CN109536630A - 与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记及其应用 - Google Patents
与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记,命名为CoSNP3、CoSSR12,该分子标记对芥蓝花瓣颜色基因的最终克隆及芥蓝分子标记辅助育种体系的建立更有帮助;可以简便、快速、高通量的应用于芥蓝育种实践。
Description
技术领域
本发明涉及与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记及其应用。
背景技术
花色通常是指花瓣的颜色,花色是植物重要性状,能作为视觉信号吸引昆虫授粉,从而达到生殖繁衍的目的,由于传粉者及取食者的不同偏好,花色受到强烈的选择,花色的变化可能导致授粉者类型不同和基因交流方式不同,最终可能形成不同的物种。另外,花色素(决定花色的主要成分)还有吸收紫外线,反射过多热量,抵御病害,维持花器官正常生理功能的作用。此外,花色还具有重要的观赏价值,直接影响着观赏植物的商业价值。
芸薹属是十字花科中最重要的一个属,具有重要的经济价值,其包括重要的油料作物(B.rapa、B.napus和B.juncea),甘蓝(B.oleracea),和香料(B.nigra和B.carinata),其中,白菜(B.rapa,AA基因组,2n=20)、甘蓝(B.oleracea,CC基因组,2n=18)和黑芥(B.nigra,BB基因组,2n=16)为二倍体,而甘蓝型油菜(B.napus,AACC基因组,2n=38)、埃塞俄比亚芥菜(B.carinata,BBCC基因组,2n=36)和芥菜型油菜(B.juncea,AABB基因组,2n=34)均是由3个基本体二倍体相互自然杂交形成的异源四倍体物种。
芸薹属植物的花通常是黄色,同时也存在白色、乳白色、金色或橙色。现有研究表明在芸薹属二倍体基本种甘蓝和白菜中,花色的遗传规律较为简单一致。甘蓝中较多的研究发现白花性状受单一显性基因控制;和二倍体基本种甘蓝花色遗传规律不同,研究发现在白菜品种中白花突变体性状受单一隐性基因的控制。同时,与二倍体基本种花色遗传规律不同,芸薹属异源四倍体因其花色突变体材料来源不同,花色遗传规律不尽相同,遗传规律更为复杂。
在甘蓝种(B.oleracea)花色基因定位研究中,前人以青花菜和芥蓝杂交,通过构建遗传连锁图在C03染色体上定位到一个花色位点,并找到一个距离花色位点遗传距离为5.88c M的连锁标记Bo CL3107s。Han等(2015)通过结球甘蓝和芥蓝构建遗传群体对花色基因进行定位,并将目标基因定位在C03染色体上标记M4136和M4139之间约503Kb的物理距离内。
甘蓝种包含15个以上不同变种,其中,芥蓝与其它变种的亲缘关系较远,并且其基因组已经测序完成,因此,利用芥蓝品种之间杂交构建遗传群体来定位花色基因更为有效和便捷,同时,芥蓝花色基因共分离标记的开发为芥蓝育种及花色基因克隆奠定基础,从而有助于解析芸薹属植物花色性状的分子机制,阐述芸薹属中花色的不同调控途径并揭示芸薹属花色进化的模式。
发明内容
本发明的目的在于提供与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记及其相应引物对。
本发明的另一个目的在于提供所述与芥蓝花瓣颜色基因共分离分子标记在分子标记辅助育种中的应用。
本发明所采取的技术方案是:
与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记,命名为CoSNP3、CoSSR12,其中
CoSNP3由序列SEQ ID NO.1所示核苷酸片段和SEQ ID NO.2所示核苷酸片段组成,其中SEQ ID NO.1所示片段与芥蓝花瓣白色基因Ckpc共分离,SEQ ID NO.2所示片段与芥蓝花瓣黄色基因ckpc共分离;
CoSSR12由序列SEQ ID NO.3所示核苷酸片段和SEQ ID NO.4所示核苷酸片段组成,其中SEQ ID NO.3所示片段与芥蓝花瓣白色基因Ckpc共分离,SEQ ID NO.4所示片段与芥蓝花瓣黄色基因ckpc共分离。
一种引物,可扩增得到上述的与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记CoSNP3、CoSSR12。
进一步地,SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物可扩增得到与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记CoSNP3。
进一步地,SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示引物可扩增得到与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记CoSSR12。
与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记CoSNP3、CoSSR12在辅助育种中的应用。
一种辅助育种方法,使用与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记CoSNP3、CoSSR12,包括以下步骤:以芥蓝变种为育种对象,在幼苗期扩增待检测植株DNA,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示片段,则表示该植株花瓣颜色为白色,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示片段,则表示该植株花瓣颜色为黄色。
进一步地,使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物扩增待检测植株DNA,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.1所示片段,则表示该植株花瓣颜色为白色,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.2所示片段,则表示该植株花瓣颜色为黄色。
进一步地,使用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示引物扩增待检测植株DNA,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.3所示片段,则表示该植株花瓣颜色为白色,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.4所示片段,则表示该植株花瓣颜色为黄色。
