JP6739741B2 - 分子生態学的手法を用いた植物共生糸状菌の多様性解析法 - Google Patents
分子生態学的手法を用いた植物共生糸状菌の多様性解析法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6739741B2 JP6739741B2 JP2016051621A JP2016051621A JP6739741B2 JP 6739741 B2 JP6739741 B2 JP 6739741B2 JP 2016051621 A JP2016051621 A JP 2016051621A JP 2016051621 A JP2016051621 A JP 2016051621A JP 6739741 B2 JP6739741 B2 JP 6739741B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lna
- primer
- seq
- plant
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 COP(C)(OC1C2(CO*)O[C@@](*)C1OC2)=O Chemical compound COP(C)(OC1C2(CO*)O[C@@](*)C1OC2)=O 0.000 description 2
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、植物共生糸状菌の多様性を解析する新技術を提供することを目的とする。
(1)植物試料由来のDNAと、植物共生糸状菌のITS領域を標的とする2つのプライマーから成るプライマーセットと、植物のDNAにアニーリングするLNAオリゴヌクレオチドを含有する反応液をPCRに供する工程を含む、植物共生糸状菌のITS領域を増幅する方法であって、
前記プライマーの少なくとも一方は、前記植物のDNAと比較して植物共生糸状菌のDNAに特異的な塩基にアニーリングする塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、
前記LNAオリゴヌクレオチドは、前記プライマーの少なくとも一方が前記植物のDNAにアニーリングする部位と競合する位置に設計され、その5'末端において該プライマーの3'末端と1塩基以上同一であり、該プライマーが前記植物共生糸状菌のDNAにアニーリングする位置から伸長反応側にスライドした位置において該植物共生糸状菌のDNAと比較して該植物のDNAに特異的な塩基にアニーリングする塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、且つ該LNAオリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されており、
該LNAオリゴヌクレオチドにより植物のITS領域の増幅が阻害され、且つ前記プライマーにより植物共生糸状菌のITS領域を選択的に増幅する、
前記方法。
(2)植物試料由来のDNAと、以下の(a)及び(b)のプライマーから成るプライマーセットと、以下の(c)〜(e)のうち少なくとも1つのLNAオリゴヌクレオチドを含有する反応液をPCRに供する工程を含み、該LNAオリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されており、且つ該LNAオリゴヌクレオチドにより植物のITS領域の増幅が阻害され、且つ前記プライマーにより植物共生糸状菌のITS領域を選択的に増幅する、植物共生糸状菌のITS領域を増幅する方法。
(a)CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号1)の塩基配列から成るLNAプライマー(ここで、第5、20及び22番目の塩基がLNAである)(ITS1F-LNAプライマー)
(b)TCCTCCGCTTATTGATATGC(配列番号2)の塩基配列から成るプライマー(ITS4プライマー)
(c)CTTAAACTCAGCGGGTAGTCCC(配列番号3)の塩基配列から成るLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第6、7及び22番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドa)
(d)CTTAAACTCAGCGGGTAGCCCC(配列番号4)の塩基配列から成るLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第6、7、19及び22番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドb)
(e)GCTTAAACTCAGCGGGTAATCCC(配列番号5)の塩基配列から成るLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第7、8、19及び23番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドc)
(3)前記PCR工程後に得られたPCR産物を、ネステッドPCRに供する工程をさらに含む、(1)又は(2)記載の方法。
(4)以下の(f)及び(g)のプライマーから成るプライマーセットをネステッドPCRに使用する、(3)記載の方法。
(f)CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号6)の塩基配列から成るプライマー(ITS1F-GCプライマー)
(g)GCTGCGTTCTTCATCGATGC(配列番号7)の塩基配列から成るプライマー(ITS2プライマー)
(5)前記ネステッドPCR工程後に得られたPCR産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(以下、「DGGE」と称する)に供する工程をさらに含む、(3)又は(4)記載の方法。
前記プライマーの少なくとも一方は、前記植物のDNAと比較して植物共生糸状菌のDNAに特異的な塩基にアニーリングする塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、
