CN105408482B - 小麦秆锈病抗性基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及已将编码赋予对小麦禾柄锈菌，诸如小麦禾柄锈菌的Ug99组小种的抗性的多肽的外源多核苷酸整合进其基因组的转基因植物。在实施方案中，所述多核苷酸为来自野山羊草的Sr33基因。

Description

小麦秆锈病抗性基因
发明领域
本发明涉及转基因植物，转基因植物已将编码赋予对麦秆锈菌(Pucciniagraminis)诸如小麦禾柄锈菌(Puccinia graminis f.sp.Tritici)的Ug99组小种的抗性的多肽的外源多核苷酸整合进其基因组。
发明背景
小麦的秆锈(小麦禾柄锈菌)是全球粮食安全的主要威胁，从而使得必需持续开发新的秆锈病抗病品种。于1999年在乌干达首次验证的秆锈菌小种Ug99或TTKSK对许多商业品种，包括迄今已被证明是持久的和广泛种植的携带Sr31抗性基因的那些品种(Jones等，1991；Bariana和McIntosh,1993)，是致命的。Ug99及其突变体衍生的小种已蔓延至其它非洲地区和中东。对潜在流行病的担忧：其可能会到达亚洲的产粮区一直以来是抗击由Ug99及其谱系造成的粮食安全威胁的全球性倡议的关键驱动力。在提出的病原体的迁移路径中超过90％的小麦品种是易感的(Bariana和McIntosh,1993)。提高抗锈能力的全球小麦育种努力很大程度上基于抗小麦锈病病原体效应子库的免疫识别特异性库，免疫识别特异性库体现在于小麦及其近缘种的基因库中发现的主要抗性(R)基因。使能够检测宽范围的效应子的不同特异性R基因组合被认为是在商业性农业生产中遏制锈病流行的有效策略。
在所有生长阶段赋予抗性的超过50个秆锈病R基因已被归类在包含从野生型近缘种渗入的那些秆锈病R基因的小麦中。迄今为止，这些小麦秆锈病R基因均未被克隆。相反地，已克隆了提供免受小麦叶锈病真菌小麦叶锈菌(Puccinia triticina)侵害的3个小麦R基因(Lr1、Lr10和Lr21)(Somers等，2004；Hayden等，2008；Manly等，2001)。普通小麦(小麦(Triticum aestivum))的来源于二倍体D基因组祖先野山羊草(Kosambi,1944)的小麦秆锈病R基因Sr33展示许多有趣的特性；其提供抗Ug99小种及其谱系以及来自不同地理区域的所有通常可获得的锈病分离株的中等抗性感染反应(Kota等，2006)。目前正努力对基因组进行完全测序以及表征来自小麦秆锈病病原体(包括Ug99)的效应子(Akhunov等，2010)。
存在对赋予植物(尤其是小麦)至少一定水平的抗麦秆锈菌(诸如小麦禾柄锈菌的Ug99组小种)的抗性的基因的鉴定的迫切需要。
发明概述
本发明人已鉴定了赋予植物(尤其是小麦)至少一定水平的抗麦秆锈菌(诸如小麦禾柄锈菌的Ug99组小种)的抗性的多肽。
因此，在第一方面，本发明提供了已将编码赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽的外源多核苷酸整合进其基因组的转基因植物，其中多核苷酸被可操作地连接于能够指导多核苷酸在植物细胞中表达的启动子。
在实施方案中，麦秆锈菌为小麦禾柄锈菌。在其它实施方案中，小麦禾柄锈菌是Ug99组小种。
在另一个实施方案中，当与缺乏外源多核苷酸的同基因植物相比较时，转基因植物具有增强的对麦秆锈菌的抗性。
在实施方案中，多肽为Sr33多肽。
在其它实施方案中，
i)多肽包含具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中提供的序列、其生物活性片段、或与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的一种或两种具有至少87％同一性的氨基酸序列的氨基酸，和/或
ii)多核苷酸包含具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中提供的序列、与SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4中的一种或两种具有至少87％同一性的序列、或与SEQ ID NO:3和SEQID NO:4中的一种或两种杂交的序列的核苷酸。
在实施方案中，多核苷酸包含卷曲螺旋(CC)结构域、核苷酸结合(NB)结构域和富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域的一个或多个，优选地全部。
在其它实施方案中，多肽包含NB结构域的p–环基序、激酶2基序和激酶3a基序的一个或多个，优选地全部。
在实施方案中，p-环基序包含序列GxxGxGK(T/S)T(SEQ ID NO:110)，更优选地序列GFGGLGKTT(SEQ ID NO:111)。
在实施方案中，激酶2基序包含序列LxxxDDVW(SEQ ID NO:112)，更优选地序列LVIIDDVW(SEQ ID NO:113)。
在实施方案中，激酶3a基序包含序列GxxxxxTxR(SEQ ID NO:114)，更优选地序列GSRLIITTR(SEQ ID NO:115)。
在其它实施方案中，LRR结构域包含序列xxLxLxxxx(SEQ ID NO:116)的约10至约20个有缺陷的重复序列。
优选地，植物是谷类植物。本发明的转基因谷类植物的实例包括，但不限于小麦、大麦、玉米、稻、燕麦和小黑麦。在特别优选实施方案中，植物为小麦。
在其它实施方案中，植物包含一个或多个另外的编码另一种植物病原体抗性多肽的外源多核苷酸。此类其它植物病原体抗性多肽的实例包括，但不限于Lr34、Lr1、Lr3、Lr2a、Lr3ka、Lr11、Lr13、Lr16、Lr17、Lr18、Lr21、LrB和Sr35。
优选地，植物对于外源多核苷酸是纯合的。
在实施方案中，植物正在田间生长。
还提供了一个正在田间生长的至少100株本发明的转基因植物的群体。
在另一个方面，本发明提供了用于鉴定编码赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽的多核苷酸的方法，该方法包括：
i)获得可操作地连接于启动子的多核苷酸，多核苷酸编码包含具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2提供的序列、其生物活性片段、或与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的一种或两种具有至少40％同一性的氨基酸序列的氨基酸的多肽，
ii)将多核苷酸引入植物，
iii)确定对麦秆锈菌的抗性水平相对于缺乏多核苷酸的同基因植物是否被改变，和
iv)任选地，选择当表达时赋予对麦秆锈菌的抗性的多核苷酸。
在实施方案中，该方法具有以下方面的一个或多个方面，
a)多核苷酸包含具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中提供的序列、与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的一种或两种具有至少40％同一性的序列、或与SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4中的一种或两种杂交的序列的核苷酸，
b)植物是谷类植物诸如小麦植物，
c)多肽是植物多肽或其突变体，和
d)步骤ii)还包括将可操作地连接于启动子的多核苷酸稳定地整合进植物的基因组中。
还提供了基本上纯化的和/或重组麦秆锈菌植物抗性多肽。
在实施方案中，多肽为Sr33多肽。
在另一个实施方案中，多肽包含具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2提供的序列、其生物活性片段、或与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的一种或两种具有至少87％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的氨基酸序列的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供基本上纯化的和/或重组的多肽，其包含具有如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2中提供的序列、或与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的一种或两种具有至少87％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的氨基酸序列的氨基酸。
在实施方案中，本发明的多肽是还包含至少一个其它多肽序列的融合蛋白。至少一个其它多肽可以是例如增强本发明的多肽的稳定性的多肽，或帮助融合蛋白的纯化或检测的多肽。
在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸和/或外源多核苷酸，该多核苷酸包含具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中提供的序列、与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的一种或两种具有至少87％同一性的序列、编码本发明的多肽的序列、或与SEQ ID NO:3和SEQID NO:4中的一种或两种杂交的序列的核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的嵌合载体。
优选地，将多核苷酸可操作地连接于启动子。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的外源多核苷酸和/或本发明的载体的重组细胞。
细胞可以是任何细胞类型诸如，但不限于，植物细胞、细菌细胞、动物细胞或酵母细胞。
优选地，细胞是植物细胞。更优选，植物细胞是谷类植物细胞。甚至更优选，谷类植物细胞是小麦细胞。
在另一个方面，本发明提供了产生本发明的多肽的方法，该方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达本发明的多核苷酸。
优选地，方法还包括分离多肽。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的外源多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的重组细胞的转基因非人生物体。
优选地，转基因非人生物体是植物。优选地，植物是谷类植物。更优选地，谷类植物是小麦植物。
在另一个方面，本发明提供了产生本发明的细胞的方法，该方法包括将本发明的多核苷酸或本发明的载体引入细胞的步骤。
优选地，细胞是植物细胞。
在另一个方面，本发明提供了产生本发明的转基因植物的方法，该方法包括如下步骤：
i)将本发明的多核苷酸和/或本发明的载体引入植物细胞，
ii)从细胞再生转基因植物，和
iii)任选地从植物收获种子，和/或
iv)任选地从转基因植物产生一个或多个后代植物，
从而产生转基因植物。
在另一个方面，本发明提供了产生已将编码赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽的多核苷酸整合进其基因组的植物的方法，该方法包括如下步骤：
i)将两个亲本植物杂交，其中至少一个植物包含编码赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽的多核苷酸，
ii)筛选来自杂交的一个或多个后代植物的多核苷酸的存在或不存在，和
iii)选择包含多核苷酸的后代植物，由此产生植物。
在实施方案中，亲本植物的至少一个是本发明的转基因植物，并且所选择的后代植物包含编码赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽的外源多核苷酸。
在其它实施方案中，亲本植物的至少一个是四倍体或六倍体小麦植物。
在另一个实施方案中，步骤ii)包括分析来自植物的包含DNA的样品的多核苷酸。
在另一个实施方案中，步骤iii)包括
i)选择对于多核苷酸是纯合的后代植物，和/或
ii)分析植物或其一个或多个后代植物的对麦秆锈菌的抗性。
在实施方案中，方法还包括
iv)将步骤i)的杂交的后代与具有与第一亲本植物相同的基因型的植物回交，进行足够的次数以产生具有第一亲本的大部分基因型但包含多核苷酸的植物，第一亲本植物缺乏编码赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽的多核苷酸，和
iv)选择具有对麦秆锈菌的抗性的后代植物。
在另一个方面，本发明的方法还包括分析植物的至少一个其它遗传标记的步骤。
还提供了使用本发明的方法产生的植物。
在另一个方面，本发明提供了本发明的多核苷酸或本发明的载体用于产生重组细胞和/或转基因植物的用途。
在实施方案中，转基因植物具有当与缺乏外源多核苷酸和/或载体的同基因植物相比较时增强的对麦秆锈菌的抗性。
在另一个方面，本发明提供了用于鉴定包含编码赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽的多核苷酸的植物的方法，该方法包括如下步骤：
i)从植物获得核酸样品，和
ii)筛选样品的多核苷酸的存在或不存在，其中多核苷酸的存在表示植物抗麦秆锈菌。
在实施方案中，多核苷酸编码本发明的多肽。
在其它实施方案中，方法鉴定本发明的转基因植物。
在另一个实施方案中，方法还包括在步骤i)之前从种子产生植物。
还提供了本发明的植物的植物部分。
在实施方案中，植物部分是包含编码赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽的外源多核苷酸的种子。
在另一个方面，本发明提供了产生植物部分的方法，该方法包括，
a)使本发明的植物生长，和
b)收获植物部分。
在另一个方面，本发明提供了产生面粉、全麦粉、淀粉或获自种子的其它产品的方法，该方法包括；
a)获得本发明的种子，和
b)提取面粉、全麦粉、淀粉或其它产品。
在另一个方面，本发明提供了从本发明的植物和/或本发明的植物部分产生的产品。
在实施方案中，该部分是种子。
在实施方案中，该产品是食品或饮品。实例包括，但不限于；
i)选自由以下组成的组的食品：面粉、淀粉、发酵或未经发酵的面包、面糊、面条、动物饲料、早餐谷物、零食、糕饼、麦芽、啤酒、糕点、和含基于面粉的调味酱的食物，或
ii)为啤酒或麦芽的饮品。
在替代实施方案中，该产品是一种非食物产品。实例包括，但不限于，膜、涂料、粘合剂、建材和包装材料。
在另一个方面，本发明提供了制备本发明的食品的方法，该方法包括将种子或来自种子的面粉、全麦粉或淀粉与另一种食品成分混合。
在另一个方面，本发明提供了制备麦芽的方法，该方法包括使本发明的种子发芽的步骤。
还提供了本发明的植物或其部分用作动物饲料，或用于生产用于动物消费的饲料或用于人消费的食物的用途。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、或本发明的重组细胞的一种或多种以及一种或多种可接受的载体的组合物。
在另一个方面，本发明提供了鉴定化合物的方法，该化合物结合包含具有如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2中提供的序列、其生物活性片段、或与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的一种或两种具有至少40％同一性的氨基酸序列的氨基酸的多肽，该方法包括：
i)将多肽与候选化合物接触，和
ii)确定化合物是否结合多肽。
除非另外明确地指出，否则本文中的任何实施方案将被采用来应用(就实际的情形在细节上做必要的修正)于任何其它实施方案。
本发明的范围不受由本文中描述的特定实施方案的限制，其仅用于例示的目的。功能等效的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内，如本文描述的。
在整个本说明书中，除非另外明确说明或上下文另外要求，否则对单个步骤、物质组成、步骤的组或物质组成的组的提及将被采用来涵盖那些步骤、物质组成、步骤的组或物质组成的组的一个和多个(即一个或多个)。
通过以下非限制性实施例和参照附图来在下文中描述本发明。
附图简述
