CN111471789B - 一种花生开花习性相关基因位点的分子标记方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物分子遗传学和分子育种技术领域，提供一种花生开花习性相关位点的分子标记方法及其应用，分子标记包括位于第12染色体的InDel标记PID12‑21和PID12‑29和位于第02染色体的InDel标记PID2‑9；单基因遗传的杂交群体，开花习性只需考虑第12染色体开花习性相关位点的基因型；双基因遗传的杂交群体，开花习性要综合考虑第02和第12染色体开花习性相关位点的基因型；无论是单/双基因遗传模式的杂交群体，只需鉴定扩增的目的条带的基因型，就能够将花生的连续开花型和交替开花型区分开，快速筛选花生杂交后代开花习性的类型，辅助与开花习性相关的株型育种、产量育种等。

Description

一种花生开花习性相关基因位点的分子标记方法及其应用

技术领域：

本发明属于作物分子遗传学和分子育种技术领域，涉及花生开花习性相关基因位点的分子标记辅助选择方法，用于对花生开花习性相关性状的分子标记辅助改良，进一步实现对花生分枝数、株型以及产量等的分子标记辅助改良。

背景技术：

花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物之一，它富含人体所需的多种营养元素，如不饱和脂肪酸、蛋白质和微量元素等。栽培花生(异源四倍体AABB，2n＝4x＝40)是由两个不同基因组类型的二倍体野生种天然异交加倍后驯化而来，其基因组结构相对复杂，遗传研究开展相对较晚。随着目前野生二倍体花生和栽培种花生的全基因组测序结果的公布，花生的分子遗传研究得到了快速发展。其中，开花习性是花生极为重要的亚种分类性状，与产量、株型息息相关，同时也是一个重要的驯化性状。花生的开花习性，是指花生叶腋发育成花序或者枝条最终表现出的花序和分枝的排列方式，主要有两种典型的代表：连续开花型(见图1A)和交替开花型(见图1B)。连续开花型最典型的性状表现为：主茎开花同时侧枝上每一节(叶腋)均可着生花序，或在一级侧枝的基部1-2节或第一节上着生二次营养枝、花序，以后各节连续着生花序；在二级分枝上第一至第二节及以后各节均着生花序。这种模式限制了花生的分枝数，所以又称疏枝型花生。交替开花型的典型性状表现为：主茎不开花同时花序与营养枝在侧枝上交替出现，一般是侧枝基部1-3节或1-2节上生长营养枝，不长花序，其后的4-6节或3-4节长花序，不长营养枝，如此交替发生(常见2花:2枝交替出现)。这类花生从基部开始着生营养枝，且分枝占节位的近二分之一，有分枝多而密的株丛特点，所以又称密枝型花生。分类学上简单地根据主茎是否开花将花生栽培品种分为两个亚种：连续开花亚种(Arachis hypogaea subsp.fastigiata)和交替开花亚种(Arachis hypogaea subsp.hypogaea)(Krapovickas A，2007)。除此之外还有较少的非典型性或中间型品种，主要表现为连续开花偶有分枝和交替分枝同时所有叶腋均开花等类型。花生的开花习性通过影响花生的花序数目、分枝数目和荚果集中程度、成熟一致性等直接影响花生地上部株型，进而影响花生群体产量、种植方式和籽仁的品质。由于花生叶腋发育渐次进行，因而连续开花型花生开花结荚时间和空间上均比较集中、成熟较一致、荚果收获容易、品质一致。交替开花型花生开花结荚时间上前后差距较大，间隔较远，导致荚果分散、荚果成熟不一致、荚果的产量和品质均受到影响。

随着人们对花生性状的研究，花生开花习性遗传规律得到了分析，在20世纪70年代，Hammons等利用两个亚种做正反交发现主茎不开花为显性，根据F₂的表型判断开花习性由两组重复基因座的等位基因控制，在该基因座的等位基因之间存在上位性(Hammons RO，1971)。不久后Wynne等人通过对来自Virginia、Spanish和Valencia四个品系的杂交F₁代和F₂代进行研究，不仅验证了Hammons提出的遗传模型，还研究了花生分枝型的遗传规律，结果表明侧枝上分枝型等位基因中存在两组具有上位性的重复基因座(Wynne JC，1975)。后来有研究者发现交替开花对连续开花有时也出现少量不完全显性和共显性，例如蒋复等研究发现交替型与连续型杂交，F₁中交替开花呈显性，但有时也出现少量不完全显性和共显性，不仅如此研究者还在交替型与交替型杂交中发现后代有连续开花型(蒋复等，1982)，而甘信民等研究认为，交替型对连续型为显性，F₂代的分离符合交替开花:连续开花＝3:1的单显性基因控制规律(甘信民等，1984)。

随着分子生物学的发展，花生性状相关位点的定位工作也取得了长足的进展，从最初的RFLP标记、SSR标记，发展到现在基于芯片和基因组重测序的高密度SNP标记。两个供体野生种基因组的发表及栽培种基因组数据的公布(http://www.peanutbase.org/)，推动了花生的遗传定位的快速发展。基于上述数据的公布，花生开花习性的分子遗传学研究颇丰，印度学者利用TMV2及其突变体TMV2-NLM构建RIL群体定位到分枝模式和开花数量的相关位点，结果表明在B02上的AhTE0357标记与分枝模式、开花数量达到50％的天数以及次级分枝数等性状关联(Pandey MK，2017)。殷冬梅等利用全基因组关联研究(GWAS)对158个花生种质的11个农艺性状进行了分析，结果表明在A10上定位到与总分枝数相关位点(ZhangX et.al，2017)。Mark D.Burow等用A.duranensis和A.cardenasii为亲本构建群体在第六连锁群上LG06上定位到一个主茎开花与否相关的QTL，并解释了44％的表型变异(ChopraR，2018)。

现有的研究未见一个统一认识，还没有针对花生开花习性相关基因位点较为准确的定位与可用于分子标记辅助选择标记的开发。本发明根据遗传规律将花生开花习性分为了单基因和双基因控制的两种遗传模式，并对花生开花习性相关基因在两种模式下进行了定位，分别确定了一套分子标记及其辅助选择的方法。

发明内容：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种对花生开花习性相关基因的分子标记方法，通过检测与花生开花习性相关基因位点连锁的分子标记的基因型，可以对后代个体开花习性等位基因位点及性状进行标记辅助选择；提供花生开花习性育种的分子标记辅助选择的室内检测和表型鉴定筛选的可操作性，提高性状的选择效率、加快育种进度。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

通过对多种交替开花和连续开花品种间杂交后的分离群体的遗传分析，发现交替开花花生与连续开花花生杂交后代通常表现出两种遗传模式：一种是单基因遗传模式；一种是双基因遗传模式。单基因遗传模式是指交替开花和连续开花花生品种间杂交，后代分离群体表现单基因控制的分离规律，例如在不出现偏分离的情况下，F₂群体表现为3交替:1连续分离，重组自交系(Recombinant Inbred Lines,RIL)群体表现为1交替:1连续分离；双基因遗传模式是指交替开花和连续开花花生品种间杂交，后代分离群体表现双基因控制的分离规律，例如在不出现偏分离的情况下，F₂群体表现为15交替:1连续分离，RIL群体为3交替:1连续分离。

根据花生杂交遗传模式的不同，本发明提供一种花生开花习性相关基因位点的分子标记方法，对于单基因遗传模式的花生杂交群体，所述分子标记包括位于第12染色体的InDel标记PID12-21和InDel标记PID12-29；对于双基因遗传模式的花生杂交群体，所述分子标记包括位于第12染色体的InDel标记PID12-21和InDel标记PID12-29以及位于第02染色体的InDel标记PID2-9；其中，所述标记PID12-21的物理位置位于花生参考基因组第12染色体末端，其对应的交替开花花生品种Tifrunner的2kb范围的序列如SEQ ID NO:1所示，其对应的连续开花花生品种狮头企的同源序列如SEQ ID NO:2所示；标记PID12-21的引物对PID12-21-F/R：

PID12-21-F:5`-AAATAATAAAGCCGCTTTAGG-3`(SEQ ID NO:3)，

PID12-21-R:5`-AAGAAGTTTGTCAACCATCCC-3`(SEQ ID NO:4)；

所述标记PID12-29的物理位置位于花生参考基因组的第12染色体末端，其对应的交替开花花生品种Tifrunner的2kb范围的序列如SEQ ID NO:5所示，其对应的连续开花花生品种狮头企的同源序列如SEQ ID NO:6所示；标记PID12-29的引物对PID12-29-F/R：

PID12-29-F:5`-TTAAAATTGTTGTCCCTCAAACTT-3`(SEQ ID NO:7)，

PID12-29-R:5`-ATGGAATAAGTTAGGTAATGATTCT-3`(SEQ ID NO:8)；

所述标记PID2-9的物理位置位于花生参考基因组的第02染色体末端，其对应的交替开花花生品种Tifrunner的2kb范围的序列如SEQ ID NO:9所示，其对应的连续开花花生品种狮头企的同源序列如SEQ ID NO:10所示；标记PID2-9的引物对PID2-9-F/R：

