UA127405C2

UA127405C2 - Ген стійкості до стеблової іржі

Info

Publication number: UA127405C2
Application number: UAA201807258A
Authority: UA
Inventors: Самбасівам Куппусамі Періаннан; Самбасивам Куппусами Перианнан; Пітер Норман Доддс; Питер Норман Доддс; Рохіт Маго; Рохит Маго; Еванс Лагудах; Эванс Лагудах
Original assignee: Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн; Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриел Рисерч Организейшн
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2023-08-16
Also published as: US11566258B2; CA3006872A1; WO2017091847A1; US20230257765A1; AU2016363108B2; EA037570B1; EA201891314A1; US20200270627A1; AU2016363108A1

Description

Винахід стосується трансгенної рослини, в геном якої інтегрують екзоненний полінуклеотид, що кодує поліпептид, який надає стійкості до однієї або декількох рас Риссіпіа дгатіпів ї. вр.

Іпсі, зокрема групи рас Шд9З9 Риссіпіа дгатіпів ї. вр.

Іісі.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ЯКОЇ СТОСУЄТЬСЯ ВИНАХІД

Даний винахід стосується трансгенної рослини, яка інтегрує в свій геном екзогенний полінуклеотид, що кодує поліпептид, який надає стійкості до однієї або декількох рас Риссіпіа дгатіпів, такої як група рас де99 Риссіпіа дгатіпів ТТ. 5р. їгйісі.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Грибковий патоген Риссіпіа дгатіпіє Регв.ї. 5р. ігйісі (РУ), збудник стеблової іржі пшениці, являє собою серйозну загрозу для виробництва пшениці, частково через рівень спустошення, який вона може нанести на врожай пшениці з майже повними втратами при тяжких епідеміях.

Незважаючи на те, що стійкі до іржі сорти контролювали хворобу протягом більше 40 років, поява в Уганді в 1999 році раси Раї ТТК5К, широко відомої як Шод99, і подальше поширення її похідних у інших частинах Африки і на Близькому Сході, підкреслила збереження небезпеки стеблової іржі. Шде9 і похідні штами є вірулентними для рослин, що містять ген стійкості до стеблової іржі 5г31, який раніше чинив ефективний опір протягом більше тридцяти років (ЕїЇіїб5 еї а!., 2014 року), а також багато інших загальних генів стійкості до стеблової іржі (5г) (Зіпоп еї аї., 2011). Нещодавня поява ще однієї раси Раї (яка відрізняється від лінії Шд99) в Німеччині і

Ефіопії в 2013-2014 роках, яка уражає важливі комерційні сорти пшениці, викликала ще більш серйозну стурбованість щодо виробництва пшениці. В той час як шляхом міжнародної співпраці під назвою «глобальна ініціатива Борлауга щодо боротьби з іржею» (ВОК) відтоді активно ведеться робота з розробки стратегії щодо боротьби зі стебловою іржею, зміни в глобальному кліматі і потепління можуть потенційно знайти додаткові ділянки для епідемій іржі, які раніше вважалися безпечними від стеблової іржі (Спакгаропу еї аї., 2011).

Контроль іржі пшениці залежить від включення ефективних генів стійкості під час вирощування та комбінації генів з множинною стійкістю до іржі грунтуються на забезпеченні тривалої стійкості, що потребує визначення нових генів стійкості. Дикі і культивовані споріднені форми пшениці надають важливий запас нових генів, ефективних проти патогенів іржі пшениці.

Жито посівне (зесаїе сегеає) є одним з таких джерел, і декілька генів жита використовуються для вирощування пшениці, стійкої до іржі і тритикале. Дійсно, ген стійкості 5г31 був інтрогресований з жита у вигляді повного заміщення 18 пшениці або транслокації короткого плеча хромосоми жита 1 (1К5) з сорту жита РеїКи5 (2ейПег, 1973) у довге плече пшениці хромосоми 18 (1ВІ) їі набував стійкості до стеблової іржі протягом більше 30 років в польових умовах (ЕЇЇї5 еї а!., 2014 року). 5150 (раніше відомий як 5гК) також інтрогресували в пшеницю у вигляді транслокацій 1К5 у довгі плечі хромосом 18 і 10 пшениці, але отримані з сорту жита

Ітрепіа! (Зперйега 1973 Мадо єї аї., 2004). Третій ген стійкості до іржі, також відомий як

ЗИ Н5Атіво, був інтрогресований у вигляді транслокації 125 з сорту жита Іпзаме у хромосому ТА пшениці в сорті Атідо (2еїег апа Рисп5, 1983). Оскільки ці гени жита надали стійкість до всіх відомих штамів Раї, незрозуміло, чи мають вони різні специфічності стійкості. Як 5гЗ31, так і 5г50 пов'язані з кластером генів на 15 (Мадо еї аї., 2004 і 2005), що кодують білки спірально закрученого нуклеотид-зв'язувального багатого на лейцин повтору (СС-МВ-І ЕК), ортологічні кластеру гена ячменю Міа, що забезпечує стійкість до Віштегіа дгатіпів ї. 5р. погаєї (збудник борошнистої роси) (Умеї еї аї., 1999 і 2002). Проте, невідомо, який з цих білків є продуктом самого гена 5150. Нещодавно клонований ген 5г33 з Тгйсит їаийивзспії (Регуаппап еї аї., 2013) є ортологом Міа, і, як ії 9г50, він забезпечує стійкість до ізолятів Родї у всьому світі, тому знову ж таки неможливо було розрізнити ці дві специфічності.

Локус ячменю Міа є одним з найрізноманітніших класів генів стійкості в злаках, що кодують більше 30 різних алелів з різними специфічностями стійкості до борошнистої роси у ячменю (Зеепої2ег еї аї., 2010). Цей локус також є потенційним джерелом корисної стійкості до хвороб у інших злаків, включаючи пшеницю. Наприклад, ген ТптМіа!1 пшениці, присутній в диплоїдних А- геномних різновидах пшениці Тгйісцит топососсит, є ортологом Міа і надає расоспецифічної стійкості до борошнистої роси пшениці (догдап еї аї., 2011). Нещодавно ідентифікований ген 9г33, перенесений в пшеницю з диплоїдних Ю-геномних видів Ае. їаизспії, є першим відомим членом сімейства Міа для забезпечення стійкості до Раї (Регіуаппап еї аї., 2013).

Існує нагальна потреба у визначенні генів, які надають, щонайменше, певний рівень стійкості рослинам, зокрема пшениці, проти Риссіпіа дгатіпі5, зокрема групи рас 0д99 Риссіпіа дгатіпів 7. 5р. їпсі.

СУТЬ ВИНАХОДУ

Автори винаходу визначили поліпептиди, які надають щонайменше, певний рівень стійкості рослинам, особливо житу і пшениці, проти Риссіпіа дгатіпієх, зокрема групи рас Оде99 Риссіпіа дгатіпів 7. 5р. їпсі.

Таким чином, в першому аспекті даний винахід передбачає наявність трансгенних рослин, 60 які інтегрують у свій геном екзогенний полінуклеотид, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Рибссіпіа дгатіпіх, де полінуклеотид функціонально зв'язаний з промотором, здатним спрямовувати експресію полінуклеотиду в клітину рослини.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, Риссіпіа дгатіпіє являє собою Риссіпіа дгатіпів т. 5р. ігйісі. У подальшому варіанті здійснення даного винаходу, Риссіпіа дгатіпів Т. 5р. їгйісі являє собою расу групи 0999.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу, трансгенні рослини мають підвищену стійкість до Риссіпіа дгатіпіє порівняно з ізогенною рослиною, позбавленою екзогенного полінуклеотиду.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид являє собою поліпептид 5г50.

У подальшому варіанті здійснення даного винаходу, ї) поліпептид містить в собі амінокислоти, що мають послідовність, передбачену у ЗЕО ІЮ

МО:1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 8295 ідентична 5ЕО ІЮ МО:1, і/або ії) полінуклеотид містить в собі нуклеотиди, які мають послідовність, передбачену в 5ЕО ІЮ

МО:10, або послідовність, яка на 8295 ідентична 5ЕО ІЮ МО:10, або послідовність, яка гібридизується з БЕО ІЮ МО:10.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид містить в собі один або декілька, переважно всі спірально закручені (СС) домени, нуклеотид-зв'язувальний (МВ) домен і домен повтору, багатого на лейцин (І ВК).

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу поліпептид містить в собі один або декілька, переважно всі, р-петльові мотиви і мотив кінази За в нуклеотид-зв'язувальному домені (МВ).

В одному варіанті здійснення даного винаходу, р-петльовий мотив містить в собі послідовність сххохОК(Т/5)ГТ (ЗЕО ІЮ МО:4), більш переважно послідовність СЕС КТ (ЗЕО ІЮО МО:5).

В одному варіанті здійснення даного винаходу, мотив кінази містить в собі послідовність

СхххххТХе (ЗЕО ІЮ МО:6), більш переважно послідовність З5ВІИТТТА (ЗЕО ІЮ МО:7).

У ще одному варіанті здійснення винаходу, домен повтору, багатого на лейцин (КК) містить в собі приблизно від 5 до приблизно 20 або від приблизно 10 до приблизно 20

Зо недосконалих повторів послідовності ххі хі хххх (ЗЕО ІЮ МО:8).

В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид надає більшої стійкості до раси

Риссіпіа дгатіпів Є. 5р. їгйісі ТТК5К, ніж 5г33 (з амінокислотною послідовністю, передбаченою в

ЗБО ІО МО: 13). В іншому варіанті здійснення даного винаходу, 5г33 (з амінокислотною послідовністю, передбаченою в 5ЕО ІЮ МО: 13), надає більшої стійкості до раси Риссіпіа дгатіпів ї. 5р. їгйісі ОБС5С, ніж поліпептид за даним винаходом. В одному варіанті здійснення даного винаходу, детально описаному в прикладі 2, більша стійкість визначається, коли поліпептид за даним винаходом знаходиться в лінії Т.аезіїмшт сЗаро 10І.1К5-ОЕ.А1 їі коли 5г33 знаходиться в лінії Т.аезіїмит Ууезіопіа/С5105405.

Переважно рослина являє собою злакову рослину. Приклади трансгенних злакових рослин за даним винаходом включають в себе, але не обмежуються ними, пшеницю, ячмінь, кукурудзу, рис, овес, сорго і тритикале. В особливо переважному варіанті здійснення даного винаходу рослина являє собою пшеницю.

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу, рослина містить в собі один або декілька додаткових екзогенних полінуклеотидів, що кодують інший поліпептид стійкості до патогенів рослин. Приклади таких інших поліпептидів стійкості до патогенів рослин включають в себе, але не обмежуються ними, І г34, 11, Їг3, І г2а, Ії гЗКа, 11, 113, 116,1 17,18, Її г21, В, 5135 і

Зг33. В одному варіанті здійснення даного винаходу, рослина, щонайменше, додатково містить в собі екзогенний полінуклеотид, що кодує поліпептид стійкості до патогенів рослин 5г33.

Наприклад, щонайменше, додатково міститься екзогенний полінуклеотид, який кодує

БО поліпептид, що містить амінокислоти, які мають послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 13 або

ЗБО ІЮ МО: 14, або амінокислотну послідовність яка щонайменше на 8795 ідентична, щонайменше, на 9095 ідентичні або, щонайменше, на 9595 ідентичні одному або двом з 5ЕО ІЮ

МО: 13 ії БЕО ІО МО: 14, що надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів.

Переважно рослина є гомозиготною відносно екзогенного полінуклеотиду.

У одному варіанті здійснення даного винаходу рослина росте в полі.

У подальшому аспекті даний винахід передбачає трансгенну рослину, яка інтегрує в свій геном екзогенний полінуклеотид, що кодує поліпептид, який містить в собі амінокислоти, що мають послідовність, передбачену в 5ЕО ІЮО МО: 1, або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 8295 ідентична 5ЕО ІО МО: 1, де полінуклеотид функціонально зв'язаний з бо промотором, здатним спрямовувати експресію полінуклеотиду в клітину рослини.

Також передбачається популяція щонайменше 100 трансгенних рослин за даним винаходом, що ростуть в полі.

У подальшому аспекті даний винахід передбачає спосіб визначення полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпіб5, що включає в себе: ї) отримання полінуклеотиду, функціонально зв'язаного з промотором, полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який містить в собі амінокислоти, що мають послідовність, передбачену в

ЗБО ІЮ МО:1, її біологічно активного фрагмента, або амінокислотної послідовності, яка щонайменше на 8295 ідентична 5ЕО ІЮ МО:1, і) введення полінуклеотиду в рослину, ії) визначення, чи рівень стійкості до Риссіпіа дгатіпіх є зміненим відносно ізогенної рослини, позбавленої полінуклеотиду, і їм) необов'язково, вибір полінуклеотиду, який при експресії надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів.

У одному варіанті здійснення даного винаходу спосіб має один або декілька наступних аспектів, а) полінуклеотид містить в собі нуклеотиди, які мають послідовність, передбачену в ЗЕО ІЮ

МО:10, або послідовність, яка щонайменше на 8295 ідентична ЗЕО ІЮО МО:10, або послідовність, яка гібридизується з ЗЕО ІЮ МО:10, р) рослина являє собою злакову рослину, таку як пшениця, с) поліпептид являє собою поліпептид рослини або її мутант, і а) стадія ії) додатково включає в себе стійку інтеграцію полінуклеотиду, функціонально зв'язаного з промотором у геном рослини.

Також передбачається по суті очищений і/або рекомбінантний поліпептид стійкості рослини до Риссіпіа дгатіпів.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид містить в собі амінокислоти, які мають послідовність, передбачену в 5ЕО ІЮ МО:1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 8295 ідентична, щонайменше на 90905 ідентична, або щонайменше на 9595 ідентична 5ЕО ІЮ МО:1.

Зо У подальшому аспекті, даний винахід передбачає по суті очищений і/або рекомбінантний поліпептид з вмістом амінокислот, що мають послідовність, передбачену в 5ЕО ІЮО МО, або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 8295 ідентична, щонайменше на 9095 ідентична або щонайменше на 9595 ідентична 5ЕО ІЮ МО:1.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид за даним винаходом є злитим білком, який додатково містить в собі щонайменше одну іншу поліпептидну послідовність.

Щонайменше один інший поліпептид може бути, наприклад, поліпептидом, який підвищує стійкість поліпептиду за даним винаходом або поліпептид, який сприяє очищенню або виявленню злитого білка.

У ще одному аспекті даний винахід передбачає виділений і/або екзогенний полінуклеотид, який містить в собі нуклеотиди, що мають послідовність, передбачену в ЗЕО ІЮ МО:10, або послідовність, яка щонайменше на 8295 ідентична ЗЕО ІЮ МО:10, або послідовність, що кодує поліпептид за даним винаходом або послідовність, що гібридизується з 5ЕО ІЮ МО:10.

У іншому аспекті, даний винахід передбачає химерний вектор, що містить в собі полінуклеотид за даним винаходом.

Переважно, полінуклеотид функціонально зв'язаний з промотором.

У подальшому аспекті, даний винахід передбачає рекомбінантну клітину з вмістом екзогенного полінуклеотиду за даним винаходом і/або вектора за даним винаходом.

Клітиною може бути будь-який тип клітин, зокрема, але не обмежуючись ними, рослинна клітина, бактеріальна клітина, тваринна клітина або дріжджова клітина.

Переважно, клітина є рослинною клітиною. Більш переважно, рослинна клітина є рослинною клітиною злаків. Ще більш переважно, рослинною клітиною злаків є клітина пшениці.

У подальшому аспекті, даний винахід передбачає спосіб отримання поліпептиду за даним винаходом, причому спосіб включає в себе експресію в клітині або систему безклітинної експресії полінуклеотиду за даним винаходом.

Переважно, спосіб додатково включає виділення поліпептиду.

У ще одному аспекті, даний винахід передбачає трансгенний нелюдський організм з вмістом екзогенного полінуклеотиду за даним винаходом, вектор за даним винаходом і/або рекомбінантну клітину за даним винаходом.

Переважно, трансгенним нелюдським організмом є рослина. Переважно, рослина є бо злаковою рослиною. Більш переважно, злаковою рослиною є пшениця.

В іншому аспекті даний винахід передбачає спосіб отримання клітини за даним винаходом, причому спосіб включає в себе стадію введення полінуклеотиду за даним винаходом або вектора за даним винаходом у клітину.

Переважно, клітина є рослинною клітиною.

У подальшому аспекті даний винахід передбачає спосіб отримання трансгенної рослини за даним винаходом, причому спосіб включає в себе стадії її введення полінуклеотиду за даним винаходом і/або вектора за даним винаходом у рослину, і) відновлення трансгенної рослини з клітини, і ії) необов'язкове збирання насіння рослини і/або їм) необов'язкове отримання однієї або декілька потомствених рослин з трансгенної рослини, тим самим отримуючи трансгенну рослину.

У подальшому аспекті, даний винахід передбачує спосіб отримання рослини, яка інтегрує у свій геном полінуклеотид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпі5, причому спосіб включає в себе стадії: її схрещування двох батьківських рослин, де щонайменше одна рослина містить в собі полінуклеотид, який кодує поліпептид, що надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів, ії) дослідження однієї або декількох потомствених рослин, отриманих на основі схрещування, на наявність або відсутність полінуклеотиду, і ії) вибір потомственої рослини з вмістом полінуклеотиду, тим самим отримуючи рослину.

В одному варіанті здійснення даного винаходу щонайменше одна з батьківських рослин є трансгенною рослиною за даним винаходом і вибрана потомствена рослина містить в собі екзогенний полінуклеотид, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів.

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу, щонайменше одна з батьківських рослин є тетрапаплоїдною або гексапаплоїдною пшеницею.

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу, стадія ії) включає в себе аналіз зразків з вмістом ДНК рослини на полінуклеотид.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу, стадія її) включає в себе ї) вибір потомствених рослин, які є гомозиготними відносно полінуклеотиду, і/або ії) аналіз рослини або її однієї або декількох потомствених рослин на стійкість до Риссіпіа дгатіпів.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, спосіб додатково включає в себе ім) зворотне схрещування потомства, отриманого шляхом схрещування на стадії ї) за допомогою рослин такого самого генотипу як першої батьківського рослини, позбавленої полінуклеотиду, який кодує поліпептид, що надає стійкості до Риссіпіа дгатіпіє достатню кількість разів для отримання рослини переважно генотипу першої батьківської рослини, але з вмістом полінуклеотиду, і їм) вибір потомственої рослини, яка має стійкість до Риссіпіа дгатіпів.

У ще одному аспекті спосіб за даним винаходом додатково містить в собі етап аналізу рослини на наявність щонайменше одного іншого генетичного маркера.

Також передбачена рослина, отримана в спосіб за даним винаходом.

У іншому аспекті, даний винахід передбачає застосування полінуклеотиду за даним винаходом або вектора за даним винаходом для отримання рекомбінантної клітини і/або трансгенної рослини.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, трансгенна рослина підвищила стійкість до

Риссіпіа дгатіпіх порівняно з ізогенною рослиною, позбавленою екзогенного полінуклеотиду і/або вектора.

У подальшому аспекті даний винахід передбачає спосіб визначення рослини з вмістом полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який надає стійкості Риссіпіа дгатіпіх5, причому спосіб

БО включає в себе стадії ї) отримання зразка нуклеїнової кислоти з рослини, і ії) дослідження зразка на наявність або відсутність полінуклеотиду, де наявність полінуклеотиду свідчить про те, що рослина стійка до Риссіпіа дгатіпів.

У одному варіанті здійснення даного винаходу, полінуклеотид кодує поліпептид за даним винаходом.

У подальшому варіанті здійснення даного винаходу, спосіб передбачає визначення трансгенної рослини за даним винаходом.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу, спосіб додатково включає в себе отримання рослини з насіння до стадії і). бо Також передбачена частина рослини за даним винаходом.

У одному варіанті, частиною рослини є насіння з вмістом екзогенного полінуклеотиду, який кодує поліпептид, що надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів.

У подальшому аспекті, даний винахід передбачає спосіб отримання частини рослини, причому спосіб включає в себе а) вирощування рослини за даним винаходом, і р) збирання частини рослини.

У іншому аспекті, даний винахід передбачає спосіб виготовлення борошна, непросіяного борошна, крохмалю або іншого продукту, отриманого з насіння, причому спосіб включає в себе а) отримання насіння за даним винаходом, і

БЮ) отримання борошна, непросіяного борошна, крохмалю або іншого продукту.

У подальшому аспекті, даний винахід передбачає наявність продукту, отриманого з рослини за даним винаходом і/або частину рослини за даним винаходом.

В одному варіанті здійснення винаходу частина рослини являє собою насіння.

В одному варіанті здійснення винаходу, продукт являє собою харчовий продукт або питний продукт. Приклади включають в себе, але не обмежуються ними: ї харчовий продукт, який вибирають з групи, що складається з: борошна, крохмалю, квасного або прісного хліба, макаронів, локшини, корму для тварин, злакових продуктів для сніданку, закусок, тортів, солоду, пива, борошняних кондитерських виробів та харчових продуктів з вмістом борошняних соусів, або ії) питний продукт, який являє собою пиво або солод.

В альтернативному варіанті здійснення даного винаходу, продукт є нехарчовим продуктом.

Приклади включають в себе, але не обмежуються ними, плівки, покриття, клейкі речовини, будівельні матеріали та пакувальні матеріали.

У подальшому аспекті, даний винахід передбачає спосіб приготування харчового продукту за даним винаходом, причому спосіб включає в себе змішування насіння або борошна, непросіяного борошна або крохмалю з насіння, з іншим харчовим інгредієнтом.

В іншому аспекті, даний винахід передбачає спосіб приготування солоду, що включає в себе стадію проростання насіння за даним винаходом.

Також передбачається застосування рослини за даним винаходом або її частини як корм для тварин або для отримання корму для споживання твариною або харчового продукту для споживання людиною.

У подальшому аспекті, даний винахід передбачає композицію, яка містить в собі один або декілька поліпептидів за даним винаходом, полінуклеотид за даним винаходом, вектор за даним винаходом або рекомбінантна клітина за даним винаходом, і один або декілька прийнятних носіїв.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу визначення сполуки, яка зв'язується з поліпептидом, що містить амінокислоти, які мають послідовність, передбачену в ЗЕО ІО МО. 1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 8295 ідентична 5ЕО ІО МО : 1, причому спосіб включає в себе: ї) контактування поліпептиду зі сполукою-кандидатом, і і) визначення, чи сполука зв'язується з поліпептидом.

Будь-який варіант, зазначений в даному документі, має передбачати застосування тиїаїі5 тшиапаї5 до будь-якого іншого варіанта, якщо спеціально не зазначено інше.

Обсяг даного винаходу не має обмежуватися окремими варіантами його здійснення, описаними в даному документі, які наведені лише як приклади. Функціонально еквівалентні продукти, композиції та способи звісно входять до обсягу даного винаходу, як описується в даному документі.

У даному описі, якщо спеціально не зазначено інше, або якщо контекст не вимагає іншого, посилання на одну стадію, композицію, групу стадій або групу композицій слід розуміти як таке, що охоплює одну або множину (наприклад одну або більше) таких стадій, хімічних композицій, груп стадій або груп хімічних композицій.

Далі йде опис винаходу на основі наступних необмежувальних прикладів та з посиланням на супроводжувальні фігури.

КОРОТКИЙ ОПИС СУПРОВОДЖУВАЛЬНИХ КРЕСЛЕНЬ

Фігура 1. Виділення клонів ДНК фага лямбда з локусу 5г50. Авторадіограф показує гібридизацію міченого РЗ32 зонда В7б з обробленими Ога! лямбда-клонами 4, 5, 8, 11, 12і 181 геномною ДНК пшениці баро 18ВІ.1К5. Ділянка, очищена гелем, що застосовується для утворення бібліотеки геномної ДНК лямбда, вказана на смузі саро1ВІ 125 в пунктирній частині з фрагментами, відсутніми у делеційних мутантів, позначених стрілками. бо Фігура 2. Схематичне зображення контигу ВАС на локусі 5г50. Показана схема п'яти перекривних клонів ВАС, що охоплюють делецію (пунктирна лінія) у мутанті М2. Кінцеві послідовності ВАС в межах делеції не були присутні в М2, а кінцеві послідовності ВАС за межами делеції присутні в М2. Відносні положення членів сімейства генів ЗСКОА1-А-О і передбаченого гена інгібітору хімотрипсину (ЗСсСІ2) показані в п'яти клонах ВАС. Показано, що

ЗеВОАТ1-А є геном 5150, як описується в даному документі.

Фігура 3. Структура гена 5г50. На фігурі показано схематичне зображення структури гена

Зг50 (5СВИАТ1-А), що включає в себе 5 і 3' ОТЕ, розміри інтронів та екзонів (в парах основ, Бр) і положення мутацій у мутантів М7 ії М13. Також показані відносні положення доменів СС, МВ і

ЇКК в поліпептиді 550 і положення праймерів 5рЕЗ ї 5рК2 для ампліфікації ділянки, що включає в себе стартовий кодон трансляції.

Фігура 4. Філогенетичний зв'язок 5г50 і споріднених білків СС-МВ-ЇКК сімейства Міа.

Філогенетичне дерево, побудоване за допомогою найближчих сусідів було отримане з передбачених амінокислотних послідовностей генів ЗСКСАТ з 5.сегеаіє, відомих функціональних МІ А-членів сімейства ячменю (НУМІ А), ТпМГА з Т. топососсит, 5г33, 5г35 і поліпептидів стійкості до іржі листя Г1, 10 її І к21.

КЛЮЧ ДО ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕО І МО:1 - Амінокислотна послідовність поліпептиду стійкості до стеблової іржі (Зг50).

ЗЕО І0 МО2 - Амінокислотна послідовність варіанта 5г50 від Свалофса Отелло та

Фронтьєра.

ЗЕО ІЮ МО:З - Амінокислотна послідовність варіанта 5г50 від Дворфа Петкуса.

ЗЕО І МО:4 - Консенсусний р-петльовий мотив.

ЗЕО ІО МО:5 - р-петльовий мотив поліпептиду, зазначеного як ЗЕО ІЮ МО:1.

ЗЕО І МО:6 - Консенсусний мотив кінази За.

ЗЕО ІО МО:7 - Мотив кінази За поліпептиду, зазначеного як ЗЕО ІЮ МО:1.

ЗЕО І МО:8 - Консенсусний повтор домену повторів, багатих на лейцин (І КК).

ЗЕО ІЮ МО:9 - Нуклеотидна послідовність КДНК, що кодує поліпептид стійкості до стеблової іржі (5г50).

ЗЕО ІО МО:10 - Нуклеотидна послідовність відкритої рамки зчитування, що кодує поліпептид стійкості до стеблової іржі (5150).

Зо ЗЕО ІО МО:11 - Нуклеотидна послідовність експресуючої конструкції рМесМео5г50.

ЗЕО ІЮ МО:12 - Нуклеотидна послідовність експресуючої конструкції рМесВаг5г50.

ЗЕО ІЮ МО:13 - Амінокислотна послідовність поліпептиду стійкості до стеблової іржі (від гаплотипу І) (5г33).

ЗЕО ІЮ МО:14 - Амінокислотна послідовність алельного варіанта поліпептиду стійкості до стеблової іржі, зазначена як ЗЕО ІЮ МО:13 (від гаплотипу ІЇ) (5г33).

ЗЕО ІЮ МО:15 - Функціональний сигнал ядерного експорту МЕЗ від Кеу. НІМ

ЗЕО ІЮ МО:16 - Нефункціональний сигнал ядерного експорту.

ЗЕО І МО 17 - 59 - Олігонуклеотидні праймери.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Загальні методи та визначення

Якщо спеціально не визначено інше, всі технічні та наукові терміни, які в вживаються даному документі, мають таке саме значення, що зазвичай розуміє фахівець в даній галузі (наприклад, в галузі культури клітин, молекулярної генетики, молекулярної біології рослин, хімії білків і біохімії).

Якщо не зазначено інше, рекомбінантний білок, культура клітин та імунологічні методи, що застосовуються в даному винаході, є стандартними процедурами, добре відомими фахівцям в даній галузі техніки. Такі методи описуються і пояснюються в таких джерелах, як 9. Реграї, А

Ргасіїса! Сіціде то МоїІесшіаг Сіопіпду, дуойп УМіПеу апа оп (1984), У. ЗатрбгоокК еї аї., МоіІесшаг

Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї, Соїа 5ргіпд Нагроиг І арогафогу Ргезз (1989), Т.А. Вгом/п (редактор),

Еззепійа! Моїієсшіаг Віоіоду: А Ргасіїса! Арргоасі, МоЇштез 1 апа 2, ІВІ. Ргевз (1991), О.М. Спіомег апа В.О. Натез (редактори), ОМА Сіопіпд: А Ргасіїса! Арргоасі, Моїштез 1-4, ІВ! Ргезз (1995 апа 1996), апа Е.М. А!,Єзибеї еї а. (редактори), Сигтепі Ргоїосої5 іп МоїІесшціаг Віоіоду, сгеепе Риб.

Авзосіаїе5 апа Ум Пеу-Іпівег5сіепсе (1988, включаючи всі нові редакції дотепер), Ед Нагіом апа

Вамій І апе (редактори) Апііродієв: А І арогаїгу Мапиаї, Соїй 5ргіпд Нагброиг І арогайогу, (1988), апа У.Е. Соїїдап еї а. (редактори) Сигтепі Ргоїосої!5 іп Іттипоїіоду, допп Умієу 8 5оп5 (включаючи всі нові редакції дотепер).

Термін "і/або", наприклад, "Х і/або У" слід розуміти як "Х та У'або "Х або У" для надання чіткої підтримки обом значенням або одному зі значень.

Термін «приблизно», що вживається в даному документі, якщо не зазначено інше, 60 стосується ж/- 1095, більш переважно ж/- 595, більш переважно ж/- 195, більш переважно ж/- б

0,595, від вказаного значення.

У цьому описі слово «включати в себе/містити в собі» або варіанти, такі як «включає в себе/містить в собі» або «який включає в себе/містить в собі» слід розуміти як таке, що має на увазі включення зазначеного елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але без виключення будь-якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.

Стеблова іржа

Термін «стеблова іржа», що вживається в даному документі, стосується захворювання рослин, викликаного Риссіпіа дгатіпіх, або збудника патогенних грибів Риссіпіа дгатіпіб, як це визначає контекст. Термін «стеблова іржа пшениці» стосується захворювання рослин, викликаного Риссіпіа дгатіпів т. 5р. їгйісі або збудником патогенних грибів Риссіпіа дгатіпів ї. 5р. їгйісі, як визначає контекст.

Група 0999 рас стеблової іржі пшениці (Риссіпіа дгатіпіє ї. 5р. ігйісі) (також відома як «ТТК5ЗК» в північноамериканської номенклатурної системі) є добре відомим патогенним грибом пшениці і зазвичай присутнім на пшеничних полях в країнах Африки і Близького сходу (5іпдп еї аІ.,, 2011 року; Нодзоп еї аї., 2012). Шд999 може спричинити великі втрати врожаю і є вірулентним проти генів стійкості, які раніше захищали пшеницю від стеблової іржі. На даний момент існують вісім відомих варіантів групи Цде9, які тісно пов'язані на основі аналізу маркерів ДНК. Кожний варіант патогену, який відрізняється своїм профілем вірулентності/авірулентності на панелі рослин пшениці, кожна з яких містить інший ген К резистентності, відомий як «раса» збудника.

Ізоляти в групі Шд99 є тісно пов'язаними і, як вважається, вони походять від спільного потомка, але можуть відрізнятися за своїми профілями вірулентності/авірулентності, і в цьому випадку вони вважаються різними расами. Сім з цих восьми варіантів зведені в таблиці 2 від 5іпди зі співавторами (2011). В одному з варіантів здійснення даного винаходу група рас стеблової іржі 999 проявляє вірулентність відносно рослин пшениці, що містять в собі один або декілька генів стійкості 5Г31, 5г21, 5124 і 536 (5іпоп еї аї., 2011). В одному варіанті здійснення даного винаходу група, група рас стеблової іржі Шудщ99 Риссіпіа дгатіпів ї. 5р. ігйісі має вірулентність, щонайменше, відносно рослин пшениці, що містить ген стійкості 5Гг31 (Ргефогіцйз еї аї., 2000).

Поліпептиди/Пептиди

Винахід стосується поліпептидів, які надають стійкості рослині, наприклад, пшениці, до стеблової іржі, переважно до стеблової іржі пшениці, такої як група рас Шде99. У переважному варіанті здійснення даного винаходу поліпептид кодується аллелем або варіантом гена 5г50, який надає стійкості до стеблової іржі пшениці. Приклади таких поліпептидів включають в себе, але не обмежуються ними, поліпептиди, які містять в собі амінокислотну послідовність, передбачену в 5ЕО ІЮ МО: 1. Поліпептид за даним винаходом надає підвищеної стійкості до стеблової іржі, переважно стеблової іржі пшениці, такої як група рас Од99 Риссіпіа дгатіпізв 7. 5р. їгйісі порівняно з ізогенною рослиною, позбавленою гена, що кодує поліпептид. Цей термін також стосується природно отриманого білка (або білка дикого типу, з якого отриманий мутантний білок), який кодується геном, наданим рослині (наприклад, пшениці), при вирощуванні в звичайних польових умовах, підвищеної стійкості до стеблової іржі такої як група рас Цд999 Риссіпіа дгатіпів Її. 5р. їгйісі. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид за даним винаходом надає стійкості зокрема до стеблової іржі, переважно зокрема до стеблової іржі пшениці, більш переважно він не надає стійкості до іржі листя пшениці, викликаної патогенним грибом Риссіпіа ігйісіпа і/або борошнистою росою. У цьому контексті «зокрема, до стеблової іржі» і «зокрема до стеблової іржі пшениці» означає, що надана стійкість переважно стосується стеблової іржі або стеблової іржі пшениці порівняно з іншим патогенним грибом тих самих видів рослин, переважно багатьма або більшістю інших патогенних грибів тих самих видів. У більш переважному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид за даним винаходом надає стійкості до стеблової іржі і щонайменше до двох або всім трьох видів іржі: іржі листя, жовтої іржі і борошнистої роси, переважно пшениці. В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептиди за даним винаходом не кодуються геном 5г35 рослини пшениці.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептиди за даним винаходом не кодуються геном 5г35 рослини пшениці або його гомологами, такими як ті, які щонайменше на 5095 ідентичні за амінокислотною послідовністю до поліпептиду 5г35. В іншому варіанті здійснення даного винаходу, поліпептиди за даним винаходом не кодуються геном 51/33 рослини пшениці.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептиди за даним винаходом не кодуються геном 5г33 рослини пшениці або його гомологами, такими як ті, які щонайменше на 8795 ідентичні за амінокислотною послідовністю до поліпептиду 5Гг33, як описано в УМО 2014/000594 (ЗЕО ІЮ МО 13 ї 14 в даному документі). Таким чином, в одному варіанті здійснення даного 60 винаходу, поліпептид за даним винаходом не містить в собі амінокислоти, що мають послідовність, щонайменше, на 8795 ідентичну за амінокислотною послідовністю до ЗЕО ІЮ МО: 13 і/або 5ЕО ІЮ МО: 14. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид за даним винаходом має амінокислотну послідовність, яка більш тісно пов'язана (має вищий рівень ідентичності) з ФЕО ІЮ МО: 1, ніж ЗЕО ІЮО МО: 13 і/або 14.

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу, при експресії в трансгенній рослині, зараженій стебловою іржею, наприклад, расою ЦОд99 Риссіпіа дгатіпіє ї. 5р. їгйісі, клітини рослини проявляють незначні ознаки (у разі їхньої наявності) загибелі клітин (аутофлуоресценція), наприклад, порівняно з ізогенною рослиною, що експресує 5145.

Поліпептиди за даним винаходом зазвичай містять спірально закручений домен (СС) в напрямку М-кінця, за яким іде нуклеотид-зв'язувальний (МВ) домен і домен повтору, багатого на лейцин (І КК) в напрямку С-кінця (див. Фігуру 3). Кожен з цих трьох типів доменів є спільним в поліпептидах, які надають стійкості до патогенів рослин. Крім того, поліпептиди, що містять в собі СС-МВ-ГЕЕ, являють собою відомий великий клас поліпептидів, які як клас надають стійкості до різних видів патогенів рослин (див., наприклад, ВиїдагеїЇї еї аї!., 2010; МеНаїгйе еї аї., 2006, Таккеп еї аї.,, 2006; М/апд еї аї.,, 2011 року; Сеппаго еї аї., 2009; ОіїБігіїді еї аї!., 2003), незважаючи на те, що кожен поліпептид СС-МВ-Ї КК специфічний для конкретного виду або підвиду патогену. Відповідно, шляхом вирівнювання поліпептидів за даним винаходом з іншими поліпептидами СС-МВ-І ЕК в поєднанні з великою кількістю досліджень цих типів білків, а також спірально закручених доменів (СС), нуклеотид-зв'язувальних доменів (МВ) і доменів повтору, багатого на лейцин (ІЕЕ), фахівець в даній галузі винаходу має значну кількість способів з розробки функціональних варіантів конкретних поліпептидів, наведених в даному документі.

Спірально закручений домен або мотив являє собою структурний мотив, який є однією з найпоширеніших третинних структур білків, де а-спіралі закручені разом як мотузкові нитки.

Були розроблені комп'ютерні програми для виявлення гептад і створення спірально закручених структур (див., наприклад, ОеїІогеплі апа 5реєа, 2002). Спірально закручені котушки зазвичай містять повторну модель пххпсхс гідрофобних (ПІ) і заряджених (с) амінокислотних залишків, що називаються гептадними повторами. Положення в гептадному повторі зазвичай позначаються як абсдег, де а і а - це гідрофобні положення, які часто займає ізолейцин, аланін, лейцин або валін. Укладання білка з гептадами в а-спіральну вторинну структуру призводить до того, що

Зо гідрофобні залишки приймають форму «смуги», яка легко закручується проти годинникової стрілки, утворюючи амфіпатичну структуру.

Нуклеотид-зв'язувальний домен (МВ) присутній в генах стійкості, а також в деяких кіназах, таких як АТФ/ГТФф-зв'язувальні білки. Цей домен зазвичай містить в собі три мотиви: кіназу-їа (р-петля), кіназу-2 і передбачувану кіназу-За (Тгацйі 1994; Татеїйпо еї аї., 2002). Консенсусна послідовність сххОохХоОК (Т/5)Т (ЗЕО ІЮО МО: 4) (СРО ОК (5ЕО ІО МО: 5) в поліпептиді, яка надає стійкості до Риссіпіа дгатіпі5, представленому як 5ЕО ІЮ МО: 1), і хххххТхХК (ЗЕО ІЮ МО: 6) (З5КІІТТТК (5ЕБО ІО МО: 7) в поліпептиді, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів, представленому як ЗЕО ІЮ МО: 1) для мотивів гена стійкості р-петлі, кінази-2 і передбачуваної кінази-За, що, відповідно, відрізняються від тих, які присутні в інших білках, які кодують МВ.