图1.(c)携带Sr33的小麦1DS区与(a)粗山羊草(Ae.tauschii)(AL8/78)BAC重叠群、(b)粗山羊草(AUS18913)BAC、(d)大麦、(e)短柄草属(Brachypodium)和(f)稻之间的同线性的示意图。椭圆形表示用于研究的基因。(c)中的数字表示每2850个配子的重组体的数目。(d)至(f)中的数字显示标记之间的以千碱基计的物理距离。(a)和(b)中的数字表示如下指定的粗山羊草BAC：1.HI134N19、2.HD512N18、3.RI353E24、4.HI328O18、5.HD071G23、6.HD147M18、7.HD036N08、8.RI074M08、9.HI085F18、10.69I06、11.172J10和12.86D17。
图2.通过EMS处理产生的易感突变体的类型的示意图。虚线条表示因突变而导致的染色体片段丢失的长度，而“Sr33”代表AeRGA1e基因中的SNP变化。
图3.AetRGA2b多肽的结构的示意图。通过RT-PCR分析预测的氨基酸序列由与大麦Mla基因座的RGA2种类相关的CC、NB和LRR结构域和与胞吐体(exocyst)70亚单位相关的罕见结构域组成。
图4.(A)Sr33(AetRGA1e)的结构的示意图。矩形条代表外显子和UTR，而两者之间的黑线表示内含子。(B)4个点突变中的核苷酸和相应氨基酸变化的细节。E9和E7在P-环(Walker A)中具有取代，而E6和E8分别在NB结构域的RNBS-B和GLPL基序中具有取代。
图5.来自粗山羊草的RGA多肽(AetRGA)、大麦(HvMla)和一粒小麦(T.monococcum)(TmMla)的功能性Mla和来自小麦的CC-NB-LRR类型(Lr1、Lr10和Lr21)的叶锈病抗性的邻接树分析。
图6.针对粗山羊草中的Sr33基因的等位基因鉴定的单体型的多肽氨基酸序列的比对。多态性变化通过阴影指示并且虚线代表缺失变异。
图7.实施例7中所述的截短Sr33构建体的图形示意和数值单位(numericaldenomination)。
序列表的说明
SEQ ID NO:1–秆锈病抗性多肽的氨基酸序列(来自单体型I)。
SEQ ID NO:2–以SEQ ID NO:1提供的秆锈病抗性多肽的等位基因变体的氨基酸序列(来自单体型II)。
SEQ ID NO:3–编码SEQ ID NO:1的秆锈病抗性多肽(来自单体型I)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4–编码SEQ ID NO:2的秆锈病抗性多肽(来自单体型II)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5–编码SEQ ID NO:1的秆锈病抗性多肽(来自单体型I)的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6–Sr33多肽变体单体型III的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7–Sr33多肽变体单体型IV的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8–Sr33多肽变体单体型V的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9–编码Sr33多肽变体单体型III的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10–编码Sr33多肽变体单体型IV的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11–编码Sr33多肽变体单体型V的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12–编码SEQ ID NO:2的秆锈病抗性多肽(来自单体型II)的基因的多核苷酸序列。
SEQ ID NOs 13至109–寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:110–共有p-环基序。
SEQ ID NO:111–以SEQ ID NO:1提供的多肽的P-环基序。
SEQ ID NO:112–共有激酶2基序。
SEQ ID NO:113–以SEQ ID NO:1提供的多肽的激酶2基序。
SEQ ID NO:114–共有激酶3a基序。
SEQ ID NO:115–以SEQ ID NO:1提供的多肽的激酶3a基序。
SEQ ID NO:116–LRR结构域的共有重复序列。
发明详述
一般技术和定义
除非另外明确定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语将被采用来具有与由本领域中(例如，细胞培养、分子遗传学、植物分子生物学、蛋白质化学和生物化学中)的普通技术人员通常理解的相同的含义。
除非另有所指，否则本发明中利用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是标准程序，对于本领域技术人员来说是公知的。此类技术在以下来源中的文献通篇中进行了描述和解释，所述来源为诸如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,JohnWiley和Sons(1984),J.Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(编辑),Essential MolecularBiology:A Practical Approach，第1和2卷，IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:A Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)，和F.M.Ausubel等(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直至目前的所有更新),Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory,(1988)以及J.E.Coligan等(编辑)Current Protocols in Immunology,JohnWiley&Sons(包括直至目前的所有更新)。
术语“和/或”，例如，“X和/或Y”应当被理解为意指“X和Y”或“X或Y”并且应当被采用来提供对两种含义或对任一含义的明确支持。
如本文中所用，除非指出相反，否则术语约是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％，更优选+/-1％，更优选+/-0.5％。
在整个本说明书中，单词“包含”或变型诸如“包括”或“含有”将被理解为暗指包含所述元素、整体或步骤、或元素、整体或步骤的组，但不排除任何其它元素、整体或步骤，或元素、整体或步骤的组。
秆锈病
如本文中所用，“秆锈病”是指由麦秆锈菌引起的植物的疾病或指致病真菌病原体麦秆锈菌，根据上下文确定。如本文中所用，“小麦秆锈病”是指由小麦禾柄锈菌引起的植物的疾病或指致病真菌病原体小麦禾柄锈菌，根据上下文确定。
小麦秆锈病(小麦禾柄锈菌)(在北美命名系统下也称为'TTKSK')的Ug99组小种是公知的小麦的真菌病原体并且通常存在于诸如非洲和中东的国家的麦田中(Singh等，2011；Hodson等，2012)。Ug99可引起主要农作物损失并且对于先前保护小麦免受秆锈病的抗性基因具有毒性。目前存在组Ug99的8个已知变种，所述变种基于DNA标记分析密切相关。差异在于其对于一小组小麦植物(每一种包含不同的抗性R基因)的毒力/无毒力特征的病原体的每一个变种称为病原体的“种”。Ug99组分离株全都密切相关并且据信从共同祖先进化而来，但可能差异在于它们的毒力/无毒力特征，在该情况下它们被认为是不同的小种。这8个变种中的7个概括于Singh等(2011)的表2中。在实施方案中，Ug99组秆锈病小种展示对包含抗性基因Sr31、Sr21、Sr24和Sr36的一个或多个的小麦植物的毒力(Singh等，2011)。在一个实施方案中，小麦禾柄锈菌的Ug99组秆锈病小种具有至少对包含抗性基因Sr31的小麦植物的毒力(Pretorius等，2000)。
多肽/肽
本发明涉及赋予植物例如小麦植物对秆锈病，优选地对小麦秆锈病诸如Ug99组小种的抗性的多肽。在优选实施方案中，多肽由赋予对小麦秆锈病的抗性的Sr33基因的等位基因或变体编码。此类多肽的实例包括，但不限于，包含如在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中提供的氨基酸序列的那些多肽。本发明的多肽赋予当与缺乏编码多肽的基因的同基因植物相比较时增强的对秆锈病，优选地小麦秆锈病诸如小麦禾柄锈菌的Ug99组小种的抗性。该术语还指由赋予植物(例如，小麦)的基因编码的天然产生的蛋白质(或突变蛋白所源自的野生型蛋白质)，当在正常田间条件下生长时，蛋白质增强对秆锈病诸如小麦禾柄锈菌的Ug99组小种的抗性。在优选实施方案中，本发明的多肽赋予特异性针对秆锈病，优选地特异性针对小麦秆锈病的抗性，更优选地，其不赋予对由真菌病原体小麦叶锈菌和/或对白粉病引起的小麦叶锈病的抗性。在上下文中，“特异性针对秆锈病”和“特异性针对小麦秆锈病”意指赋予的抗性相较于相同植物种的另一种真菌病原体，优选地相较于相同种的许多或大多数其它真菌病原体，是优先针对秆锈病或小麦秆锈病的。在更优选实施方案中，本发明的多肽赋予对优选地小麦中的秆锈病和叶锈病、条锈病和白粉病的至少两种或所有三种的抗性。在实施方案中，本发明的多肽不由小麦植物的Sr35基因编码。在实施方案中，本发明的多肽不由小麦植物的Sr35基因或其同源物，诸如与Sr35多肽在氨基酸序列上具有至少50％同一性的那些同源物编码。
在实施方案中，本发明的多肽不结合RAR1、SGT1或HSP90中的一个或多个或全部。在其它实施方案中，本发明的多肽不结合WRKY1/2诸如来自大麦或粗山羊草的WRKY蛋白。在另一个实施方案中，本发明的多肽不形成同源二聚体。
在其它实施方案中，当在利用秆锈病，诸如利用小麦禾柄锈菌的Ug99小种感染的转基因植物中表达时，植物的细胞展示极小的(如果有的话)细胞死亡的征兆(自发荧光)，例如当与表达Sr45的同基因植物相比较时。
本发明的多肽通常包含朝向N末端的卷曲螺旋(CC)，随后核苷酸结合(NB)结构域和朝向C末端的富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域(参见图4)。这3种类型的结构域的每一种在赋予对植物病原体的抗性的多肽中是共同的。另外，含CC-NB-LRR多肽是已知的一大类多肽，其作为种类，赋予跨众多种的不同植物病原体的抗性(参见，例如，Bulgarelli等，2010；McHale等，2006；Takken等，2006；Wang等，2011；Gennaro等，2009和Dilbirligi等，2003)，尽管每一种CC-NB-LRR多肽对于病原体的特定种或亚种是特异的。因此，通过将本发明的多肽与其它CC-NB-LRR多肽比对，结合大量关于这些类型的蛋白质以及CC结构域、NB结构域和LRR结构域的研究，本领域技术人员具有相当量的关于设计本文中提供的特定多肽的功能性变体的指导。
卷曲螺旋结构域或基序是结构基序，其为其中α-螺旋象绳子的链卷曲在一起的蛋白质的最常见三级结构之一。计算机程序已被设计来检测七肽并导致卷曲螺旋结构(参见，例如Delorenzi和Speed,2002)。卷曲螺旋通常包含疏水(h)和带电荷的(c)氨基酸残基的重复模式hxxhcxc，称为七肽重复序列。七肽重复序列中的位置通常被标记以abcdefg，其中a和d是疏水位置，通常被异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸占据。将具有这些七肽的蛋白质折叠成α螺旋二级结构使得疏水性残基被呈递为以左手方式轻轻围绕螺旋卷曲，从而形成两亲性结构的'条纹'。
NB结构域存在于抗性基因以及几种激酶诸如ATP/GTP-结合蛋白中。该结构域通常含有3个基序：激酶-1a(p-环)、激酶-2和假定的激酶-3a中(Traut 1994；Tameling等，2002)。分别地针对抗性基因基序p-环、激酶-2和假定的激酶-3a的GxxGxGK(T/S)T(SEQ IDNO:110)(如SEQ ID NO:1中提供的赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽中的GFGGLGKTT(SEQ IDNO:111))、LxxxDDVW(SEQ ID NO:112)(如SEQ ID NO:1中提供的赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽中的LVIIDDVW(SEQ ID NO:113))和GxxxxxTxR(SEQ ID NO:114)(如SEQ ID NO:1中提供的赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽中的GSRLIITTR(SEQ ID NO:115))的共有序列与存在于其它NB编码蛋白中的那些共有序列不同。存在于NB/LRR型抗性基因的NB结构域中的其它基序为GLPL、RNBS-D和MHD(Meyers等，1999)。散布在这些基序和结构域中的序列可以甚至在抗性基因的同源物之间极不相同(Michelmore和Meyers,1998；Pan等，2000)。
富含亮氨酸的结构域是形成α/β马蹄形折叠的蛋白质结构基序(Enkhbayar等，2004)。LRR结构域含有9-41个不完美的重复序列，各重复序列的长度约为25个氨基酸，具有xxLxLxxxx(SEQ ID NO:16)的共有氨基酸序列(Cooley等，2000)。在实施方案中，本发明的多肽包含约10至约20个，更优选约12至约18个，更优选约15个富含亮氨酸的重复序列。这些重复序列通常折叠在一起以形成螺线管蛋白质结构域。通常地，每一个重复单位具有β链-转角-α螺旋结构，并且由许多此类重复序列组成的组装的结构域具有拥有内部平行β折叠和外部螺旋阵列的马蹄形状。
在其它实施方案中，赋予对麦秆锈菌的抗性的多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号99的位置上具有苯丙氨酸和/或在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号501的位置上具有天冬氨酸。
如本文中所用，“抗性”是相对术语，其中本发明的多肽的存在(i)相对于缺乏R基因的植物减少包含赋予抗性的基因(R基因)的植物的疾病症状，和/或(ii)在包含R基因的植物上减少病原体繁殖或扩散。如本文中所用的抗性是相对于植物对相同病原体的“易感”反应的。通常地，当用病原体感染时R基因的存在，当与用病原体感染的但缺乏R基因的同基因植物比较时，改善包含R基因的植物的至少一个生产性状(诸如粮食产量)。同基因植物可具有一定水平的对病原体的抗性，或可被分类为易感的。因此，术语“抗性”和“增强的抗性”在本文中通常可互换使用。此外，本发明的多肽不一定赋予完全病原体抗性，例如当一些症状仍然发生或在感染时存在一定的病原体繁殖(但以减少的量)时。增强的抗性可通过许多本领域中已知的方法来测定，诸如分析植物的病原体的量和/或分析在病原体存在的情况下植物生长或对植物的损伤或疾病症状的量，并将这些参数的一个或多个与缺乏编码本发明的多肽的外源基因的同基因植物相比较。
提及"基本上纯化的多肽"或"纯化的多肽"，我们意指通常已与在其天然状态下与其结合的脂质、核酸、其它肽和其它污染分子分离的多肽。优选地，基本上纯化的多肽至少90％不含与其天然结合的其它组分。
本发明的转基因植物和宿主细胞可包含编码本发明的多肽的外源多核苷酸。在这些情况下，植物和细胞产生重组多肽。术语"重组的"在多肽的上下文中是指当由细胞产生时由外源多核苷酸编码的多肽，多核苷酸已通过重组DNA或RNA技术诸如例如转化被引入细胞或祖细胞。通常地，该细胞包含引起改变的量的多肽产生的非内源基因。在实施方案中，"重组多肽"是通过外源(重组)多核苷酸在植物细胞中表达产生的多肽。
术语"多肽"和"蛋白质"通常可互换使用。
多肽的百分比同一性通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)，利用空位生成罚分＝5和空位延伸罚分＝0.3来测定。查询序列在长度上为至少150个氨基酸，并且GAP分析在至少150个氨基酸的区域中比对两个序列。更优选地，查询序列在长度上为至少500个氨基酸，并且GAP分析在至少500个氨基酸的区域中比对两个序列。更优选地，查询序列在长度上为至少750个氨基酸，并且GAP分析在至少750个氨基酸的区域中比对两个序列。甚至更优选地，查询序列在长度上为至少900个氨基酸，并且GAP分析在至少900个氨基酸的区域中比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在它们的全长范围内比对两个序列。
