CN108950044A - 华山新麦草分子特异性标记引物及其应用 - Google Patents

华山新麦草分子特异性标记引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种华山新麦草分子特异性标记引物及其应用，涉及分子生物学技术领域。本发明利用基因数据库信息，通过筛选、设计、合成以及PCR扩增验证，筛选得到34个SSR分子特异性标记引物对和102个EST分子特异性标记引物对，上述标记均可在华山新麦草中扩增出特异条带，在华山新麦草、小麦及部分同源种属材料间有显著差异，且为华山新麦草分子标记辅助育种工作提供理论支撑。

Description

华山新麦草分子特异性标记引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种华山新麦草分子特异性标记引物及其应用。
背景技术
华山新麦草(2n＝14，NsNs)是小麦近缘物种，携带多种与小麦农艺性状有关的优良基因和抗病基因。目前有关华山新麦草遗传物质转移至小麦遗传背景中的研究取得了很多关键研究成果，其中华山新麦草遗传物质的鉴别与筛选是重要一环。
随着分子技术的快速发展，大量SSR标记和EST标记被开发利用。但是在小麦远缘杂交过程中，丰富的种类和数量也给单一材料研究带来选择困难、差异性低的问题。针对这一现象，本发明利用现有的分子标记，筛选得到可以直接扩增出华山新麦草的特异片段的特异分子标记，使研究过程变得简单快速。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种华山新麦草分子特异性标记引物及其应用，主要目的是筛选出可鉴定华山新麦草的特异性引物。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种华山新麦草分子特异性标记引物，所述特异分子标记引物包括34个SSR引物对和102个EST引物对；
所述SSR引物对的名称分别为：Xwmc166(9g1F)、Xcfd0156、Xgwm314、Xgwm271、Xcfd190、Xcfd31、Xcwm532、Xcfd156、Xgdm0136、Xgpw5195、Xgpw7244、Xgwm518、Xwmc522(22h5F)、Xwmc533(26h1F)、Xwmc85-1B、Xwmc631、Xwmc702、Xwmc93(6h12F)、Xgwm264-1B、Xwmc471(25e1F)、Xgwm0249、Xgwm0265、Xwmc734、Xcfd35、Xwmc397、Xgpw4095、Xgpw5237、Xmag1932、Xmag1809、Xmag834、Xmag1441、Xmag3137、Xmag1682及Xmag3318；
所述EST引物对的名称分别为：BE426274、BF291740、BE406901、BE497107、CD490579、BG262410S、BM134486、BE425354、BE443071、BE443797、BE637935、BE490643、BE403153、BF293581、BF201704、BE403214、BE426257、BE352611、BE497177、BE403867、BF291549、BF473049、BG607666、BQ166400、CD453617、CD373543、CD373500、CD452643、CD491981、CD452846、BF484028、BF474569、BF429122、BE59069、BE490237、BE407068、BE499071、BG264080、BQ171235、BQ159493、BQ167013、CD452736、BQ159475、CD454353、CD454198、BF48528、BF484133、BE499843、BE404437、BE398399L、CD373513、BM135247、BE443103、BE406996、BE499327、BE406901、BE443796、BE497584、BE495292、BE404332、BQ160526、CD490485、CD373475、CD454575、BQ169491、BF291730、BM137713、CD452844、BE605103、BE637806、BE606250、BF429203、CD454173、BE446061、BE404973、CD373484、BE444811、BE591142、BE444644、BG604865、CD491981、BF482781、BF482530、BE591737、BE637663、BG274576、BE591127、BQ168298、BG606097、BE495150、BF291549、BE405518、BF485168、BE495786、BE405749、BE518255、BE443691、BE404963、BF202706、BE490599、BE606392及BE638039。
又一方面，本发明实施例提供了上述特异性引物在鉴定华山新麦草遗传物质中的应用。
再一方面，本发明实施例提供了上述特异性引物的使用方法，包括以下步骤：
(1)采用CTAB方法提取叶片全基因组DNA作为待鉴定样品；
(2)利用数据库信息，筛选和设计符合要求的EST、SSR引物；
(3)以所述待鉴定样品作为DNA模板进行PCR扩增，获得扩增产物；
(4)对所述扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得清晰条带。
作为优选，所述PCR扩增体系为10μl，具体如下：
作为优选，所述PCR的扩增程序：
94℃预变性3min；
94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；