前記LNAオリゴヌクレオチドは、前記プライマーの少なくとも一方が前記植物のDNAにアニーリングする部位と競合する位置に設計され、その5'末端において該プライマーの3'末端と1塩基以上同一であり、該プライマーが前記植物共生糸状菌のDNAにアニーリングする位置から伸長反応側にスライドした(ずらした)位置において該植物共生糸状菌のDNAと比較して該植物のDNAに特異的な塩基にアニーリングする塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、且つ該LNAオリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、
前記キット。
(7)以下の(a)及び(b)のプライマーから成るプライマーセットと、以下の(c)〜(e)のうち少なくとも1つのLNAオリゴヌクレオチドを含む、植物共生糸状菌のITS領域増幅用キットであって、該LNAオリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、前記キット。
(a)CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号1)の塩基配列から成るLNAプライマー(ここで、第5、20及び22番目の塩基がLNAである)(ITS1F-LNAプライマー)
(b)TCCTCCGCTTATTGATATGC(配列番号2)の塩基配列から成るプライマー(ITS4プライマー)
(c)CTTAAACTCAGCGGGTAGTCCC(配列番号3)の塩基配列から成るLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第6、7及び22番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドa)
(d)CTTAAACTCAGCGGGTAGCCCC(配列番号4)の塩基配列から成るLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第6、7、19及び22番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドb)
(e)GCTTAAACTCAGCGGGTAATCCC(配列番号5)の塩基配列から成るLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第7、8、19及び23番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドc)
(8)2つのネステッドPCR用プライマーから成るプライマーセットをさらに含む、(6)又は(7)記載のキット。
(9)2つのネステッドPCR用プライマーが、以下の(f)及び(g)のプライマーである、(8)記載のキット。
(f)CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号6)の塩基配列から成るプライマー(ITS1F-GCプライマー)
(g)GCTGCGTTCTTCATCGATGC(配列番号7)の塩基配列から成るプライマー(ITS2プライマー)
(10)DGGE用試薬をさらに含む、(8)又は(9)記載のキット。
本発明に係る植物共生糸状菌のITS領域を増幅する方法(以下、「本方法」と称する)は、鋳型DNAとして植物試料由来のDNAと、植物共生糸状菌のITS領域を標的とする(植物共生糸状菌のITS領域に隣接するrRNA遺伝子にアニーリングする)2つのプライマーから成るプライマーセットと、当該プライマーセットの少なくとも一方のプライマーと競合する位置に設計した植物のDNAに対応するLNAオリゴヌクレオチドを含有する反応液を用いて、PCRを行う方法である。当該プライマーの少なくとも一方のプライマーは、LNAプライマーである。図1〜3に示すように、当該LNAオリゴヌクレオチドによれば、植物のITS領域の増幅が阻害され、当該プライマーにより植物共生糸状菌のITS領域を選択的に増幅することができる。
(a)CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号1)の塩基配列から成るか、又は当該塩基配列を含むLNAプライマー(ここで、第5、20及び22番目の塩基がLNAである)(ITS1F-LNAプライマー);
(b)TCCTCCGCTTATTGATATGC(配列番号2)の塩基配列から成るか、又は当該塩基配列を含むプライマー(ITS4プライマー)。
(c)CTTAAACTCAGCGGGTAGTCCC(配列番号3)の塩基配列から成るか、又は当該塩基配列を含むLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第6、7及び22番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドa);
(d)CTTAAACTCAGCGGGTAGCCCC(配列番号4)の塩基配列から成るか、又は当該塩基配列を含むLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第6、7、19及び22番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドb);
(e)GCTTAAACTCAGCGGGTAATCCC(配列番号5)の塩基配列から成るか、又は当該塩基配列を含むLNAオリゴヌクレオチド(ここで、第7、8、19及び23番目の塩基がLNAである)(ITS4-LNAオリゴヌクレオチドc)。
当該(c)〜(e)のLNAオリゴヌクレオチドの3'末端は、リン酸化又はジデオキシ化されている。
(f)CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号6)の塩基配列から成るか、又は当該塩基配列を含むプライマー(ITS1F-GCプライマー:第1〜40番目の塩基がGCクランプである);
(g)GCTGCGTTCTTCATCGATGC(配列番号7)の塩基配列から成るか、又は当該塩基配列を含むプライマー(ITS2プライマー)。
以下に、本実施例において使用する配列を示す。ITS4-LNAオリゴヌクレオチド(a, b, c)の3'末端は伸長反応が生じないようにリン酸化した(「p」との表記がリン酸化を示す)。
(1) ITS1F-LNAプライマー:5'-CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA-3'(配列番号1:第5、20及び22番目の塩基がLNAである);
ITS4プライマー:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(配列番号2)
(2) ITS4-LNAオリゴヌクレオチドa:5'-CTTAAACTCAGCGGGTAGTCCCp-3'(配列番号3:第6、7及び22番目の塩基がLNAである);
