CN115232823A - 芥蓝菇叶发育相关基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业基因开发技术领域，具体涉及一种芥蓝菇叶发育相关基因及其应用。该芥蓝菇叶发育相关基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。可以通过调控本发明中的芥蓝菇叶发育相关基因的序列，从而有效调控芥蓝菇叶的发育。

Description

芥蓝菇叶发育相关基因及其应用
技术领域
本发明属于农业基因开发技术领域，具体涉及一种芥蓝菇叶发育相关基因及其应用。
背景技术
芥蓝(Brassica oleracea var.chinenis Lei，2n＝18)是十字花科芸薹属一年生或二年 生草本植物，属于甘蓝类变种，是起源于我国南方地区的特色蔬菜之一。芥蓝叶绿，叶面平 滑或皱缩，以柔嫩肉质花薹和嫩叶为主要食用器官，富含类胡萝卜素、维生素C、硫代葡萄 糖苷等营养成分，具有较高的营养价值。与其他芸苔属蔬菜相比，芥蓝的遗传多样性较低， 但形态性状多样且遗传差异显著。
菇叶，又称菇花，是着生于芥蓝叶脉上类似蘑菇的的变态小叶，是一种特殊的植物学性 状，其发育时间及在叶脉上的具体着生位置具有不确定性，其发育可能受到叶片近-远轴极性 变化的影响。由于植物叶片形态在不同的生存环境中可能会发生不同的变化，是植物在选择 压力下适应环境变化的表现；叶片大小受光照、温度、湿度等非生物因素和光竞争、养分竞 争等生物因素的影响，叶片形状的空间变异受温度和湿度的共同影响。所以，菇叶的生长降 低了芥蓝叶片的比叶面积，增加了叶片的周长-面积比，使单位面积所需要的干物质的投入更 大，使叶片获取光能的代价增大；菇叶生长促进叶片边界层与外界的水气交换，以适应湿热 的环境。
目前对芥蓝菇叶等特色性状研究甚少，现需要对有/无菇叶芥蓝根据具体情况进行培育或 菇叶生长进行防调控的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种芥蓝菇叶发育相关基因，可以通过调控该基因的表达，从而调 控芥蓝菇叶的生长。
本发明一方面提供了一种芥蓝菇叶发育相关基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体地，本发明是以高代自交系有菇叶芥蓝52号为母本，无菇叶芥蓝55号为父本，通 过杂交，构建F2分离群体，对菇叶性状进行遗传分析，探究芥蓝菇叶性状的遗传规律；利用 BSA-seq的方法，快速发育相关芥蓝菇叶发育相关基因的染色体区间，在候选区间内开发分 子标记进行初步发育相关，结合芥蓝参考基因组注释候选基因的功能，通过基因序列分析、 同源分析和表达分析确定菇叶性状相关的关键候选基因。
具体地，主要在芥蓝的叶和花中表达，有菇叶芥蓝中基因的相对表达量显著低于无菇叶 芥蓝材料，即芥蓝菇叶是由的表达量降低引起的。可以通过调控芥蓝中基因的表达，从而调 控芥蓝中菇叶的发育。
本发明另一方面还提供了一种上述的芥蓝菇叶发育相关基因的表达载体。
本发明另一方面还提供了一种CRISPR-Cas9系统，包含可以识别上述的芥蓝菇叶发育相 关基因的gRNA。
本发明另一方面还提供了一种用于调控芥蓝菇叶的药剂，其包含上述的表达载体或上述 的CRISPR-Cas9系统。
在某些具体实施例中，上述用于调控芥蓝菇叶的药剂还包括辅料。
在某些具体实施例中，上述用于调控芥蓝菇叶的药剂剂型为液体剂或颗粒剂。
本发明另一方面还提供了一种促进上述的芥蓝菇叶发育相关基因表达的促进剂在制备用 于抑制芥蓝菇叶发育制剂中的应用。
本发明另一方面还提供了一种上述的芥蓝菇叶发育相关基因在培育无菇叶芥蓝中的应用。
本发明另一方面还提供了一种上述的表达载体在培育有/无菇叶芥蓝中的应用。
本发明另一方面还提供了一种上述的CRISPR-Cas9系统在培育有/无菇叶芥蓝中的应用。
具体地，菇叶的生长降低了芥蓝叶片的比叶面积，增加了叶片的周长-面积比，使单位面 积所需要的干物质的投入更大，使叶片获取光能的代价增大；菇叶生长促进叶片边界层与外 界的水气交换，以适应湿热的环境。所以，在培育芥蓝中，可以根据具体生长环境，来确定 培育有菇叶或无菇叶的芥蓝。
本发明有益效果在于：可以通过调控本发明中的芥蓝菇叶发育相关基因的表达，从而有 效调控芥蓝菇叶的生长。
附图说明
图1为本发明实施例流程示意图；
图2为亲本芥蓝叶片特征与叶脉切片观察；
图3为芥蓝表型和F2分离群体中的表型数；
图4为有菇叶和无菇叶混池之间的BSA分析结果；
图5为部分DNA样本的琼脂糖凝胶电泳检测；
图6为4号染色体上菇叶位点的遗传连锁图谱；
图7为候选基因在不同组织部位的表达模式热图；
图8为RNA样本的电泳检测；
图9为候选基因qPCR分析；
图10为芥蓝DNA的提取及BocNGA1DNA序列的克隆；
图11为BocNGA1CDS扩增结果；
图12为多个品种芥蓝NGA1CDS序列的多重序比对；
图13为BocNGA1基因的分子进化树；
图14为BocNGA1基因在52号芥蓝不同部位的表达量分析；
图15为不同品种芥蓝BocNGA1表达量分析。
其中，图2中，a表示52号芥蓝叶片；b表示55号芥蓝叶片；c表示52号芥蓝叶脉切片；d表示55号芥蓝叶脉切片；图3中，a表示52号芥蓝；b表示55号芥蓝；c表示F1单 株；d表示无菇叶F2单株表示；e表示有菇叶F2单株；f表示F2分离群体中的有菇叶和无 菇叶的芥蓝单株数；图4中，a中，Δ(SNP-index)在染色体组的分布，圆点代表Δ(SNP-index)， 红线代表置信度为99％生的阈值线，蓝线代表置信度为95％阈值线，黑色线为Δ(SNP-index) 划窗后的拟合线；b中，黑线为G’value在染色体组的分布，红色线为阈值线；图7中，G 表示根；L表示花蕾；T表示花薹；Y表示叶片；2、3、4分别表示三个重复；灰色表示FPKM 均值为0；图8中，泳道1表示DL2，000DNAMarker，泳道2-5分别表示为52号、55号、F2 有菇叶和F2无菇叶植株的RNA；图9中，ns表示无显著性差异；*表示5％的显著性水平差异 