一种辅助育种试剂盒,其中含有用于检测与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记CoSNP3、CoSSR12的试剂。
本发明的有益效果是:
本发明公开了芥蓝黄色花瓣性状基因ckpc定位在于芥蓝第3号染色体565550kb-56619kb之间约69kb的区域内,实现了将芥蓝花瓣颜色性状基因进一步精细定位。
本发明中与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记对芥蓝花瓣颜色基因的最终克隆及芥蓝分子标记辅助育种体系的建立更有帮助;本发明的分子标记可以简便、快速、高通量的应用于芥蓝育种实践。
附图说明
图1为黄色花瓣基因ckpc遗传连锁图及物理图。
具体实施方式
以母本(P1)红脚黄花芥蓝YCK-1和父本(P2)白花芥蓝Lb07M杂交获得F1、F2和BC1P1和BC1P2遗传群体,调查表明芥蓝花瓣颜色性状由1个独立基因控制,白色对黄色为完全显性。
基于以上调查结果,在F2群体中随机挑取白色花瓣和黄色花瓣植株各50株,以常规CTAB法提取各单株DNA,用Thermo nanodrop 2000检测DNA浓度并用1%琼脂糖电泳检测DNA纯度及完整性,检测合格后分别将50个白色花瓣单株和黄色花瓣单株DNA等量混合成终浓度为40ng/μl的白色花瓣DNA混池和黄色花瓣DNA混池。利用SLAF-seq技术并结合BSA分析方法寻找芥蓝花瓣颜色性状基因关联区间,并在芥蓝基因组第3号染色体上找到唯一的关联区间,长约2.06Mb(55.29-57.35Mb)。
为将芥蓝花瓣颜色性状基因进一步精细定位,在以上关联区间附近设计并筛选多态分子,共筛选到10个多态分子标记。同时构建了5704株F2分离群体,其中黄花单株有1435株。利用距离最远的两个多态分子标记检测1435株黄花单株基因型,检测到26个交换单株,并最终将芥蓝黄色花瓣性状基因ckpc定位在标记M916和SNP4之间约69.0kb的区间内,且标记CoSNP3和CoSSR12与该基因共分离(图1)。
其中CoSNP3由序列SEQ ID NO.1所示核苷酸片段和SEQ ID NO.2所示核苷酸片段组成,其中SEQ ID NO.1所示片段与芥蓝花瓣白色基因Ckpc共分离,SEQ ID NO.2所示片段与芥蓝花瓣黄色基因ckpc共分离;CoSNP3由上游引物序列SEQ ID NO.5和下游引物序列SEQID NO.6扩增得到。
CoSSR12由序列SEQ ID NO.3所示核苷酸片段和SEQ ID NO.4所示核苷酸片段组成,其中SEQ ID NO.3所示片段与芥蓝花瓣白色基因Ckpc共分离,SEQ ID NO.4所示片段与芥蓝花瓣黄色基因ckpc共分离;CoSSR12由上游引物序列SEQ ID NO.7和下游引物序列SEQID NO.8扩增得到。
以上实施过程中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳等实验,如无特殊说明,通常按照常规方法操作,具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW,Janssen K,Argentine J.黄培堂等译,2002,北京:科学出版社),或按照制造厂商所建议的条件。其中,CoSNP3分子标记的检测采用了HRM技术,在该技术执行中所用PCR体系为10μl,具体如表1:(反应前加入25μl矿物油)。反应程序为:95℃预变性2min;55个循环:94℃变性30s,Tm(合适的退火温度)退火30s,72℃延伸30s。PCR扩增后加入浓度为10μM的高低温内标各1μl,后采用Lightscanner(LS96)进行荧光信号扫描及数据搜集,分析植株基因型。
上述与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记在芥蓝分子标记辅助育种中的应用,以芥蓝变种为育种对象,在幼苗期用上游引物序列SEQ ID NO.5和下游引物序列SEQ IDNO.6或上游引物序列SEQ ID NO.7和下游引物序列SEQ ID NO.8PCR扩增待检测植株DNA,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示片段,则表示该植株花瓣颜色为白色,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示片段,则表示该植株花瓣颜色为黄色。
田间试验验证
以下试验中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳等实验,如无特殊说明,通常按照常规方法操作,具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW,Janssen K,Argentine J.黄培堂等译,2002,北京:科学出版社),或按照制造厂商所建议的条件。CoSNP3分子标记的检测采用了HRM技术,所用PCR体系为10μl,具体见表1(反应前加入25μl矿物油)。反应程序为:95℃预变性2min;55个循环:94℃变性30s,Tm(合适的退火温度)退火30s,72℃延伸30s。
试验1
田间表型鉴定出5704株F2分离群体中共有黄花单株共1435株,以本发明提供的两个共分离标记对其进行基因分型检测,结果表明,CoSNP3扩增出的产物均是SEQ ID NO.2所示序列,CoSSR12扩增出的产物均是SEQ ID NO.4所示序列,表型和基因型达到100%完全吻合。
试验2
本单位叶菜课题组以红脚芥蓝(开黄花)为母本,以自交系612F(开白花)为父本选育了一紫臺芥蓝新品种(待审定,未命名,已参加广东省芥蓝新品种多点比较试验),比较试验中某试验点播种312株F1植株,待开花时田间表型观察发现有8株开黄花,推测为假杂种。为了验证以上共分离标记预测表型的准确率,田间取了8株开黄花单株嫩叶并随机取样184株开白花单株进行分子标记检测,检测结果显示,对于8株开黄花单,CoSNP3扩增出的产物均是SEQ ID NO.2所示序列,CoSSR12扩增出的产物均是SEQ ID NO.4所示序列;对于184株开白花单株,CoSNP3扩增出的产物均是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成的杂合序列,CoSSR12扩增出的产物均是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成的杂合序列,与表型的吻合度达到100%。