ITS4-LNAオリゴヌクレオチドb:5'-CTTAAACTCAGCGGGTAGCCCCp-3'(配列番号4:第6、7、19及び22番目の塩基がLNAである);
ITS4-LNAオリゴヌクレオチドc:5'-GCTTAAACTCAGCGGGTAATCCCp-3'(配列番号5:第7、8、19及び23番目の塩基がLNAである)
Claims (8)
- 植物試料由来のDNAと、以下の(a)及び(b)のプライマーから成るプライマーセットと、以下の(c)〜(e)のうち少なくとも1つのロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドを含有する反応液をPCRに供する工程を含み、該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されており、且つ該LNA含有オリゴヌクレオチドにより植物の内部転写スペーサー領域(ITS領域)の増幅が阻害され、且つ前記プライマーにより植物共生糸状菌のITS領域を選択的に増幅する、植物共生糸状菌のITS領域を増幅する方法。
(a)CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号1)の塩基配列から成るLNA含有プライマー(ここで、第5、20及び22番目の塩基がLNAである)
(b)TCCTCCGCTTATTGATATGC(配列番号2)の塩基配列から成るプライマー
(c)CTTAAACTCAGCGGGTAGTCCC(配列番号3)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、第6、7及び22番目の塩基がLNAである)
(d)CTTAAACTCAGCGGGTAGCCCC(配列番号4)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、第6、7、19及び22番目の塩基がLNAである)
(e)GCTTAAACTCAGCGGGTAATCCC(配列番号5)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、第7、8、19及び23番目の塩基がLNAである) - 前記PCR工程後に得られたPCR産物を、ネステッドPCRに供する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 以下の(f)及び(g)のプライマーから成るプライマーセットをネステッドPCRに使用する、請求項2記載の方法。
(f)CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号6)の塩基配列から成るプライマー
(g)GCTGCGTTCTTCATCGATGC(配列番号7)の塩基配列から成るプライマー - 前記ネステッドPCR工程後に得られたPCR産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)に供する工程をさらに含む、請求項2又は3記載の方法。
- 以下の(a)及び(b)のプライマーから成るプライマーセットと、以下の(c)〜(e)のうち少なくとも1つのLNA含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法による植物共生糸状菌のITS領域増幅用キットであって、該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、前記キット。
(a)CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号1)の塩基配列から成るLNA含有プライマー(ここで、第5、20及び22番目の塩基がLNAである)
(b)TCCTCCGCTTATTGATATGC(配列番号2)の塩基配列から成るプライマー
(c)CTTAAACTCAGCGGGTAGTCCC(配列番号3)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、第6、7及び22番目の塩基がLNAである)
(d)CTTAAACTCAGCGGGTAGCCCC(配列番号4)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、第6、7、19及び22番目の塩基がLNAである)
(e)GCTTAAACTCAGCGGGTAATCCC(配列番号5)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、第7、8、19及び23番目の塩基がLNAである) - 2つのネステッドPCR用プライマーから成るプライマーセットをさらに含む、請求項5記載のキット。
- 2つのネステッドPCR用プライマーが、以下の(f)及び(g)のプライマーである、請求項6記載のキット。
(f)CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTYGGTCATTTAGAGGAASTAA(配列番号6)の塩基配列から成るプライマー
(g)GCTGCGTTCTTCATCGATGC(配列番号7)の塩基配列から成るプライマー - DGGE用試薬をさらに含む、請求項6又は7記載のキット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016051621A JP6739741B2 (ja) | 2016-03-15 | 2016-03-15 | 分子生態学的手法を用いた植物共生糸状菌の多様性解析法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016051621A JP6739741B2 (ja) | 2016-03-15 | 2016-03-15 | 分子生態学的手法を用いた植物共生糸状菌の多様性解析法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017163891A JP2017163891A (ja) | 2017-09-21 |
JP6739741B2 true JP6739741B2 (ja) | 2020-08-12 |
Family