显著；**表示1％的显著性水平差异显著；***表示0.1％的显著性水平差异显著；图10中，A 表示芥蓝DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测，其中1为DL2,000DNAMarker；2-7为不同植株的 DNA；B中，1为DL2,000DNAMarker，2为BocNGA1-52DNA序列扩增结果，3为BocNGA1-55DNA 序列扩增结果；C中，1为DL2，000DNAMarker，2、3、4为菌液PCR的凝胶电泳检测；图11 中，1为DL2,000DNAMarker，2、3分别为BocNGA1-52和BocNGA1-55CDS扩增的凝胶电泳检 测；图12中，红框中是361bp-363bp，对应的氨基酸为精氨酸；无菇叶芥蓝中花、55号、78 号、13号363bp处的碱基均为C，有菇叶芥蓝52号、25号、大笋和大芯菇花363bp处的碱 基均为G；图15中，52号、25号、50号为有菇叶芥蓝材料，81号、97号、55号为无菇叶 芥蓝材料。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施 例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍 属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具 有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解， 诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、 材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加 一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使 用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
以下实施例中，芥蓝高代自交系均来自华南农业大学；52号自交系为有菇叶材料(见图 3a)，由老种香选育而来；55号自交系为无菇叶材料(见图3b)；所有材料种于华南农业大学 启林北蔬菜基地。
以下实施例中，55号的NGA1 CDS基因序列如SEQ ID NO.2所示；52号NGA1基因序列如 SEQ ID NO.3所示；55号的NGA1基因序列DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
以下实施例中，使用CTAB法提取芥蓝叶片的DNA，具体操作步骤如下：(1)取叶片放入 2mL的离心管中，加入700μL2％CTAB和两颗小钢珠，于研磨机中60HZ研磨1min；(2)65℃恒温金属浴45min，期间颠倒2～3次；(3)65℃金属浴结束后，加700μL氯仿：异戊醇(24:1),颠倒混匀,10,000rpm离心5min；(4)取上清，加入两倍体积的乙醇，颠倒混匀，-80℃放置30min后12,000rpm离心10min；(5)去上清，用70％乙醇洗涤2～3次，65℃烘干沉淀；(6) 加入无菌水50μL溶解沉淀，于-20℃冰箱中保存。
以下实施例中，RNA的提取采用的是上海普洛麦格生物技术有限公司的
Figure BDA0003652207470000041
Super总 RNA提取试剂盒，具体实验步骤如下：(1)将50mg样品用液氮研磨成粉末状，加到RNA裂解 液和稀释液等比例的混合液中，混匀后室温放置3-5min；(2)14,000×g离心5min，取上清 液，加入0.5倍体积的无水乙醇后混匀；(3)将混合物转移至的离心柱中，12,000×g离心 1min，弃滤液；(4)加入600μLRNA洗液，12,000×g离心45s，弃滤液；(5)加入现配50μLDNA 酶Ⅰ孵育液(配方见表1)，室温放置15min；(6)加入600μLRNA洗液，12000×g离心45s，弃滤液；(7)重复步骤(6)；(8)不加试剂，12000×g离心2min；(9)将离心柱放至洗脱管 上，加入30μL无核酸酶水，静置2min，12,000×g离心1min，RNA产物保存于-80℃。
表1DNA酶Ⅰ孵育液
试剂 体积
10×DNA酶Ⅰ缓冲液 5μL
DNA酶Ⅰ 5μL
无核酸酶水 40μL
以下实施例中，cDNA的合成是使用
Figure RE-GDA0003837867550000042
MixforqPCR(gDNAdigesterplus)对进行，反应体系如表2，用移液枪轻轻吹打混匀，42℃孵育2min；然后向反应产物中加入
Figure RE-GDA0003837867550000043
用移液枪轻轻吹打均匀后， 于PCR仪上进行逆转录(表3)得到cDNA。
表2去除残留基因组DNA反应体系
组分 使用量
Total RNA 500ng
5×gDNA digester Mix 3μL
RNase-free water To 15μL
表3逆转录程序
温度 时间
25℃ 5min
55℃ 15min
85℃ 5min
以下实施例中，荧光定量PCR(qPCR)使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司 2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix，以芥蓝actin基因作为内参基因，设计特异性引物(见表4)，qPCR反应体系见表5，反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，55℃退 火20s，72℃延伸30s，重复40个循环；对候选基因进行荧光定量PCR。
表4 qPCR引物信息
Figure BDA0003652207470000051
Figure BDA0003652207470000061
表5荧光定量反应体系