PID2-9-F:5`-AGTGTTCTTCCATCTCCTTTC-3`(SEQ ID NO:11)，

PID2-9-R:5`-ATATTCGGGCATCCGAGTTAT-3`(SEQ ID NO:12)；

SEQ ID NO:1的具体序列如下：

GTCCAAGTTCACCAGACCCTAAACTTAAAACAAGTCTCAAATCATAATGTAATTACTATGGAGGCTTGTTGCTGGGTATGCCAAGCTACAACATCTTTATAAACCATGTTTCCCCCAAAAATGTCCAATGCACTTCCCACGGTGACATCCACGCGCTCCATCCCCGCCATCTTTAACCTCTCTAAATAGTCCATTACAGTCACACCCCCAGCATATGTAACAGGAATCTGATTATGGAAATCAGATTTTAGAATTAAGACACAAAATTGTTAAATGTTTGTTAGAATTTAAGAGAAAAAGGCGCACGCACACGCTAGCACACACAAATCCTATATTTATGGTTATAATTCAGACGACTGAACAACCTTAATGCAAGCTAAGACTTCAATATGCAAGGATAAAGTCAAGGCAGCTTAAGAAAGTTACCAACCAGTTTGAACAGGTTTTGCCTTTTGATGTGATACATATTTTAAACCCTCCAAATATTTTTAGATTTCAGTCCTTGATGCTGCAAGTTCAACAAATTCAAACGGCGACAAGATGGTAGGACCTCATTTGAACAGCAAGCTTTGAGTGGGAACTATCACAGTCAAAAATATCAAAGATGACATTCCATATATTCCAAACTAACAATCAAATCACCAGGAAGAACCTTCATAAACTCATGCATTGGCAAACTTATTCACAGCAGCCGAATATGTGTGTTATTGTGTATTGGGCAAACAGAATTACAGTACAAAATGGTCAAGCACAAAAGCATTCACATTTCACAGCCAACCAATCAATATAAATAATAAAGCCGCTTTAGGGAACATAAGAAAATGATGACAAAAACATAGGCAAGGATTATTACCTTTTCGAAATTCAAATGTGCCTATTTGACCTCCTGGGCATTCTCTTCTTCCCACTGGATGCCAGGGAAAATAAAGACAGCATACAAATCATCTCTTATTCCCCAACTCGAGACCTCCATTCTGTACATGTGCATGCTAAGGACCTTCCAATCTAAGAACTCACACTCCGTTGGGGGCCTCACAGACCTACGGAGGACCCGGGAGGGATGGTTGACAAACTTCTTTGGAACAACCTGAAGAACCAACACAAAGAGGACCTGGTCCTCTTTTTCTTCCTTTGCAGAGCCAGGTACCATAACAATAAACTTGCCTTTGCCATCAAGATCAACAAGCACAGGCGTTTTCTCATAATACAAGGACGGCATTCTATCTAAGCAGCCTTCAAGCCTTTGGAAGAAAAGGACACCCAATTCATCCACCTGGAATGCATATATCACTTTTTTCCCTCCAATGCGTTCGCATGAAAGTGCCAGGTATTTGCCAGGATCAACCAAATCTGTAACAATATACCAATAACAGAATGATGAAGGGTGAAGAGTGAAAATTGCATATTTTACAATAAGACAAAGAAAATCATGTGCAATGCACACTTGGAGAGTAATTATGAATACCTGGAATATGCACCCTTGGAAAAAAGAACCGACGCTGGTCATCGGATGCCAGTGGGACACAAAAAGAACGCGTAAAACTATTGTCACCCTCACTCGTTGTCCAATGTAGGTTATGGGTGTCATAAGAGAAGACGACAACTCTTCCATCTTCGAAACAGAGTCGGATGTATAGCTTACCATAGAAGTCGAACCATGAACTGTGATCAATTCTGGAATGGTAGCCAGGAAGATCAGGAGCATCAGGCAAGTGTTCCCAAACCTTGGTCCCAGAGCGTAGAACCCAAAAATTCTGAGCATCATTGTCGGGTAGGAAACCACCGCGACCACACATCAACATAAAATAATAATCACTTTCGATTTTGTGAAGAGTAGAGAACCCGGAAACAGATAACTCTGGAGCATCATCGATTGATTTCGACTCCTCTAACTCCTTCTTGTCAAGGTCTAGTTCGTAGACTTTATTGCAAGGAGTATAGTAAGCACCATCAAAATAATAACCATAGCTGGACATATATTTGAGACCTCCAACGAGATG；

所述SEQ ID NO:2的具体序列如下：

AAATAACTATTGTGGGAAATTATGATCATATAATGAAAAAAAAGTTAAAAAAACATCACCAAATAGAAGGTTACAAACACGAGAGAAACAATTTCAAGAAGTCCAAGTTCACCAGACCCTAAACTTAAAACAAGTCTCAAATCATAATGTAATTACTATGGAGGCTTGTTGCTGGGTATGCCAAGCTACAACATCTTTATAAACCATGTTTCCCCCAAAAATGTCCAATGCACTTCCCACGGTGACATCCACGCGCTCCATCCCCGCCATCTTTAACCTCTCTAAATAGTCCATTACAGTCACACCCCCAGCATATGTAACAGGAATCTGATTATGGAAATCAGATTTTAGAATTAAGACACAAAATTGTTAAATGTTTGTTAGAATTTAAGAGAAAAAGGCGCACGCACACGCTAGCACACACAAATCCTATATTTATGGTTATAATTCAGACGACTGAACAACCTTAATGCAAGCTAAGACTTCAATATGCAAGGATAAAGTCAAGGCAGCTTAAGAAAGTTACCAACCAGTTTGAACAGGTTTTGCCTTTTGATGTGATACATATTTTAAACCCTCCAAATATTTTTAGATTTCAGTCCTTGATGCTGCAAGTTCAACAAATTCAAACGGCGACAAGATGGTAGGACCTCATTTGAACAGCAAGCTTTGAGTGGGAACTATCACAGTCAAAAATATCAAAGATGACATTCCATATATTCCAAACTAACAATCAAATCACCAGGAAGAACCTTCATAAACTCATGCATTGGCAAACTTATTCACAGCAGCCGAATATGTGTGTTATTGTGTATTGGGCAAACAGAATTACAGTACAAAATGGTCGAGCACAAAAGCATTCACATTTCACAGCCAACCAATCAATATAAATAATAAAGCCGCT TTAGGGAACATAACAAAATGATGACAAAAACATAGGCAAGCATTACTTTTTCGAAGCAAGCATGTTCTAAATTCAAATATGCCTATTTCTTTTTCCTCTCCTGGGCATTCTCTTCTTCCCACTGGATGTCAGGGAAAATAAAGACAGCAGACAAATAATCTCTTATTCCCCACTTCGGGACCTCCATGCTGTACATGTGCATGCTAAGGACCTTCCAATCTAAGAACGCACACTCCGTTGGGGACCTCACAGACCTACGGAGGACCCGGGAGGGATGGTTGACAAACTTCTTTGGAACAACCTGAAGAACCAACACAAAGAGGACCTGGTCCTCTTTTTCTTCCTTTGCAGAGCCAGGTACCATAACAATAAACTTGCCTTTGCCATCAAGATCAACAAGCACAGGCGTTTTCTCATCATACAAGGGCGGCATTCTATCTAAGCAGCCTTCAAGCCTTTGGAAGAAAAGGACACCCAATTCATCCACCTGGAATGCATATATCCTTTTTTTCCCTTCAATGCGTTCGCATGAAAGTGCCAGGTATTTGCCAGGATCAACCAAATCTGTAACAATATACCAATAACAGAATGATGAAGGGTGAAGAGTGAAAATTGCATATTTTACAATAAGACAAAGAAAATCATGTGCAATGCACACTTGGAGAGTAATTATGAATACCTGGAATATGCACCCTTGGAAGAAAGAAGCGACGCTGGTCATCGGATGCCAGTGGGACACAAAAAGAACGCGTAAAACTATTGTCACCCTCACTCGTTGTCCAATGTAGGTTATGGGTGTCATAAGAGAAGACGACAACTCTTCCATCTTCGAAACAGAGTCGGATGTATAGCTTACCATAGAAGTCGAACCATGAACTGTGATCAATTATGGAATGGTAG；

所述SEQ ID NO:5的具体序列如下：

ATTTTGGTCTATAAATTTTAATCCAAACACATACTTAATTATTTATTTAAGATCTATAGATTCATTCTTACAAACAATAACTGTATCACAATCCTATATTAAAGATAATTAAAGATAAATACAAAGAAGGGTGAAAACAATAATAAATTTTAGCGATGAAGCAGCCTTTGGACCGTGTAAATGCCAATAAAGATGGCATTACTTCCGATTTCAATTTGACTCCGATCATTAATTTTGGGATAGTTAGCTCGGATGACAATAAAGGAATATTCTCTCCACGCATATATGCTAGTATTCTTTAGACTACATATTCGAATCCTAAAAAAGATGATGTGAGTTTAAGAGTTTTTTTTTCTATTATAATATGATATTATAATCCATATGCTTACAAGCTCTAAAAATAAGAGAGTACGAGAGAGTACGAGACGAAAGTACTAGAGAAAGAGAGCGACGGAATAAGAAAACACAGGGTGGGTAGAATAAGACAACTACATTACATAGAAAATTCGGCAATTTAAAACCGAAAAAGATACTAGCTTTTGGAGAGTGAATCATTTATATTTTTTGTGGAAAATTTACTGAGTACTCTTTAATCCGAAATTTGTTAAAAAAATAACCTAAAATTTTGTAACATAACTGGAGGACTATTTTTTTAATAGAGTCATCATCATTTATTATTTTGATTACTAGTTAATTAATAATGTTTAAAAATATTAACTAAAAATATAATACTAAATTATTAAATTAAAGATATTGAGTTACTAGTTAAAAATACTTACTAATATAAATTAAAATTGTTGTCCCTCAAACTTTTTTCTCATGCATATTTACTTTTTTTAAAAATGTTATTTGTATATTAAAATCAGTCTAATTATTCTATTTAAAAAATGCTATTTGTATACTAAAATCAGCTTAATGCTATTTAAAAAATGTTATACATTCTAACATTCAAATTTAAGTGACATTGCATTTAAGCTAGCCTAATTATTCTTAGGTATTAAATCAATAAAATAAACTTCTATTTTTTGTATAAACAAGAATCATTACCTAACTTAT TCCATTTGAAGAAATTTTCGTACTCTAAATTATTCAAATTTTGATATTAATGGTTTGATGAATCAGGAGAGATAGAAAAAGAGAAAAATAAATTCTTTTTATTTTGAAAAGAATAAAAAATCCTTCGAAAAATATTTATTGAGTTATCACACTTTATATACTATGTACTCTTTATGTACTCTCATTATAAAAAAAATTACAATCAATAAATCTATATCTATTATTGATAAAAAAAATAATCTAGATATATAACACCATAAAAAAAATTAGTGTGGGATAAATCAACGTGAAATGCCGACTTATAGGTTCTTCAATTTCATTAAATTCTGATTAAAGTGCCGGTAATCTATCGTATTATAACACCTTCAATTTCATGAAATTTGGAAATGAACTCATTTTTATTTGACTTGATGGATTTTAGAGACAAACACAACCCTCAATCCTAAGTACTCTAATGAATTGGATAATTCATAATTCTAGATATACAACACACCCACATACTCTTCACATTTTCTAAACCCAACCGATACCTTATTACTGTCAATCTTAAGTTAGATTCTAAAATTTTAAGGACTATGGTGAAGATGGTCCCCGAGGATCGGATTTCAATTTTTGACGGTAGTGAGTTCCTCTACATTGCTGAATCATTGCCCTTTGAGAACCTTCCCTACTCTTTAACTTCGCCTTGTCTACAACTATATTTACAACTGCTTCTACCAACTTCTTTGCAATTCCCTAAGTATAAAAAAATGTTAAAAATCAGTAGAATCGAGTTATGAATAAAATAAAGTTACAAAAAGAGTTATGGACAGAAGAGTTACATAAGTTATAATAGTGACTATAATAAGTAGGATAAAAGATGACAAAAATAAAAAATGGCACACCTTTCTTCCATGACACTCATTTATGATCTTCACAGCTTCTTCGGGACTAATATGCTCCCA；