以上田间试验结果表明本发明的2个共分离标记确实能准确预测表型,在一定数量的单株检测中准确率达到100%,并在幼苗期可以实施,可运用于特定芥蓝品种选育及其F1种子纯度检测,具有简单、高效,快速,成本低等优势。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
<120> 与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记及其应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 82
<212> DNA
<213> 芥蓝
<400> 1
aaaggcttga aagtgttgga ctgtactata tacgagacat atatatgcta acatgacata 60
taaggacaat aagggtggaa at 82
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<211> 82
<212> DNA
<213> 芥蓝
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taaggacaat aagggtggaa at 82
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<211> 222
<212> DNA
<213> 芥蓝
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acgcatacaa gtagccctgg gcatacgggt aggaaccatt cggttccggg tatatcgcat 60
aaatcattct tatacccaat aggtaattat gaaatttcag ttcgattttg attcggtttc 120
ggatactcgt ttaatatatg aatcaaatat atatatatat atatatattg gttaacatat 180
taatctaagt ggtatattag ttacggattt gcatattctt cg 222
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<211> 238
<212> DNA
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atattggtta acatattaat ctaagtggta tattagttac ggatttgcat attcttcg 238
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 8
cgaagaatat gcaaatccgt aa 22
Claims (9)
1.与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记,命名为CoSNP3、CoSSR12,其特征在于:
CoSNP3由序列SEQ ID NO.1所示核苷酸片段和SEQ ID NO.2所示核苷酸片段组成,其中SEQ ID NO.1所示片段与芥蓝花瓣白色基因Ckpc共分离,SEQ ID NO.2所示片段与芥蓝花瓣黄色基因ckpc共分离;
CoSSR12由序列SEQ ID NO.3所示核苷酸片段和SEQ ID NO.4所示核苷酸片段组成,其中SEQ ID NO.3所示片段与芥蓝花瓣白色基因Ckpc共分离,SEQ ID NO.4所示片段与芥蓝花瓣黄色基因ckpc共分离。
2.一种引物,其特征在于:可扩增得到权利要求1所述的与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记。
3.根据权利要求2所述的引物,其特征在于:SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物可扩增得到与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记CoSNP3。
4.根据权利要求2所述的引物,其特征在于:SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示引物可扩增得到与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记CoSSR12。
5.权利要求1所述的与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记在辅助育种中的应用。
6.一种辅助育种方法,其特征在于:使用权利要求1中所述的与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记,包括以下步骤:以芥蓝变种为育种对象,在幼苗期扩增待检测植株DNA,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示片段,则表示该植株花瓣颜色为白色,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示片段,则表示该植株花瓣颜色为黄色。
7.根据权利要求6所述的辅助育种方法,其特征在于:使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物扩增待检测植株DNA,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.1所示片段,则表示该植株花瓣颜色为白色,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.2所示片段,则表示该植株花瓣颜色为黄色。
8.根据权利要求6所述的辅助育种方法,其特征在于:使用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示引物扩增待检测植株DNA,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.3所示片段,则表示该植株花瓣颜色为白色,如果扩增产物中存在SEQ ID NO.4所示片段,则表示该植株花瓣颜色为黄色。
9.一种辅助育种试剂盒,其特征在于,其中含有用于检测权利要求1所述的与芥蓝花瓣颜色基因共分离的分子标记的试剂。
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GR01 | Patent grant | ||
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