如本文中所用，"生物活性"片段是维持全长多肽的所定义的活性的本发明的多肽的部分，所定义的活性是诸如当在植物(诸如小麦)中表达时，当与不表达多肽的同基因植物相比较时，赋予对秆锈病，优选地小麦秆锈病诸如小麦禾柄锈菌的Ug99组小种的(增强的)抗性。生物活性片段可是任何大小，只要它们维持所定义的活性但优选长度为至少750个或至少900个氨基酸残基。优选地，生物活性片段维持至少10％、至少50％、至少75％或至少90％的全长蛋白质的活性。
关于所定义的多肽，应当理解，高于上文中提供的那些百分比同一性数字的百分比同一性数字将包括优选实施方案。因此，适用时，根据最小百分比同一性数字，优选地，多肽包含与相关指定的SEQ ID NO具有至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％和甚至更优选至少99.9％同一性的氨基酸序列。
本发明的多肽的氨基酸序列突变体可通过将适当的核苷酸变化引入本发明的核酸，或通过所需多肽的体外合成来制备。此类突变体包括，例如，氨基酸序列内的残基的缺失、插入或取代。可产生缺失、插入和取代的组合以获得最终构建体，只要最终的肽产物具有所需特征。优选的氨基酸序列突变体相对于参照野生型多肽仅具有1、2、3、4或少于10个氨基酸变化。
突变(改变的)多肽可使用本领域已知的任何技术，例如使用定向进化或合理设计策略(参见下文)来制备。可使用本文中描述的确定它们是否赋予对麦秆锈菌(例如，小麦禾柄锈菌的Ug99组小种)的抗性的技术来容易地筛选从突变的/改变的DNA衍生的产物，诸如通过产生表达突变的/改变的DNA的转基因植物并测定植物在病原体存在的情况下产生谷粒的能力。
在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的特征。可单个地或系列地修饰用于突变的位点，例如通过(1)首先用保守氨基酸选择进行取代，随后取决于实现的结果用更加激进的选择进行取代，(2)删除目标残基，或(3)将其它残基插入在所定位的位点附近。
氨基酸序列缺失通常在约1至15个残基，更优选约1至10个残基和通常地约1至5个连续残基的范围内。
取代突变体使多肽分子中至少一个氨基酸残基被除去并且在其位置插入不同的残基。为了维持活性，目标位点包括不存在于活性部位诸如CC、BD或LRR结构域中的那些位点，以及在不同种之间不是高度保守的那些位点。这些位点，尤其是落在至少3个其它非保守位点的序列内的那些位点通常可以以相对保守或非保守方式取代。保守取代的实例在“示例性取代”的标题下示于表1中。
表1.示例性取代
Figure BDA0000895398780000201
Figure BDA0000895398780000211
在优选实施方案中，当与天然存在的多肽比较时，突变/变体多肽具有1或2或3或4个保守氨基酸变化。保守氨基酸变化的详细内容提供于表1中。在优选实施方案中，所述变化不存在于在随其一起提供的不同多肽之间是高度保守的一个或多个基序中。如本领域技术人员将意识到的，可合理地预测，当在重组细胞中表达时，此类小的变化不改变多肽的活性。
在实施方案中，本发明的蛋白质是CC-NB-LRR植物病原体抗性基因，其包含如图4中显示构造的结构域。
本发明的多肽的一级氨基酸序列可用于基于与包含NB和LRR结构域，更优选地CC、NB和LRR结构域的密切相关的抗性多肽的比较设计其变体/突变体。如本领域技术人员将理解的，在密切相关的CC-NB-LRR蛋白间高度保守的残基不太可能能够被改变(尤其是通过非保守取代)，并且维持的活性高于不太保守的残基(参见上文)。
还包括在本发明的范围内的是在合成期间或之后被差异修饰(例如，通过生物素化、苄化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生、蛋白水解裂解、至抗体分子或其它细胞配体的键联等)的本发明的多肽。多肽可以例如通过磷酸化在细胞中被翻译后修饰，修饰可调节其活性。这些修饰可用于增加本发明的多肽的稳定性和/或生物活性。
定向进化
在定向进化中，将随机诱变应用于蛋白质，并且将选择方案用于挑出具有期望的质量例如增加的活性的变体。随后应用其它轮的突变和选择。典型的定向进化策略包括3个步骤：
1)多样化：随机突变和/或重组编码目标蛋白的基因以产生大的基因变体文库。可通过易错PCR(参见，例如，Leung,1989；Cadwell和Joyce,1992)从由亲本模板制备的DNA酶I消化的片段池(Stemmer,1994a；Stemmer,1994b；Crameri等，1998；Coco等，2001)，从简并寡核苷酸(Ness等，2002,Coco,2002)或从两者的混合物，或甚至从未消化的亲本模板(Zhao等，1998；Eggert等，2005；Jézéquek等，2008)构建变体基因文库，并通常通过PCR组装文库。还可通过同源或非同源重组(Ostermeier等，1999；Volkov等，1999；Sieber等，2001)从体内或体外重组的亲本序列产生文库。还可通过将目标基因亚克隆进合适的载体，将载体转化入"增变基因"株诸如大肠杆菌(E.coli)XL-1red(Stratagene)并将转化的细菌增殖适当的代数来构建变体基因文库。还可通过如由Harayama(1998)广泛描述的将目标基因经历DNA改组(即，通过随机片段化和重组装进行的选择的突变基因库的体外同源重组)来构建变体基因文库。
2)选择：使用筛选或选择测试文库的具有所需性质的突变体(变体)的存在。筛选使得能够人工鉴定和分离高性能突变体，然而选择自动地消除所有非功能性突变体。筛选可包括筛选已知的保守氨基酸基序的存在。可选择地或另外地，筛选可包括在宿主生物体或其部分中表达突变的多核苷酸和测定活性的水平。
3)扩增：可复制在选择或筛选中鉴定的变体许多倍，从而使得研究者能够对它们的DNA进行测序，以理解什么突变已发生。
总之，这3个步骤称为一"轮"定向进化。大多数实验将必需进行不止一轮。在这些实验中，先前轮的"赢者"在下一轮中被多样化以产生新的文库。在实验结束时，使用生物化学方法来表征所有进化的蛋白质或多核苷酸突变体。
合理设计
可基于关于蛋白质结构和折叠的已知信息合理地设计蛋白质。这可通过从头设计(从新设计)或通过基于天然支架的重新设计来实现(参见，例如，Hellinga,1997；以及Lu和Berry,Protein Structure Design and Engineering,Handbook of Proteins 2,1153-1157(2007))。蛋白质设计通常包括鉴定折叠成给定的结构或靶结构的序列并且可使用计算机模型来实现。计算机蛋白质设计算法搜索当折叠成靶结构时处于低能量状态的序列的序列-构象空间。计算机蛋白质设计算法使用蛋白质能量学的模型来评估突变是如何影响蛋白质的结构和功能的。这些能量函数通常包括分子机制、统计学(即基于知识的)和其它经验术语的组合。合适的可获得的软件包括IPRO(迭代的蛋白质重新设计和优化)、EGAD(蛋白质设计的遗传算法)、Rosetta设计、Sharpen和Abalone。
多核苷酸和基因
本发明提及各种多核苷酸。如本文中所用，"多核苷酸"或"核酸"或"核酸分子"意指核苷酸的聚合物，其可以是DNA或RNA或其组合，并且包括基因组DNA、mRNA、cRNA和cDNA。不太优选的多核苷酸包括tRNA、siRNA、shRNA和hpRNA。其可以是细胞、基因组或合成来源(例如在自动合成仪上产生的)的DNA或RNA，并且可将其与糖类、脂质、蛋白质或其它材料组合，用荧光或其它基团标记，或附接于固体载体以进行本文中定义的特定活性，或包含未在自然界中发现的对于本领域技术人员来说是公知的一个或多个经修饰的核苷酸。聚合物可以是单链的、基本上双链的或部分双链的。如本文中所用的碱基配对是指核苷酸之间的碱基配对，包括G:U碱基对。"互补"意指两个多核苷酸能够沿着它们的长度的部分，或沿着一者或两者的全长碱基配对(杂交)。"杂交的多核苷酸"意指多核苷酸实际上与其互补序列碱基配对。术语"多核苷酸"在本文中可与术语“核酸”互换使用。本发明的优选多核苷酸编码本发明的多肽。
提及"分离的多核苷酸"，我们意指通常已与在其天然状态下与其结合或连接的多核苷酸序列分离的多核苷酸，如果多核苷酸在自然界中被发现的话。优选地，分离的多核苷酸至少90％不含与其天然结合的其它组分，如果其在自然界中被发现的话。优选地，多核苷酸是非天然存在的，例如通过以未在自然界中发现的方式共价连接两个较短的多核苷酸序列(嵌合多核苷酸)产生的。
本发明包括基因活性和结构的修饰以及嵌合基因的使用。如本文中所用，术语"基因"包括任何脱氧核糖核苷酸序列(其包括蛋白质编码区或其在细胞中被转录但不被翻译)以及连接的非编码和调控区。此类连接的区域通常位于编码区或转录区的5’和3’末端附近，距离任一端约2kb。在这一点上，基因可包括与给定的基因天然连接的控制信号诸如启动子、增强子、终止和/或多聚腺苷酸化信号，或异源控制信号(在该情况下基因被称为"嵌合基因")。位于编码区的5’和存在于mRNA上的序列被称为5’非翻译序列。位于编码区的3’或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3’非翻译序列。术语"基因"包括基因的cDNA和基因组形式。
如本文中所用，"Sr33基因"是指与本文中所述的分离的Sr33基因(SEQ ID NO:5)或Sr33cDNA(SEQ ID NO:3)同源的核苷酸序列。如本文中所述，Sr33基因家族的一些等位基因和变体编码赋予对秆锈病(例如由小麦禾柄锈菌的Ug99组小种引起的)的抗性的蛋白质。Sr33基因包括存在于谷类诸如小麦中的天然存在的等位基因或变体。在本文中显示为SEQID NO:3(cDNA)或SEQ ID NO:5(基因组序列)，编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质的具有核苷酸序列的核酸分子是赋予对秆锈病的抗性的Sr33基因的实例。
含有转录区域的基因的基因组形式或克隆可被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列打断，所述内含子或间插序列相对于基因的“外显子”可以是同源的或异源的。如本文中所用，"内含子"是转录为初级RNA转录物的部分但不存在于成熟mRNA分子中的基因区段。内含子从核或初级转录物除去或"剪接掉"；内含子从而不存在于信使RNA(mRNA)中。内含子可含有调控元件诸如增强子。如本文中所用，"外显子"是指对应于存在于成熟mRNA或在其中RNA分子未被翻译的情况下成熟RNA分子中的RNA序列的DNA区域。mRNA在翻译过程中用于指定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。术语"基因"包括编码本文中描述的本发明的蛋白质的全部或部分的合成或融合分子和针对上述序列的任一个的互补核苷酸序列。可将基因引入适合的载体以用于在细胞中染色体外维持，或优选地，用于整合进宿主基因组中。
如本文中所用，"嵌合基因"是指包含未被发现天然联接的共价联接的序列的任何基因。通常地，嵌合基因包含未被发现天然地在一起的调控序列和转录的序列或蛋白质编码序列。因此，嵌合基因可包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或来源于相同来源但以与天然发现的方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。术语"内源的"在本文中用于指通常存在于处于与正在研究的植物相同的发育阶段的未经修饰的植物中或在其中产生的物质。"内源基因"是指存在于其在生物体的基因组的天然位置中的天然基因。如本文中所用，"重组核酸分子"、"重组多核苷酸"或其变体是指已通过重组DNA技术构建或修饰的核酸分子。术语"外来多核苷酸"或"外源多核苷酸"或"异源多核苷酸"等是指通过实验操作将其引入细胞的基因组的任何核酸。
外来或外源基因可以是被插入非天然生物体的基因、被引入天然宿主内的新位置的天然基因或嵌合基因。"转基因"是已通过转化程序将其引入基因组的基因。术语"遗传修饰的"包括通过转化或转导将基因引入细胞，使细胞中的基因突变和改变或调节已对其进行这些作用的细胞或生物体或它们的后代中的基因调控。
此外，术语"外源的"在多核苷酸(核酸)的上下文中是指当存在于未天然包含多核苷酸的细胞中时的多核苷酸。细胞可以是包含导致改变的编码的多肽的产生量的非内源多核苷酸，例如增加内源多肽的表达的外源多核苷酸的细胞，或在其天然状态不产生多肽的细胞。本发明的多肽的增加的产生在本文中也称为“过表达”。本发明的外源多核苷酸包括还未与其存在于其中的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统的其它组分分离的多核苷酸，和在此类细胞或无细胞系统中产生的，随后从至少一些其它组分纯化出来的多核苷酸。外源多核苷酸(核酸)可以是天然存在的核苷酸的连续区段，或包含被联接以形成单个多核苷酸的两个或更多个来自不同来源的连续核苷酸区段(天然存在的和/或合成的)。通常地，此类嵌合多核苷酸包含至少可操作地连接于适合在目标细胞中驱动开放阅读框转录的启动子的编码本发明的多肽的开放阅读框。
在实施方案中，如果存在于小麦植物或其部分(诸如小麦谷粒)或细胞中，则多核苷酸不存在于基因组的染色体1D和/或染色体7D上。
多核苷酸的百分比同一性通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)，利用空位生成罚分＝5和空位延伸罚分＝0.3来测定。查询序列在长度上为至少450个核苷酸，并且GAP分析在至少450个核苷酸的区域中比对两个序列。优选地，查询序列在长度上为至少1,500个核苷酸，并且GAP分析在至少1,500个核苷酸的区域中比对两个序列。甚至更优选地，查询序列在长度上为至少2,700个核苷酸，并且GAP分析在至少2,700个核苷酸的区域中比对两个序列。甚至更优选，GAP分析在它们的完整长度范围内比对两个序列。
关于所定义的多核苷酸，应理解，高于上文中提供的百分比同一性数字的百分比同一性数字将包括优选实施方案。因此，适当时，根据最小百分比同一性数字，优选地，多核苷酸包含与相关指定的SEQ ID NO具有至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，和甚至更优选至少99.9％同一性的多核苷酸序列。
在其它实施方案中，本发明涉及与本文中特别描述的那些多核苷酸基本上同一的多核苷酸。如本文中所用，关于多核苷酸，术语"基本上同一的"意指一个或少数(例如2、3或4个)核苷酸的取代，同时维持由多核苷酸编码的天然蛋白质的至少一种活性。另外，该术语包括核苷酸的添加或缺失，添加或缺失导致编码的天然蛋白质的大小增加或减少一个或几个(例如2、3或4个)氨基酸，同时维持由多核苷酸编码的天然蛋白质的至少一种活性。
本发明还涉及寡核苷酸例如用于筛选本发明的多核苷酸或编码本发明的多肽的方法的用途。如本文中所用，"寡核苷酸"是在长度上达到50个核苷酸的多核苷酸。此类寡核苷酸的最小大小是寡核苷酸与本发明的核酸分子上的互补序列之间的稳定杂交的形成所需的大小。它们可以是RNA、DNA或任一种的组合或衍生物。寡核苷酸通常是长度为10至30个核苷酸，通常15-25个核苷酸的相对短的单链分子。当在扩增反应中用作探针或引物时，此类寡核苷酸的最小大小为寡核苷酸与靶核酸分子上的互补序列之间的稳定杂交的形成所需的大小。优选地，寡核苷酸在长度上为至少15个核苷酸，更优选至少18个核苷酸，更优选至少19个核苷酸，更优选至少20个核苷酸，甚至更优选至少25个核苷酸。通常用标记诸如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子缀合用作探针的本发明的寡核苷酸。
本发明包括可用作，例如鉴定核酸分子的探针，或产生核酸分子的引物的寡核苷酸。探针和/或引物可用于从其它物种克隆本发明的多核苷酸的同源物。此外，本领域中已知的杂交技术还可用于筛选基因组或cDNA文库的此类同源物。
本发明的多核苷酸和寡核苷酸包括在严格条件下与如SEQ ID NO:3至5或12提供的序列的一个或多个杂交的那些多核苷酸和寡核苷酸。如本文中所用，严格条件是如下那些条件：(1)使用低离子强度和高温进行洗涤，例如，0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO4，于50℃；(2)在杂交过程中使用变性剂诸如甲酰胺，例如，50％(体积/体积)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、pH 6.5的50mM磷酸纳缓冲液和750mM NaCl、75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于42℃于0.2×SSC和0.1％SDS中。
当与天然存在的分子相比较时，本发明的多核苷酸可具有为核苷酸残基的缺失、插入或取代的一个或多个突变。突变体可以是天然存在的(即，从天然来源分离的)或合成的(例如，通过对核酸进行定点诱变)。本发明的多核苷酸或寡核苷酸的变体包括具有不同大小的与本文中定义的参照多核苷酸或寡核苷酸分子的序列接近的小麦基因组和/或能够与所述基因组杂交的分子。例如，变体可包含另外的核苷酸(诸如1、2、3、4或更多个)或较少的核苷酸，只要它们仍然与靶区域杂交。此外，可取代少数核苷酸而不影响寡核苷酸与靶区域杂交的能力。另外，可容易地设计变体，所述变体在例如50个核苷酸内与其中本文中定义的特异性寡核苷酸所杂交的植物基因组的区域紧密杂交。具体地，这包括编码相同多肽或氨基酸序列但在核苷酸序列上变化在于遗传密码的冗余性的多核苷酸。术语"多核苷酸变体"和"变体"还包括天然存在的等位基因变体。
核酸构建体
本发明包括包含本发明的多核苷酸的核酸构建体、包含这些构建体的载体和宿主细胞、它们的产生和使用方法及其用途。本发明是指可被操作地联接或连接的元件。"可操作地联接的"或"可操作地连接的"等是指具有功能关系的多核苷酸元件的键联。通常地，可操作地联接的核酸序列是连续地连接的，并且当必需联接两个蛋白质编码区时，是连续的并且在阅读框内。当RNA聚合酶将使两个编码序列转录成单个RNA(RNA如果被翻译则随后被翻译成具有来源于两个编码序列的氨基酸的单个多肽)时，编码序列被"可操作地联接于"另一个编码序列。编码序列不一定彼此是连续的，只要表达的序列最终被加工成产生所需蛋白质。
如本文中所用，术语"顺式作用序列"、"顺式作用元件"或"顺式调控区"或"调控区"或类似术语应当被采用来意指任何核苷酸序列，所述序列，当相对于可表达的基因序列被适当地放置和联接时，能够至少部分调控基因序列的表达。本领域技术人员将意识到，顺式调控区可以能够在转录或转录后水平上激活、沉默、增强、抑制或另外地改变基因序列的表达的水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明的优选实施方案中，顺式作用序列是增强或刺激可表达的基因序列的表达的激活物序列。
将启动子或增强子元件"可操作地连接"至可转录的多核苷酸意指将可转录的多核苷酸(例如，蛋白质编码多核苷酸或其它转录物)置于启动子的调节控制下，启动子则控制该多核苷酸的转录。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选地以与该启动子与其在其天然背景(即，启动子所源自的基因)中控制的蛋白质编码区之间的距离大致相同的离可转录的多核苷酸的转录起始位点的距离，放置启动子或其变体。如在本领域中已知的，该距离的一些变化可被容纳而不丧失功能。类似地，调控序列元件(例如，操纵子、增强子等)相对于待置于其控制之下的可转录的多核苷酸的优选定位通过元件在其天然背景(即其所源自的基因)中的定位来确定。
如本文中所用，"启动子"或"启动子序列"是指在目标细胞中控制转录的起始和水平的基因的区域，通常地存在于RNA编码区的上游(5')。"启动子"包括经典的基因组基因的转录调控序列，诸如TATA盒和CCAAT盒序列，以及响应发育和/或环境刺激，或以组织特异性或细胞类型特异性方式改变基因表达的另外的调控元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)。启动子通常但不一定(例如，一些PolIII启动子)位于其表达受其调控的结构基因的上游。此外，包含启动子的调控元件通常位于基因的转录起始位点的2kb之内。启动子可含有位于离起始位点更远的另外的特异性调控元件，以进一步在细胞中增强表达，和/或改变与其可操作地联接的结构基因的表达的时间选择或可诱导性。
"组成型启动子"是指在生物体诸如植物的许多或所有组织中指导可操作连接的转录的序列的表达的启动子。如本文中所用，术语组成型不一定表示基因以相同的水平在所有细胞类型中表达，而是表示基因在宽范围的细胞类型中表达，尽管水平上的一些变化通常是可检测的。如本文中所用，"选择性表达"是指几乎只在例如植物的特定器官，诸如例如，胚乳、胚胎、叶、果实、块茎或根中的表达。在优选实施方案中，启动子在植物优选地谷类植物的叶和/或茎中选择性或优先表达。选择性表达从而可与组成型表达形成对比，组成型表达是指在大多数或所有由植物经历的条件下在植物的许多或所有组织中的表达。
选择性表达还可在特定植物组织、器官或发育阶段中导致基因表达产物的区室化。特定亚细胞位置诸如质体、细胞溶胶、液泡或质外体空间中的区室化可通过在基因产物的结构中包含适当的信号例如信号肽(以转运至所需细胞区室)，或在半自主性细胞器(质体和线粒体)的情况下通过将具有适当的调控序列的转基因直接整合进细胞器基因组来实现。
"组织特异性启动子"或"器官特异性启动子"是相对于例如植物中的许多其它组织或器官(优选地大多数其它组织或器官，如果不是所有其它组织或器官的话)在一种组织或器官中优先表达的启动子。通常地，启动子在特定组织或器官中相较于在其它组织或器官中以10倍高的水平表达。
在实施方案中，启动子是茎特异性启动子或在植物的地上部分指导基因表达的启动子(绿色组织特异性启动子)诸如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(RUBISCO)启动子。
茎特异性启动子的实例包括，但不限于US 5,625,136和Bam等(2008)中描述的那些启动子。
本发明涵盖的启动子对于待转化的宿主植物可以是天然的或可来源于替代来源，其中该区域在宿主植物中是有功能的。其它来源包括土壤杆菌属(Agrobacterium)T-DNA基因，诸如用于胭脂碱、章鱼碱、甘露碱的生物合成的基因的启动子、或其它冠瘿碱(opine)启动子、组织特异性启动子(参见，例如，US 5,459,252和WO 91/13992)；来自病毒的启动子(包括宿主特异性病毒)，或部分或完全合成的启动子。在单子叶和双子叶植物中具有功能的许多启动子在本领域中是公知的(参见，例如，Greve,1983；Salomon等，1984；Garfinkel等，1983；Barker等，1983)；包括从植物和病毒分离的各种启动子，诸如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S,19S)。用于评估启动子活性的非限制性方法由Medberry等(1992,1993),Sambrook等(1989，同上)和US5,164,316公开。
可选择地或另外地，启动子可以是诱导型启动子或能够在例如植物的适当发育阶段驱动引入的多核苷酸的表达的发育调控型启动子。可使用的其它顺式作用序列包括转录和/或翻译增强子。增强子区域对于本领域技术人员来说是公知的，并且可包括ATG翻译起始密码子和相邻的序列。当被包含时，起始密码子应当与与外来或外源多核苷酸相关的编码序列的阅读框同相，以确保完整序列的翻译(如果其将被翻译的话)。可从转录起始区的来源或从外来或外源多核苷酸提供翻译起始区。序列还可来源于被选择来驱动转录的启动子的来源，并且可被特异性修饰以增加mRNA的翻译。
本发明的核酸构建体可包含约50至1,000个核苷酸碱基对的3'非翻译序列，其可包括转录终止序列。3'非翻译序列可含有可包括或可以不包括多聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工的任何其它调控信号的转录终止信号。多聚腺苷酸化信号用于将多聚腺苷酸片段添加至mRNA前体的3'末端。多聚腺苷酸化信号通常因与规范形式5'AATAAA-3'的同源性(尽管变化并不罕见)的存在而被识别。不包括多聚腺苷酸化信号的转录终止序列包括PolI或PolIII RNA聚合酶的终止子，终止子包含一连串4个或更多个胸苷。合适的3'非翻译序列的实例为来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱合酶(ocs)基因或胭脂碱合酶(nos)基因的含有多腺苷酸化信号的3'转录的非翻译区(Bevan等，1983)。合适的3'非翻译序列还可来源于植物基因诸如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因，尽管也可使用本领域技术人员已知的其它3'元件。
由于转录起始位点与编码序列的起始之间插入的DNA序列，即非翻译5’前导序列(5’UTR)，可影响基因表达(如果其被翻译以及转录的话)，因此还可使用特定的前导序列。合适的前导序列包括包含被选择来指导外来或外源DNA序列的最优表达的序列的那些序列。例如，此类前导序列包括可增加或维持mRNA稳定性并且阻止翻译的不恰当起始(如例如由Joshi(1987)描述的)的优选共有序列。
载体
本发明包括载体用于基因构建体的操作或转移的用途。"嵌合载体"意指可将核酸序列插入其中或在其中克隆的核酸分子，优选地来源于例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子。载体优选地是双链DNA并且含有一个或多个独特的限制性位点，并且可以能够在确定的宿主细胞包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织中自主复制，或能够整合进确定的宿主的基因组以便克隆的序列是可复制的。因此，载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，线性或闭合的环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可含有用于确保自我复制的任何方法。或者，载体可以是当被引入细胞时，被整合进受体细胞的基因组中并且与已将其整合进其中的染色体一起复制的载体。载体系统可包含单个载体或质粒、两个或更多个载体或质粒，载体或质粒一起含有待引入宿主细胞的基因组或转座子中的总DNA。载体的选择将通常取决于载体与待向其中引入载体的细胞的相容性。载体还可包括选择标记诸如抗生素抗性基因、除草剂抗性基因或可用于选择合适的转化体的其它基因。此类基因的实例对于本领域技术人员来说是公知的。
可将本发明的核酸构建体引入载体诸如质粒。质粒载体通常包括提供表达盒在原核和真核细胞中的容易的选择、扩增和转化的另外的核酸序列，例如，pUC-衍生的载体、pSK-衍生的载体、pGEM-衍生的载体、pSP-衍生的载体、pBS-衍生的载体或含有一个或多个T-DNA区的二元载体。另外的核酸序列包括提供载体的自主复制的复制起点、选择标记基因(优选地编码抗生素或除草剂抗性)、独特的多克隆位点(提供多个位点来插入核酸构建体中编码的核酸序列或基因)以及增强原核和真核(尤其是植物)细胞的转化的序列。
"标记基因"意指赋予表达标记基因的细胞独特表型，从而允许此类转化的细胞区别于不具有标记的细胞的基因。选择标记基因赋予可基于对选择剂(例如，除草剂、抗生素、辐射、热或损害未转化的细胞的其它处理)的抗性“选择”其的性状。可筛选标记基因(或报告基因)赋予可通过观察或测试，即通过"筛选"(例如，β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、GFP或不存在于未转化的细胞中的其它酶活性)鉴定的性状。无需连接标记基因与目标核苷酸序列。
为了促进转化体的鉴定，核酸构建体期望地包含可选择或可筛选的标记基因作为外来或外源多核苷酸，或除了外来或外源多核苷酸以外，还可包含可选择或可筛选的标记基因。标记的实际选择不是至关重要的，只要其与选择的植物细胞的组合是有功能的(即，选择性的)。标记基因和外来或外源目标多核苷酸不必被连接起来，因为未连接的基因的共转化(如，例如，US 4,399,216中描述的)在植物转化中也是高效的过程。
细菌选择标记的实例是赋予抗生素抗性诸如氨苄青霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性，优选地卡那霉素抗性的标记。用于植物转化体的选择的示例性选择标记包括，但不限于，编码潮霉素B抗性的hyg基因；赋予对卡那霉素、巴龙霉素、G418的抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因；来自大鼠肝的赋予对谷胱甘肽衍生的除草剂如，例如EP 256223中描述的除草剂的抗性的谷胱甘肽-S-转移酶基因；在过表达后赋予对谷氨酰胺合成酶抑制剂诸如草丁膦的抗性的谷氨酰胺合成酶基因(如，例如，WO 87/05327中描述的)、赋予对选择剂草丁膦的抗性的来自产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰转移酶基因(如，例如，EP 275957中描述的)、赋予对草甘膦的耐受性的编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因(如，例如，由Hinchee等(1988)描述的)、赋予对双丙氨膦的抗性的bar基因(如，例如，WO91/02071中描述的)；赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶基因诸如来自臭鼻克雷白杆菌(Klebsiella ozaenae)的bxn(Stalker等，1988)；赋予对甲氨蝶呤的抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet等，1988)；赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS抑制性化学物质的抗性的突变型乙酰乳酸合酶基因(ALS)(EP 154,204)；赋予对5-甲基色氨酸的抗性的突变的邻氨基苯甲酸合酶基因；或赋予对除草剂的抗性的茅草枯脱卤素酶基因。
优选的可筛选的标记包括，但不限于，编码针对其的各种生色底物是已知的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的uidA基因、编码针对其的生色底物是已知的酶的β半乳糖苷酶基因、可用于钙敏感性生物发光检测的水母发光蛋白基因(Prasher等，1985)；绿色荧光蛋白基因(Niedz等，1995)或其衍生物；允许生物发光检测的荧光素酶(luc)基因(Ow等，1986)以及本领域中已知的其它基因。如本说明书中所用，“报告分子”意指根据其化学性质，提供有利于通过参照蛋白质产物测定启动子活性的可分析鉴定的信号的分子。
优选地，将核酸构建体稳定地整合进例如植物的基因组中。因此，核酸包含允许分子被整合进基因组中的适当元件，或将构建体置于可被整合进植物细胞的染色体中的适当载体中。
本发明的一个实施方案包括重组载体，其包括至少一个插入能够将核酸分子递送入宿主细胞的任何载体的本发明的多核苷酸分子。此类载体含有异源核酸序列，其为未被天然地发现与本发明的核酸分子相邻并且优选地来源于除核酸分子所源自的物种外的物种的核酸序列。载体可以是RNA或DNA、原核或真核的，并且通常为病毒或质粒。
已在例如Pouwels等，Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,增刊1987；Weissbach和Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989；和Gelvin等，Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990中描述了适合用于植物细胞的稳定转染或用于转基因植物的建立的许多载体。通常地，植物表达载体包括，例如，处于5’和3’调控序列的转录控制下的一个或多个克隆的植物基因以及显性选择标记。此类植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，控制诱导型或组成型表达、环境或发育调节的表达或细胞或组织特异性表达的调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
本发明的蛋白质的水平可通过升高植物细胞中的编码蛋白质的核苷酸序列的表达水平或降低植物中的编码蛋白质的基因的表达水平，从而导致改进的病原体抗性来调节。基因的表达水平可通过改变每细胞的拷贝数，例如通过引入包含编码序列和与其可操作地联接的并且在细胞中具有功能的转录控制元件的合成基因构建体来调节。可选择多个转化体，并筛选具有因转基因整合位点附近的内源序列的影响而产生的转基因表达的有利水平和/或特异性的转化体。转基因表达的有利水平和模式是导致病原体抗性或其它表型的显著改进的水平和模式。或者，可筛选诱变种子的群体或来自育种程序的植物的群体的具有改变的病原体抗性或与病原体抗性相关的其它表型的个别品系。
重组细胞
