CN115725606A - 一种花脸香蘑单核体交配型基因及其引物组合组和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花脸香蘑单核体交配型基因及其引物组合组和应用。本发明基于花脸香蘑全基因组测序序列为模板，筛选获得了两个花脸香蘑单核体交配型基因Mating A和Mating B，以及两对特异性强、稳定性好的交配型标记引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.3‑SEQ ID No.6所示。本发明的花脸香蘑单核体交配型引物组合物能够用来鉴定花脸香蘑4种单核体的交配型，准确度高，重复性好。将不同交配型的单核菌株进行亲和配对，可以进行定向杂交育种，对于提高育种效率具有重要指导意义。
Description
技术领域
本发明属于食用菌DNA分子标记技术领域，具体涉及一种花脸香蘑单核体交配型基因及其引物组合组和应用。
背景技术
花脸香蘑（Lepista sordida）属于口蘑科、香蘑属，是一种珍稀的药食两用食用菌，不仅有较高的营养价值，还有很高的药用价值。市场上花脸香蘑以野生菌应季销售为主，产量低且日渐稀少，其由于抗杂菌能力较差、对出菇条件要求高、生物学转化率较低、产量不稳定等因素，目前仍未实现大面积人工栽培。
大多数担子菌具有复杂的交配型系统，通常涉及到两类交配型基因，即编码同源域转录因子的A交配型基因以及编码脂肽信息素和信息素受体的B交配型基因。具四极性交配型系统的担子菌通常需要一对可亲和的单核菌丝体才能够形成稳定的双核菌丝体。A位点上的交配型基因一般控制锁状细胞的形成、双核的配对、双核的同步分裂、锁状细胞与顶端细胞间隔膜的形成。B 位点上的交配型基因多控制核的迁移、细胞隔膜的融解、锁状细胞与次顶端细胞的融合。交配位点对于双核菌丝生长发育和交配亲和性起到了至关重要的作用。在 A 位点和 B 位点中交配型基因的共同作用下，可亲和的单核菌丝间可以形成稳定的双核体菌丝，并可以在适宜的环境条件下形成子实体，进而有利于担子菌的人工栽培。
传统的单核菌株鉴定方法主要是通过是否具有锁状联合进行鉴定，需要在显微镜下进行长时间和多视野观察，工作量极其繁重，且容易产生疏漏。而以基因组DNA为基础的分子标记技术具有不受外界环境的影响，检测过程简单快速、检测结果稳定高效和特异性强等优点。通过对花脸香蘑单核体交配型基因序列的克隆与分析，能够迅速鉴定单核基因交配型菌株，将为分子标记辅助育种、杂合子初筛和遗传多样性研究提供重要支持。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种花脸香蘑单核体交配型基因及其引物组合组和应用。所述引物组合物包括2对扩增条带清晰、稳定性高、特异性强、多态性丰富的特异引物，并能够扩增交配型基因Mating A和Mating B。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种花脸香蘑单核体交配型基因，所述花脸香蘑单核体交配型基因包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的Mating A和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的Mating B。
本发明还提供了一种扩增所述的花脸香蘑单核体交配型基因的引物组合物，所述引物组合物包括以下引物：
MatA：正向引物：CGACGACTCTCATACCACTTCA ；反向引物：ATGGGAGTCTATTCCATTCAAAGG；
MatB：正向引物：TTGCTCTGGTTGACGAGGAA ；反向引物：TGGCTTTCGAACCAGTAACGTGGA。
进一步的，所述引物MatA能够扩增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的花脸香蘑单核体交配型基因Mating A；所述引物MatB能够扩增核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的花脸香蘑单核体交配型基因Mating B。
本发明还提供了所述的引物组合物在用于鉴定花脸香蘑单核菌株的交配型中的应用。
进一步的，鉴定花脸香蘑单核菌株的交配型包括以下步骤：
（1）提取待测花脸香蘑单核菌株的菌丝体的基因组DNA；
（2）以提取的基因组DNA作为模板，利用引物MatA和MatB分别进行PCR扩增；
（3）电泳检测PCR扩增产物的特异性条带；若在800 bp-1000 bp处具有对应条带，1000bp-1200bp处没有对应条带，鉴定菌株为A1B2交配型单核菌株；若在1000bp-1200bp处具有对应条带，800bp-1000bp处没有对应条带，鉴定菌株为A2B1交配型单核菌株；若在800bp-1000bp和1000bp-1200bp处均具有对应条带，鉴定菌株为A1B1交配型单核菌株；若在800bp-1000bp和1000bp-1200bp处均没有对应条带，鉴定菌株为A2B2交配型单核菌株。
进一步的，所述步骤（2）中PCR的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，52℃退化25s，72℃延伸40s，重复该过程35次；72℃延伸5min；4℃保温。
进一步的，所述步骤（2）中PCR的反应体系为：基因组DNA 1微升，正向引物1微升，反向引物1微升，2×M5 HiPer plus TaqHiFi PCR mix 10微升，ddH2O补足至20微升。
本发明还提供了所述的引物组合物在用于花脸香蘑单核菌株的杂交育种以及筛选杂合子中的应用。
进一步的，花脸香蘑单核菌株的杂交育种以及筛选杂合子包括以下步骤：
（1）提取待测花脸香蘑单核菌株的菌丝体的基因组DNA，并利用引物MatA和MatB分别进行PCR扩增；
（2）电泳检测PCR扩增产物的特异性条带；根据所述特异性条带的大小鉴定花脸香蘑单核菌株的交配型；
（3）根据步骤（2）中的花脸香蘑单核菌株的交配型，选择具有亲和性的单核菌株作为亲本进行杂交，并共培养至单核菌株的菌丝相接触，呈现亲和状态；
（4）挑取接触线远端的菌丝样本进行培养，并提取其菌丝体基因组DNA，再次利用引物MatA和MatB分别进行PCR扩增；
（5）电泳检测PCR扩增产物的特异性条带；若在800bp-1000bp或1000bp-1200bp处具有单一条带，则样本为杂交的单核亲本；若在800bp-1000bp或1000bp-1200bp处均具有特异性条带，则样本为双核杂合子菌株。
进一步的，所述步骤（2）中，花脸香蘑单核菌株的交配型的鉴定方法为：若在800bp-1000 bp处具有对应的条带，1000bp-1200bp处没有对应条带，菌株为A1B2交配型单核菌株；若在1000bp-1200bp处具有对应条带，800bp-1000bp处没有对应条带，菌株为A2B1交配型单核菌株；若在800bp-1000bp以及1000bp-1200bp处均具有对应条带，菌株为A1B1交配型单核菌株；若在800bp-1000bp以及1000bp-1200bp处均没有对应条带，菌株为A2B2交配型单核菌株。
进一步的，若所述单核亲本为A1B1交配型单核菌株，则需对杂合子菌株进行镜检复筛。
进一步的，所述800bp-1000bp具体指856bp；所述1000bp-1200bp具体指1166bp。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明利用实验室测序的花脸香蘑全基因组信息，运用生物信息学方法检测基因组上的交配型位点，并根据该位点上下游的基因序列设计引物，最终得到了2对扩增条带清晰、稳定性高、特异性强、多态性丰富的特异性引物。
2、本发明的引物可用于鉴定花脸香蘑单核菌株的交配型以及是否为同一交配型，再利用鉴定出确定交配型且具有亲和性单核菌株两两杂交，可以迅速获得杂合子，大量节省筛选时间。
3、本发明准确性高，重复性好，操作简单，大大减少了工作强度，有利于提高育种效率，促进目的性状的筛选。
附图说明
图1为花脸香蘑单核菌丝与双核菌丝；其中，箭头表示为锁状联合。
图2为单核菌丝交配型电泳图；其中，M为DNA分子量标准，1、3、7、9、15、19、21、23、27泳道均为A1B2交配型单核菌株；6、14、18泳道均为A2B1交配型单核菌株；11-12，25-26，31-32均为A2B2交配型单核菌株；33-34为A1B1交配型单核菌株。
图3为单核菌丝亲本以及杂交成功的双核杂合子菌丝交配型电泳图；其中，M为DNA分子量标准，泳道1-6为单核菌株亲本，7-12泳道为3个杂合子菌株。
图4为现有技术中其他引物不能有效鉴定花脸香蘑的mating A和mating B位点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1：花脸香蘑单核体交配型位点分析及引物筛选
本发明中的步骤、方法、引物等适用于所有的花脸香蘑。但在本实施例中，所用双核菌株材料为花脸香蘑菌株蒙花L1；所述花脸香蘑菌株蒙花L1的保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2022年05月05日；蒙花Lepista sordid L1的保藏编号为CCTCC NO：M 2022511。
所用单核菌株为蒙花L1栽培出菇后采集的子实体、以及采集的内蒙野生花脸香蘑、山东野生花脸香蘑的子实体，收集担孢子后，再经梯度稀释涂平板，挑取单菌落获得（见图1）。
1、花脸香蘑单核体交配型位点分析
采用OMEGA试剂盒方法提取花脸香蘑单核菌丝样本的全基因组DNA，具体为：准备0.1g 新鲜菌丝体，选用液氮迅速将菌丝体研磨碎，依次加入试剂盒内特定溶液进行提取，并加入RNA酶去除RNA，最终获得花脸香蘑基因组。利用Illumina HiSeq2000测序仪进行全基因组重测序，获得的基因组大小为39Mb。通过与已知的交配型序列比对，将得到的基因序列再与已知基因功能的序列比对，然后采用UniProt在线软件中的Retrieve/ID mapping鉴定得到的基因是否是交配型基因。
在本实施例中，共得到2个交配型基因序列，分别如SEQ ID No.1所示的Mating A和如SEQ ID No.2所示的Mating B。
2、引物设计
对上述获得的交配型序列设计引物，使用SnapGene和CE Design软件进行引物设计，选用NovoPrO在线工具PCR引物性质计算对设计引物检测，得到18-30碱基，G+C含量在40%~60%之间的引物序列。设计的引物序列如下：
MatA：正向引物：CGACGACTCTCATACCACTTCA ；
反向引物：ATGGGAGTCTATTCCATTCAAAGG。
MatB：正向引物：TTGCTCTGGTTGACGAGGAA ；
反向引物：TGGCTTTCGAACCAGTAACGTGGA。
实施例2：花脸香蘑单核体交配型的鉴定
（1）分别提取待测双核菌株和单核菌株的菌丝体基因组DNA；
（2）以提取的基因组DNA作为模板，利用引物MatA和MatB分别进行PCR扩增；
PCR的反应体系为：基因组DNA 1微升，正向引物1微升，反向引物1微升，2×M5HiPer plus TaqHiFi PCR mix 10微升，ddH2O补足至20微升；
PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，52℃退化25s，72℃延伸40s，重复该过程35次；72℃延伸5min；4℃保温；
（3）电泳检测PCR扩增产物（其中利用引物MatA扩增出的产物条带大小为856bp，利用引物MatB扩增出的产物条带大小为1166bp）；若在856bp处具有对应条带，而1166bp处没有对应条带，则该菌株是A1B2交配型单核菌株；若在1166bp处具有对应条带，而856bp处没有对应条带，则该菌株是A2B1交配型单核菌株；若在856bp和1166bp处均有对应条带，则该菌株为A1B1交配型单核菌株；若在856bp和1166bp处均没有对应条带，则该菌株为A2B2交配型单核菌株（图2）。
实施例3：花脸香蘑单核杂交育种及杂合子的筛选
（1）根据实施例2中已测定的单核菌株交配型，可以对不同交配型进行定向杂交育种（参见表1），选择具有亲和性的单核菌株两两杂交，可以迅速获得杂合子，大量节省筛选时间。
表1 单核菌株交配型亲和状态
注：√表示菌株具有亲和性，ⅹ表示菌株不具有亲和性。
（2）选择已鉴定的A1B2交配型单核菌株和A2B1交配型单核菌株进行两两杂交，将2个菌株在无菌条件下分别接种到同一平板上，共同培养至菌丝相接触，二者表现为菌丝亲和状态；
（3）挑取接触线远端的菌丝，分别转接到新的平板上进行培养保存；
（4）分别提取已挑取的待测菌株的菌丝体基因组DNA；
（5）以提取的基因组DNA作为模板，利用引物MatA和MatB分别进行PCR扩增；
（6）电泳检测PCR扩增产物；如在856bp或1166bp处具有单一条带，则该菌株是杂交单核亲本；如在856bp处和1166bp处同时都具有特异性的条带，则该菌株是双核杂合子菌株（图3）；如单核亲本为A1B1交配型单核菌株，则需对杂合子菌株进行镜检复筛。
实施例4：现有技术中引物对Mating A和Mating B位点的检测情况
（1）分别提取已鉴定单核菌株的菌丝体基因组DNA；
（2）以提取的基因组DNA作为模板，利用鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的专用引物分别进行PCR扩增；引物序列如下：
| SR-1×3 F | GAGGATGTTGGTGGGAGAAA |
| SR-1×3 R | ACAATCGTACTTTGAAACCTTGT |
| SR-2×8 F | TTTCGAGATGCCAAGGGTAG |
| SR-2×8 R | GCAAAAATGCCCTTATCCCA |
| IS-857c F | TGAGATATAATCACGAGTGCAAAT |
| IS-857c R | TAGGACAAAATGGTAGGGGA |
| SR-1×8b F | TTGCCCAAATCCCTACTTCC |
| SR-1×8b R | ATCAGGCGGTCTTTGTAGTC |
（3）电泳检测PCR扩增产物；所有单核菌株在500-1000bp处均出现特异性的条带（图4），说明现有技术中的引物不能有效鉴定本发明中的花脸香蘑mating A和mating B位点。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种花脸香蘑单核体交配型基因，其特征在于，所述花脸香蘑单核体交配型基因包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的Mating A和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的MatingB。
2.一种扩增权利要求1所述的花脸香蘑单核体交配型基因的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括以下引物：
MatA：正向引物：CGACGACTCTCATACCACTTCA ；反向引物：ATGGGAGTCTATTCCATTCAAAGG；
MatB：正向引物：TTGCTCTGGTTGACGAGGAA ；反向引物：TGGCTTTCGAACCAGTAACGTGGA。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物MatA能够扩增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的花脸香蘑单核体交配型基因Mating A；所述引物MatB能够扩增核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的花脸香蘑单核体交配型基因Mating B。
4.权利要求2或3所述的引物组合物在用于鉴定花脸香蘑单核菌株的交配型中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测花脸香蘑单核菌株的菌丝体的基因组DNA；
（2）以提取的基因组DNA作为模板，利用引物MatA和MatB分别进行PCR扩增；
（3）电泳检测PCR扩增产物的特异性条带；若在800 bp-1000 bp处具有对应条带，1000bp-1200bp处没有对应条带，鉴定菌株为A1B2交配型单核菌株；若在1000bp-1200bp处具有对应条带，800bp-1000bp处没有对应条带，鉴定菌株为A2B1交配型单核菌株；若在800bp-1000bp和1000bp-1200bp处均具有对应条带，鉴定菌株为A1B1交配型单核菌株；若在800bp-1000bp和1000bp-1200bp处均没有对应条带，鉴定菌株为A2B2交配型单核菌株。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中PCR的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，52℃退化25s，72℃延伸40s，重复该过程35次；72℃延伸5min；4℃保温。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中PCR的反应体系为：基因组DNA 1微升，正向引物1微升，反向引物1微升，2×M5 HiPer plus TaqHiFi PCR mix 10微升，ddH2O补足至20微升。
8.权利要求2或3所述的引物组合物在用于花脸香蘑单核菌株的杂交育种以及筛选杂合子中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测花脸香蘑单核菌株的菌丝体的基因组DNA，并利用引物MatA和MatB分别进行PCR扩增；
（2）电泳检测PCR扩增产物的特异性条带；根据所述特异性条带的大小鉴定花脸香蘑单核菌株的交配型；
（3）根据步骤（2）中的花脸香蘑单核菌株的交配型，选择具有亲和性的单核菌株作为亲本进行杂交，并共培养至单核菌株的菌丝相接触，呈现亲和状态；
（4）挑取接触线远端的菌丝样本进行培养，并提取其菌丝体基因组DNA，再次利用引物MatA和MatB分别进行PCR扩增；
（5）电泳检测PCR扩增产物的特异性条带；若在800bp-1000bp或1000bp-1200bp处具有单一条带，则样本为杂交的单核亲本；若在800bp-1000bp或1000bp-1200bp处均具有特异性条带，则样本为双核杂合子菌株。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，花脸香蘑单核菌株的交配型的鉴定方法为：若在800 bp-1000 bp处具有对应的条带，1000bp-1200bp处没有对应条带，菌株为A1B2交配型单核菌株；若在1000bp-1200bp处具有对应条带，800bp-1000bp处没有对应条带，菌株为A2B1交配型单核菌株；若在800bp-1000bp以及1000bp-1200bp处均具有对应条带，菌株为A1B1交配型单核菌株；若在800bp-1000bp以及1000bp-1200bp处均没有对应条带，菌株为A2B2交配型单核菌株。
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|---|---|---|---|---|
| CN116179756A (zh) * | 2023-04-03 | 2023-05-30 | 北京市农林科学院 | 香菇0912品种交配型鉴定引物及其应用 |
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