组分 使用量
2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5μL
Primer 1 0.2μL
Primer 2 0.2μL
cDNA 1μL
ddH<sub>2</sub>O To 10μL
以下实施例中，PCR产物使用北京擎科新业生物技术有限公司的DNA凝胶回收试剂盒进 行回收，实验步骤如下：(1)在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入2ml离心管 中；(2)加入500μL的BufferGL；(3)65℃水浴至凝胶完全熔化，每2-3min颠倒混匀一次， (4)将溶液转入吸附柱EC中，12,000×g离心1min，弃废液；(5)加入700μLBufferW2，12,000×g离心1min，弃废液；(6)重复步骤(5)一次；(7)不加试剂，12,000×g离心2min；(8)取出吸附柱，放入干净的1.5ml离心管中，加入35μLEluent，20-25℃放置2min，12,000g离心2min。(9)弃吸附柱，DNA保存于-20℃。
以下实施例中，一步法快速克隆按照按照翊圣生物科技(上海)股份有限公司的一步法 快速克隆试剂盒
Figure RE-GDA0003837867550000062
的说明书进行快速克隆，具体操作步骤 如下：(1)重组反应：于冰上配制重组反应体系(表6)，线性化载体(X)与插入片段(Y) 的用量一般推荐摩尔比为1:2至1:3；用移液器吸打混匀各组分，于PCR仪中50℃反应20min； (2)重组产物的转化：①在冰上解冻DH5α感受态细胞(购自康体生命科技有限公司)；② 加入10μL重组产物，轻弹管壁混匀，冰上静置30min；③42℃水浴90s，冰上冷却2min； ④加入900μLLB液体培养基(不含抗生素)，200rpm，37℃复苏1h；
⑤5,000rpm离心5min，弃上清液，重悬菌体并涂布在含有正确抗性的平板上；⑥37℃倒 置培养12-16h；(3)重组产物的鉴定：挑取单克隆菌落初摇8h，菌液PCR反应体系见表7， 反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸kb/min，共进行34个循环；72℃终延伸5min；(4)进一步扩摇阳性菌液以提取质粒。
表6一步克隆法重组反应体系
试剂 体积
线性化载体 XμL
插入片段DNA YμL
2×Hieff Clone Enzyme Premix 5μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 10μL
表7大肠杆菌菌液PCR反应体系
试剂 体积
2×Green Taq Mix 5μL
Primer-F(10μM) 0.2-0.5μL
Primer-R(10μM) 0.2-0.5μL
模板DNA 1μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 10μL
以下实施例中，质粒DNA的提取按照北京擎科新业生物技术有限公司高纯度质粒DNA提 取试剂盒的说明书进行，具体操作步骤如下：(1)取1-4ml过夜培养的菌液，12,000×g离 心1min，收集菌体；(2)加200μLBufferS1重悬菌体沉淀，涡旋震荡至无菌块；(3)加 200μLBufferS2，温和翻转4-7次裂解菌体；(4)加200μLBufferS3，温和翻转4-7次，充 分混匀(溶液由紫红色转至淡黄色并出现白色絮状沉淀)，12,000×g离心15min；(5)取上 清转入吸附柱中，12,000×g离心1min，弃废液；(6)吸附柱中加700μLBufferW2，12,000×g 离心1min，弃废液；(7)重复步骤(6)一次；(8)将吸附柱放回空收集管中，12,000×g离 心2min；(9)将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，室温静置2min，加入35μLEluent，室 温静置2min，12,000×g离心2min；(10)弃去吸附柱，DNA产物保存于-20℃。
以下实施例中，BocNGA1基因的生物信息学分析所用的软件和工具如(表)所示。
表8 BocNGA1基因的生物信息学分析工具
Figure BDA0003652207470000071
Figure BDA0003652207470000081
实施例1菇叶性状观察及表型鉴定
以52号芥蓝为母本，55号芥蓝为父本，杂交获得了F1代植株，通过对F1进行自交，构建了菇叶有无F2代分离群体。F2代分离群体于2020年9月18日开始育苗，10月3日定植于 面积为15㎡的两块试验小区内，株距为25㎝，行距为25㎝，对实验材料进行常规田间管理。
观察菇叶在叶片上的着生部位和发育时间，结果如图2所示，发现菇叶主要着生在叶片 的主脉上，少数会着生在侧脉上(见图2a)；当出现花蕾时，说明芥蓝营养生长完成，开始 转向生殖生长，因此应在现蕾期对菇叶性状进行观察和统计。
在52号芥蓝嫩叶菇叶长出时对有菇叶的叶片进行取样，在55号芥蓝取相同大小的叶片， 再进行切片的制作，并用番红O-固绿植物组织染色液染色，观察两个材料叶片及其解剖学结 构的差异，结果如图2所示，发现55号芥蓝叶片和维管束均为正常形态(见图2b和图2d)， 而52号芥蓝叶片发生皱缩，近轴面叶脉向上突起(见图2a)，维管束发生远轴化，木质部被 韧皮部包围(见图2c)，说明菇叶的产生可能是由于叶片极性变化而造成的。
实施例2菇叶遗传分析
本发明实施例为验证芥蓝菇叶性状的遗传特性，有菇叶的52号芥蓝(见图3a)为母本， 无菇叶的55号芥蓝(见图3b)为父本，杂交获得的F1代植株均表现为有菇叶(见图3c)，说 明有菇叶性状受显性基因控制。将有菇叶的F1代芥蓝进行自交，产生的F2代分离群体(见图 3d和图3e)。