72℃终延伸10min，12℃保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用基因数据库信息，通过筛选、设计、合成、以及PCR扩增验证，筛选出34个SSR分子特异性引物对和102个EST分子特异性引物对，上述标记均可在华山新麦草中扩增出特异的条带，本发明的提供的上述136个特异性引物对在华山新麦草、小麦、部分同源种属材料间有显著差异，且为华山新麦草分子标记辅助育种工作提供理论支撑。
附图说明
图1是本发明实施例2提供的利用BE443103扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；
(1:CS，2:7182，3:长穗偃麦草，4:中间偃麦草，5:拟鹅观草，6:华山新麦草，7:滨麦，8:黑麦；)
图2是本发明实施例2提供的利用BE591142扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；
图3是本发明实施例2提供的利用BE490643扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；
图4是本发明实施例2提供的利用CD452643扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；
图5是本发明实施例2提供的利用BE637806扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；
图6是本发明实施例2提供的利用BE605103扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；
图7是本发明实施例2提供的利用BE497584扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；
图8是本发明实施例2提供的利用BE497177扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；
图9是本发明实施例2提供的利用BF291549扩增的目的产物的凝胶电泳图谱。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1
利用序列数据库查找比对华山新麦草近缘物种和小麦低同源序列，遵循引物设计原则，利用Primer5.0设计EST引物和SSR引物，涉及到的特意标记总计136个，其中SSR标记34个，EST标记102个，上述特异性引物的筛选验证工作是由本发明独立完成，上述136对特异引物在染色体的位置和核苷酸序列如表1所示。
表1.华山新麦草136对特异性引物生物信息
注：1-34为SSR分子标记，35-136为EST分子标记；
本领域技术人员可根据上述引物对名称从PCR引物网站(http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml)或者URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)中获取上述136对引物的详细信息，如染色体位置和核苷酸序列。
实施例2
(1)DNA提取用CTAB方法提取华山新麦草幼嫩叶片(或7182、长穗偃麦草、中间偃麦草、拟鹅观草、滨麦、黑麦)全基因组DNA，分别获得7种待鉴定样品DNA；具体提取过程如下：
A将2颗灭菌的钢珠放入2ml灭菌的离心管中，剪取适量幼嫩叶片放入离心管中，随后液氮冷冻10min；
B取出离心管，放在高通量组织研磨仪上震荡2min，直至叶片呈粉末状；
C加入60℃预热的CTAB微量提取液1ml，混匀，再加入400ul三氯甲烷，颠倒、混匀，吸出钢珠，60℃水浴10min，取出离心管并冰浴10min；
D 12000rpm离心15min,吸取700μl上清液到1.5ml的离心管中，加入相同体积的异丙醇，缓慢颠倒数次，静置10min或者-20℃过夜处理效果更好；
E 12000rpm离心5min，倒掉上清液，加入200μl的70％乙醇冲洗，离心，倒去酒精，重复3次；
F放在超净工作台中，风干12h，加入500μl 1×TE(100mM Tris-Hcl，10mM EDTA，PH＝8.0)溶解；
(2)EST、SSR引物选取利用数据库信息，筛选、设计合成了136对分子特异性引物(引物对的序列如表1所示)，包括34对SSR引物(SEQ ID NO.1-68)和102对EST引物(SEQ IDNO.69-272)，上述特异性引物由北京奥科鼎盛公司合成；
(3)利用表1中的每一对特异引物分别对7种待鉴定物种分别进行PCR扩增，每一种特异引物经过扩增后获得7种目的产物；
上述PCR扩增过程具体如下：
在S1000型热循环仪(Bio-Rad美国)上进行PCR扩增反应，扩增体系为10μl：
扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，50-60℃(根据引物退火温度选择)退火45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃终延伸10min，12℃保存；
(4)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
A制胶、电泳：用无水乙醇将玻璃板擦干净、晾干，利用夹子固定玻璃板，将40ml聚丙烯酰胺胶母液(Acr:Bis＝37.5:1，w/w)、400μl 10％的过硫酸铵、40μl TEMED混匀，倒入玻璃板中，插入梳子，静置，凝固后拔下梳子，放入电泳槽中。在PCR扩增产物中加入2μl5×Loading dye buffer，混匀，依次向点样孔中加样5μl。在160V恒压下电泳2.5-3.0h；