ID=59908516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016051621A Active JP6739741B2 (ja) | 2016-03-15 | 2016-03-15 | 分子生態学的手法を用いた植物共生糸状菌の多様性解析法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6739741B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109666762B (zh) * | 2019-03-01 | 2022-03-11 | 云南大学 | 干巴菌单拷贝基因的特异性扩增引物及其应用 |
CN111020051A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-04-17 | 云南大学 | 一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法 |
-
2016
- 2016-03-15 JP JP2016051621A patent/JP6739741B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2017163891A (ja) | 2017-09-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Högberg et al. | Fungal but not bacterial soil communities recover after termination of decadal nitrogen additions to boreal forest | |
WO2017215055A1 (zh) | 凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因est-ssr标记及其特异性引物和检测方法 | |
Douhan et al. | Contrasting root associated fungi of three common oak-woodland plant species based on molecular identification: host specificity or non-specific amplification? | |
CN106498088B (zh) | 基于SNP位点鉴定糙果苋的CAPs分子标记及其应用 | |
CN110144418A (zh) | 一种普通油茶ssr分子标记引物及标记方法和应用 | |
JP6739741B2 (ja) | 分子生態学的手法を用いた植物共生糸状菌の多様性解析法 | |
Park et al. | Chromosomal localization and sequence variation of 5S rRNA gene in five Capsicum species | |
CN109234423B (zh) | 大豆分子标记及其多态性在鉴定大豆分枝数性状中的应用 | |
Armaleo et al. | Sizing the fungal and algal genomes of the lichen Cladonia grayi through quantitative PCR | |
Wang et al. | Mining new microsatellite markers for Siberian apricot (Prunus sibirica L.) from SSR-enriched genomic library | |
CN106676176B (zh) | 一种利用多重pcr对四倍体紫花苜蓿进行ssr分析的方法 | |
Li et al. | Development of microsatellite markers from tartary buckwheat | |
Varghese et al. | Use of 5-anchored primers for the enhanced recovery of specific microsatellite markers in Brassica napus L. | |
CN107604094B (zh) | 基于转录组测序开发的花椰菜ssr引物 | |
KR20200054750A (ko) | 일천궁 및 토천궁의 바이러스 동시 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 일천궁 및 토천궁 바이러스의 진단방법 및 키트 | |
CN108588091A (zh) | 一种黄秋葵内参基因及其应用 | |
CN108728569A (zh) | 一种黄秋葵内参基因及其应用 | |
CN110878372B (zh) | 银缕梅微卫星标记组合及其引物和应用 | |
CN108103229B (zh) | 克柔念珠菌str分子标记及其应用 | |
Tungalag et al. | Varietal identification study of six wheat varieties using ISSR markers | |
KR101137799B1 (ko) | 느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도 | |
CN110656196A (zh) | 能够准确测定浙闽樱its的碱基序列的引物组、合成与快速分子鉴定 | |
CN107828781A (zh) | 一种简单快速的水稻dna提取方法 | |
CN112695129B (zh) | 一种真姬菇沪真12号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
CN109456980B (zh) | 白及高温内参基因Bs18S rRNA和BsUBI |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190218 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20191121 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200206 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200623 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200703 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6739741 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |