CN111020051A - 一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法 - Google Patents

一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法 Download PDF

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CN111020051A CN201911210929.6A CN201911210929A CN111020051A CN 111020051 A CN111020051 A CN 111020051A CN 201911210929 A CN201911210929 A CN 201911210929A CN 111020051 A CN111020051 A CN 111020051A
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沙涛
杨小雨
张亚平
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明公开一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，在干巴菌生长地，用5点法，取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，每2cm为一个土壤深度，共7个不同深度的土壤样品装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在‑80℃；将土壤进行DNA提取，所得的液体为土壤真菌DNA混合液体，将提取到的土壤真菌DNA混合液放到‑20℃备用；采用引物Tg进行qPCR试验，将检测到的Ct值代入标准曲线方程式计算得到土壤中菌丝体含量；本发明可以实现快速检测土壤中干巴菌菌丝体含量的目的，方法简单，高效。

Description

一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法
技术领域
本发明涉及菌丝体含量的测定方法，特别是涉及一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法。
背景技术
菌丝体含量的测定对于探究真菌生长机理及代谢活动起到非常重要的作用，菌丝体含量可以作为衡量真菌生长状况的参数。测定土壤真菌的菌丝体含量的方法一般为间接测定法，间接测量法即通过测定真菌菌丝体中某些特殊物质的含量(如几丁质等)来推算出菌丝体的含量。主要的方法有：几丁质法、麦角固醇法、蛋白质法和核酸法。不同的测定方法均存在一定的局限性，实际测定时需根据实际需求选择较为适合的测量方法。
核酸是非常稳定的一种菌丝体测定方法，几乎不受众多外界因素的影响，与生物量存在很好的线性关系。固态发酵所用底物有时不可避免地含有少量DNA，底物中含有的核酸在发酵过程中不会发生变化，实际测定中可从测得的结果中减去底物所含核酸，因此并不影响测定结果。在核酸含量测定的方法中，实时定量PCR(qPCR)技术可快速准确的测定核酸含量。
对于大型外生菌根真菌生长的土壤中含有复杂的微生物群落，其他真菌对目标菌丝体含量的测定产生一定的干扰。而通过生物量的测定有助于确定子实体形成前后变化，分析菌塘及其共生植物根际的生长状况和松茸子实体形成的时间，能更加有效的对野生菌资源以及共生植物进行管理，实现可持续采摘。
目前，越来越多的真菌基因组测序已完成，利用生物信息学手段可快速筛选多个物种间的单拷贝直系同源基因(single-copy orthologous genes)用于探讨物种演化关系。再结合实验验证筛选结果的可靠性，可以获得的单拷贝基因作为实时定量PCR测定菌丝体含量的候选分子标记。但是，单考贝基因的挑选，需要具有较强的生物信息背景知识的专业人员才可获得。而ITS(多拷贝)序列是真菌的DNA条形码，在NCBI库中很容易获得，涵盖物种也比较全面。因此应用多拷贝基因的qPCR方法，也可快速计算出菌丝体的含量，对于探究干巴菌生长机理及代谢活动起到非常重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，该方法所用的基因为干巴菌多拷贝基因ITS，由于多拷贝基因ITS的拷贝数众多且未知，故测定的结果是相对值，能对不同地点不同深度的干巴菌菌丝体含量的高低进行快速比较，与单拷贝基因获得准确结果相比，利用多拷贝基因进行测定与比较更加高效和快速。具体步骤如下：
(1)在干巴菌生长地，用5点法，取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，每2cm为一个土壤深度，共7个不同深度的土壤样品装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃；
(2)将步骤(1)的土壤进行DNA提取，所得的液体为土壤真菌DNA混合液体，将提取到的土壤真菌DNA混合液体放到-20℃备用；
(3)步骤(2)提取的DNA采用引物Tg进行qPCR试验，将检测到的Ct值代入标准曲线方程式y＝-4.639x+11.396，其中y是qPCR试验检测到的Ct值，x是菌丝体含量。
步骤(2)DNA提取使用的是凯杰公司的