B银染、显影：电泳结束将聚丙烯酰胺凝胶放入0.1％的硝酸银溶液中，摇床轻摇5min，放入蒸馏水中漂洗60s，之后放入显影液(1.5％氢氧化钠、0.4％甲醛)中，摇床震荡，直至显出清晰的条带，记录，拍照；每一组特异引物获得一张电泳图(每张电泳图上显示1个中国春作为对照和7个待鉴定物种，如普通下麦7182、长穗偃麦草、中间偃麦草、拟鹅观草、华山新麦草、滨麦、黑麦)，在获得的136张凝胶电泳图谱上，华山新麦草泳道均出现特异性亮带(不同bp片段)，该结果验证了本申请设计的136对特异引物可以用以鉴定华山新麦草。由于实验附图具有136张，数量太多，无法一一展示，仅挑选亮带最明显或特异性较高的电泳图作为本实施例2的实验过程图，具体如图1-图9所示，从图中可以看出，至少在华山新麦草泳道出现了较亮或DNA分子较多的亮带，其可充分证明本实施例2设计的136个引物对具有较高的特异性。
本发明利用基因数据库信息，从PCR引物网站(http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml)或者URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)筛选出可见用于鉴定华山新麦草的34个SSR分子特异性标记引物对和102个EST分子特异性标记引物对，上述标记均可在华山新麦草中扩增出特异的条带，本发明的提供的上述136个特异性引物对在华山新麦草、小麦、部分同源群和外缘材料间有显著差异。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.华山新麦草分子特异性标记引物，其特征在于，所述分子特异性标记引物包括34个SSR引物对和102个EST引物对；
所述SSR引物对的名称分别为：Xwmc166(9g1F)、Xcfd0156、Xgwm314、Xgwm271、Xcfd190、Xcfd31、Xcwm532、Xcfd156、Xgdm0136、Xgpw5195、Xgpw7244、Xgwm518、Xwmc522(22h5F)、Xwmc533(26h1F)、Xwmc85-1B、Xwmc631、Xwmc702、Xwmc93(6h12F)、Xgwm264-1B、Xwmc471(25e1F)、Xgwm0249、Xgwm0265、Xwmc734、Xcfd35、Xwmc397、Xgpw4095、Xgpw5237、Xmag1932、Xmag1809、Xmag834、Xmag1441、Xmag3137、Xmag1682及Xmag3318；
所述EST引物对的名称分别为：BE426274、BF291740、BE406901、BE497107、CD490579、BG262410S、BM134486、BE425354、BE443071、BE443797、BE637935、BE490643、BE403153、BF293581、BF201704、BE403214、BE426257、BE352611、BE497177、BE403867、BF291549、BF473049、BG607666、BQ166400、CD453617、CD373543、CD373500、CD452643、CD491981、CD452846、BF484028、BF474569、BF429122、BE59069、BE490237、BE407068、BE499071、BG264080、BQ171235、BQ159493、BQ167013、CD452736、BQ159475、CD454353、CD454198、BF48528、BF484133、BE499843、BE404437、BE398399L、CD373513、BM135247、BE443103、BE406996、BE499327、BE406901、BE443796、BE497584、BE495292、BE404332、BQ160526、CD490485、CD373475、CD454575、BQ169491、BF291730、BM137713、CD452844、BE605103、BE637806、BE606250、BF429203、CD454173、BE446061、BE404973、CD373484、BE444811、BE591142、BE444644、BG604865、CD491981、BF482781、BF482530、BE591737、BE637663、BG274576、BE591127、BQ168298、BG606097、BE495150、BF291549、BE405518、BF485168、BE495786、BE405749、BE518255、BE443691、BE404963、BF202706、BE490599、BE606392及BE638039。
2.权利要求1所述的华山新麦草分子特异性标记引物在鉴定华山新麦草中的应用。
3.权利要求1所述的华山新麦草分子特异性标记引物的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用CTAB方法提取叶片全基因组DNA作为待鉴定样品；
(2)利用小麦数据库信息，筛选和设计可扩增出华山新麦草的特异条带的EST、SSR引物；
(3)以所述待鉴定样品作为DNA模板进行PCR扩增，获得扩增产物；
(4)对所述扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得清晰条带。
4.如权利要求3所述的华山新麦草分子特异性标记引物的使用方法，其特征在于，
所述PCR扩增体系为10μl，具体如下：
5.如权利要求3所述的华山新麦草分子特异性标记引物的使用方法，其特征在于，所述PCR的扩增程序：
94℃预变性3min；
94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；
72℃终延伸10min，12℃保存。
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