本发明的另一个实施方案包括包含利用本发明的一种或多种重组分子转化的宿主细胞的重组细胞或其后代细胞。可通过可籍以将核酸分子插入细胞的任何方法来实现核酸分子至细胞内的转化。转化技术包括，但不限于，转染、电穿孔、显微注射、脂转染、吸收和原生质体融合。重组细胞可保持单细胞或可生长成组织、器官或多细胞生物体。本发明的转化的核酸分子可保持在染色体外或可以以使它们被表达的能力得以保持的这类方式整合进转化(即，重组)的细胞的染色体内的一个或多个位点。优选的宿主细胞是植物细胞，更优选谷类植物的细胞，更优选大麦或小麦细胞，和甚至更优选小麦细胞。
转基因植物
如本文中所用，术语"植物"作为名词是指完整植物并且指植物界的任何成员，但当用作形容词时，是指存在于植物中的、获自植物的、来源于植物的或与植物相关的任何物质，诸如例如，植物器官(例如，叶、茎、根、花)、单细胞(例如花粉)、种子、植物细胞等。小植株和根及芽已从其出现的萌发的种子也包括在“植物”的含义之内。如本文中所用，术语“植物部分”是指获自植物并且包含植物的基因组DNA的一个或多个植物组织或器官。植物部分包括营养结构(例如，叶、茎)、根、花器官/结构、种子(包括胚、子叶和种皮)、植物组织(例如，维管组织、地下组织等)、细胞及其后代。如本文中所用，术语“植物细胞”是指获自植物或存在于植物中的细胞，并且包括原生质体或来源于植物的其它细胞、配子生成细胞、和再生成完整植物的细胞。植物细胞可以是培养中的细胞。“植物组织”是指植物中的或获自植物的分化的组织(“外植体”)或来源于未成熟或成熟胚的未分化组织、种子、根、芽、果实、块茎、花粉、肿瘤组织，诸如冠瘿和培养中的植物细胞的聚集体的各种形式，诸如愈伤组织。种子中的或来自种子的示例性植物组织是子叶、胚和胚轴。因此，本发明包括植物和植物部分和包含这些植物或部分的产品。
如本文中所用，术语“种子”是指植物的“成熟种子”，其已准备用于收割或已从植物收获，诸如通常在田间被商业收获，或为在受精后并在种子修眠建立前和收获前在植物中产生的“发育中的种子”。
如本文中所用，“转基因植物”是指含有未在相同物种、变种或栽培种的野生型植物中发现的核酸构建体的植物。即，转基因植物(转化的植物)含有在转化之前它们不含有的遗传物质(转基因)。转基因可包括获自或来源于植物细胞或另一种植物细胞或非植物来源的基因序列或合成序列。通常地，已通过人工操作诸如例如，通过转化(但可使用本领域技术人员公认的任何方法)将转基因引入植物。遗传物质优选地被稳定整合进植物的基因组中。引入的遗传物质可包含天然存在于相同物种中但以重排的顺序或以不同的元件排列的序列(例如反义序列)。含有此类序列的植物包括在本文中的“转基因植物”中。
“非转基因植物”是未通过重组DNA技术引入遗传物质进行遗传修饰的植物。在优选实施方案中，转基因植物对于每个和每一个已被引入的基因(转基因)是纯合的，以便它们的后代的所需表型不分离。
如本文中所用，术语“相较于同基因植物”或类似的短语，是指相对于转基因植物是同基因的但无目标转基因的植物。优选地，对应的非转基因植物为与目标转基因植物的祖先相同的栽培种或变种，或缺乏构建体的姊妹植物品系，通常称为“分离子”，或利用“空载体”构建体转化的相同栽培种或变种的植物，并且可以是非转基因植物。如本文中所用，“野生型”是指还未曾按照本发明进行修饰的细胞、组织或植物。野生型细胞、组织或植物可被用作对照来与如本文所述修饰的细胞、组织或植物比较外源核酸的表达水平或性状修饰的程度和性质。
转基因植物，如在本发明的上下文中定义的，包括已使用重组技术进行遗传修饰的植物的后代，其中后代包含目标转基因。此类后代可以通过原代转基因植物的自体受精或通过将此类植物与相同物种的另一植物杂交来获得。这通常将调节至少一种本文中定义的蛋白质在所需植物或植物器官中的产生。转基因植物部分包括所述包含转基因的植物的所有部分和细胞，诸如例如，培养组织、愈伤组织和原生质体。
预期用于本发明的实践的植物包括单子叶植物和双子叶植物。目标植物包括但不限于以下植物：谷类(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦、稻、玉米、高粱和相关作物)；甜菜(糖用甜菜和饲用甜菜)；梨果、核果和软果(苹果、梨、李子、桃子、杏仁、樱桃、草莓、树莓和黑莓)；豆科植物(菜豆、小扁豆、豌豆、大豆)；油料植物(油菜或其它芸苔属、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、红花、亚麻、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)；黄瓜属植物(西葫芦、黄瓜、甜瓜)；纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)；柑橘类水果(橘子、柠檬、葡萄柚、柑橘)；蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、西红柿、土豆、辣椒)；樟科(鳄梨、肉桂、樟脑)；或植物诸如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶叶、葡萄、蛇麻草、草、香蕉和天然橡胶植物以及观赏植物(花卉、灌木、阔叶树和常青树、诸如针叶树)。优选地，植物是谷类植物，更优选小麦、稻、玉米、小黑麦、燕麦或大麦，甚至更优选小麦。
如本文中所用，术语“小麦”是指小麦属(Triticum)的任何种，包括其祖先，以及通过与其它物种杂交产生的后代。小麦包括具有AABBDD的基因组组构，由42条染色体组成的“六倍体小麦”，和具有AABB的基因组组构，由28条染色体组成的“四倍体小麦”。六倍体小麦包括普通小麦(T.aestivum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、莫迦小麦(T.macha)、密穗小麦(T.compactum)、圆粒小麦(T.sphaerococcum)、瓦维洛失小麦(T.vavilovii)及其种间杂交品种。六倍体小麦的优选种是普通小麦小麦亚种(T.aestivum ssp aestivum)(也称为"面包小麦")。四倍体小麦包括硬粒小麦(T.durum)(在本文中也称为硬质小麦或栽培二粒小麦(Triticum turgidum ssp.durum))、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、二粒小麦(T.dicoccum)、波兰小麦(T.polonicum)及其种间杂交品种。另外，术语"小麦"包括六倍体或四倍体小麦属的种的潜在祖先诸如(T.uartu)、栽培一粒小麦或野生一粒小麦(T.boeoticum)(对于A基因组)、拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides)(对于B基因组)和节节麦(T.tauschii)(也称为方穗山羊草(Aegilops squarrosa)或粗山羊草(Aegilopstauschii))(对于D基因组)。特别优选的祖先是A基因组的那些祖先，甚至更优选A基因组的祖先为栽培一粒小麦。用于本发明的小麦栽培种可属于，但不限于上文所列的种的任何种。还包括了在与非小麦属的种(诸如黑麦[裸麦(Secale cereale)])(包括但不限于黑小麦)有性杂交中使用小麦属的一个种作为亲本，通过常规技术来产生的植物。
如本文中所用，术语"大麦"是指大麦属(Hordeum)的任何种，包括其祖先，以及通过与其它种杂交产生的其后代。优选地，植物为被商业种植(诸如例如，大麦(Hordeumvulgare)的品系或栽培种或变种)或适合用于谷粒的商业生产的大麦属的种。
如本发明的上下文中定义的转基因植物包括已使用重组技术遗传修饰以使得本发明的至少一种多肽在所需植物或植物器官中产生的植物(以及所述植物的部分和细胞)及其后代。可使用本领域中已知的技术，诸如A.Slater等，Plant Biotechnology-TheGenetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)以及P.Christou和H.Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley和Sons(2004)中一般描述的那些技术来产生转基因植物。
在优选实施方案中，转基因植物对于已被引入的每个和每一个基因(转基因)是纯合的，以便它们的后代的所需表型不分离。转基因植物诸如例如在已从杂交种子生长的F1后代中对于引入的转基因还可以是杂合的。此类植物可提供本领域中公知的有利方面诸如杂种优势。
如本文中所用，"其它遗传标记"还可以是与植物的所需性状连锁的任何分子。此类标记对于本领域技术人员来说是公知的，并且包括与决定性状诸如抗病性、产率、植物形态学、谷粒质量、休眠性状、谷粒颜色、种子中的赤霉酸含量、植物高度、面粉颜色等的基因连锁的分子标记。此类基因的实例是条锈病抗性基因Yr10或Yr17、线虫抗性基因诸如Cre1和Cre3、决定面团强度的麦谷蛋白基因座上的等位基因诸如Ax、Bx、Dx、Ay、By和Dy等位基因、决定半矮秆生长习性和因此抗倒伏性的Rht基因。
已描述了用于基因至细胞的直接递送的4个一般方法：(1)化学方法(Graham等，1973)；(2)物理方法诸如显微注射(Capecchi,1980)；电穿孔(参见，例如，WO 87/06614、US5,472,869、5,384,253、WO 92/09696和WO 93/21335)；和基因枪(参见，例如，US 4,945,050和US 5,141,131)；(3)病毒载体(Clapp,1993；Lu等，1993；Eglitis等，1988)；和(4)报告基因介导的机制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)。
可使用的加速方法包括，例如，微粒轰击法等。用于将转化核酸分子递送至植物细胞的方法的一个实例为微粒轰击。该方法已由Yang等，Particle Bombardment Technologyfor Gene Transfer,Oxford Press,Oxford,England(1994)综述。可用推进力将被核酸涂覆的非生物颗粒(微粒)递送进细胞。示例性颗粒包括由钨、金、铂等组成的那些颗粒。除了其为可重现地转化单子叶植物的有效装置外，微粒轰击的特别有利方面在于既不需要分离原生质体，也不需要土壤杆菌属感染的易感性。适合用于本发明的颗粒递送系统是氦加速PDS-1000/He枪，其可获自Bio-Rad Laboratories。对于轰击，可将未成熟胚或衍生的靶细胞诸如来自未成熟胚的盾片或愈伤组织排列在固体培养基上。
在另一个替代实施方案中，可稳定地转化质体。所公开的用于在高等植物中进行质体转化的方法包括含有选择标记的DNA的基因枪递送和DNA通过同源重组至质体基因组的靶向(US 5,451,513、US 5,545,818、US 5,877,402、US 5,932479和WO 99/05265)。
土壤杆菌属介导的转移是用于将基因引入植物细胞的广泛适用系统，因为DNA可被引入整个植物组织，从而避开了对从原生质体再生完整植物的需要。土壤杆菌介导的植物整合载体以将DNA引入植物细胞的用途在本领域中是公知的(参见，例如，US 5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。此外，T-DNA的整合是相对精确的过程，从而导致少量重排。待转移的DNA的区域由边界序列界定，并且通常将间插DNA插入植物基因组。
土壤杆菌属转化载体能够在大肠杆菌和土壤杆菌属中复制，从而允许如所描述的方便操作(Klee等，Plant DNA Infectious Agents,Hohn和Schell,(编辑),Springer-Verlag,New York,(1985):179-203)。此外，用于土壤杆菌属介导的基因转移的载体中的技术进步已改善了基因和限制性位点在载体中的排列，以有利于能够表达各种多肽编码基因的载体的构建。上述载体具有侧接启动子和多腺苷酸化位点(用于插入的多肽编码基因的直接表达)的方便的多接头区并且适合用于本发明目的。另外，含有装配的和去装配的Ti基因的土壤杆菌属可用于转化。在其中土壤杆菌属介导的转化是高效的那些植物变种中，其由于基因转移的容易性和确定性性质而为选择的方法。
使用土壤杆菌属转化法形成的转基因植物通常在一条染色体上含有单个基因座。此类转基因植物可被称为对于添加的基因是半合子的。更优选的是对于添加的结构基因是纯合的转基因植物，即含有两个添加的基因(一个基因在染色体对的各染色体上的相同基因座上)的转基因植物。纯合的转基因植物可通过有性交配(自交)含有单个添加的基因的独立的分离子转基因植物，使一些产生的种子发芽并分析所得植物的目标基因来获得。
还应理解，可将两个不同的转基因植物交配来产生含有两个独立分离外源基因的后代。适当的后代的自交可产生对于两个外源基因是纯合的植物。还预期对亲本植物回交和与非转基因植物异型杂交，同样地预期了营养繁殖。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可见于Fehr,Breeding Methods for Cultivar Development,J.Wilcox(编辑)American Society of Agronomy,Madison Wis.(1987)。
植物原生质体的转化可使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔以及这些处理的组合的方法来实现。对不同的植物变种应用这些系统取决于从原生质体再生该特定植物品系的能力。描述了用于从原生质体再生谷类的举例说明性方法(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Abdullah等，1986)。
还可使用细胞转化的其它方法，并且方法包括但不限于通过将DNA直接转移进花粉、通过将DNA直接注射进植物的生殖器官、或通过将DNA直接注射进未成熟胚的细胞，随后使干燥的胚再水化来将DNA引入植物。
从单个植物原生质体转化子或从各种转化的外植体再生、发育和栽培植物在本领域中是公知的(Weissbach等，Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,San Diego,(1988))。该再生和生长过程通常包括选择转化的细胞、培养那些个体化的细胞通过胚胎发育的通常阶段，通过生根的小植株期的步骤。类似地再生转基因胚和种子。随后在适当的植物生长介质诸如土壤中种植所得的转基因生根幼苗。
含有外来、外源基因的植物的发育或再生在本领域中是公知的。优选地，使再生植物自花授粉以提供纯合的转基因植物。另外，将获自再生植物的花粉与农艺上重要的品系的种子生长的植物杂交。相反地，将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生植物授粉。使用本领域技术人员公知的方法栽培含有所需外源核酸的本发明的转基因植物。
已公布了用于棉花(US 5,004,863、US 5,159,135、US 5,518,908)、大豆(US 5,569,834、US 5,416,011)、芸苔(US 5,463,174)、花生(Cheng等，1996)和豌豆(Grant等，1995)的用于转化双子叶植物(主要通过根癌土壤杆菌的使用)和获得转基因植物的方法。
用于谷类植物诸如小麦和大麦的转化以通过外源核酸的引入将遗传变异引入植物和用于从原生质体或未成熟植物胚再生植物的方法在本领域中是公知的，参见例如，CA2,092,588、AU 61781/94、AU 667939、US 6,100,447、WO 97/048814、US 5,589,617、US 6,541,257，并且在WO 99/14314中提出了其它方法。优选地，通过根癌土壤杆菌介导的转化法产生转基因小麦或大麦植物。可将携带所需核酸构建体的载体引入组织培养的植物或外植体的可再生小麦细胞，或合适的植物系统诸如原生质体。可再生小麦细胞优选地来自未成熟胚、成熟胚的盾片、来源于这些细胞的愈伤组织、或分生组织。
为了确认转基因在转基因细胞和植物中的存在，可使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增或DNA印迹(Southern blot)分析。可以以多种方法的任何方法检测转基因的表达产物，这取决于产物的性质，并且方法包括蛋白印迹(Westernblot)和酶测定。定量蛋白质表达和检测在不同植物组织中的复制的一个特别有用的方法是使用报告基因诸如GUS。一旦获得转基因植物，就可使它们生长以产生具有所需表型的植物组织或部分。可收获植物组织或植物部分，和/或收集种子。种子可用作使具有拥有所需特征的组织或部分的另外的植物生长的来源。
标记辅助选择
标记辅助选择是选择当在经典育种程序中与回归亲本回交时所需的杂合植物的公认方法。每一个回交代中的植物的群体对于通常以1:1比率存在于回交群体中的目标基因是杂合的，并且分子标记可用于区分基因的两个等位基因。通过从例如幼苗提取DNA，并用特异性标记测试渗入的所需性状，进行用于进一步回交的植物的早期选择，同时将能量和资源集中于较少的植物。为了进一步加速回交程序，可从未成熟种子(开花后25天)切取胚，并在无菌条件下将其在营养培养基中生长，而非使得完全种子成熟。该方法(称为"胚胎拯救")，与三叶期进行的DNA提取和至少一个赋予植物增强的对秆锈病的抗性的Sr33等位基因或变体的分析组合使用，允许快速选择携带所需性状的植物，可将植物在温室或田中培养至成熟，以随后进一步对回归亲本回交。
本领域中已知的任何分子生物学技术可用于本发明的方法。此类方法包括，但不限于，核酸扩增、核酸测序、核酸与适合地标记的探针的杂交、单链构象分析(SSCA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链体分析(HET)、化学裂解分析(CCM)、催化核酸裂解或其组合的使用(参见，例如，Lemieux,2000；Langridge等，2001)。本发明还包括检测与赋予增强的对秆锈病的抗性的(例如)Sr33基因的等位基因连锁的多态性的分子标记技术的使用。此类方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、RAPD、扩增片段长度多态性(AFLP)和微卫星(简单重复序列，SSR)多态性的检测或分析。可通过本领域中公知的方法，诸如混合群体分离分析法(如由Langridge等(2001)综述的)容易地获得紧密连锁的标记。
在实施方案中，用于标记辅助选择的连锁基因座与编码本发明的多肽的基因相距至少在1cM或0.5cM或0.1cM或0.01cM以内。
"聚合酶链式反应"("PCR")是其中使用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或“引物组”和聚合催化剂诸如DNA聚合酶(通常地热稳定性聚合酶)产生目标多核苷酸的复制拷贝的反应。用于PCR的方法在本领域中是已知的，并且在例如"PCR"(M.J.McPherson和S.GMoller(编辑),BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford,(2000))中进行了教导。对从逆转录mRNA(从表达赋予增强的对秆锈病的抗性的Sr33基因或等位基因的植物细胞分离的)获得的cDNA进行PCR。然而，如果对从植物分离的基因组DNA进行PCR，其将通常更容易。
引物是能够以序列特异性方式与靶序列杂交并在PCR过程中被延伸的寡核苷酸序列。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是包含引物和靶序列的新合成的拷贝的延伸产物。多重PCR系统含有导致同时产生不止一种扩增子的多组引物。引物可优选地与靶序列匹配或它们可含有可导致限制性酶或催化核酸识别/裂解位点在特定靶序列中的引入的内部错配碱基。引物还可含有另外的序列和/或含有有利于扩增子的捕获或检测的经修饰的或标记的核苷酸。DNA的热变性、引物对它们的互补序列的退火和利用聚合酶对退火的引物的延伸的重复循环导致靶序列的指数扩增。术语靶或靶序列或模板是指被扩增的核酸序列。
用于核苷酸序列的直接测序的方法对于本领域技术人员来说是公知的并且可见于例如Ausubel等，(同上)和Sambrook等，(同上)中。可通过任何适当的方法例如双脱氧测序、化学测序或其变型来进行测序。直接测序具有测定特定序列的任何碱基对中的变化的有利方面。
TILLING
本发明的植物可使用称为TILLING(定向诱导基因组局部突变技术)的方法来产生。在第一步骤中，通过用化学诱变剂处理种子(或花粉)，随后将植物推进至其中突变将被稳定地遗传的代来在植物的群体中诱导引入的突变诸如新型单碱基对变化。提取DNA，并贮存来自群体的所有成员的种子以生成可随时间推移重复存取的资源。
对于TILLING测定，PCR引物被设计来特异性扩增目标单基因靶。如果靶是基因家族的成员或多倍体基因组的部分，则特异性是尤其重要的。随后，可将染料标记的引物用于从多个个体的汇集的DNA扩增PCR产物。将这些PCR产物变性，并退火以允许错配碱基对的形成。错配或异源双链体代表天然存在的单核苷酸多态性(SNP)(即，来自群体的几株植物可能携带相同多态性)和诱导的SNP(即，只有极少数个体植物可能展示该突变)。在异源双链体形成后，识别错配DNA并切割其的内切核酸酶诸如Cel I的使用是发现TILLING群体内的新型SNP的关键。
通过使用该方法，可筛选数以千计的植物以鉴定在任何基因或基因组的特定区域中具有单碱基变化以及小的插入或缺失(1-30bp)的任何个体。被测定的任何基因组片段的大小可在0.3至1.6kb的范围内。以8倍汇集1.4kb片段(扣除其中SNP检测因噪音而有问题的片段的末端)并且每测定96个泳道，该组合允许每单个测定高达百万碱基对的基因组DNA被筛选，从而使TILLING成为高通量技术。
TILLING进一步描述于Slade和Knauf(2005)以及Henikoff等(2004)中。
除了允许突变的高效检测以外，高通量TILLING技术对于天然多态性的检测也是理想的。因此，通过与已知的序列异源双链化来询问未知的同源DNA揭示了多态性位点的数目和位置。鉴定了核苷酸变化以及小的插入和缺失，包括至少一些重复数目多态性。这已被称为Ecotilling(Comai等，2004)。
每一个SNP根据其在少数核苷酸内的大致位置而被记录。因此，可基于其迁移率将每一个单体型归档。可使用用于错配裂解测定的相同的扩增的DNA的等分，通过相对小的增量努力获得序列数据。用于单个反应的左或右测序引物通过其与多态性的接近度来选择。Sequencher软件进行多重比对，并且发现碱基变化，这在每一种情况下确认了凝胶条带。
Ecotilling可以比完全测序(目前用于大部分SNP发现的方法)更便宜地进行。可筛选含有排列的生态型DNA的板而非来自诱变植物的DNA池。因为检测在具有几乎碱基对分辨率的凝胶上进行并且背景图案是跨泳道均匀的，所以具有相同大小的条带可匹配，从而可在单个步骤中发现SNP并对SNP进行基因分型。这样，SNP的最终测序是简单和高效的，通过可将用于筛选的相同PCR产物的等分经历DNA测序的事实更加表明如此。
植物/谷粒加工
使用本领域已知的任何技术将本发明的谷粒/种子，优选地谷物谷粒，更优选本发明的小麦谷粒或其它植物部分加工来产生食品成分、食物或非食物产品。
在一个实施方案中，产品是全麦面粉诸如例如，超细磨全麦面粉或从约100％的谷粒制备的面粉。全麦面粉包括精制面粉成分(精制面粉或精制面粉)和粗粒级分(超细磨粗粒级分)。
精制面粉可以是例如通过研磨和筛选清洗的谷粒诸如小麦或大麦谷粒来制备的面粉。精制面粉的粒度被描述为其中不少于98％通过具有不大于指定为"212微米(U.S.Wire 70)"的金属丝编织网的开口的开口的布的面粉。粗粒级分包含糠麸和胚芽的至少一种。例如，胚芽是在粒核内发现的胚体植物。胚芽包括脂肪、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养素，诸如黄酮类。糠麸包括几个细胞层，并具有显著量的脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养素，诸如黄酮类。此外，粗粒级分可包括糊粉层(其还包括脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养素，诸如黄酮类)。糊粉层，虽然在技术上被认为是胚乳的一部分，但展示许多与糠麸相同的特性并因此而通常在研磨过程中随同糠麸和胚芽一起被除去。糊粉层中含有蛋白质、维生素和植物营养素，诸如阿魏酸。
此外，可将粗粒级分与精制面粉成分共混。可将粗粒级分与精制面粉成分混合以形成全麦面粉，从而提供相较于精制面粉具有增加的营养价值、纤维含量和抗氧化能力的全麦面粉。例如，可以以不同的量将粗粒级分或全麦面粉用于在焙烤食品、零食产品和食品中替代精制或全麦面粉。还可将本发明的全麦面粉(即-超细磨全麦面粉)直接销售给消费者以用于他们的自制烘焙制品。在示例性实施方案中，全麦面粉的粒化特征使得按全麦面粉的重量计98％的颗粒小于212微米。
在其它实施方案中，将全麦面粉和/或粗粒级分的糠麸和胚芽中发现的酶灭活，以稳定全麦面粉和/或粗粒级分。稳定化是使用蒸汽、热、辐射或其它处理来灭活在糠麸和胚芽层中发现的酶的方法。已被稳定的面粉保持其烹饪特性并且具有更长的货架期。
在另外的实施方案中，全麦面粉、粗粒级分或精制面粉可以是食品的组分(成分)，并且可用于生产食品。例如，食品可以是面包圈、饼干、面包、小面包、羊角面包、团子、英式松饼、松饼、皮塔饼面包、速制糕饼、冷藏/冷冻的面团产品、面团、烤豆、墨西哥玉米煎饼、辣椒、玉米面豆卷、玉米粉蒸肉、玉米饼、菜肉馅饼、即食麦片、即食饭、填料、微波食品、布朗尼蛋糕、蛋糕、干酪饼、咖啡蛋糕、饼干、甜点、面粉糕饼、小甜面包、方糖块、馅饼皮、饼馅、婴儿食品、混合烘焙混物、面糊、面包屑、混合肉汁、肉类填充料、肉类替代品、混合调味品，汤粉、肉汁、油面酱、沙拉酱、汤、酸奶油、面条、意大利面、拉面、炒面、捞面条、冰淇淋包容物、冰砖、冰淇淋蛋卷、夹心冰淇淋、薄脆饼、油煎面包块、甜甜圈、鸡蛋卷、挤压膨化食品、水果和压块干粮、微波炉零食产品、营养棒、薄烤饼、平面烘焙焙烤食品、椒盐卷饼、布丁、基于格兰诺拉燕麦的产品、零食片、快餐食品、小吃搭配，华夫饼、披萨饼皮、动物性食品或宠物食品。
在替代实施例中，全麦面粉、精制面粉或粗粒级分可以是营养补充剂的组分。例如，营养补充剂可以是被添加至含有一种或多种其它成分的饮食的产品，通常包括：维生素、矿物质、中草药、氨基酸、酶、抗氧化剂、中草药、香料、益生菌、提取物、益生元和纤维。本发明的全麦面粉、精制面粉或粗粒级分包括维生素、矿物质、氨基酸、酶和纤维。例如，粗粒级分含有浓缩量的膳食纤维以及其它必需营养物，诸如B族维生素、硒、铬、锰、镁和抗氧化剂，这对于健康饮食是必需的。例如22克本发明的的粗粒级分递送33％的个人的每日推荐纤维消耗。营养补充剂可以包括任何已知的将有助于个人的整体健康的营养成分，实例包括但不限于维生素、矿物质、其它纤维成分、脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸、肽、蛋白质、叶黄素、核糖、ω-3脂肪酸和/或其它营养成分。补充剂可以以以下形式进行递送，但不限于以下形式：速溶饮料混合物、现成饮用饮料、营养棒、华肤、饼干、薄脆饼，凝胶球、胶囊、咀嚼物、可咀嚼片剂和丸剂。一个实施方案以调味摇或麦芽型饮料的形式递送纤维补充剂，该实施方案作为纤维补充剂对儿童特别有吸引力。
在另外的实施方案中，研磨工艺可用于制造多谷物面粉或多谷物粗粒级分。例如，可碾磨来自一种类型的谷粒的糠麸和胚芽，并将其与另一种类型的谷物的碾磨的胚乳或全麦面粉混合。或者可碾磨一种类型的谷粒的糠麸和胚芽并将其与另一种类型的谷粒的碾磨的胚乳或全麦面粉混合。可预期本发明包括将一个或多个谷粒的糠麸、胚芽、胚乳和全麦面粉的一种或多种的任意组合混合。该多粒法可用于制造定制面粉和利用多个类型的谷粒的质量和营养内含物来产生一种面粉。
可以预期，本发明的全麦面粉、粗粒级分和/或谷物产品可通过本领域中已知的任何研磨方法来产生。示范性实施方案包括在单料流中研磨谷粒而不将谷粒的胚乳、糠麸和胚芽分离至单独的料流中。将清洁和匀湿的谷粒输送至第一通道磨床诸如锤磨机、辊磨机、针磨机、冲击式磨机、盘式磨机、空气碾磨机、缝磨机等。研磨后，颗粒被排出，并被输送至筛子。此外，可以预期的是，可通过许多其它方法诸如：发酵、即溶、挤出、封装、烘烤、焙烧等来改变或增强本发明的全麦面粉、粗粒级分和/或谷粒产品。
麦芽制造
由本发明提供的基于麦芽的饮料包括酒精饮料(包括蒸馏的饮料)和通过使用麦芽作为它们的起始材料的部分或整体而产生的非酒精饮料。实例包括啤酒、发泡酒(低麦芽啤酒饮料)、威士忌、低酒精麦芽基饮料(例如，含有少于1％的醇的麦芽基饮料)和非酒精饮料。
麦芽制造是受控的浸渍和萌发，随后干燥谷粒诸如大麦和小麦谷粒的过程。这一系列事件对于导致谷粒改性(主要使死亡的胚乳细胞壁解聚和动员谷粒营养物的过程)的许多酶的合成是非常重要的。在随后的干燥过程中，风味和颜色都因化学褐变反应而产生。尽管麦芽的主要用途是用于饮料生产，但其还可用于其它工业过程，例如在烘烤业中用作酶源，或如在食品工业中用作调味剂和着色剂，例如作为麦芽或作为麦芽粉，或间接作为麦芽糖浆等。
在一个实施方案中，本发明涉及产生麦芽组合物的方法。该方法优选地包括如下步骤：
(i)提供本发明的谷粒，诸如大麦或小麦谷粒，
(ii)浸泡所述谷粒，
(iii)在预定条件下使浸泡的谷粒发芽和
(iv)使所述萌发的谷粒干燥。
例如，麦芽可通过Hoseney(Principles of Cereal Science and Technology，第2版，1994:American Association of Cereal Chemists,St.Paul,Minn.)中描述的任何方法来产生。然而，用于产生麦芽的任何其它合适方法也可用于本发明，诸如用于特种麦芽生产的方法，包括但不限于：烘焙麦芽的方法。
麦芽主要用于酿造啤酒，而且还用于生产蒸馏酒。酿造包括麦芽汁生产、主发酵和后发酵以及后处理。首先将麦芽磨成粉，搅拌入水中，并加热。在该“糖化”过程中，在糖化中被激活的酶将内核的淀粉降解成可发酵的糖。将所产生的麦芽汁澄清，加入酵母，将混合物发酵并进行后处理。
实施例
实施例1.Sr33的遗传作图
获得小麦保藏品种CS1D5405，其含有Sr33基因-CS1D5405为参照小麦基因型中国春(CS)的染色体1D被来自粗山羊草保藏品种(RL5288)(Sr33的供体)的对应染色体取代的单染色体取代遗传种质系。用秆锈病小麦禾柄锈菌致病型34-1、2、3、4、5、6、7、11(PlantBreeding Institute培养号171,Cobbity,New South Wales,Australia)感染小麦叶，并进行组织学检查以将Sr33抗性反应与由强反应基因Sr45(也来源于粗山羊草并渗入六倍体小麦)赋予的抗性反应相比较。在于接种后(dpi)5天收集的六倍体小麦叶中，相较于含有Sr45基因的感染的植物，在含Sr33的植物中观察到较大的感染部位。
为了研究这两个不同抗性基因的潜在作用模式，进一步清洁染色的锈病感染的叶组织，并通过自发荧光鉴定细胞死亡。清洁锈病感染的叶组织，并用缀合于FITC的麦胚凝集素(WGA)进行染色，如Ayliffe等(2011)中描述的。为了使自发荧光的细胞可视化，在饱和水合氯醛溶液中清洁相同的叶样品，随后在紫外光下进行观察。含Sr33的六倍体小麦相较于Sr45在锈病感染部位因植物细胞死亡而显示极少的自发荧光，从而显示强过敏性细胞死亡。利用Ug99秆锈病分离株和衍生的小种以及北美(Rouse等，2011)和澳大利亚秆锈病分离株的进一步测试显示，Sr33在CS1D5405中的存在赋予与中国春遗传背景中的Sr45基因相比的中等抗性表型。
如下进行遗传作图法以定位Sr33基因。从含有Sr33的抗性植物CS1D5405(Jones等，1991)与缺乏Sr33的易感变种中国春的植物之间的杂交产生作图群体。作图群体包括85个重组近交系(RIL)和1150个从CS1D5405与中国春之间的杂交衍生的F2品系。使用小麦禾柄锈菌致病型34-1、2、3、4、5、6、7、11(Plant Breeding Institute培养号171,Cobbity,NewSouth Wales,Australia)以及Bariana和McIntosh(1993)的方法进行这些植物材料的锈病筛选。与CS1D5405一起，粗山羊草保藏品种CPI110799(Sr33的原始供体)也用作阳性对照。秆锈病抗性在重组近交系家族中作为Sr33基因座上的单一共显性基因分离。
使用Hayden等(2008)的方法对85个RIL筛选对于染色体1D是特异的简单重复序列(SSR)标记(Somers等，2004)，并且使用MAP MANAGER版本QTXb20(Manly等，2001)和Kosambi(1944)作图功能对RIL群体进行11个鉴定的多态性标记的作图。从该筛选中鉴定了两个紧密连锁的侧翼标记，即BE405778和BE499711，并使用Kota等(2006)中描述的方法以该位置作图策略将其用于从大的F2群体鉴定重组体。使用含Sr33的区域中的侧翼EST衍生标记BE405778和BE499711分析CS1D5405x CS的遗传作图群体中的约2850个配子。这鉴定了各自在两个标记之间具有重组的30个独立的重组品系。
为了鉴定Sr33区中的另外的标记，按照Lagudah等(2006)的方法筛选对于染色体组1(Akhunov等，2010)是特异的小麦表达的序列标签(wEST)。此外，使用来源于17个PstI和24个MseI选择性扩增引物的408个引物组合和如Mago等(2002)中描述的方法进行AFLP分析。
为了起始Sr33区的物理作图，按照Lagudah等(2006)筛选从粗山羊草保藏品种AL8/78(Luo等，2003)和AUS18913(Moullet等，1999)制备的D基因组特异性BAC文库。将位于含有脱水素基因的序列的Sr33的0.04cM内的紧密连锁的AFLP来源的标记用作针对从粗山羊草保藏品种AL8/78制备的D基因组BAC文库的探针，并鉴定阳性克隆。使用分离的低拷贝序列对鉴定的BAC作图，如Lagudah等(2006)描述的。在中国北京基因组学研究所(BeijingGenomic Institute,China)和在美国堪萨斯州立大学整合基因组学实验室(IntegratedGen omics facility,Kansas State University,USA)对阳性BAC克隆进行测序。从美国加州大学戴维斯分校粗山羊草物理图项目(Ae.tauschii Physical Mapping Project,UCDavis,USA)鉴定阳性克隆的重叠群。使用小麦重复序列数据库(http://wheat.pw.usda.gov/ITMI/Repeats/blast repeats3.html)掩蔽存在于BAC内的组装的短重叠群中的重复序列，并且使用麻省理工学院(Massachusetts Institute ofTechnology)的基因预测软件(http://genes.mit.edu)分析基因的非重复序列。鉴定了BAC重叠群ctg4713，其携带编码Pum/Mpt5/FBF-样基因(称为Bpm)和具有结合富含亮氨酸的重复序列结构域的卷曲螺旋核苷酸(CC-NB-LRR)的抗性基因类似物(RGA)(称为AetRGA1a)的另外的序列(参见图4)。
脱水素、Bpm和AetRGA1a序列在大麦和一粒小麦中各自具有与成簇的防御相关基因连接的直系同源基因成员(Wei等，2002；Jordan等，2011)并且被分别绘制于染色体1H和1A上的对应的同源位置处。在高分辨率遗传图谱中，AetRGA1a被近似地绘制于与脱水素和Bpm序列相同的位置上(图1)。
利用AetRGA1a作为探针再筛选BAC文库进一步鉴定了含有被遗传绘制为与Sr33共分离的3个另外的密切相关的RGA成员(称为AetRGA1b、AetRGA1c和AetRGA1d)的序列重叠群5455(图1)。在地理上更靠近并且位于与Sr33供体的原始来源相同的基因池内的来自粗山羊草保藏品种AUS18913的第二BAC文库的随后筛选(Moullet等，1999)，显示另外4个共分离RGA序列(图1)。这些序列被称为AetRGA1e、AetRGA1f和两个其它不同的RGA类型AetRGA2a和AetRGA3a(图1)。AetRGA1f和AetRGA3a各自具有框内终止密码子并且被认为是无功能的，从而被认为是也存在于携带Sr33的植物中的假基因。
在Sr33基因座处的3个RGA种类RGA1、RGA2和RGA3显示分别与大麦Mla基因座处的3个非交叉杂交NB-LRR基因RGH1、RGH2和RGH3的密切相似性(Wei等，2002)。AetRGA2a显示具有含有不存在于大麦中的胞吐体70亚单位结构域的C末端区的独特基因融合物(图3)。大麦Mla基因座还含有胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)基因家族的成员，与在粗山羊草中发现的CI2e基因成员相关的其序列被绘制在距Sr33为0.3cM处的远端(图1)。也使用Phytozome平台(www.phytozome.net)将来自小麦的标记序列与稻和短柄草属基因组序列相比较，以鉴定直系同源序列。使用Bpm和CI序列的该分析鉴定了分别在短柄草属和稻基因组的染色体2和5中的直系同源区域。然而，这些基因组缺乏在粗山羊草、小麦和大麦中发现的3个RGA种类的任何种类(图1)。
本发明人得出在作图的区域中存在至少8个候选LRR-NBS型基因，其任一个可以是Sr33，如果Sr33抗性表型确实由单基因赋予以及如果Sr33基因编码LRR-NBS型多肽。
实施例2.Sr33突变体的诱变和分离
为了鉴定哪个候选基因是Sr33，如果它们中的任一个确实为Sr33的话，则进行突变方法。通过甲基磺酸乙酯(EMS)处理2000粒CS1D5405的种子产生突变体品系(Mago等，2005)。用具有致病型34-1、2、3、4、5、6、7、11的锈病菌株攻击来自诱变品系的850株M2植物以筛选它们的Sr33表型。从EMS处理的群体鉴定了9个易感突变体，如下将其用于鉴定负责秆锈病抗性功能的基因成员。
基于染色体1D特异性标记，突变体中的4个(E1至E4；组I)经鉴定在染色体1D中携带大的缺失，同时1个突变体(E5；组II)具有丢失AetRGA1b、AetRGA1c、AetRGA1e、AetRGA2a和AetRGA3a基因的短的缺失(图2)。这5个突变体不用于鉴定Sr33基因。相反地，余下的4个突变型植物(E6至E9；组III)被鉴定为假定的点突变，因为未检测到DNA标记丢失。按照由Lagudah等(2009)描述的PCR法将沿着预测的基因的完整长度设计的重叠引物对(表2)用于从CPI110799(Sr33供体品系)和组III易感突变体扩增序列。
使用多序列比对(CLUSTAL-European Bioinformatics Institute-http://www.edi.ac.uk/Tools/sequence.html)来比较扩增的序列的核苷酸变异。AetRGA1a、AetRGA1b、AetRGA1c、AetRGA1d、AetRGA1f、AetRGA2a和AetRGA3a基因的扩增的部分的核苷酸序列与来自抗性亲本CS1D5405的对应序列的比较显示，它们是100％同一的，然而AetRGA1e的核苷酸序列在易感突变体中显示独立的核苷酸变化。本发明人得出AetRGA1e为Sr33基因。突变型植物中的两个包含导致编码的多肽的P-环中的氨基酸变化的核苷酸变化，然而另外两个分别在编码NBS结构域的RNBS-B和GLPL基序的序列中具有突变(图4)。
Sr33的互补分析
为了进一步将AetRGA1e确认为对于Sr33抗性是足够的，使用8kb长的基因组DNA(由所有外显子和内含子组成)和AetRGA1e的2.4kb上游和1.5kb下游区域进行遗传互补测试。本发明人预期该片段包括基因的全长，包括其启动子。在制造商推荐的条件下使用引物(5'-TTCAAGATGTCAAATTTTAAAAGGGC-3')(SEQ ID NO:13)、(5'-CTACTCATTAGGAACTCGAGCGG-3')(SEQ ID NO:14)和Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.)扩增8kb片段。将Sr33基因片段插入二元载体pVecNeo(其中35S潮霉素基因已被来源于pCMneoSTL2(Maas等，1997)的35S NPTII选择标记基因替代的pWBvec8的衍生物(Wang等，1998))。通过使用根癌土壤杆菌菌株GV3101(pMP90)转化将包含AetRGA1e基因序列的基因构建体引入秆锈病易感小麦栽培种Fielder。测试超过20个T0转化体的对锈病的抗性反应。感染测试显示，20个独立的AetRGA1e转基因植物展示Sr33抗性的典型秆锈病感染反应，然而缺乏转基因的近亲品系是高度易感的，从而确认AetRGA1e赋予Sr33抗性。本发明人得出AetRGA1e基因是必需的并且足以赋予Sr33表型。
Figure BDA0000895398780000561
实施例3.Sr33基因和多肽的结构及其表达
Sr33的基因组序列具有6个外显子和5个内含子，如通过RT-PCR以及5’和3’RACE(cDNA末端的快速扩增)反应预测的。基因的结构示意性地示于图4中，并且基因序列以SEQID NO:5提供。外显子1跨越SEQ ID NO:5的核苷酸1226至1299，外显示子2跨越核苷酸1389至1511，外显子3跨越核苷酸2238至3080，外显子4跨越核苷酸4155至6157，外显子5跨越核苷酸6266至6344以及外显子6跨越核苷酸6824至7233。
病原体抗性Sr33多肽(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)是含有具有以下基序的多肽的CC-NB-LRR：卷曲螺旋、EDVID、hhGRExe、Walker A、Walker B、RNBS-B、RNBS-C、GLPL、RNBS-D、MHD和LRR。卷曲螺旋区通常从SEQ ID NO:1的氨基酸残基1延伸至160。NB结构域通常从SEQ ID NO:1的氨基酸残基161延伸至550，而LRR结构域通常从SEQ ID NO:1的氨基酸残基551延伸至961。
通过邻接树分析进行的系统发育分析表明，编码的Sr33多肽与来自二倍体A基因组的种一粒小麦(TmMla)和大麦(HvMla)的Mla蛋白归为一组；与TmMla具有86％的最高相似性，而HvMla1是最接近的大麦直系同源物(图5)。编码CC-NB-LRR蛋白的分离的小麦叶锈病抗性基因(LR1、LR10和LR21)均不与Sr33(展示在25％至34％的范围内的氨基酸序列同一性)或大麦Mla成员相关。AetRGA1e(Sr33)分别与AetRGA1a，AetRGA1d，AetRGA1b，AetRGA1c和AetRGA2a具有82％、81％、80％、78％和30％同一性(表3)。
表3.小麦Sr33与来自其它植物物种的Sr33同源物的氨基酸同一性百分比
Figure BDA0000895398780000571
Figure BDA0000895398780000581
实施例4.其它植物中的Sr33的同源物
为了测定Sr33基因的等位基因在二倍体小麦植物中的存在或不存在，并且为了鉴定变体等位基因，从368个粗山羊草保藏品种(从不同地理位置收集的并且在Tamworth,Australia的Australian Winter Cereals Collection、在CSIRO Plant Industry,Australia的Commonwealth Plant Introduction collection(CPI)和UC Davis,USA维持的)的每一个筛选植物。
通过在来自36个保藏品种的植物中进行PCR来获得Sr33的等位基因的全长序列，剩余的332个品系中无扩增产物表明后一类保藏品种携带高度趋异的序列或缺乏该基因。当基因存在时，基于氨基酸序列如下归类基于Sr33序列的单体型(图6，表4)。7个保藏品种具有与原始Sr33来源同一的序列(SEQ ID NO:1)并且被分类为单体型I。第二单体型(单体型II，SEQ ID NO:2)与SEQ ID NO:1在位置588(天冬酰胺而非天冬氨酸)的差异在于单个氨基酸(于保藏品种PI603225中发现的)。在C末端(LRR区)上具有5个氨基酸取代的20个其它保藏品种的序列构成单体型III(SEQ ID NO:6)。在3个俄罗斯保藏品种中发现了在NBS和LRR区中均具有几个氨基酸变化的第四单体型(SEQ ID NO:7)，而在伊朗来源的5个保藏品种中发现了编码截短的蛋白质的第五个单体型(SEQ ID NO:8)。单体型I、II和III经发现源于里海的南海岸区。筛选来自每一个单体型的植物的Sr33表型。单体型I和II的植物显示针对多个秆锈病小种的抗性(表4)。
Figure BDA0000895398780000591
实施例5.Sr33功能的VIGS分析表明抗性不依赖于RAR1、SGT1和HSP90
由一个亚组的NB-LRR型R蛋白介导的疾病抗性需要3个伴侣蛋白即RAR1、SGT1和HSP90的功能，所述伴侣蛋白被认为将相容性蛋白维持和稳定在自动灭活状态并且促进适当的免疫功能(Shirasu等，2009)。病毒诱导的基因沉默(VIGS)是用于特定基因的靶向沉默的有用工具并且通常被用于描绘蛋白质功能。事实上，Scofield等(2005)证明在六倍体小麦中减弱RAR1、SGT1和HSP90基因的表达足以削弱Lr21基因的免疫能力。为了确定Sr33-介导的抗性是否依赖于RAR1、SGT1和HSP90，进行实验来在表达Sr33的六倍体小麦品系CS1D5405中使编码这些伴侣蛋白的基因瞬时沉默，随后通过抗性测试测定Sr33表型。
沉默使用来源于获自UC Berkeley的Dr.Andrew O.Jackson(Petty等，1989)的大麦条纹花叶病毒(BSMV)载体的病毒载体。重新构建BSMVγ载体来包含准备PCR的克隆位点。为此，用两种限制内切酶NotI和PacI消化γ载体，并将其与包括两个XcmI限制性位点的GGCCCCACTCATGACATGGCGTTAGCCATGGGAAGCTTGGAT(SEQ ID NO:67)的序列连接。用限制性内切酶XcmI使经修饰的γ载体(称为γPCR载体)线性化以产生用于PCR产物的直接克隆的TA克隆位点。为简便起见，将不具有插入物的BSMV衍生的构建体命名为γ00，并且将每一个BSMV沉默构建体命名为γ靶。例如，BSMV沉默构建体携带命名为γPDS的小麦PDS基因的185-bp片段。
用于使Sr33基因沉默的BSMV构建体携带190-bp Sr33基因特异性片段。制备两个构建体来使Exo70基因沉默；每一个构建体携带命名为γExo70N和γExo70C的来自基因的N或C末端的190-bp基因特异性片段。相反地，Rar1、Sgt1和Hsp90各自在小麦的A、B和D基因组上具有3个同源物。为了使基因组中的所有3个同源物沉默，设计构建体来携带其核苷酸序列在每一个基因的所有3个同源物中是保守的约190-bp片段。
使用T7RNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)通过体外转录从线性化的α、β和γ质粒合成感染性RNA转录物(Scofield等，2005)。用等摩尔比的α、β和γ转录物加上含有致伤剂的接种缓冲液来制备BSMV接种物。将接种物摩擦-接种至每一株9日龄小麦幼苗的第二叶上。
在温室条件下利用秆锈病小种QFCSC进行秆锈病评估。将夏孢子悬浮于Soltrol170异链烷烃(Chempoint,Bellevue,WA)中。按照制造商的推荐(Hausser Scientific,Horsham,PA)，使用Brightline血细胞计数器将孢子接种密度计算为227,500个孢子/ml。使用Badger 350-3喷枪(Badger Air-Brush Co.,Franklin Park,IL)以0.05mg孢子/10mlSoltrol/植物的速率应用接种物。使用光学显微镜在接种的显微镜载玻片上评估孢子萌发率。将具有光照的露室预条件化至19-22℃的气温并孵育24小时，随后在高湿度和高光强条件下孵育至少3小时，随后转移至温室。当中国春在接种后14天显示完全易感性时，按照Bariana和McIntosh(1993)中描述的标度进行评估。
被靶向沉默的基因的表达通过比较定量实时PCR(qRT-PCR)来进行定量。利用SYBRGreen实时-PCR通过iScript One-Step RT-PCR试剂盒来定量转录物丰度，以及使用通过CFX Manager软件(Bio-Rad,Hercules,CA)操作的CFX96实时PCR检测系统进行定量。将转录物丰度针对18s和肌动蛋白转录物丰度进行标准化，并且使用如CFX96手册(Bio-Rad,Hercules,CA)中描述的ΔΔCt法计算相对转录物丰度，其中倍数变化＝2-ΔΔCt并且百分比转录物丰度＝倍数变化×100。以一式三份进行每一个反应，只有当Ct≤30并且重复之间的Ct标准偏差≤0.3才使用数据。循环条件如下：50℃，10分钟，95℃，5分钟，随后进行40个循环：95℃，10秒；55℃，30秒；和95℃，1分钟；55℃，1分钟；熔点曲线55℃至95℃，增量0.5℃。在所有情况下，靶基因的相对表达呈现为该基因在沉默的植物中相对于相同基因在用γ00感染的植物中的表达水平的表达水平，并且基因表达的值是3个植物的平均值。对于每一个PCR，验证扩增的特异性，并且使用Bio-Rad iCycler软件计算高于本底的阈值循环。PCR效率接近100％。如Scofield等(2005)中所述计算基因转录物丰度的相对定量。所有显示qRT-PCR数据的图中的误差棒表示从原始CT(循环阈值)值计算的标准偏差。
用于检测每一个基因的引物序列如下：
SR33-F：5′GCAGGAGGACGTGGAAATC 3′(SEQ ID NO：68)
SR33-R：5′AAAGTCTACCATACAGCGGAAC 3′(SEQ ID NO：69)
Exo70-F：5′ATGGAGCAATGCCCAAAGT 3′(SEQ ID NO：70)