Іншими мотивами, присутніми в МВ-домені генів стійкості типу МВ/Л КК, є СГ РІ, КЕМВ5-О і МНО (Меуєгз: еї аї!., 1999). Послідовності, які розсіюють ці мотиви і домени, можуть бути дуже різними навіть серед гомологів гена стійкості (Міспеї!тоге апа Меуег5, 1998; Рап еї аї., 2000).

Домен, багатий на лейцин, являє собою структурний мотив білка, який утворює укладку а/В підкови (ЕпКпбБауаг еї аї., 2004). Домен І ЕК містить в собі 9-41 недосконалих повторів, кожен з яких має довжину приблизно 25 амінокислот з консенсусною амінокислотною послідовністю

ХХІ хі хххх (ЗЕО ІЮ МО: 8) (Сооіеу єї аї., 2000). В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид за даним винаходом містить приблизно від 10 до приблизно 20, більш переважно приблизно від 12 до приблизно 18, більш переважно приблизно 15 повторів, багатих на лейцин.

Ці повтори зазвичай укладаються разом для утворення соленоїдного білкового домена. Як правило, кожна одиниця повтору має структуру бета-лист-поворот-альфа-спіраль, а зібраний домен, що складається з множини таких повторів, має форму підкови з внутрішнім паралельним бета-листом і зовнішнім масивом спіралей.

В одному варіанті здійснення даного винаходу поліпептид містить одну, дві, три, чотири або більше амінокислоти, які присутні в амінокислотній послідовності, представленій як ЗЕО ІЮ МО: 1, але які не виявлені у відповідному положенні амінокислоти поліпептиду, що містить амінокислоти, які мають послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 13 і ЗЕО ІЮ МО: 14.

В одному варіанті здійснення винаходу, поліпептид не містить амінокислоти, що мають послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 1 або 5ЕО ІЮО МО: 2, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 8795 ідентична одній або обом з 60 наступних послідовностей ЗЕО ІЮО МО: 13 ї БЕО ІЮО МО: 14. В одному варіанті здійснення даного винаходу, поліпептид не містить амінокислоти, що мають послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ

МО: 13 або ЗЕО ІЮ МО: 14.

В одному варіанті здійснення винаходу, поліпептид отриманий з 5. сегеа!е.

Термін «резистентність», що вживається в даному документі, є відносним терміном в тому, що присутність поліпептиду за даним винаходом (ї) зменшує симптоми хвороби рослини, що містить ген (ген К), який надає стійкості порівняно з рослиною, позбавленою гена К, і/або (ії) зменшує розмноження або поширення патогенів на рослині, що містить ген К. Стійкість, про яку йдеться в даному документі, стосується «чутливої» реакції рослини на той самий патоген. Як правило, присутність гена К покращує щонайменше одну продуктивну ознаку рослини, що містить ген К, при зараженні патогеном, таку як вихід зерна, порівняно з ізогенною рослиною, зараженою патогеном, але позбавленою гена К. Ізогенна рослина може мати певний рівень стійкості до патогену або може бути розцінена як сприйнятлива. Таким чином, терміни «стійкість» і «підвищена стійкість» зазвичай вживаються в даному документі взаємозамінно.

Крім того, поліпептид за даним винаходом не обов'язково надає повну стійкість до патогенів, наприклад, коли досі виникають деякі симптоми або спостерігається певне розмноження патогенів при заражені, але у зменшеній кількості. Підвищена стійкість може визначатися за допомогою низки способів, відомих в даній галузі техніки, таких як аналіз рослин на кількість патогенів і/або аналіз росту рослин або кількість пошкоджень або симптомів хвороби відносно рослини за наявності патогену і порівняння одного або декількох цих параметрів з ізогенною рослиною, позбавленою екзогенного гена, що кодує поліпептид за даним винаходом.

Під «по суті очищеним поліпептидом» або «очищеним поліпептидом» ми розуміємо поліпептид, який зазвичай відокремлюється від ліпідів, нуклеїнових кислот, інших пептидів та інших заражувальних молекул, з якими він пов'язаний в своєму природному стані. Переважно, по суті, очищений поліпептид щонайменше на 9095 вільний від інших компонентів, з якими він природно пов'язаний.

Трансгенні рослини і клітини-хазяї за даним винаходом можуть містити екзогенний полінуклеотид, що кодує поліпептид за даним винаходом. В таких випадках рослини і клітини продукують рекомбінантний поліпептид. Термін «рекомбінантний» в контексті поліпептиду стосується поліпептиду, який кодується екзогенним полінуклеотидом, коли він продукується

Зо клітиною, причому полінуклеотид вводиться в клітину або клітину-попередник за допомогою методів рекомбінантної ДНК або РНК, таких як, наприклад, трансформація. Як правило, клітина містить в собі неендогенний ген, який викликає зміну кількості поліпептидів, що продукуються. В одному варіанті здійснення даного винаходу, «рекомбінантний поліпептид» являє собою поліпептид, отриманий шляхом експресії екзогенного (рекомбінантного) полінуклеотида в рослинній клітині.

Терміни "поліпептид" і "білок" загалом вживаються взаємозамінно.

Ідентичність поліпептиду у відсотках визначається за допомогою САР-аналізу (МееаІетап апа М/ипзсп, 1970) (програма ОСС) зі штрафом за створення гепу -5, і штрафом за подовження гепу -0,3. Довжина запитуваної послідовності становить щонайменше 150 амінокислот, та сАР- аналіз вирівнює дві послідовності в ділянці щонайменше 150 амінокислот. Більш переважно, довжина запитуваної послідовності становить щонайменше 500 амінокислот, та сАР-аналіз вирівнює дві послідовності в ділянці щонайменше 500 амінокислот. Більш переважно, довжина запитуваної послідовності становить щонайменше 750 амінокислот та САР-аналіз вирівнює дві послідовності в ділянці щонайменше 750 амінокислот. Ще більш переважно, довжина запитуваної послідовності становить щонайменше 900 амінокислот та САР-аналіз вирівнює дві послідовності в ділянці щонайменше 900 амінокислот. Ще більш переважно, САР-аналіз вирівнює дві послідовності по всій їхній довжині.

Термін «біологічно активний» фрагмент, що вживається в даному документі, являє собою частину поліпептиду за даним винаходом, який підтримує певну активність повнорозмірного поліпептиду, такого як поліпептид, який при експресії в рослині, такій як пшениця, надає (підвищеної) стійкості до стеблової іржі, переважно стеблової іржі пшениці, такої як група раси

Ц999 Риссіпіа дгатіпів 7. 5р. їгйісі порівняно з ізогенною рослиною, яка не експресує поліпептид.

Біологічно активні фрагменти можуть бути будь-якого розміру доти, доки вони підтримують певну активність, але переважно містять щонайменше 750 або щонайменше 900 амінокислотних залишків. Переважно біологічно активний фрагмент містить щонайменше 1095, щонайменше 5095, щонайменше 7595 або щонайменше 9095 активності повнорозмірного білка.

Що стосується визначеного поліпептиду, слід врахувати, що показники ідентичності у відсотковому співвідношенні, що перевищують показники зазначені вище, належать до переважних варіантів здійснення даного винаходу. Таким чином, в застосовних випадках, з бо урахуванням мінімальних показників ідентичності у відсотковому співвідношенні, бажано, щоб поліпептид містив амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 6095, більш переважно щонайменше на 6595, більш переважно щонайменше на 7095, більш переважно, щонайменше на 7595, більш переважно щонайменше на 7695, більш переважно щонайменше на 8095, більш переважно щонайменше на 8595, більш переважно щонайменше на 9095, більш переважно щонайменше на 9195, більш переважно щонайменше на 9295, більш переважно щонайменше на 9395, більш переважно щонайменше на 9495, більш переважно щонайменше на 9595, більш переважно щонайменше на 9695, більш переважно щонайменше на 9795, більш переважно щонайменше на 9895, більш переважно щонайменше на 9995, більш переважно щонайменше на 99,195, ще більш переважно щонайменше на 99,295, ще більш переважно щонайменше на 99,395, ще більш переважно щонайменше на 99,495, більш переважно щонайменше на 99,595, більш переважно щонайменше на 99,695, ще більш переважно щонайменше на 99,795, ще більш переважно щонайменше на 99,895 і ще більш переважно щонайменше на 99,995 ідентичні відповідній призначеній 5ЕО ІЮ МО.

Мутанти амінокислотної послідовності поліпептидів за даним винаходом можуть бути отримані шляхом внесення відповідних нуклеотидних змін до нуклеїнових кислот за даним винаходом або шляхом синтезу іп міго бажаного поліпептиду. Такі мутанти включають в себе, наприклад, делеції, вставки або заміщення залишків в амінокислотній послідовності. Може бути здійснено поєднання делееції, вставки і заміщення для досягнення кінцевої конструкції, за умови, що кінцевий пептидний продукт має необхідні характеристики. Переважні мутанти амінокислотної послідовності мають лише одну, два, три, чотири або менше 10 амінокислотних змін відносно еталонного поліпептиду дикого типу.

Мутантні (змінені) поліпептиди можуть бути отримані будь-яким методом, відомим в даній галузі техніки, наприклад, за допомогою стратегій спрямованого розвитку або раціонального проектування (див. нижче). Продукти, що походять від мутантної/зміненої ДНК, можуть бути легко перевірені за допомогою способів, описаних в даному документі, з метою визначення, чи забезпечують вони стійкість до Риссіпіа дгатіпі5 (наприклад, раси Шд99 групи Риссіпіа дгатіпів ї 5р. їгйісі), наприклад, шляхом продукування трансгенної рослини, яка експресує мутовану/змінену ДНК і визначення здатності рослини виробляти зерно за наявності патогену.

При конструюванні мутантів амінокислотних послідовностей, розташування сайту для

Зо мутацій і характер мутації будуть залежати від характеристики (характеристик), що підлягає модифікації. Сайти для мутації можуть бути модифіковані окремо або послідовно, наприклад, шляхом (1) заміни спочатку на консервативні варіанти амінокислот, а потім на більш радикальні варіанти залежно від досягнутих результатів, (2) видалення цільового залишку або (3) введення інших залишків розташованих поруч із зазначеним сайтом.

Делеції амінокислотних послідовностей загалом знаходяться в діапазоні приблизно від 1 до 15 залишків, більш переважно приблизно від 1 до 10 залишків і зазвичай приблизно від 1 до 5 суміжних залишків.

В мутантах, які піддаються заміні видаляють щонайменше один амінокислотний залишок в молекулі поліпептиду, і на його місце вводять інший залишок. Для підтримки активності, сайти, що представляють інтерес, включають сайти, які не знаходяться на активному сайті, такі як домен СС, ВО або І РК, і ті, які не є висококонсервативними серед різних видів. Ці сайти, зокрема ті, які знаходяться в межах послідовністі щонайменше трьох інших неконсервативних сайтів, зазвичай можуть бути замінені у консервативний або неконсервативний спосіб.

Приклади консервативних замін показані в таблиці 1 під заголовком «Приклади замін».

Таблиця 1

Приклади замін. ле) | ешмараа

Таблиця 1

Приклади замін.

РО) ЇЇ дугу

У переважному варіанті здійснення даного винаходу мутантний/варіантний поліпептид має одну або два або три або чотири зміни консервативної амінокислоти порівняно з поліпептидом, що зустрічається в природі. Детальна інформація щодо консервативних амінокислотних змін наведена в таблиці 1. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, зміни не складаються з одного або декількох мотивів, які є висококонсервативними серед різних поліпептидів, передбачених цим винаходом. Як відомо фахівцю в даній галузі техніки, такі незначні зміни можна розумно передбачити, щоб не змінювати активність поліпептиду при експресії в рекомбінантній клітині.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, білок за даним винаходом являє собою ген стійкості до патогенів рослин СС-МВ-ІКК, який містить в собі домени, сконфігуровані як показано на Фігурі 3.

Первинна амінокислотна послідовність поліпептиду за даним винаходом може застосовуватися для розробки варіантів/мутантів на основі порівнянь з близькоспорідненими резистентними поліпептидами, що містять домени МВ і КЕ, більш переважно домени СС, МВ і

ІКК. Досвідчений фахівець має розуміти, що висококонсервативні залишки серед близькоспоріднених білків СС-МВ-ЇКК рідше можуть змінюватися, зокрема з неконсервативними замінами і активністю, що підтримується, ніж менш консервативні залишки (див. вище).

В обсяг даного винаходу включені також поліпептиди за даним винаходом, які диференційовано змінюються під час або після синтезу, наприклад, шляхом біотинілювання, бензилування, глікозилування, ацетилювання, фосфорилування, амідування, дериватизації відомими захисними/блокувальними групами, протеолітичного розщеплення, зв'язування з молекулою антитіла або іншим клітинним лігандом тощо. Поліпептиди можуть бути посттрансляційно модифіковані в клітині, наприклад, шляхом фосфорилування, які можуть модулювати її активність. Ці модифікації можуть служити для підвищення стійкості і/або біоактивності поліпептиду за даним винаходом.

Спрямований розвиток

В спрямованому розвитку до білка застосовується випадковий мутагенез, і для вибору варіантів, які мають бажані якості, наприклад, підвищену активність, застосовується режим відбору. Потім застосовуються подальші стадії мутації і відбору. Типова стратегія спрямованого розвитку включає в себе три етапи: 1) Диверсифікація: Ген, що кодує білок, який представляє інтерес, мутує і/або рекомбінує у випадковому порядку для створення великої бібліотеки варіантів гена. Бібліотеки варіантів гена можуть бути сконструйовані за допомогою ПЛР низької точності (див., наприклад, І ейпоа, 1989;

СадугеїЇ апа доусе, 1992), з пулів розщеплених фрагментів ДНКази І, отриманих з батьківських матриць (5іеттег, 1994а; 5іеттег, 1994р; Стгатегі ей а! ., 1998, Сосо еї аї., 2001) з дегенеративних олігонуклеотидів (Ме55 еї аїЇ.,, 2002 Сосо, 2002) або з сумішей обох і навіть з нерозщеплених батьківських матриць (2пао еї аї., 1998; Еддег!і єї аї. 2005; де7едиек еї а!., 2008) і зазвичай зібрані за допомогою ПЛР. Бібліотеки також можуть бути отримані з батьківських послідовностей, рекомбінованих іп омімо або іп омйго за допомогою гомологічної або негомологічної рекомбінації (О5іептеїег еї аіІ., 1999; МоїЇКом еї аїЇ., 1999; Біверег єї аї., 2001).

Бібліотеки варіантів гена також можуть бути сконструйовані шляхом субклонування гена, який представляє інтерес, у придатний вектор, перетворюючи вектор в штам «мутатор», такий як червоний ХІ-1 (Зігаїадепе) Е. соїї, і поширення трансформованих бактерій на відповідну кількість генерацій. Бібліотеки варіантів гена також можуть бути сконструйовані шляхом піддавання гена, що представляє інтерес, перетасуванню ДНК (тобто гомологічній рекомбінації іп міго пулів вибраних мутантних генів шляхом випадкової фрагментації і перебудування), як широко описується у Нагауата (1998). 2) Відбір: Бібліотеку перевіряють на наявність мутантів (варіантів), що мають бажані властивості, методом перевірки або відбору. Перевірка надає можливість визначення та виділення високоефективних мутантів вручну, а за допомогою відбору автоматично усуваються всі нефункціональні мутанти. Перевірка може включати в себе дослідження на наявність відомих консервативних амінокислотних мотивів. В альтернативному варіанті, або, крім того, перевірка може включати в себе експресію мутованого полінуклеотиду в організмі-хазяїні або його частині та аналізі рівня активності.

З) Ампліфікація: Варіанти, визначені при відборі або перевірці, багаторазово реплікуються, що дозволяє дослідникам секвенувати їхнє ДНК, щоб зрозуміти, які відбулися мутації.

Разом ці три етапи називаються «стадією» спрямованого розвитку. Більшість експериментів тягне за собою більше однієї стадії. В цих експериментах «переможці» попередньої стадії диверсифікуються в наступній стадії, щоб створити нову бібліотеку. Наприкінці експерименту всі білкові або полінуклеотидні мутанти, що розвинулися, характеризуються біохімічними способами.

Раціональне проектування

Білок може бути розроблений раціонально, на основі відомої інформації про структуру і укладку білка. Це може здійснюватися за допомогою проектування з самого початку (нове проектування) або шляхом перепроектування на основі природних скафолдів (див., наприклад,

Неїїїпда, 1997, ії Си апа Веггту, Ргоївїп Зігисішге Оезідп апа Епдіпеегіпа, Напабоок ої Ргоївіпз 2, 1153-1157 (2007)). Проектування білка зазвичай включає в себе визначення послідовностей, які укладаються в задану або цільову структуру і може здійснюватися за допомогою комп'ютерних моделей. Алгоритми розрахунку проектування білків передбачають пошук простору конформації послідовностей, які мають низьку енергію при укладанні в цільову структуру.

Алгоритми розрахунку проектування білків передбачають застосування моделей енергетики білка для оцінки того, як мутації впливають на структуру і функцію білка. Ці енергетичні функції

Зо зазвичай включають в себе комбінацію молекулярної механіки, статистичних (тобто що грунтуються на даних) та інших емпіричних умов. Придатне доступне програмне забезпечення включає в себе ІРКО (Інтерактивне перепроектування та оптимізація білків), ЕСАЮО (Генетичний алгоритм для проектування білків), Козеца Оевзідп, ЗПагреп і Арайіопе.

Полінуклеотиди і гени

Даний винахід стосується різних полінуклеотидів. Термін «полінуклеотид» або «нуклеїнова кислота» або «молекула нуклеїнової кислоти», що вживається в даному документі, означає полімер нуклеотидів, який може являти собою ДНК або РНК або їхню комбінацію, і включає в себе геномну ДНК, мРНК, кРНК і кКДНК. Менш переважні полінуклеотиди включають в себе

ТРНК, міРнНК, кшРНК і впРНК. Це може бути ДНК або РНК клітинного, геномного або синтетичного походження, наприклад, зроблена на автоматизованому синтезаторі і може бути поєднана з вуглеводнем, ліпідами, білком або іншими матеріалами, міченими флуоресцентними або іншими групами або прикріплена до твердої підкладки для здійснення певної активності, визначеної в даному документі, або містять один або декілька модифікованих нуклеотидів, не виявлених в природі, добре відомих фахівцям в даній галузі техніки. Полімер може бути одноланцюжковим, по суті, довголанцюжковим або частково довголанцюжковим. Спарювання основ, що застосовується в даному документі, стосується стандартного спарювання основ між нуклеотидами, включаючи пари основ :). «Комплементарний» означає, що два полінуклеотиди здатні до спарювання основ (гібридизації) вздовж частини їхньої довжини або по всій довжині одного або обох полінуклеотидів. «Гібрідизований полінуклеотид» означає, що полінуклеотид по суті піддавався спарюванню основ она його комплементі. Термін «полінуклеотид» вживається в даному документі взаємозамінно з терміном «нуклеїнова кислота». Переважні полінуклеотиди за даним винаходом кодують поліпептид за даним винаходом.

Під «виділеним полінуклеотидом» ми маємо на увазі полінуклеотид, який зазвичай відокремлюється від полінуклеотидних послідовностей, з якими він пов'язаний або зв'язаний в його нативному стані, якщо полінуклеотид виявлений в природі. Переважно, виділений полінуклеотид щонайменше на 9095 вільний від інших компонентів, з якими він природно пов'язаний, якщо він виявлений в природі. Переважно, полінуклеотид не зустрічається в природі, наприклад, шляхом ковалентного зв'язування двох коротших полінуклеотидних бо послідовностей у спосіб, не виявлений в природі (химерний полінуклеотид).

Даний винахід включає в себе модифікацію активності генів і побудову і використання химерних генів. Термін «ген», що вживається в даному документі, включає в себе будь-яку дезоксирибонуклеотидну послідовність, яка включає в себе ділянку кодування білка або яка транскрибується в клітині, але не транслюється, а також асоційовані некодувальні і регуляторні ділянки. Такі асоційовані ділянки зазвичай розташовані поруч з кодувальною ділянкою або транскрибованою ділянкою на обох кінцях 5'і 3' на відстані приблизно 2 т.н. з обох боків. В цьому відношенні ген може включати в себе контрольні сигнали, такі як промотори, енхансери, сигнали термінації і/або поліаденілювання, які природно пов'язані з даним геном, або гетерологічні контрольні сигнали, і в цьому випадку ген називається «химерний ген».

Послідовності, які розташовані 5' від кодувальної області і які присутні на мРНК, називаються 5' нетрансльованими послідовностями. Послідовності, які розташовані 3 або нижче від кодувальної ділянки і які присутні на мРНК, називаються 3' нетрансльованими послідовностями.

Термін «ген» включає в себе як кКДНК, так і геномні форми гена. «Ген 5150», що вживається в даному документі, стосується нуклеотидної послідовності, яка гомологічна ізольованому гену 5г50 або кКДНК 5150 (5ЕО ІЮО МО: 9), що описується в даному документі. Як описано в даному документі, деякі алелі і варіанти сімейства генів 5г50 кодують білок, який надає стійкості до стеблової іржі (наприклад, викликану групою рас Шде99 Риссіпіа дгатіпів Її. Зр. ігйісі). Гени 5г50 включають в себе алелі або варіанти, які зустрічаються в природі, що існують в злаках, таких як пшениця. Молекули нуклеїнової кислоти, які мають нуклеотидну послідовність, показану тут як ЗЕО ІЮ МО: 9 (КДНК) або ЗЕО ІО МО: 10 (відкрита рамка зчитування), що кодують білок з амінокислотною послідовністю 5ЕО І МО: 1, є прикладами гена 51г50, який надає стійкості до стеблової іржі.

Геномну форму або клон гена, що містить транскрибовану ділянку, можна перервати за допомогою некодувальних послідовностей, які називаються «інтронами» або «проміжними ділянками» або «проміжними послідовностями», які можуть бути або гомологічними, або гетерологічними відносно «екзонів» гена. «Інтрон», що вживається в даному документі, являє собою сегмент гена, який транскрибується як частина первинного транскрипту РНК, але відсутній в молекулі зрілої МРНК. Інтрони видаляються або «сплайсуються» з ядерного або первинного транскрипту; тому інтрони відсутні в інформаційній РНК (іРНК). Інтрони можуть

Зо містити в собі регуляторні елементи, такі як енхансери. «Екзони», що вживаються в даному документі, стосуються ділянок ДНК, які відповідають послідовностям РНК, що присутні в молекулі зрілої МРНК або зрілої РНК в тих випадках, коли молекула РНК не транслюється.

МРНК функціонує під час трансляції для визначення послідовності або порядку амінокислот в поліпептиді, що утворюється. Термін «ген» включає в себе синтетичну молекулу або молекулу злиття, що кодує всі або частину білків за даним винаходом, які описуються в даному документі, і комплементарну нуклеотидну послідовність до будь-чого з переліченого вище. Ген може бути введений у відповідний вектор для позахромосомної підтримки в клітині або, переважно, для інтеграції в геном хазяїна.

Термін «химерний ген», що вживається в даному документі, стосується будь-якого гену, який містить ковалентно зв'язані послідовності, які не зустрічаються в природі у зв'язаному вигляді. Як правило, химерний ген містить регуляторні та транскрибовані послідовності або послідовності, що кодують білок, які не зустрічаються разом в природі. Відповідно, химерний ген може містити регуляторні послідовності і кодувальні послідовності, які отримані з різних джерел або регуляторних послідовностей і кодувальних послідовностей, що походять з того самого джерела, але розташовані інакше, ніж ті, які зустрічаються в природі. Термін «ендогенний» вживається в даному документі для позначення речовини, яка зазвичай присутня або виробляється на немодифікованій рослині на тій самій стадії розвитку, що і досліджувана рослина. «Ендогенний ген» стосується нативного гена в його природному місці розташування в геномі організму. Терміни «рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти», «рекомбінантний полінуклеотид» або їхні варіації, що вживаються в даному документі, стосуються молекули нуклеїнової кислоти, яка була сконструйована або модифікована за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Терміни «чужорідний полінуклеотид» або «екзогенний полінуклеотид» або «гетерологічний полінуклеотид» тощо стосуються будь-якої нуклеїнової кислоти, яка вводиться в геном клітини за допомогою експериментальних маніпуляцій.

Чужорідними або екзогенними генами можуть бути гени, які вводять в чужорідний організм, нативні гени, введені в нове місце всередині нативного хазяїна або химерні гени. «Трансген» являє собою ген, який був введений в геном за допомогою процедури трансформації. Термін «генетично модифікований» включає в себе введення генів у клітини шляхом трансформації або трансдукції, мутації генів в клітинах і зміни або модуляції регуляції гена в клітині або 60 організмах, відносно яких виконуються ці дії, або їхньому потомстві.

Крім того, термін «екзогенний» в контексті полінуклеотиду (нуклеїнової кислоти) стосується полінуклеотиду, коли він присутній в клітині, яка, зазвичай, не містить в собі полінуклеотид.

Клітина може бути клітиною, яка містить в собі неендогенний полінуклеотид, що призводить до зміни кількості продукованого кодованого поліпептиду, наприклад екзогенного полінуклеотиду, який підвищує експресію ендогенного поліпептиду або клітини, яка в своєму нативному стані не виробляє поліпептид. Підвищене вироблення поліпептиду за даним винаходом також називається в даному документі «надекспресією». Екзогенний полінуклеотид за даним винаходом включає полінуклеотиди, що не були відокремлені від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини або системи безклітинної експресії, в якій вона присутня, і полінуклеотиди, вироблені в таких клітинах або безклітинних системах, які потім очищуються від щонайменше деяких інших компонентів. Екзогенний полінуклеотид (нуклеїнова кислота) може бути суміжним ділянкою нуклеотидів, які існують в природі, або містити в собі дві або більше суміжні ділянки нуклеотидів з різних джерел (які зустрічаються в природі і/або синтетичні), які поєднані з метою утворення одного полінуклеотиду. Зазвичай такі химерні полінуклеотиди містять в собі, щонайменше, відкриту рамку зчитування, що кодує поліпептид за даним винаходом, функціонально зв'язаний з промотором, придатним для запуску транскрипції відкритої рамки зчитування в клітини, що представляє інтерес.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, полінуклеотид не зустрічається в природі як такий, що містить в собі нуклеотиди, які мають послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 10.

Наприклад, в одному варіанті здійснення даного винаходу, полінуклеотид є полінуклеотидом з оптимізованим кодоном, що кодує поліпептид, який містить амінокислоти, що мають послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність яка щонайменше на 8295 ідентична, щонайменше на 9095 ідентична або, щонайменше на 9595 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1, для експресії в рослині крім жита (зокрема, пшениці).

В одному варіанті здійснення даного винаходу, у разі присутності в рослині жита або його частині (зокрема зерні жита) або його клітині, полінуклеотид відсутній на хромосомі 15.

Ідентичність полінуклеотиду у відсотках визначається за допомогою САР-аналізу (Меедіетап апа Ууип5сй, 1970) (програма сс) зі штрафом за створення гепу -5, і штрафом за подовження гепу -0,3. Довжина запитуваної послідовності становить щонайменше 450 амінокислот, та САР-аналіз вирівнює дві послідовності в ділянці щонайменше 450 амінокислот.

Переважно, довжина запитуваної послідовності становить щонайменше 1500 амінокислот, та

СЯАР-аналіз вирівнює дві послідовності в ділянці щонайменше 1500 амінокислот. Більш переважно, довжина запитуваної послідовності становить щонайменше 2700 амінокислот та

САР-аналіз вирівнює дві послідовності в ділянці щонайменше 2700 амінокислот. Ще більш переважно, САР-аналіз вирівнює дві послідовності по всій їхній довжині.

Що стосується визначених полінуклеотидів, слід врахувати, що показники ідентичності у відсотковому співвідношенні, що перевищують показники зазначені вище, належать до переважних варіантів здійснення даного винаходу. Таким чином, в застосовних випадках, з урахуванням мінімальних показників ідентичності у відсотковому співвідношенні, бажано, щоб полінуклеотид містив полінуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 6095, більш переважно щонайменше на 6595, більш переважно щонайменше на 7095, більш переважно щонайменше на 7595, більш переважно щонайменше на 8095, більш переважно щонайменше на 8595, більш переважно щонайменше на 9095, більш переважно щонайменше на 9195, більш переважно щонайменше на 9295, більш переважно щонайменше на 9395, більш переважно щонайменше на 9495, більш переважно щонайменше на 9595, більш переважно щонайменше на 9695, більш переважно щонайменше на 9795, більш переважно щонайменше на 9895, більш переважно щонайменше на 9995, більш переважно щонайменше на 99,195, більш переважно щонайменше на 99,295, більш переважно щонайменше на 99,395, більш переважно щонайменше на 99,495, більш переважно щонайменше на 99,595, більш переважно щонайменше на 99,695, більш переважно щонайменше на 99,795, більш переважно щонайменше на 99,895, і ще більш переважно щонайменше на 99,995 ідентична відповідній призначеній 5ЕО ІЮ МО.

У подальшому варіанті здійснення даного винаходу, даний винахід стосується полінуклеотидів, які по суті ідентичні полінуклеотидам, окремо описаним в даному документі.

Термін «по суті ідентичний», що вживається в даному документі відносно полінуклеотиду означає заміщення одного або декількох (наприклад, 2, З або 4) нуклеотидів при збереженні щонайменше однієї активності нативного білка, кодованого полінуклеотидом. Крім того, цей термін включає в себе додавання або делецію нуклеотидів, що призводить до збільшення або 60 зменшення розміру кодованого нативного білка однією або декількома (наприклад, 2, З або 4)

амінокислотами при збереженні щонайменше однієї активності нативного білка, кодованого полінуклеотидом.

Даний винахід також стосується застосування олігонуклеотидів, наприклад, в способах скринінгу на наявність полінуклеотиду або кодування поліпептиду за даним винаходом. «Олігонуклеотиди», що вживаються в даному документі, являють собою полінуклеотиди довжиною до 50 нуклеотидів. Мінімальний розмір таких олігонуклеотидів є розмір, необхідний для утворення стійкого гібрида між олігонуклеотидом і комплементарною послідовністю на молекулі нуклеїнової кислоти за даним винаходом. Вони можуть являти собою РНК, ДНК або їхні комбінації або похідні Олігонуклеотиди зазвичай являють собою відносно короткі одноланцюжкові молекули довжиною від 10 до 30 нуклеотидів, зазвичай 15-25 нуклеотидів. При використанні як зонда або як праймера в реакції ампліфікації мінімальний розмір такого олігонуклеотида є розміром, необхідним для утворення стійкого гібрида між олігонуклеотидом і комплементарною послідовністю на цільовій молекулі нуклеїнової кислоти. Переважно, олігонуклеотиди мають довжину щонайменше 15 нуклеотидів, більш переважно щонайменше 18 нуклеотидів, більш переважно щонайменше 19 нуклеотидів, більш переважно щонайменше нуклеотидів, ще більш переважно щонайменше 25 нуклеотидів. Олігонуклеотиди за даним винаходом, що застосовуються як зонд, зазвичай кон'юговані міткою, такою як радіоізотопи, фермент, біотин, флуоресціююча молекула або хемілюмінесцентна молекула.

Даний винахід включає в себе олігонуклеотиди, які можуть застосовуватися, наприклад, як 20 зонди для визначення молекул нуклеїнових кислот або праймерів для отримання молекул нуклеїнової кислоти. Зонди і/або праймери можуть застосовуватися для клонування гомологів полінуклеотидів за даним винаходом від інших видів. Крім того, способи гібридизації, відомі в даній галузі техніки, також можуть бути застосовуватися для дослідження геномних бібліотек або бібліотек КДНК щодо таких гомологів.

Полінуклеотиди і олігонуклеотиди за даним винаходом включають в себе полінуклеотиди і олігонуклеотиди, які гібридизуються в жорстких умовах з однією або декількома послідовностями, представленими у вигляді ЗЕО ІЮ МО: 9 і/або 10. Суворими умовами, про які йдеться в даному винаході, є умови, що передбачають (1) застосування низької іонної сили і високої температури для промивання, наприклад, 0,015 М Масі/0,0015 М цитрату натрію/0,190о

Зо Мароавзої при 50 "С; (2) застосування під час гібридизації денатуруючого засобу, такого як формамід, такого як 5095 (06./06.) формамід з 0,195 альбуміну з бичачої сироватки, 0,195 РісоїЇ, 0,195 полівінілпіролідону, 50 мМ натрій-фосфатного буфера при рН 6,5 з 750 мМ Масі, 75 мМ цитрату натрію при 420 "С; або (3) застосування 5095 формаміду, 5 х З55С (0,75 М Масі, 0,075 М цитрат натрію), 50 мМ фосфату натрію (рН 6,8), 0,195 пірофосфату натрію, 5 х розчину

Денхардта, озвученої ультразвуком ДНК сперми лосося (50 г/мл), 0,195 додецилсульфату натрію і 1095 сульфату декстрану при 420 "С в 0,2 х розчину цитрату та хлориду натрію і 0,195 додецилсульфату натрію.

Порівняно з молекулами, що зустрічаються в природі, полінуклеотиди за даним винаходом можуть мати, одну або декілька мутацій, які являють собою делеції, вставки або заміни нуклеотидних залишків. Мутанти можуть бути такими, що зустрічаються в природі (тобто виділеними природного джерела), або синтетичними (наприклад, шляхом здійснення сайт- спрямованого мутагенезу на нуклеїновій кислоті). Варіант полінуклеотиду або олігонуклеотиду за даним винаходом включає в себе молекули різних розмірів і/або здатних до гібридизації з геномом пшениці, близьких до молекул контрольного полінуклеотиду або олігонуклеотиду, визначених в даному документі. Наприклад, варіанти можуть містити в собі додаткові нуклеотиди (такі як 1, 2, 3, 4 і більше) або менше нуклеотидів, доки вони гібридизуються з цільовою ділянкою. Крім того, кілька нуклеотидів можуть бути заміщені без впливу на здатність олігонуклеотиду до гібридизації з цільовою ділянкою. Крім того, можуть бути легко розроблені варіанти, які гибрідизуються, наприклад, приблизно в межах 50 нуклеотидів, з ділянкою геному рослини, де гібридизуються окремі олігонуклеотиди, визначені в даному документі. Зокрема, вони включають в себе полінуклеотиди, які кодують ту саму поліпептидну або амінокислотну послідовність, але які змінюються в нуклеотидній послідовності за рахунок надмірності генетичного коду. Терміни «варіант полінуклеотида» і «варіант» також включають в себе алельні варіанти, які зустрічаються в природі.

Конструкції нуклеїнових кислот

Даний винахід включає в себе конструкції нуклеїнових кислот, які містять в собі полінуклеотиди за даним винаходом, і вектори і клітини-хазяї, що їх містять, способи їхнього отримання та їхнє застосування. Даний винахід стосується елементів, які функціонально зв'язані один 3 одним. Термін «функціонально зв'язані» тощо стосується з'єднання бо полінуклеотидних елементів у функціональному зв'язку. Зазвичай функціонально зв'язані нуклеїнові кислоти безперервно зв'язані і, за необхідності, з'єднуються з двома ділянками, які кодують білок, суміжними і в рамці зчитування. Кодувальна послідовність «функціонально зв'язана з" іншою кодувальною послідовністю, коли РНК-полімераза транскрибує дві кодувальні послідовності в одну РНК, яка, у разі трансляції, потім транслюється в один поліпептид, що має амінокислоти, отримані з обох кодувальних послідовностей. Кодувальні послідовності не обов'язково мають бути суміжними один з одною доти, доки експресовані послідовності зрештою не будуть оброблені для отримання бажаного білка.

Термін «цис-діюча послідовність», «цис-діючий елемент» або «цис-регуляторна ділянка» або «регуляторна ділянка» або подібний термін, що вживається в даному документі, слід розуміти як будь-яку послідовність нуклеотидів, яка при відповідному розташуванні та з'єднанні відносно експресованої генетичної послідовності, здатна регулювати, щонайменше частково, експресію генетичної послідовності. Фахівцям в даній галузі техніки має бути відомо, що цис- регуляторна ділянка може бути здатна активувати, пригнічувати, підвищувати, стримувати або іншим чином змінювати рівень експресії і/або специфічність клітинного типу і/або специфічність розвитку послідовності генів на транскрипційному або посттранскрипційному рівні. У переважних варіантах здійснення даного винаходу цис-діюча послідовність є послідовністю активатора, яка підвищує або стимулює експресію генетичної послідовності, яка експресується. "Функціонально зв'язувальний" промотор або енхансерний елемент з транскрибованим полінуклеотидом означає піддавання транскрибованого полінуклеотиду (наприклад, полінуклеотиду, що кодує білок або іншого транскрипту) контролю регуляції промотору для здійснення контролю транскрипції полінуклеотиду. При побудові гетерологічних комбінацій промоторів/структурних генів загалом бажано розташовувати промотор або його варіант на певній відстані від місця початку транскрипції транскрибованого полінуклеотиду, яка приблизно така сама, як і відстань між цим промотором і ділянкою, що кодує білок, яку він контролює в своєму природному оточенні; тобто ген, з якого отриманий промотор. Як відомо в даній галузі техніки, щодо цієї відстані можуть бути внесені певні зміни без втрати функції. Аналогічним чином, переважне розташування елемента регуляторної послідовності (наприклад, оператора, енхансера тощо) відносно транскрибованого полінуклеотиду, що має знаходитися під його контролем, визначається шляхом розташування елемента в його природному оточенні; тобто гени, з яких він отриманий. «Промотор» або «промоторна послідовність», що вживається в даному документі, стосується ділянки гена, зазвичай вище (5) ділянки, що кодує РНК, яка контролює ініціацію та рівень транскрипції в клітині, що викликає інтерес. «Промотор» включає в себе транскрипційні регуляторні послідовності класичного геномного гена, такі як послідовності ТАТА-бокс і ССААТ- бокс, а також додаткові регуляторні елементи (тобто вищі активувальні послідовності, енхансери і сайленсери), які змінюють експресію гена у відповідь на розвиток і/або екологічні стимули, або у спосіб, специфічний для тканин або клітин. Промотор зазвичай, але не обов'язково (наприклад, деякі промотори РоПШІ), розташовані вище структурного гена, експресія якого його регулює. Крім того, регуляторні елементи, що містять промотор, зазвичай розташовані в межах 2 т.н. сайту початку транскрипції гена. Промотори можуть містити в собі додаткові специфічні регуляторні елементи, розташовані більш віддалено від сайту початку для подальшого підвищення експресії в клітині і/або для зміни часу або індуцибельності експресії структурного гена, з яким він функціонально зв'язаний. "Конститутивний промотор" стосується промотору, який спрямовує експресію функціонально зв'язаної транскрибованої послідовності в багатьох або у всіх тканинах організму, такого як рослина. Термін «конститутивний», що вживається в даному документі, необов'язково означає те, що ген експресується на одному рівні у всіх типах клітин, але що ген експресується в широкому діапазоні типів клітин, хоча часто виявляється певна зміна рівня. «Вибіркова експресія», що вживається в даному документі, майже виключно стосується експресії в певних

БО органах, наприклад, в рослині, зокрема, наприклад, ендоспермі, ембріоні, листі, плодах, бульбі або корені. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, промотор експресується вибірково або переважно в листі і/або стеблах рослини, переважно в рослині злаків. Тому вибіркова експресія може відрізнятися від конститувної експресії, яка стосується експресії в багатьох або в всіх тканинах рослини в більшості або в усіх умовах, де знаходиться рослина.

Вибіркова експресія також може призводити до компартменталізації продуктів експресії генів в певних тканинах рослин, органах або на стадіях розвитку. Компартменталізація в певних внутрішньоклітинних місцях, таких як пластида, цитозоль, вакуоль або апопластичний простір, може здійснюватися шляхом включення в структуру продукту гена відповідних сигналів, наприклад, сигнальний пептид для транспортування в необхідний клітинний компартмент або у бо випадку напівавтономних органел (пластид і мітохондрій) шляхом інтеграції трансгена з відповідними регуляторними послідовностями безпосередньо в геном органели. "Тканиноспецифічний промотор" або "органоспецифічний промотор" являє собою промотор, який переважно експресується в одній тканині або органі відносно багатьох інших тканин або органів, переважно більшості, якщо не всіх інших тканин або органів, наприклад, в рослині.

Зазвичай, промотор експресується на рівні в 10 разів вище в специфічній тканині або органі, ніж в інших тканинах або органах.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, промотор являє собою специфічний для стебла промотор або промотор, який спрямовує експресію гена в наземну частину рослини (промотор, специфічний для зеленої тканини), такий як промотор оксигенази рибулозо-1,5- бісфосфаткарбоксилази (КОВІЗСО).

Приклади промоторів, специфічних для стебла включають в себе, але не обмежуються ними, приклади, описані у 05 5,625,136, і Ват еї а. (2008).

Промотори, передбачені цим винаходом, можуть бути нативними для рослини-хазяїна, що підлягає трансформації, або можуть бути отримані з альтернативного джерела, де ділянка є функціональною в рослині-хазяїні. Інші джерела включають в себе гени Т-ДНК Аадгобасіегішт, такі як промотори генів для біосинтезу нопаліну, октапіну, манопіну або інші промотори опіну, тканиноспецифічні промотори (див., наприклад, О5 5,459,252 ії МО 91/13992); промотори від вірусів (включаючи віруси, специфічні для хазяїна), або частково або повністю синтетичні промотори. Численні промотори, які є функціональними в одно- і дводольних рослинах, добре відомі в даній галузі (див., наприклад, сгеме, 1983; ЗаІотоп еї аї., 1984; Сагпіпкеї еї аї., 1983;

ВаїКег сеї аї!., 1983); включаючи різні промотори, виділені з рослин і вірусів, такі як промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (Сбамм 355, 195). Необмежувальні способи оцінки активності промотору описані у Меабегту еї аї. (1992, 1993), ЗатьгооК еї аїЇ. (1989, див. Вище) і 05 5,164,316.

В альтернативному варіанті або додатково промотор може бути індуцибельним промотором або промотором регульованим розвитком, який здатний стимулювати експресію введеного полінуклеотиду на відповідній стадії розвитку, наприклад, рослини. Інші цис-діючі послідовності, які можуть застосовуватися, включають в себе транскрипційні і/або трансляційні енхансери.

Ділянки енхансера добре відомі фахівцям в даній галузі техніки і можуть включати в себе кодон

Зо ініціації трансляції АТГ і суміжні послідовності. При включенні, кодон ініціації має знаходитися у фазі з рамкою зчитування кодувальної послідовності, що стосується чужорідного або екзогенного полінуклеотиду, щоб забезпечити трансляцію всієї послідовності, якщо така трансляція має відбутися. Ділянки ініціації трансляції можуть бути отримані з джерела ділянки ініціації транскрипції або з чужорідного або екзогенного полінуклеотиду. Послідовність також може бути отримана з джерела промотору, вибраного для стимулювання транскрипції, і може бути спеціально модифікована таким чином, щоб збільшити трансляцію мРНК.

Конструкція нуклеїнової кислоти за даним винаходом може містити З "нетрансльовану послідовність приблизно від 50 до 1000 пар основ нуклеотидів, що можуть включати в себе послідовність термінації транскрипції. 3 нетрансльована послідовність може містити в собі сигнал термінації транскрипції який може включати або не включати в себе сигнал поліаденілювання і будь-які інші регуляторні сигнали, здатні здійснювати процесинг мРНК.

Сигнал поліаденілювання працює з метою додавання ділянок поліаденілової кислоти до 3'-кінця попередника мРНК. Сигнали поліаденілювання зазвичай підтверджуються наявністю гомології до канонічної формі 5 "ААТАДА-3", незважаючи на те, що зміни не є рідкими. Послідовності термінації транскрипції, які не включають в себе сигнал поліаденілювання, включають в себе термінатори для полімерази РНК Рої або Рон, які містять в собі цикл з чотирьох або більше тимідинів. Прикладами придатних З "нетрансльованих послідовностей є 3' транскрибовані нетрансльовані ділянки, що містять в собі сигнал поліаденілювання з гена октопінсинтази (ос5) або гена нопалінсинтази (по5) Адгорасіеєгішт ішптеїасіеп5 (Вемап еї аї., 1983). Придатні З "нетрансльовані послідовності також можуть бути отримані з генів рослин, таких як ген рибулози-1,5-бісфосфаткарбоксилази (55КИ8І5СО), незважаючи на те, що можуть також застосовуватися інші 3'-елементи, відомі фахівцям в даній галузі техніки.

Оскільки послідовність ДНК, вставлена між сайтом ініціації транскрипції і початком кодувальної послідовності, тобто нетрансльованої 5'-лідерної послідовності (ТК), може впливати на експресію гена, якщо вона транслюється, а також транскрибується, можна також використовувати певну лідерну послідовність. Придатні лідерні послідовності включають в себе послідовності, які містять послідовності, вибрані для прямої оптимальної експресії чужорідної або ендогенної послідовності ДНК. Наприклад, такі лідерні послідовності включають в себе переважну консенсусну послідовність, яка може підвищувати або підтримувати стабільність бо МРНК і запобігати небажаній ініціації трансляції, як, наприклад, описано Джоші (1987).

Вектори

Даний винахід включає в себе застосування векторів для маніпуляції або перенесення генетичних конструкцій. Під «химерним вектором» мається на увазі молекула нуклеїнової кислоти, переважно молекула ДНК, отримана, наприклад, з плазміди, бактеріофага або вірусу рослин, де може бути вставлена або клонована нуклеотидна послідовність. Вектор переважно являє собою дволанцюжкову ДНК і містить в собі один або декілька унікальних сайтів рестрикції і може бути здатний до автономної реплікації у визначеній клітині-хазяїні, що включає в себе клітину-мішень або тканину або клітину-попередник або її тканину, або здатний до інтеграції в геном визначеного хазяїна господар, так щоб клонована послідовність була репродукованою.

Відповідно, вектор може бути вектором, який автономно реплікується, тобто вектором, який існує як позахромосомний об'єкт, реплікація якого не залежить від хромосомної реплікації, наприклад, лінійна або замкнута кільцева плазміда, позахромосомний елемент, мініхромосома або штучна хромосома. Вектор може містити будь-які засоби для забезпечення самореплікації.

В альтернативному варіанті, вектор може являти собою вектор, який при введенні в клітину інтегрується в геном клітини-реципієнта і реплікується разом з хромосомою (мами), в яку (які) він був інтегрований. Векторна система може містити в собі один вектор або плазміду, два або більше вектори або плазміди, які разом містять в собі загальну ДНК, яка має бути введена в геном клітини-хазяїна, або транспозон. Вибір вектора, як правило, буде залежати від сумісності вектора з клітиною, в яку має бути введений вектор. Вектор може також включати в себе маркер відбору, такий як ген стійкості до антибіотиків, ген стійкості до гербіциду або інший ген, який може застосовуватися для відбору придатних трансформантів. Приклади таких генів добре відомі фахівцям в даній галузі техніки.

Конструкцію нуклеїнової кислоти за даним винаходом можна вводити у вектор, такий як плазміда. Плазмідні вектори зазвичай включають в себе додаткові послідовності нуклеїнових кислот, які забезпечують легкий відбір, ампліфікацію і трансформацію експресійної касети в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах, наприклад, вектори, отримані з рос, вектори, отримані з роК, вектори, отримані з рОЕМ, вектори, отримані з роР, вектори, отримані з рВз5 або бінарні вектори, що містять в собі одну або декілька ділянок Т-ДНК. Додаткові послідовності нуклеїнових кислот включають в себе точки початку реплікації для забезпечення автономної

Зо реплікації вектора, селектованих маркерних генів, переважно тих, що кодують стійкість до антибіотиків або гербіцидів, унікальні численні сайти клонування, що надають можливість вставки послідовностей нуклеїнових кислот або генів, що кодуються в конструкції нуклеїнової кислоти, і послідовностей, які підвищують трансформацію прокаріотичних і еукаріотичних (особливо рослинних) клітин.

Під «маркерним геном» мається на увазі ген, який надає конкретний фенотип клітинам, які експресують маркерний ген, і, таким чином, надає можливість таким трансформованим клітинам відрізнятися від клітин, які не мають маркера. Селектований маркерний ген надає властивість, за якою можна «вибирати» на основі стійкості до селективного засобу (наприклад, гербіциду, антибіотика, радіації спеки або іншого виду обробки, що пошкоджує нетрансформовані клітини). Селективний маркерний ген (або репортерний ген) надає властивість, яку можна визначити за допомогою спостереження або перевірки, тобто шляхом «скринінгу» (наприклад, ВД-глюкуронідази, люциферази, СЕР або іншої ферментної активності, відсутньої в нетрансформованих клітинах). Маркерний ген і нуклеотидна послідовність, що викликає інтерес, не обов'язково мають бути зв'язані.

Для спрощення визначення трансформантів, конструкція нуклеїнової кислоти бажано має містити селективний або селективний маркерний ген як чужорідний або екзогенний полінуклеотид або на додаток до чужорідного або екзогенному полінуклеотиду. Фактичний вибір маркера не має вирішального значення, якщо він є функціональним (тобто селективним) в поєднанні з вибраними клітинами рослин. Маркерний ген і чужорідний або екзогенний полінуклеотид, що представляє інтерес, необов'язково має бути зв'язаний, оскільки спільна трансформація незв'язаних генів таких як, наприклад, описані в патенті О5 4399216, також є ефективним способом трансформації рослин.

Прикладами бактеріальних селектованих маркерів є маркери, які надають стійкості до антибіотиків, таким як ампіцилін, еритроміцин, хлорамфенікол або стійкості до тетрацикліну, переважно стійкості до канаміцину. Типові селектовані маркери для відбору рослинних трансформантів включають в себе, але не обмежуються ними, ген пуд, який кодує стійкість до гігроміцину В; ген неоміцинфосфотрансферази (прі), що надає стійкості до канаміцину, паромоміцину, (3418; ген глутатіону-5-трансферази з печінки щура, що надає стійкості до гербіцидів, отриманих з глутатіону, як, наприклад, описаний в ЕР 256223; гена бо глутамінсинтетази, що при надекспресії надає стійкості до інгібіторів глутамінсинтетази, таких як фосфінотрицин, як, наприклад, описаний в МО 87/05327, ген ацетилтрансферази з

Зігеріотусез мігідоспготодепевз, що надає стійкості до селективного засобу фосфінотрицину, як, наприклад, описаний в ЕР 275957, ген, що кодує 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б), що надає стійкості до М-фосфонометилгліцину, як, наприклад, описується у Ніпспее еї а!. (1988), ген Баг, що надає стійкості до біалафосу, як, наприклад, описується в УМО 91/02071; ген нітрилази, такий як рхп від Кіерзіве(а о7аепає, який надає стійкості до бромоксинілу (ЗіаїКкег еї а!., 1988); ген дигідрофолатредуктази (ОНЕК), що надає стійкості до метотрексату (ТпйЙеї еї а!.,, 1988); ген мутанта ацетолактатсинтази (А 5), який надає стійкості до імідазолінону, сульфонілсечовини або інших хімічних речовин, які інгібують АЇ 5 (ЕР 154, 204); мутантний ген антранілатсинтази, який забезпечує стійкості до 5-метилтриптофану; або ген далапондегалогенази, який надає стійкості до гербіциду.

Переважні селективні маркери включають в себе, але не обмежуються ними, ген цідА, що кодує фермент р-глюкуронідази (5И5), відносно якого відомі різні хромогенні субстрати, ген |Д- галактозидази, що кодує фермент, відносно якого відомі хромогенні субстрати, ген екворину (Ргагнег єї аІ., 1985), що може застосовуватися для виявлення біолюмінесценції, чутливої до кальцію; ген зеленого флуоресцентного білка (Міє4й7 еї аїЇ., 1995) або його похідні; ген люциферази (Іс) (Ом еї а!., 1986), який сприяє виявленню біолюмінесценції та інші гени, відомі в даній галузі техніки. Під «репортерною молекулою», що вживається в даному описі, мається на увазі молекула, яка за своєю хімічною природою надає аналітично ідентифікований сигнал, який спрощує визначення промоторної активності на основі білкового продукту.

Переважно, конструкція нуклеїнової кислоти стабільно інкорпорована в геном клітини, наприклад, рослинної клітини. Відповідно, нуклеїнова кислота може містити відповідні елементи, які дозволяють молекулі інкорпоруватися в геном або конструкція розміщена в придатному векторі, який може бути інкорпорований в хромосому клітини рослини.

Один варіант здійснення даного винаходу включає в себе рекомбінантний вектор, який містить щонайменше одну молекулу полінуклеотиду за даним винаходом, вставлену в будь- який вектор, здатний доставити молекулу полінуклеотиду в клітину-хазяїна. Такий вектор містить гетерологічні нуклеотидні послідовності, тобто нуклеотидні послідовності, що не зустрічаються в природі поряд з молекулами нуклеїнових кислот за даним винаходом і які переважно є похідними від видів, які відрізняються від видів, з яких отримують молекулу (и) нуклеїнової кислоти. Вектор може бути або РНК, або ДНК, або прокаріотичним, або еукаріотичним, і зазвичай являє собою вірус або плазміду.

Низка векторів, придатних для стабільної трансфекції рослинних клітин або для створення трансгенних рослин, описується, наприклад, у РоцуеїЇ5 еї аї., Сіопіпд Месіог5: А І арогафогу

Мапиаї, 1985, зирр. 1987; М/візвраси апа МУвіззрбаси, Меїйпоай5 їТог Ріапі Моїесшіаг Віоіоду,

Асадетіс Ргебз5, 1989; апа Сеїміп єї аїЇ., Ріапі МоіІесшаг Віоіоду Мапиаї!ї, Кіпмег Асадетіс

Рибіїєпего, 1990. Зазвичай вектори експресії рослин включають в себе, наприклад, один або декілька клонованих генів рослин під транскрипційним контролем 5- і З3'-регуляторних послідовностей і переважний селектований маркер. Такі вектори експресії рослин також можуть містити в собі регуляторну ділянку промотору (наприклад, регуляторну ділянку, яка контролює індуцибельну або конститутивну клітиноспецифічну або тканиноспецифічну експресію, регульовано навколишнім середовищем або розвитком), сайт початку ініціації транскрипції, сайт зв'язування рибосом, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції і/або сигнал поліаденілювання.

Рівень білка за даним винаходом може бути модульований шляхом підвищення рівня експресії нуклеотидної послідовності, яка кодує білок в рослинній клітині, або зниження рівня експресії гена, який кодує білок в рослині, що призводить до модифікованої стійкості до патогенів. Рівень експресії гена може бути модульований шляхом зміни кількості копій на клітину, наприклад, шляхом введення синтетичної генетичної конструкції, що містить кодувальну послідовність і елемент транскрипційного контролю, який функціонально зв'язаний з нею і який є функціональним в клітині. Множина трансформантів може бути вибрана і досліджена на наявність сприятливого рівня і/або специфічності експресії трансгена, що виникає через вплив ендогенних послідовностей поблизу сайту інтеграції трансгена. Саме сприятливий рівень і патерн експресії трансгена призводять до суттєвої модифікації стійкості до патогенів або іншого фенотипу. В альтернативному варіанті, популяція мутагенізованого насіння або популяція рослин в рамках селекційної програми може бути досліджена на наявність окремих ліній зі зміненою резистентністю до патогенів або інших фенотипів, пов'язаних зі стійкістю до патогенів.

Рекомбінантні клітини бо Інший варіант здійснення даного винаходу включає в себе рекомбінантну клітину, що містить клітину-хазяїна, трансформовану однією або декількома рекомбінантними молекулами за даним винаходом або їхнє потомство. Трансформацію молекули нуклеїнової кислоти в клітину можна здійснити у будь-який спосіб, за допомогою якого в клітину можна вставити молекулу нуклеїнової кислоти. Методи трансформації включають в себе, але не обмежуються ними, трансфекцію, електропорацію, мікроін'єкцію, ліпофекцію, адсорбцію і злиття протопластів.

Рекомбінантна клітина може залишатися одноклітинною або може перетворитися на тканину, орган або багатоклітинний організм. Трансформовані молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом можуть залишатися позахромосомними або можуть інтегруватися в один або декілька сайтів всередині хромосоми трансформованої (тобто рекомбінантної) клітини таким чином, щоб зберігалася їхня здатність до експресії. Переважними клітинами-хазяями є рослинні клітини, більш переважно клітини злакової рослини, більш переважно клітини ячменю або клітини пшениці і ще більш переважно клітини пшениці.

Трансгенні клітини

Термін «рослина», який вживається в даному документі як іменник, стосується цільних рослин і стосується будь-якого члену царства рослин, але як прикметник стосується будь-якої речовини, яка присутня в, отримана з, походить з або пов'язана з рослиною, зокрема, наприклад, органами рослин (наприклад, листя, стебло, коріння, квіти), окремі клітини (наприклад, пилок), насіння, рослинні клітини тощо. Саджанці і проросле насіння, з яких виникло коріння і пагони, також включені в значення «рослина». Термін «частини рослин», що вживається в даному документі, стосується однієї або декількох тканин або органів рослини, які отримані з рослини і які містять геномну ДНК рослини. Частини рослин включають в себе рослинні структури (наприклад, листя, стебла), коріння, квіткові органи/структури, насіння (включаючи ембріон, сім'ядолі і насіннєва оболонка), тканину рослин (наприклад, судинну тканину, покривну тканину тощо) клітини та їхнє потомство. Термін «рослинна клітина», що вживається в даному документі, стосується клітини, отриманої з рослини або в рослині, і включає в себе протопласти або інші клітини, отримані з рослин, клітин, які виробляють гамети і клітин, які регенерують в цільні рослини. Рослинні клітини можуть бути клітинами в культурі. Під «рослинною тканиною» мається на увазі диференційована тканина в рослині або отримана з рослини («експлантати») або недиференційована тканину, отримана з незрілих або зрілих ембріонів, насіння, коріння, пагонів, плодів, бульб, пилку, пухлинної тканини, такої як корончатий гал і різні форми агрегації рослинних клітин в культурі, такі як калюси. Прикладами рослинних тканин в насінні або отриманих з насіння є сім'ядолі, ембріон і вісь ембріона.

Відповідно, винахід, включає в себе рослини і частини рослин і продукти, що містять.

Термін «насіння», що вживається в даному документі, стосується «зрілого насіння» рослини, яке або готове для збору врожаю, або було зібрано з рослини, наприклад, як правило, збирають з комерційною метою в поле або як «насіння, яке розвивається», що знаходиться в рослині після удобрювання і перед настанням спокою насіння і до збору врожаю. «Трансгенні рослини», що вживаються в даному документі, стосуються рослини, яка містить конструкцію нуклеїнової кислоти, що не виявлену в рослині дикого типу того ж виду або сорту.

Тобто трансгенні рослини (трансформовані рослини) містять генетичний матеріал (трансген), який вони не містили до трансформації. Трансген може включати в себе генетичні послідовності, отримані з або які походять від рослинної клітини або іншої рослинної клітини, або нерослинного джерела або синтетичну послідовність. Зазвичай, трансген вводять в рослину за допомогою маніпуляції людиною, наприклад, шляхом трансформації, але може застосовуватися будь-який спосіб, який вважає доцільним фахівець в даній галузі техніки.

Генетичний матеріал переважно стабільно інтегрується в геном рослини. Введений генетичний матеріал може містити в собі послідовності, які зустрічаються в природі у тому самому виді, але в перегрупованому порядку або в іншому розташуванні елементів, наприклад антисмисловій послідовності. Рослини, що містять такі послідовності, включені тут в «трансгенні рослини». «Нетрансгенна рослина» - це рослина, яка генетично модифікована шляхом введення генетичного матеріалу методами рекомбінантної ДНК. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, трансгенні рослини є гомозиготними для кожного гена, який був введений (трансген), так щоб їхнє потомство не відокремлювалось відносно бажаного фенотипу.

Термін «порівняно з ізогенною рослиною» або подібні фрази, що вживаються в даному документі, стосуються рослини, яке є ізогенною відносно трансгенних рослин, але без трансгену, що представляє інтерес. Переважно, відповідна нетрансгенна рослина має той самий сорт або різновид, що і попередник трансгенної рослини, яка представляє інтерес, або споріднену клітинну лінію, яка не має конструкції, що часто називається «сегрегантом», або рослину того самого сорту або різновиду, трансформованою конструкцією «порожній вектор» і 60 яка може бути нетрансгенною рослиною. «Дикий тип», що вживається в даному документі,

стосується клітини, тканини або рослини, що не була модифікована відповідно до даного винаходу. Дикі клітини, тканини або рослини можуть застосовуватися як контрольний зразок для порівняння рівнів експресії екзогенної нуклеїнової кислоти або ступеню і характеру модифікації ознак з клітинами, тканинами або рослинами, модифікованими, як описується в даному документі.

Трансгенні рослини, як визначено в контексті даного винаходу, включають в себе потомство рослин, які були генетично модифіковані за допомогою рекомбінантних методів, де потомство містить в собі трансген, що представляє інтерес. Таке потомство може бути отримане шляхом самозапилення первинної трансгенної рослини або шляхом схрещування таких рослин з іншою рослиною того ж виду. Це, як правило, має модулювати отримання щонайменше одного білка, визначеного в даному документі, в бажаній рослині або органі рослини. Частини трансгенних рослин включають в себе всі частини і клітини зазначених рослин, що включають трансген, такий як, наприклад, культивовані тканини, калюси і протопласти.

Рослини, призначені для застосування на практиці здійснення даного винаходу, включають в себе як однодольні, так і дводольні рослини. Цільові рослини включають в себе наступні рослини, але не обмежуються ними,: злакові рослини (наприклад, пшениця, ячмінь, жито, овес, рис, кукурудза, сорго та пов'язані з ними культури); буряк (цукровий буряк і кормовий буряк); насіннєві, кісточкові і соковиті плоди (яблука, груші, сливи, персики, мигдаль, вишня, полуниця, малина і ожина); бобові рослини (квасоля, сочевиця, горох, соєві боби); олійні рослини (рапс або інші капустяні культури, гірчиця, мак, оливки, соняшник, сафлор, льон, кокос, рицина, боби какао, арахіс); огіркові рослини (кабачки, огірки, дині); волокнисті рослини (бавовна, льон, конопля, джут); цитрусові (апельсини, лимони, грейпфрути, мандарини); овочі (шпинат, салат, спаржа, капуста, морква, цибуля, помідори, картопля, червоний перець); лаврові (авокадо, кориця, камфора); або рослини, такі як кукурудза, тютюн, горіх, кава, цукрова тростина, чай, виноград, хміль, дерен, банани і рослини з натурального каучуку, а також декоративні рослини (квіти, чагарники, широколисті дерева і вічнозелені рослини, такі як хвойні дерева). Переважно рослина являє собою злакову рослину, більш переважно пшеницю, рис, кукурудзу, тритикале, овес, сорго або ячмінь, ще більш переважно пшеницю.

Термін «пшениця», що вживається в даному документі, стосується будь-яких видів роду

Тийсуцт, включаючи їхні попередники, а також їхнє потомство, отримане за допомогою схрещування з іншими видами. Пшениця включає в себе «гексаплоїдну пшеницю», яка має геномну організацію ААВВОЮ, що складається з 42 хромосом і «тетраплоїдну пшеницю», яка має геномну організацію ААВВ, що складається з 28 хромосом. Гексаплоїдна пшениця включає

Т. аезімит, Т. 5рена, Т. таспа, Т. сотрасіит, Т. 5рпаегососсит, Т. маміїомії та їхні міжвидові схрещення. Переважними видами гексаплоїдної пшениці є Т. аезімит 55р аевзіїмит (що також називається «пшениця м'яка»). Тетраплоїдна пшениця включає в себе Т. дигит (що також тут називається «тверда пшениця» або Тийісит їшгдідит 55р. бигит), Т. дісоссоїдев, Т. аісоссит, Т. роїопісит і міжвидове схрещення. Крім того, термін «пшениця» включає в себе потенційні попередники гексаплоїдних або тетраплоїдних Тгйісит 5р. таких як Т. чаги, Т. топососсит або

Т. роеоїйсит для генома А, Аедіїор5 5рейоїде5 для генома В їі Т. їаизспії (також відомий як

Аедііор5 здциагтоза або Аедііор5 іаизспії) для генома О. Особливо переважними попередниками є гени А, ще більш переважно попередником генома А є Т. топососсцт. Сорт пшениці для застосування в цьому винаході може належати, але не обмежуватися ними, до будь-якого з перелічених вище видів. Також до даного документу включені рослини, які отримують звичайними методами за допомогою Ттйісит 5р. як батько в статевому схрещенні з видами, що не належать до виду Тгййсцт (наприклад, жито (|ЗесаІе сегеаІєЇ), включаючи, але не обмежуючись, Ттгйіса!|е.

Термін «ячмінь», що вживається в даному документі, стосується будь-яких видів роду

Ногдеит, включаючи його попередники, а також їхнє потомство, отримане шляхом схрещування з іншими видами. Переважно, рослина являє собою різновид Ногдецт, що культивується в комерційних цілях, зокрема, наприклад, штам або сорт або різновид Ногдешт уцідаге або придатний для комерційного виробництва зерна.

Трансгенні рослини, визначені в контексті даного винаходу, включають в себе рослини (а також частини і клітини зазначених рослин) та їхнє потомство, які були генетично модифіковані за допомогою рекомбінантних методів для забезпечення отримання щонайменше одного поліпептиду за даним винаходом в бажаній рослині або органі рослини. Трансгенні рослини можуть бути отримані за допомогою методів, відомих в даній галузі техніки, зокрема, методів, які загалом описуються у А А. Зіаїег еї аї., Ріапі Віосесппоюду - Те Сепеїїс Мапіршіаїйоп ої

Ріапі5, Охгога Опімегейу Ргев5 (2003), і Р. Спгізои апа Н. КіІее, Напароок ої Ріапі Віотесппо!оду, 60 удопп Уеу апа 5опв (2004).

У переважному варіанті здійснення даного винаходу, трансгенні рослини є гомозиготними для кожного гена, який був введений (трансген), так щоб їхнє потомство не відокремлювалось відносно бажаного фенотипу. Трансгенні рослини також можуть бути гетерозиготними для введеного(их) трансгена(ів), такого(их) як, наприклад, в потомстві ЕТ, які були вирощені з гібридного насіння. Такі рослини можуть забезпечити такі переваги, як гібридна сила, добре відома в даній галузі техніки.

Термін «інші генетичні маркери», що вживається в даному документі, може являти собою будь-які молекули, які пов'язані з бажаною ознакою рослини. Такі маркери добре відомі фахівцям в даній галузі техніки і включають в себе молекулярні маркери, зв'язані з генами, що визначають ознаки, такі як стійкість до хвороб, вихід, морфологія рослин, якість зерна, характеристики спокою, колір зерна, вміст гіберелінової кислоти в насінні, висота рослини, колір борошна тощо. Прикладами таких генів є гени стійкості до жовтої іржі МІ10 або Уг17, гени стійкості до нематод, такі як Стеї і Сте3З, алелі в локусах глютеніну, які визначають ступінь воскової стиглості, зокрема алелі Ах, Вх, Ох, Ау, Ву і Бу, гени КПЇї, які визначають форму роста напівкарликів і, таким чином, стійкість до вилягання.

Були описані чотири загальні способи прямої доставки гена в клітини: (1) хімічні способи (Сгтапат еї аї., 1973); (2) фізичні способи, такі як мікроін'єкція (Саресспі, 1980); електропорація (див., наприклад, УУО 87/06614, 005 5478669, 5384253, УМО 92/09696 та УМО 93/21335); і генна гармата (див., наприклад, 05 4,945,050 і 05 5114113); (3) вірусні вектори (СіІарр, 1993; Ги еї аї., 1993; Едійз еї а!., 1988); і (4) механізми, опосередковані рецепторами (Сигіє! єї аї., 1992; ММадпег еї а!., 1992).

Способи прискорення, які можуть застосовуватися, включають в себе, наприклад, бомбардування мікрочастинками тощо. Одним із прикладів способу доставки трансформуючих молекул нуклеїнових кислот в рослинні клітини є бомбардування мікрочастинками. Цей метод був розглянутий у Мапа еї аї., Рагіісіє Вотбагатепі ТесппоіІоду тог Сепе Тгапв/єег, Охога Ргезв,

Охіога, Епдіапа (1994). Небіологічні частинки (мікрочастинки), які можуть бути покриті нуклеїновими кислотами і доставлені в клітини за допомогою рушійної сили. Приклади частинок включають в себе частинки, що складаються з вольфраму, золота, платини тощо. Особлива перевага бомбардування мікрочастинками, крім того, що вона є ефективним засобом

Зо відтвореної трансформації однодольних рослин, полягає в тому, що не потрібна ізоляція протопластів або сприйнятливість до інфекції Адгобасіегішт. Система доставки частинок, придатна для застосування в даному винаході, являє собою гармата для прискорення гелію

РОБ-1000/Не, наявна в лабораторії Віо-Кай І абогагіе5. Для бомбардування незрілі ембріони або похідні клітини-мішені, такі як 5сціеМйа або саїїї від незрілих ембріонів, можуть бути розташовані в твердому середовищі культивування.

В іншому альтернативному варіанті здійснення даного винаходу, пластиди можуть бути стабільно трансформовані. Описаний спосіб щодо трансформації пластид в вищих рослинах, включає в себе доставку генною гарматою ДНК, що містить селектоварний маркер, і націлювання ДНК на геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації (05 5, 451, 513,

ОЗ 5545818, 05 5877402, 05 5,932479 і УМО 99/05265.

Перенесення, опосередковане Адгобрасіегішт, є широко застосовувану системою введення генів у рослинні клітини, тому що ДНК може бути введена в цілі рослинні тканини, тим самим минаючи необхідність регенерації інтактного рослини з протопласта. Використання

Адгорасіегійт-опосередкованих рослин, інтегруючих вектори для введення ДНК в рослинні клітини, добре відомо в даній області (див., Наприклад, ОБ 5,177,010, 05 5,104,310, 05 5,004,863, 05 5,159,135). Крім того, інтеграція Т-ДНК являє собою відносно точний процес, що приводить до невеликих перебудов. Ділянка ДНК, що підлягає перенесенню, визначається граничними послідовностями, а проміжна ДНК зазвичай вводиться в рослинний геном.

Вектори для трансформації АдгоБрасіегійт здатні до реплікації в ЕЕ. соїї, а також

Адгорасіегішт, що дозволяє застосовувати зручні маніпуляції згідно з описом (Кіеє еї аї.,

Іптесйои5 Адепів Ріапі ОМА, Нопп апа зспеї (редактори), Зргіпдег-Мепад, Мем Могк, (1985)): 1 79- 203). Крім того, завдяки технічному прогресу відносно векторів для перенесення гена, опосередкованого Адгорасіегіцшт, покращилося розташування генів і сайтів рестрикції у векторах для сприяння конструюванню векторів, здатних експресувати різні гени, що кодують поліпептиди. Описані вектори мають зручні багатолінкерні ділянки, фланковані промотором, і сайтом поліаденілювання для прямої експресії вставлених генів, що кодують поліпептиди і придатні для даних цілей. Крім того, Адгобасіегішт, що містить як озброєні Ті, так і неозброєні Ті гени, може застосовуватися для трансформацій. В тих різновидах рослин, де трансформація, опосередкована Адгобрасіегішт, є ефективною, цей спосіб є переважним в зв'язку з простим та 60 визначеним характером перенесення гена.

Трансгенна рослина, утворена за допомогою способів трансформації Адгобрасієгічт, зазвичай містить в собі один генетичний локус на одній хромосомі. Такі трансгенні рослини можна назвати гемізиготними щодо доданого гена. Більш переважним є трансгенна рослина, яка є гомозиготною щодо доданого структурного гена; тобто трансгенна рослина, яка містить два доданих гена, один ген в тому самому локусі на кожній хромосомі пари хромосом.

Гомозиготна трансгенна рослина може бути отримана шляхом статевого спарювання (самозапилення) незалежної трансгенної рослини-сегреганта, що включає в себе один доданий ген, пророщування певного отриманого насіння і аналіз отриманих рослин на наявність гена, представляє інтерес.

Слід також розуміти, що дві різних трансгенних рослини можуть також спарюватися з утворенням потомка, що містить два незалежно один від одного екзогенні гени. Самозапилення відповідного потомства може утворювати рослини, гомозиготні для обох екзогенних генів.

Передбачається також зворотне схрещування батьківської рослини і ауткросинг з нетрансгенною рослиною, так само як і вегетативне розмноження. Описи інших способів розмноження, які зазвичай застосовуються відносно різних ознак і культур, можна знайти у Ренпйг,

Вгеєдіпуд Меїподь їтог Сиймаг Оемеіортепі, у. УМіїсох (едіюг) Атегісап Босієїу ої Адгопоту,

Мадізоп Му/ів. (1987).

Трансформація протопластів рослин може бути досягнута за допомогою способів, які грунтуються на осадженні фосфатом кальцію, обробленні полієтиленгліколем, електропорації і комбінаціях цих оброблень. Застосування цих систем до різних сортів рослин залежить від здатності регенерувати цей конкретний рослинний штам від протопластів. Описані ілюстративні способи регенерації злаків з протопластів (Еціїтига еї аї!., 1985; Тогіуата еї аї., 1986; Арашіапй еї а!., 1986).

Можуть також застосовуватися інші способи трансформації клітин, які включають в себе, але не обмежуються ними, введення ДНК в рослини шляхом прямого перенесення ДНК в пилок, шляхом прямого введення ДНК в репродуктивні органи рослини або шляхом прямого введення

ДНК в клітини незрілих ембріонів, після чого настає регідратація висушених ембріонів.

Регенерація, розвиток і культивування рослин з трансформантів протопластів однієї рослини або з різних трансформованих експлантів добре відомі в даній галузі техніки

Зо (Ууеіззбасі еї а!І., Меїйоаз ої Ріапі МоїІесшаг Віоіоду, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, (1988)). Цей процес регенерації і росту зазвичай включає в себе стадії відбору трансформованих клітин, культивування цих виокремлених клітин за допомогою звичайних стадій ембріонального розвитку за допомогою стадії укорінення саджанців. Трансгенні ембріони та насіння регенеруються аналогічним чином. Потім отримані трансгенні кореневі пагони саджають у відповідне середовище росту рослини, таке як грунт.

Розвиток або регенерація рослин, що містять чужорідний екзогенний ген, добре відомі в даній галузі винаходу. Переважно регенеровані рослини піддають самозапиленню для отримання гомозиготних трансгенних рослин. В іншому випадку пилок, отриманий з регенерованих рослин, схрещується з рослинами, вирощеними на насінні, важливими з агрономічної точки зору. І навпаки, пилок з цих важливих рослин застосовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенні рослини за даним винаходом, що містять бажану екзогенну нуклеїнову кислоту, культивують за допомогою способів, добре відомих фахівцям в даній галузі техніки.

Були опубліковані способи трансформації дводольних рослин, головним чином (із застосуванням Адгорасіегішт ішптегасіеп5 і отримання трансгенних рослин для бавовни (05 5 004 863, 05 5,159,135, 05 5,518,908); сої (5 5569834, 05 5416011); Вгазвзіса (05 5463174); арахісу (Спепо еї а!., 1996); і гороху (Сгапі еї аї., 1995).

Способи трансформації злакових рослин, таких як пшениця і ячмінь, для внесення генетичної зміни в рослину шляхом введення екзогенної нуклеїнової кислоти і для регенерації рослин з протопластів або незрілих зародків рослин добре відомі в даній галузі техніки, див., наприклад, СА 2,092,588, А 61781/94, АЮ 667939, 05 6,100,447, ММО 97/048814, 5 5589617, 05 554257 та інші способи наведені в УМО 99/14314. Переважно, трансгенні рослини пшениці або ячменю отримують за допомогою процедур трансформації, опосередкованих Адгобасіегішт

Іштегасіеєп5. Вектори, що містять бажану конструкцію нуклеїнової кислоти, можуть бути введені в регенеровувані клітини пшениці культивованих тканинами рослин або експлантів або придатні системи рослин, такі як протопласти. Регенеровані клітини пшениці переважно являють собою щиток незрілих ембріонів, зрілих ембріонів, калюсу, отриманих з них, або меристематичної тканини.

Для підтвердження присутності трансгенів в трансгенних клітинах і рослинах може бути бо здійснена ампліфікація методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або аналізу Саузерн-

блотинг із застосуванням способів, відомих фахівцям в даній галузі техніки. Продукти експресії трансгенів можуть бути виявлені у будь-який з найрізноманітніших способів, залежно від виду продукту, і включають в себе аналіз Вестерн-блот і ферментний аналіз. Одним з особливо корисних способів кількісного визначення експресії білка і виявлення реплікації в різних тканинах рослин є застосування репортерного гена, такого як С5И5. Після отримання трансгенних рослин, їх можна вирощувати для отримання рослинних тканин або частин рослин, що мають бажаний фенотип. Можуть бути зібрані рослинна тканина або частини рослини і/або насіння. Насіння можуть служити джерелом для вирощування додаткових рослин з тканинами або частинами, які мають бажані характеристики.