所述SEQ ID NO:6的具体序列如下：

AATAAGAGAGTACGAGAGAGTACGAGACGAAAGTACTAGAGAAAGAGAGCGACGGAATAAGAAAACACAGGGTGGGTAGAATAAGACAACTACATTACATAGAAAATTCGGCAATTTAAAACCGAAAAAGATACTAGCTTTTGGAGAGTGAATCATTTATATTTTTTGTGGAAAATTTACTGAGTACTCTTTAATCCGAAATTTGTTAAAAAAATAACCTAAAATTTTGTAACATAACTGGAGGACTATTTTTTTAATAGAGTCATCATCATTTATTATTTTGATTACTAGTTAATTAATAATGTTTAAAAATATTAACTAAAAATATAATACTAAATTATTAAATTAAAGATATTGAGTTACTAGTTAAAAATACTTACTAATATAAATTAAAATTGTTGTCCCTCAAACTTTTTTCTCATGCATATTTACTTTTTTTAAAAATGTTATTTGTATATTAAAATCAGTCTAATTATTCTATTTAAAAAATGCTATTTGTATACTAAAATCAGCTTAATGCTATTTAAAAAATGTTATACATTCTAACATTCAAATTTAAGTGACATTGCATTTTTTTTTTGGTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGTTTGACATTGCATTTAAGCTAGCCTAATTATTCTTAGGTATTAAATCAATAAAATAAACTTCTATTTTTTGTATAAACAAGAATCATTACCTAACTTATTCCATTTGAAGAAATTTTCGTACTCTAAATTATTCAAATTTTGATATTAATGGTTTGATGAATCAGGAGAGATAGAAAAAGAGAAAAATAAATTCTTTTTATTTTGAAAAGAATAAAAAATCCTTCGAAAAATATTTATTGAGTTATCACACTTTATATACTATGTACTCTTTATGTACTCTCATTATAAAAAAAATTACAATCAATAAATCTATATCTATTATTGATAAAAAAAATAATCTAGATATATAACACCATAAAAAAAATTAGTGTGGGATAAATCAACGTGAAATGCCGACTTATAGGTTCTTCAATTTCATTAAATTCTGATTAAAGTGCCGGTAATCTATCGTATTATAACACCTTCAATTTCATGAAATTTGGAAATGAACTCATTTTTATTTGACTTGATGGATTTTAGAGACAAACACAACCCTCAATCCTAAGTACTCTAATGAATTGGATAATTCATAATTCTAGATATACAACACACCCACATACTCTTCACATTTTCTAAACCCAACCGATACCTTATTACTGTCAATCTTAAGTTAGATTCTAAAATTTTAAGGACTATGGTGAAGATGGTCCCCGAGGATCGGATTTCAATTTTTGACGGTAGTGAGTTCCTCTACATTGCTGAATCATTGCCCTTTGAGAACCTTCCCTACTCTTTAACTTCGCCTTGTCTACAACTATATTTACAACTGCTTCTACCAACTTCTTTGCAATTCCCTAAGTATAAAAAAATGTTAAAAATCAGTAGAATCGAG；

所述SEQ ID NO:9的具体序列如下：

ACATTTATCATGAAAATGTATTTTCCATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATGTGCCCAAACAATAATATTTTTTATTTTTTTCAAAGATAATAAATTATATTTCATTAATTATTAAAAAATAAAATATAAAAATGTTTAAAAACAAGACAACATAATAAAAAATAGGAATCTCTTAAAACAATACATTAAAAATATTTATCTAACAGTGTATAGTCAAAAATTAAGAAAAATTAAAAAAAATAAATCAAATTAAATGAAACTAAAAATTTTTTTTGTAAAGACGACGAACTAAGATAAAATTATTTACAAATTTCATAGAATAACTTGACCAAGCCTCAAAGATTATTTTTAGCATTAGTGCACATTTGATTACTAATTTATGAAAAAAAAAGGAAACAAAAATTAATCTATGTCAAATATAAATAAATAAAACAAAACTCTAAATTGAAATAATTTAACATTAAATTATTTAAAAAAAAAAAGCTTTTGATCACATCAACAACTATATATCTTCTCATGATGCAATGACTAAAGTCTAAAACTCCTTAACTTTGAGTTTTCAAATTCATAATGCATGCTGAGAATGAGATCTTTTTAAAGTCTTTGACTTTGAGAGAGTGTTTTAAATTCATTCTAGAAGACACAACAATACATATTGGAGTATTGATCATAACACAAAATAATAAAGCAACCTTATTCATACGTGTTCCATATTTGATGACCACACAAATTAGGAGTGTGGTCTGCCACTTTATGAAATGTGTTGTTTAACTTCTCCATAACCAATCATGACACATCCTTGTGGATGTATACATAAAGTTTTAATATGTGAACCTTAGTGTTCTTCCATCTCCTTTCAACTTAATTAGTCAAACCCTATCATCATGTCATATTTCTATCACAACAAAATAGGGTTTCATTAATAATGTTACTTATTAAGACCTCTCATCACTTCTCTATGCCACTCAATAACTTTGTGGTTCCTATAGTAATAATAATAGTGATAATGGATTATTATAACTCGGATGCCCGAATATGCCTAAACAATTGTGTTGACTATCTTCTATAAAATCACTTATATAAAAAAATTAAATTATAAAAATTATAAAAATTTATATCTCACTCTAATATTTTTTTAAAATTTTTTTTCTTTTTGAGTTTGCTTAAATTATCTATAGTTCTTTTCCATTTCCCTTTTCTTGTTTTGCTTTATGAAGACCACTTCAATAAAGATACTAAAAATGTCTTCTTTTTTTTAAGACGTTTATATGTGTCATGATATTATTTTACATATTTATTAAACCGGTTAATAATTTATTTTTTAAGAAACCAGAACAAAATCGATTTATTATAGCAACAATAATAAACTCAATTGTTCGCATTATAATTATTAGACCCGATTTGATTCGATCGATTTACATAATCTAAACCGAATCATATTTAAATTTTTGATAAAAAAATAAATATATTCCTAATTTTTGTTTAAAAAAATGATCCAGTGATCTGATAACAATTGCATTTATTGTTATTGTTATAAAAAAATTAGTTTTATTCTAATTTGTTAAGAAATTAAAAAATAACCGGTTCATTAATATGTCTAATAATAATGAGACACATAAATGTCTTTACAAAAAGATGTTTTACGCATTTTTATGGGAGCATCCTCTTGCTTTATATATGCTGATTTTTTTTAAAATTAATAAAATTAAATATTAAACTTTTTTTATCATCATAAAAACTCCTAATAATTTAAGTTGATAAAAATATAAATAAATAATTATTATATTTTTAATTATTACCTACATTTAATTGTATAAAAATAAAACTATTAATTTAAATGTTGAAATATCTTTCACATATATCTTTCGATCTTACTATTACATATATGATCAAAGAACTTATGCCGACCAAAGACCTTGT；

所述SEQ ID NO:10的具体序列如下：

ATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATGTGCCCAAACAATAATATTTTTAATTTTTTTCAAAGATAATAAATTATATTTCATTAATTATTAAAAAATAAAATATAAAAATGTTTAAAAACAAGACAACATAATAAAAAATAGGAATCTCTTAAAACAATACATTAAAAATATTTATCTAACAGTGTATAGTCAAAAATTAAGAAAAATTAAAAAAAATAAATCAAATTAAATGAAACTAAAATTTTTTTTTGTAAAGACGACGAACTAAGATAAAATTATTTACAAATTTCATAGAATAACTTGACCAAGCCTCAAAGATTATTTTTAGCATTAGTGCACATTTGATTACTAATTTATGAAAAAAAAAGGAAACAAAAATTAATCTATGTCAAATATAAATAAATAAAACAAAACTCTAAATTGAAATAATTTAACATTAAATTATTTAAAAAAAAAGCTTTTGATCACATCAACAACTATATATCTTCTCATGATGCAATGACTAAAGTCTAAAACTCCTTAACTTTGAGTTTTCAAATTCATAATGCATGCTGAGAATGAGATCTTTTTAAAGTCTTTGACTTTGAGAGAGTGTTTTAAATTCATTCTAGAAGACACAACAATACATATTGGAGTATTGATCATAACACAAAATAATAAAGCAACCTTATTCATACGTGTTCCATATTTGATGACCACACAAATTAGGAGTGTGGTCTGCCACTTTATGAAATGTGTTGTTTAACTTCTCCATAACCAATCATGACACATCCTTGTGGATGTATACATAAAGTTTTAATATGTGAACCTTAGTGTTCTTCCATCTCCTTTCAACTTAATTAGTCAAACCCTATCATGTCATATTTCTATCACAACAAAATAGGGTTTCATTTAGTTTCACATCTAATAATGTTACTTATTAAGACCTCTCATCACTTCTCTATGCCACTCAATAACTTTGTGGTTCCTATAGTAATAATAATAGTGATAATGGATTATTATAACTCGGATGCCCGAATATGCCTAAACAATTGTGTTGACTATCTTCTATAAAATCACTTATATAAAAAAATTAAATTATAAAAATTATAAAAATTTATATCTCACTCTAATATTTTTTTAAAATTTTTTTTCTTTTTGAGTTTGCTTAAATTATCTATAGTTCTTTTCCATTTCCCTTTTCTTGTTTTGCTTTATGAAGACCACTTCAATAAAGATACTAAAAATGTCTTCTTTTTTTTAAGACGTTTATATGTGTCATGATATTATTTTACATATTTATTAAACCGGTTAATAATTTATTTTTTAAGAAACCAGAACAAAATCGATTTATTATAGCAACAATAATAAACTCAATTGTTCGCATTATAATTATTAGACCCGATTTGATTCGATCGATTTACATAATCTAAACCGAATCATATTTAAATTTTTGATAAAAAAATAAATATATTCCTAATTTTTGTTTAAAAAAATGATCCAGTGATCTGATAACAATTGCATTTATTGTTATTGTTATAAAAAAATTAGTTTTATTCTAATTTGTTAAGAAATTAAAAAATAACCGGTTCATTAATATGTCTAATAATAATGAGACACATAAATGTCTTTACAAAAAGATGTTTTACGCATTTTTATGGGAGCATCCTCTTGCTTTATATATGCTGATTTTTTTTAAAATTAATAAAATTAAATATTAAACTTTTTTTATCATCATAAAAACTCCTAATAATTTAAGTTGATAAAAATATAAATAAATAATTATTATATTTTTAATTATTACCTACATTTAATTGTATAAAAATAAAACTATTAATTTAAATGTTGAAATATCTTTCACATATATCTTTCGATCTTACTATTACATATATGATCAAAGAACTTATGCCGACCAAAGACCTTGT。

本发明还提供一种单基因遗传模式花生群体开花习性相关基因位点辅助选择标记的应用，具体为：以交替开花亲本、连续开花亲本及其杂交后代的基因组DNA为模板，用标记PID12-21的引物对、标记PID12-29的引物对中的一对引物或两对引物对上述模板进行PCR扩增和凝胶检测，根据杂交后代个体的扩增产物大小与亲本的扩增产物大小比较判定个体标记的基因型，进而判定开花习性相关基因的基因型及该个体的开花习性性状；若后代个体的标记扩增大小与交替开花亲本大小一样，则该个体开花习性相关基因的基因型是交替开花亲本型，其表型即为交替开花；若后代个体的标记扩增大小与连续开花亲本大小一样，则该个体开花习性相关基因的基因型是连续开花亲本型，其表现即为连续开花；鉴于交替对连续为显性，因而当后代个体的标记扩增产物为父母本条带都有，则该个体开花习性相关基因的基因型是杂合型，该个体的表型为交替型。

本发明涉及的单基因遗传模式花生群体开花习性相关基因位点辅助选择标记的应用中，采用标记PID12-21判定后代个体表型和基因型的吻合度的准确率约为95.22％，重组率约为4.78％；标记PID12-29判定后代个体表型和基因型的吻合度的准确率约为93.71％，重组率约为6.29％；同时利用标记PID12-21和标记PID12-29两个分子标记的判定后代个体表型和基因型的吻合度的准确率超过99.70％，错误率约为0.30％。

本发明还提供一种双基因遗传模式花生群体开花习性相关基因位点辅助选择标记的应用，具体为：分别用标记PID2-9对第02染色体上的开花习性相关位点进行基因型判定，用标记PID12-21或PID12-29对第12染色体上的开花习性相关位点进行基因型判定；用上述标记的上下游引物对交替亲本、连续亲本及其杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增和凝胶检测，根据杂交后代个体的扩增产物大小与亲本的比较判定个体标记的基因型，进而判定标记连锁区域开花习性相关基因的基因型；若后代个体的标记扩增产物大小与交替亲本的标记扩增产物大小一样，则该位点的基因型是交替亲本型；若后代个体的标记扩增产物大小与连续亲本的标记扩增产物大小一样，则该位点的基因型是连续亲本型；若后代个体的标记扩增产物为父母本条带都有，则该位点的基因型是杂合型；双基因遗传模式的杂交组合群体中的后代个体的表型判定需要综合考虑第02染色体和第12染色体开花习性基因的基因型，当第02染色体和第12染色体中任一个染色体上存在交替开花型位点或同时存在交替开花型位点，则后代个体均表现为交替开花；当第02染色体和第12染色体同时为连续开花位点，则后代个体才能表现为连续开花。

本发明涉及的双基因遗传模式花生群体开花习性相关基因位点辅助选择标记的应用中，标记PID2-9对后代个体第02染色体上开花习性相关位点基因型的判定准确率约为90.0％，重组率约为10.0％；标记PID12-21对后代个体第12染色体上开花习性相关位点基因型的判定准确率约为95.22％，重组率约为4.78％；标记PID12-29对后代个体第12染色体上开花习性相关位点基因型的判定准确率约为93.71％，重组率约为6.29％；同时利用PID12-21和PID12-29判定后代个体第12染色体上开花习性相关位点基因型的准确率超过99.70％，错误率低于0.30％。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明花生开花习性相关的基因位点的InDel标记，是一种明确、精细、快速的鉴定方法，选择效率高，只需鉴定扩增的目的条带的基因型，就能够将花生的连续开花型和交替开花型区分开，快速筛选花生杂交后代开花习性的类型，辅助与开花习性相关的株型育种、产量育种等。

(2)标记辅助选择育种选择目标明确，节约成本，不受环境影响。标记辅助选择育种加快育种速度，提高育种的效率。

附图说明：

图1为本发明涉及的花生开花习性模式图，其中A图为连续开花型，B图为交替开花型。

图2为本发明涉及的标记PID12-21在平度9616和Florunner及其RIL-PF群体中的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳带型图。

图3为本发明涉及的标记PID12-21在小红毛和河南南阳及其RIL-HN群体中的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳带型图。

图4为本发明涉及的PID12-29的平度9616和Florunner及其RIL-PF群体中8％聚丙烯酰胺凝胶电泳带型图。

图5为本发明涉及的PID12-29在小红毛和河南南阳及其RIL-HN群体中8％聚丙烯酰胺凝胶电泳带型图。

图6为本发明涉及的标记PID2-9在小红毛和河南南阳及其RIL-HN群体中8％聚丙烯酰胺凝胶电泳带型图。

图7为本发明涉及的RIL-PF-F₇群体第12染色体局部连锁图，其中圆点为目标位点。

图8为本发明涉及的RIL-HN-F₈群体第02和12染色体局部连锁图，其中圆点为目标位点。

具体实施方式：

下面通过实施例和说明书附图对本发明做进一步说明。

实施例1：单基因遗传模式杂交群体开花习性相关基因位点的遗传定位

(一)材料与方法：

(1)植物材料和遗传群体的构建：以青岛农业大学花生中心实验室保存的连续开花型栽培花生平度9616、交替开花型栽培花生Florunner为试材，连续开花型栽培花生平度9616与交替开花型栽培花生Florunner杂交，种植杂交种F₁，自交获得F₂分离群体，连续多代株系自交繁育，最终形成F₇代重组自交系RIL-PF-F₇。

(2)用改良的CTAB法提取群体基因组DNA(具体参照《分子克隆实验指南》)。

(3)多态性InDel标记开发：根据Florunner和平度9616的转录组测序数据和另外两个青岛农业大学花生中心实验室保存的花生材料小红毛和南阳花生基因组重测序的数据以及在NCBI网站上下载Tifrunner和狮头企的参考基因组，在花生第12染色体上开发了若干个InDel标记，以Florunner与平度9616花生的DNA为模板，用新开发的InDel标记分别对上述模板在PCR仪上进行PCR扩增，将扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，取1-1.5μL扩增产物进行电泳检测，电压为300V，电流为280mA进行电泳检测1-1.5小时，其中电泳时间长短可根据目标片段大小进行适度调节。将聚丙酰胺凝胶进行固定、渗透、漂洗和显色，使凝胶银染显影。筛选出条带清晰，亲本间条带大小有差异的多态性标记7个(表1)，用于后续遗传图谱的构建。

表1 PF群体中第12染色体所用标记的引物

其中，PCR反应体系为10μl，其中2×Taq Master Mix for PAGE 12.5μl，模板1μl，10μM上下游引物各0.5μl，补充加ddH₂O至10μl；PCR反应程序为DNA 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min。PCR反应体系及程序可以根据扩增酶及PCR仪等做适当调整。

(4)用7个有多态的InDel标记对PF-F₅全群体个体进行基因分型，根据基因型资料构建花生的第12染色体的遗传图谱，利用软件QTL IciMapping v4.0提供的遗传图谱模块，采用LOD＝3.0为阈值进行遗传图谱构建，利用该软件中定位模块进行基因定位。

(6)初定位采用BSR-seq的方法。

(二)结果与分析

(1)群体分离规律分析

对平度9616×Florunner(PF)组合杂交F₇代群体的开花习性表型调查表明：交替型256株，连续型149株，而交替分枝且连续分枝型为35株，连续开花型：交替开花型为256:184。PF群体的开花习性的遗传分离比接近3:2。考虑到群体构建过程中有一定的损失及偏分离情况，连续交替的比例近似于1:1，因此推测PF组合群体中，开花习性受一对基因控制。

(2)栽培花生开花习性相关基因位点的初定位

选用亲本平度9616、Florunner及平度9616×Florunner(RIL-PF)群体F₅代群体中60个极端个体用于转录组测序，选用RIL-PF-F₅群体中60个极端个体用于转录组测序，其中选择30个连续开花并匍匐的花生植株(称为PL池)和30个交替开花并直立的花生植株(称为ZJ池)，对亲本和选取的株系共62个样品的旺花期侧枝茎端分别进行转录组测序。通过转录组测序及测序质量的评估以及SNP位点的获取和筛选，并通过对两个混池的ΔSNP-index的连锁分析，将控制花生开花习性相关基因位点定位在了花生第12染色体的末端117,682,534bp到119,846,824bp范围内，共得到1个区域，总长度为2.16Mb。

(3)RIL-PF-F₇群体中开花习性相关基因位点的精细定位

根据亲本转录组测序数据和基因组重测序(小红毛、南阳花生)的数据以及在NCBI网站上下载Tifrunner和狮头企的参考基因组，在第12染色体开发了若干个InDel标记，通过对InDel标记的分析，获得了7个InDel标记在平度9616和Florunner两亲本间表型具有良好的共显性差异(表1)。用7个有多态的InDel标记对平度9616×Florunner群体F₇代群体中445个个体详细的进行基因分型。根据InDel标记的基因分型，构建了第12染色体的分子标记遗传图谱(物理距离3Mb，遗传距离26.81cM)(见图7)。利用PF-F₇群体构建的第12染色体的分子标记遗传图谱发现在染色体末端上定位到与开花习性相关的位点，该位点位于第12染色体末端的标记PID12-21和PID12-29之间，其间的遗传距离为：10.94cM，贡献率为85.00％，LOD值479.56。这一结果与BSR-Seq的定位结果一致。

实施例2：单基因遗传模式群体开花习性相关基因位点辅助选择标记的开发与应用

以实施例1中平度9616、Florunner及其RIL-PF-F₇群体个体的基因组DNA为模板，在PCR仪上用标记PID12-21的引物对、PID12-29的引物对中的一对引物或两对引物对上述模板进行PCR扩增，取1-1.5μL扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电压为300V，电流为280mA进行电泳检测1-1.5小时，其中电泳时间长短可根据目标片段大小进行适度调节，最后将聚丙酰胺凝胶进行固定、渗透、漂洗和显色，使凝胶银染显影。

标记PID12-21的物理位置位于花生参考基因组Tifrunner的第12染色体末端，其对应的2kb范围的序列如SEQ ID NO:1所示(具体为Tifrunner.gnm2.Arahy.12:119016937..119018936)；其对应的连续开花花生品种狮头企的同源序列如SEQ ID NO:2所示；标记PID12-21优选的引物对为PID12-21-F/R：

PID12-21-F:5`-AAATAATAAAGCCGCTTTAGG-3`(SEQ ID NO:3)，

PID12-21-R:5`-AAGAAGTTTGTCAACCATCCC-3`(SEQ ID NO:4)；

标记PID12-29的物理位置位于花生参考基因组Tifrunner的第12染色体末端，其对应的2kb范围的序列如SEQ ID NO:5所示(具体为Tifrunner.gnm2.Arahy.12:119907229..119909228)；其对应的连续开花花生品种狮头企的同源序列如SEQ ID NO:6所示；InDel标记PID12-29的引物对优选为PID12-29-F/R：

PID12-29-F:5`-TTAAAATTGTTGTCCCTCAAACTT-3`(SEQ ID NO:7)，

PID12-29-R:5`-ATGGAATAAGTTAGGTAATGATTCT-3`(SEQ ID NO:8)；

PCR反应体系为10μl，其中2×Taq Master Mix for PAGE 12.5μl，模板1μl，10μM上下游引物各0.5μl，补充加ddH₂O至10μl；PCR反应程序为DNA 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

根据电泳检测结果进行后代个体的分子标记的基因型判定，将分子标记的引物对在杂交后代个体的扩增产物大小与该分子标记的引物对在亲本的扩增产物大小相比较判定后代个体的分子标记的基因型，进而判定标记连锁区域开花习性相关基因的基因型，根据扩增产物的基因型进行后代个体的选择。

当采用标记PID12-21的引物对时，标记PID12-21的引物对在亲本及RIL-PF-F₇群体中的电泳检测结果见图2，标记PID12-21的引物对在交替型花生亲本Florunner中的扩增产物为290bp一条带，在连续型亲本平度9616中扩增产物为308bp一条带；若后代个体的扩增产物为290bp一条带，则该个体的标记PID12-21的基因型为交替亲本Florunner型，对应的表型为交替开花；若后代个体的扩增产物为308bp一条带，则该个体的标记PID12-21的基因型为连续亲本平度9616型，对应的表型为连续开花；若后代个体的扩增产物为290bp和308bp的两条带，则该个体的标记PID12-21的基因型为杂合型，鉴于交替对连续为显性，因而当PID12-21的基因型是杂合型时，该个体表型为交替型；采用标记PID12-21判定后代个体表型与基因型间的吻合度的准确率约为95.22％，重组率约为4.78％。

当采用标记PID12-29的引物对时，标记PID12-29的引物对在亲本及RIL-PF-F₇群体中的电泳检测结果见图4，其在交替型花生亲本Florunner中扩增产物为273bp，在连续型亲本平度9616中扩增产物为352bp；若后代个体的扩增产物为273bp一条带，则该个体的标记PID12-29的基因型为交替亲本Florunner型，对应的表型为交替开花；若后代个体的扩增产物为352bp一条带，则该个体的标记PID12-29的基因型为连续亲本平度9616型，对应的表型为连续开花；若后代个体的扩增产物为273bp和352bp的两条带，则该后代个体的标记PID12-29的基因型为杂合型，鉴于交替对连续为显性，因而当PID12-29的基因型是杂合型时，该个体表型为交替开花。采用标记PID12-29判定后代个体表型与基因型间的吻合度的准确率约为93.71％，重组率约为6.29％。

同时利用标记PID12-21和标记PID12-29两个分子标记判定后代个体表型与基因型间的吻合度的准确率超过99.70％，错误率约为0.30％。

实施例3：双基因遗传模式杂交群体开花习性相关基因位点的遗传定位

(一)材料与方法：

(1)以青岛农业大学花生中心实验室保存的交替开花型栽培花生小红毛与连续开花型栽培花生河南南阳为亲本，进行杂交，种植杂交种F₁，自交获得F₂分离群体，连续多代株系自交繁育，最终形成F₈代重组自交系RIL-HN-F₈。

(2)用改良的CTAB法提取群体基因组DNA(具体参照《分子克隆实验指南》)。

(3)多态性InDel标记开发：根据小红毛和河南南阳花生基因组重测序的数据以及在NCBI网站上下载Tifrunner和狮头企的参考基因组，在花生第02和第12染色体上开发了若干对InDel标记，以小红毛和河南南阳花生的DNA为模板，用新开发的InDel标记分别对上述模板在PCR仪上进行PCR扩增，将扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，取1-1.5μL扩增产物进行电泳检测，电压为300V，电流为280mA进行电泳检测1-1.5小时(其中电泳时间长短可根据目标片段大小进行适度调节)。将聚丙酰胺凝胶进行固定、渗透、漂洗和显色，使凝胶银染显影。筛选出条带清晰，亲本间条带大小有差异的多态性标记分别第02染色体5个，第12染色体7个(表2)，用于后续遗传图谱构建。

其中，PCR反应体系为10μl，其中2×Taq Master Mix for PAGE 12.5μl，模板1μl，10μM上下游引物各0.5μl，补充加ddH2O至10μl；PCR反应程序为DNA 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火15s(退火温度根据情况适当调整)，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min。体系及程序可以根据扩增酶及PCR仪等做适当调整。

(4)遗传图谱的构建和位点定位，分别采用Icimapping4.0软件的构图模块和定位模块。

表2 HN群体所用的第02和第12染色体标记的引物

(二)结果与分析

(1)群体分离规律分析

对小红毛×河南南阳(HN)组合杂交构建的RIL-HN-F₈代群体的开花习性表型调查发现：交替开花型153株，连续开花型30株，而交替分枝且连续分枝型为23株。将交替分枝且连续分枝型为23株看成连续开花型时，RIL-HN-F₈群体中交替开花型：连续开花型为153：53。HN群体中交替开花型：连续开花型约为3:1(x2＝0.059,p值为0.7)，初步判断在HN群体中存在两个位点差异调控开花习性。

(2)RIL-HN-F₈群体中开花习性相关基因位点的精细定位

根据实施例1和2中RIL-PF-F₇的定位结果，及花生异源四倍体的情况，推测HN群体在第02和第12染色体可能存在控制开花习性的两个同源位点。为了验证这一推测，我们利用小红毛和南阳花生的基因组重测序结果开发了HN组合第02和第12染色体上的InDel标记，对河南南阳×小红毛RIL-HN-F₈群体中202个个体详细的分析了目标区和同源区的12个InDel标记的基因型，即第02染色体5个和第12染色体7个(表2)。根据InDel标记的基因分型，构建了第02染色体(物理距离26.92Mb，遗传距离36.45cM)和第12染色体(物理距离3.17Mb，遗传距离26.3cM)的目标区局部遗传图谱(图8)。通过遗传定位发现，果然在两条染色体上各存在一个影响开花习性的位点。

通过对两条染色体的验证，发现在第02和第12染色体末端上均定位到与开花习性相关的位点。开花习性位点统计表明第02染色体定位在PID2-9之后，贡献率10.66％，LOD值为4.72；第12染色体定位于PID12-21和PID12-29之间，贡献率为47.73％，LOD值为1373.39。其中第02染色体的贡献率较低，这可能是02染色体上的标记偏分离，导致偏分离的标记在第02染色体上成簇出现，形成了偏分离的热点区域，进而影响了位点定位效果。可见，HN群体中开花习性性状确实在第2染色体存在同源位点。这一验证结果，也印证了HN群体接近3(交替开花型):1(连续开花型)的分离现象，且交替型为完全显性，以及解释了第12染色体验证过程中出现的矛盾个体。

实施例4：双基因遗传模式杂交群体中开花习性相关基因位点辅助选择标记的开发及应用

针对双基因遗传模式的杂交组合群体，鉴于花生是异源四倍体，而实施例3研究发现花生开花习性的双基因遗传模式是AB两套亚基因组上各自有一个同源基因位点差异引起的，因此对于双基因遗传模式的花生品种，同时针对第02染色体(A亚基因组)和第12染色体(B亚基因组)上的开花习性相关位点进行分子标记辅助选择。

以实施例3中交替开花型栽培花生小红毛、连续开花型栽培花生河南南阳及RIL-HN-F₈群体的基因组DNA为模板，在PCR仪上用分子标记的引物对对上述模板进行PCR扩增，将扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，取1-1.5μL扩增产物进行电泳检测，电压为300V，电流为280mA进行电泳检测1-1.5小时，其中电泳时间长短可根据目标片段大小进行适度调节。将聚丙酰胺凝胶进行固定、渗透、漂洗和显色，使凝胶银染显影。

所述分子标记包括用于第02染色体上开花习性相关位点的分子标记辅助选择的标记PID2-9以及用于第12染色体上开花习性相关位点的分子标记辅助选择的标记PID12-21和标记PID12-29中的一个或两个，具体为：

标记PID2-9的物理位置位于花生参考基因组Tifrunner的第02染色体末端，其对应的2kb范围的序列如SEQ ID NO:9所示(具体为Tifrunner.gnm2.Arahy.02:100608264..100610263)；其对应的连续开花花生品种狮头企的同源序列如SEQ ID NO:10所示，标记PID2-9的优选引物对为PID2-9-F/R：

PID2-9-F:5`-AGTGTTCTTCCATCTCCTTTC-3`(SEQ ID NO:11)，

PID2-9-R:5`-ATATTCGGGCATCCGAGTTAT-3`(SEQ ID NO:12)；

标记PID12-21的物理位置位于花生参考基因组Tifrunner的第12染色体末端，其对应的2kb范围的序列如SEQ ID NO:1所示(具体为Tifrunner.gnm2.Arahy.12:119016937..119018936)；其对应的连续开花花生品种狮头企的同源序列如SEQ ID NO:2所示；标记PID12-21优选的引物对为PID12-21-F/R：

PID12-21-F:5`-AAATAATAAAGCCGCTTTAGG-3`(SEQ ID NO:3)，

PID12-21-R:5`-AAGAAGTTTGTCAACCATCCC-3`(SEQ ID NO:4)；

标记PID12-29的物理位置位于花生参考基因组Tifrunner的第12染色体末端，其对应的2kb范围的序列如SEQ ID NO:5所示(具体为Tifrunner.gnm2.Arahy.12:119907229..119909228)；其对应的连续开花花生品种狮头企的同源序列如SEQ ID NO:6所示；InDel标记PID12-29的引物对优选为PID12-29-F/R：

PID12-29-F:5`-TTAAAATTGTTGTCCCTCAAACTT-3`(SEQ ID NO:7)，

PID12-29-R:5`-ATGGAATAAGTTAGGTAATGATTCT-3`(SEQ ID NO:8)。

上述引物对为优选引物，但不仅限于此，但凡围绕交替开花品种和连续开花品种该片段中心差异区域能够进行PCR扩增和凝胶检测的引物对均可采用。

PCR反应体系为10μl，其中2×Taq Master Mix for PAGE 12.5μl，模板1μl，10μM上下游引物各0.5μl，补充加ddH₂O至10μl；PCR反应程序为DNA 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min。扩增体系及程序可以根据扩增酶、引物特性及PCR仪等做适当调整。

根据电泳检测结果进行后代个体的分子标记的基因型判定，将分子标记的引物对在杂交后代个体的扩增产物大小与该分子标记的引物对在亲本的扩增产物大小相比较判定后代个体的分子标记的基因型，进而判定标记连锁区域开花习性相关基因的基因型，根据扩增产物的基因型进行后代个体的选择。

对第02染色体上开花习性相关位点的基因型判定：标记PID2-9在交替开花型品种小红毛中扩增产物为200bp的条带，在连续型品种河南南阳中扩增产物为213bp(见图6)；若后代个体中标记PID2-9的扩增产物为200bp的条带，则该个体第02染色体开花习性基因的基因型为小红毛型的交替型；若后代个体中标记PID2-9的扩增产物为213bp，则该个体第02染色体开花习性基因的基因型为河南南阳型的连续型；如果后代个体中标记PID2-9的扩增产物为200bp和213bp的两条带，则该个体的第02染色体开花习性基因的基因型即为杂合型；采用标记PID2-9对第02染色体上开花习性相关位点进行基因型判定的准确率为90.0％，重组率为10.0％。

对第12染色体上开花习性相关位点的基因型判定：

当采用标记PID12-21的引物对时，标记PID12-21的引物对在交替型花生小红毛中扩增产物为308bp和290bp的两条带，在连续型品种河南南阳中扩增产物为308bp的一条带(见图3)；若后代个体中标记PID12-21的扩增产物为308bp的一条带，则该个体对应的第12染色体上的开花习性相关基因位点的基因型为河南南阳的连续型；若后代个体中标记PID12-21的扩增产物为308bp和290bp的两条带，则该个体对应的第12染色体上的开花习性相关基因位点的基因型为纯合小红毛型交替型或杂合型交替型；标记PID12-21对第12染色体上开花习性相关位点进行基因型判定的准确率约为95.22％，重组率约为4.78％；

当采用标记PID12-29的引物对时，标记PID12-29的引物对在小红毛中扩增产物为273bp和325bp的两条带，在连续型品种河南南阳中扩增产物为325bp的一条带(见图4)；若后代个体中标记PID12-29的扩增产物为325bp的一条带，则该个体对应的第12染色体上的开花习性相关基因位点的基因型为河南南阳的连续型；若后代个体中标记PID12-29的扩增产物为273bp和325bp的两条带时，则该个体对应的第12染色体上的开花习性相关基因位点的基因型为纯合小红毛型交替型或杂合型交替型；标记PID12-29对第12染色体上开花习性相关位点进行基因型判定的准确率约为93.71％，重组率约为6.29％；

当同时利用标记PID12-21和PID12-29对第12染色体上开花习性相关位点进行基因型判定时的准确率超过99.70％，错误率为0.30％。

在双基因遗传模式群体中，后代个体的表型需要综合考虑第02染色体和第12染色体的开花习性基因的基因型，当第02染色体和第12染色体中任一个染色体上存在交替开花型位点或同时为交替开花型，不论是纯合交替开花型还是杂合交替开花型时，后代个体均表现为交替开花；当第02染色体和第12染色体同时为连续开花位点时，后代个体才能表现为连续开花；当第02染色体和第12染色体的基因型均为杂合型时，后代个体为交替开花。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种花生开花习性相关基因位点的分子标记方法及其应用

<130> 20200401

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtccaagttc accagaccct aaacttaaaa caagtctcaa atcataatgt aattactatg 60

gaggcttgtt gctgggtatg ccaagctaca acatctttat aaaccatgtt tcccccaaaa 120

atgtccaatg cacttcccac ggtgacatcc acgcgctcca tccccgccat ctttaacctc 180

tctaaatagt ccattacagt cacaccccca gcatatgtaa caggaatctg attatggaaa 240

tcagatttta gaattaagac acaaaattgt taaatgtttg ttagaattta agagaaaaag 300

gcgcacgcac acgctagcac acacaaatcc tatatttatg gttataattc agacgactga 360

acaaccttaa tgcaagctaa gacttcaata tgcaaggata aagtcaaggc agcttaagaa 420

agttaccaac cagtttgaac aggttttgcc ttttgatgtg atacatattt taaaccctcc 480

aaatattttt agatttcagt ccttgatgct gcaagttcaa caaattcaaa cggcgacaag 540

atggtaggac ctcatttgaa cagcaagctt tgagtgggaa ctatcacagt caaaaatatc 600

aaagatgaca ttccatatat tccaaactaa caatcaaatc accaggaaga accttcataa 660

actcatgcat tggcaaactt attcacagca gccgaatatg tgtgttattg tgtattgggc 720

aaacagaatt acagtacaaa atggtcaagc acaaaagcat tcacatttca cagccaacca 780

atcaatataa ataataaagc cgctttaggg aacataagaa aatgatgaca aaaacatagg 840

caaggattat taccttttcg aaattcaaat gtgcctattt gacctcctgg gcattctctt 900

cttcccactg gatgccaggg aaaataaaga cagcatacaa atcatctctt attccccaac 960

tcgagacctc cattctgtac atgtgcatgc taaggacctt ccaatctaag aactcacact 1020

ccgttggggg cctcacagac ctacggagga cccgggaggg atggttgaca aacttctttg 1080

gaacaacctg aagaaccaac acaaagagga cctggtcctc tttttcttcc tttgcagagc 1140

caggtaccat aacaataaac ttgcctttgc catcaagatc aacaagcaca ggcgttttct 1200

cataatacaa ggacggcatt ctatctaagc agccttcaag cctttggaag aaaaggacac 1260

ccaattcatc cacctggaat gcatatatca cttttttccc tccaatgcgt tcgcatgaaa 1320

gtgccaggta tttgccagga tcaaccaaat ctgtaacaat ataccaataa cagaatgatg 1380

aagggtgaag agtgaaaatt gcatatttta caataagaca aagaaaatca tgtgcaatgc 1440

acacttggag agtaattatg aatacctgga atatgcaccc ttggaaaaaa gaaccgacgc 1500

tggtcatcgg atgccagtgg gacacaaaaa gaacgcgtaa aactattgtc accctcactc 1560

gttgtccaat gtaggttatg ggtgtcataa gagaagacga caactcttcc atcttcgaaa 1620

cagagtcgga tgtatagctt accatagaag tcgaaccatg aactgtgatc aattctggaa 1680

tggtagccag gaagatcagg agcatcaggc aagtgttccc aaaccttggt cccagagcgt 1740

agaacccaaa aattctgagc atcattgtcg ggtaggaaac caccgcgacc acacatcaac 1800

ataaaataat aatcactttc gattttgtga agagtagaga acccggaaac agataactct 1860

ggagcatcat cgattgattt cgactcctct aactccttct tgtcaaggtc tagttcgtag 1920

actttattgc aaggagtata gtaagcacca tcaaaataat aaccatagct ggacatatat 1980

ttgagacctc caacgagatg 2000

<210> 2

<211> 1804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaataactat tgtgggaaat tatgatcata taatgaaaaa aaagttaaaa aaacatcacc 60

aaatagaagg ttacaaacac gagagaaaca atttcaagaa gtccaagttc accagaccct 120

aaacttaaaa caagtctcaa atcataatgt aattactatg gaggcttgtt gctgggtatg 180

ccaagctaca acatctttat aaaccatgtt tcccccaaaa atgtccaatg cacttcccac 240

ggtgacatcc acgcgctcca tccccgccat ctttaacctc tctaaatagt ccattacagt 300

cacaccccca gcatatgtaa caggaatctg attatggaaa tcagatttta gaattaagac 360

acaaaattgt taaatgtttg ttagaattta agagaaaaag gcgcacgcac acgctagcac 420

acacaaatcc tatatttatg gttataattc agacgactga acaaccttaa tgcaagctaa 480

gacttcaata tgcaaggata aagtcaaggc agcttaagaa agttaccaac cagtttgaac 540

aggttttgcc ttttgatgtg atacatattt taaaccctcc aaatattttt agatttcagt 600

ccttgatgct gcaagttcaa caaattcaaa cggcgacaag atggtaggac ctcatttgaa 660

cagcaagctt tgagtgggaa ctatcacagt caaaaatatc aaagatgaca ttccatatat 720

tccaaactaa caatcaaatc accaggaaga accttcataa actcatgcat tggcaaactt 780

attcacagca gccgaatatg tgtgttattg tgtattgggc aaacagaatt acagtacaaa 840

atggtcgagc acaaaagcat tcacatttca cagccaacca atcaatataa ataataaagc 900

cgctttaggg aacataacaa aatgatgaca aaaacatagg caagcattac tttttcgaag 960

caagcatgtt ctaaattcaa atatgcctat ttctttttcc tctcctgggc attctcttct 1020

tcccactgga tgtcagggaa aataaagaca gcagacaaat aatctcttat tccccacttc 1080

gggacctcca tgctgtacat gtgcatgcta aggaccttcc aatctaagaa cgcacactcc 1140

gttggggacc tcacagacct acggaggacc cgggagggat ggttgacaaa cttctttgga 1200

acaacctgaa gaaccaacac aaagaggacc tggtcctctt tttcttcctt tgcagagcca 1260

ggtaccataa caataaactt gcctttgcca tcaagatcaa caagcacagg cgttttctca 1320

tcatacaagg gcggcattct atctaagcag ccttcaagcc tttggaagaa aaggacaccc 1380

aattcatcca cctggaatgc atatatcctt tttttccctt caatgcgttc gcatgaaagt 1440

gccaggtatt tgccaggatc aaccaaatct gtaacaatat accaataaca gaatgatgaa 1500

gggtgaagag tgaaaattgc atattttaca ataagacaaa gaaaatcatg tgcaatgcac 1560

acttggagag taattatgaa tacctggaat atgcaccctt ggaagaaaga agcgacgctg 1620

gtcatcggat gccagtggga cacaaaaaga acgcgtaaaa ctattgtcac cctcactcgt 1680

tgtccaatgt aggttatggg tgtcataaga gaagacgaca actcttccat cttcgaaaca 1740

gagtcggatg tatagcttac catagaagtc gaaccatgaa ctgtgatcaa ttatggaatg 1800

gtag 1804

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaataataaa gccgctttag g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagaagtttg tcaaccatcc c 21

<210> 5

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attttggtct ataaatttta atccaaacac atacttaatt atttatttaa gatctataga 60

ttcattctta caaacaataa ctgtatcaca atcctatatt aaagataatt aaagataaat 120

acaaagaagg gtgaaaacaa taataaattt tagcgatgaa gcagcctttg gaccgtgtaa 180

atgccaataa agatggcatt acttccgatt tcaatttgac tccgatcatt aattttggga 240

tagttagctc ggatgacaat aaaggaatat tctctccacg catatatgct agtattcttt 300

agactacata ttcgaatcct aaaaaagatg atgtgagttt aagagttttt ttttctatta 360

taatatgata ttataatcca tatgcttaca agctctaaaa ataagagagt acgagagagt 420

acgagacgaa agtactagag aaagagagcg acggaataag aaaacacagg gtgggtagaa 480

taagacaact acattacata gaaaattcgg caatttaaaa ccgaaaaaga tactagcttt 540

tggagagtga atcatttata ttttttgtgg aaaatttact gagtactctt taatccgaaa 600

tttgttaaaa aaataaccta aaattttgta acataactgg aggactattt ttttaataga 660

gtcatcatca tttattattt tgattactag ttaattaata atgtttaaaa atattaacta 720

aaaatataat actaaattat taaattaaag atattgagtt actagttaaa aatacttact 780

aatataaatt aaaattgttg tccctcaaac ttttttctca tgcatattta ctttttttaa 840

aaatgttatt tgtatattaa aatcagtcta attattctat ttaaaaaatg ctatttgtat 900

actaaaatca gcttaatgct atttaaaaaa tgttatacat tctaacattc aaatttaagt 960

gacattgcat ttaagctagc ctaattattc ttaggtatta aatcaataaa ataaacttct 1020

attttttgta taaacaagaa tcattaccta acttattcca tttgaagaaa ttttcgtact 1080

ctaaattatt caaattttga tattaatggt ttgatgaatc aggagagata gaaaaagaga 1140

aaaataaatt ctttttattt tgaaaagaat aaaaaatcct tcgaaaaata tttattgagt 1200

tatcacactt tatatactat gtactcttta tgtactctca ttataaaaaa aattacaatc 1260

aataaatcta tatctattat tgataaaaaa aataatctag atatataaca ccataaaaaa 1320

aattagtgtg ggataaatca acgtgaaatg ccgacttata ggttcttcaa tttcattaaa 1380

ttctgattaa agtgccggta atctatcgta ttataacacc ttcaatttca tgaaatttgg 1440

aaatgaactc atttttattt gacttgatgg attttagaga caaacacaac cctcaatcct 1500

aagtactcta atgaattgga taattcataa ttctagatat acaacacacc cacatactct 1560

tcacattttc taaacccaac cgatacctta ttactgtcaa tcttaagtta gattctaaaa 1620

ttttaaggac tatggtgaag atggtccccg aggatcggat ttcaattttt gacggtagtg 1680

agttcctcta cattgctgaa tcattgccct ttgagaacct tccctactct ttaacttcgc 1740

cttgtctaca actatattta caactgcttc taccaacttc tttgcaattc cctaagtata 1800

aaaaaatgtt aaaaatcagt agaatcgagt tatgaataaa ataaagttac aaaaagagtt 1860

atggacagaa gagttacata agttataata gtgactataa taagtaggat aaaagatgac 1920

aaaaataaaa aatggcacac ctttcttcca tgacactcat ttatgatctt cacagcttct 1980

tcgggactaa tatgctccca 2000

<210> 6

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aataagagag tacgagagag tacgagacga aagtactaga gaaagagagc gacggaataa 60

gaaaacacag ggtgggtaga ataagacaac tacattacat agaaaattcg gcaatttaaa 120

accgaaaaag atactagctt ttggagagtg aatcatttat attttttgtg gaaaatttac 180

tgagtactct ttaatccgaa atttgttaaa aaaataacct aaaattttgt aacataactg 240

gaggactatt tttttaatag agtcatcatc atttattatt ttgattacta gttaattaat 300

aatgtttaaa aatattaact aaaaatataa tactaaatta ttaaattaaa gatattgagt 360

tactagttaa aaatacttac taatataaat taaaattgtt gtccctcaaa cttttttctc 420

atgcatattt acttttttta aaaatgttat ttgtatatta aaatcagtct aattattcta 480

tttaaaaaat gctatttgta tactaaaatc agcttaatgc tatttaaaaa atgttataca 540

ttctaacatt caaatttaag tgacattgca tttttttttt ggtgactttt tttttttttt 600

ttttttttcg tttgacattg catttaagct agcctaatta ttcttaggta ttaaatcaat 660

aaaataaact tctatttttt gtataaacaa gaatcattac ctaacttatt ccatttgaag 720

aaattttcgt actctaaatt attcaaattt tgatattaat ggtttgatga atcaggagag 780

atagaaaaag agaaaaataa attcttttta ttttgaaaag aataaaaaat ccttcgaaaa 840

atatttattg agttatcaca ctttatatac tatgtactct ttatgtactc tcattataaa 900

aaaaattaca atcaataaat ctatatctat tattgataaa aaaaataatc tagatatata 960

acaccataaa aaaaattagt gtgggataaa tcaacgtgaa atgccgactt ataggttctt 1020

caatttcatt aaattctgat taaagtgccg gtaatctatc gtattataac accttcaatt 1080

tcatgaaatt tggaaatgaa ctcattttta tttgacttga tggattttag agacaaacac 1140

aaccctcaat cctaagtact ctaatgaatt ggataattca taattctaga tatacaacac 1200

acccacatac tcttcacatt ttctaaaccc aaccgatacc ttattactgt caatcttaag 1260

ttagattcta aaattttaag gactatggtg aagatggtcc ccgaggatcg gatttcaatt 1320

tttgacggta gtgagttcct ctacattgct gaatcattgc cctttgagaa ccttccctac 1380

tctttaactt cgccttgtct acaactatat ttacaactgc ttctaccaac ttctttgcaa 1440

ttccctaagt ataaaaaaat gttaaaaatc agtagaatcg ag 1482

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttaaaattgt tgtccctcaa actt 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggaataag ttaggtaatg attct 25

<210> 9

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acatttatca tgaaaatgta ttttccatta ttattattat tattattatt attattatta 60

ttattattat tattattatt attattatta ttattattat tattattatt attattatta 120

ttattattat gtgcccaaac aataatattt tttatttttt tcaaagataa taaattatat 180

ttcattaatt attaaaaaat aaaatataaa aatgtttaaa aacaagacaa cataataaaa 240

aataggaatc tcttaaaaca atacattaaa aatatttatc taacagtgta tagtcaaaaa 300

ttaagaaaaa ttaaaaaaaa taaatcaaat taaatgaaac taaaaatttt ttttgtaaag 360

acgacgaact aagataaaat tatttacaaa tttcatagaa taacttgacc aagcctcaaa 420

gattattttt agcattagtg cacatttgat tactaattta tgaaaaaaaa aggaaacaaa 480

aattaatcta tgtcaaatat aaataaataa aacaaaactc taaattgaaa taatttaaca 540

ttaaattatt taaaaaaaaa aagcttttga tcacatcaac aactatatat cttctcatga 600

tgcaatgact aaagtctaaa actccttaac tttgagtttt caaattcata atgcatgctg 660

agaatgagat ctttttaaag tctttgactt tgagagagtg ttttaaattc attctagaag 720

acacaacaat acatattgga gtattgatca taacacaaaa taataaagca accttattca 780

tacgtgttcc atatttgatg accacacaaa ttaggagtgt ggtctgccac tttatgaaat 840

gtgttgttta acttctccat aaccaatcat gacacatcct tgtggatgta tacataaagt 900

tttaatatgt gaaccttagt gttcttccat ctcctttcaa cttaattagt caaaccctat 960

catcatgtca tatttctatc acaacaaaat agggtttcat taataatgtt acttattaag 1020

acctctcatc acttctctat gccactcaat aactttgtgg ttcctatagt aataataata 1080

gtgataatgg attattataa ctcggatgcc cgaatatgcc taaacaattg tgttgactat 1140

cttctataaa atcacttata taaaaaaatt aaattataaa aattataaaa atttatatct 1200

cactctaata tttttttaaa attttttttc tttttgagtt tgcttaaatt atctatagtt 1260

cttttccatt tcccttttct tgttttgctt tatgaagacc acttcaataa agatactaaa 1320

aatgtcttct tttttttaag acgtttatat gtgtcatgat attattttac atatttatta 1380

aaccggttaa taatttattt tttaagaaac cagaacaaaa tcgatttatt atagcaacaa 1440

taataaactc aattgttcgc attataatta ttagacccga tttgattcga tcgatttaca 1500

taatctaaac cgaatcatat ttaaattttt gataaaaaaa taaatatatt cctaattttt 1560

gtttaaaaaa atgatccagt gatctgataa caattgcatt tattgttatt gttataaaaa 1620

aattagtttt attctaattt gttaagaaat taaaaaataa ccggttcatt aatatgtcta 1680

ataataatga gacacataaa tgtctttaca aaaagatgtt ttacgcattt ttatgggagc 1740

atcctcttgc tttatatatg ctgatttttt ttaaaattaa taaaattaaa tattaaactt 1800

tttttatcat cataaaaact cctaataatt taagttgata aaaatataaa taaataatta 1860

ttatattttt aattattacc tacatttaat tgtataaaaa taaaactatt aatttaaatg 1920

ttgaaatatc tttcacatat atctttcgat cttactatta catatatgat caaagaactt 1980

atgccgacca aagaccttgt 2000

<210> 10

<211> 1964

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

attattatta ttattattat tattattatt attattatta ttattattat tattattatt 60

attattatta ttattattat tattatgtgc ccaaacaata atatttttaa tttttttcaa 120

agataataaa ttatatttca ttaattatta aaaaataaaa tataaaaatg tttaaaaaca 180

agacaacata ataaaaaata ggaatctctt aaaacaatac attaaaaata tttatctaac 240

agtgtatagt caaaaattaa gaaaaattaa aaaaaataaa tcaaattaaa tgaaactaaa 300

attttttttt gtaaagacga cgaactaaga taaaattatt tacaaatttc atagaataac 360

ttgaccaagc ctcaaagatt atttttagca ttagtgcaca tttgattact aatttatgaa 420

aaaaaaagga aacaaaaatt aatctatgtc aaatataaat aaataaaaca aaactctaaa 480

ttgaaataat ttaacattaa attatttaaa aaaaaagctt ttgatcacat caacaactat 540

atatcttctc atgatgcaat gactaaagtc taaaactcct taactttgag ttttcaaatt 600

cataatgcat gctgagaatg agatcttttt aaagtctttg actttgagag agtgttttaa 660

attcattcta gaagacacaa caatacatat tggagtattg atcataacac aaaataataa 720

agcaacctta ttcatacgtg ttccatattt gatgaccaca caaattagga gtgtggtctg 780

ccactttatg aaatgtgttg tttaacttct ccataaccaa tcatgacaca tccttgtgga 840

tgtatacata aagttttaat atgtgaacct tagtgttctt ccatctcctt tcaacttaat 900

tagtcaaacc ctatcatgtc atatttctat cacaacaaaa tagggtttca tttagtttca 960

catctaataa tgttacttat taagacctct catcacttct ctatgccact caataacttt 1020

gtggttccta tagtaataat aatagtgata atggattatt ataactcgga tgcccgaata 1080

tgcctaaaca attgtgttga ctatcttcta taaaatcact tatataaaaa aattaaatta 1140

taaaaattat aaaaatttat atctcactct aatatttttt taaaattttt tttctttttg 1200

agtttgctta aattatctat agttcttttc catttccctt ttcttgtttt gctttatgaa 1260

gaccacttca ataaagatac taaaaatgtc ttcttttttt taagacgttt atatgtgtca 1320

tgatattatt ttacatattt attaaaccgg ttaataattt attttttaag aaaccagaac 1380

aaaatcgatt tattatagca acaataataa actcaattgt tcgcattata attattagac 1440

ccgatttgat tcgatcgatt tacataatct aaaccgaatc atatttaaat ttttgataaa 1500

aaaataaata tattcctaat ttttgtttaa aaaaatgatc cagtgatctg ataacaattg 1560

catttattgt tattgttata aaaaaattag ttttattcta atttgttaag aaattaaaaa 1620

ataaccggtt cattaatatg tctaataata atgagacaca taaatgtctt tacaaaaaga 1680

tgttttacgc atttttatgg gagcatcctc ttgctttata tatgctgatt ttttttaaaa 1740

ttaataaaat taaatattaa acttttttta tcatcataaa aactcctaat aatttaagtt 1800

gataaaaata taaataaata attattatat ttttaattat tacctacatt taattgtata 1860

aaaataaaac tattaattta aatgttgaaa tatctttcac atatatcttt cgatcttact 1920

attacatata tgatcaaaga acttatgccg accaaagacc ttgt 1964

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agtgttcttc catctccttt c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atattcgggc atccgagtta t 21

Claims (2)

1.引物对在花生开花习性相关基因位点分子标记辅助选择中的应用，其特征在于：所述引物对为PID12-21-F/R和/或引物对PID12-29-F/R；

所述引物对PID12-21-F/R为：

PID12-21-F: 5`- AAATAATAAAGCCGCTTTAGG -3`，

PID12-21-R: 5`- AAGAAGTTTGTCAACCATCCC -3`；

所述引物对PID12-29-F/R为：

PID12-29-F: 5`- TTAAAATTGTTGTCCCTCAAACTT -3`，

PID12-29-R: 5`- ATGGAATAAGTTAGGTAATGATTCT -3`；

所述花生为连续开花型栽培花生平度9616与交替开花型栽培花生Florunner的杂交后代，是单基因遗传模式的花生群体；

以交替开花亲本花生Florunner、连续开花亲本花生平度9616及其杂交后代的基因组DNA为模板，用所述引物对PID12-21-F/R、引物对PID12-29-F/R中的一对引物或两对引物对上述模板进行PCR扩增和凝胶检测，根据杂交后代个体的扩增产物大小与亲本的扩增产物大小比较判定个体标记的基因型，进而判定开花习性相关基因的基因型及该个体的开花习性性状；若后代个体的标记扩增大小与交替开花亲本大小一样，则该个体开花习性相关基因的基因型是交替开花亲本型，其表型即为交替开花；若后代个体的标记扩增大小与连续开花亲本大小一样，则该个体开花习性相关基因的基因型是连续开花亲本型，其表型即为连续开花；鉴于交替对连续为显性，因而当后代个体的标记扩增产物为父母本条带都有，则该个体开花习性相关基因的基因型是杂合型，该个体的表型为交替型。

2.引物对在花生开花习性相关基因位点分子标记辅助选择中的应用，其特征在于：所述引物对为PID2-9-F/R和引物对PID12-21-F/R，或所述引物对为PID2-9-F/R和引物对PID12-29-F/R；

所述引物对PID2-9-F/R为：

PID2-9-F: 5`- AGTGTTCTTCCATCTCCTTTC -3`，

PID2-9-R: 5`- ATATTCGGGCATCCGAGTTAT -3`；

所述引物对PID12-21-F/R为：

PID12-21-F: 5`- AAATAATAAAGCCGCTTTAGG -3`，

PID12-21-R: 5`- AAGAAGTTTGTCAACCATCCC -3`；

所述引物对PID12-29-F/R为：

PID12-29-F: 5`- TTAAAATTGTTGTCCCTCAAACTT -3`，

PID12-29-R: 5`- ATGGAATAAGTTAGGTAATGATTCT -3`；

所述花生为交替开花型栽培花生小红毛与连续开花型栽培花生河南南阳的杂交后代，为双基因遗传模式的花生群体；

分别用所述引物对PID2-9-F/R对第02染色体上的开花习性相关位点进行基因型判定，用所述引物对PID12-21-F/R或PID12-29-F/R对第12染色体上的开花习性相关位点进行基因型判定，具体为：用标记的上下游引物对交替亲本花生小红毛、连续亲本花生河南南阳及其杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增和凝胶检测，根据杂交后代个体的扩增产物大小与亲本的比较判定个体标记的基因型，进而判定标记连锁区域开花习性相关基因的基因型；若后代个体的标记扩增产物大小与交替亲本的标记扩增产物大小一样，则该位点的基因型是交替亲本型；若后代个体的标记扩增产物大小与连续亲本的标记扩增产物大小一样，则该位点的基因型是连续亲本型；若后代个体的标记扩增产物为父母本条带都有，则该位点的基因型是杂合型；双基因遗传模式的杂交组合群体中的后代个体的表型判定需要综合考虑第02染色体和第12染色体开花习性基因的基因型，当第02染色体和第12染色体中任一个染色体上存在交替开花型位点或同时存在交替开花型位点，则后代个体均表现为交替开花；当第02染色体和第12染色体同时为连续开花位点，则后代个体才能表现为连续开花。

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