谱抗性，这些病原体包括来自子囊菌和担子菌的真菌。Rubiales和Nicks(1995)报道了Lr34与降低的胞间菌丝生长相关，但与超敏感性应答或乳突形成无关。在八个Lr34突变体对抗叶锈病、条锈病和白粉病的抗性中，八个Lr34突变体受到了影响，并且它们没有显示出如上所述的叶尖坏死。感染实验揭示了抗性的水平与叶尖坏死的发展相关，并且在叶尖坏死出现之前人工接种叶锈病导致比较后时间点的感染更严重的疾病症状。这些观察表明Lr34的抗性机制是由于一般生理效应引起的，而不是包括病原体诱导物的识别或抗具菌成分的分泌的“经典”抗性机制引起的。

自此形成了一个假设：由Lr34给予的持久抗性与旗叶(特别是叶尖)的早衰相关，并且至少部分是由于旗叶(特别是叶尖)的早衰引起。与坏死相反，衰老是高度控制的过程，包括营养素的再动员和叶绿素的降解。认为开始于叶尖的叶子早衰可能阻止来自宿主细胞的病原体的喂养，并且可能延迟其生长和增殖。因此，在带有或不带Lr34的小麦植物中分析了衰老相关的基因。

已知基因HvS40在大麦的衰老过程中是高度上调的(Krupinska等人，2007)。从cDNA制得了对应于该基因的探针。在Northern印迹杂交分析中使用该探针揭示了小麦HvS40在63天大的植物中，在“ThatcherLr34”而不是“Thatcher”的旗叶尖中高度表达。此外，该基因在六个Lr34叠氮化物突变体中下调或不表达(图8)。这强烈表明了Lr34调节成年小麦植物中的旗叶衰老。另一方面，显微镜观察表明了Lr34基因型的叶锈病感染后细胞壁沉积(apposition)的积累。因此很可能是Lr34介导的抗性以更复杂方式影响了病原体的发展。

Lr34的克隆是首次报道的来自小麦的多病原体抗性QTL的克隆，QTL包括Lr34、Yr18、Pm38、Ltn1，并且证明了这受单个基因的控制。将PDR亚家族的ABC转运子鉴定为负责给予这种持久成株抗性的基因。抗性和易感等位基因在编码区域中只有三个小的序列改变的差异。认为抗性等位基因加速了旗叶尖的衰老，并因此通过专性活体营养性病原体损害了营养吸收。

实施例6.来自小麦和其他物种的相关基因

通过使用源自小麦Lr34基因的用以探测cDNA或基因组文库的探针，分离了来自小麦A和B基因组的同源基因，和编码其他物种中同源物的基因。分离了来自A和B基因组的同源基因。从节节麦分离出同源基因，节节麦是与小麦相关的二倍体谷物(D基因组)(SEQIDNO：6)。从包含部分序列的EST数据库鉴定出其他相关序列(表6)。

表6.与Lr34同源的EST。显示了配对区域中的百分比序列同一性。

EST’s	同一性	对应于EST的SEQ ID NO：2的区域
			小麦
CJ669561	99％	1496-2333
			DR733734	96％	3089-3802
CJ562397	99％	3561-4206
			CV773074	100％	3732-4206


水稻
			AK102367	91％	569-2775
AK103110	91％	569-2775
			CB630740	91％	1280-2085
CI097424	92％	2292-2775
			CI380443	93％	2425-2775
CI361087	93％	2432-2775
			CI522302	90％	1904-2252

			大麦
BU991506	71％	2518-2991

甘蔗
			CA075859	77％	3216-3883
CA267101	77％	3407-3995

将源自基因的3’一半的cDNA探针在标准条件下与基因组大麦DNA杂交时，在大麦中也检测到了相关基因成员。

本发明人还测定了存在于小麦染色体7B上的Lr34的同源物。作为SEQIDNO：63提供了该同源物的蛋白序列，作为SEQIDNO：64提供了cDNA序列。

实施例7.表达外源性成株病原体抗性基因的转基因小麦的产生

为了产生转基因小麦，将包含SEQIDNO：2中提供的核苷酸序列的多核苷酸亚克隆至pPlex载体中(Schunmann等人，2003)，使得地三叶矮病毒启动子能够驱动小麦细胞中的基因转录。

根据Pellegrineschi等人(2002)的方法，进行了从栽培品种Bobwhite26的小麦胚转化。为了证实所产生的植物含有构建体，根据供应商的说明书，使用试剂盒(BIO101Inc.，Vista，California，USA)，对从叶子提取的基因组DNA进行了PCR分析。将DNA稀释至100μl无菌去离子水中，并将1μl用于PCR。