Exo70-R：5′GGCATCAGCAAACACCAACT 3′(SEQ ID NO：71)
HSP90-F：5′CGACCAGCACGCTCACGAT 3′(SEQ ID NO：72)
HSP90-R：5′GCGATGGTCCCGAGGTTGT3′(SEQ ID NO：73)
SGT1-F：5′CAAGCTGGGCAGTTAC 3′(SEQ ID NO：74)
SGT1-R：5′TCCTTCGATGCATAAAGC 3′(SEQ ID NO：75)
RAR1-F：5′ATGCGGTGCCAGCGAATA 3′(SEQ ID NO：76)
RAR1-R：5′GGGTTGTCGTCGTCGGTG 3′(SEQ ID NO：77)
肌动蛋白-F：5’AAATCTGGCATCACACTTTCTAC 3’(SEQ ID NO：78)
肌动蛋白-R：5’GTCTCAAACATAATCTGGGTCATC 3’(SEQ ID NO：79)
18SF：5’GTGACGGGTGACGGAGAATT 3’(SEQ ID NO：80)
18SR：5’GACACTAATGCGCCCGGTAT 3’(SEQ ID NO：81)
PDS-F：5’TGTCTTTAGCGTGCAAG 3’(SEQ ID NO：82)
PDS-R：5’GATGATTTCGGTGTCACT 3’(SEQ ID NO：83)
根据指示每一个基因(AetRGAle、RARl、SGTl和HSP90)的相对表达减少50-84％之间的量的数据，通过qRT-PCR分析确认沉默(表5)。沉默的植物和对照植物展示相同的免疫抗性能力，这表明Sr33介导的抗性在小麦中进行的这些实验中不依赖于RARl、SGTl和HSP90。此外，由于BSMV：AetRGAle处理的植物展示增加的对秆锈病感染的易感性，因此这些数据进一步验证了该基因为小麦提供了Sr33-依赖性秆锈病抗性的想法。携带胞吐体70亚单位的相邻AetRGA2b成员的沉默不减弱抗性，从而表明该基因不是Sr33介导的抗性所需的。
表5.在通过BSMV:VIGS进行的沉默过程中Sr33、RGA2a+Exocyst70、RAR1、SGT1和HSP90表达的qRT-PCR分析
Figure BDA0000895398780000631
*通过将沉默植物中针对靶基因测定的表达值除以用Bsmv:00感染的植物中测量的相同基因的表达值来计算相对表达。*每一个数字是一式三份的平均值。
实施例6.酵母双杂交分析
实施例5中描述的实验表明Sr33多肽不依赖于RAR1-SGT1-HSP90伴侣蛋白复合物而发挥功能。然而，有一点需要注意的是，基因沉默是极少完全的。即，在VIGS实验期间RAR1、SGT1和HSP90蛋白的量可能未被充分减小至低于改变抗病性的阈值。为了评估Sr33是否能够在第二类型的实验中与HSP90、SGT1和RAR1多肽的任一个相互作用，进行了定向酵母双杂交分析。使用WRKY1/2多肽进行类似实验。
如下在酿酒酵母报告菌株Hf7c中进行酵母双杂交实验。使用大麦(H.vulgare)HSP90、RAR1、SGT1、WRKY1/2氨基酸序列作为查询序列来检索公共数据库以分离来源于小麦的相关表达序列标签(EST)。通过使用可获得的文献和序列数据，选择EST CK208966.1和CJ619316.1(对于SGT1)、CJ684577.1(对于RAR1)、GQ240780.1(对于HSP90)、DR741433.1、BQ578389.1(对于WRKY1)和DR740124.1、DR741886.1(对于WRKY2)(Tai,2008；Wang等，2011)，并且开发用于从粗山羊草品系CPI110799分离HSP90、RAR1、SGT1和WRKY1/2的全长cDNA的引物配对(表6)。
从来自小麦品系CPI110799和大麦变种黄金大麦(Golden Promise)的植物扩增HSP90、SGT1、RAR1、WRKY1和WRKY2的cDNA。使用经设计具有特定限制性内切酶位点(表6)的引物通过PCR扩增获得靶cDNA，随后将其在相应的位点克隆入pGADT7(Clontech)。通过Gietz和Woods(2002)的方法进行酵母转化，在缺乏亮氨酸和色氨酸的SD培养基上选择共转化体。在缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的培养基上进行相互作用分析，将酵母在30℃下生长3-4天。作为阳性对照，使用亚麻L6TIR结构域，已显示其在酵母或MLA10CC1-46-HvWRKY1260–353组合中形成同源二聚体(Bernoux等，2011；Jordan等，2011)。按照Kushnirov(2000)提取总酵母蛋白。通过SDS-PAGE分离蛋白质，将其转移至硝酸纤维素膜(Pall)。将膜在5％脱脂奶中进行封闭，并用抗HA或抗-Myc小鼠单克隆抗体(Roche)，随后用缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗-小鼠抗体(Pierce)进行探测。使用SuperSignal WestPico或Femto化学发光试剂盒(Pierce)检测标记。利用Ponceau S对膜进行染色以确认等量上样。
全长Sr33(作为诱饵)与大麦或粗山羊草HSP90、SGT1和RAR1多肽的全长等效物的共表达不能检测与Sr33的相互作用。结构证据表明SGT1可提供相容性NB-LRR蛋白籍以与伴侣蛋白复合物缔合的对接界面(Zhang等，2010)。此类相互作用已通过两个不同的NB-LRR型R蛋白的LRR结构域能够与SGT1直接相互作用的观察获得实验性地验证(Bieri等，2004；Leister等，2005)。为了减小空间位阻可能是该研究中限制因素的可能性，将Sr33的LRR结构域表达为截短的蛋白质。LRR551-961(作为诱饵)与AetSGT1(作为猎物)的共表达再次产生负相互作用。与VIGS分析一起，这些数据提供了Sr33不依赖于伴侣蛋白HSP90、RAR1和SGT1起作用的强有力的遗传和生物化学证据。
利用WRKY1/2的酵母双杂交分析
邻接分析表明Sr33多肽氨基酸序列与大麦Mla多肽的组群聚类。鉴于多个大麦Mla基因与具有Sr33的TmMla1之间的相似性的程度，进行酵母双杂交分析以评估Sr33是否能够与WRKY1/2的大麦或粗山羊草等效物相互作用。
已显示HvMLA10和TmMLA1的N末端卷曲螺旋结构域(CC1-46)对于介导与这些WRKY蛋白的C末端结构域(HvWRKY1260–353和HvWRKY2242–319)的相互作用是必需的和足够的(Jordan等，2011；Shen等，2007；Maekawa等，2011)。因此，Sr33CC1-46(作为诱饵)与HvWRKY1260–353、HvWRKY2242–319和AetWRKY1258–348以及AetWRKY2246–322(作为猎物)的共表达不能检测相互作用。这表明Sr33多肽无需与WRKY1/2多肽相互作用而起作用。
Figure BDA0000895398780000661
Figure BDA0000895398780000671
Sr33的CC结构域在酵母中不会自我缔合
MLA10CC5-120结构域能够在溶液中自我缔合以形成二聚体。此外，MLA10CC-NB1-225结构域还在酵母双杂交测定中自我相互作用(Maekawa等，2011)。为了评估Sr33的CC结构域是否能够自我相互作用，进行定向酵母双杂交分析。既作为诱饵又作为猎物的3个截短的Sr33CC结构域变体(等效于CC结构域的截短部分(CC1-125)、完整CC结构域(CC1-160)和CC-NB结构域(CC1-225))的共表达不能检测Sr33CC结构域自我缔合。
实施例7.SR33的结构功能分析
如实施例3中所述，Sr33多肽含有结构域CC-NB-LRR。对于CC-NB-LRR蛋白，CC结构域被认为是发出超敏反应(HR)起始的信号所需要的，中央NB-ARC区参与蛋白质调控，并且LRR结构域参与配体识别。为了测试该模型对于Sr33多肽是否正确以及为了剖析存在于Sr33中的亚结构域对整体蛋白质功能的相对贡献，将Sr33经历结构域截短或特定氨基酸的定点诱变(SDM)。针对靶向SDM选择的氨基酸均对应于已显示对于MLA10(来自大麦的Sr33的直系同源物)的蛋白质功能是重要的相同位置中的保守氨基酸。
使用载体pTN(蛋白质表达受CaMV 35S启动子控制)进行实验。将该载体转化进土壤杆菌菌株GV3101中，随后通过叶的背轴表面的压力浸渗将其引入3周龄的本生烟草(N.benthamiana)植物。接种后72-96小时获取数据。
Sr33的CC结构域在本生烟草中发送HR信号
将Sr33截短成如图7中指示的5个排列(#1-5)并且遗传构建体被产生来用于在pTN载体中表达每一个截短的多肽。测试每一个构建体(包括用于961个氨基酸残基的全长多肽的表达的构建体(图7中的#6))在本生烟草叶中诱导HR的能力。在该实验中，空载体用作阴性对照，而MLA10CC结构域(氨基酸1-160)用作HR诱导的阳性对照。接种的叶的目测观察显示只有含有CC结构域(即1.CC、2.CC-NB、3.CC-NB-ARC，但非全长Sr33)的Sr33的截短形式才能够诱导与Sr33功能相关的弱HR。因此，在Gateway载体pBIN中的CaMV35S启动子的控制下表达Sr33和MLA10两种多肽的氨基酸1-160(CC结构域)。通过使用该特定载体，观察到较强的更显著的HR，从而确认Sr33的CC结构域对于在植物中诱导HR是必需的并且是足够的。
实施例8.Sr33在F99或D501处的定点诱变自动激活SR33，然而K207灭活SR33
以相同的方式在本生烟草叶中表达Sr33的定点突变体。目测观察显示全长Sr33，当在本生烟草中表达时不能诱导HR。Sr33多肽含有2个保守的氨基酸，所述氨基酸(当在MLA10中突变时)已被显示自动激活FL蛋白。Sr33中的对应的第一氨基酸为CC结构域中的位置99处的苯丙氨酸(F)(F99)，并且对应的第二氨基酸为ARC结构域的MHD基序中的位置501处的天冬氨酸(D)(D501)。此外，Sr33含有当在MLA10中突变时，已被显示灭活FL蛋白的另一个保守氨基酸。该氨基酸为NB结构域的P-环中的位置207处的赖氨酸(K)(K207)。当在本生烟草中测试时，单个地发现F99E和D501V突变自动激活Sr33，两者均提供强的可见HR，然而K207R没有作用。然而，当将K207R突变与F99E或D501V突变组合时，发现该修饰减弱/灭活自动激活活性。
实施例9.讨论
实施例1中描述的高分辨率遗传和物理作图显示一簇各自编码NB-LRR蛋白的基因(包括至少6个跨越Sr33基因座的基因成员)的存在。诱导的突变体和互补分析确认簇内的单个基因AetRGA1e是赋予Sr33介导的抗性所需的并且足够的。不同的NB-LRR基因AetRGA2经鉴定与Sr33紧密连锁。越来越多的证据表明成对的不同NB-LRR基因在介导针对病原体分离株的抗病性中一起发挥作用，如对于小麦叶锈病(Lr10)、稻瘟病(Pikm)、细菌性青枯病和细菌性斑点病(RRS1/RPS4)以及拟南芥中的霜霉病(RPP2)所报导的(Eitas和Dangl,2010)。在Sr33的情况下，通过相邻AetRGA2a基因的敲低进行的基因沉默实验对Sr33介导的抗性没有影响，这表明AetRGA2a不是抗性基因功能所必需的。值得指出的是，AetRGA2a具有拥有胞吐体70亚单位结构域的新型C末端。虽然包括NB-LRR蛋白和其它功能多样的蛋白质结构域诸如激酶和WRKY转录因子的基因融合物是已知的(Brueggeman等，2008；Narusaka等，2009)，但这是第一次报导NB-LRR-胞吐体70亚单位融合蛋白，。
跨小麦的A和D基因组的Sr33区以及大麦的对应染色体区的比较遗传分析显示Bpm样(RNA结合蛋白)和Mla相关防霉性基因家族的保守性(Wei等，2002；Jordan等，2011)。简言之，所有已知的功能性Mla等位基因属于一类来自Mla基因座处的混合基因簇的抗性基因类似物(Seeholzer等，2010)。Sr33与大麦和二倍体A基因组祖先一粒小麦中的Mla等位基因具有高达86％的序列同一性。迄今为止，针对大麦(HvMla)和一粒小麦(TmMla)的基因座只报导了小种的抗白粉病(禾白粉病菌(Blumeria graminis))的特异性抗性。上述实例描述了在序列上与Mla相关的基因，即小麦的D基因组中直系同源物基因座处的Sr33基因，赋予抗来自霉菌的不同病原体即小麦秆锈病-麦秆锈菌的抗性。先前的遗传研究将秆锈病R基因Sr31和SrR(现命名为Sr50)绘制在于渗入小麦的谷类黑麦染色体区段中发现的黑麦Mla相关基因成员的部分同源基因座(Mago等，2002)。可能的是，Sr33、Sr31和Sr50构成针对小麦秆锈病抗性的Mla样基因谱系的部分同源小组。
已显示由Sr33介导的广谱中等免疫能力不依赖于蛋白质伴侣HSP90、SGT1和RAR1而起作用。VIGS分析不能在小麦中区分改变的秆锈病抗性状态。当在酵母双杂交系统中共表达时，未检测到Sr33与这些蛋白质之间的相互作用。众所周知一个亚组的植物NB-LRR型R蛋白的适当功能依赖于这些伴侣蛋白。此类关联被认为促进相容性R蛋白的折叠、成熟和稳定性(Jordan等，2011)。数据表明Sr33不需要针对秆锈病抗性的细胞机构的这些组分的维持和/或来自所述组分的调控。
HvMLA10的CC结构域形成同源二聚体，一种对于该蛋白的细胞死亡信号传导能力是必需的属性(Maekawa等，2011)。此外，MLA10通过CC结构域界面与两个WRKY(WRKY1/2)转录因子直接相互作用(Shen等，2007)。另外，来自二倍体小麦一粒小麦的MLA1的CC结构域能够与HvWRKY1直接相互作用(Jordan等，2011)。这表明在蛋白质激活后，NB-LRR型R蛋白的CC结构域可能用作信号传导架构，起始和协调下游免疫应答。通过使用代表CC结构域的截短部分(CC1-125)、完整CC结构域(CC1-160)和CC-NB结构域(CC1-225)的3个Sr33CC结构域变体，本发明人不能在酵母中检测Sr33CC自我缔合。这表明Sr33CC二聚体在酵母中未形成或CC同二聚化不是所有CC型R蛋白的唯一特性。另外，Sr33CC结构域不与大麦或粗山羊草WRKY1/2相互作用。
来自保藏品种PI603225的单体型II中发现的单氨基酸变体Asp588Asn似乎不改变秆锈病抗性功能。在牵涉PI603225和原始Sr33供体的多个病原体分离株表型的等位基因性测试中，在后代中未获得易感植物，这为单体型I和II是均用作抗性等位基因的变体提供了进一步的支持。
本领域的技术人员应理解，可在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的前提下如在具体实施方案中所示的对本发明做出许多变型和/或修饰。因此，本实施方案在所有方面都将被视为示例性而非限制性。
本申请要求来自2013年6月6日提交的AU 2013902049(其完整内容通过引用整体并入本文)的优先权。
本文中论述和/或引用的所有出版物整体并入本文。
已被包含在本说明书中的文献、作用、材料、装置、物品等的任何论述只为了提供本发明的背景的目的。它不应被视为任何或所有这些事项形成现有技术基础的部分或为与本发明相关的领域中共同一般常识的承认，因为其在本申请的每一个权利要求的优先权日之前存在。
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Claims (7)

1.一种生产面粉的方法，所述方法包括；
i)从大麦或小麦植物获得谷粒，
ii)研磨谷粒，
iii)筛选研磨的谷粒，和
iv)回收面粉，
其中植物是转基因植物，其具有整合进其基因组的编码Sr33多肽的外源多核苷酸，并且其中所述Sr33多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中面粉是全麦面粉。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中植物是小麦植物。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中植物是大麦植物。
5.一种生产麦芽的方法，所述方法包括：
i)从大麦或小麦植物获得谷粒，
ii)浸泡谷粒，
iii)使浸泡的谷粒发芽，
iv)使发芽的谷粒干燥，和
v)回收麦芽，
其中植物是转基因植物，其具有整合进其基因组的编码Sr33多肽的外源多核苷酸，并且其中所述Sr33多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其中植物是小麦植物。
7.根据权利要求5所述的方法，其中植物是大麦植物。
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