Відбір за допомогою маркера

Відбір за допомогою маркера - це добре відомий спосіб вибору для гетерозиготних рослин, необхідний при зворотному схрещенні з рекурентним батьком в класичній селекційній програмі.

Популяція рослин в кожному поколінні, отриманому шляхом зворотного схрещування буде гетерозиготною відносно гена, що представляє інтерес, зазвичай присутнього в співвідношенні 171 в популяції, отриманої шляхом зворотного схрещування, і для розрізнення двох алелів гена може застосовуватися молекулярний маркер. Шляхом виділення ДНК наприклад з молодих пагонів і аналізу за допомогою специфічного маркера інтрагресованої бажаної ознаки, проводиться ранній відбір рослин для подальшого зворотного схрещування, тоді як енергія і ресурси зосереджені на меншій кількості рослин. Для подальшого прискорення програми зворотного схрещування, ембріон з незрілого насіння (через 25 днів після періоду розквітання) може бути вирізаний і вирощений у поживних середовищах в стерильних умовах, а не шляхом досягнення повної зрілості насіння. Цей процес, що називається «порятунок ембріону», який застосовується в поєднанні з виділенням ДНК на трилистковій стадії і аналізом щонайменше одного алелю 5г50 або варіанта, що надає підвищену стійкість до стеблової іржі рослин, дозволяє здійснювати швидкий відбір рослин, які включають в себе бажану ознаку, що можуть бути доведені до зрілості в теплиці або на полі для подальшого наступного зворотного схрещування з рекурентним батьком.

Будь-який спосіб молекулярної біології відомий в даній галузі техніки, може застосовуватися в способах даного винаходу. Такі способи включають в себе, але не

Зо обмежуються ними, застосування ампліфікації нуклеїнових кислот, секвенування нуклеїнових кислот, гібридизацію нуклеїнових кислот за допомогою відповідно мічених зондів, одноланцюжковий конформаційний аналіз (55СА), електрофорез в градієнті денатуруючого гелю (ОССЕ), гетеродуплексний аналіз (НЕТ), аналіз хімічного розщеплення (ССМ), каталітичне розщеплення нуклеїнової кислоти або їхню комбінацію (див., наприклад, І етієих, 2000;

І апогідде еї аї.,, 2001). Винахід також включає в себе застосування методів молекулярних маркерів для виявлення поліморфізмів, зв'язаних з алелями (наприклад) гена 51/50, що забезпечує підвищену стійкість до стеблової іржі. Такі способи включають в себе виявлення або аналіз поліморфізмів довжини рестрикційних фрагментів (КР Р), КАРО, поліморфізмів довжини ампліфікованих фрагментів (АРІ Р) ї мікросателіта (прості послідовності, що повторюються (ЗЗ5К)). Тісно зв'язані маркери можуть бути легко отримані способами, добре відомими в даній галузі техніки, такими як масовий сегрегаційний аналіз, як описується у І апогідде еї аї. (2001).

В одному варіанті здійснення даного винаходу, зв'язані локуси для відбору за допомогою маркера становлять, щонайменше, в межах 1 СМ або 0,5 СМ або 0,1 сМ або 0,01 сМ від гена, що кодує поліпептид за даним винаходом. «Полімеразна ланцюгова реакція» («ПЛР») являє собою реакцію, в якій репліковані копії отримані з цільового полінуклеотиду з використанням «пари праймерів» або «набору праймерів», що складаються з «прямого» і «зворотного» праймера, і каталізатора полімеризації, такого як ДНК-полімераза, і зазвичай термостійкий фермент полімерази. Способи

ПЛР відомі в даній галузі техніки і наведені, наприклад, в ""СК" (М.9У. МеРпегзоп апа 5.05 МоПег (едйогє), ВІОЗ Бсіепійіс Рибіїпеге ЦЯ, Охгога, (2000)3). ПЛР може бути проведена на кДНК, отриманої зі зворотно транскрибуючої мРНК, виділеної з рослинних клітин, що експресують ген 550 або алель, який надає підвищену стійкість до стеблової іржі. Проте, як правило, ПЛР легше проводити на геномній ДНК, виділеній з рослини.

Праймер являє собою олігонуклеотидну послідовність, яка здатна до гібридизації у спосіб, характерний для послідовності відносно послідовності-мішені, та її подовження під час ПЛР.

Амплікони або продукти ПЛР або фрагменти ПЛР або продукти ампліфікації є продуктами розширення, які включають в себе праймер і нові синтезовані копії цільових послідовностей.

Системи мультиплексної ПЛР містять численні набори праймерів, які призводять до одночасного вироблення більше одного амплікона. Праймери можуть бути ідеально підібрані 60 для цільової послідовності або можуть містити внутрішні невідповідні основи, які можуть призвести до введення сайтів розпізнавання/розщеплення рестриктивного фермента або каталітичної нуклеїнової кислоти в певних цільових послідовностях. Праймери можуть також містити в собі додаткові послідовності і/або містити модифіковані або мічені нуклеотиди для полегшення захоплення або виявлення ампліконів. Повторні цикли термічної денатурації ДНК, відпалювання праймерів до їхніх комплементарних послідовностей і подовження відпалених праймерів за допомогою полімерази призводять до значної ампліфікації послідовності-мішені.

Терміни мішень або послідовність-мішень або матриця стосуються послідовностей нуклеїнової кислоти, які ампліфікуються.

Способи прямого секвенування нуклеотидних послідовностей добре відомі фахівцям в даній галузі техніки та їх можна знайти, наприклад, у А!зибреї еї а. (Див. Вище) і Затюогоок еї аї. (див. вище). Секвенування може здійснюватися у будь-який придатний спосіб, наприклад, дидезокси- секвенування, хімічне секвенування або їхні варіанти. Перевага прямого секвенування полягає у визначенні зміни в будь-якій парі основ певної послідовності.

ТІШШІМа

Рослини за даним винаходом можуть бути отримані у спосіб, відомий як ТІ СІМО (Цілеспрямований пошук локальних пошкоджень в геномах). На першій стадії введені мутації, такі як нові зміни в одній парі основ, індукуються в популяції рослин шляхом оброблення насіння (або пилку) хімічним мутагеном, а потім отримання покоління рослин, де мутації будуть стабільно успадковуватися. ДНК виділяється, а насіння беруть на зберігання у всіх членів популяції, щоб створити ресурс, до якого з часом можна буде отримувати багаторазовий доступ.

Для аналізу ТІМ праймери для ПЛР призначені для специфічної ампліфікації одного гена-мішені. Специфічність є особливо важливою, коли мішень є членом сімейства гена або частиною поліплоїдного геному. Далі, мічені барвниками праймери можуть застосовуватися для ампліфікації продуктів ПЛР за допомогою об'єднаної ДНК декількох осіб. Ці продукти ПЛР денатурують і повторно відпалюють для забезпечення утворення невідповідних пар основ.

Невідповідності або гетеродуплекси являють собою однонуклеотидні поліморфізми (ЗМР), які зустрічаються в природі (наприклад, кілька рослин з популяції, ймовірно, містять в собі той самий поліморфізм), та індуковані БМР. (наприклад, тільки рідкісні окремі рослини, ймовірно,

Зо демонструють мутацію). Після утворення гетеродуплекса, застосування ендонуклеази, такої як

Се! І, яка розпізнає і розщеплює невідповідну ДНК, є основою для виявлення нових ЗМР. в популяції в рамках ТІ ІМа.

За допомогою такого підходу, багато тисяч рослин можуть бути досліджені з метою визначення будь-якої рослини зі зміною однієї основи, а також невеликих вставок або делецій (1-30 б.п.-) в будь-якому гені або в певній ділянці геному. Розмір аналізованих геномних фрагментів може знаходитися в діапазоні від 0,3 до 1,6 т.п.н. При 8-кратному поєднанні фрагментів 1,4 т.п.н. (не враховуючи решти фрагментів, де виявлення 5МР є проблематичне в зв'язку із шумом) і 96 смуг на аналіз, ця комбінація надає можливість дослідження до мільйона пар основ геномної ДНК генома на один аналіз, здійснюючи ТІГІМО з високою пропускною здатністю.

ТІССІЮО додатково описується у 5іаде апа Кпашцї (2005), і Непікої еї а. (2004).

На додаток до ефективного виявлення мутацій, технологія з високою пропускною здатністю

ТІССІМО ідеально підходить для виявлення природних поліморфізмів. Тому, дослідження невідомої гомологічної ДНК шляхом гетеродуплексного аналізу на основі відомої послідовності показує кількість і розташування поліморфних сайтів. Визначаються як нуклеотидні зміни, так і невеликі вставки і делеції, включаючи, щонайменше, деякі поліморфізми з певною кількістю повторів. Це називається Есойійпа (Сопа| еї аі., 2004).

Кожен ЗМР фіксують за допомогою його приблизного положення в декількох нуклеотидах.

Таким чином, кожен гаплотип може бути заархівований на основі його рухомості. Дані послідовності можуть бути отримані за допомогою відносно невеликої поступової роботи, використовуючи аліквоти тієї самої ампліфікованої ДНК, яка застосовується для аналізу розщеплення помилкових нуклеотидів. Лівий або правий секвенуючий праймер для однієї реакції вибирають за його близькістю до поліморфізму. Програмне забезпечення Зедиепспег виконує множинне вирівнювання і виявляє зміну основи, що в будь-якому випадку підтвердило смугу гелю.

ЕсоїШіпуд можна здійснювати дешевше, ніж повне секвенування, спосіб, який переважно використовується на даний момент для виявлення ЗМР. Пластини, що містять упорядковану екотипову ДНК, можна піддавати скринінгу на відміну від пулів ДНК з мутагенізованих рослин.

Оскільки виявлення відбувається на гелях практично з розділенням пар основ, а фонові бо структури є однорідними за смугами, можуть бути підібрані смуги однакового розміру, таким чином виявляючи і здійснюючи генотипування ЗМР за один крок. Таким чином, кінцева послідовність БМР є простою і ефективною, тим паче, що аліквоти тих самих продуктів ПЛР, що застосовуються для скринінгу, можуть бути піддані секвенуванню ДНК.

Оброблення рослини/зерна

Зерно/насіння за даним винаходом, переважно зерно злаків та більш переважно зерно пшениці або інші частини рослини за даним винаходом, можуть бути оброблені для отримання харчового інгредієнта, харчового або нехарчового продукту у будь-який спосіб, відомий в даній галузі техніки.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, продукт являє собою борошно з цільного зерна, таке як, наприклад, борошно з цільного зерна надзвичайно тонкого помелу або борошно, виготовлене приблизно з 10095 зерна. Борошно з цільного зерна включає в себе інгредієнт з рафінованого борошна (рафіноване борошно) і велику фракцію (велику фракцію надзвичайно тонкого помелу).

Рафіноване борошно може являти собою борошно, яку отримують, наприклад, шляхом шліфування і просіювання очищеного зерна, такого як зерно пшениці або зерно ячменю. Розмір частинок рафінованого борошна описується як борошно, в якому не менше 9895 проходить через тканину, що має отвори, які не більше отворів тканої дротяної сітки, позначені «212 мікрометрів (0.5. УМіге 70)». Велика фракція включає в себе щонайменше один з інгредієнтів: висівки і паростки. Наприклад, паросток є зародковою рослиною, що знаходиться в зародку зерна. Паросток включає в себе ліпіди, волокна, вітаміни, білки, мінерали і фітонутрієнти, такі як флавоноїди. Висівки містять в собі декілька клітинних шарів і мають значну кількість ліпідів, волокон, вітамінів, білка, мінералів і фітонутрієнтів, таких як флавоноїди. Крім того, велика фракція може включати в себе алейроновий шар, який також включає в себе ліпіди, волокна, вітаміни, білки, мінерали і фітонутрієнти, такі як флавоноїди. Незважаючи на те, що алейроновий шар технічно вважається частиною ендосперму, такий алейроновий шар, проявляє багато тих самих характеристик, що і висівки, і тому зазвичай видаляється з висівками і паростком під час процесу подрібнення. Алейроновий шар містить в собі білки, вітаміни і фітонутрієнти, такі як ферулова кислота.

Крім того, велика фракція може бути змішана з інгредієнтом з рафінованого борошна.

Зо Велика фракцію може бути змішана з інгредієнтом з рафінованого борошна для утворення борошна з цільного зерна, тим самим забезпечуючи борошно з цільного зерна підвищеною поживною цінністю, вмістом волокон і антиоксидантною здатністю порівняно з рафінованим борошном. Наприклад, велика фракція або борошно з цільного зерна можуть використовуватися в різних кількостях для заміни рафінованого борошна або борошна з цільного зерна в хлібобулочних виробах, продуктах для легкої закуски і харчових продуктах.

Борошно за даним винаходом (тобто борошно з цільного зерна надзвичайно тонкого помелу) також може продаватися безпосередньо споживачам для використання в їхній домашній випічці. У прикладі варіанта здійснення даного винаходу, профіль гранулювання борошна з цільного зерна є таким, що 9895 частинок за масою борошна з цільного зерна становить менше 212 мікрометрів.

В інших варіантах здійснення даного винаходу, ферменти, виявлені всередині висівок і паростків борошна з цільного зерна і/або великої фракції, інактивуються для стабілізації борошна з цільного зерна і/або великої фракції. Стабілізація - це процес, в якому застосовується пара, тепло, опромінення або інші методи оброблення, щоб інактивувати ферменти, виявлені у висівках і зародковому шарі. Борошно, яке було стабілізоване, зберігає свої кулінарні властивості і має більш триваліший термін придатності.

У додаткових варіантах здійснення даного винаходу, борошно з цільного зерна, велика фракція або рафіноване борошно може бути компонентом (інгредієнтом) харчового продукту і може використовуватися для виробництва харчового продукту. Наприклад, харчовий продукт

БО може бути бубликом, бісквітом, хлібом, булочкою, круасаном, галушкою, англійською булочкою, мафіном, лавашем, бездріжджовим хлібом, охолодженою/замороженою тістовою заготовкою, тістом, тушкованою квасолею, буріто, чилі, тако, тамалом, тортильєю, закритим пирогом, злаковим продуктом, готовим до споживання, їжею, готовою до споживання, начинкою, їжею для приготування в мікрохвильовій печі, шоколадним кексом, тортом, чізкейком, кавовим тістечком, печивом, десертом, випічкою, солодким рулетом, шоколадним батончиком, скоринкою пирога, начинкою для пирога, дитячим харчуванням, сумішшю для випічки, млинцевим тістом, паніруванням, сумішшю для підливи, наповнювачем для м'яса, замінником м'яса, сумішшю спецій, суповою сумішшю, підливкою, заправкою для соусу, салатною заправкою, супом, сметаною, локшиною, макаронними виробами, локшиною швидкого 60 приготування, локшиною чоу мейн, локшиною ло мейн, добавкою для морозива, морозивом на паличці, морозивом у вафельному стаканчику, морозивом в брикеті, крекером, сухариком, пончиком, яєчним рулетом, пресованою легкою закускою, зерновим батончиком з фруктами, продуктом для приготування легкої закуски у мікрохвильовій печі, поживним батончиком, млинцем, напівфабрикатом хлібобулочних виробів для допікання, кренделем, пудингом, продуктом на основі граноли, закускою з чіпсів, закускою, сумішшю для закуски, вафлями, основою для піци, кормом для тварин, зокрема домашніх тварин.

В альтернативних варіантах здійснення даного винаходу, борошно з цільного зерна, рафіноване борошно або велика фракція можуть бути компонентами харчової добавки.

Наприклад, харчова добавка може бути продуктом, який додається до раціону, що містить один або декілька додаткових інгредієнтів, які зазвичай включають: вітаміни, мінерали, трави, амінокислоти, ферменти, антиоксиданти, трави, спеції, пробіотики, екстракти, пребіотики і волокна. Борошно з цільного зерна, рафіноване борошно або велика фракція за даним винаходом включає в себе вітаміни, мінерали, амінокислоти, ферменти і волокна. Наприклад, велика фракція містить в собі концентровану кількість харчових волокон, а також інші необхідні поживні речовини, такі як вітаміни групи В, селен, хром, марганець, магній і антиоксиданти, які необхідні для здорового харчування. Наприклад, 22 грама великої фракції за даним винаходом забезпечують 3396 щоденного споживання людиною волокон. Харчова добавка може включати в себе будь-які відомі харчові інгредієнти, які мають сприяти підтримці загального здоров'я людини, приклади включають в себе, але не обмежуються ними, вітаміни, мінерали, інші компоненти волокон, жирні кислоти, антиоксиданти, амінокислоти, пептиди, білки, лютеїн, рибозу, омега-3 жирні кислоти і/або інші харчові інгредієнти. Добавки можуть надаватися в наступних формах, але не обмежуючись ними: суміші для швидкого приготування напоїв, готові до споживання напої, поживні батончики, вафлі, печиво, крекери, желе, капсули, жувальні гумки, жувальні таблетки і пігулки. Один варіант здійснення даного винаходу передбачає забезпечення волокнистої добавки у вигляді ароматизованого коктейлю або напою на основі солоду, тож цей варіант здійснення даного винаходу може бути особливо прийнятним як волокнисті добавки для дітей.

У додатковому варіанті здійснення даного винаходу, може застосовуватися спосіб подрібнення для отримання борошна з декількох видів зерен або великої фракції з декількох

Зо видів зерен. Наприклад, висівки і паростки з одного типу зерна можуть бути подрібнені і змішані з меленим ендоспермом або злаковим борошном з цільного зерна іншого типу злаків. В альтернативному варіанті здійснення даного винаходу, висівки і зародки одного типу зерна можуть бути подрібнені і змішані з меленим ендоспермом або борошном з цільного зерна іншого типу. Передбачається, що даний винахід включає в себе змішування будь-якої комбінації одного або декількох наступних інгредієнтів: висівок, паростків, ендосперму і борошна з одного або декількох цільних зерен. Цей підхід з декількома зернами може застосовуватися для виготовлення особливого борошна, виходячи з якостей і поживного вмісту декількох видів зерна злаків для отримання борошна.

Передбачається, що борошно з цільним зерном, велика фракція і/або зернові продукти за даним винаходом можуть бути отримані у будь-який спосіб подрібнення, відомим в даній галузі техніки. Приклад варіанта здійснення даного винаходу включає в себе подрібнення зерна в одному потоці без відокремлення ендосперму, висівок і паростків зерна в окремі потоки. Чисте і кондиціоноване зерно передають в дробарку першого проходу, таку як молоткова дробарка, вальцьова дробарка, штифтова дробарка, дробарка ударного типу, дискова дробарка, фрикційний млин, валкову дробарку тощо. Після подрібнення зерно вивантажують і передають в просіювач. Крім того, передбачається, що борошно з цільним зерном, велика фракція і/або зернові продукти за даним винаходом можуть бути змінені або удосконалені за допомогою численних інших процесів, таких як ферментація, інкубація, екструзія, інкапсуляція, підсмажування тощо.

Солодження

Напій на основі солоду, що пропонується відповідно до даного винаходу, включає в себе алкогольні напої (включаючи лікеро-горілчані напої) і безалкогольні напої, які отримують за допомогою солоду як частини або основного компонента вихідного матеріалу. Приклади включають в себе пиво, хапосю (напій з низьким вмістом солоду), віскі, слабоалкогольні напої на основі солоду (наприклад, напої на основі солоду, що містять менше 195 алкоголю) і безалкогольні напої.

Солодження - це процес контрольованого замочування і проростання, за яким йде сушіння зерна, такого як ячмінь і пшениця. Ця послідовність подій важлива для синтезу численних ферментів, які викликають модифікацію зерна, процес, який головним чином деполімеризує бо стінки клітин мертвого ендосперму і мобілізує поживні речовини зерна. В подальшому процесі сушіння ароматизатор і колір утворюються в результаті хімічних реакцій потемніння.

Незважаючи на те, що солод головним чином призначений для виготовлення напоїв, його можна також застосовувати в інших промислових процесах, наприклад, як джерело ферменту в хлібопекарській промисловості або як ароматизуючу добавку і барвник в харчовій промисловості, наприклад, у вигляді солоду або солодове борошно або непрямо у вигляді солодового сиропу тощо.

В одному варіанті здійснення даного винаходу, даний винахід стосується способів отримання солодової композиції. Спосіб переважно включає в себе стадії: () надання зерна, такого як ячмінь або зерно пшениці за даним винаходом, (ії) замочування зазначеного зерна, (ії) проростання замочених зерен у наперед визначених умовах і (м) сушіння зазначених пророслих зерен.

Наприклад, солод може бути отриманий у будь-який зі способів, описаних в «Нозепеу» (Ргіпсірієз ої Сегеа! бсіеєпсе апа Тесппоіоду, Зесопа Едйоп, 1994: Атегісап Авзосіайоп ої Сегеа!

Спетівів5, БІ. Раш, Міпп.). Проте, будь-який інший придатний спосіб отримання солоду також може застосовуватися з цим винаходом, зокрема способи отримання спеціальних солодів, включаючи, але обмежуючись ними, способи підсмажування солоду.

Солод головним чином застосовується для пивоваріння, але також і для виготовлення дистильованих спиртів. Пивоваріння включає в себе виробництво сусла, основна і вторинна ферментація і подальше оброблення. Спочатку солод подрібнюють, перемішують у воді і нагрівають. Під час цього «затирання» ферменти, активовані в процесі солодження, розкладають крохмаль ядра на зброджуваний цукор. Отримане сусло очищують, додають дріжджі, суміш ферментують і проводять подальшу обробку.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Матеріали і способи

Рослинний матеріал та умови росту

В експериментах, описаних в даному документі, застосовували рослини двох ліній пшениці, що містять незалежні інтрогресії 5г50, заро1вВі 15 і сСаро101І .1К5-ОК.АТ, а також мутантів М2 (00.002), М7 (00.007) ії М13 (01.013), отриманих з цих ліній шляхом у-опромінення і оброблення

Зо етилметансульфонатом (ЕМ5). Ці лінії були такими як описується у Кодоугоз5кКу еї аї. (1991) і

Мадо еї аї. (2004). Транслокація сзаро1ВІЛ1К5 піддавалася зворотному схрещуванню п'яти поколінь в рослинах пшениці сорту Федерації для створення лінії стійкості Федерація"5/

Габо18І.125-1-1, що містить 5г50, за відсутності фонового генів Саро. Рослини лінії

Саро18ВІ.1К5 були стійкі до північноамериканських і африканських ізолятів іржі Радї за наявності гена стійкості 5г50.

Рослини Місоїйапа репіпатіапа вирощували у камері для вирощування при температурі 22 7С в період освітлення 16 годин та в темний час доби - 8 годин на 24 години.

Аналіз за допомогою маркерів та фенотипування іржі

Маркери, розроблені з Міа, що містить ген ВАС з хромосоми 5Н ячменю (УМеї еї аї., 1999) і які застосовуються для аналізу мутантів в цьому документі, були описані у Мадо еї аї. (2004).

Фенотипування стеблової іржі і дослідження мутанта проводили на саджанцях, що досягли віку 1 тижня з Риссіпіа дгатіпів Її. 5р ігйісі (РОЮ раса 98-1 2,3,5,6 (номер доступу до культур в

Сіднейському університеті 279), як описано у Мадо еї аї. (2009). Для диференціації 5г50 їі 5г31 рослини були фенотиповані расами Раї расами ТТК5К (999), ТТК5Т і 98-1,2,3,5,7 ї- 50 (номер доступу до культур в Сіднейському університеті 632). Трансгенні рослини також були фенотиповані, щоб викликати реакцію на іржу листя і жовту іржу, шляхом інокуляції саджанців патотипом Р. Ігйісіпа 104-2,3, (6), (7), 11 (номер доступу до культур в Сіднейському університеті 423) і патотипом Р. вігійогтів ї. 5р. їгйсі раїйпоїуре 110 Е143А «з (номер доступу до культур в

Сіднейському університеті 444), відповідно.

В рамках аналізу зараження іржею для розрізнення 5150 від інших генів стійкості з різною специфічністю, саджанці, що досягли віку один тиждень були інокульовані расами Раї 34- 2,4,5,7,11, (Мо доступу в інституті селекції рослин 760785); 34-2,12,13, (Мо 840552); 126-5,6,7,11, (Мо 334), ТТК5К (04КЕМ156/04, 0999), ТТК5Т (О6КЕМ19мУ3, ЦШде9 ж 5г24), ОЕБСЗС (03М076С),

ТРМКО (74ММ1409), ТАТТЕ (06МЕМ34-1), ТККТР (132ЕН16-1), ОСМУС (07МА140-515).

Рослини також інокулювали расою Р. ігййсіпа 104-2,3, (6), (7), 11 (Мо 890172) і расою Р. 5ігійогтів т. 5р. Ігпйсі гасе 110 Е143 А «з (Мо 861725). Види заражень оцінювали згідно з описом (Мсіпіо5п, 1995).

Утворення бібліотеки геномної ДНК лямбда

Препарати геномних ДНК, оброблені Огаї, з рослин пшениці лінії сзаро10І 185 піддавали бо електрофорезу на 195 агарозному гелі протягом ночі і видаляли ділянку гелю з вмістом фрагментів від 9 до 13 т.п.н., Її ДНК екстрагували і очищали з гелю. Отриману ДНК лігували до адапторів Ватні і клонували у вектор ЕМВІ З А-Ватні (Ерісепіег Тесппоіодієб5) і пакували за допомогою екстрактів для пакування лямбда МахРіах (Ерісепіеєг ТесппоЇодіеєх) відповідно до інструкцій виробника. Бібліотеку гібридизували за допомогою зонда, отриманого з ділянки, що кодує ГЕ, Міа! (876: Мадо еї а1., 2004), і були ідентифіковані та секвеновані позитивні клони.

Дослідження ВАС та аналіз послідовностей

Пшенично-житня дитілосомна додаткова лінія, яка містить в собі хромосому 1К5 жита, що містить 5г50 на тлі пшениці. Сорт «китайська весна» був описаний у біткКома еї аї. (2008).

Бібліотека ВАС була отримана з хромосоми 15, що пройшла проточне сортування, з цієї дитілосомної додаткової лінії Ця 1К5-хромосомоспецифічна бібліотека була досліджена шляхом гібридизації ДНК з використанням зонда В76б, як описано нижче. Позитивні ВАС-клони очищали і робили їхній ідентифікаційний відбиток за допомогою методів ідентифікаційних відбитків ВАС з високим інформаційним вмістом відповідно до стандартних способів. ДНК ВАС отримували за допомогою модифікованого протоколу лужного лізису (5іппей еї аї., 1998).

Кінцеве секвенування ВАС клонів на мінімальному шляху оброблення контигу, що містить Зг50, виконували за допомогою праймерів, призначених для вектора ВАС ріпаїдо, шляхом секвенування Запдег. Послідовності ВАС використовували для конструювання специфічних праймерів для ПЛР. П'ять клонів ВАС секвенували за допомогою платформи секвенування

Коспе 454. Послідовності повторів, присутні в зібраних ВАС, маскували за допомогою бази даних повторів пшениці (м/пеаї. рм.изаа.дом// ТМІ/Кереаї5/ріазігереаї53.піті). Показання послідовностей взяли за допомогою Мем/ріег м2.3. Послідовності без повторів аналізували на наявність генів за допомогою програмного забезпечення для прогнозування генів ЕОСЕМЕЗН (мли. зойбеггу.сот) і ЗЕМЗСАМ (депез.тії еаша ЕМЗСАМ. ті).

ПЛР-ампліфікації кандидатів 5г50

ПЛР-ампліфікація генів стійкості до іржі від Заро 10 .1К5-ОК.А1 і різних сприйнятливих мутантів М2 передбачала застосування пари праймерів, які фланкують гени. Ампліфіковані послідовності порівнювали на наявність змін нуклеотидів шляхом множинного вирівнювання послідовностей (СГОЗТАЇ-Епгореап Віоіпіоптаїйсв5 Іпбзійше - мумлму.еді.ас.икК/Гооі5/зедиепсе. піті).

Виділення РНК, синтез кДНК, 5'ї 3" КАСЕ (швидка ампліфікація кінців КДНК) проводилися у

Зо способи, описані у Регіуаппап еї аї. (2013). Праймери, сконструйовані на передбачених 5 і 3 кінцях транскриптів 5г50, застосовували для аналізу ПЛР зі зворотною транскрипцією. Що стосується 5- і 3-КАСЕ, праймери, сконструйовані на 5- і 3-кодувальних ділянках, застосовували як ген-специфічні праймери.

Трансформація пшениці

Були отримані дві конструкції геномної ДНК, кожна з яких містила 5г50 і, таким чином, кодувала поліпептид 5г50. Перша з них містила фрагмент розміром 7,5 т.п.н., в тому числі 2,4 т.п.н. у вищій ділянці і 1,38 т.п.н. у нижчій ділянці відносно ділянки кодування білка ЗСКОА1-А в бінарному векторі рмесВагії. Цей фрагмент ампліфікували з геномної ДНК сСаро10І 185 за допомогою праймерів Е1-К1, а потім вкладених праймерів Б2-К2, перелічених в таблиці 2, з

ДНК-полімеразою РішШПЙга Ії Ризіоп Н5 (Адіїепі ТесппоїІодіез) відповідно до рекомендованих виробником умов. Друга конструкція містила в собі фрагмент Мої! розміром 9,8 т.п.н. з клону 180318 ВАС, що включає в себе 4,2 т.п.н. у вищій ділянці і 1,88 т.п.н. у нижчій ділянці відносно ділянки кодування білка і вставлена в бінарний вектор рУесмМео.

Таблиця 2

Праймери, що застосовуються для ПЛР-ампліфікації кандидатів 5г50, ЗСКОА1 та кінців ВАС.

МО:17 ЗЕО І МО:18

ЗЕО І МО119 ІО МО 20 вв екю

МО 21

МО:22 С (ЗЕО І МОС23 реальному часі /|1О МО:24 ІО МО 25

Таблиця 2

Праймери, що застосовуються для ПЛР-ампліфікації кандидатів 5г50, ЗСКОА1 та кінців ВАС. транскрипцією

ЗЕО ОО МО С28 ЗЕО І МО:29

МО:30 ІО МО:31

МО:32 ІО МО СЗЗ

МО:34 ЗЕО ІО МО:35

МО:36 ІО МО:37

МО:З8 ІО МО:39

МО:40 ІО МО 41

МО:42 ІО МО 43

МО:44 ІО МО 45

МО:46 ІО МО 47

МО:48 ЗЕО І МО:49

МО:50 ІО МО:С51

МО:52 ЗЕО ІЮ МО:5З3

МО:54 ІО МОС55

ЗЕО ОО МОС56 ЗЕО ІО МО:57

ЗЕО ІЮ МО:58 ас (ЗЕО ІО МО:59

Бінарні вектори рМесМео і рмМесВагі! є похідними рууУВмес8 (Умапд еї аї., 1998), в яких промотор 355: ген стійкості до гігроміцину був замінений на промотор 355: селектований маркерний ген МРТІЇ, отриманий з реоМпеоз5ті12 (Мааз еї аї., 1997), або ділянка кодування гена стійкості до біалафосу (Баг) як селективний маркер для трансформації рослини.

Трансформація сорту пшениці Філдер, сприйнятливого до стеблової іржі, була здійснена з використанням штаму Адгобасієгішт (шптегтасіеп5 ЗМ3101 (рРМРОО), згідно з описом (Ізпіда еї аї., 2014; Кіспагазоп еї аї., 2014). Трансформанти ТО їі рослини-потомства Т1, в тому числі обидві рослини, які містили в собі трансгени і сегреганти, які їх не містили як негативні контрольні рослини, були випробувані на реакцію на іржу за допомогою штаму 98-1,2,3,5,6 Родї, як описано вище. Присутність трансгена і/або селектованого маркерного гена була виявлена за допомогою

Саузерн-блот-гібридизації, згідно з описом (Мадо еї а!., 2004). Для цього застосовувалась ПЛР- ампліфікована послідовність з з 5-кінця 5г50. В альтернативному варіанті, для виявлення трансгену можна було б виконати трансген-специфічну ПЛР.

Дріжджовий двогібридний аналіз

Дріжджові двогібридні експерименти проводили в репортерному штамі Ні7с Засспаготусе5 сегемізіає. КДНК, які кодують повнорозмірний або зрізаний 5г50, клонували на сайтах ЕсоКІ-ХнпоЇ рОвВКкт7 і рОАОТтТ7 (СіІопіесп). Трансформація дріжджів проводилася згідно з описом соіеєїх і

УмМосд5 (2002) за допомогою співтрансформантів, вибраних на 5О-носіях, що не містять лейцин і триптофан. Аналіз взаємодії проводили шляхом посіву дріжджових клітин на середовищах, позбавлених лейцину, триптофану і гістидину, та інкубації пластин при 30 "С протягом 3-4 днів.

Зо

Конструкції для експресії в польових умовах

Всі продукти ПЛР, що застосовуються для клонування, були отримані з використанням високоточної полімерази ДНК Рпшзіоп Нідп-Рідешу ОМА Роїутегазе (Ріпп7утевз) з праймерами, переліченими в таблиці 2. Молекулярне клонування здійснювали шляхом рекомбінації Сагемау (І їе ТесппоїІодіеє5) або сайт-направленого мутагенезу Оціскспапде (Зігаїадепе). Для створення вихідних клонів (заїемау застосовувався РООМК207 (І Ше ТесппоїЇодіе5). Для експериментів з інфільтрації Адгобасіегішт іШптегасіеп5 (адго) застосовувались рВІМ19-355:А: ПМ :ЗНА, рВІМІ9-

З355:2Т1ММ:СЕР (Севзагі еї аї. 2014), рАМ-РАТ-355:2 ТММ: МЕР:МІ 5; рАМ-РАТ-355:СТМ:МЕР:пів; рАМ-РАТ-355:ТММ:УЕРУ: МЕЗ і рРАМ-РАТ-355:211 М МЕРум:пев.

Функціональні МЕЗ з НІМ Кем (МЕ5: ГОГРРІ ЕКГ ТІ; 5ЕО ІО МО: 15) і нефункціональні пе5 (ГОАРРАЕКАТІ; ЗЕО ІЮ МО: 16) (Меп еї аї!., 1995) були введені у вектор РАМ-РАТ-355-СМ/М -

МЕРМ (Ветоих єї аїЇ., 2008) С-термінальному кінці МЕРу. Фрагменти МУЕРУ-МЕ5Б/пе5 ампліфікували методом ПЛР за допомогою прямого праймера, що містить в собі сайт 3-5 паї, і зворотного праймера, що містить в собі сайт 5'-ХраїЇ, а також послідовність МЕ5 або пев.

Відповідні продукти ПЛР лігували в розріз рАМ-РАТ-355-СМУУ-УЕРму за допомогою Зтаї/Хбаї для заміни вихідного ХЕРм за допомогою злиття МЕРу-МЕ5/пев.

Транзієнтна експресія та аналізи загибелі клітин у М. Ббепіпатіапа

Для опосередкованої Адгобасіегішт трансформації клітин листя М. репіпатіапа культур штаму Адгорасіегійшт ЗМУ3101, трансформовані генетичною конструкцією РМРОО, вирощували в рідкому середовищі І игіа-Вепапі, що містить 50 мг мл-л рифампіцину, 15 мг мл-л гентаміцину і мг мл-л канаміцину при 28 "С протягом 24 годин. Конструкції, що передбачають експресію білків злитих МІ 5, МЕ, пів і пе5, трансформували в штамі А. ішптеїасіеп5 СМ3103 і вирощували, як описано вище, з додаванням 25 мг/мл карбеніциліну. Бактерії збирали шляхом центрифугування, ресуспендували в середовищі інфільтрації (10 мМ МЕЗ5 рн 5,6, 10 мм МаосІі?2 і 25 150 мкМ ацетосирингону) до ОО600 нм в діапазоні від 0,5 до 1 і інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі до інфільтрації листя. Інфільтровані рослини інкубували в камерах для вирощування в контрольованих умовах для проведення експериментів з коіїмунопреципітації і аналізів загибелі клітин. Для документального підтвердження загибелі клітин листя фотографували через 3-5 днів після інфільтрації.

Зо Конфокальна мікроскопія

Епідермальні клітини М. репіпатіапа спостерігалися під конфокальним мікроскопом (ТС5

Р, І віса) через 20 годин після інфільтрації. Специфічна флуоресценція УЕР була виявлена за допомогою наступних спектральних параметрів: збудження 488 нм; детекція, 515-545 нм.

Автофлуоресценція хлоропластів була виявлена при 670-730 нм. Всі зображення були отримані за допомогою водної імерсійної лінзи (НС РІ. АРО 63х/1,20 МУ СОКК С552, І еіса).

Отримання білків за допомогою вестерн-блотингу та коїмунопреципітація

Отримання білків з листя М. рБепіпатіапа і експерименти з коїмунопреципітації проводили згідно з описом Себзагі еї аІ. (2014). Для імуноблот-аналізу білки розділяли 505-РАСЕ і переносили на нітроцелюлозну мембрану (РаїЇ). Мембрани блокували в 595 знежиреного молока і зондували мишачими моноклональними антитілами проти НА або проти Мус (Коспе), а потім козячими антимишачими антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону (Ріегсе). Мічення була виявлене за допомогою хемілюмінесцентних наборів Зирегзідпа! Умезі Рісо або Ретіо (Ріегсе). Мембрани забарвлювали Ропсеаи 5 для підтвердження однакового завантаження.

Приклад 2. Ген 5г50 кодує унікальну специфічність стійкості, ефективної проти Шд99

Щоб визначити, чи забезпечує ген стійкості до грибів 5г50 таку саму специфічність стійкості як 5Г31 або специфічну стійкість, яка відрізняться від 5Гг31, рослини пшениці визначених ліній, що містять в собі той чи інший з цих генів, або жоден з цих генів як контрольний зразок, випробували на реакцію на набір штамів Раї з різною специфічністю вірулентності, як описано в прикладі 1. Також випробували мутантні рослини, що містять мутації в гені Зг50; передбачається, що вони сприйнятливі до штамів РЮ, які містять в собі ген авірулентності, що має специфічність 5г50. Дані щодо інокуляційних проб наведені в таблиці 3.

Таблиця З

Типи інфекцій, вироблених лініями, що містять лінії 5г31 і 5г50 при інокуляції штамом Раї ТТК5К (999) 11111111 нокулятрасиРоїїд//://НСН (баров ТАЗ 8І50(М7) 77777771 Ї10о: ЇЇ гн | 2 | 2

Результати показали, що незважаючи на те, що 5г31 був, як і очікувалося, неефективним щодо забезпечення стійкості до штамів Рід Оде9 (ТТК5К) і його похідних ТТК5Т, ген 5150 на генетичному фоні сорту пшениці Забо забезпечував ефективну стійкість до цих штамів, що призводило до типу інфекції 1 (таблиця 3). Мутант 5г50 на цьому ж генетичному фоні (М7 в таблиці 3) показав аналогічний фенотип (тип інфекції 2) у батька Сабо без гена 5г50, що вказує на те, що мутація в гені 5г50 у мутанта інактивує ген стійкості. При певних інокуляціях в рослинах цих ліній спостерігався проміжний фенотип інфекції - це було пов'язано з наявністю інших генів стійкості до стеблової іржі на фоні Саро, що надавало часткову стійкість до похідних ц999.

З метою сприяння проведенню окремого дослідження на наявність гена 5г50, з однієї пустули був виділений спонтанний мутантний штам Раї з вірулентністю для 51/50, позначений 98-1,2,3,5,6 я 5150 (наявний в інституті селекції рослин під Ме 130176), що спостерігається після зараження рослин 5г50 штамом 98-1,2,3,5,6 (Ж 781219). З огляду на зараження низки диференційованих ліній пшениці, кожна з яких містить різні К-гени, було підтвержено, що мутантний штам Роаї був ідентичний батьківському ізоляту, але з вірулентністю до 5г50. Тому цю пару штамів Радї можна було б застосовувати для окремого виявлення присутності 5г50.

Генотипова і фенотипова різниця між генами стійкості 5г31 і 5150 у рослин була додатково підтверджена шляхом інокуляції рослин похідним батьківського Рід і мутантного Рід, 98-1,2,3,5,6 я 5Гг50. Батьківський штам Рід 98-1,2,3,5,6 був вірулентним на рослинах сорту Сабо, де цей сорт не мав стійких генів проти цього штаму Рід і авірулентним на рослинах, що окремо містять 5г31 або 5г50. На відміну від цього, мутантний Рід 98-1,2,3,5,6 ж 550 зберігав авірулентність відносно 5Г31, але був вірулентним відносно 5150 (Таблиця 4). Крім того, як батьківський штам, так і мутантний Рід були одночасно авірулентними відносно рослин, що містять 5133, ортологу пшениці 5г50 (див. нижче), а також бглплідо (1АІ 1825), присутнього в рослинах сорту Атідо.

Отже, дійшли висновку, що мутантний штам 51/50 Рід втратив активність гена авірулентності

Зг50 (Амгого0О) і що ген стійкості до 5г50 кодує унікальну специфічність стійкості, яку можна відрізнити від інших 1К5, що містять гени стійкості до стеблової іржі. Також дійшли висновку, що

Зо 550 можна відрізнити від інших генів стійкості до стеблової іржі шляхом інокуляції рослин різними расами Рід.

Таблиця 4

Порівняльні види заражень, що виробляють різні лінії, при зараженні расою Раї 98-1,2,3,5,6 і її мутантом 5г50. 11111111 ШтамРю/////СССсС

Приклад 3. Фізичне мапування локусу 5г50

Мадо еї аї. (2004) відзначили, що зонд гібридизації ДНК, позначений В76, отриманий з ділянки, що кодує І ЕЕ гена стійкості до борошнистої роси ячменю Міа!, виявив щонайменше 17 гібридизуючих фрагментів в геномній ДНК з обмеженим ЮОгаіІ в локусі пшениці 5г50 і те, що декілька мутантів 5г50 з невеликими делеціями втратили тільки два з цих фрагментів, що становлять приблизно 10 і 12 т.п.н. У спробі виділити ген 5г50 була створена бібліотека геномної ДНК фагу лямбда, як описано в прикладі 1, з рослин лінії 550 сЗаро1Ві 125 та була досліджена. Бібліотека лямбда містила фрагменти Огаї, розмір яких варіювався від 9 до 13 т.п.н. За допомогою зонду гібридизації В7б, шість унікальних клонів були виділені з бібліотеки і вибрані для подальшого аналізу (Фігура 1).

Аналіз послідовності показав, що всі ці послідовності кодують кодовані пов'язані з Міа послідовності СС-МВ-І ЕК. Три з них містять різні зрізання або зсуви рамки і, таким чином, не можуть кодувати повнорозмірні білою СС-МВ-І ЕК, а двоє з них є послідовностями з певною подібністю з ділянкою КЕ зонду В7б. Шоста послідовність, клон 5 (Фігура. 1), містила здебільшого повнорозмірний ген без внутрішніх переривань рамки зчитування, але була зрізана на сайті Ога! в ділянці, що кодує І ЕЕ і, таким чином, у неї був відсутній 3'-кінець прогнозованого гена.

Для покращення фізичного охоплення видаленої ділянки, включаючи 5150, зонд В7б потім застосовували для дослідження 1К5 хромосомоспецифічної бібліотеки ВАС, сконструйованої з пшенично-житньої дитілосомної додаткової лінії з вмістом 5г50, як описано в прикладі 1. Цей зонд визначив 175 клонів ВАС. За допомогою методів ідентифікаційних відбитків ВАС з високим інформаційним вмістом вдалося згрупувати їх в 6 неперекривних контигів на основі 2, 3, 11, 24, 71 і 72 клонів. Вісімнадцять ВАС, що становлять мінімальний шлях оброблення цих контигів, піддавали скринінгу за допомогою ПЛР за допомогою праймерів, специфічних для гомолога Міа в клоні лямбда 5. Таким чином, ВАС р207 (Фігура 2) визначили як такий, що містить цю послідовність. Продукт ПЛР також ампліфікували з чотирьох клонів ВАС, що перекривають рго?7, р2Е7 р2812, р2В89 і р1Н3З, які підтверджують присутність гена-кандидата в цьому контигу (Фігура 2).

Для мапування гена 5150 і локусу, що його оточує, на фізичний контиг, ВАС, що утворювали мінімальний шлях оброблення з контигу, секвенували за кінцевими послідовностями, а маркери

ПЛР, розроблені з кінців ВАС, застосовували для дослідження батьківського 5г50 і мутанта з делецією М2 (00.002), Цей аналіз виявив, що делеція в мутанті Ма2 і, таким чином, гені 5г50 повністю міститься в ділянці, що охоплюють З клони ВАС, а саме р207, ргАЗ ї р2С2, причому ближній і дальній кінці р2О7 і р2С2 відповідно зберігалися (Фігура 2).

Ці три клони ВАС, що охоплюють делецію, а також ВАС р2Е?7, який повністю містився в р2гоО7 і прилеглому ВАС, р2С7, були секвеновані. Завдяки анотації нуклеотидних послідовностей з цієї області 250 т.п.н. було визначено шість пов'язаних з Міа ділянок кодування білка МВ-І ВА (відкриті рамки зчитування) у видаленій ділянці та одну відкриту рамку зчитування МВ-І ЕК в прилеглій ділянці на ВАС р2С7 (Фігура 2). Вони були позначені як 5СКОА1-А-5сВИА1-а.

Довжина відкритих рамок зчитування варіювала від 3,6 до 12,1 т.п.н., і кожна з таких рамок мала або один, або два передбачених інтрони. Вони кодували передбачені поліпептиди в діапазоні від 944 до 974 амінокислот. Унікальна копія гена інгібітору хімотрипсину (Сі), гомолог якого також був присутній в локусі ячменю Міа, також була виявлена у видаленій ділянці. Це відповідало попереднім аналізам гібридизації ДНК, в ході яких були визначені 4 копії гена пов'язаного з Сі на 1К5, лише один з яких був видалений у мутантів інтерстиціальної делеції (Мадо еї аї., 2004). Амінокислотна послідовність, кодована клоном лямбда 5, була на 10095 ідентична амінокислотній послідовності З5ХСЕОСА1-А, але інші клони лямбда, визначені згідно з вищенаведеним описом, не відповідали жодному з інших генів хХСКОА1 в контигу ВАС.

Приклад 4. Визначення гена 5г50

На додаток до мутанту з делецією М2, описаного вище, авторами винаходу раніше було виділено декілька мутантів гена 5г50, отриманих з ЕМ5, які зберігають всі фрагменти, що гібридизують В76 і тому, можливо, представляють точкові мутації 5г50 (Мадо еї аї., 2004). Були отримані дві мутантні рослини, М7 (00.007) ії М13 (01.013), а також вироблені потомствені рослини. Схрещування між рослинами М7 і М13 не викликало стійкого потомства, вказуючи на те, що вони переносили мутацію в тому самому гені. Шість генів зСКОАТ, визначених в делеції

М2, як описано вище, ампліфікували з М7 і з М13, а також з Саро10І.1кК5 ОК.А1 і секвенували.

Один з шести генів-кандидатів, а саме 5СКОА1-А, містив одну делецію пар основ в М7 і делецію 23 т.п.н. в М13. Обидві мутації призвели до зсуву рамки зчитування, що спричинило передчасний стоп-кодон у відкритій рамці зчитування (рис. 3). Всі інші гени-кандидати були ідентичні за послідовністю в рослинах дикого типу і мутантах М7 і М13. Визначення множинних 60 незалежних мутацій в тій самій кодувальній ділянці показала, що ділянка, яка кодує ЗСКОА1-А,

відповідає гену 5г50. Цей висновок був підтверджений експериментами з трансформації (див. нижче).

Приклад 5. Трансформація пшениці генами 5г50

Для підтвердження того, що ЗСКОА1-А надає стійкості 9г50, дві конструкції, що містять цей ген, застосовували для трансформації сприйнятливих до іржі рослин пшениці сорту Філдер, як описано в прикладі 1. Перша конструкція руесВагог50 (ЗЕО ІЮ МО: 12) містила ампліфіковану

ПЛР геномну послідовність 5СКОА1-А розміром 7,9 т.п.н., включаючи нативний промотор і термінатор (2,4 і 1,4 т.п.н., відповідно) в Т-ДНК. Друга конструкція румесМеобг50 (5ЕО 10 МО: 11) містила геномний фрагмент Мої! розміром 9,7 т.п.н. з ВАС р207 з більшими 5'- і 3'-ділянками всередині Т-ДНК. Таким чином, обидві конструкції містили геномну форму ЗСКОА1-А, включаючи всі її інтрони, а також нативний промотор, але зв'язані з гетерологічними послідовностями в химерній конструкції Т-ДНК. Конструкції застосовували для трансформації пшениці і підтверджені трансгенні рослини та їхні потомства, випробувані згідно з описом в

Прикладі 1.

Незалежні трансгенні рослини ТО і потомствені рослини Т1, що містять Т-ДНК з руесВагог5о0о, інокулювали штамами Раї. Трансгенні рослини демонстрували реакцію на Раї, характерну для 5г50-опосередкованої стійкості, а рослини-сегреганти, у яких трансген був відсутній, були такі само сприйнятливими як і нетрансформовані батьківські рослин. Аналогічно, лінії пшениці ТО, трансформовані руесМео5г50, продемонструвати стійкість, характерну для 550. З метою підтвердження того, що спостережуваний фенотип стійкості був специфічним для раси, а не в зв'язку із загальним покращенням захисних шляхів, потомство Т1 з чотирьох стійких до іржі трансгенних рослин (лінії 2, 105, 13 ії 194) випробували на їхню реакцію на іржу листя і жовту іржу шляхом інокуляції штамами, описаними в Прикладі 1.

Всі трансгенні потомствені рослини були сприйнятливі до іржі листя і жовтої іржі як нетрансформовані контрольні зразки. Крім того, популяції потомства Т1 показали співвідношення сегрегації 3: 1 (стійкий: сприйнятливий) на реакцію на стеблову іржу, що відображує коефіцієнти Менделівського успадкування відносно введення одного трансгена в ядерний геном. Комбіновані мутаційні і комплементарні дані переконливо показали, що ген, позначений 5СКСА1-А, є геном стійкості 5г50.

Зо Експеримент також довів, що ген забезпечує стійкість до іржі у разі його застосування з метою трансформації злакової рослини. Таким чином, на думку фахівця в даній галузі техніки, такі самі або аналогічні конструкції (наприклад, з різними промоторними ділянками) можуть застосовуватися для отримання інших злакових рослин (таких як рис, ячмінь, кукурудза або сорго), які експресують 5150, що призводить до стійкості до однієї або декількох рас Риссіпіа дгатіпів.

Приклад 6. Структура 5г50 і порівняння з функціональними генами Міа ячменю та пшениці

Наявність двох передбачених інтронів в ділянці, що кодує білок 5г50, була підтверджена

ПЛР зі зворотною транскрипцією і порівнянням КДНК і геномних нуклеотидних послідовностей.

Шляхом аналізу «швидка ампліфікація кінців КДНК (КАСЕ)», виконаного згідно з описом догаап апа аї. (2011), було визначено 5 і 3' нетрансльовані ділянки 629 і 238 п.о. відповідно, що містять

З додаткові інтрони (рис. 3). Розміри екзонів та інтронів 5г50 показані на Фігурі 3.

Передбачений поліпептид 5г50 був ідентичний на 77-7895 в амінокислотній послідовності поліпептидам в сімействі білків МА ячменю, причому деякі з них надають стійкість до борошнистої роси, а не стійкість до іржі. В ході філогенетичного аналізу гомологів Міа злаків з використанням їхніх амінокислотних послідовностей білок 5г50 вміщали в кладу з іншими поліпептидами 5СКОА1, а також з ортологічними білками ТтМіаї! і 5г33 з диплоїдних видів пшениці, Т. топососсит і Ае. їаиб5спії (Фігура 4). Ступінь ідентичності амінокислотної послідовності серед членів БСКОА!1 знаходилася в діапазоні між 78-8995, тоді як поліпептид

Зг50 показав ідентичність на 8195 і 8095 до послідовностей амінокислот ТтМіаї їі 5гЗ33, відповідно. Білки стійкості до іржі листя пшениці 1, 10 ї їг21 значно відрізнялися від клади

Міа/5г33/51г50 (Фіг. 4), з ідентичністю послідовностей від 1995 до 3395, що свідчить про відсутність спорідненості з поліпептидами стійкості до іржі листя. Поліпептиди з іржею листя значно відрізнялися від поліпептидів, стійких до іржі, та їх можна було легко відрізнити.

Поліпептид, кодований єдиним іншим клонованим геном стійкості до іржі пшениці, 5г35 з Т. топососсит, показав ідентичність амінокислоти до 5г50 на 48905.

Приклад 7. Присутність гена 5г50 і варіанти в злакових рослинах

Для виявлення присутності гена 5г50 в житі, вихідні види гена 5г50 в пшениці, 114 географічно різних сортів жита були досліджені за допомогою ПЛР з праймерами, які фланкують 5г50. Ампліфікацію ПЛР здійснювали за допомогою полімерази ДНК РішШНга Ії бо Еивіоп Н5 і олігонуклеотидних праймерів Е1-К1 з подальшою вставкою ПЛР з праймерами Е3-

КЗ. Ці реакції ампліфікували продукт ПЛР 4,17 т.п.н., включаючи весь ген 5г50.

Ампліфікація послідовностей 5г50 відбувалася тільки на 10 з 114 зразків, що вказує на присутність гена 5г50 або близького гомолога в цих 10 зразках. У п'яти з цих зразків ампліфікований ген був ідентичний 5г50, а в трьох інших містилися невеликі заміни, а два зразки були зруйновані інверсією послідовностей. Всі ці зразки жита, за винятком К1! Дворфа

Петкуса, показали стійкість до декількох рас стеблової іржі, включаючи мутант вірулентний до

Зг50, що свідчить про наявність додаткових генів г, які можуть знаходитись на інших хромосомах. Незважаючи на схожість послідовностей гена 5150 в більшості з цих зразків, вони містили різноманітні гаплотипи цього складного локусу, що надає підстави припускати значну рекомбінацію всередині цього кластера в житі. Обидва гени 5г31 та Мг9 з жовтою іржею зустрічаються в тій самій ділянці 1К5 і можуть також належати до цього сімейства генів. Таким чином, цей локус ймовірно є гарячою точкою для розвитку специфічності стійкості до грибів в злаках, в тому числі в пшениці, ячмені та житі.

Приклад 8. Функціональний аналіз поліпептиду 5г50

Спірально закручений домен МІ А10, 5г33 та 5150 достатній для індукції загибелі клітин.

Попередній функціональний аналіз М-кінцевої ділянки МІ А показав, що фрагмент з 225 амінокислот, що включає спірально закручені домени і частину нуклеотид-зв'язувальних доменів, може самоасоціюватися в дріжджах, а фрагмент з 160 амінокислот, який містить лише спірально закручений домен, був самоактивним при передаванні сигналу про загибель клітин в рослинах. Фрагмент зі 120 амінокислот, який був зрізаним спірально закрученим доменом, міг димеризуватися іп міго (Маекауча еї а!., 2011; Ваї еї аї., 2012).

З метою дослідження того, чи функціонували ортологи пшениці і жита 5133 і 5г50 аналогічно до МІ А і з метою визначення мінімальної функціональної ділянки при передаванні сигналів про загибель клітин, різні М-кінцеві фрагменти поліпептидів 5г50 і 5г33 зливалися або з С-кінцевою міткою НА, або з міткою СЕР. Ці злиті поліпептиди були транзієнтно експресовані в клітинах листя М. рбепіпатіапа під контролем промотору 355, як описано в Прикладі 1. Конструкції, які експресували повні спірально закручені домени 5Г33 і 5г50, а саме амінокислоти 1-160 та 1-163, відповідно, викликали сильну реакцію на загибель клітин в клітинах листя, що було помітно через 40 годин після агроінфільтрації як некрозу тканин листя в інфільтрованих зонах.

Як і в попередніх звітах (Макеауча еї аї., 2011; Ваї еї аІ., 2012), відповідна доменна форма ячменю МГА, МІ А101-160 також викликала сильну реакцію на загибель клітин, що було помітно протягом 24 годин при експресії в клітинах листя М. репіпатіапа. Інша конструкція, утворена для експресії позитивного контрольного білкового синтезу, рисового самоактивного СС-МВ-І ВА

ЕБАА (Сезагі єї аї., 2014), також викликала сильну реакцію на загибель клітин, а мутантний варіант КОСА4 не викликав реакції в клітинах листя М. Бепіпатіапа. Експресія спірально закручених доменів разом з частиною нуклеотид-зв'язувальних доменів 5г33 (1-225), 5150 (1- 228) і МІ А10 (1-225) також викликала сильні реакції на загибель клітин. Проте, зрізані спірально закручені домени МІ А10 (1-120), 5/33 (1-120) ї 5г50 (1-123), злиті з міткою НА, не викликали загибель клітин в М. Ббепіпатіапа. Вестерн-блот-аналіз показав, що всі злиті білюим належним чином експресуються в клітинах листя.

У сукупності ці результати показали, що повні спірально закручені домени МІ АТО, 5г33 і 5г50 є необхідними і достатніми для індукції передавання сигналів про загибель клітин, і незважаючи на те, що зрізаний спірально закручений домен МІ А10, димеризований в розчині, і його кристалічну структуру було відокремлено (МаєекКаула еї аї., 2011), цього було недостатньо, щоб викликати реакцію на загибель клітин. Ці дані показали, що функція спірально закрученого домену в кожному поліпептиді має ініціювати індукцію загибелі клітин, що пов'язана з реакцію стійкості в клітинах стебла пшениці за присутності патогену.

Спірально закручені домени 5г33, 5г50 і Її г21 утворюють гомокомплекси

Незважаючи на зрізаний фрагмент МГАТ1О СС5-120 здатний самоасоціюватися в розчині з утворенням димеру, було показано, що лише домен МГАТО СС-МВ1-225 самовзаємодіє при випробуванні в дріжджовому двогібридному аналізі (Маекама еї аї.., 2011). Самовзаємодія не була продемонстрована з мінімальним активним доменом СС1-160. Тому були проведені дріжджові двогібридні експерименти для перевірки взаємодії між зрізаними фрагментами СС,

СС і Со-МВ МГАТ0 ї 5г50. Імуноблотинг показав, що під час експериментів всі фрагменти білка експресуються в дріжджових клітинах. Результати показали, що повні спірально закручені домени МІ А10 і 5г50 необхідні для самоасоціації в дріжджах, а в зрізаних спірально закручених доменах цих білків не була виявлена жодна взаємодія.

Щоб визначити, чи активні спірально закручені домени МІА10, 5г33 і 5г50, які самоасоціювалися в рослинах, комбінації мічених НА і СЕР доменів МІ АТО, 5г33 ї 51:50 бо коекспресувалися в клітинах листя М. Бепійатіапа і чи проводилися аналізи коїмунопреципітації. Домен СС1-284 неспорідненого поліпептиду стійкості І г21, який, як відомо, був самоактивним в рослинах, був також включений до експерименту для перевірки його здатності до самовзаємодії. Як контрольний зразок для визначення специфічності зв'язування застосовували домен КОСА4 СС (амінокислоти 1-171), злитий з СЕР. Імуноблотинг за допомогою антитіл анти-СЕР і анти-НА показав, що всі поліпептиди експресувалися, як передбачалося, за винятком злитих поліпептидів МІ А10, що, ймовірно, пов'язано з швидшою реакцією на загибель клітин, викликаною цими поліпептидами, і їхнім подальшим розкладанням в клітинах.

Імунопреципітацію застосовували для аналізу асоціації коекспресії поліпептидів.

Імунопреципітація антитілами анти-СЕР призвела до збагачення всіх злитих СЕР білків і 5г331- 160: НА, 51501-163: НА ії І г211-284: НА, специфічно копреципітували з 5г331-160: СЕР, 51501- 163: СЕР ї Гг211-284: СЕР, відповідно, але не з КОА41-171: СЕР. У сукупності ці результати показали, що спірально закручені домени 5г33, 5г50 і Їг21 мають здатність утворювати специфічні гомокомплекси в рослинах, тобто самоасоціюватися.

Цитоплазматична локалізація спірально закручених доменів МІАТО, 5гЗ33 і 9550 є необхідною для індукції загибелі клітин

Було показано, що повнорозмірний поліпептид МІ А10 ї його домен СС-МВ1-225 викликають передавання сигналу загибелі клітин при локалізації в цитоплазмі клітин листя М. Бепіпатіапа (Ваї єї аІ., 2012). Щоб визначити, чи може коротший домен МІ А10 СС1-160, який, як вважається, необхідний для індукції загибелі клітин, самостійно викликати загибель клітин при локалізації в цитоплазмі і щоб перевірити цю властивість у спірально закручених доменів 5г33 і 5г50, ці домени транзієнтно експресувалися в М. Ббепіпатіапа, злитого з УЕР разом з сигналом ядерної локалізації (МІ 5), мутованим МІ 5 (пі5), сигналом ядерного експорту (МЕ5) або мутантним МЕ5 (пе5). Після експресії МЕР: злиті МІ/.5 спірально закручені домени, специфічну флуоресценцію

МЕР було виявлено виключно в ядрах клітин М. Ббепіпатіапа. На відміну від цього, спірально закручені домени, злиті з МЕР: МЕЗ були фактично виключені з ядер, причому флуоресценція

МЕР була виявлена в цитозолі і оточувала тільки ядра, тоді як мутовані варіанти пів і пе5 допускали виявлення флуоресценції УЕР як в цитозолі, так і в ядрах як передбачалося. Аналізи загибелі клітин в клітинах листя М. бепіпатіапа показали, що примусова ядерна локалізація всіх спірально закручених доменів зменшувала активність загибелі їхніх клітин. Інші злиття з МЕР:

Зо МЕ5, МЕР: пе або УЕР: пі5 не впливали на активність спірально закручених доменів МІ А10 або 533, що індукує загибель клітин. У випадку спірально закрученого домену 5г50 мутантні пів також демонстрували певне зменшення активності загибелі клітин відносно злиття МЕ5 і пев.

Експресія білків всіх конструкцій була підтверджена імуноблотингом. Конструкції злиття МЕ5 послідовно демонстрували нижче накопичення білка. Проте, ці конструкції продемонстрували найсильніший фенотип загибелі клітин (гіперчутлива реакція, НЕК) фенотип, що надає підстави для припущення, що процеси загибелі клітин і розкладання білка вже були активовані під час відбору проб. Ці результати показали, що цитозольна локалізація цих спірально закручених доменів необхідна для індукції загибелі клітин.

Приклад 9. Обговорення

Як стійкість до борошнистої роси, так і стійкість до іржі кодуються генами Міа

Гілка гена Міа з генів СС-МВ-І КК, спочатку визначена на хромосомі 1Н5 в ячмені як ген стійкості до борошнистої роси, також зустрічається у пшениці, де ортологи включають ген стійкості до борошнистої роси ТтМіа! (Чогаоп еї аї., 2011) і ген стійкості до стеблової іржі 5г33 (Регіуаппап еї аї., 2013). Гени зустрічаються як невелике сімейство генів, що складається з 5 членів, в пшениці і ячмені. Блот-аналіз на основі гелю ДНК показав, що це сімейство значно зросло до більше 20 членів на хромосомі 1К5 в житі (Мадо еї а!., 2004). Експерименти, описані вище, тепер показали, що ген стійкості до стеблової іржі 5г50 є членом сімейства ортологічних генів Міа жита.

Незважаючи на те, що раніше були виділені гени 5г33 і 5г35, стійкі до стеблової іржі пшениці (Регіуаппап еї аї., 2013; Заіпіепас еї аї., 2013), що походять з пшениці, ген 5г50 був першим клонованим геном стійкості до іржі, який походить з жита і який ефективний проти всіх відомих польових рас Рдї, включаючи 0999. Шляхом мапування з високим розділенням і дослідження мутацій, ген 5г31 та ген стійкості до жовтої іржі Уг9 від жита РеїКи5 1К5 були вміщені в ділянку, гомологічну 5г50 (Мадо еї аї., 2005), що надає підстави вважати, що ці гени можуть також належати до сімейства генів Міа. Отже, цей багатовидовий локус, ймовірно, є «гарячою точкою» для розвитку стійкості в злакових рослинах.

Підклітинна локалізація білків МВ-І КЕ та активація загибелі клітин

Завдяки підвищенню поінформованості про локалізацію білків МВ-І ЕК було виявлено, що вона може спостерігатися і активуватися в широкому розмаїтті клітинних компартментів. Деякі з 60 них є виключно ядерними, такі як КК51 (ОезіІапаез еї аї., 2003; Тазвзеї еї аї., 2010), тоді як інші,

такі як КОА4 і КОА5Б, в основному локалізуються в цитозолі (Сезагі еї аї., 2014 року). Крт!1 (Сао еї аї., 2011), ВРБ2 (АхієїЇ апа їабзКаміс:, 2003) і КРБЗ5 (ОЇ еї аїЇ., 2012) розташовані на плазматичній мембрані, а білки Ї6 і М льону зустрічаються на мембранах Гольджи і тонопластів, відповідно (ТаКетоїо еї аЇ, 2012). Проте, багато демонструють нуклеоцитоплазматичну локалізацію, таку як М (Вигсйп-Зтіїй єї аї!., 2007; Саріап еї а!., 2008),

АРБА (УМіпнтиеПег єї аї!., 2007), 5МС1 (Спепд еї аї., 2009), РІіК1/РІіК2 (7Наї єї а!., 2014), Ах (Біооїмєд вї аї!., 2010) апа МІ АТО (неп еї аї., 2007).

У випадку поліпептиду СС-МВ-І КЕ. картоплі Ех, який ініціює розпізнавання білка оболонки (СР) вірусу картоплі Х (РУХ), було показано, що СР активує Ех в цитоплазмі, а примусова ядерна локалізація Ех значно порушила як вірусостійкість, так і процес загибелі клітин (5іооїмед еї аї, 2010; Татеїйпа еї аї!., 2010). Проте, вихід з ядра Ех лише помірно зменшував стійкість до

РМС (біооїмед еї аїЇ., 2010), що вказує на те, що цитозольний пул був найважливішим, незважаючи на те, що ядерні та цитоплазматичні пули білка стійкості могли б сприяти передаванню сигналів стійкості. На відміну від цього, в іншому дослідженні, присвяченому

МІ АТО, було продемонстровано, що ядерний локалізований рецептор є достатнім для надання стійкості до В. дгатіпі5 в ході аналізу перехідних одиночних клітин в ячмені, тоді як виключений в ядерний спосіб МІ А10 не є достатнім для цього (Зпеп еї аї., 2007). Проте, примусова ядерна локалізація самоактивних варіантів білла МА порушувала індукцію загибелі клітин, тоді як варіанти, виключені в ядерний спосіб, були достатніми для ініціації стійкості (Ваї еї аї., 2012).

Щоб це пояснити, було висловлено припущення про те, що передача сигналів про загибель клітин, викликана МІ АТО і передача сигналів про стійкість до захворювань відбуваються в різних компартментах (Ваї єї аї!., 2012). В альтернативному варіанті, розпізнавання АМКадто може відбуватися виключно в ядрі, що пояснюється вимогою до ядерного локалізованого рецептора надавати стійкість з подальшими сигнальними подіями, які, ймовірно, відбуваються в цитоплазмі.

Зг33 і, як показали експерименти, описані вище, 5г50 є гомологами МІ А10 і за допомогою їхніх мінімальних спірально закручених доменів сигналізації, спостерігалася подібна модель індукції загибелі клітин відносно того, що ініціювалося повнорозмірним білююом МІА1Т0 або доменом МІАТО СС-МВ (Ваї еї аї., 2012). Таким чином, виходить, що реакції, викликані МГ АТО в

Зо ячмені і його близьких гомологах пшениці, є схожими, що вказує на консервативний шлях загибелі клітин, викликаної різними патогенами у двох різних видів злакових рослин.

Фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що до даного винаходу можуть бути включені численні варіанти і/або модифікації, як показано в конкретних варіантах здійснення даного винаходу, не відходячи від суті або обсягу винаходу, як широко описано. Тому дані варіанти здійснення даного винаходу мають розглядатися у всіх випадках як ілюстративні, а не обмежувальні.

Дана заявка запитує пріоритет від АО 2015904976, поданої 1 грудня 2015 р., повний зміст якої включений до даного винаходу шляхом посилання.

Всі публікації, що описуються і/або на які йде посилання в даному документі, повністю включені до нього.

Будь-яке обговорення документів, дій, матеріалів, пристроїв, виробів тощо, включене в даний опис, призначено лише з метою надання контексту для цього винаходу. Його не слід сприймати як припущення, що будь-які або всі ці питання є частиною основи попереднього рівня техніки або є загальнодоступними відомостями в галузі, що стосується даного винаходу, які існували до дати пріоритету кожного пункту формули цієї заявки.

Джерела інформації:

Арашіан еї аї. (1986) Віоїесппоіоду 4:1087.

АхієїЇ апа єїазКамісаг (2003) Сеї! 112:369-377.

Ваї єї а). (2012) РІ о5 Раїйод 8(6): е1002752. доі:10.1371/Лошттаї.рраї.1002752.

Ват еї а!. (2008) Ргос 5 Аїї 5ид Тесппої Ав 81:508-512.

Вагкег єї а!. (1983) Ріапі Мої. Віої. 2: 235-350.

Ветоих вї а!. (2008) Ріапі СеїІ 20:2252-2264.

Вемап сеї а. (1983) Мисі. Асіа Нев. 11: 369-385.

Витсп-5тій еї а!. (2007) РІо5 Віо! 5: еб8.

Садмеї! апа доусе (1992) РСВ Мейїнодз Аррі. 2:28-33.

Сарессні (1980) СеїІ 22:479-488.

Саріап єї а!. (2008) СеїІ 132:449-462.

Сезагі еї аІ. (2014) ЕМВО у 33:1941-1959.

СНнакКгабопу еї а!. (2011) ЕЄирНуїїса 179:19-32. 60 Снепа еї аї. (1996) Ріапі Сеї! Вер. 15:653-657.

Снепа еї а. (2009) Ріапі Сеї! 21:2503-2516.

СіІарр (1993) Сііп. Регіпайо!. 20:155-168.

Сіошіег єї аї. (2007) Ріапі Мої Віо! 65:93-106.

Сосо еї аї. (2001) Майшге Віоїесппоіоду 19:354-359.

Сосо еї аї. (2002) Майшге Віоїесппоіоду 20:1246-1250.

Сотаї еї а!. (2004) Ріапі У 37: 778-786.

Сооівєу єї а!. (2000) Ріапі Сеї! 12:663-676.

Статет!!і еїг а. (1998) Майшиге 391:288-291.

Сигієї! еї а. (1992) Нит. Сеп. Тег. 3:147-154.

Резіапаез вї аї. (2003) Ргос Маї! Асай бсі ОБА 100:8024-8029.

Бирієзввів вї а!. (2011) Ргос Маї! Асад 5сі ОБА 108:9166-9171.

Едает еї а!. (2005) Спетріоснет 6:1062-1067.

Евійіз еї а!. (1988) Віотесппіднев 6:608-614.

ЕІЇв єї аї. (2014) Егопііегз іп Ріапі бсієпсе 5:641.

ЕпКкпвауаг евї а!. (2004) Ргоївєїн5 54:394-403.

Еецйеї єї аї. (2003) Ргос Маї! Асад 5сі 100:15253-15258.

Ецітига еї а!. (1985) Ріапі Тіззиє Сийигаї! І еНегз 2:74.

Сао еї аї. (2011) Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 108:7619-7624.

Сапіпкеї! еї аї. (1983) СеїІ 27: 143-153.

Сієї? апа М/осаз (2002) Меїй. Епгутої. 350:87-96.

Станат еї аї. (1973) Мігоіїоду 54:536-539.

Стапі єї а!. (1995) Ріапі Сеї! Вер. 15:254-258.

Стеме (1983) 9. Мої. Аррі. Сепеї. 1: 499-511.

Нагауата (1998) Ттепаз Віоїтесппої!. 16:76-82.

Неїїпда (1997) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. 94:10015-10017.

Непікої єї а!. (2004) РіІапі Рпувзіо! 135: 630-636.

Ніпснеєеє еї а!. (1988) Віотесп. 6:915

Ниапя єї а!. (2003) Сепеїйсв 164:655-664.

Ібпіда єї аї. (2014) М/пеаї (Тиййсит аевіїмит І.) їапетоптаїйоп ивіпд іттайшге упеаї етбгуов.

Зо Іп У/апа (єд.) Адгобасівтит ргоїюсоїів: Моїште 1, Меїйодз іп Моїесшіаг Віоіоду, мої. 1223. Зргіпдет",

Мем Могк.

Уегеадцеї еї а. (2008) Віоїесппіднев5 45:523-532.

УЛіп апа 5іпой (2006) Ріапі бів 90:476-480.

Чогаап сеї а. (2011) Ріапі У 65:610-621.

Човпї (1987) Мисі. Асіа Рез. 15: 6643-6653.

Кегрег апа руск (1979) Невібїапсе Ю 5ієт апа Івєаї гиві ої улеаї іп Аедіюр5 5диатоза апа

ШМапвіег ої а депе ог віт гиві гевівіапсе (о пехаріоїд м/Неаї. Р.358-364. Іп 5. Ватапціат (єд.)

Ргос. Бій Іпі. МУнеаї Сепеї Зутр, Мем Оеїні, Іпаіа, 23-28 Бер 1978.

Ктаніпде" єї аї. (2009) бсієпсе 323:37-395.

Ї апдгідде еї а. (2001) А!йві. У. Адгіс. Нев5. 52: 1043-1077.

І етівих (2000) Ситепі Сепотісв 1: 301-311.

Ї еипа еї а!ї. (1989) Тесппідие 1:11-15.

Ги апа Веїту (2007) Ргоївїп Бігисіцге Оевідп апа Епдіпеегіпд, Напабоок ої Ргоїєїпв5 2: 1153- 1157.

Ї и еї а. (1993) 9. Ехр. Меа. 178: 2089-2096.

Мааз еї а). (1997) Мої. Вгеєа 3:15-28.

Маеєкама є! а!. (2011) Сеї! Нові Містобе 9:187-199.

Мадо еї а!. (2004) Сепоте 47, 112-121.

Мадо еї а!. (2005) Тнеог Аррі Сепеї 112: 41-50.

Мадо еї а!. (2009) Тнеог Аррі Сепеї 124:65-70.

Мсіпюзн еї аї. (1995) Мнеаї гивів: ап айавз ої гезівїапсе депез (С5ІВО Рибіївпіпо, 1995).

Медрег!ту вї а!. (1992) Ріапі Сеї! 4: 185-192.

Меадре!ту сеї а!. (1993) Ріапі у. 3: 619-626.

Меуєгз еї аї. (1999) Ріапі доитаї 20:317-332.

Місне!тоге апа Меуегз (1998) Сепоте Вез. 8:1113-1130.

МеєеаІетап апа Уипзсп (1970) 9. Мої Віої. 45:443-453.

Мез5 вї аї. (2002) Майте ВіотесппоІоду 20:11251-1255.

Мієд2 єї а. (1995) Ріапі Сеї! Верогів 14: 403-406.

Оівоп еї а!. (2013) Тнеог Аррі Сепеї (001 10.1007/500122-013-2045-5). 60 О5іептвеіег єї а. (1999) Майте ВіотесппоЇоду 17:1205-1209.

Ом єїа!. (1986) Зсієпсе 234: 856-859.

Рап еї аї. (2000) 9. Мої. Емої. 50:203-2013.

Регіуаппап вї а!. (2013) Зсієпсе 341:786-788.

Ргазнег еї а!. (1985) Віоспет. Віорпув. Ве5. Сотт. 126: 1259-68.

ОЇ єї аї. (2012) Ріапі Рнузіоіоду 158:1819-1832.

Віснагазоп еї аї. (2014) Ріапі Сеї, Тізвиє апа Огдап Сийиге 119:647-659.

Водом»кКу евї аї. (1991) Тнеог Аррі Сепеї 82:537-544. зЗаіютоп єї аї. (1984) ЕМВО 3. 3: 141-146.

Заіпієпас єї а!. (2013) Зсієпсе 341:783-786.

Зеепоїег вї а!. (2010) Мої! Ріапі Містгобе Іпіегасі 23:497-509. зпеп еї аї. (2007) Зсієпсе 325:1098-103. зперпега, КМУ. іп Ргосеєдіпдв ої Ше 4 Іпіегпайопа! М/неаї Сепеїїсв 5утрозішт, Соїштрбіа,

Мівзошгі, ОБА (єд5 Зеагїв Е.В. в Звагв І .М.5.). 745-760 (Опімегейу ої Міззоишті, 1973). зЗіебег єї аї. (2001) Майте ВіоїесппоІоду 19:456-460.

ЗіткКома еї а!. (2008) ВМО ССепотісв. 9:237. зіпой еїаї. (2011) Аппи Нем РПпуїораїйної 49:465-481. зЗіппеїй єї а!. (1998) ВіоТеснпіднев 24:752-754.

Зіаде апа Кпаші (2005) Тгтапздепіс Вев. 14: 109-115.

Зіооїмеа сеї а!. (2010) Ріапі СеїІ 22:4195-4215. «заїКег еї а!. (1988) Зсіепсе 242:419-423.

Зіеттег (1994а) Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. ОБА 91:10747-10751.

Зіеттег (19945) Маште 370(6488):389-391.

ТаКетоїо еї аї. (2012) Мо! Ріапі Містобе Іпіегасі 25:379-392.

Татеїпа еї а!. (2002) Ріапі Сеї! 14:2929-2939.

Татеїпа еї а. (2010) Ріапі СеїІ 22:4176-4194.

Таззеї єї а. (2010) РІ о5 Раїштод 6(11): е1001202. доїі:10.1371/Лошттаї.рраї.1001202.

Тпйеї еї а. (1988) 9. Віої. Спет. 263:12500.

Топуата еї а!. (1986) Тнеог. Аррі. Сепеї. 205:34.

Ткацші (1994) Єиг. 9. Віоспет. 222:9-19.

Зо МоїКом еї а!. (1999) Мисієїс Асіа5 Незеагсі 27:е18.

М/адпег єї а. (1992) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 89:6099-6103.

Мапа еї а. (1998) Асіа. Нопіс. 461:401-405.

Мапа еї а. (2011) Мем Рпуїоодіві. 191: 418-431.

МУеї єї а. (1999) Сепеїїсв 153:1929-1948.

Меї єї а!. (2002) Ріапі Сеї! 14:1903-1917.

Меп еї а. (1995) Сеї! 82:463-473.

М/іпптиеї!ег еї аї. (2007) Ситт Віої! 17:2023-2029. 7еМег, Е.). іп Ргосеєдіпд5 ої Ше 4 Іпіегпайопа! МУнєаї Сепеїїсз Зутровзішт, СоІштрбіа,

Мівзоцгі, ОБА (єд5 Зеагїв Е.В. в зва І .М.5.). 209-221 (Опімегейу ої Міззоишті, 1973). 2ейПег апа Риснз (1983) 2. Ріїлісні 90:285296. «Паї еїг а. (2014) Р О5БОМЕ 9:е98067. доі:10.1371/Лошитаї.ропе.0098067. «пас еї а. (1998) Маїшге Віотесппоіоду 16:258-261.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Соштопмеа1єб 5сієпріїтіс апа Іпди5сгіа! БРезеакссі

Огдапівасіоп «1205 ГЕН СТІЙКОСТІ ДО СТЕБЛОВОЇ ІРЖІ «1305 522819 «1505 А) 2015904976 «1515 2015-12-01 «1605 (59 «1705 РарепсІпПп уегквзіоп 3.5 «2105 1 «2115 956 «2125 РЕТ «213» Жито посівне «4005 1 бо Меє АБп о І1їе Уаії ТПг сіу А1ї1а Меєс сі1у Бек Гей І1їе Рго Ппув Ге Щ1У 1 З 10 15 біш Гей Гей Меє Авр бій Тук Ппув Гей Нів Ппув Агуд І1е Ппув Тув Авр 20 25 30

Уаї біш Рпбе Гей пув Ппув біц Гей сбіц бек Меє Ні Аї1а Аїа Гей І1е 35 40 45 пув Маї б1у бі Уаі Рго Агуд Авр біп Гей Авр Агуд біп Уаї Гпув Іей 50 55 бо

ТЕр Аїа Авр сіц Уаії Агкд біц Гей бек Туг Авп Меє бій Авр Уа1ї Уаї 65 70 75 80

Авр пув Ріпе Ггец Уаі Агд Уаі Авр сб1і1у Авр б1у І1е сбіп сіп Рго Нів 85 90 95

Авр Авп обек біу Акд Рпе Гув біц ІТецшп Гув АвБп Гпув Меє Іїе с1Уу Іец 100 105 110

Рпе Ппув Ппув б1у Агуд АвБп Нів Нів Акуд І1е Азїа АБр Аїа І1е Іув сіц 115 120 125

І1е ув біц біп Тец бі1іп сій Уаі Аза Аза Агуд Агуд Авр Агуд Авп о Гув 130 135 140

Уаї Аза Уа1ї Рго Авп Рго Месє бій Рго І1ї1е ТПг І1е АБр Рго Сув Іеєец 145 150 155 160

Акуд Аза Гей Тут Аїа біцш Аза ТБПг біц Іец Уаії с1у І1е Тук с1УуУ Гув

Зо 165 170 175

Акуд Авр біц біц Іец Меє Агд Гец Іец бек Меє сій с1у Авр Авр Аїа 180 185 190 зек Авп ГПув Агуд Гешп Ппув Ппув УМаї бек Іїе Уаї сі1у Рпе сіу с1Уу Іецй 195 200 205 сб1у Гпув ТПг ТпПс Геш Аза Агуд Аза Уа1і Тукг Авр пув І1е Ппув б1у Авр 210 215 220

Рпе Авр Сув Агд Азїа Рпе Уаі Ркго Уаі сб1і1у біп Авп Рго Авр Меє Гув 225 230 235 240

Тпув Маї гей Агуд Авр Іїе Гей І1їе Авр Гей с1у Авп Рго Нів б5ег Авр 245 250 255

Тец Аї1а І1е гей Авр Ар Гпув сіп Гей Уа1і Ппув Ппув Гей Нібв Авр РіПе 260 265 270

Тен бій АвБп о Гпув Аг Туг Тецй Уаї Іїе І1е Авр АвБр І1е Тгр АБр біц 275 280 285

Меє гей Тгр біш с1іу Іїе Авп Рпе Аза Ріе бБег АвБп Агд АБп АвБп Гей 290 295 300 бі1іу век Агкд Гей Іїе ТПг ТПг ТПг Агуд Авп Рпе Авр Уаї бек Кпув бег 305 310 315 320

Сув Сув Гей бек Аїа Авр Авр бек Іїе Тукг Ппув Меє пуб Рго Іец 5ег 60 325 330 335

ТПЕ Авр Авр бБег Агуд Агд Тец Рпе Нів пуб Агд І1е Рпе Рго АБр Аза 340 345 350 сі1у б1у Сув Рго Бек біш Рбе сіп сбіп Уаі1і бек сій Авр І1е Іецй Гу 355 3З6о 365

Тпув Сув б1у сіу Уаі Рго гейш Аза Ії1е Іїе ТПг Іїе Аза бек Аїа Іей 370 375 380

А1а бек с1у біп Нів Маії Ппув Рго Ппув Нів бій Тгр Авр І1е Іец Іецй 385 390 395 400 біп бек Гей сіу Бек сіу Уа1 ТПг пув Авр Ап бек Гей Уаї сі Меє 405 410 415

Акуд Агуд ч1І1е Гец бек РПе бек Тук Тукг Авп Гей Рго бек Нів Гец Гув 420 425 430

ТПЕ Сув Гей Гей Тукг ІТец Сув І1е Туг Рго б1ц Авр бек ТПг І1е с01У 435 440 445

Акуд Авр Агуд Гец І1е Тгр ув Тгр Уаі Аїа біцш сб1у Рпе Уаї Нів Нів 450 455 460 с1у Авр біп біу ТПг бек Гей Рібе Гей Уаії с1іу Гей АвБп Тук Рпе Авп 465 470 475 480 біп Гей І1їе АвБп Агуд Бек Меє І1їе сіп Рго Іїе Туг Авр сбіц Гец с1Уу 485 490 495

Зо біп Маії Нів Аза Сув Агкуд Уа1і1 Нів Авр Меє Уаї Іецй Авр Гей Іїе Сув 500 505 510

Авп оРпе бек Нів біц Аза Гув Рбе Уаі Авп Уаі Іейп АвБр с01у ТПгЕ щ1У

З5 515 520 525

АвпобБекг І1е бек бек біп бек Авп Уаі Агуд Агд Гей бек Гец біп Авп 530 535 540 пув Меє біц Авр Нів біп Аїа Пув Рго Гей ТПг Ап І1е Меєс бек Меє 545 550 555 560 зек Агуд Уаі Агд бек І1е ТПг Іїе Рпе Рго Рго Аза Уаї бек І1е Меє 565 570 575

Ркго Бек Пец бек Меє Рпе бій Уаії Іец Агуд Уаї Гей Авр Гей бек Авп 580 585 590

Сув Авр Гей сіу Ппув Бек бек бек Ггец біп Тец Авп Гей Гув сіу Уаї 595 бо 605 сбі1у Нів Гей Іїе Нів Гей Агуд Туг Гей Авр Гей сіп сіу ТПг сбіп І1е 610 615 620 зек бі їем Рго ТПг біц Іїе с1у АвБп Гей біп Рпе Гей сі Уа1! Іецй 625 630 635 640

Авр Гей Авр АвБп АвБп о Тук бій Гец Авр бій Гей Рго Бек ТПг Гей Ріе 645 650 655 60 ув Теп Агуд Агуд Гей Іїе Тук Гей Авп Уа1і Меє Гей Тук пув Уа1ї Уаї

А

6бво 665 670

Ркго ТПг Рго біу УМаії Іейп біп Авп Меє ТПг бек Іїе сі Уаі1і Гей Агд 675 68 685 сі1у Маї Гей Уаії бек гейш Авхп І1їе І1ї1е Аїа сіп сій Гец с1у Авп Іей 690 695 700

ТПгЕ Агуд гей Агуд біц Гец Гуз Іїе Сув Рбе Губв Авр б1у Авп Гей Авр 705 710 715 720 зек Тук Мпув Тец Рпе Уаї Ппув бек Іец б1у АвБп Гей Нів Нів Іїе сіц 725 730 735 зек Гпеп бек І1е бек Тук Авп бек Пув бій ТПг бек Рпе сі Іец Мес 740 745 750

Авр Гей Ггец сіу біц Агуд Тер Уаї Ркго Рго Уаі Нів Гей Агд сій Ре 755 760 765

Уаї бек Тер Меє Рго бек Ссіп Гец бек Аза Гей Агуд сіу Тгр І1е Гув 770 775 780

Акуд Авр о Рго бек Нів Іец бек Авп ІТец бек біп Гей Іїе Гей Тер Рго 785 790 795 800

Уаї пув бі Уаі1 сбіп сбіп біц Авр Уа1! сіц І1їе І1е сС1у с1у Іец Іецй 805 810 815

Зо зек Геп Акуд Агуд Гей Тгр І1їе Ппув бек ТіПг Нів сіп ТПг сіп Ак Іецй 820 825 830

Тец Маії І1ї1е Агуд Аза Авр сіу Рпе Агуд Сув Меє Меє Авр Рібе сіц Іей 835 840 845

З5

Ап оСув сіу бек Аїа Азїа біп І1е Меє Рпе бій Рго с1у Аїа Гей Рго 850 855 860

Акуд Аїа сіц Уаї Іец УМаії Рпе бег Іец бі1у Уаі Агуд Уаі Аїа сіп сіц 865 870 875 880

Авр о с1у Авп Сув біу Рпе Авр Гец біу Іїецп біп с1іу Авп Гей Гей б5ег 885 890 895 їесч Агуд Ні Авр Уаі Ріпе Уаї Акуд І1е Тук Сув сі1у б1у А1ї1а Агд Уаї 900 905 910 с1у 611 Аза пув біш Аїа сбіц Аза Аза Уаі Агку Нів Аїа Гец сіц А1а 915 920 925

Нів Рго Ап оНів Рго Рго І1е Авр Ії1е біц Меє ТПг Рго Туг Іе Аїа 930 935 940 бі б1у Аза Агуд Авр АвБр Авр Гей Сув бій бій Авп 945 950 955 «2105 2 «2115» 956 «212» РЕТ 60 «213» Жито посівне «4005 2

Меє Ап чІ1ї1е Уаі1і ТпПг сіу Аїа Меє сіу бек Гей Ії1е Рго Гув Іеш 0Щ1У 1 5 10 15 біш Гей Гей Меє Авр бій Тук Ппув Гей Нів Ппув Агуд І1е Ппув Тув Авр 20 25 30

Уаї бій Рпе Гей Ппув Ппув біц Гей бій бек Месє Ні5 Аза Аїа їецй те 35 40 45 пув Ма1ї б1у бі Маї Ркго Агуд Авр біп Гей Авр Агуд біп Уаї Ппув Гей 50 55 бо

ТЕр Аїа Авр сіц Уаії Агкд біц Гей бек Тут Авп Меє бій Авр Уа1 Уаї 65 70 75 80

Авр Авп обек біу Акд Рпе Гув біц Тец Ппув Ап пув Меє І1ї1е СсС1Уу Іей 100 105 110

Рпе пув пув б1у Агд АБп Нів Ні Агуд І1е Аза АБр Аза Іїе Гув сіц 115 120 125

Іїе пув біц біп Геп біп сій Уаі! Аї1а Аза Агуд Агуд Авр Агуд АвБп о Гув 130 135 140

Зо

Акуд Аза Гец Туг Аїа бі1іп Аза ТПг бій Ге Уа1! сіу І1е Тук с1Уу Гув 165 170 175

Акуд Авр біц біц Іец Меє Агд Гец Іец бек Меє сій с1у Авр Авр Аїа

З5 180 185 190 зек Авп о ГПув Агд Тец Гув Кпув Уаії Бек Іїе Уа1 сіу Робе сСіу С1Уу Іей 195 200 205 сі1у Ппув ТП ТПг Гей Аза Агуд Аїа Уаї Тукг Авр Пув І1е Гув с1у Авр 210 215 220

Рпе Авр Сув Агд Азїа Рпе Уаі Рго Уаі б1і1у біп Авп Рго Авр Меє Гув 225 230 235 240

Те бій АвБп Гпув Агуд Туг Гей Уаі Іїе Ії1е Ар Авр І1е Тгр АБр б1іц 275 280 285

Меє теп Тер сій с1у І1їе АБп Рбе Азїа Рре бек Авп Агуд АБп о Авп о ТГец 290 295 300 бі1іу век Агкд Гей Іїе ТПг ТПг ТПг Агуд Авп Рпе Авр Уаї бек Кпув бег 305 310 315 320 60

Сув Сув Гей бек Аїа Авр Авр бек Іїе Тукг Ппув Меє пуб Рго Іец 5ег

325 330 335

Аза бек сіу біп Ні Уаї Гпув Рго Гу Нів бій Тгр Авр Іїе Гей Іец 385 390 395 400 сіп бек Ге сіу бек с1іу Маї ТБг Гпув Авр Авп бек Те Уаї сі Меє 405 410 415

ТПЕ Сув Гей Гей Туг ІТец Сув І1е Туг Рго б1цп Авр бБег ТПг Ше Щ1У 435 440 445

Акуд Авр Агуд Гец І1е Тгр ув Тгр Уаі Аїа біцш сб1у Рпе Уаї Нів Нів 450 455 460 б1у Авр біп сіу ТПг Бек Гей Рпе Гей Уаі сіу Гей Авп Тук Робе Авп 465 470 475 480

Зо сіп Гей І1е АвБп Агуд бек Меєсє І1їе сбіп Рго Іїе Туг Авр бій Те 1У 485 490 495 біп Ма1ї Нів Аза Сув Акуд Уа1 Нів Авр Меє Уа1! Ггецй Авр Іец І1е Сув 500 505 510

З5

Авп оРпе бек Нів біц Аза Гув Рбе Уаі Авп Уаі Іейп АвБр с01у ТПгЕ щ1У 515 520 525

АвпобБект І1е бек бек біп бек Авп Уаі Агуд Агд Гей бек Гей біп Авп 530 535 540

Тпув Меє бій Авр Нів сбіп Аза Ппув Рго Гей ТПг Авп І1е Меєсє бек Меє 545 550 555 560 зек Ак Уа1і Агуд бек Іїе ТПг Іїе Рпбе Рго Рго Аза Уаі бек Іі Мес 565 570 575

Сув Авр Гей сіу Ппув Бек бек Бек Гей біп Гей Авп Гец пув Сбіу Уаї 595 бо 605 сбі1у Нів Гей Іїе Нів Гей Агуд Туг Гей Авр Гей сіп сіу ТПг сбіп І1е 610 615 620 зек біц Гец Рго ТПг біцп І1їе с1у АБп Іїецй біп Рпе Гей бій Уа1ї ГІец 625 630 635 640 бо Авр Гей Авр АвБп АБп о Тук бій Гецп Авр бій Гей Рго бек ТПг Іей Ріе 645 650 655 ув Теп Агуд Агуд Гей Іїе Тук Гей Авп Уа1і Меє Гей Тук пув Уа1ї Уаї 6бво 665 670

Рго ТПг Ркго біу Маії Гей сіп Авп Меє ТіПг бек І1е сій Уаі Іеч Агд 675 68 685 сі1у Маї Гей Уаії бек гейш А5п І1е І1ї1е Аїа сбіп бій Гец сб1у Авп Іецй 690 695 700

ТПгЕ Агуд гей Агуд біц Гец Гуз Іїе Сув Рбе Губв Авр б1у Авп Гей Авр 705 710 715 720 зек Тук Мпув Тец РоПе Уаї Ппув бек Іец б1у АБп Гей Нів Нів І1е с1іц 725 730 735 зек Гей бек І1е бек Тук Авп бек Гув бій ТПг бек Рпе бій Гей Меє 740 745 750

Авр Геч Гей біу біц Агуд Тер Маї Рго Ркго Уаії Нів Гей Агуд сій РБГе 755 760 765

Акуд Авр Рго бБекг Нів Іец бек Авп Тец бек бій Гей І1ї1е Гей Тгр Рго 785 790 795 800

Уаї пув бі Уаі1 сбіп сбіп біц Авр Уа1! сіц І1їе І1е сС1у с1у Іец Іецй

Зо 805 810 815 зек Гей Агуд Агд ІТец б1у І1е Ппув Бек ТПг Нів сіп ТПг біп Агд Іей 820 825 830 їеч Маії І1е Агд Аїа Авр сбіу Рбе Агу Сув Меє Меє Авр Робе с1ц Гей 835 840 845

Ап оСув сіу бек Аїа Азїа біп І1їе Меє Рпе сій Рго сіу Аїа Іецй Рго 850 855 860

Авр о с1у Авп Сув біу Рпе Авр Гей сіу Гей біп с1іу Авп Гей Гей б5ег 885 890 895

Тец Акуд Нів Авр Уаі Рпе Уаі1і Агу Іїе Тук Сув сіу сб1у Аїа Агд Уаї 900 905 910 сі1у бій Аза Ппув бій Аїа бій Аза Азїа Уаії Агуд Нів Аїа Тей с1іц Аїа 915 920 925

Нів Рго Ап оНів Рго Рго І1е Авр Ії1е біц Меє ТПг Рго Туг Іе Аїа 930 935 940 бі б1у Аза Агуд Авр Авр Авр Гей Сув бій бій Авп 945 950 955 «2105 З 60 «2115 959 «212» РЕТ

«2135 Жито посівне «4005 З

Меє Ап чІ1ї1е Уаі1і ТПг сіу Аїа Меє сіу бек Гец І1е Рго Гув Іеп ШУ 1 5 10 15 біш Гей Гей Меє Авр бій Тук Ппув Гей Нів Ппув Агуд І1е Ппув Тув Авр 20 25 30

Уаї бій Рпе Гей Ппув Ппув біц Гей бій бек Месє Ніб5 Аза Аз1а еп Пе 35 40 45 пув Маї б1у бі Уаі Рго Агуд Авр біп Гей Авр Агуд біп Уаї Гпув Іей 50 55 бо

Тгр Аїа Авр бій Уаі! Агуд біц Гецй бек Тугк Авп Мес сі Авр Уаї Уаї1ї 65 70 75 80

Зо Уа1ї1 Аїа Уаї Рго Авп Рго Мес бій Рго І1їе ТПг І1їе Авр Рго Сув Іец 145 150 155 160

Акуд Аза Гей Тут Аїа біцш Аза ТБПг біц Іец Уаії с1у І1е Тук с1УуУ Гув 165 170 175

З5

Акуд Авр біц біц Іец Меє Агд Гец Іец бек Меє сій с1у Авр Авр Аїа 180 185 190 зек Авп о ГПув Агд Тец Гув Кпув Уаії бек І1ї1е Уаії сі1у Рпе с1іу с1Уу ГІец 195 200 205 сб1у Гпув ТПг ТпПс Геш Аза Агуд Аза Уа1і Тукг Авр пув І1е Ппув б1у Авр 210 215 220

Рпе Авр Сув Агуд Азїа Рпе Уаі Рго Уаі біу біп Авп Рго Авр Меє Гув 225 230 235 240

Тец Аї1а І1е Гей Авр Авр Ппув сбіп Гей Уа1і Ппув пув Гей Нів Авр РІПе 260 265 270

Меє гей Тгр біш с1іу Іїе Авп Рпе Аза Рібе бег Авп Агуд АвБп Ап Гей 290 295 300 бо сіу бек Агд Гецп І1їе ТБг ТБПг ТБг Агуд АвБп о Рре Ар Уаі1ї! бек Ппув 5ег 305 310 315 320

Сув Сув Гей бек Аїа Авр Авр бБег Іїе Тук Ппув Меє Гув Рго Іец 5ег 325 330 335

ТПЕ Авр Авр бек Агуд Агуд Гей Рпе Ні Ппув Акуд І1е Робе Рго Ар Аїа 340 345 350 сі1у б1у Сув Ркго Бек бі Рпе сіп сбіп Уаії бек біцш Авр І1е Гей Гув 355 360 365

Аза бек сіу біп Ні Уаї Гпув Рго Ппув Нів бій Тер Авр І1їе Іец Іей 385 390 395 400 біп бек Гей сіу Бек сіу Уа1 ТПг пув Авр Авп бек Ггец Уаї сій Меє 405 410 415

Агуд Агуд І1е ІТецй бек Рре бек Тук Туг АБп Гей Рго бек Нів Гей Гув 420 425 430

Акуд Авр Агуд Гец І1е Тер ув Тгр Уаі Аїа сій сіу Рібе Уаї Нів Нів 450 455 460 б1у Авр біп сіу ТПг Бек Гей Рпе Гей Уаі сіу Гей Авп Тук Робе Авп

Зо 465 470 475 480 біп Гей І1ї1е АвБп Агуд Бек Меє Іїе сіп Рго Іїе Туг Авр сбіц Гец с1Уу 485 490 495 сіп Маі Ніз Аїа Сув Акуд Уаії Нів Авр Меє Уаї Гей Авр Іец Іїе Сув 500 505 510

Тпув Меє бій Авр Нів сбіп Аза Ппув Рго Гей ТПг Авп І1е Меєсє бек Меє 545 550 555 560 зек Агуд Уаі Агд бек І1е ТПг І1е Робе Рго Рго Аза Уаі Бек І1їе Меє 565 570 575

Рго Бек Гей бек Мес Рпе сій Уаії Гей Акуд Уаї Гей Авр Гей бек Авп 580 585 590

Сув Авр Гей сіу Ппув Бек бек Бек Гей біп Гей Авп Гец пув Сбіу Уаї 595 6боо 605 сбі1у Нів Гей Іїе Нів Гей Агуд Туг Гей Авр Гей сіп сіу ТПг сбіп І1е 610 615 620 зек біц Гец Рго ТПг біцп І1їе с1у АБп Іїецй біп Рпе Гей бій Уа1ї ГІец бо 625 630 635 640

Авр Гей Авр АвБп АвБп о Тук бій Гец Авр бій Гей Рго Бек ТПг Гей Ріе 645 650 655 ув Теп Агуд Агуд Гей Іїе Тук Гей Авп Уа1і Меє Гей Тук пув Уа1ї Уаї бо 665 670

Ркго ТПг Рго біу УМаії Іейп біп Авп Меє ТПг бек Іїе сі Уаі1і Гей Агд 675 68 685 сіу Маї Гецп Маї бек Гей АБп І1їе І1е Аїа сбіп сій Гей сб1у АБвп Гей 690 695 700

ТПгЕ Агуд гей Агуд біц Гец Гуз Іїе Сув Рбе Губв Авр б1у Авп Гей Авр 705 710 715 720 зек Тук Мпув Тец Рпе Уаї Ппув бек Іец б1у АвБп Гей Нів Нів Іїе сіц 725 730 735 зек Гей бек І1е бек Тук Авп бек Гув бій ТПг бек Рпе бій Гей Меє 740 745 750

Уаї бек Тер Меє Рго бек біп Іїей бек Аза Гей Акуд сбіу Тгр І1е Гув 770 775 780

Зо

Уаї пув бі Уаі1 сбіп сбіп біц Авр Уа1! сіц І1їе І1е сС1у с1у Іец Іецй 805 810 815 зек Гей Агуд Агд ІТецй Тгр І1е пуб бек ТПг Нів сбіп ТПг біп Агд Гец

З5 820 825 830

Авп оСув с1іу бек Аї1а Аза сіп чІ1їе Меє Рбе сій Рго с1іу Аїа Іецй Рго 850 855 860

Авр о с1у Авп Сув біу Рпе Авр Гец біу Іїецп біп с1іу Авп Гей Гей б5ег 885 890 895

Тец Акуд Нів Авр Уаі Рпе Уаі1і Агу Іїе Тук Сув сіу сб1у Аїа Агд Уаї 900 905 910 с1у 611 Аза пув біш Аїа сбіц Аза Аза Уаі Агу Нів Аза Гец сі Аїа 915 920 925

Нів Рго Авп о Нів Рго Рго Іїе АБр І1їе сій Меє ТПг Рго Тук І1е Аїа 930 935 940 бі б1у Аза Агуд Авр Авр Авр Гей Сув бій Агуд Агуд ТБг Авр Гей 945 950 955 60 «2105 4

«2115 13 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна послідовність «2205 «2215 х «222» (2)..(3) «223» будь-яка амінокислота «2205 «2215 х «222» (5)..(5) «223» будь-яка амінокислота «2205 «2215 х «222» (8)..(8) «223» т або 5 «4005 4 с1у Хаа Хаа сіу Хаа с1у Ппув Хаа ТПг 1 5 «2105 -35 «2115 13 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» р-петльовий мотив МВ домену «4005 5

Зо сі1у Рпе сб1у сб1іу Гей с1у Пув ТПг ТПг 1 5 «2105 16 «2115 13 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» мотив кінази За МВ домену «2205 «2215 Х «222» (2)..(5) «223» будь-яка амінокислота «2205 «2215 Х «222» (6)..(6) «223» будь-яка амінокислота або відсутній «2205 «2215 Х «222» (8)..(8) «223» будь-яка амінокислота «4005 6 сб1у Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа ТПг Хаа Агд 1 5 «2105 17 «2115 13 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність бо «2205 «223» мотив кінази За МВ домену

«4005 17 бі1у век Агкд Гей Іїе ТПг ТПг ТПг Агд 1 2 «2105 8 «2115 139 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Мотив повтору ІВВ «2205 «2215 Х «2225 (1)..(2) «223» будь-яка амінокислота «2205 «2215 Х «222» (4)..(84) «223» будь-яка амінокислота «2205 «2215 Х «222» (6)..(89) «223» будь-яка амінокислота «4005 8

Хаа Хаа Те Хаа Гей Хаа Хаа Хаа Хаа 1 2 «2105 13 «2115 3803 «2125» ДНК «2135 Жито посівне «4005 13 ачададсаєсу ЕЄдоддЕдсЕеЕсСЕ сеЕсаєсєссєєс дасстдссЯєс содссоодесссд саєсєссадесс бо сЕСсСссСсссса сСсдсодссдсс сСддаасаадда ссдаєссоддсес ЕЄссСЕеЕЄЧаєвоа деЕдадсесае 120 ссаассесса дсЕСсассссо дссаасеєдас єЄдссададчас сЕсСсСдасасс соагддвавдвода 180 чачадеЕддаа садсбадсаа даадсаєдда дсссссоддсс ассасссада дсассасаса 240

Еддааєссас ЕєдасседдсеЕ адсоддсессоссу Саассссаєс сСсассєсесст сдссассдаа Зоо аєаєаєєеєса даєссасасс єссссдссса дассдадада дададассдс сссесссаас 3З6о

ЕдасдсседЕ даадсврадда єсгаааааає дасеЕссеЕсст дсеЕСТтТасеєда аарсеЕрессас 420 асссдсасує ЄсеЕгдЕеЕсСаає сесдседасеЕс сссасаєтає аасєссеває єссддєссода 480

Еєсадедаад ЕЄЧдссЯосЕдЕ ЯдЕЄЯЧЕССсССсСає ссасбсаєсссад Сдсадсдасс сссасддсаєс 5340

ЕддссеЕСсСвєдуд баєдссассу ссуагассссд сессдссоаосда аадаассаад Чдсдоадссс9ад 60

Ессадаєсєс дсадеЕєстає єсЕЧдЧдЄсссс аассдаєсдда Сссадададс Ссасссєсссяо 6б6о дсЕСЕСаєЄєДда асаєєдеЕсас доадоаддссаєсда ддсадсссда Сссссаадесс дддсдадссгд 720 сЕсасодаєд адбасаадсс дсасаадсудс аєсаадааач агдссдадсеє ссеЕсаадаад 78о0 чадсЕеЕєдада дсаєдсасдс ЕдсссеЕсаєс ааддеЕсдадсу аддедссдсд ддассадсьс 840 часаддсаад Єсаадсеєстьд додссдасдад дссадададс Ссоссссасаа сасддаддвдває 900

ЧдЕСЯЕСЧдаса адеЕсссеєсцдє асодсоассдас ддсдасддса сСссадсадсс сСсасдасаас 960

Ессддсадає ЄЕааддадсе саадаасаад аєдаєсддсе ЕдДдЕеЕєсаадаа аддсаддаає 1020 сассаєсдса Садссдасудс дассааддаа ассааддадс аассссадда даєддсеЕдсе 1080 аддсдЕдаса ддаасааддЕеЕ адсеЕдеЕессе аассстаєдуча аассааєтас гаєсддаєсся 1140

ЄдЕСсСЕссдад сЕсСЕДдДЕасодс адаадсдаса дадссадеЕсєд дсаєаєаєдоа даададоадає 1200 чаддадсеса ЄдаддЕеЕсдсЕеЕ сессаєддад додаєдаєдаєд ссеЕссаасаа дадассааад 1260 ааддеЕсЕСсса ЄЕЯДЕсОдаєсе ЕдддаддЧаєвд додсаадасса сЕСЕєдсвад адсадсаєсас 1320 чдасаачаєса ааддаєчаєсеЕ єдасєдеЕсоуд дсаєсеЕдеЕсс ссдєсддеЕса даассседас 1380 аєдаадаадд ЄЕсСЕаадоудда баєссеєсарс даєсссуддса асссеєсасес адаєсеЕсдсье 1440 асасєддаєд асааасаасе ЕдЕеЕсааааад сеЕссаєдаєе єссрададаа сааааддеає 1500 сЕєдЕСаєаа ЕсЧдаєдасає аєдддасдаа асдЕєдеЕдду ааддсаєсава сЕсеЕдсевес 1560

Ессаасадда аєааєссаду садеЕсддсра аєсассасаа сссдсаарее сдаєсдесессс 1620 бо аааєсаєдеЕє дсеваєсодс Едаєдаєсса агагбаєаааа Єдааассеєсе ЕсССсСсаседає 1680 часеЕСссадаа доасЕСсСЕссса аададаага СЕсСсСсСЕдасу сЕддеЕддаєд Ессаадедаа 1740 вЕЄСсаасаад Єдсссдаада сагаєсдаад аааєдеЕдЧчдчеєд дадеассасе ддссаєсаєе 1800 асваєєдсва дЕдсЕЕсдддс гадесддссад саєдеЕдааас сааадсаєда дЕдадаєсаєсяе 1860 сеасеєссаде сссеЕгдудсЕеЕсС сддадеааса ааадаєааєса чЕЕеЕсоодЕеЕсда даєдсоддада 1920 асгасваєсьє Єсадсвтаєса єааєссассу Єсссаєсєда ааасевдеЕсь асеЕстасста 1980 бдсаєаваєс садаадаєад сассаєсєдує адачаєсадас Єдагаєддааа дЕдддЕддсс 2040 чааддаєєьд Єссассаєду адаєсааддд ассадеЕСЕдЕ ЕЕ ддЕСЯд асгааассас 2100 бЕсаассадс Єсаєсааєад аадсаєдаєс садссаасає аєдаєдаасе аддссаддаєта 2160 саєдсеЕєдсс деЕдсасаєда баєвдЧаєсссе даєсеЕваєсь дсаасеесьс асаєдаадса 2220 аадЕсЄєдесса аєдесаєсода єддсасаддд аасадсаває сессасааад Єаасдєссде 2280 сЯдЕЕсдЕєссс Ессадаасаа ааєддаадає саєсаадсса адссеЕсЕсас аааєсаєсаєд 2340 адсаєдеЕСас дадеЕдадудєс ааєсасвтаєс сЕсССсСсСассвд сЕдЕсадьнає саєдссааде 2400 сЕДЕСВяаєдЕ ЕсЧдВгадеЕЄсєЕ дсудєдвасесєе даєседеЕсда асеєдеєдавєсе доддаааааде 2460 адсадссеєдс адсеЕсаассе саадуддЕдЕс ддасаєстаа Ессасссаад дсассеєвдає 2520 сеасааддса сссаааєсад єдаасесссу асєдадаєад дааассеєдса аєсеЕссддвад 2580 чЧЕдДЕєдддаєс ЄЕдасаасаа Есаєдадста даєсдаастдс сеЕЄсСсасьст єЕсеЕсСаааєтд 2640 ачаадаєсаа ЄссасеЕсааа ЕдЕсСаєдеЕвд сасааддеЕдд ЕЄссаасьсс ЕДдОЄЧЄЧЕв 2700 садаагаєда саєссаєєда адеЕдЕеЕєдадуч дадддЕСЕвд ЕСЕСЕСЕдаа саєтаєвдса 2760 саададсесд дсаасседас ааддсеєдаду дчадсеЕєаада ЕсСЕДдссЕеСсСаа ддаєддадеаає 2820

ЄЕЧддаєєсає асааассеєсе суєдаадесе ссдддсаасс бдсаєсаєбає сдааадссста 2880 адсаєстадьс асааєсессаа адааасасєсє сЕсддааседа Єддаєсєссе додададесдЧе 2940

ЄдаддЕдссЕС сЕЯДвасаєсе ссдудсддаасьс дЕдЕСсСЕсддда Єдсссадсса асеЕсеЕсьдса Зоо

ЕЕдсдаддає ддаєааадад адассссссуд саєсєсеЕсда ассеЕсЕссда дЕєВааєссьс З06о бдадассадеда аддаадсдса дсаддаддас деЕддаааєса ЕЄДЧОдДОдасЕ ДдДСсСЕДЕСССТЕ 3120 сдссдЕсЕсСЕ одасааадад сасссассаа асасадсддс єдссадеЕсає єсудєдсадає 3180 чадЕєсСсодсЕ дсаєдаєдда сЕЕєдадевд ааседеЕддає садсадсдса ааєсасдеве 3240 чаассаддад сЕсЕдссудад ддасоддаадта сеЕЕдЕдсЕеЕсСа дссеЕдддсдЯдЕ дсодаєдаса 300 саададдаєд дааасєдеєда ЕсЕСЯдасесд ддссеЕдсадд ддаасседсс сеЕСссьєсС9д 3360 саєдаєдеЕСсСЕ ЕсЧЯєсЕСУОває асаєєддсдаєЕ доаддсдадоад ЕсоЯ9доададдс аааддаадсд 3420

Зо чададасєЕдсду Єдаддсасдс дсеЕсдаадсс саєсссаасс аєсссссддає Єдатгаєєдад 3480 аєдассссує агагадсада аддєдсеЕсчє даєдчаєдаєє єдеЕдеЕдЧдадда дааседаєте 3540 аєдаєдеада ддасссасад Едааєсадчдє адсаддддсуд Едддаєсасе дсеЕддесддса З6о0

Єсододадааєсє содососоодЕеЕСЕ сасєаасаєс сеЕдоддЕдддс дссоддесссвд сааадааєєтд З6бо аадчаєддаа аддеЕсЕсдас сЕгддсЕдда адсеЕдеЕдеЕда Єдадссєдса дааааадаєа 3720

ЄЕДДСЕсЧЧЧЕЄ ЄЕдеЕааєдаа Есадеєаасод СосЕЧдоодоаєд ааєєдаєсся гассдааааа 3780 агдеЕееессу судсесеЕсЧвЕ ва 38во3 «2105 10 «2115 2871 «2125 ДНК «2135 Жито посівне «4005 10 аєчаасаєєд єсасодддададдас саєдоддсадс ссдаєсссса адссдддасда дседсссаєд бо чаєчдчадеаса адсеєдсасаа дсдсаєссаад ааачасдєсєсдд адссссссаа дааддадсесес 120 чачадсаєдс асдсеЕдсссЕ саєсааддЕє досдаддсєдс сдсооддасса дсссдасадд 180 саадссаадс сСссдддссда сдаддссада дадсесессст асаасаєдда дчдаєдеЕсдес 240 часаадеЕєсс Есдрасодсуає сдасоддсдас ддсасссадс адссссасда саассссддс Зоо ачаєєвсаадуд адсеєсаадаа саачаєдаєс ддсссдссса адаааддсад даассассає 3З6о сдсасадссд асдсдаєсєсаа ддаааєссаад дадсаасссс аддаддсддс Єдссаддсдаі 420 часаддааса аддсадссдЕ Ссссаассся агддаассаа ЄСсассаєсуа ЕЄсСссруєсье 480 счадсесссдс асдсадаадс дасададста деЕсддсатвтає аєдодаадад ддваєдадчвад 5340 сесаєдаддс Сдсесссссає ддадддеєдає даєрдссеєста асаададасе ааадааддес 60

ЕссаєєдеЕєЧд даєєєддвада дЕсєдоддсаад ассасссссд ссададсадс агсбасддасаад 6б6о аєсааадчаєдч аєєєеєдаєвсда єсодасассс дсссссоаєсд десесадаассс сСдасаєсдаад 720 аадЧчЕсесаа додасассся саєсдасєсеєс додасаассссс асесадаєсс гдссаєсасьд 78о0 чаєдасааас аасеЕєдеЕсаа ааадсеєсає дарєєеєсстад адаасаааад дчрассеЕвдеЕс 840 аєааєєдаєд аєсаєсаєдоада счдааасдссд сдддааддса Ссаассссддс ссЕсссссаає 900 аддааєааєс баддсадесу дсеаассасс асаасссдса ассссздаєсдс ссссаааєса 960 бо єдсЕЕдсеЕсає содссдаєда Ессаасасає ааааєдааас сЕСЕСсСсссас сдаєдасесс 1020 ачдааддсЕсЕ Єссаєсаадад аагавєсессе дасуседудєд даєдеЕссаад Едааєсесаа 1080 саадедеЕссуд аадасаваєє даадаааєдеЕ додєддадеас сасєсддссає саєсасвтаєтєє 1140 чдсвЕадеЕдсьсє Єддссадеду ссадсаєдед ааассааадс аєдадеЕддда гарсссасес 1200 садеЕсссьсуд дсЕсСсддаде аасаааадає аагадеЕсєвєда Есдадаєдсу дадаасаста 1260