Figure BDA0002298070160000021
DNA Isolation Kit。
步骤(3)qPCR试验反应程序为：95℃预变性2min；然后95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共40次循环后终止反应。
步骤(3)标准曲线方程式y＝-4.639x+11.396的求取方法：
(1)提取干巴菌的DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，用引物Tg进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)将所述步骤(2)中扩增产物切胶回收、连接腺嘌呤、连接载体，然后进行菌液PCR实验，并提取质粒，将所提取的3份质粒，分别稀释到50ng/μL，然后再依次稀释十倍，共稀释7个浓度梯度，分别为：5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL、0.000005ng/μL，进行qPCR实验确定合适的浓度梯度，最适的浓度梯度为：0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL；再用最适浓度的质粒进行qPCR实验，重复两遍，最终确定标准曲线方程式为：y＝-4.639x+11.396(R2＝0.997)，其中y是qPCR试验检测到的Ct值，x是菌丝体含量。
所述引物Tg的核苷酸序列为Tg1：5’-ACCTGTGCACCCTCTGTAGTTCC-3’，如SEQ IDNO：1所示；Tg2：5’-GTCCAAGCTCATCATGGCA-3’，如SEQ ID NO：2所示，该引物为干巴菌多拷贝基因ITS的特异性引物。
本发明的有益效果：本发明可以实现快速检测土壤中干巴菌菌丝体含量的目的，方法简单，高效。
附图说明
图1干巴菌ITS特异性引物Tg溶解曲线图；
图2干巴菌ITS特异性引物Tg标准曲线；
图3不同深度土壤干巴菌菌丝体含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
标准曲线的确定，具体步骤如下：
1.材料
干巴菌土样品在云南省武定县、易门县和禄丰县采集到的(见表1)，采集方法：在每个干巴菌生长地，用5点法，取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，每2cm为一个土壤深度，共7个不同深度的土壤样品装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃(土壤样品为含有干巴菌的真菌混合样品)；
表1干巴菌土壤样品采集信息
Figure BDA0002298070160000031
2.方法
2.1DNA提取：
使用凯杰公司的
Figure BDA0002298070160000032
DNA Isolation Kit进行DNA提取，每个深度取300mg干巴菌土壤样品，将提取到的土壤真菌DNA混合液体放到-20℃备用；
2.2引物合成：
将干巴菌特异性引物Tg委托昆明硕擎生物科技有限公司合成，得到PCR扩增引物；引物Tg的核苷酸序列为Tg1：5’-ACCTGTGCACCCTCTGTAGTTCC-3’(SEQ ID NO：1)，Tg2：5’-GTCCAAGCTCATCATGGCA-3’(SEQ ID NO：2)，该引物为干巴菌多拷贝基因ITS的特异性引物；
2.3PCR反应：
PCR反应体系为：金牌MIX液22.5μL、上游引物Tg1 1μL、下游引物Tg2 1μL和上文中提取的含有干巴菌的土壤真菌DNA混合液体3μL，用无菌水代替DNA为模板作为阴性对照，PCR反应程序为98℃预变性2min；然后98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min后终止反应，具体反应程序如下：
Figure BDA0002298070160000041
收集PCR反应的产物，置于4℃保存备用；
2.4切胶回收：
取25μL上文中PCR反应的扩增产物和5μL 10*loading buffer混匀，2％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物回收时做割胶回收，具体回收步骤按照从云南晨绿生物科技有限公司购买的天根DNA纯化回收试剂盒操作，把回收的DNA放到-20℃保存备用；
2.5连接腺嘌呤：
由于PCR试剂金牌MIX扩增的基因片段两端没有连接腺嘌呤，上文2.4切胶回收的DNA片段两端需要加入腺嘌呤，反应体系为：回收产物10μL，dNTP 1μL，10*LaTaq PCRBuffer 2μL，La Taq 1μL，混匀，反应条件为：72℃反应30min，-20℃保存备用；
2.6连接载体：
把加入腺嘌呤之后的DNA片段与硕擎生物有限公司的007S载体连接，反应体系为：加入腺嘌呤之后的回收产物4μL，PClone 007S Vector 1μL，10*ToPo mix 1μL，ddH2O 4μL，反应条件为：室温反应5min，产物导入到TaKaRa E.coli JM109感受态细胞中，具体步骤如下：
1.准备工作：(1)准备LB液体和固体培养基，配置800mL的LB液体培养基和100mL的LB固体培养基，120℃灭菌10min，固体培养基温度降到50℃左右后，按质量分数千分之一的比例加入氨苄青霉素混匀，倒平板备用；(2)把水浴锅调至42℃；(3)准备复苏培养基；
(4)打开摇床，调节温度至37℃；
2.取感受态细胞(Takara)放置于冰上溶解；把感受态细胞直接加入到连接产物中，用枪慢慢吸打混匀，然后放置于冰上30min；把加入了感受态细胞的连接产物放到42℃水浴锅中90s，立即放置冰上5min左右；然后再全部转移至加入1mL的LB复苏培养基(不加入氨苄青霉素)的1.5mL的EP管中，放置于摇床上，180转/min 37℃培养1h；
3.涂板：每管取160μL加到准备好的平板上，用涂布器涂匀，放置到37℃恒温培养箱中30min之后，把培养平板翻转，培养11-12h；
2.7菌液PCR：
用200μL移液枪挑取单克隆，放入到加入1mL的LB扩大培养基(加入氨苄青霉素)的1.5mL的EP管中，每个平板挑取30个单克隆，固定在摇床上180转/min、37℃培养3-4h，然后用培养的菌液做PCR扩增，所用引物是007S载体通用引物M13F，M13R，M13F的的核苷酸序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO：3)，M13R的的核苷酸序列为5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(SEQ ID NO：4)，PCR反应扩增体系为：金牌MIX 22.5μL，M13F 1μL，M13R 1μL，DNA 1μL，扩增条件为：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min，取1μL的PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，GeneFinderTM染色，紫外透射仪检测，检测结果有条带的，把PCR反应产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序，剩余菌液加入200μL的甘油溶液，固定在摇床上180转/min37℃培养1h，然后放置于-20℃的冰箱中保存；
测序结果在ncbi数据库进行序列比对，30个插入载体中克隆的序列测序结果通过ncbi blsate均为目的片段；
2.8质粒提取：
随机挑取3个之前保藏的菌液，转移到装有9mL的LB培养基的试管中，固定在摇床上180转/min、37℃培养12h，提取质粒，质粒提取具体步骤按照从云南晨绿生物科技有限公司购买的高纯度质粒提取试剂盒操作，提取到的质粒DNA用NanoDrop 2000定量仪测定浓度并记录，将提取的3份质粒放入-20℃冰箱里保存备用；
2.9标准曲线的筛选：
将所提取的3份质粒，分别稀释到50ng/μL，然后依次稀释十倍，共稀释7个浓度梯度，分别为：5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL、0.000005ng/μL，进行qPCR实验确定合适的浓度梯度，最适的浓度梯度为：0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL；
qPCR体系为：SYBR TaqⅡ：10μL、上游引物Tg1：0.5μL、下游引物Tg2：0.5μL、ROXⅡ：0.4μL、ddH2O：7.6μL和最适的浓度梯度之一的质粒1μL，用ddH2O代替DNA为模板作为阴性对照；
qPCR反应程序为：
Figure BDA0002298070160000051
Figure BDA0002298070160000061
qPCR溶解曲线见图1，其溶解曲线均为特异性的单峰，说明qPCR反应为特异性扩增，引物的特异性也通过测序进一步确认，引物Tg扩增的干巴菌基因片段与NCBI下载的Tg扩增片段完全相同，所以这对引物的PCR产物是特异且准确的。
以最适浓度梯度的每种浓度进行以上实验并重复两遍，最终确定标准曲线方程式为：y＝-4.639x+11.396(R2＝0.997)(见图2)，其中y是qPCR试验检测到的Ct值，x是菌丝体含量。
实施例2
测定土壤干巴菌菌丝体含量：
1.材料
干巴菌土样品在云南省武定县、易门县和禄丰县采集到的(见表2)，采集方法：在每个干巴菌生长地，用5点法，取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，每2cm为一个土壤深度，共7个不同深度的土壤样品装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃(土壤样品为含有干巴菌的真菌混合样品)；
表2干巴菌土壤样品采集信息
Figure BDA0002298070160000062
2.方法
2.1DNA提取：
使用凯杰公司的
Figure BDA0002298070160000063
DNA Isolation Kit进行DNA提取，每个深度取300mg干巴菌土壤样品，将提取到的土壤真菌DNA混合液体放到-20℃备用；
2.2引物合成：
将干巴菌特异性引物Tg委托昆明硕擎生物科技有限公司合成，得到PCR扩增引物；引物Tg的核苷酸序列为Tg1：5’-ACCTGTGCACCCTCTGTAGTTCC-3’(SEQ ID NO：1)，Tg2：5’-GTCCAAGCTCATCATGGCA-3’(SEQ ID NO：2)，该引物为干巴菌多拷贝基因ITS的特异性引物；
2.3qPCR反应：
qPCR体系为：SYBR TaqⅡ：10μL、上游引物Tg1：0.5μL、下游引物Tg2：0.5μL、ROXⅡ：0.4μL、ddH2O：7.6μL和上文2.1中提取的含有干巴菌的土壤真菌DNA混合液体1μL，用ddH2O代替DNA为模板作为阴性对照，qPCR反应程序为：
Figure BDA0002298070160000071
qPCR试验检测到的Ct值带入最终确定的标准曲线方程式：y＝-4.639x+11.396(R2＝0.997)，得到的x值即为土壤中菌丝体含量，实验再重复操作两遍，求平均值。
按照上面的方法测定表1中WD1、WD2、WD3、WD4、YM1、YM2、LF1、LF2共8份土壤样品，分别测定7个不同深度(0-2cm，2-4cm，4-6cm，6-8cm，8-10cm，10-12cm，12-14cm)300mg土壤干巴菌菌丝体含量，得到的Ct值分别代入标准曲线方程式中，计算出菌丝体含量，实验再重复操作两遍，求平均值，运用Excel整理数据，制作图表，用IBM SPSS Statistics 22.0软件对上述测定的菌丝体含量，进行单因素方差分析，测定结果用GraphPad prism7.0做图，测定结果见图3，8个不同地点的干巴菌土壤样品菌丝体含量均存在一定的差异性，本发明方法可以用来研究干巴菌菌丝体的分布情况。
Figure BDA0002298070160000081
序列表
<110> 云南大学
<120> 一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acctgtgcac cctctgtagt tcc 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtccaagctc atcatggca 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggaaacag ctatgacc 18

Claims (5)

1.一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)在干巴菌生长地，用5点法，取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，每2cm为一个土壤深度，共7个不同深度的土壤样品装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃；
(2)将步骤(1)的土壤进行DNA提取，所得的液体为土壤真菌DNA混合液体，将提取到的土壤真菌DNA混合液体放到-20℃备用；
(3)步骤(2)提取的DNA采用引物Tg进行qPCR试验，将检测到的Ct值代入标准曲线方程式y＝-4.639x+11.396，其中y是qPCR试验检测到的Ct值，x是菌丝体含量。
2.根据权利要求1所述干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，步骤(2)DNA提取使用的是凯杰公司的
Figure FDA0002298070150000011
DNA Isolation Kit。
3.根据权利要求1所述干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)qPCR试验反应程序为：95℃预变性2min；然后95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共40次循环后终止反应。
4.根据权利要求1所述干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)标准曲线方程式y＝-4.639x+11.396的求取方法：
(1)提取干巴菌的DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，用引物Tg进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)步骤(2)中扩增产物经切胶回收、连接腺嘌呤、连接载体，然后进行菌液PCR实验，并提取质粒，将所提取的3份质粒，分别稀释到50ng/μL，然后再依次稀释十倍，共稀释7个浓度梯度，分别为：5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL、0.000005ng/μL，进行qPCR实验确定最适的浓度梯度为：0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL；再用最适的浓度进行qPCR实验，重复两遍，最终确定标准曲线方程式为：y＝-4.639x+11.396，其中y是qPCR试验检测到的Ct值，x是菌丝体含量。
5.根据权利要求1或4所述干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，引物Tg的核苷酸序列为Tg1：5’-ACCTGTGCACCCTCTGTAGTTCC-3’，如SEQ ID NO：1所示；Tg2：5’-GTCCAAGCTCATCATGGCA-3’，如SEQ ID NO：2所示，该引物为干巴菌多拷贝基因ITS的特异性引物。
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