当实验材料达到现蕾期时进行观测统计，对有亲本和F2代分离群体的菇叶数量和发育特 征进行观察，记录每一株芥蓝菇叶性状(有/无)。调查结果通过χ2拟合优度检验进行F2代 分离比的分析,χ2检验的P值由MicrosoftExcel2019软件的CHISQ.TEST函数计算而来。
404株F2代单株中，包括有菇叶芥蓝264株和无菇叶芥蓝140株(见图3f)，使用MicrosoftExcel2019软件对F2群体中芥蓝的菇叶性状进行χ2优度拟合检验，其分离比遵循5：3的比例，P值为0.237>0.05。由此推芥蓝菇叶的有无可能受两对独立遗传且存在相互作用的主效基因控制。
实施例3BSA混池测序与分析
本发明实施例中，以52号芥蓝和55号芥蓝为亲本池，经性状调研后，选取F2代分离群 体中有菇叶和无菇叶芥蓝各30株，每一株用打孔器取直径0.5cm的嫩叶，构成“有菇叶”和 “无菇叶”两个极端池。将混池样本委托武汉菲沙基因信息有限公司进行DNA提取和基因组 重测序，测序得到的原始测序序列去除带接头的、低质量的序列，得到高质量的序列数据。
本发明实施例中，通过BWA软件比对到中花芥兰参考基因组，通过GATK软件进行多个样 本SNP标记和InDel标记的检测，使用picard进行去重复；利用snpEff软件对SNP和InDel 进行注释。
基于BGI(MGI-seq2000)高通量测序平台，共生成98.92Gb数据，包含过滤后获得的测 序序列(Reads)638,614,928个，有效率在96.64％以上。原始数据中Q20均在96.5％以上， Q30均在89.8％以上，基因组的GC含量正常，分别为36％、35.8％、35.8％和36.8％(表)，其 中99.65％的高质量Reads对比到中花芥蓝参考基因组上。说明所有样本的数据量足够，测序 数据质量合格,与中花芥兰参考基因组比对效率较高，可用于后续变异检测及性状的基因定位。
表9重测序数据汇总表
Figure BDA0003652207470000091
本发明实施例中，以测定的中花染色体水平的基因组作为参考基因组，由基于R语言的 QTL-seqr包进行分析(https://github.com/bmansfeld/QTLseqr)，分别统计极端混池与参 考基因组在同一个碱基位点中突变型亲本基因型的Reads占总Reads的比例，以1Mb为窗口， 10Kb为步长，计算每个窗口SNP-index的平均值，来反映子代两个极端混池的SNP-index。 Δ(SNP-index)为两个极端混池的SNP-index的差值。进行1000次置换检验，选取95％和 99％置信水平作为阈值，得到两个混池的Δ(SNP-index)在染色体上的分布。Grubbs检测的 α值设置为0.001，得到G’value在染色体组的分布。Δ(SNP-index)>95％的置信水平和 和Grubbs检测中阈值线以上的区域确定为潜在的QTL候选区域。
Δ(SNP-index)分布图(图4a)和G’value分布图(图4b)如图4所示。经比对，在 F2群体极端混池中共检测到4,663,771个SNP位点，过滤后得到SNP位点3,593,233个。根 据Δ(SNP-index)分布图，以95％置信水平为筛选阈值，发现在4号染色体出现了两个明显 的峰，分别位于60,217,093bp-61,017,093bp和65,817,093bp-67,617,093bp处。根据 G’value分布图，发现阈值线以上只有4号染色体有一个峰，位于58,243,405bp-67,606,738bp之间，G’value的最大值为43.1097，位于67,078,568bp，该 位点的Δ(SNP-index)值为0.777。
根据Δ(SNP-index)分析和Grubbs检测的结果，取两种分析方法关联区域的交集作为 候选区间，该区间位于4号染色体的60,217,093bp-67,606,738bp，总长度约为7.4Mb，包含 InDel位点共5,003个。
实施例4DNA提取与检测
先使用CTAB法提取将404个F2单株和2个亲本芥蓝叶片的DNA，然后进行超微量紫外分 光光度计检测和琼脂糖凝胶检测，具体如下：
(1)超微量紫外分光光度计检测
使用超微量紫外分光光度计检测406个DNA母液(404个F2单株和2个亲本)的浓度和 纯度。结果发现其核酸和蛋白质的吸光度比值(A260/A280)均大于1.8，核酸和碳水化合物 的吸光度比值(A260/A230)均大于2.0；随机抽取DNA样本的检测结果(表)，说明提取的DNA母液较纯净，蛋白质、多酚类、盐类和有机溶剂等杂质含量较少。
表10部分DNA样本的吸光度
DNA母液编号 5 17 53 60 108 117
浓度(μg/μg) 654.9 524.4 1233.5 1141.1 1516.1 1281.4
A260/A280 2.18 2.16 2.14 2.14 2.16 2.15
A260/A230 2.15 2.09 2.11 2.13 2.20 2.18
(2)琼脂糖凝胶检测
使用0.8％琼脂糖凝胶120V电泳20min，进行DNA条带完整性检测。结果如图5所示，DNA 呈一条带清晰且完整的亮带，说明基因组DNA母液质量良好，可以用于后续的试验。
实施例5InDel标记的遗传图谱构建
将筛选的InDel位点定位在中花芥蓝参考基因组上，取该InDel位点上下游各200bp的 序列，利用PrimerPremier5软件进行引物设计，PCR产物包含InDel位点在内，大小为 150～400bp，引物由擎科生物技术有限公司合成(表11)。PCR反应总体系为10μL，其中诺唯 赞GreenTaqMix5μL，上下游引物各0.5μL，DNA小于200ng，ddH2O加至10μL。反应程序 为：95℃预变性3min；95℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸20s；重复35个循环；72℃ 终延伸2min。以180V的电压在电泳缓冲液(1×TBE)中对PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳 检测，利用凝胶成像系统进行电泳条带观察。
表11 10对InDel标记引物的信息