测试植物对植物病原体增强的抗性，所述病原体如小麦秆锈菌(Pucciniagraminisf.sp.Tritici)(其引起茎锈病)、条锈菌(Pucciniastriiformis)(其引起条锈病)和/或小麦叶锈菌(Pucciniareconditaf.sp.tritici)(其引起叶锈病)。

本领域技术人员将认识到可以对特定具体实施方案中所示的本发明进行各种改变和/或变化，而没有脱离宽泛所述的本发明的精神或范围。因此，认为本发明的具体实施方案在所有方面中是说明性的，并且不是限制性的。

本申请要求2008年8月25日提交的AU2008904364的优先权，将其全部内容引入本文作为参考。

将本文中讨论和/或参考的所有出版物以其整体引入本文。

已经包括在本说明书中的文件、法令、材料、装置、文章等的任何讨论仅仅是为本发明提供背景的目的。因为其在本申请每个权利要求的优先权日之前存在，因此不将其理解为承认任何这些内容或全部这些内容形成现有技术基础的一部分，或是与本发明相关领域中的普通一般知识。

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Claims

1.一种在细胞中产生多肽的方法，所述方法包括在细胞中表达编码成株病原体抗性多肽的外源性多核苷酸，其中所述抗性多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，并且所述抗性多肽赋予小麦植物对小麦秆锈菌(Pucciniagraminisf.sp.tritici)、条锈菌(Pucciniastriiformis)或小麦叶锈菌(Pucciniareconditaf.sp.tritici)的抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中当所述多肽在小麦植物cv.LalbahadurLr34当中产生时，所述多肽赋予成株植物病原体抗性。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中当所述多肽在小麦植物cv.LalbahadurLr34当中产生时，所述多肽还赋予加速的旗叶尖衰老。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述植物细胞是小麦植物细胞。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述植物细胞在植物中。

7.一种纯化和/或重组的成株病原体抗性多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

8.一种包含核苷酸的分离的和/或外源性的多核苷酸，该核苷酸具有编码根据权利要求7所述的多肽的序列。

9.一种包含根据权利要求8所述的多核苷酸的嵌合载体。

10.根据权利要求9所述的载体，其中多核苷酸可操作地连接启动子。

11.一种生产权利要求7所述的多肽的方法，该方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达根据权利要求8所述的多核苷酸。

12.一种生产重组植物细胞的方法，该方法包括将根据权利要求8所述的多核苷酸，或根据权利要求9或权利要求10所述的载体引入植物细胞中的步骤。

13.一种生产转基因植物的方法，该方法包括从重组植物细胞再生转基因植物，所述重组植物细胞包含根据权利要求8所述的外源性多核苷酸，和/或根据权利要求9或权利要求10所述的载体。

14.根据权利要求8所述的多核苷酸或根据权利要求9或权利要求10所述的载体用以生产重组细胞和/或转基因植物的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中转基因植物与缺失外源性多核苷酸和/或载体的等基因植物相比时，具有加速的旗叶尖衰老，和/或与缺失外源性多核苷酸和/或载体的等基因植物相比时，具有增强的对植物病原体的抗性。

16.一种生产植物部分的方法，该方法包括，

a)使在其基因组中整合了编码成株病原体抗性多肽的外源性多核苷酸的转基因植物生长，和

b)采收植物部分，

其中所述抗性多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，并且所述抗性多肽赋予小麦植物对小麦秆锈菌(Pucciniagraminisf.sp.tritici)、条锈菌(Pucciniastriiformis)或小麦叶锈菌(Pucciniareconditaf.sp.tritici)的抗性。

17.一种生产获自种子的面粉或淀粉的方法，该方法包括；

a)从在其基因组中整合了编码成株病原体抗性多肽的外源性多核苷酸的转基因植物中获得种子，和

b)提取面粉或淀粉，

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述面粉是全麦粉。

19.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中与缺失所述抗性多肽的等基因植物相比时，所述植物具有加速的旗叶尖衰老。

20.一种从转基因植物、或其部分产生的产品，所述转基因植物、或其部分在其基因组中整合有编码成株病原体抗性多肽的外源性多核苷酸，

其中所述抗性多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，并且所述抗性多肽赋予小麦植物对小麦秆锈菌(Pucciniagraminisf.sp.tritici)、条锈菌(Pucciniastriiformis)或小麦叶锈菌(Pucciniareconditaf.sp.tritici)的抗性，以及

所述产品是

i)食物产品，选自面粉、淀粉、发酵面包、未发酵的面包、面条、动物饲料、早餐谷物、点心食物、麦芽、啤酒和含有基于面粉的酱的食物；或者

ii)非食物产品，选自薄膜、涂层、粘合剂、建筑材料和包装材料。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述面条是意大利面。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述点心食物是蛋糕或糕饼。

23.一种组合物，其包含权利要求7所述的多肽，或权利要求8所述的多核苷酸，和一种或多种可接受的载体。