CN113215302A - 一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记及方法，所述InDel分子标记的碱基序列选自：SEQ ID NO.1；鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的方法包括以下步骤：S1、获取香菇的DNA；S2、PCR扩增香菇的DNA；S3、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；S4、根据电泳条带的数量和长度判断香菇的交配型；本发明提供的InDel位点和引物为香菇B交配型鉴定提供了一种新方法。

Description

一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子 标记及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记、引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术

香菇作为最重要的栽培食用菌，对其交配型多态性的研究一直受到遗传育种学者的高度重视。香菇属于四级性异宗结合食用菌，A位点上的交配型基因控制锁状细胞的形成、双核的配对、双核的同步分裂、锁状细胞与顶端细胞间隔膜的形成。B位点上的交配型基因控制核的迁移、细胞隔膜的融解、锁状细胞与次顶端细胞的融合。现有报道，中国香菇自然群体中据测算存在121种A特异型和151种B特异型，可以产生18000多种交配型。

交配型和交配型相关基因的研究是揭示真菌有性生殖机制的关键。交配型基因位点的解析有利于了解异宗配合真菌的性亲和系统作用机制，也是食用菌遗传育种、菌种改良的基础。早期研究认为不同的MAT基因来源于染色体上同一DNA保守区，这些区域发生定向或非定向突变，导致不同交配方式的产生，因此同宗配合和异宗配合为共同起源。近年来，在基因组测序的基础上，担子菌中对香菇、草菇、灵芝、金针菇等交配型位点的研究不断取得进展，交配型位点被发现和鉴定以来，科学家进行了大量的研究，明确了其中一些基础性的问题，如MAT基因与交配型控制、MAT基因的信号通路及上下游基因等。因此，进一步围绕交配型基因开展有性生殖机制的深入研究，在不同的真菌中分析交配型基因的结构、功能和亲缘关系，对担子菌生长发育和遗传进化的研究仍具有重要的意义。

此外，交配型基因能够控制食用菌杂交和有性繁殖过程，全面和深入了解交配型系统的分子遗传学结构并开发有效鉴定交配型的分子标记，将有助于我们解决食用菌产业发展中的育种相关科学问题。香菇目前最常用的新品种选育手段是杂交育种，而单核体是香菇杂交育种和进行遗传学研究的重要中间材料。单核体的鉴定通常采用显微镜检确认是否存在锁状联合来判断，而鉴定单核体的交配型则需要进行大量的配对和显微镜检工作，且工作量随着单核群体数量的增加而增加，多轮交配通常需耗时2个月左右，并且容易发生人为因素误检。

综上所述，目前还缺少一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B快速、准确、高效鉴定的技术手段。

发明内容

本发明提供一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B快速、准确、高效鉴定的InDel分子标记、引物组合物、试剂盒及方法。

为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记，所述InDel分子标记的碱基序列选自：SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：GCCACTGATA。

优选的，所述香菇包括申香10号、申香12号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、939、3161、0285、0338、3242、4705。

本发明的第二个方面，提供了一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的引物组合物，所述引物组合物包括：

扩增SEQ ID NO.1的引物：

SEQ ID NO.2：5’-GCCTTGATGTGGAATTGAGG-3’

SEQ ID NO.3：5’-ACCGGTGTTGGGTATTGAAA-3’。

优选的，所述香菇包括申香10号、申香12号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、939、3161、0285、0338、3242、4705。

本发明的第三个方面，提供了一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的试剂盒，所述试剂盒包括鉴定SEQ ID NO.1碱基序列的碱基、蛋白或化合物。

优选的，所述试剂盒包括：

扩增SEQ ID NO.1的引物：

SEQ ID NO.2：5’-GCCTTGATGTGGAATTGAGG-3’

SEQ ID NO.3：5’-ACCGGTGTTGGGTATTGAAA-3’。

优选的，所述香菇包括申香10号、申香12号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、939、3161、0285、0338、3242、4705。

本发明的第四个方面，提供了一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的方法，包括以下步骤：

S1、获取香菇的DNA；

S2、PCR扩增香菇的DNA；

S3、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；

S4、根据电泳条带的数量和长度判断香菇的交配型。

优选的，步骤S4的判断方法为：当扩增出大小分别为211bp和201bp的2个条带，鉴定香菇为B交配型。

优选的，步骤S3中PCR扩增的引物的碱基序列选自：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。

优选的，所述香菇包括申香10号、申香12号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、939、3161、0285、0338、3242、4705。

优选的，步骤S2的PCR扩增的条件为：94℃预热5min；94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。

优选的，步骤S1中获取香菇的DNA的方法包括：用接种针挑取少量香菇菌丝置于离心管中(装有100uL 1×TE buffer的0.2mL)，放置于PCR仪上97℃保持5min，随后立即置于冰上冷却并用枪反复吸打20次，可快速获得基因组DNA，为了确保DNA的最佳使用状态和试验结果的准确性，DNA即制即用。

本发明在对香菇菌株重测序的基础上，针对交配因子序列中的InDel位点设计了特异引物对，根据InDel分子标记扩增结果确定香菇菌株孢子单核体的交配型，以提高鉴定效率和准确率，并为食用菌遗传育种工作提供参考。本发明所提供的分子标记、方法以及实验路线和获得的研究经验可以为克隆其它食用真菌的交配型位点提供指导，利用担子菌全基因组序列信息，为拓展食用菌分子遗传学研究领域提供有益的借鉴。

与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：本发明获得了可以用于鉴别香菇交配型B的类型的分子标记、引物组合物、试剂盒及方法。本发明提供的InDel位点和引物为香菇交配型B鉴定提供了一种新方法。

附图说明

为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。

显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。

图1为本发明实施例的L135菌株B交配型位点InDel位点位置；

图2为本发明实施例的40株双核香菇菌株交配型B鉴定结果图；

图3为本发明实施例的香菇L135菌株单核体交配型B鉴定结果图；

图4为本发明实施例的香菇931菌株单核体交配型B鉴定结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例中所提供的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要理解的是：

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接或活动连接，亦可是成为一体；可以是直接连接，也可以是通过中间媒介的间接连接或是无形的信号连接，甚至是光连接，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。

对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。

下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1筛选InDel分子标记

如图1所示，将L135双核体菌株进行重测序的数据比对到香菇L54(NCBI：JN129271.1)交配型因子区域。在β-fg的位置获得一个InDel位点，大小10bp(SEQ IDNO.1)。

进一步比对结果发现，在香菇中，这个InDel位点区域高度保守，提示这个位点可能为交配型基因分型提供选择。

实施例2设计InDel分子标记的引物

如图1所示，从A因子HD1保守区外侧，β-fg基因区域筛选得到一个10bp的缺失位点(SEQ ID NO.1)设计一对InDel引物。引物列表见表1，两个菌株中B交配型扩增片段大小为211bp。B因子InDel分型引物序列见表1。

表1

初步分析采用上述引物可以鉴别香菇B交配型类型，其原理为：当扩增的香菇序列为1条带(211bp的完整带)时，该引物不适用于该菌株B交配型位点鉴定；当扩增的香菇序列为2条带(一条211bp的完整带和一条因为缺失10bpInDel分子标记的201bp的缺失带)时，表明该引物可以鉴别该菌株的B交配型。

实施例3

实验材料：实验用双核香菇(来源于国家食用菌工程技术研究中心)：申香8号、申香10号、申香12号、Cr04、武香1号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、香菇Cr02、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、L135、Jang808、L808、苏香、939、3161、0285、0338、3242、4705、241-4、闽丰1号、沪香F2、华香5号、浙香6号。

按照如下方法进行鉴定：

步骤3.1、将上述的双核香菇菌株接种于直径为9cm的PDA平板上25℃恒温、避光培养；

步骤3.2、待菌落长至直径1cm左右时，用接种针挑取少量菌丝置于离心管中(装有0.2mL 100uL 1×TE buffer)，放置于PCR仪上97℃保持5min，随后立即置于冰上冷却并用枪反复吸打20次，可快速获得基因组DNA，为了确保DNA的最佳使用状态和试验结果的准确性，DNA即制即用；

步骤3.3、使用高效率的PCR预混酶(TAKARA PremixTaq)，包括2×PCRPremix10uL，10umoL/L正反向引物各1uL，模板DNA 2uL，加ddH₂O补至20uL。PCR反应条件：94℃预热5min；94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存；

步骤3.4、PCR产物经2％的琼脂糖凝胶进行电泳(凝胶中先加人1/100000的DNA染料)，电压U＝110V，电泳时间4h，完成后用凝胶成像仪观察并拍照。

结果如图2所示，图中泳道1-40分别代表香菇菌株申香8号、申香10号、申香12号、Cr04、武香1号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、香菇Cr02、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、L135、Jang808、L808、苏香、939、3161、0285、0338、3242、4705、241-4、闽丰1号、沪香F2、华香5号、浙香6号。从图中可以看出，2、3、6-19、21-25和30-35泳道的申香10号、申香12号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、939、3161、0285、0338、3242、4705扩增出了211bp和201bp的2个条带，而1、4、5、20、26-29、36-40泳道的申香8号、Cr04、武香1号、香菇Cr02、L135、Jang808、L808、苏香、241-4、闽丰1号、沪香F2、华香5号、浙香6号仅扩增出一条泳道。可见，本发明提供的分子标记、引物组合物可以用于申香10号、申香12号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、939、3161、0285、0338、3242、4705的B交配型。

实施例4香菇L135和931菌株孢子单核体检测

4.1、获取香菇L135和931菌株的孢子单核体：将香菇L135和931菌株的新鲜子实体菌褶向下放置于灭菌平板中，24h后收集孢子印，将平板封存后于4℃保存。从封存的平板中挑取孢子于无菌水中，用移液枪吸打混匀，稀释后用血球计数板镜检计数，稀释至浓度为10⁴个/mL左右，吸取100uL孢子稀释液涂布于PDA平板上，25℃恒温、避光培养4d后观察孢子萌发生长情况。待孢子萌发后，在超净工作台内体式镜下镜检，挑取单菌落转接到新的PDA平板上。继续25℃恒温、避光培养至菌丝直径为1cm左右，挑取少量菌丝在20倍镜下进行镜检，没有锁状联合的即为孢子单核体菌丝，每个亲本各收集500个以上单孢子，编号保存备用。

4.2、按照实施例3的方法进行鉴定。

结果如图3和图4所示，可见，香菇L135和931菌株的孢子单核体均为一条带，这进一步证实了本发明提供的分子标记、引物组合在检测香菇L135和931菌株孢子单核体时的检测结果与实施例3检测香菇L135和931菌株双核体的不同。再次验证了，本发明提供的分子标记、引物组合可以用于鉴别香菇交配型B。

在上述说明书的描述过程中：

术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。

最后应说明的是：

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；

尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记及方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccactgata 10

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccttgatgt ggaattgagg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accggtgttg ggtattgaaa 20

Claims (10)

1.一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记的碱基序列选自：SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记，其特征在于，所述香菇包括申香10号、申香12号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、939、3161、0285、0338、3242、4705。

3.一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：

扩增SEQ ID NO.1的引物：

SEQ ID NO.2：5’-GCCTTGATGTGGAATTGAGG-3’

SEQ ID NO.3：5’-ACCGGTGTTGGGTATTGAAA-3’。

4.一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括鉴定SEQ IDNO.1碱基序列的碱基、蛋白或化合物。

5.如权利要求4所述的一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

扩增SEQ ID NO.1的引物：

SEQ ID NO.2：5’-GCCTTGATGTGGAATTGAGG-3’

SEQ ID NO.3：5’-ACCGGTGTTGGGTATTGAAA-3’。

6.一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、获取香菇的DNA；

S2、PCR扩增香菇的DNA；

S3、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；

S4、根据电泳条带的数量和长度判断香菇的交配型。

7.如权利要求6所述的一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的方法，其特征在于，步骤S4的判断方法为，当扩增出大小分别为211bp和201bp的2个条带，鉴定香菇为B交配型。

8.如权利要求6所述的一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的方法，其特征在于，步骤S3中PCR扩增的引物的碱基序列选自：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。

9.如权利要求6所述的一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的方法，其特征在于，所述香菇包括申香10号、申香12号、香杂26、菌兴8号、931、L26、平泉18、庆元9015、金地香菇、7402、广香、庆科20、申香16、9319、9608、森源10号、华香8号、王Japan、赣香1号、Cr62、寿香1号、939、3161、0285、0338、3242、4705。

10.如权利要求6所述的一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的方法，其特征在于，步骤S2的PCR扩增的条件为：94℃预热5min；94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。

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