ЄсСЕЕєсадсе аєсаєааєсе ассудєсеЕсає сеЕдаааасеє дЕСвасеєвса сстаєднтаєа 1320 баєссадаад асадсассає єддсададає адассдаває ддаадедадЕ ддссдаадда 1380 гЕєдЕССасс агддадаєса адддассаде сЕдсЕсеЕсодд єсоддаєтааа стасеєссаас 1440 садсеєсаєса асадаадсає даєссадсса асаєаєдаєд аассаддсса ддєасаєдсе 1500

Єдссуаєдсас аєдасаєсуддеЕ ЕСЕєДЧаєсьс аєсеЕдсаасе Есессасаєда адсааадесе 1560

ЧдЕєсааєднає соддаєддсас адддааєгадс агаєсеЕссас ааадеаарде ссуєсЧєсвд 1620

Єсссеєссада асааааєсода адаєсаєсаа дссаадссєс Єсасааасгає саєдадтаєд 1680

Єсасдадеда дассааєстас гаєсеЕсесса сседсеЕдЕеЕса деаєсаєдсс аадесстьдеса 1740 агдеЕєеєдаад ЄЕСЕДЯДСЯєЯЧЕ асЕєЄдаєсьд Єсдаассдеєд аєєсєддадааа аадсадсадс 1800 сЕдсадсеЕса ассссаадудд єЄДдЕсддасає сеааєсссасс бааддеассе Едаєссасаа 1860 чдодасасеєсааа ЄгадсдаасеЕ сссдаседад агаддааасс ЕдсаавеесЕ додадчаєдчеЕвд 1920 чаєсєєдаса асаастаєда дстгадаєдаа СЕДдДСсССсСЕСССЯа СЕСЕСЕСсСваа асеєдадаада 1980

ЄЕааєсвасе баазааєсудєтає чсеЕдеаєаад дЕддЕЕсСсаа сЕССЕЯдДЯдЕдЕ дЕєддсадаає 2040 аєдасаєсса ЄЕдаачдесЧєЕ даддоддоадеЕсС ЄЕЯ9ДУЧДЄєСсСЕСсСЕсС Едаасаєвтає Едсасаадад 2100 сЕєддсаасс ЕдасааддсЕ дадддадссєе аадаєєєдсеЕ Есааддаєда Єааєєєсддає 2160

Єсагаєааас ЄЕСсСЕСУдЄддаа дЕСсСЕСєдддс аассєдсаєс аєаєсддааад ссеЕаадтаєє 2220 адеЕсасааєс ссааадааас асссєсєсдаа седаєсодаєс ЕСЕєддддада дсасеєдодЧЕд 2280 ссЕССсСЕДвас ассесссусдда асєсЧдвдеЕсеЕ гддаєдссса дссаасесьс Єдсаєєсдсда 2340 ччдаєддаєаа адададассс сеЕсдсаєсес ссдаассесе ссдадеЕсаає ссеЕСЕддсса 2400 чЧЕдааддаад Єдсадсадда ддасдєддаа аєсаєєдоддоа ддсеЕдседЕС ссеЕгсСддссде 2460 сЕСЕддаєаа ададсассса ссааасасад сддсЕдсвад Есаєсєсуєдс адаєдодеес 2520 сдсєдсаєда єддчасесєсда деЕєдаасеєдЕ ддаєсадсад сдсаааєсає дЕсєдаасса 2580 ччдадсЕєєдс сддаддодасоуда адграсеєдед сЕСадссвдуа дсдєдсдддЕ ддсдсаадад 2640 чаєддааасе дЕдЧдЕЕссда сЕгдоддссьд саддддаасс ЕдсЕСЕСсСссЕ Есдддсаєдає 2700

ЧФЕСЕЄЕЕЯЧЕЕеєС деаєаваєсд єдЧдєддоадсд адддєєдоада аддсааадда адсоддадасе 2760 чсддЕдаддс асдсдсєссда адсссаєссс аассаєсссс сдаєєдаває Едадаєдасс 2820

Зо ссдбаєаєад садааддєдс єсдєдаєдає дасеЕсодєсєдсд аддадаастд а 2871 «2105 11 «2115 9795 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» руесМеобс50 конструкція експресії «4005 11 чдсддссдссс аєссадсуєс дЕСЕЄССсССсСсС ассдссдсад СсассдЯдсссо сссдсадессе бо асдеЕсдаєсс дЕСВадддсеЕ соддсдссуєсд сссеЕссеЕсСсу сссссссад єссасоаєсод 120 аддЕсссЕвд сеЕСЧЯЕєЧадеЕє сЕСЕЄДСсССсСсСсСЯ ссодссдсдсо дсасдсаєда сСдсдссссда 180 чадчаєддаа дсасаєсаєд саєдсаєсддсес сЕссаасаса асссаддсда Сссддссадда 240

Ббєсаддадса сддсдссста ЄсЕССсСаадас сссдсбассдс ассасесасо адссааддаа Зоо

Егассдбаса СЄЯЕЕСЕСЕСеЕ Ессассссус аааааааааа сСЕСУЯСЕЄЕЕЕЕ Ессе сссаа 3З6о асєссддсас содсаєдссу СЕСудссодсса сассддсусеЕ адсеЕссодддд єдсаєдсадес 420 сесдссасдс сассдссдсс сдсссеЕсдад ддадсасевд ссааєєсьса ссаседааасєс 480

Еєддеєаадаа ааавадсеєсе ддаєєссдсо сссдадсаса ссссаасасо даассссааа 5340 асЕсаааааа аадддааада аааавдассає садсдссааа ссасссссса ссасссассєс 60 аєдссаадаа аааєдаааає даадааадаа адааааааад садсассдає сдссдасааа 6б6о аачаєаєдса дадсеЕссдаа деасдссасе даасасачасє баасассдаа дгасадасад 720 сдсдсаасдс аасссссаса ассасадсда дасадасаєс асаєдддааа аадаєсассд 78о0 чдсдадсаддс дасодддадсоадЕ даєєссдддс дадсаєсдсса СбСасбсаєсссаєс сссоссесесс 840

БбЕСсСсСЕССсСсдс ЄдсЕСсСсСодЕСсС, соссеЕссдсес Ссссосдссда дсдасдсссдуд дасссесдее 900

ЧдЕєСсСсоодадд садсаєсдчає саєсєдссає ссдасдддсає саассаадесд аассссаадс 960 асдсссєдас ссессассссс десаєссудєс ЄссеЕссСсаєсє аассставає асааєсаєває 1020 асадваєсьєс єсссадсуддЕ даєдеЕсьСсад Ссассасасс сааддеЕдесЕ дасааааєда 1080 ссаасеєаада гаадддеЕддс ЕсЕСсСасадса сусбсастадса деавєєсеЕдеде ЕСЕССЕЕЄСЕ 1140 сЕСЕДЯДСсСєаає дсаассааєд єдодадЕССаяаас асеЕсєсвааєд ЕСЧсоддЧаєда садеЕдеЕдадс 1200 часЕдсадсеЕ дсасаадасу ЕсдєддЕСВд сЕДЯдаєєсдсс дсддаєдсвд ссасадгадс 1260 бо дсеЕддаддас дссодсссгад ссеєдссасаа даааєсдадда сеЕдссЕеЕсСствд дасдсссеєд 1320 адеЕсасеєсда сдаааєдсас аддададада дададассдс ддсссассас аасаасддаса 1380 сеаєєсддсад деЕдсудєсааса асеЕсдссвдс сеЕссасесьс Ессставеєвс ссвєдсаєдна 1440 чаєєсааєдна сеадесеЕсаєсуд ааєдсавадеі сЕдЕадсаєд ЕссуддсЕссЕ ссссассасс 1500 сдбадаасдс аассусеЕдсеЕ сеЕдеЕсссусс Есдассуєсе дссссєвссеє агадсаєсад 1560 сдсЕдсЕсас асссассєса аддсассдсс Ессаєссудсс садесеєЕсдада сЕдоодасед 1620 сассєсєсдад ЄсссдоадеЕда Єдаєдсаєсс дааєсдадад аааєааєєса дааассдааа 1680 аааєаадеєса аааєсудєдає єсдєесадаа сааасаєдає аєсаєдеЕсас асесаєдеда 1740 ааачаєєсас дааєдааєда сЕЕссаєдна сЕСЕсдссда аадааассаа ааєсддасасе 1800 агаєаааадеі Сасраєссає дсЕсеЕсасас ссассаарає сЕсЕсеЕсддсс садаадесає 1860

ЄсСЕЕєсудсда ададсаєсас асградаєста дегаєдеЕсссс ааааєдеЕсс адааєсеєде 1920 дассЕсеЕсес дсаасеєссса ааєсасєєсся ссаасеєсада Єдсаєєддада сссдадассс 1980 аєєддадвавсє сеЕСОдЕаєсу асЕдсеЕеЕсвд адсаседсає аададвавєсе ассасседдс 2040 ааардеЕсєда ЄЕсСЕаддаду чаддоддеааа ЄдсаєдаєдеЕ ддасеєдасса ассаассдад 2100 ачачаєєсад адаааєдада ддаєсададеі ааєсдсадед аадсададда Єсададсаде 2160 агдсааєстає сЕеЕсСсСЕЕеЕсСудаа ЕСсССссЕдЕдДЕеЕС сссасдассс аседаасада садаєсадсес 2220 аааадсадевта сеЕдеЕсссдад ддаєсдєдад доасЕссЕсЕсс сассдсассс ассдааадса 2280 сЕасеЕссасеЕ ЕсЕсСсСЕсеЕсас дсассьссос ссасаєссаа сдсаєсудасс асеЕдаєдаас 2340 ааасасаєда дссаааадса ЕсасеЕдеЕсєсс дадоадаєсєсу баєсеЕвєдасе гдссоєвЧвед 2400 дЯдЕСЕссСсЕС ЄдсЕССсСЄсСдс сеЕСсССаседад ЄдсЕеЕсСссЕса аєсеЕсудеЕссс адессесссс 2460 рЕСаАЕЕЕєСва адсеЕдЕдадс Едааастаєд СЧЯсЕСсСаєстдеЕ басадеЕстад сдраєдеєсса 2520

Єдаєсассса ЯФЕСЕсСоОСадуа баєдаєсєса досЕСЕдЕСсСа садеЕстсаася єЕДдЕДСсСсаєсо9о 2580 аадеЕсеЕсесса ЄЕдадаадсе аддеЕсссдсд сасаєддаєа саєссдадед дсссаєдсас 2640 чаєєссдєсе ассадедудеєд ддасаадада ассдасаасс дсааєссссаа ссддсаадсе 2700 аєддсЕєссс ссассаєудсе суєсеЕсуєдуд ассаєєєдда аєдааадааа сдсасдоддаддЧЕд 2760

БбЕссдссаса ададедсдсс асссассаєс сстасссассуд ссаєсдссда ддаддссаад 2820 сСЕсєддваєда ЕСсдсодддсдс ааадсааєса дддаасаєєсє єсссадоасооа деЕадеЕсдесса 2880

ЄдасчавгаєдеЕ дсдододЕдЕдЕ ЕдЕаасесьс сСааасеЕстає сєсеЕЕсссеЕсСа ЕсСЕаасадає 2940 чаддсааадс Єваєдссесс дЕЕссдаааа аааааасадеі Еєаасуєдед сесаєсаасе Зоо чааасвтаєдс сЕСадддсаєсе дадсаєєсас сассаааєсу аааєсєеєссаа асеЕдаасода З06о чадаєєсаає ЄсеЕесасссу Есдсааадає дааадссадеЕ дааааааасе аагадесдеса 3120

Зо ЄЕдссеєдаєса аасосаєдаа додаєсодадад асоаодеддадоад сЕСЕДдтаєса Єгдсстддса 3180 чаєдсаєдад деадаєссад адаааєдада ддасдбасаа ЕсаєєсдеЕсСьсс Едадесасьд 3240

Ессаєдааєд асссассдса сєдааєдаєс дсаєдадсса ааадсасвтас гаєссадад 300 саєсдЕдадЕ десЕСЕСЕСає сЕСЕЕЧДдассє дсЕДдДЕЄЧЕВУУ дЕСЄдсаєсє садеЕссьсьс 3360 сЕСсСаєєдсу седсссддаа Єааддесдає ссудсеЕєсеЕ даєсоддеЕдад сЕСдЕССсСа8аас 3420 сЕссадсеса ссссгдссаа сєдасєдсса дадассеЕєсд асасссдєсод аддеаєсаєсає 3480 ссЕЕссдасе єсЕсСЕСсССсСадс Єдаадеасдс Есддаєсєаа ааасеЕсадеЕс деЕССададсе 3540

Єдоададчасед аєгєсеЕдеЕдеЕсдд дсЕдааєсса дддадддадеі ддаасадсва дсаадаадса 3600 бддадсесєсс доаєсаєсасе сададсасса сасаєсддаає ссасєдассе ддссадсддс З6бо сЕСЧдєЄаасеЕЕ сдЕСсСЕСЯАЄСЕ ЕсСЕБдсвас Едаааєаває Ессадаєсса сассеєссссд 3720 сссадаєсда дадададада ссдсссссЕєсС саассдасдс седЕдаадсе аддаєссааа 3780 аааєдасеєс ЕЄссеЕдсссса сєдааарсьс ссасасссдс асуєєсєсеЕвдае Еааєссдсьд 3840 авсєеєсстава Єгаєаасесс єсаєєссдеєс соодаєєсадеі даадевдссу седсуєседеЕс 3900 ссаєссарає ЕсадеЕдсадс дасссесасу саєсеЕддссеЕ сеЕддеаєдсс ассддссдвас 3960

ЄседсеЕСвдс сооєЄдаадаає Єааддедддс сЕдудєссада ЕсЕСдсадее ссасеєстоде 4020 садеЕєссаса дсеЕСЧдаєдаа ассааадссє сасасааєєє сдасєддаєс асддсесссс 4080

Єгаєдсваад сЕсСЕаасесу дсадсессудє сссададсес дЕссасасаа ЕсСЕДдаєсос 4140 аєсасадсес сссеЕсаєсеєса Есааєєсваса дудаєсЕсСсаає сЄдаєсдаєсс адададсеса 4200

ЄссеЕСсСсСвдсЕ сеЕСаєдааса ЕсдЕсасдудд ддссаєдддс адсседаєсс ссаадесед9д 4260 сдадседссс асддаєдаде асаадссдса саадсдсаєс аадааадчаєд ЄЕДдадеєесся 4320 саадааддад ссгдЧдададса гдсасдседс ссссассаад ЧчЕсСдодсдада Сдссдасоддва 4380 ссадсссдас аддсаадсса адсссстдддс сдасдаддес адададсесе ссгасаасає 4440 зччаддаєдеЕс дЕСЧдасаадеі ЕссЕСдЕасд судєсєсдасудс дасддсаєсс адсадссеса 4500 сдасаасесс ддсадаєста аддадсссаа даасаадаєд ассдудсеЕсдЕ сеЕаадааачдд 4560 саддаассас сассдсасад ссдасдсдає сааддааасс ааддадсаас Сссаддадае 4620 чдасЕдссадуд содєЄдасадда асааддрадс СодосЕССсСаає сссаєсддаас сааєстастсає 4680 счдаєссеЕвдЕ сЕЕСдадсеє єдеЕасусада адсдасадад ссадеЕсддса баєаєдддаа 4740 чадаодаєдад дадсєсаєда ддєєдсЕсСЕеЕсС саєддадоаді даєдаєдсся сеЕаасаадад 4800 асєсааадаад дЕСЕССаєс Есоодаєєсодд аддудаєєдддс аадассасеіс Есдстгададес 4860 адсаєасдас аадаєтааад деЕдчавєстесда сЕдЕСОддса ЕД ЕесСссу ЕсуддЕсСадаа 4920 бо сссеєдасаєд аадчааддєсЕсє сааддадаває ссесаєєдає сссддсаасс сеЕСасєссада 4980

ЕсЕгдсвава сеЕддаєдаса аасаасеЕвдс Сааааадсеє саєдаєсесс гададаасаа 5040 ааддбєаєдса Єсадесвасад саасааєсва састасаєда басасєсує єсддсаєдеста 5100 дсЕдбасаад Саагассудса асадеадсЧдс дегаааєсаєває єдсасудєсас асоодаададЧе 5160

Єсадааєаає СЕсСсаадудес ассеЕссасьд аєдеаєдсад баєдсассаа ассдсааасс 5220

Єгаєаддеєдс Єсасесессаа дссєдсаєаа дЕсСтасаєдеЕ ЄеєДаєсесьсь ссеССЄЕває 5280 сдааасгаєає ааєсадеаас басеЕсєсстдЕ Едсаєєстаєє асааєдоасед ааасеєсаєвд 5340 чсаєєдудеєсс аадаааєсса Есгааасесеєс сЕсСадааєсті басвраєсадс ааааєсаєада 5400 сааааддаса асдстасасе аєеєсдадеЕду дчЕсЕссссаа гагаєстасс Єдассааєсьс 5460 аасеЕєссдва дЕсСВяавєєсеса ЕсСЕсасуєдчс даєсасесдає дсадсаарєе дсраєсвдаед 520 гЕЄвасеєссс ЕЕДааєсеЕса аагсагадеес арсеЕсудєєсса єсаєсєдасе дсаддаєсає 5580 аасасаєдсе Ссаєдадаає сачдаєстаєсд адЕсСЕдадас дсасдседсеєс Састадессд 5640

Есе єдаава басдсссеса ссдаєднава дЕсСссассса багаєєсаєа гЕддсодсесад 5700 сСЕЄЕЕдЕДДаса Есасадасся басасеєдаса сеЕСсСєДдаасста асдсадудасає сеЕєдЕСаєаа 57б6Оо гЕдаєдаєає аєдоадасудаа асдеЕєдеЕддадд ааддсаєсаа СЕЄЕдсСЕвЕсС ЕСсаагадда 5820 аєааєсвадд садеЕсуддсса аєссассасаа сссусааєеє сддаєдеЕсьсс аааєсаєдеьс 5880 дсЕсаєсддсе Єчдчаєдаєсеєса асасасаааа Сдааассеєсеє ЕЄсвасеєдає дассссадаа 5940 дасЕСЕєСсСса Саададааса ЕСЕССєдасуд сЕдЧдсдддаєд Ессаадєдаа ЕсСЕСВаасаад 6бО0о бдЕСсСєдаада сасаєєдаауд аааєдеддеєд дадеассасе ддссаєсаєсе астаєсдста 6бОбо

ЧдЕдсЕсєддс бадеддссад саєдеЕдааас сааадсаєда деЕдддасаєсе ссасессаде 6120 сссЕсддсесС сддадсааса ааадаєааса чЯчЕЕсєддЕеЕєда даєдсддада агбасваєсьс 6180

Єсадсстаєта Сааєстассу Есссаєссда ааасеєсдесс асеЕстасста содосасаваєс 6240 садаадаєад сассаєєдУчє ададаєадас Едаєсаєддаа чЕддаєддасс дааддаєсвд 6300

Ессассаєдда адаєсаадду ассадеЕссЯдє СЕСсСЕдуЧєЄсоду аєсааасьас Ессаассадес 636о

Єсаєєаасад аадраєдаєс садссаасає аєдаєдаасе аддссаддбра саєдсесєдсс 6420

ЧдЕдЕасаєда басоодеЕсссеЕ даєсеЕваєсі дсаасеЕссеєс асаєдаадса аадсеЕсддева 6480 аєдеаєєдда Єддсасаддч аасадсасає сеЕссасааад ЄааєдеЕссує сдЕседеЕссс 6540 бЕсадааєсаа аасоддаадає саєсаадсса адссессссас аааєаєсаєд адгаєдеЕсас 66 чадеЕдаддЕеЕс аастассаєс ЕсЕеЕССасстд сЕдеЕвадсає саєдссаадеі сЕдЕСВЯВЕЕ 6бббо гЕдаадеЕєсеЕ дсдЕдвасесє даєсьдеЕСсцдча ассдєсєдаєсе додааааадеі адсадссеєдс 6720 адсЕєаассє сааддуєдсЕ ддасаєєсаа сСссасссаад деассеЕєдає ссасааддса 67Во

Зо сЕСаааєстад єдаасессссу асєдадаєад дааассєдса асєсеЕсодад ДдЕДЕЄсЧДдаєс 6840 бЕдасаасаа Єгаєдадсса даєдааєсодс сеЕсСсСсасесе єЕсЕаааєсу адаадаєсаа 6900

ЄсвсасеЕєааа ЄдсваєдеЕєсд гаєааддєдд СЕССсСаасесс Ед9ЧдєдЕдЕеЕс садаасаєда 6б96о саєссаєєда адеЕдЕсЧчаду доддЕСЕЕду ЕСЕСЕСЕєдаа саєсаєвдса саададсе вд 7020 дсаассєдас ааддсеЕдаду дадсеЕєаада ЕсЕДдсесЕСсСаа ддаєддаєаає ЕгЕддаєєссає 7080 асааасеЕсєес сосдаадесеЕ ссдддсаасс Сдсаєсаває сдааадссса адесаєсадеє 7140 асааєєссаа адааасаєсе ЕсЕЧдаасеєда содддаєсєсеє додададсдЕе ЕдддЕдссес 7200 сЕдЕасаєсеЕ ссусудааєєє деЕдеЕсеЕсодда Едсссадсса асеЕсеЕссдса Есдсддаддває 7260 чдаєааадад адассссесу саєсеЕсесда ассеЕсеЕссда дЕсааєссяєс Еддссадеда 7320 аддаадедса дсаддаддас деЕддаааєса СЕЧ9УдЧодЧУЧєЕ дсЕдДЕССсССсСЄЕЕ сдссуєсесе 7з8о0 ддаєааадад сасссассаа асасадсддс Єдстадессає єсдеЕдсадає ддасеЕссдсе 7440 чсаєдаєдда сЕсСЕЧдадеЕсдд ааєсдеєддає садсадсудса ааєсаєдесЕ даассаддад 7500 сСЕЄЕдссддад доадсододаадта сЕєдЕдЕЕсСа дссєдддсдЕ дсододуаєдоасоа саададдаєд 7560 чааасеєдедда ЄЕссдасьсуд ддссеЕдсадд ддаассєдсеЕ сЕСССЕЄСсду саєдаєдеЕсе 7620 гЕЕДЯДЕєЄСУдває агаєсдоєсоодЕ доаддадсдаддад ЄЕддоодаддс аааддаадсда даддседс4дд 7680

Єдаддсасдс дсессдаадсс саєсссаасс аєсссссдає Єдавгаєсдад асдассссде 7740 асаєсадсада аддеасссас деЕсдсаєста ассааєсасеЕ судєдсасеса сддсаєдеЕдсе 7800

ЕСЕ ЕеєСсСЕеЕС аасдасддас Едассеварс асесеЕсссдса ЕдоддЕЕсєдає сессдааєсяе 7860 ссЕСсаддеЕдс Есуєдаєдає даєєсвдчсддсєд аддадаасьуд асеєсаєдаєд сададдасес 7920 асадєедааєс аддеЕдеЕдссс Ессабаєдна ЄдсасеЕсасе ддєсававрсє єссассасся 7980

СЕСЕЄЕСЄСсСсС аєсеЕстададд сесадсеЕсдс сЕСтасаєсд асааассдсда ссасадааде 8040 бдсЕвадеЕсе дааассасдс ааєсеЕСсаєсє єсоддсаадед сЕДдаєдааад сеЕааєдарсєе 8100 бадчавєєєс аєдсааассє дсадааддає адсеЕсддсадеЕ асасседсса гаваарадеее 8160

Єгаддаєєьс ссдасадаач бадаєсесодд даачаєседеЕ ддаєаддоада ЕДФЕСОДЕЄСЕЄ 8220 адсЕдасаад Єдасаадтас ЕссаєдеЕсає асааєєвавєсє сеЕсСаєсддєсаад дуасаєсесьд 8280 бадсеєсеєсда дЕССсСсСадсас ааєєсаасоі сасеєдаааєсє Єадаадддда ссаседаєсєтд 8340

ЄдаадачЕсЕс ассссдадаа асаадсадда ЄЕсСЧОЄдааса додасть ссдсесаєсьс 8400 баєдсаєава дсессссдааа Ессасадесвд ааасаасссе дсеєЕдаааасе єЕсодтаєднка 8460 ааадеЕєсстас ЄЕааєтаада Есаааєстаєе ассаєсдддеЕса дсааєсадаа асасадтаєс 8520

ЄЕаассуддад аєааєссааа Есаєададае адсудєсоддеЕдс аддаааассЯ єЕСсЕСЕСЕЄЕЄ 8580 бо ЄЕдсадсада ааададссаа Єддаєсасасє дяссЕсеЕсаас ЄдеЕєсСЯдаєсо сесссдаєсає 8640 аєєєддааса сасдсддеЕсеЕ Єаавасадес ссеєдЕсадса єддададасе садеЕсаєє9д 8700

ЧдЕааєдааєс ссаддуддеЕаа адаєаддаає сЕддсЕеЕссвд аєаддаєадеі доаседеЕваєс 87б6о

Єдаааасдад дааадаєаає ЄдсЕєЄдаааа аааааєссас баєддаєссс адсєдсасЧе 8820

ЧЕдЕаддєвд бааадссдса гаєєдсасає сеЕсСаседдеЕс бадсеєвасад адаааадаає 8880 бдсасдаєєд саддсадсад доадсодєддда Єгасєсдседу Єддсаєсоода даасеЕсдєде 8940 даєЕєЄСсСасвта асаєсеєсода єдддсдссодд ссседсааад аасєдаадда єддааааддчесє 9000

ЄсдассеЕєдд сеЕддаадеЕсд ЕдЕЧдаєдадс сеЕдсадаааа адаваєсусе ЕдФасЕСвЧна 9060 аєдааєвсадеЕ аасочодЕдЕеЕЄєд доадеЕдааєсд асссесассду ааааааєдеьс єЕСсдсддсесе 9120 гЕДЕеЕвасе сеЕСЕССЯдЕсСсС аааадсрасьс деЕсаєсаааа Єддасааааа аадаєднтаєс 9180 бадаасвєааа агасаєстад асасаєсєсс ЄЕСЕСЕсСаєЄ ЕЄеєЧдаєдаса адраєсессд 9240 часододадодда деасааадса ассаассдаа ссасссадду асаддсдссд ддсддаадса 9300 дсасадссас дсссаааада аасдасадад ааададсааа адааасааає дссдасаасд 93360 чдсоддаєсаас ааааасдаад аадсааадса ассдссдсдс ссассаадає сесссастсад 9420 дсЕСсСсаадас Ессдаадсдс сддсассстаєс саасассосс аадааддаєс дсдасдаєда 9480 счасдссдсс дссаадддсс ссссссддба сасдасдадда сдададдаад ддгадссссс 9540 часдсссЕсс соудааддсса додєддсассс агаддсдсса ссдсдссоодс дЕСадссаєд 9600 ссдасадддд ССсСссссдає сссаасссас ассгсддасуд сессдаадсс гбассассааа 9660 ссаассасса ссссссдсса асасддесаа даддсссаса сддссдсссса ссасддсасс 9720 чЧЕЧчаадедад даєсадсасодд сдаадаасса дадссдддає сСадддсаєса асассеєссддд 9780 сасдєдддад ддссс 9795 «2105 12 «2115 8001 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Конструкція експресії руУесВакбкг50 «4005 12

Едсдєаасаа сЕЄЧдсЕеЕсдсесс Ессассссссєс сссстасрєссєсєс седсаєдсад ассааєсдгас бо бадеЕєваєда аєдсавадеє єдеадсаєсдс ссддссссос сссассассс дсадаасдса 120

Зо ассуссдсеЕсС Едссссуссе сдассуєсту ссссссссса бадсасстадс дссдсесаса 180

Ессассеєсаа ддсасеєдссеЕ ссаєссдссс адсссдадає содддасоаєдаєс ассЕссдвдає 240 сеЕсдддєдає дасдсаєссд аассдадада аасааєссад ааассдаааа аагсаадессаа Зоо ааєгєдеЕЧавєє єдеЕсєвсадаас ааасаєдаса сСсасдессаса сссаєсдесдаа аадаєсссасд 3З6о ааєчааєдас ЕЄЄсаєдесас єсСЕєдссдаа адааассааа ассдасасса Сасаааадес 420 ассаєєсаєд сЕСЕсСасасе сассаараєс сЕСЕСсСЕссс адаадесасє сеессддсдаа 480 чадеаєсаса сгадаєстад гаєдеЕсссса аааєдеЕссса дааєсеЕсуєу ассесеЕсеєство 5340 саассєсссаа ассасссссс саасссадде дсаєєсдодоадас ссдадассса Ссддаграєссс 60

Есоддбаєсдча єсдсЕЕееєда деаседсаса ададсаєссса ссасссддса аасдєсстсдає 6б6о гєсаддадоад аддддеєааає дсаєчаєсдсд дассдассаа ссаассдада дадаєсссада 720 чаааєдачад дчассададста аєєдсадсда адесададчдає сададсадса Єдсааєсацвєе 78о0 бЕСЕсеЧдаає сссЕдЕдЕСЕ сраєдассса ссдаасадас адаєссадсса ааадсадсгас 840 гдЕєсСсдадуа даєсчедоадуа дсЕссссссс о ассдсассса ссдааадсас Сбассссаєссс 900 сЕсссссасд сасссссосс сасасссаас дсаєсдасса срдаєдааса аасасаєдад 960 ссаааадсає гассдесеєссу аддадаєссує ассеЕєдасьє дсЕдеЕдедач дЕСЕЕссЕсе 1020 десЕссЕсСдсс ЄссаседадеЕ дсЕССсСсСЕСаа СсссудЕСЕСа ДдЕССЄСЄСсСсСЕ ЕсасеЕссстсаа 1080

ЧдЕєдЧЕЧдадсеЕ дааастаєдеЕ дчЕЕсасвєдеЕс асадесесадс деаєдеЕсєсає даєсасесад 1140

ЕЕсЕЧеЕадуає агддєеєссад ЧдЧЕЕСЕдДЕсСас адсеЕсаасЯає деЕдстаєдда адеЕсьсьсає 1200

Єдадаадсва дассссдсдс асаєддаєсас аєссдадедд сссаєдсасу асеЕссдеЕсСта 1260 ссадсддсдуд дасаададаа ссдасаассуд сааєсстаас сддсаадста гддсеЕссссе 1320 сассаєдссс дЕсссуєдда ссасєєєддаа Єдааадааас дсасодддодаєдс сссдссасаа 1380 чадеЕдсдсса сссассаєсс басеєсассдс саєсудєсдад даддссаадс ЕЕсОодаєсодве 1440 сдсддасодса аадсааєсад ддаавгасеЕсеЕ єсеаддсдад гадесеЕдеЕсає дасадвєаєдьед 1500 сЯчдаЕЧЕЧЕЕ дсаасеєсеЕсе ааасеЕссасеЕ сеЕсссеЕває єЕсааєадаєд аддсааадсе 1560 баєдссессд ЄЕссдааааа ааааасадеьс саасдеєдеЕдс Есаєсаассід ааассаєсдсе 1620

Єсаддсаєєд адсасеєсасе ассаааєсда аасеєсссааа сєдаасддад додасеЕсааєс 1680 сЕЕвасссде Едсааадаєд ааадссадсд аааааааєса асадедеЕсає єЄдсседаєаа 1740 аєдсаєдаад даєсоддадада соддєддоадас єссдсаєсає єдссеєддсад деЕдсаєдад 1800 бадаєєсада даааєдадад дасудбасаає гасеєдеЕсься дадесаседеЕ ссаєдааєда 1860 сссаседсас Едааєдаєєд саєдадссаа аадсастасе асесададдс аєсЧчдєдаЧЕд 1920 бо сЕСЕСЕСаєс ЕСЕЄсЧСЧасстд сЕДдЕсоЧєЄєдУа ЕСЕДсаєстєс адессссссс сссаєєсдсдас 1980

Єдссеєддаає ааддесєсдаєс соддсЕсссва аєсддеЕдадс єсудЕссаасс сссадсесас 2040 сссЕдссаас ЕдасеЕдссад адассеЕседа сассеЕдеєдда ддеагаваєс сеЕєесцдаєье 2100 сСЕвЕЕССсСадсЕ даадеасдсеЕ єддаєссааа аасеЕсадесд ЕссададсеЕєсє додадаседа 2160 гЕєЯєЯдЧЕсдЯ ЄЕДдДдааєссад ддадоодадед даасадстад саадаадсає ддадссєссд 2220 дЕсаєсаєєс ададсассас асаєсддааєс сасеєдассвд дсеадсддес ЕсдєЄаассес 2280 дЕСЕСАЕЄСЬЄ ЄсеЕгдссасеЕ даааєаваєс ссадаєссас ассеЕссссдд ссадаєсдвад 2340 ачачачдадас сдсссссссс аасєдасдес сЄдсдаадсса ддаєсєаааа ааєдасьєся 2400 ссЕдсЕСвас Едаааєсєсєсє сасасссуса суєсЕсСЕсуЧЄЕеЕ аасстєдседа ЕсСЕССсаває 2460 баєааєеєєсе сасессдєсс ддаєєсадед аадеЕсдссдс ЕДдДЕДЕЕдЕеЕсСсС саєссатаєяс 2520 садедсадсд асссеЕсасудс аєссддссесс єддсаєдсса ссдссдудрасс сеЕдсєсвдсс 2580

ЧЕдаадааєє ааддєдддсеЕ ЕддЕССадає сеЕСдсадеєеєс сасеЕстддеєс адеЕєстаєад 2640 сЕСЧдаєдааа Есааадсесєс асасааєсесс даєєсддаєса сддсеЕссссе саєдсеаадс 2700

СЕсааєєсдд садсессусе ссададсссд СЕСсСасасаає Еєддаєєсдса Есасадсессс 2760 ссеЕсаєєсає сааєсеєсасад дЕєЕсссааєсе даєсдаєсса дададсесає ссеЕсстьдсес 2820

Єсаєдаасає сЄдссасддадуа дссаєдддса дссєдаєссс саадесєдддс дадсеєдсьса 2880 бддаєдадна саадседсас аадсдсаєса адааадаєде Едадеєссес аадааддадес 2940 бЕдададсає дсасдссдсс сесаєсаадд СЕдодсддадде дссодсоддддас садсеЕсддаса Зоо чдадасаадеЕсаа дсессддудсес дасдадудесєса дададсесьсС сгасаасаєд дадчдаєдесд З06о

Єсдасаадьсє ссесдрасдс деЕсдасуддсуд асддсаєєса дсадссеєсас дасаасьссд 3120 дсачаєєсаа ддадсеєсаад аасаадаєда СсуддасЕсдсЄЕ Єаадаааддс аддааєссасс 3180 аєсдсаєадс Еєдасдсдаєс ааддаааєса аддадсаасс ссаддаддєд дседсгсаддс 3240

ЧдЕдасаддаа сааддеадсеЕ дЕЕсссааєс сргаєддаасс ааєтасстаєс дарссєвдес 300 гЕСсСдадсЕвс деасдсадаа дсдасададс садеЕсддсає аєаєддадаач адоадаєдад 3360 адсЕСсаєдад дЕсЄдсЕСЕСсСсС асддададед аєдаєдссес баасаадада ссааадаадд 3420

ЄсессаєєсдеЕ Єодаєсєсода доддсєдддса адассасссс содсгададса деагасдаса 3480 ачаєсааадд ЄчаєсеЕсдає єдЕСсСододдсає сЕдЕссссує суддеЕСсСадаас ссеЕдасаєда 3540 ачдаадчдЕсєЕеє аадоддасаєс сесаєєсдаєс ссдудсаассс Есасеєсадає сегдссасас З6о0 бддаєдасаа асаасеЕсусе ааааадссес аєдаєсеєссся ададаасааа аддсаєдсає З6бо садеЕсасадс аасааєсеєсас асвагаєдає асаєєвєдеЕсеЕ сдсаєдссад сеЕдсасааде 3720

Зо аасасєдсаа Садградсооєд бааасаваєс деасудеєЕсаса сддааддадаєє садаасааєє 3780 бЕсааддеЕса ссесЕсаседа Едеаєдсаді аєдсассааа сЕдЕааассе гагаддеЕдсяе 3840 сасеЕсєеєсаад ссеЕдтаєаад ЕсваваєдеЕс сдаєссєвсс сеЕССЕЕсаєс даааєаєваєа 3900 аєсадеаасе асесесссуєе дсаєєсаєвта сааєдудсеєда аасеЕсаєвду саєсддесса 3960 адаааєссає сргааасесеєсеЕ Есадааєсьс ассассадса аааєаєадас ааааддаєаа 4020

Єдссасасвта СЕсСОВгооєсоодУа ЕСЕЄсСссаає агсаєсстасся дассааєсеєса ассессаєад 4080

ЄЕааєєеває сеЕсСасуєдсуд аєсасеєдаєд садсааєсєєуд сьтавєєсвдедеЕ ЕсСвасессся 4140

Єдааєсєсаа агагадесеса ЕЄЕєдеЕЕеСсСає саєсєдасвд баддаєсаєса асасасдсеє 4200 саєдадааєс адаєтаєсда дЕеЕсдадасу саєдсеЕдсее асрадесесує єЕЄедааває 4260 агдсссеЕсас счдаєднаєад Есссасссає агаєссаває ддсдсеЕСадс ЕсЕЯЧЕЧаєає 4320 басадассес асассдавас єсЕдаассаа Сосадодасаєс єєдЕСасаає Єдаєдаєваєа 4380 бдоадасдааа єЧд9ЕсЕЕдЕЧдодда аддсаєсаас СЕСУЧСсСЕСсЕеЕСсСЕеЕ ссаасаддаа гааєсссаддс 4440 адеЕсддссраа Єсассасаас ссудсаарсєес даєдесссса аассаєдеЕвд сеЕсаєсддсе 4500 чаєдаєєсаа басасаааає дааассесьс сссаседаєд асеєссадаад дсеЕСЕЄсссає 4560 аададаасає сеЕСссдасдс Еддєддаєдс ссаадедаає ЕЄсаасаадеі дЕСсдаадасєс 4620 асгаєєдаада аасодосодеЕдуа адеассасвуд дссаєсаєса ссаєсдсьад ЄдссеЕСсодсе 4680 адеддссадс аєдеЕдааасс ааадсаєдад Єдддаваєсс басеЕссадес ссЕсддсесссе 4740 чдадеаасаа аадаєаасгад ЕсСЕдЧдєЕедад аєдсоддадаа басваєсьсе садстаєвсає 4800 ааєсвассує сеЕСаєссдаа аасеЕсєдеЕста сЕсСвасстає деаєаваєсс адаадаєадсес 4860 ассаєєсддна дадасадасе дасаєддаад єдоддЕддссду ааддаєеєвєдеЕ ссассаєсдда 4920 чаєсааддда ссадесссуєеЕ єЕсЕдодсєсдда Сгааассасе Єсаассадсе саєсааєада 4980 адсаєдаєсс адссаасаса Едаєдаасва додссаддеас аєдсеЕвдсся Едгасаєдає 5040 агддЕєсевд аєсеЕсаєссу саасеЕсссса саєсдаадсаа азєеЕсдеєєаа Едеаєсвддває 5100 чдадасасаддда агадсасаєс Ессасаааді аасудсєссуєс дЯдЕЕЕдЕСсСсСЕ Есадааєааа 5160 аєддаадаєс аєсаадссаа дссЕСЕссаса аасаєсєсаєда деаєдесасу адеЕдаддеса 5220 аєсассаєсє єеЕСсСсассвдс ЕДдЕсСадраєс аєдссаадес ЄдеЕсааєсуєє єдаадчсеЕстьу 5280 сдаєдсасесу асссдессдаа седеЕдаєсвд ддааааадса дсадсседса дсеЕєсаассьс 5340 аадччддЕдЕеЕвд дасаєсеєсаає ссасссаадд басссєдаєс басааддсас Есаааєтаде 5400 чаасеєсссда сЕдадасаду ааассєдсаа СЄЕСсСЕсоОодад ЕДдДЕєддаєсь Едасаасаає 5460 баєдадстад аєдааєсддсес Есссасесьс сЕеЕсСаааєєда даадаєєаає сргасевааає 520 бо дЕсаєдЕсДЕ аєаадоаєдудЕ Ессаасесся дососооєсєдс адаасаєдас асссаєседаа 5580

ЧЕЧДЕєЧдадоад дадЕСЕсСЯЯЯдЕ сЕСЕСєдаас аєсаєсеєдсас аададсевду саассєдаса 5640 аддсєдаддд адсеЕсаадає єсодсЕеЕссаад даєсддеєааєсє єддаєеєсаєва гавасесесес 5700 чЧЕдаадеЕсесС Єдддсаассе дсаєсараєс дааадсстаа деаєсадеса сааєсессааа 57б6Оо чааасаєсьє єЕдаасеєдає ддаєсєссвд ддададсуєеЕ дододЕдссьсс Едгасаєсьс 5820 сдасддааєєсуд єдДдЕСЕсдддає дсссадссаа сЕСсСЕСЕєдсає Едсдаддаєд даєааадада 5880 чдассссеєсдс аєсеЕсЕсдаа ссеЕСсСсссдад ЕсСааєссєся ддссадедаа доаадеЕдсад 5940 саддаддасу Еддаааєсає єдоаддоаддЧдЕсЄдд седЕсСссЕєс дссдеЕсСЕсСвд даєсааададс 6бО0о асссассааа сасадсдудсеЕ дсргадесаєс суєсдсадаєд ддЕєссдсвд саєдаєддвас 6бОбо гЕєддадеЕєда аєсудєсєдддаєс адсадсусаа аєсаєдеЕсвд аассаддадс ЕЄгдссдад 6120 чдсддаадстас ЄЕДдЕДЕсСсСад ссЕдддсдЕд соодудєддсодс аададдаєдуа ааасеЕдедаЧеЕ 6180 сЕССасеєсдуд дссеЕдсадду даасссдсес Сссссєсддс аєдасдєссє єдеЕсССЯтаєа 6240 бассосодсо додсодадоде бдодоадодса ааддаадсуд аддссдсддЕ даддсасдсу 6300 сЕСдаадссс ассссаасса Есссссудаєс дасаєсєєдада Єдассссуба гагадсадаа 6360 чдабасеєсасуд Єсдсаєстаа ссааєсасес деЕдсасесас дсаєдеЕдссЕ єЕсЕСЕСсСЄСа 6420 аєдасддасеЕ дассеєваєса сЕЕєсеєдсає додЕсСЕДдаєс ЕсеЕдааєстс сесаддеЕдся 6480 сдаєдаєдаєдч асєсоосодєда ддадааседа ЕсСтаєдаєде ададдасеса садсдааєса 6540

ЧдаєдЕдсЕсСЕ ссагаєднає дсаєєсасьд деЕСсасасеЕве ссассассеєвє єсЕсСЕсСесСса 66

ЄсеЕСвададс ЄсадсеЕсудЄеЕ єсвасаєєсда сСаааседсдс басадаадзее дсеЕсСадеЕСтд 6бббо ааассасдса аєсеЕсасеЕсе єддсаадесдс Єдаєдааадс Єааєдаєьсе аддаєсеєва 6720 бдсааасевд бадааддаса чЯЕеЕєдЕадна сассєдстає ааарадеЕесе гаддасеєее 67Во сдасадаадеЕ адасєЕсеєдоад аадаєєсоєд дчаєаддодоадає ч«сЕдасЕста дсєдасааде 6840 часаадвасеЕ ссаєдеЕсаєса сааєєсасєьс сеаєдеЕаад деаєсеЕсьдЕ адсессссдад 6900

ЕссгадсасеЕ аасеєсаассс асеЕдаааєьєс адаадддадуасє басеЕдаєєдеЕ даадчдесеса 6б96о сЕСЕДдадааа гаадсаддає єєдЕдааєадд ддадсаєєеєсєс вгдеЕсССЯЕСсСсСЯЄ агдсаєаєад 7020 сЕСЕСЧдааає ЕсасадеЕєда аасаасссєд сєдааааєєсе гЕддсаєсдєаа аадеєстасе 7080 бааєсаадає саааєтаєса ссаєддеЕєсад сааєсадааа басадваєсє гаассддада 7140 бааєстааає сасададудєса деЕдЕддЕдса ддаааасеЕдеЕ ЄЕС єдсадсадаа 7200 аададеЕсаає ддаєсасасу сЕЕсеЕсаасеі дЕсССсСЯдастдс ЕсСЕСЯдЕєсаса ЕсЕдддаасасєс 7260 аєЕєдЕддЕСьЬс аасасадесс седЕеЕсадсає ддададасеє адеваєсдда гааєсдаасьс 7320 садддадаєааа дагаддааєс ЄдЧаєЕеЕссСеєда садоадеадед дсеЕДдЕвавєсеЕ даааасдад 7з8о0

Зо ааачаєааєс дссєдааааа ааааєссассі аєддаєссса дсеєдсасоаєда єДдеЕаодЕЄЧЕ 7440 ааадсеЕдває аєсодсасасе еєсаседдеЕссІ адсеЕсасада даааадааєе дсасчдаєсдс 7500 аддеЕадсадд дасочєддадає гасєдсеЕдЧчЕ додсаєсддад аагєсдєдєд дЕсЕСасьеаа 7560 саєесвеЕдадЕ дддсдссдде ссеЕдсааада асєдааддає ддаааддаєес сдассеЕєдас 7620 боддаачЕеЕсєдЕ дЕдаєдадсесс Едсадааааа дасасеЕдсеЕе ддєЕсЕдЕаа Едааєсадна 7680 асдчєдЧЕєсдуа даєЄдаасеєда Есссгассда ааааааєсдуеЕсє єссусудсСееєе єдЕсСЕСасес 7740

ЕсеЕссдєсса ааадсасесд Єсаєсаааає ддасааааав адаєдеаєсьі адаассаааа 7800 басаєсвада басассєсссє ЕСЕСЕсСаєс сЕЧдаєдасаа деаєсессда асоодадоадад 7860

Басааадсаа ссаассдаас саєєсаддада саддсдссда дсддаадсад сасадссасд 7920 сссаааадаа асдасадада аададсаааа дааасаааєсуд ссдасаасууд сддаєсааса 7980 аааасдаада адсааадсаа Є 001 «2105 13 «211» 961 «212» РЕТ «213» Аеді1орв Бацвспії «4005 13

Меє Авр І1ї1е Уаі1і ТПг сіу Аїа Іїе Аїа Ппув Гец І1е Рго Гув5 ІТеп ШУ 1 5 10 15 січ Гей Гецп УМаї с1і1у бій Тук Пув Гей Ні Ппув сіу Уа1ї Ппув Ппув Авп 20 25 30

І1е біц Авр Тец ІТец Гув бій Тец Гув ТПг Меє АБп Аза Аїа ей І1е 35 40 45

Тпув І1е с1у сій Уаї Рго Рго Авр сбіп Гей Авр бек біп Авр Гув5 Іей 50 55 бо

ТЕр Аїа Авр сіц Уаії Агд біц Гей бек Туг Уаі І1ї1е б1п1 Авр Аза Уаї бо 65 70 75 80

Авр пув РіПе Гец Уаі Агкуд Уаі Нів сіу Маії бій Рго Авр Авр Авп о ТаПг 85 90 95

Авпосіу Рпе Ппув біу Гей Меє пуб Агуд ТП ТПг пув Гей Гей Гпув Гу 100 105 110

Уаї Уаї Авр пув Нів сіу Іїе Аїа Нів Аза Іїе пуб Авр І1е Гув Гув 115 120 125 січ Гей біп бій Уаі Аїа А1їа Агуд Агуд Авр Агд Авп Гув Рре Авр 01Уу 130 135 140

І1е Аїа бек І1е Рго ТПг бій Азїа І1е АБр Рго Агд Гей Агуд Аїа Гей 145 150 155 160

Ту Іїе бій Аїа Аза сіцш Іец Уаї сіу І1е Тук б1у Ппув Агд Авр сіп 165 170 175 біц Гей Ме бек Гей Гей бек Гей бі с1у Авр Авр Аза бек ТПг Гу 180 185 190

Тпув ТГешп Гпув Ппув Уаії Бек Іїе Уаі сі1у Рпе сіу б1у Іец б1у Ппув ТПг 195 200 205

ТПЕ Ггешп Аїа пув Аїа Уаї Тук сбіцш Ппув Іїе Пув б1у Авр Ропе Авр Сувг 210 215 220

Нів Аїа Рпе Уа1і Рго Уаії сбіу сбіп Авп Рго Авр Пув Ппув Ппув Уа1 Ре 225 230 235 240

Зо

Акуд Авр І11е Гец Меєс Авр Гей бБег Авп бек Авп бБег Авр Гей Аїа Гей 245 250 255

Тец Авр бій Агуд біп Гей Іїе АвБп пуб Гец Нів Гу Рпе ІТеп бій Авп

З5 260 265 270 ув Агуд Тук Гей Уаі Іїе І1ї1е Авр Авр Уаі Тер Авр сіц с1у Іец Тгр 275 280 285 ув Авр І1е АвБп Гей Аза Рібе бБег Авп Агуд Авп АвБп Гей сіу бек Аг4д 290 295 300

Тецп І1їе І1е ТПг ТПг Агуд чІ1е Рпе сіу Уа1і Бек сій бек Сув Сув вег 305 310 315 320 зек Аза Авр АвБр Рго Уа! Тук сій Іїе бій Рго Гей бБег І1е Авр Авр 325 330 335 зек бек Ппув Тецп РпПе Туг ТПг Агуд І1е Рпе бек Авр Бек с1у Сув Рго 340 345 350 пув бій Рпе сій сбіп Уа1ї Бек Ппув Авр Іїе Гей Гпув пув Сув б1у с1У 355 3З6о 365

Уаї Рго Геш Аїа І1їе І1е ТПг І1ї1е Аза бек Аза Іей А1їа бек с1у сіп 370 375 380 біп Маї Гпув Рго Ппув Нів бій Тер Авр Іїе Гей Гей Ссіп бек ГІец С1Уу 385 390 395 400 60 зек сіу Уаії ТПг Гув Авр Авп бег Іец Уаі бій Меє Агуд Агуд Іїе ГІец

405 410 415 зек РПе бек Тук Тук Авп Гей Рго бек Нів Гецп Ппув ТПг Сув Гей Іец 420 425 430

Тук Гей Сув Іїе Тук Рго біц Авр бек Мес І1е Ніб5 Агуд Авр Агд Іец 435 440 445

І1е Тер Пув Тгр Уаі Аї1а сій сі1у Рре Уаії Нів Нів с1у Авр сбіп Щ1У 450 455 460

ТПг Бек Гей Рбе Гец Уаї сіу Гей Авп Туг Роре АвБп біп Тейп І1е Авп 465 470 475 480

Агдуд бек Меє Іїей біп Рго І1їе Тук бек Авр Мес с1у Авп Уа1ї Туг А1а 485 490 495

Сув Акуд Уаії Нів Авр Меє Уаі1 Гей Авр Гей Іїе Суб Авп Іецй бек Нів 500 505 510 бі Аза Гуз Рпе Уаі Ап Уаі Рпе Авр с1іу ТПг сіу Авп І1е Меє 5ег 515 520 525 зек біп бБег Авп Уаі Агуд Агуд Тїец бек Гей біп Авп Гув Авп бій Авр 530 535 540

Нів біп Аїа Ппув Рго Гец ТПг Авп І1І1е Мес бег І1е бек біп Уаі Агд 545 550 555 560

Зо зек Іїе ТПг І1їе Рбе Рго Рго Аїа Уаі бек І1їе Месє Рго Аїа Іец 5ег 565 570 575

Акуд Рпе сіц Уаї Іец Агкд Уаії Гец Авр ІТец бек Авр Сув Авп Гей 01У 580 585 590

З5 біц бек бек бек Гей біп Рго Авп Гей Ппув сіу Уа1і сСіу Нів Іец І1е 595 бо 605

Нів Гей Агуд Туг Гец біу ІТец бек сіу ТБг Агуд І1е бек Гув Гечц Рго 610 615 620

Аза сій І1їе сіу ТПг Іец біп Рбе Іец біц Уаї Гей Авр Ге с1у Туг 625 630 635 640

Авп оНів сій Темп Авр біц Гей Рго бек ТПг Гей Рре Гпувз Гечп Агд Агд 645 650 655

Тецшц І1е Тук Гей Авп Уа1! Бек Рго Тугк Ппув Уа1і Уа1і Рго ТПг Рго 01Уу 6бво 665 670

Уаї Гей біп Авп Меє ТПг бег Іїе біш Уаі1і гей Агуд сіу І1е РіПе Уаї 675 68 685 зек Гец АБп І1е І1е Аза сіп сбіц Іец б1у Гпув Гей Аза Агд Гей Агд 690 695 700 біш Гей біп Іїе Тук Рпе Ппув Авр сіу Бек Гей Авр Гей Туг біц с1У 705 710 715 720 бо Рпе Уаї Пув бек Гецп Сув Авп Гей Нів Нів І1е бій бек Гечп І1е Уаї 725 730 735 зек Сув Авп бек біу біцп ТПг бек Роре бій Гей Ме Авр Гей Геш 0Щ1У 740 745 750 сій біп Тер Маї Рго Ркго Уаї Нів Гей Агуд бій Рпе Уа1! бек сі Меє 755 760 765

Ркго Бек біп Іец бек Аза Тецй Агуд біу Тгр І1е Гпув Агуд Авр Рго 5ег 770 775 780

Нів Гей бек Авп Гец бег біц Гей Іїе Гец Рго ТПг Уаії ув сі Уаї 785 790 795 800 біп бі1іп бій Авр Уаі бій Іїе І1е сіу с1у Гей Гей бБег Гей Агд Агд 805 810 815

Тец ІТецп І1їе сій Бек ТПг Нів сбіп ТПг біп Агд Гей Гей Уаі І1е Агд 820 825 830

А1а Авр с1у Рбе Агуд Суб Меє УМаії Авр РібПе Туг Гей Авп Сув с1іу бег 835 840 845

Аза ТПг сіп І1е Меє Рре бій бек біу Аїа їей Рго Агуд Аїа сіц сій 850 855 860

Уаї Сув Рпе Бек Гей сіу Уаі Акуд Уаі1 Аїа пув біц Авр б1у Авп Аг4д 865 870 875 880 сб1у Рпе Авр Гей с1іу Гей біп сіу Авп Гей Гей бек ІТецй Агуд Агуд Уаї

Зо 885 890 895

Уаї Тер Уаі1ії пув Меє Тук Сув сіу сіу Аїа Акд Уаії сіу біцш А1тїа Гув 900 905 910 сі Аїа Ггуз Аза Аїа Уаі Агу Нів Аза Гей бій Авр Нів Рго Авп Нів 915 920 925

Рго Рго І1е біп І1е АБп Меє Рбе Рго Агд Ії1е Аза сбіш с1у Аїа сіп 930 935 940

Авр Авр Авр Гец Меє Суб Тук Рго Уаі с1іу сіу Рго І1е бБег Авр А1а 945 950 955 960 січ «2105 14 «211» 961 «212» РЕТ «213» Аеді1іорв Сацйвзспії «4005 14

І1е біц Авр Тец ІТец Гув бій Тец Гув ТПг Меє АБп Аза Аїа ей І1е 35 40 45 60

Тпув І1е с1у сій Уаї Рго Рго Авр сбіп Гей Авр бек біп Авр Гув5 Іей

50 55 бо

ТЕр Аїа Авр сіц Уаії Агд біц Гей бек Туг Уаі І1ї1е б1п1 Авр Аза Уаї 65 70 75 80

Уаї Уаї Авр пув Нів сіу Іїе Аїа Нів Аза Іїе пуб Авр І1е Гув Гув 115 120 125 січ Гей біп бій Уаі Аїа А1їа Агуд Агуд Авр Агд Авп Гув Рре Авр с1Уу 130 135 140

Ту Іїе бій Аїа Аза сіцш Іец Уаї сіу І1е Тук б1у пув Агд Авр сіп 165 170 175 біц Гей Ме бек Гей Гей бек Гей бі с1у Авр Авр Аза бек ТПг Гу 180 185 190

Зо ТПЕ Ггешп Аїа пув Аїа Уаї Тук сбіцш Ппув Іїе Пув б1у Авр Ропе Авр Сувг 210 215 220

Нів Аїа Рпе Уа1і Рго Уаії сбіу біп Авп Рго Авр Пув Ппув Ппув Уа1 Ре 225 230 235 240

З5

Тец Авр бій Агуд біп Гей Іїе АвБп пуб Гец Нів Гу Рпе ІТеп бій Авп 260 265 270 ув Агуд Тук Гей Уаі Іїе І1ї1е Авр Авр Уаі Тер Авр сіц с1у Іец Тгр 275 280 285 ув Авр І1е АвБп Гей Аза Рібе бБег Авп Агуд Авп АвБп Гей сіу бек Аг4д 290 295 300

Тецп І1їе І1е ТПг ТПг Агуд чІ1е Рпе сіу Уа1і Бек сій бек Сув Сув вег 305 310 315 320 зек Аза Авр АвБр Рго Уа! Тук сій Іїе бій Рго Гей бБег І1е Авр Авр 325 330 335 зек бек Ппув Тецп РпПе Туг ТПг Агуд І1е Рпе бек Авр Бек с1у Сув Рго 340 345 350 пув бій Рпе сій сбіп Уа1ї Бек Ппув Авр Іїе Гей Гпув пув Сув б1у с1У 355 3З6о 365 бо Уаї Рго Геш Аїа І1їе І1е ТПг І1ї1е Аза бек Аза Іей А1їа бек с1у сіп 370 375 380 біп Маї Гпув Рго Ппув Нів бій Тгр Авр Іїе Гей Гей Ссіп бек ГІец С1Уу 385 390 395 400 зек сіу Уа1 ТПг пуб Авр Авп бек Гец Уаі! сі Месє Агуд Акуд І1е Іецй 405 410 415 зек РПе бек Тук Тук Авп Гей Рго бек Нів Гецп Ппув ТПг Сув Гей Іец 420 425 430

Сув Акуд Уаії Нів Авр Меє Уаі1 Гей Авр Гей Іїе Суб Авп Іецй бек Нів 500 505 510 бі Аза Гуз Рпе Уаі Ап Уаі Рпе Авр с1іу ТПг сіу Авп І1е Меє 5ег 515 520 525 зек біп бБег Авп Уаі Агуд Агуд Тїец бек Гей біп Авп Гув Авп бій Авр

Зо 530 535 540

Нів біп Аїа Ппув Рго Гец ТПг Авп І1І1е Мес бег І1е бек біп Уаі Агд 545 550 555 560 зек Іїе ТПг І1їе Рбе Рго Рго Аїа Уаі бек І1їе Месє Рго Аїа Іец 5ег 565 570 575

Акуд Рпе сіц Уаї Іец Агкд Уаії Гец Авр ІТец бек Авп Сув Авп Гецй С01У 580 585 590 біц бек бек бек Гей біп Рго Авп Гей Ппув сіу Уа1і сСіу Нів Іец І1е 595 6боо 605

Уаї Гей біп Авп Меє ТПг бег Іїе біш Уаі1і гей Агуд сіу І1е РіПе Уаї 675 68 685 зек Гец АБп І1е І1е Аза сіп сбіц Іец б1у Гпув Гей Аза Агд Гей Агд бо 690 695 700 біш Гей біп Іїе Тук Рпе Ппув Авр сіу Бек Гей Авр Гей Туг біц с1У 705 710 715 720

Рпе Уаї Ппув бек ІТец Сув Авп о Тец Ні Нів Іїе сій Бек Гей І1їе Уаї 725 730 735 зек Сув Авп бек біу біцп ТПг бек Роре бій Гей Ме Авр Гей Геш 0Щ1У 740 745 750 сій біп Тер Маї Рго Ркго Уаї Нів Гей Агуд бій Рпе Уа1! бек сі Меє 755 760 765

Нів Гей бек Авп Гец бег біц Гей Іїе Гец Рго ТПг Уаї Ггув сі Уаї 785 790 795 800 біп бі1іп бій Авр Уаі бій Іїе І1е сіу с1у Гей Гей бБег Гей Агд Агд 805 810 815

Зо

Уаї Сув Рпе Бек Гей сіу Уаі Акуд Уаі1 Аїа пув біц Авр б1у Авп Аг4д 865 870 875 880 сб1у Рпе Авр Гей с1іу Гей біп с1іу Авп Гей Гец бек Тецй Агуд Агуд Уаї

З5 885 890 895

Авр Авр Авр Гец Меє Суб Тук Рго Уаі с1іу сіу Рго І1е бБег Авр А1а 945 950 955 960 січ «2105 15 «2115 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Функціональний сигнал ядерного експорта МЕб5 від НІУ Веу «4005 15

Тец біп Гей Рго Рго Гей сій Агд Гей ТПг Іецй 60 1 2 10

«2105 16 «2115 11 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Нефункціональний МЕБ5 «4005 16

Тец біп Аза Рго Рго Аїа сій Агуд Аїа ТпПг Іецй 1 5 10 «2105 17 «2115 22 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер 5Ег50-Е1, ВІ1 «4005 17 бадсдсеєдсеЕ сасаєссасс єс 22 «2105 18 «2115 23 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» гемекве ргішекгк 5Е50-Е1, ВІ «4005 18 чаєссдссЯяє Єдссддсавєе де 23 «2105 19

Зо «2115 27 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер 5Ег50-Е2, В2 «4005 19 авреєсаєдсесє свавасссас Єаасаєс 27 «2105 20 «2115 19 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер 5кг50-Е2, В2 «4005 20 дачдсдєдасеЕ дЕдсЕдсье 19 «2105 21 «2115 20 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер 5Е50-ЕЗ «4005 21 гЕСадедаад ЕЕДсссЕдЕ 20 «2105 22 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «2205 «223» Зворотний праймер 5СВСА1-А-МУІС5

«4005 Д 22 сдасаасесс ддсадаєєста 20 «2105 23 «2115 25 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер 5СВСА1-А-МІС5 «4005 23 часааддаєс дасадеаасе ддавес 25 «2105 24 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер 5СВСА1-А БТ-ЯРСВ «4005 24

Ессассваад деассеЕєсдає ссас 24 «2105 25 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер 5СВСА1-А БТ-ЯРСВ «4005 25

Зо чзачеєддаас сассеЕсата 19 «2105 26 «2115 20 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер 5СВСА1-А ЕТ-РСВ «4005 26 дсадасеЕдссвд дааєааддес 20 «2105 27 «2115 21 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер 5СВСА1-А БТ-РСВ «4005 27 баааасааад ссдсддаааа с 21 «2105 28 «2115 27 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер ВАСЕ 5р,Зр «4005 28 чаєєссьдсс ЄЕЕсСсСсвааас аадссда 27 «2105 29 бо «2115 21 «2125» ДНК

«2135 Штучна послідовність «223» Прямий праймер ВАСЕ 5р,Зр «4005 29

Єсодсаєдає дЕСЕЕсдсС Я 21 «2105 30 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р207-Е-кінець «4005 30 часдддсЕдс бадравєсьсс 20 «2105 31 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р207-Е-кінець «4005 31 дссаєсдддає сеЕддададаа 20 «2105 32 «2115 22 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205

Зо «223» Зворотний праймер р207-В-кінець «4005 32 сЯдєєдсааєсуд асдсассавба сд 22 «2105 33 «2115 19 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р207-в-кінець «4005 33 ассдадсєсд ЄдеЕдсеЕсаа 19 «2105 34 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2Е7-Е-кінець «4005 34 саасаадасуд сасассассе 20 «2105 35 «2115 20 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2Е7-Е-кінець «4005 35 чЕдсадеЕєдс ададдассод 20 60 «2105 36

«2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2Сс2-Е-кінець «4005 36

ЕЕСсСдсаддеє саєсаєдаеєс 20 «2105 37 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2сС2-Е-кінець «4005 37 сЕССсСсдааєеЕ ддааадеддва 20 «2105 38 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2Сс2-Е-кінець «4005 38

СсСсСЕБгОДсСсСЕЕ Садсевдасд9д9 20 «2105 39 «2115 20 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2сС2-Е-кінець «4005 39 гЕдссддаад саадаасьсе 20

З5 «2105 840 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер рікЕ7-Е-кінець «4005 40 садададЕдЕеЕсЕ ддаєдааачдд 20 «2105 41 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер ріЕг7-Е-кінець «4005 41 ссдаєссаду ддасаєсадчеЕ 20 «2105 42 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер рікЕ7-в-кінець бо «4005 42 сЕєСсСЯдЕсаду ааєддсадче 20

«2105 43 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер ріг7/-в-кінець «4005 43 саєдссеєдає ЕсааєдЕсдс 20 «2105 44 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2в8-Е-кінець «4005 44 дсасдсаєдс аєдеадевда 20 «2105 45 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2Вв8-Е-кінець «4005 45 чадаадсесс ЄОдЕСЕЧЕСЇ 20 «210» 46

Зо «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2в8-К-кінець «4005 46 аєссдєдодада дсеЕдсадчед 20 «2105 47 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2в8-вК-кінець «4005 47 ачаєдчаєвд дасєдеддває 20 «2105 48 «2115 19 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2сС8-Е-кінець «4005 48 садсЕСадЕеЕСЕ дссдаааад 19 «2105» 49 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «2205 «223» Прямий праймер р2сС8-Е-кінець

«4005 49 аєсддадеЕсд Есддададад 20 «2105 50 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2Сс8-В-кінець «4005 50 даЯдєсСссЕвдсС ЕсдеЕДаде сс 20 «2105 51 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2с8-в-кінець «4005 51

ЄЧдЕЧаєддед агдсеЕєдедс 20 «2105 -52 «2115 21 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2сС7-Е-кінець «4005 52

Есеєдаадссду дЕСдадеЕсьс с 21

Зо «2105 53 «2115 21 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2СсС7-Е-кінець «4005 53 чададеасва дЕСЕСЯдсаєс а 21 «2105 ч54 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер р2с7-в-кінець «4005 54 саєддсєдсс асеЕсеЕСсааад 20 «2105 55 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2Сс7-в-кінець «4005 155

Есасдсасудє саадессаааа 20 «2105 56 «2115 25 6о0 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність

«223» Зворотний праймер р2АЗ-Е-кінець «4005 чМюЩ56

Єдадагаседед ааадсчдаєсс єваєс 25 «2105 557 «2115 21 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Прямий праймер р2АЗ-Е-кінець «4005 Ь57 часддсаада Єддадсааддч а 21 «2105 58 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Зворотний праймер рІпдідовдАс5 «4005 158 ччаєдеЕдсьд сааддсдаєсе аадеЕєд9д 27 «2105 Б59 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205

Зо «223» Прямий праймер рІпаідовдАсС5 «4005 -ми59 сЕСЯваєЧчеЕ дсдсоодааєє деЕдадс 26

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Трансгенна злакова рослина, яка має інтегрований у її геном екзогенний полінуклеотид, який кодує поліпептид, що надає стійкості до однієї або більше рас Риссіпіа дгатіпів, де полінуклеотид функціонально зв'язаний з промотором, здатним керувати експресією полінуклеотиду в клітині рослини, яка має підвищену стійкість до Риссіпіа дгатіпіх порівняно з ізогенною рослиною, яка позбавлена екзогенного полінуклеотиду, і де: ї) поліпептид містить амінокислоти, які мають послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ МО: 1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1, і/або ії) полінуклеотид містить нуклеотиди, які мають послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ МО: 10, або послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 10, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіліа дгатіпів.

2. Рослина за п. 1, де Риссіпіа дгатіпів являє собою Риссіпіа дгатіпів ї. Бр. Іпйсі.

3. Рослина за п. 2, де Риссіліа дгатіпів 1. вр. Лісі являє собою расу групи 0999.

4. Рослина за будь-яким із пп. 1-3, де: ї) поліпептид містить амінокислоти, які мають послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ МО: 1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1, і/або ії) полінуклеотид містить нуклеотиди, які мають послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮО МО: 10, або послідовність, яка щонайменше на 97 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 10, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів.

5. Рослина за будь-яким із пп. 1-4, де поліпептид містить один, декілька або усі зі спірально закрученого (СС) домену, нуклеотид-зв'язувального (МВ) домену та домену лейцин-багатого повтору (І КК).

6. Рослина за будь-яким із пп. 1-5, яка являє собою рослину пшениці. 60

7. Рослина за будь-яким із пп. 1-6, яка містить один або більше додаткових екзогенних полінуклеотидів, які кодують інший поліпептид стійкості до патогенів рослин.

8. Рослина за будь-яким із пп. 1-7, яка є гомозиготною відносно екзогенного полінуклеотиду.

9. Рослина за будь-яким із пп. 1-8, яка росте на полі.

10. Спосіб визначення полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпівх, який включає: ї) отримання полінуклеотиду, функціонально зв'язаного з промотором, причому полінуклеотид кодує поліпептид, який містить амінокислоти, які мають послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ МО: 1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 до ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1, і) введення полінуклеотиду в злакову рослину, і ії) визначення, чи рівень стійкості до Риссіліа дгатіпіз модифікований порівняно з ізогенною рослиною, яка позбавлена полінуклеотиду, для ідентифікації полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів.

11. Спосіб за п. 10, який додатково включає вибір полінуклеотиду, який при експресії надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів.

12. Спосіб за п. 10 або 11, в якому застосовують один або більше з наступного: а) полінуклеотид містить нуклеотиди, які мають послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ МО: 10, або послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична ЗЕО ІЮ МО: 10, р) рослина являє собою рослину пшениці, с) поліпептид являє собою поліпептид рослини або його мутант, і а) стадія ії) додатково включає стійку інтеграцію полінуклеотиду, функціонально зв'язаного з промотором, у геном рослини.

13. Очищений і/або рекомбінантний поліпептид стійкості злакової рослини до Риссіпіа дгатіпів, який містить амінокислоти, які мають послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ МО: 1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична або щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 1.

14. Поліпептид за п. 13, який містить один, декілька або усі зі спірально закрученого (СС) домену, нуклеотид-зв'язувального (МВ) домену та домену лейцин-багатого повтору (І ЕК).

15. Поліпептид за п. 13 або 14, який являє собою злитий білок, який додатково містить щонайменше одну іншу поліпептидну послідовність.

16. Виділений і/або екзогенний полінуклеотид, який містить нуклеотиди, які кодують поліпептид за будь-яким із пп. 13-15, який надає стійкості до Риссіліа дгатіпів.

17. Химерний вектор, який містить полінуклеотид за п. 16.

18. Вектор за п. 17, де полінуклеотид функціонально зв'язаний з промотором.

19. Рекомбінантна клітина, яка містить екзогенний полінуклеотид за п. 16 і/або вектор за п. 17 або 18.

20. Клітина за п. 19, яка являє собою рослинну клітину.

21. Клітина за п. 20, де рослинна клітина являє собою злакову рослинну клітину, таку як клітина пшениці.

22. Спосіб отримання трансгенної злакової рослини за будь-яким із пп. 1-9, причому спосіб включає стадії: її введення полінуклеотиду, як визначено у п. 16, і/або вектора за п. 18 у клітину злакової рослини, і і) відновлення трансгенної злакової рослини з клітини, таким чином отримуючи трансгенну злакову рослину.

23. Спосіб за п. 22, який додатково включає збирання насіння з рослини.

24. Спосіб за п. 22 або 23, який додатково включає отримання однієї або більше рослин- нащадків із трансгенної рослини.

25. Спосіб отримання злакової рослини, яка має інтегрований у її геном полінуклеотид, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів, причому спосіб включає стадії: її дослідження однієї або більше рослин-нащадків, отриманих на основі схрещування двох батьківських злакових рослин, на присутність або відсутність полінуклеотиду шляхом аналізу зразка, який містить ДНК з однієї або кількох рослин-нащадків, на наявність полінуклеотиду, де щонайменше одна злакова рослина містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпів, і ії) вибір рослини-нащадка, яка містить полінуклеотид, таким чином отримуючи злакову рослину, де а) поліпептид, який надає стійкості до Риссіпіа дгатіпіх, містить амінокислоти, які мають послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ МО: 1, її біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1, і/або р) полінуклеотид містить нуклеотиди, які мають послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ МО: 10, або послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 10, що кодує поліпептид, який надає стійкості до Риссіліа дгатіпів.

26. Спосіб за п. 25, де щонайменше одна з батьківських рослин являє собою трансгенну рослину за будь-яким із пп. 1-9, і вибрана рослина-нащадок містить екзогенний полінуклеотид, який кодує поліпептид, що надає стійкості до Риссіліа дгатіпів.

27. Спосіб за п. 25 або 26, де щонайменше одна з батьківських рослин являє собою тетраплоїдну або гексаплоїдну рослину пшениці.

28. Спосіб за будь-яким із пп. 25-27, де стадія її) включає: а) вибір рослин-нащадків, які є гомозиготними відносно полінуклеотиду, і/або Б) аналіз рослини або однієї або більше її рослин-нащадків на стійкість до Риссіліа дгатіпів.

29. Спосіб за будь-яким із пп. 25-28, який додатково включає: вибір рослини-нащадка, отриманої від зворотного схрещування нащадка від схрещування на стадії і) з рослинами того самого генотипу, що й перша батьківська рослина, яка позбавлена полінуклеотиду, який кодує поліпептид, що надає стійкості до Риссіліа дгатіпіх, протягом достатньої кількості разів для отримання рослини з більшою частиною генотипу першої батьківської рослини, але яка містить полінуклеотид, який має стійкість до Риссіпіа дгатіпів.

30. Спосіб за будь-яким із пп. 22-29, де спосіб додатково включає стадію аналізу рослини на щонайменше один інший генетичний маркер.

31. Спосіб ідентифікації злакової рослини за будь-яким із пп. 1-9, причому спосіб включає стадії: ї) отримання зразка нуклеїнової кислоти з злакової рослини, і ії) дослідження зразка на присутність або відсутність полінуклеотиду, де присутність полінуклеотиду вказує на те, що рослина є стійкою до Риссіліа дгатіпів.

32. Спосіб за п. 31, де полінуклеотид кодує поліпептид за п. 13 або 14.

33. Спосіб за п. 31 або 32, який додатково включає отримання рослини з насіння перед стадією

Ї).

34. Частина рослини з рослини за будь-яким із пп. 1-9.

35. Частина рослини за п. 34, яка являє собою насіння, яке містить екзогенний полінуклеотид, який кодує поліпептид, що надає стійкості до Риссіліа дгатіпів. Зо

36. Спосіб отримання частини злакової рослини, причому спосіб включає: а) вирощування рослини за будь-яким із пп. 1-9, і р) збирання частини рослини.

37. Спосіб отримання борошна, причому спосіб включає: а) отримання насіння за п. 35, і Б) отримання борошна.

38. Спосіб отримання непросіяного борошна, причому спосіб включає: а) отримання насіння за п. 35, і р) отримання непросіяного борошна.

39. Спосіб отримання крохмалю, причому спосіб включає: а) отримання насіння за п. 35, і р) отримання крохмалю.

я хе -і тої 3 -

о . . | | я 45 8 11 12 18 й пон : З нн нак зх 12 ж с п: їі ПофМнннн он ВЕ Он . міф І ж 3 5 ВИ: їі ша: її, ЩО як й о. і: ою мм: ро- я ща с ск

Фіг. 1 й й «г х ба я м зх їе й Шо « в х зних пе г я з Б нн 5 т г ду ШИН с понти ШИ. ШИШКУ 8 : ВОЛІВ зание жишии нишже : ВОСОІНАВІ, Мотиви уки хв

Фіг. 2 гіпв СС домен МЕ домен 1КК домен ев же се оірролплпллплл поток РАЛАПАААТАТТ АААТАТАТ т Тр В поп п А АТ А АТР А АТР А АТ АТТАА АТ АТАТАААтА ян з беж т У зок 5 тк кт зе пп лвв ом Збвр хівово» » аг Зм я і ЗШ Ва: загар Му МІЗ МО;

Фіг. З

ЗНЕКБа ННЯ Ка ТІ і нка нкАДЮЄВОЯЯТЬ г НеміазАюстані Вк : | і нежанісимми нумівтрочавивав я Со напасти екв діло щи А с ндвлостеная ті : 1, наз т- часта Тв вит-Д(АСЕВМ В Не ати НУ аа З НА ВІАСТВ ВЕ ном 4 -- НАВ пасив ВХ)

ії. Нема АСК НМНІ М вЗУКРОЗІІОВ ведодя ЖЕ М-ВО дЛС о пен ННДИЕНІ А, інно АмААСИТНВ ЕопикаБомУуву Кт

Фіг. 4