Figure BDA0003652207470000101
Figure BDA0003652207470000111
对404个F2单株进行了带型分析，与母本型相同的标记记为“A”，与父本型相同的标记 记为“B”，杂合带型的标记记为“H”，模糊或缺失带型的标记记为“X”,用ICIMapping软件的MAP功能，基于Kosambi函数计算遗传距离，构建控制菇叶发育的遗传连锁图；利用复合区间作图法进行QTL分析，LOD值3.0作为判断QTL存在的阈值，运用线性回归分析QTL 表型解释率。
根据BSA分析的结果，得知芥蓝菇叶发育相关的基因被定位在4号染色体上物理位置为 60,217,093bp-67,606,738bp之间的区域内。通过ICIMapping软件，以404个F2单株和两个 亲本的DNA为模板，利用10对InDel标记在候选区域内对F2群体进行连锁图谱的构建。标记 间的总遗传距离为41.89cM，QTL位于标记InDel-64和InDel-69之间，遗传距离2.44cM， 物理距离255kb,LOD值最大为44.2259，该QTL的贡献率为43.1886(见图6)。
对InDel标记的带型和植株的表型进行分析，结果如下表12所示，发现引物InDel-64 与菇叶性状连锁较紧密，在101个与有菇叶亲本带型一致的F2单株中，有菇叶单株有98株； 在95株与无菇叶亲本带型一致的F2单株中，无菇叶单株有82株；在203株杂合带型的F2单 株中，有菇叶植株有151株，无菇叶植株有52株，比例约为3：1。
表12标记InDel-64的带型和植株表型的数据统计
带型 A H B
有菇叶 98 151 13
无菇叶 3 52 82
由此推测，当标记InDel-64的扩增产物带型与有菇叶亲本一致时，植株表现为有菇叶； 当带型与无菇叶亲本一致时，植株表现为无菇叶；当带型为杂合时，则受另一个独立遗传的 基因的控制，且当该基因为杂合时，植株表现为有菇叶。说明与InDel-64连锁的基因具有上 位性效应，而另一个基因具有显性效应。
实施例6候选基因qPCR分析
(1)提取RNA
提取叶片RNA，用2％琼脂糖凝胶140V电泳20min检测RNA的完整性；使用超微量紫外分 光光度计测定RNA的浓度和纯度。
以亲本和F2分离群体芥蓝现蕾期嫩叶为材料芥蓝叶片总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测结果 显示，RNA在凝胶电泳图上具有清晰的28S和18SrRNA条带(图8)。用超微量紫外分光光度 计测量RNA样品的浓度和纯度，结果表明，所有样品A260/A280比值在1.8和2.1之间，同 时A260/A230比值大于2.0(表)，说明所有提取的RNA样品质量良好。
表13部分RNA样本的吸光度
RNA样本 52叶片 55叶片 F<sub>2</sub>有菇叶 F<sub>2</sub>无菇叶
浓度(μg/μL) 213.6 381.4 155.3 271.0
A260/A280 2.07 2.10 2.04 2.08
A260/A230 2.39 2.36 2.23 2.33
(2)合成cDNA
提取芥蓝的总RNA作为模板，合成cDNA；
(3)荧光定量PCR检测
将cDNA稀释至同等浓度，对候选基因进行荧光定量PCR检测。每个试验设置三个重复， 取平均值作为测定结果。利用BIO-RAD公司的IQ5软件收集数据，采用2-△△ct法计算基因的相 对表达量。使用GraphPadPrism8分析数据并绘图。
根据中花芥蓝的根、花蕾、花薹和叶片等不同组织部位测得的转录组数据，选取候选区 间内的全部基因，使用TBTools的HeatMap功能绘制热图。在芥蓝中没有表达(方块为灰色) 或表达量较低的基因被认为不参与芥蓝叶片形态建成，故以FPKM值为0的数据个数少于66.7％ (即蓝色方块数量少于8个)为阈值(图7)，以筛选在亲本中有表达的的基因进行qPCR验 证。候选区间内共有基因37个，其中在中花芥蓝中表达量较高基因有17个，分别是 Bol_kaleZHnV1.0kC4g071550、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071560、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071580、 Bol_kaleZHnV1.0kC4g071610、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071630、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071640、 Bol_kaleZHnV1.0kC4g071650、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071660、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071690、 Bol_kaleZHnV1.0kC4g071700、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071710、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071760、 Bol_kaleZHnV1.0kC4g071770、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071790、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071840、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071880和Bol_kaleZHnV1.0kC4g071910。
通过对候选基因进行qPCR分析，发现在亲本间和F2代中有菇叶群体与无菇叶群体间的相 对表达量有显著性差异且相对表达量变化趋势一致的基因有Bol_kaleZHnV1.0kC4g071550、 Bol_kaleZHnV1.0kC4g071880和Bol_kaleZHnV1.0kC4g071910，其中
Bol_kaleZHnV1.0kC4g071550和Bol_kaleZHnV1.0kC4g071880在55号芥蓝和F2无菇叶群体中 的相对表达量高于52号芥蓝和F2有菇叶群体，并达到了极显著水平(图9)。
实施例7候选区域基因的功能注释
对候选区域内的SNP和InDel进行注释分析，获得在亲本间以及混池间的非同义突变的 SNP和移码突变的InDel；使用Diamoind以及BLAST将候选区域基因的核酸序列比对到NT数 据库和NR数据库，对候选基因进行初步筛选与功能预测。结果表明，候选区域内共注释到 37个基因，其中37个注释到NT数据库，36个基因注释到NR数据库，包括已知功能基因21 个。qPCR分析得到3个候选基因Bol_kaleZHnV1.0kC4g071550、Bol_kaleZHnV1.0kC4g071880 和Bol_kaleZHnV1.0kC4g071910分别被注释为rRNA加工蛋白FC1的同源物，B3家族转录因子 NGA1和甘氨酰肽N-十四烷酰基转移酶。
实施例8菇叶发生候选基因BocNGA1的克隆与序列分析
(1)BocNGA1基因的克隆
根据中花芥蓝参考基因组，使用PrimerPremier5软件设计克隆候选基因BocNGA1的基因 序列的特异引物，使用CEDesignV1.04软件对候选基因的cDNA序列设计带有pGBKT7-BD载体 同源臂的特异性引物(表)，对克隆序列进行差异分析。使用
Figure BDA0003652207470000131
MaxDNAPolymerase 高保真酶，反应体系见表。反应程序为如下：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸kb/5s， 共进行30个循环。经电泳检测合格的PCR产物进行回收；按照翊圣生物科技(上海)股份有 限公司的一步法快速克隆试剂盒
Figure BDA0003652207470000132
PlusOneStepCloningKit的说明书进行快速克 隆得质粒；进行质粒DNA提取，然后用超微量分光光度计测定质粒浓度后，送生工生物工程 有限公司进行测序。
表14基因克隆引物
Figure BDA0003652207470000141
表15克隆反应体系
Figure BDA0003652207470000142
(2)序列分析
根据Grubbs检测结果可知，G’value的最大值位于4号染色体67,078,568bp，注释到 基因Bol_kaleZHnV1.0kC4g071890中；由转录组测序结果可知，该基因在芥蓝中不表达。故 选取离67,078,568bp最近且在亲本和F2代的有菇叶群体与无菇叶群体间的相对表达量变化 趋势一致的Bol_kaleZHnV1.0kC4g071880作为关键候选基因，根据基因注释结果发现该基因 为B3家族转录因子NGA1)，故命名为BocNGA1。
从中花芥蓝基因组中调取包含BocNGA1完整CDS在内的1,408DNA序列作为参考序列。
在参考序列两端设计特异引物，提取52和55号芥蓝叶片的基因组DNA为模板(图10)， 产物板进行PCR扩增(见图10b)，将回收产物连接到pMD19-T载体上进行遗传转化，挑取阳 性克隆菌落进行扩摇，按照上述方法提取质粒DNA进行测序(见图10c)，发现55号芥蓝的 BocNGA1基因(BocNGA1-55)与参考基因组中花芥蓝的BocNGA1基因一致，52号芥蓝的BocNGA1 基因(BocNGA1-52)的CDS区发生了15个SNP突变。
为验证BocNGA1是否含有内含子，分别以52和55号芥蓝的cDNA为模板，扩增完整CDS。 经琼脂糖凝胶电泳检测发现扩增产物在750bp-1,000bp之间 (图)，将扩增产物连接pGBKT7-BD载体进行遗 传转化，挑取阳性克隆菌落进行扩摇，并提取质粒DNA进行测序，发现以cDNA为模板扩增出 来的BocNGA1基因CDS序列与以DNA为模板扩增出来的长度一致，说明BocNGA1基因结构为 单一外显子，无内含子。
对比55号芥蓝和和52号芥蓝的CDS序列，发现55号芥蓝和52号芥蓝之间存在15个SNP突变，其中同义突变6个，非同义突变9个，导致蛋白序列的8个氨基酸发生突变。
对氨基酸序列进行结构分析，发现BocNGA1-55的cDNA可编码304个氨基酸，蛋白相对 分子质量为33,914.07kDa，理论等电点为7.70，负电荷的残基总数为37，正电荷残基总数 为38，分子式为C1503H2316N426O453S12，原子总数为4,693，不稳定指数为42.32，说明该蛋白是不 稳定的；总平均亲水性为-0.526，说明该蛋白是亲水性蛋白。BocNGA1-52的cDNA可编码304 个氨基酸，蛋白相对分子质量为33,986.23kDa，理论等电点为8.91，负电荷的残基总数为 35，正电荷残基总数为40，分子式为C1503H2316N426O453S12，原子总数为4,710，不稳定指数为44.88， 说明该蛋白是不稳定的；总平均亲水性为-0.548，说明该蛋白是亲水性蛋白。
通过检测芸苔属和拟南芥的NGA家族基因保守结构域(motif)，发现BocNGA1-52有两个 氨基酸突变发生在保守结构域，分别是谷氨酸(酸性氨基酸)突变为赖氨酸(碱性氨基酸)， 丙氨酸(疏水性氨基酸)突变为丝氨酸(亲水性氨基酸)。
为验证芥蓝菇叶的发生是否由SNP突变引起的，选取有菇叶芥蓝品种25号、大笋芥蓝、 大芯菇花芥蓝和无菇叶芥蓝品种中花、78号芥蓝、13号芥蓝，提取DNA做为模板对NGA1基 因的CDS区域进行克隆并测序，将测序结果进行多重序列比对。结果表明，无菇叶芥蓝中花、 55号、78号、13号的NGA1基因CDS区域第363bp处的碱基均为C，有菇叶芥蓝52号、25 号、大笋、大芯菇花中均为G(见图12)，但CGC和CGG对应的氨基酸均为精氨酸，该突变为 同义突变，但是可以作为区分芥蓝菇叶有无的分子标记。。
(3)BocNGA1蛋白的同源分析
在NCBI数据库中对BocNGA1-55氨基酸进行序列比对，芥蓝、油菜、大白菜、萝卜、拟南芥等十字花科植物中获取一致性较高的氨基酸序列(表)，与BocNGA1-55和BocNGA1-52的氨基酸序列一起进行聚类分析，构建分子进化树。结果显示，BocNGA1-55的氨基酸序列与其他十字花科植物中的NGA1高度相似，其中与芥蓝“TO1000”(XP_013631735.1)的相似度高达100％，与油菜(XP_013688174.1)和大白菜(XP_009142460.2)的相似度均达到97.697％。通过聚类分析发现BocNGA1-55与芥蓝“TO1000”的NGA1(XP_013631735.1)聚在一起，BocNGA1-52与油菜的NGA1(XP_013688174.1)聚在一起(见图13)。
表16BocNGA1氨基酸序列与其他NGA1相关蛋白的同源分析
Figure BDA0003652207470000151
Figure BDA0003652207470000161
(4)BocNGA1基因的表达量分析
分别提取52号芥蓝的根、茎、叶和花的总RNA，通过荧光定量实验进行BocNGA1基因在 芥蓝不同部位的相对表达量分析(见图14)，结果表明BocNGA1在52号芥蓝的茎中无表达， 在根部的相对表达量很低，叶中相对表达量稍高，在花中的相对表达量最高，与中花芥蓝的 转录组测序结果(见图7)一致。
BocNGA1基因的表达量在有菇叶亲本和F2代群体中的表达量极显著低于无菇叶亲本和F2代群体(见图9)，为了确定BocNGA1基因在芥蓝叶片发育中是否发挥相似作用，另外选取有 菇叶芥蓝自交系25号、50号和无菇叶芥蓝自交系81号和97号的嫩叶提取RNA，进行表达量 分析。通过qPCR分析发现，有菇叶芥蓝品种中BocNGA1基因的相对表达量显著高于无菇叶芥 蓝品种(见图15)，表明该基因在芥蓝菇叶发育中起重要作用。
综上，有菇叶性状为相对显性性状，受两对独立遗传且具有相互作用的主效基因控制。 利用BSA-seq分析了控制芥蓝菇叶发育的基因，将BocNGA1确定为控制芥蓝菇叶发育的关键 候选基因。序列分析和表达量分析结果表明，菇叶的形成与BocNGA1基因CDS序列的改变无 关，而是由BocNGA1的表达量降低引起的。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施 例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进 行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利 要求范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 芥蓝菇叶发育相关基因及其应用
<130> 2022-5-18
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatgacca acttgtctct tgcaagagaa ggagaagcag aagcaaagaa gcccatagaa 60
aaagttgaga gagagcacat gttcgacaaa gtggtgactc caagcgacgt agggaaacta 120
aaccggctcg tgatcccaaa gcaacacgca gaaagatact tccctctaga ttcatcctca 180
aacgggaaag gtttgctttt aaacttcgaa gatctaacag gaaagtcatg gaggttccgt 240
tactcttact ggaacagtag ccagagctat gtcatgacta aaggttggag ccgtttcgtt 300
aaagacaaga agcttgacgc cggagatatt gtctctttcc agagatgtgt cggagacagc 360
cggttgttta tcgattggag gagaagacct aaagtccctg actatccgac atcgactgct 420
cactttgctg gaggagttat gttccctagg ttttacagtt ttccgacagc aactacttcg 480
acatgttacg atctgtacaa tcatcagccg ccacgtcatc atcacattgg ttacggttat 540
ccacagattc cgagagaatt tggatacggg tatttcgtta ggtcagtgga ccagagatcg 600
gtggtggctg atccgttagt gatcgaatct gtgccggtga tgatgcgcgg aggagctcga 660
gttagtcagg aggttgttgg aacggccggg aagaggctga ggctttttgg agtcgatatg 720
gaatgtggcg agagtggagt aaccaacagt acggaggaag aatcttcatc ttccggtggg 780
agtttgccgc gtgccggagg tggcggtgct tcttcatctt cctctttgtt tcagctgaga 840
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<210> 2
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<212> DNA
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ggagtcgata tggaatgtgg cgagagtgga gtaaccaaca gtacggagga agaatcttca 1080
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tttcagctga gacttgggag cagctgtgaa gatgatcact tctctaagaa aggaaagtct 1200
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taaaccacac ataattatat atatgacaac ataatgcatt ggtttcatta taaatttata 1320
gtgaaatgat gtacatgtgt tatagtgata tacattcata gtccatatag agaattttta 1380
tggatttgaa taatcctttt gtcaagtgtt 1410
<210> 4
<211> 1408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aactctgaga gctatagcta ttagcctatt gcagaaaacc agtgaaagat agagatgaga 60
aagagagaga gagagagatc atgctgataa gaagttaggc aaaactaact ttctatttat 120
gtataattag gtcaatcaca tcaccaattt aacttttttc ctcctctaaa tctccttcac 180
ttctcctcct ctacttccaa aattagggtt tgttgtttct ctctttcttt ctcaattttc 240
aaagtcatcc aatcggaatc aagtcaaaac cccaatctta gccacaccat taagagatct 300
gacttctaaa agatgatgac caacttgtct ctcgcaagag aaggagaagc agaagcaaag 360
aagcccatag aagaagttga gagagagcac atgttcgaca aagtggtgac tccaagcgac 420
gtagggaaac taaaccggct cgtgatccca aagcaacacg cagaaagata cttccctcta 480
gattcatcct caaacgggaa aggtttgctt ttaaacttcg aagatctaac aggaaagtca 540
tggaggttcc gttactctta ctggaacagt agccagagct atgtcatgac taaaggttgg 600
agccgtttcg ttaaagacaa gaagcttgac gccggagata ttgtctcttt ccagagatgt 660
gtcggagaca gccgcttgtt tatcgattgg aggaaacgac ctaaagtccc tgactatccg 720
acatcgggtg ttcactttgc tgcaggagct atgttcccta ggttttacag ttttccgaca 780
gcaactactt cgacatgtta cgatctgtac aatcatcagc cgccacgtca tcatcacatt 840
ggttacggtt atccacagat tccgagagaa tttggatacg ggtatttcgt taggtcagtg 900
gaccagagag cggtggtggc tgatccgttg gtgatcgaat ctgtgccggt gatgatgcgc 960
ggaggagctc gagttagtca ggaggttgtt ggaacggccg ggaagaggct gaggcttttt 1020
ggagtcgata tggaatgtgg cgagagtgga gtaacaaaca gtacggagga agaatcttca 1080
tcttccggtg ggagtttgcc gcgtgcagga ggtggcggtg cttcttcatc ttcctctttg 1140
tttcagctga gacttgggag cagctgtgaa gatgatcact tctctgagaa aggaaagtct 1200
tcattgcctt ttgatttgga tcaataatga tgatgagatt agttggtatt ataaacttaa 1260
aaccacacat aattatatac atgacaacat aatgcattgg tttcattata aatttatagt 1320
gaaattatgt atatgtgtta tagcgatata cagtcatagt ccatatagaa aatttctatg 1380
gatttgaata atccttttgt caagtgtt 1408

Claims (10)

1.芥蓝菇叶发育相关基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.包含权利要求1所述的芥蓝菇叶发育相关基因的表达载体。
3.CRISPR-Cas9系统，其特征在于，包含识别权利要求1所述的芥蓝菇叶发育相关基因的gRNA。
4.用于调控芥蓝菇叶的药剂，其特征在于，包含权利要求2所述的表达载体或权利要求3所述的CRISPR-Cas9系统。
5.根据权利要求4所述的用于调控芥蓝菇叶的药剂，其特征在于，还包括辅料。
6.根据权利要求4或5所述的用于调控芥蓝菇叶的药剂，其特征在于，所述药剂剂型为液体剂或颗粒剂。
7.调控权利要求1所述的芥蓝菇叶发育相关基因表达的调控剂在制备用于调控芥蓝菇叶发育制剂中的应用。
8.权利要求1所述的芥蓝菇叶发育相关基因在培育无/有菇叶芥蓝中的应用。
9.权利要求2所述的表达载体在培育无/有菇叶芥蓝中的应用。
10.权利要求所述3的CRISPR-Cas9系统在培育无/有菇叶芥蓝中的应用。
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